Procédé de préparation d'une dextranase par culture de micro-organismes La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'une dextranase sus ceptible de scinder les dextranes de poids moléculaire élevé en fragments de poids molé culaire plus petit compris entre le poids molé culaire primitif et 20 000 ;
ce procédé est caractérisé en ce qu'on inocule des moisissures d'Aspergillus dans un milieu de culture aqueux contenant des sels métalliques dissous et, par litre de liquide, de 2,0 à 6,0 g d'une source d'amino-acides et de 5,0 à 50 g de dextrane, d'amidon ou de glycogène, on laisse incuber la culture jusqu'à formation de la dextranase et on sépare par filtration la dextranase du magma de moisissures.
Ce procédé est basé sur les faits suivants On a découvert que lorsqu'on cultive des moisissures du genre Aspergillus dans des milieux aqueux ayant la composition indiquée ci-dessus, l'enzyme obtenue est une dextranase dite limite . Cette dextranase, qui sera dé nommée plus loin endodextranase , attaque sélectivement les liaisons gluconiques des gros ses molécules de dextrane et scinde ces grosses molécules en fragments de dimensions prati quement uniformes et déterminables à l'avance,
comprises entre les dimensions primitives des grosses molécules et des dimensions plus petites correspondant à un poids moléculaire prati quement non inférieur à 20 000. Au-delà de cette limite, l'endodextranase ne possède plus qu'un pouvoir insignifiant de scission sur le dextrane.
Cette découverte est extrêmement impor tante, car en adaptant les conditions dans les quelles l'endodextranase agit sur les grosses molécules de dextrane telles que celles du dextrane dit naissant obtenu par synthèse enzymatique à partir du saccharose en présence ou même pratiquement en l'absence de bacté ries et de débrits cellulaires, il est possible d'obtenir des fragments moléculaires de dex- trane de dimensions pratiquement égales,
de poids moléculaire supérieur à 20 000 ; ces fragments sont de véritables homologues des dextranes polymères dont ils dérivent, les groupes qui les composent pouvant être consi dérés comme intacts. Il est donc possible d'obtenir un dextrane clinique pour injec tions- intraveineuses sans avoir recours à l'hy drolyse acide du dextrane à poids moléculaire élevé et en évitant ainsi les inconvénients atta chés à cette hydrolyse.
On sait que les acides attaquent les grosses molécules de dextrane sans aucune discrimination des liaisons et les scindent en fragments non uniformes présen tant une gamme très étendue de poids molé culaires ; ils en séparent également certains groupes. Les fragments obtenus par hydrolyse acide du dextrane à poids moléculaire élevé ne sont donc pas de véritables homologues des dextranes polymères dont ils dérivent.
Suivant une communication de Hultin et Nordstrom dans les Chimica Scandinavia 3, 1405-1417 (1949), lorsqu'on cultive des moi sissures de Pénicillium et de Verticillium dans des milieux contenant du dextrane comme source de carbone, on-obtient comme enzyme une dextranase qui attaque, avec la même facilité et sans aucune discrimination,
toutes les liaisons du dextrane à poids moléculaire élevé. En utilisant leur dextranase comme agent d'hydrolyse, ces auteurs ont obtenu comme produits de scission du dextrane, des sucres réducteurs et des oligosaccharides. Ces der niers sont des substances ayant un poids molé culaire maximum de 648 correspondant à la formule (C6H1005)4, c'est-à-dire des substances à poids moléculaire peu élevé.
Selon la même communication des mêmes auteurs, lorsqu'on cultive des moisissures de Pénicillium et de Verticillium dans des milieux contenant de l'amidon (au lieu de dextrane) comme unique source de carbone, on obtient une amylase susceptible d'agir sur l'amidon, mais n'ayant aucun pouvoir de scission sur le dextrane. Les auteurs en concluent (p. 1506) que l'amylase et la dextranase sont formées seulement de façon adaptive par leurs moisissures.
La dextranase que les inventeurs ont ob tenue par leur procédé en cultivant des moisis sures du genre Aspergillus est différente des dextranases .connues jusqu'à présent par le fait qu'elle attaque sélectivement les liaisons glu- cosiques du dextrane. Ils proposent de nom mer cette nouvelle dextranase éndodextra- nase parce qu'elle montre une préférence marquée pour les liaisons internes des chaînes polysaccharides qui constituent la molécule
de dextrane et n'attaque pas sans discrimination toutes les liaisons avec la même aisance. Les moisissures du genre Aspergillus ne se conten tent pas d'engendrer une dextrânase différente des autres, mais se comportent aussi différem ment quant au milieu de culture qu'elles exi gent et la dextranase produite par elles n'est pas formée seulement de façon adaptive .
