Procédé de préparation d'une dextranase par culture de micro-organismes La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une dextranase sus ceptible de scinder les dextranes de poids moléculaire élevé en fragments de poids molé culaire plus petit compris entre le poids molé culaire primitif et 20 000 ;
ce procédé est caractérisé en ce qu'on inocule des moisissures d'Aspergillus dans un milieu de culture aqueux contenant des sels métalliques dissous et, par litre de liquide, de 2,0 à 6,0 g d'une source d'amino-acides et de 5,0 à 50 g de dextrane, d'amidon ou de glycogène, on laisse incuber la culture jusqu'à formation de la dextranase et on sépare par filtration la dextranase du magma de moisissures.
Ce procédé est basé sur les faits suivants On a découvert que lorsqu'on cultive des moisissures du genre Aspergillus dans des milieux aqueux ayant la composition indiquée ci-dessus, l'enzyme obtenue est une dextranase dite limite . Cette dextranase, qui sera dé nommée plus loin endodextranase , attaque sélectivement les liaisons gluconiques des gros ses molécules de dextrane et scinde ces grosses molécules en fragments de dimensions prati quement uniformes et déterminables à l'avance,
comprises entre les dimensions primitives des grosses molécules et des dimensions plus petites correspondant à un poids moléculaire prati quement non inférieur à 20 000. Au-delà de cette limite, l'endodextranase ne possède plus qu'un pouvoir insignifiant de scission sur le dextrane.
Cette découverte est extrêmement impor tante, car en adaptant les conditions dans les quelles l'endodextranase agit sur les grosses molécules de dextrane telles que celles du dextrane dit naissant obtenu par synthèse enzymatique à partir du saccharose en présence ou même pratiquement en l'absence de bacté ries et de débrits cellulaires, il est possible d'obtenir des fragments moléculaires de dex- trane de dimensions pratiquement égales,
de poids moléculaire supérieur à 20 000 ; ces fragments sont de véritables homologues des dextranes polymères dont ils dérivent, les groupes qui les composent pouvant être consi dérés comme intacts. Il est donc possible d'obtenir un dextrane clinique pour injec tions- intraveineuses sans avoir recours à l'hy drolyse acide du dextrane à poids moléculaire élevé et en évitant ainsi les inconvénients atta chés à cette hydrolyse.
On sait que les acides attaquent les grosses molécules de dextrane sans aucune discrimination des liaisons et les scindent en fragments non uniformes présen tant une gamme très étendue de poids molé culaires ; ils en séparent également certains groupes. Les fragments obtenus par hydrolyse acide du dextrane à poids moléculaire élevé ne sont donc pas de véritables homologues des dextranes polymères dont ils dérivent.
Suivant une communication de Hultin et Nordstrom dans les Chimica Scandinavia 3, 1405-1417 (1949), lorsqu'on cultive des moi sissures de Pénicillium et de Verticillium dans des milieux contenant du dextrane comme source de carbone, on-obtient comme enzyme une dextranase qui attaque, avec la même facilité et sans aucune discrimination,
toutes les liaisons du dextrane à poids moléculaire élevé. En utilisant leur dextranase comme agent d'hydrolyse, ces auteurs ont obtenu comme produits de scission du dextrane, des sucres réducteurs et des oligosaccharides. Ces der niers sont des substances ayant un poids molé culaire maximum de 648 correspondant à la formule (C6H1005)4, c'est-à-dire des substances à poids moléculaire peu élevé.
Selon la même communication des mêmes auteurs, lorsqu'on cultive des moisissures de Pénicillium et de Verticillium dans des milieux contenant de l'amidon (au lieu de dextrane) comme unique source de carbone, on obtient une amylase susceptible d'agir sur l'amidon, mais n'ayant aucun pouvoir de scission sur le dextrane. Les auteurs en concluent (p. 1506) que l'amylase et la dextranase sont formées seulement de façon adaptive par leurs moisissures.