La présence de dextrane dans le milieu nutritif des moisissures d'Aspergillus n'est pas indispensable pour obtenir une dextranase sus ceptible de scinder le dextrane à poids molé culaire élevé en fragments de dimensions plus petites, uniformes et déterminées à l'avance.
On a constaté en effet que les moisissures d'Aspergillus donnent naissance à une dextra- nase capable de scinder le dextrane comme il est indiqué plus haut non seulement dans des milieux de culture qui contiennent . du dextrane comme source de carbone, mais éga lement dans des milieux qui ne contiennent pas de dextrane, mais, en lieu et place de celui-ci, soit du glycogène, soit de l'amidon.
La dextranase élaborée par les moisissures d'Aspergillus dans des milieux de culture con tenant des sels inorganiques appropriés, des aminoacides ou une autre source d'amino acides, et soit du dextrane, soit du glycogène, soit de l'amidon, attaque les liaisons gluco- siques des grosses molécules de dextrane de façon à scinder ce dernier en fragments plus petits ayant un poids moléculaire pratiquement uniforme compris entre le poids moléculaire primitif du dextrane scindé et une limite infé rieure d'environ 20000.
Les dimensions des fragments peuvent être déterminées à l'avance en adaptant les conditions dans lesquelles la dextranase agit sur le dextrane et en arrêtant la réaction de toute façon appropriée lorsque la scission a atteint le degré voulu.
Le milieu nutritif utilisé pour la culture de l'Aspergillus peut aussi contenir des subs-. tances auxiliaires telles que des vitamines B ou un extrait de levure. Le milieu nutritif peut être avantageusement une composition aqueuse ayant une teneur totale en sels métalliques d'environ 2,0 g à 5,0 g par litre de liquide.
Cette solution doit contenir de 2,0 g à 6,0 g par litre de peptone, d'amino-acides ou d'une autre source d'amino-acides, par exemple des hydrolysats de protéine tels qu'un hydrolysat de caséine, et de 5,0 g 50 g par litre de dextrane, d'amidon ou de glycogène.
Le<I>pH</I> du milieu de culture peut varier entre 4,0 et 7,5 ; pour obtenir une formation rapide de quantités optima d'endodextranase, le<I>pH</I> est, de préférence, contrôlé et maintenu dans des limites comprises entre la neutralité et une légère alcalinité, par exemple entre 7,0 et 7,5. L'incubation peut être faite à la température ambiante.
Un milieu typique dans lequel les moisis sures d'Aspergillus peuvent être cultivées de façon à obtenir rapidement l'endodextranase désirée a la composition suivante
EMI0003.0013
<I>Milieu <SEP> de <SEP> culture <SEP> typique</I>
<tb> grammes
<tb> Constituants <SEP> par
<tb> litre
<tb> Peptone <SEP> .......... <SEP> 5,0
<tb> MgS04 <SEP> <B>..........</B> <SEP> 10,0
<tb> Source <SEP> NaCI <SEP> <B>......</B> <SEP> . <SEP> <B>.....</B> <SEP> 0,1
<tb> d'amino- <SEP> FeS04 <SEP> <B>....</B> <SEP> . <SEP> <B>.....</B> <SEP> 0,1
<tb> acides <SEP> MnS04 <SEP> .......... <SEP> 0,01
<tb> et <SEP> sels <SEP> KH?P04 <SEP> <B>.......... <SEP> 0,01</B>
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,1 <SEP> .
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> potassium <SEP> 2,0
<tb> Dextrane, <SEP> amidon <SEP> ou <SEP> glycogène <SEP> <B>....</B> <SEP> 5,0
<tb> milli grammes
<tb> par
<tb> litre
<tb> Acide <SEP> nicotinique <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb> Riboflavine <SEP> ...... <SEP> 1,0
<tb> Thiamine <SEP> ........ <SEP> 0,5
<tb> Vitamines <SEP> B <SEP> Pantothénate <SEP> de
<tb> calcium <SEP> ........ <SEP> 0,5
<tb> Pyridoxine <SEP> ........ <SEP> 0,4
<tb> Acide <SEP> folique <SEP> <B>......</B> <SEP> 0,1
<tb> Biotine <SEP> .......... <SEP> 0,001 Les espèces d'Aspergillus qui peuvent être cultivées dans ces milieux pour obtenir l'endo- dextranase désirée comprennent l'A.
ustus, l'A. candidus, l'A. niger, l'A. tamarii, l'A. fla- vus-orizae et l'A. Wentii. Actuellement on choisit de préférence d'inoculer le milieu avec une souche d'A.
Wentii. Lorsque l'endodextra- nase est formée, on filtre la culture pour éli miner le magma de moisissures et obtenir un filtrat contenant l'endodextranase. Ce filtrat peut être utilisé tel quel ou - après dilution appropriée avec de l'eau pour scinder le dex- trane ou toute autre fonction à laquelle l'endo- dextranase est destinée.
On peut aussi isoler cette dernière des autres substances présentes dans le filtrat, soit par précipitation fractionnée au moyen de solvants, soit par salage frac tionné. L'endodextranase isolée peut être intro duite dans un milieu contenant du dextrane à scinder ou être utilisée autrement, telle quelle ou sous forme de solutions aqueuses.
Lorsque l'endodextranase est préparée dans un milieu de culture contenant du dextrane qui peut être un dextrane à poids moléculaire élevé ou un dextrane déjà scindé à poids moléculaire rela tivement bas, ceci en remplacement des hy drates de carbone utilisés habituellement, cette endodextranase est plus active et peut être uti lisée à des dilutions beaucoup plus fortes.
Ainsi, l'endodextranasë préparée au moyen d'Asper gillus Wentil dans un milieu de culture conte nant du dextrane et ayant une composition telle que mentionnée plus haut scinde le dex- trane à poids moléculaire élevé obtenu par synthèse -à partir du saccharose au moyen de l'enzyme dextrane-saccharose en fragments de poids moléculaire plus petit pratiquement uni forme;
cette scission s'effectue très rapidement, en une à cinq heures, à la température am biante avec des dilutions de 1 partie d'endo- dextranase pour 100 à 1000 parties de solu tion ; l'opération peut aussi s'effectuer avec succès avec des dilutions beaucoup plus fortes de l'ordre de 1 partie d'endodextranase pour 10 000 à 100 000 parties de solution, mais la durée de réaction est un peu plus longue.
On peut apporter diverses modifications à la composition du milieu de culture typique mentionné plus haut. Par exemple:- on peut laisser de côté les vitamines B ; on peut rem placer la peptone par un hydrolysai de caséine à raison d'environ 5,0 g par litre, avec ou sans addition de vitamines B. Les exemples qui suivent illustrent l'inven tion .
<I>Exemple 1</I> On inocule une souche d'Aspergillus Wentü dans un flacon renfermant un milieu ayant la composition indiquée plus haut ( milieu de culture typique ) et contenant environ 5,0 g par litre d'amidon soluble. On laisse incuber à la température ambiante pêndant environ 7 jours, après quoi on filtre le mélange pour séparer le filtrat contenant l'endodextranase du magma de moisissures.
<I>Exemple 2 -</I> On inocule une souche d'Aspergillus Wentii dans un flacon renfermant un milieu ayant la composition indiquée plus haut ( milieu de culture typique ) et contenant environ 5,0 g par litre de glycogène. On laisse incuber le milieu inoculé à la température ambiante pen dant environ 7 jours, après quoi on filtre le mélange pour séparer le filtrat contenant l'en dodextranase du magma de moisissures.
<I>" Exemple 3</I> On obtient un filtrat contenant l'endodex- tranase de la même manière en inoculant l'Aspergillus Wentü dans un flacon renfermant un milieu ayant la même composition que dans les exemples précédents, mais contenant envi ron 5,0 g par litre de dextrane.
L'activité de l'endodextranase à scinder un dextrane à poids moléculaire élevé est mesurée en observant l'abaissement progressif de la durée d'écoulement de solutions aqueuses con tenant le dextrane à scinder et le filtrat à divers intervalles après adjonction du filtrat et en calculant la viscosité correspondante.
A cet effet, des portions du filtrat sont introduites dans un viscosimètre Fenske-Ostwald No 200 contenant une solution aqueuse à 4,5 % de dextrane à poids moléculaire de l'ordre de plusieurs millions.