La dextranase que les inventeurs ont ob tenue par leur procédé en cultivant des moisis sures du genre Aspergillus est différente des dextranases .connues jusqu'à présent par le fait qu'elle attaque sélectivement les liaisons glu- cosiques du dextrane. Ils proposent de nom mer cette nouvelle dextranase éndodextra- nase parce qu'elle montre une préférence marquée pour les liaisons internes des chaînes polysaccharides qui constituent la molécule
de dextrane et n'attaque pas sans discrimination toutes les liaisons avec la même aisance. Les moisissures du genre Aspergillus ne se conten tent pas d'engendrer une dextrânase différente des autres, mais se comportent aussi différem ment quant au milieu de culture qu'elles exi gent et la dextranase produite par elles n'est pas formée seulement de façon adaptive .
La présence de dextrane dans le milieu nutritif des moisissures d'Aspergillus n'est pas indispensable pour obtenir une dextranase sus ceptible de scinder le dextrane à poids molé culaire élevé en fragments de dimensions plus petites, uniformes et déterminées à l'avance.
On a constaté en effet que les moisissures d'Aspergillus donnent naissance à une dextra- nase capable de scinder le dextrane comme il est indiqué plus haut non seulement dans des milieux de culture qui contiennent . du dextrane comme source de carbone, mais éga lement dans des milieux qui ne contiennent pas de dextrane, mais, en lieu et place de celui-ci, soit du glycogène, soit de l'amidon.
La dextranase élaborée par les moisissures d'Aspergillus dans des milieux de culture con tenant des sels inorganiques appropriés, des aminoacides ou une autre source d'amino acides, et soit du dextrane, soit du glycogène, soit de l'amidon, attaque les liaisons gluco- siques des grosses molécules de dextrane de façon à scinder ce dernier en fragments plus petits ayant un poids moléculaire pratiquement uniforme compris entre le poids moléculaire primitif du dextrane scindé et une limite infé rieure d'environ 20000.
Les dimensions des fragments peuvent être déterminées à l'avance en adaptant les conditions dans lesquelles la dextranase agit sur le dextrane et en arrêtant la réaction de toute façon appropriée lorsque la scission a atteint le degré voulu.
Le milieu nutritif utilisé pour la culture de l'Aspergillus peut aussi contenir des subs-. tances auxiliaires telles que des vitamines B ou un extrait de levure. Le milieu nutritif peut être avantageusement une composition aqueuse ayant une teneur totale en sels métalliques d'environ 2,0 g à 5,0 g par litre de liquide.
Cette solution doit contenir de 2,0 g à 6,0 g par litre de peptone, d'amino-acides ou d'une autre source d'amino-acides, par exemple des hydrolysats de protéine tels qu'un hydrolysat de caséine, et de 5,0 g 50 g par litre de dextrane, d'amidon ou de glycogène.
Le<I>pH</I> du milieu de culture peut varier entre 4,0 et 7,5 ; pour obtenir une formation rapide de quantités optima d'endodextranase, le<I>pH</I> est, de préférence, contrôlé et maintenu dans des limites comprises entre la neutralité et une légère alcalinité, par exemple entre 7,0 et 7,5. L'incubation peut être faite à la température ambiante.
Un milieu typique dans lequel les moisis sures d'Aspergillus peuvent être cultivées de façon à obtenir rapidement l'endodextranase désirée a la composition suivante
EMI0003.0013
<I>Milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> typique</I>
<tb> grammes
<tb> Constituants <SEP> par
<tb> litre
<tb> Peptone <SEP> .......... <SEP> 5,0
<tb> MgS04 <SEP> <B>..........</B> <SEP> 10,0
<tb> Source <SEP> NaCI <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> <B>.....</B> <SEP> 0,1
<tb> d'amino- <SEP> FeS04 <SEP> <B>....</B> <SEP> . <SEP> <B>.....</B> <SEP> 0,1
<tb> acides <SEP> MnS04 <SEP> .......... <SEP> 0,01
<tb> et <SEP> sels <SEP> KH?P04 <SEP> <B>.......... <SEP> 0,01</B>
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,1 <SEP> .