Les résultats sont consignés dans le tableau ci-après. La durée d'écoulement de l'eau dans les viscosimètres utilisés pour ces mesures est de 14,0 secondes. La viscosité relative pour chaque durée d'écoulement des solutions figu rant dans ce tableau peut être obtenue en divi sant cette durée d'écoulement par 14,0.
EMI0004.0045
<I>Tableau</I>
<tb> Durée <SEP> d'écoulement <SEP> du <SEP> filtrat
<tb> Temps <SEP> en <SEP> secondes
<tb> après <SEP> addition <SEP> Dextrane <SEP> Amidon <SEP> Glycogène
<tb> du <SEP> filtrat
<tb> minutes <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 100 <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP> : <SEP> 10 <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP> :
<SEP> 10
<tb> 0 <SEP> 158,0 <SEP> 158,0 <SEP> 158,0
<tb> 4 <SEP> 126,5 <SEP> 122,6 <SEP> 112,4
<tb> 10 <SEP> 94,4 <SEP> 92,7 <SEP> 77,2
<tb> 20 <SEP> 70,4 <SEP> 70,0 <SEP> 55,9
<tb> 30 <SEP> 59,0 <SEP> 56,0 <SEP> 45,2
<tb> 40 <SEP> 50,0 <SEP> 47,2 <SEP> 38,8
<tb> 60 <SEP> - <SEP> 40,2 <SEP> 38,8 <SEP> 32,2
<tb> 80 <SEP> 35,8 <SEP> 34,5 <SEP> 30,5
<tb> 100 <SEP> 33,5 <SEP> 32,3 <SEP> 29,4
<tb> 120 <SEP> 31,4 <SEP> 30,4 <SEP> 28,4
<tb> 140 <SEP> 30,1 <SEP> 29,5 <SEP> 28,0
<tb> 30 <SEP> heures <SEP> 24,2 <SEP> 24,5 <SEP> 23,9 La diminution progressive de la durée d'écoulement et, par conséquent,
de la viscosité relative de la solution avec la durée de l'action de l'endodextranase sur le dextrane en cours de scission constitue la preuve que l'endo- dextranase attaque les liaisons alpha-1,6 des molécules de dextrane à poids moléculaire élevé pour scinder ces molécules en fragments plus petits.
On remarquera que les filtrats d'endodextranase obtenus de cultures contenant de l'amidon soluble ou du glycogène ont une capacité de scission du dextrane plus accentuée que les filtrats de culture contenant du dex- trane. La comparaison avec le filtrat provenant d'un milieu de culture contenant de l'amidon est particulièrement frappante si l'on se réfère aux données de la littérature selon lesquelles la culture d'autres genres de moisissures dans des milieux contenant de l'amidon ne permet pas d'obtenir une dextranase ou une
enzyme capable de scinder les liaisons glucosiques du dextrane. Contrairement donc à la dextranase préparée au moyen des moisissures utilisées jusqu'à présent, l'endodextranase obtenue par le procédé suivant l'invention n'est pas formée de façon adaptive.
Il va sans dire que le milieu de culture des moisissures d'Aspergillus et les conditions de cette culture peuvent varier et que, soit le filtrat, soit l'endodextranase isolée de ce filtrat, soit encore une dilution aqueuse du filtrat ou de l'endodextranase précipitée peuvent être introduits dans un milieu aqueux contenant le dextrine à scinder, dans n'importe quelle concentration appropriée, par exemple sous forme d'une solution à 4 % jusqu'à 10 %.
Process for preparing a dextranase by culturing microorganisms The present invention relates to a process for preparing a dextranase capable of splitting dextrans of high molecular weight into fragments of smaller molecular weight between the molar weight primitive cular and 20,000;
this process is characterized by inoculating Aspergillus molds in an aqueous culture medium containing dissolved metal salts and, per liter of liquid, from 2.0 to 6.0 g of an amino source. acids and 5.0 to 50 g of dextran, starch or glycogen, the culture is allowed to incubate until dextranase is formed and the dextranase is separated by filtration from the mold magma.
This method is based on the following facts. It has been found that when molds of the genus Aspergillus are cultivated in aqueous media having the composition indicated above, the enzyme obtained is a so-called limit dextranase. This dextranase, which will be called endodextranase later, selectively attacks the gluconic bonds of its large dextran molecules and splits these large molecules into fragments of practically uniform dimensions and determinable in advance,
between the original dimensions of large molecules and smaller dimensions corresponding to a molecular weight practically not less than 20,000. Beyond this limit, the endodextranase has only an insignificant power of splitting on the dextran.