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 2,0
<tb> Dextrane, <SEP> amidon <SEP> ou <SEP> glycogène <SEP> <B>....</B> <SEP> 5,0
<tb> milli grammes
<tb> par
<tb> litre
<tb> Acide <SEP> nicotinique <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Riboflavine <SEP> ...... <SEP> 1,0
<tb> Thiamine <SEP> ........ <SEP> 0,5
<tb> Vitamines <SEP> B <SEP> Pantothénate <SEP> de
<tb> calcium <SEP> ........ <SEP> 0,5
<tb> Pyridoxine <SEP> ........ <SEP> 0,4
<tb> Acide <SEP> folique <SEP> <B>......</B> <SEP> 0,1
<tb> Biotine <SEP> .......... <SEP> 0,001 Les espèces d'Aspergillus qui peuvent être cultivées dans ces milieux pour obtenir l'endo- dextranase désirée comprennent l'A.
ustus, l'A. candidus, l'A. niger, l'A. tamarii, l'A. fla- vus-orizae et l'A. Wentii. Actuellement on choisit de préférence d'inoculer le milieu avec une souche d'A.
Wentii. Lorsque l'endodextra- nase est formée, on filtre la culture pour éli miner le magma de moisissures et obtenir un filtrat contenant l'endodextranase. Ce filtrat peut être utilisé tel quel ou - après dilution appropriée avec de l'eau pour scinder le dex- trane ou toute autre fonction à laquelle l'endo- dextranase est destinée.
On peut aussi isoler cette dernière des autres substances présentes dans le filtrat, soit par précipitation fractionnée au moyen de solvants, soit par salage frac tionné. L'endodextranase isolée peut être intro duite dans un milieu contenant du dextrane à scinder ou être utilisée autrement, telle quelle ou sous forme de solutions aqueuses.
Lorsque l'endodextranase est préparée dans un milieu de culture contenant du dextrane qui peut être un dextrane à poids moléculaire élevé ou un dextrane déjà scindé à poids moléculaire rela tivement bas, ceci en remplacement des hy drates de carbone utilisés habituellement, cette endodextranase est plus active et peut être uti lisée à des dilutions beaucoup plus fortes.
Ainsi, l'endodextranasë préparée au moyen d'Asper gillus Wentil dans un milieu de culture conte nant du dextrane et ayant une composition telle que mentionnée plus haut scinde le dex- trane à poids moléculaire élevé obtenu par synthèse -à partir du saccharose au moyen de l'enzyme dextrane-saccharose en fragments de poids moléculaire plus petit pratiquement uni forme;
cette scission s'effectue très rapidement, en une à cinq heures, à la température am biante avec des dilutions de 1 partie d'endo- dextranase pour 100 à 1000 parties de solu tion ; l'opération peut aussi s'effectuer avec succès avec des dilutions beaucoup plus fortes de l'ordre de 1 partie d'endodextranase pour 10 000 à 100 000 parties de solution, mais la durée de réaction est un peu plus longue.
On peut apporter diverses modifications à la composition du milieu de culture typique mentionné plus haut. Par exemple:- on peut laisser de côté les vitamines B ; on peut rem placer la peptone par un hydrolysai de caséine à raison d'environ 5,0 g par litre, avec ou sans addition de vitamines B. Les exemples qui suivent illustrent l'inven tion .
<I>Exemple 1</I> On inocule une souche d'Aspergillus Wentü dans un flacon renfermant un milieu ayant la composition indiquée plus haut ( milieu de culture typique ) et contenant environ 5,0 g par litre d'amidon soluble. On laisse incuber à la température ambiante pêndant environ 7 jours, après quoi on filtre le mélange pour séparer le filtrat contenant l'endodextranase du magma de moisissures.
<I>Exemple 2 -</I> On inocule une souche d'Aspergillus Wentii dans un flacon renfermant un milieu ayant la composition indiquée plus haut ( milieu de culture typique ) et contenant environ 5,0 g par litre de glycogène. On laisse incuber le milieu inoculé à la température ambiante pen dant environ 7 jours, après quoi on filtre le mélange pour séparer le filtrat contenant l'en dodextranase du magma de moisissures.
<I>" Exemple 3</I> On obtient un filtrat contenant l'endodex- tranase de la même manière en inoculant l'Aspergillus Wentü dans un flacon renfermant un milieu ayant la même composition que dans les exemples précédents, mais contenant envi ron 5,0 g par litre de dextrane.
L'activité de l'endodextranase à scinder un dextrane à poids moléculaire élevé est mesurée en observant l'abaissement progressif de la durée d'écoulement de solutions aqueuses con tenant le dextrane à scinder et le filtrat à divers intervalles après adjonction du filtrat et en calculant la viscosité correspondante.
A cet effet, des portions du filtrat sont introduites dans un viscosimètre Fenske-Ostwald No 200 contenant une solution aqueuse à 4,5 % de dextrane à poids moléculaire de l'ordre de plusieurs millions.
Les résultats sont consignés dans le tableau ci-après. La durée d'écoulement de l'eau dans les viscosimètres utilisés pour ces mesures est de 14,0 secondes. La viscosité relative pour chaque durée d'écoulement des solutions figu rant dans ce tableau peut être obtenue en divi sant cette durée d'écoulement par 14,0.
EMI0004.0045
<I>Tableau</I>
<tb> Durée <SEP> d'écoulement <SEP> du <SEP> filtrat
<tb> Temps <SEP> en <SEP> secondes
<tb> après <SEP> addition <SEP> Dextrane <SEP> Amidon <SEP> Glycogène
<tb> du <SEP> filtrat
<tb> minutes <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 10
<tb> 0 <SEP> 158,0 <SEP> 158,0 <SEP> 158,0
<tb> 4 <SEP> 126,5 <SEP> 122,6 <SEP> 112,4
<tb> 10 <SEP> 94,4 <SEP> 92,7 <SEP> 77,2
<tb> 20 <SEP> 70,4 <SEP> 70,0 <SEP> 55,9
<tb> 30 <SEP> 59,0 <SEP> 56,0 <SEP> 45,2
<tb> 40 <SEP> 50,0 <SEP> 47,2 <SEP> 38,8
<tb> 60 <SEP> - <SEP> 40,2 <SEP> 38,8 <SEP> 32,2
<tb> 80 <SEP> 35,8 <SEP> 34,5 <SEP> 30,5
<tb> 100 <SEP> 33,5 <SEP> 32,3 <SEP> 29,4
<tb> 120 <SEP> 31,4 <SEP> 30,4 <SEP> 28,4
<tb> 140 <SEP> 30,1 <SEP> 29,5 <SEP> 28,0
<tb> 30 <SEP> heures <SEP> 24,2 <SEP> 24,5 <SEP> 23,9 La diminution progressive de la durée d'écoulement et, par conséquent,
de la viscosité relative de la solution avec la durée de l'action de l'endodextranase sur le dextrane en cours de scission constitue la preuve que l'endo- dextranase attaque les liaisons alpha-1,6 des molécules de dextrane à poids moléculaire élevé pour scinder ces molécules en fragments plus petits.
On remarquera que les filtrats d'endodextranase obtenus de cultures contenant de l'amidon soluble ou du glycogène ont une capacité de scission du dextrane plus accentuée que les filtrats de culture contenant du dex- trane. La comparaison avec le filtrat provenant d'un milieu de culture contenant de l'amidon est particulièrement frappante si l'on se réfère aux données de la littérature selon lesquelles la culture d'autres genres de moisissures dans des milieux contenant de l'amidon ne permet pas d'obtenir une dextranase ou une
enzyme capable de scinder les liaisons glucosiques du dextrane. Contrairement donc à la dextranase préparée au moyen des moisissures utilisées jusqu'à présent, l'endodextranase obtenue par le procédé suivant l'invention n'est pas formée de façon adaptive.
Il va sans dire que le milieu de culture des moisissures d'Aspergillus et les conditions de cette culture peuvent varier et que, soit le filtrat, soit l'endodextranase isolée de ce filtrat, soit encore une dilution aqueuse du filtrat ou de l'endodextranase précipitée peuvent être introduits dans un milieu aqueux contenant le dextrine à scinder, dans n'importe quelle concentration appropriée, par exemple sous forme d'une solution à 4 % jusqu'à 10 %.