This discovery is extremely important, because by adapting the conditions under which the endodextranase acts on large dextran molecules such as those of so-called nascent dextran obtained by enzymatic synthesis from sucrose in the presence or even practically in the absence of bacteria and cellular debris, it is possible to obtain molecular fragments of dextran of practically equal dimensions,
of molecular weight greater than 20,000; these fragments are true homologs of the polymer dextrans from which they are derived, the groups which compose them can be considered as intact. It is therefore possible to obtain a clinical dextran for intravenous injection without resorting to the acid hydrolysis of the high molecular weight dextran and thus avoiding the drawbacks associated with this hydrolysis.
It is known that acids attack large molecules of dextran without any discrimination of the bonds and split them into non-uniform fragments having a very wide range of molecular weights; they also separate certain groups from it. The fragments obtained by acid hydrolysis of high molecular weight dextran are therefore not true homologs of the polymer dextrans from which they are derived.
According to a communication from Hultin and Nordstrom in Chimica Scandinavia 3, 1405-1417 (1949), when cultures of Penicillium and Verticillium moieties are grown in media containing dextran as a carbon source, a dextranase enzyme is obtained. who attacks, with the same ease and without any discrimination,
all bonds of high molecular weight dextran. Using their dextranase as a hydrolysis agent, these authors obtained dextran, reducing sugars and oligosaccharides as cleavage products. The latter are substances with a maximum molecular weight of 648 corresponding to the formula (C6H1005) 4, that is to say substances with a low molecular weight.
According to the same communication by the same authors, when Penicillium and Verticillium molds are cultivated in media containing starch (instead of dextran) as the sole source of carbon, an amylase is obtained which can act on the starch, but having no cleavage power on dextran. The authors conclude (p. 1506) that amylase and dextranase are formed only adaptively by their molds.
The dextranase which the inventors obtained by their process by cultivating sure molds of the genus Aspergillus is different from the dextranases known hitherto in that it selectively attacks the glucose bonds of the dextran. They nominate this new dextranase endodextranase because it shows a marked preference for the internal bonds of the polysaccharide chains that make up the molecule.
dextran and does not indiscriminately attack all the bonds with the same ease. Molds of the genus Aspergillus do not only generate a different dextranase from others, but also behave differently in the culture medium they require and the dextranase produced by them is not only formed adaptively. .
The presence of dextran in the nutrient medium of Aspergillus molds is not essential in order to obtain a dextranase capable of splitting the dextran of high molecular weight into fragments of smaller, uniform dimensions determined in advance.
It has in fact been observed that Aspergillus molds give rise to a dextra- nase capable of cleaving dextran as indicated above not only in culture media which contain it. dextran as a carbon source, but also in media which do not contain dextran, but, instead of the latter, either glycogen or starch.
The dextranase produced by Aspergillus molds in culture media containing appropriate inorganic salts, amino acids or other source of amino acids, and either dextran, glycogen, or starch, attacks the bonds. glucosides of the large molecules of dextran so as to split the latter into smaller fragments having a substantially uniform molecular weight between the original molecular weight of the split dextran and a lower limit of about 20,000.
The dimensions of the fragments can be determined in advance by adjusting the conditions under which the dextranase acts on the dextran and stopping the reaction in any suitable way when the cleavage has reached the desired degree.
The nutrient medium used for growing Aspergillus can also contain subs. auxiliary agents such as B vitamins or yeast extract. The nutrient medium can advantageously be an aqueous composition having a total metal salt content of from about 2.0 g to 5.0 g per liter of liquid.
This solution should contain 2.0 g to 6.0 g per liter of peptone, amino acids or other source of amino acids, for example protein hydrolysates such as casein hydrolyzate, and 5.0 g 50 g per liter of dextran, starch or glycogen.
The <I> pH </I> of the culture medium can vary between 4.0 and 7.5; to obtain rapid formation of optimum amounts of endodextranase, the <I> pH </I> is preferably controlled and maintained within limits between neutrality and slight alkalinity, for example between 7.0 and 7, 5. Incubation can be done at room temperature.
A typical medium in which the sour molds of Aspergillus can be grown so as to rapidly obtain the desired endodextranase has the following composition
EMI0003.0013
<I> <SEP> medium of <SEP> typical <SEP> culture </I>
<tb> grams
<tb> Constituents <SEP> by
<tb> liter
<tb> Peptone <SEP> .......... <SEP> 5.0
<tb> MgS04 <SEP> <B> .......... </B> <SEP> 10.0
<tb> Source <SEP> NaCI <SEP> <B> ...... </B> <SEP>. <SEP> <B> ..... </B> <SEP> 0.1
<tb> d'amino- <SEP> FeS04 <SEP> <B> .... </B> <SEP>. <SEP> <B> ..... </B> <SEP> 0.1
<tb> acids <SEP> MnS04 <SEP> .......... <SEP> 0.01
<tb> and <SEP> salts <SEP> KH? P04 <SEP> <B> .......... <SEP> 0.01 </B>
<tb> Sodium <SEP> acetate <SEP> <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.1 <SEP>.
<tb> Acetate <SEP> of <SEP> potassium <SEP> 2.0
<tb> Dextran, <SEP> starch <SEP> or <SEP> glycogen <SEP> <B> .... </B> <SEP> 5.0
<tb> milli grams
<tb> by
<tb> liter
<tb> Nicotinic acid <SEP> <SEP>. <SEP>. <SEP> 1.0
<tb> Riboflavin <SEP> ...... <SEP> 1.0
<tb> Thiamine <SEP> ........ <SEP> 0.5
<tb> Vitamins <SEP> B <SEP> Pantothenate <SEP> of
<tb> calcium <SEP> ........ <SEP> 0.5
<tb> Pyridoxine <SEP> ........ <SEP> 0.4
<tb> <SEP> folic acid <SEP> <B> ...... </B> <SEP> 0.1
<tb> Biotin <SEP> .......... <SEP> 0.001 Species of Aspergillus which can be cultured in these media to obtain the desired endodextranase include A.
ustus, A. candidus, A. niger, A. tamarii, A. fla- vus-orizae and A. Wentii. Currently, the preferred choice is to inoculate the medium with a strain of A.
Wentii. When the endodextranase is formed, the culture is filtered to remove the mold magma and obtain a filtrate containing the endodextranase. This filtrate can be used as it is or - after suitable dilution with water to split dextran or any other function for which the endodextranase is intended.
The latter can also be isolated from the other substances present in the filtrate, either by fractional precipitation with solvents, or by fractional salting. The isolated endodextranase can be introduced into a medium containing dextran to be cleaved or be used otherwise, as is or in the form of aqueous solutions.
When the endodextranase is prepared in a culture medium containing dextran which can be a high molecular weight dextran or a relatively low molecular weight already split dextran, this replacing the carbohydrates usually used, this endodextranase is more active and can be used at much higher dilutions.
Thus, the endodextranza prepared by means of Asper gillus Wentil in a culture medium containing dextran and having a composition as mentioned above cleaves the high molecular weight dextran obtained by synthesis from sucrose by means of substantially unified smaller molecular weight dextran-sucrose enzyme;
this cleavage takes place very rapidly, in one to five hours, at room temperature with dilutions of 1 part of endodextranase per 100 to 1000 parts of solution; the operation can also be carried out successfully with much higher dilutions of the order of 1 part of endodextranase per 10,000 to 100,000 parts of solution, but the reaction time is somewhat longer.
Various modifications can be made to the composition of the typical culture medium mentioned above. For example: - you can leave aside the B vitamins; the peptone can be replaced by a casein hydrolyzate at a rate of approximately 5.0 g per liter, with or without the addition of B vitamins. The examples which follow illustrate the invention.
<I> Example 1 </I> A strain of Aspergillus Wentü is inoculated into a flask containing a medium having the composition indicated above (typical culture medium) and containing about 5.0 g per liter of soluble starch. It is left to incubate at room temperature for about 7 days, after which the mixture is filtered to separate the filtrate containing the endodextranase from the mold magma.
<I> Example 2 - </I> A strain of Aspergillus Wentii is inoculated in a flask containing a medium having the composition indicated above (typical culture medium) and containing approximately 5.0 g per liter of glycogen. The inoculated medium is allowed to incubate at room temperature for about 7 days, after which the mixture is filtered to separate the filtrate containing the dodextranase from the mold magma.
<I> "Example 3 </I> A filtrate containing endodextranase is obtained in the same manner by inoculating Aspergillus Wentü in a flask containing a medium having the same composition as in the preceding examples, but containing approximately 5.0 g per liter of dextran.
The activity of the endodextranase to cleave a high molecular weight dextran is measured by observing the gradual decrease in the flow time of aqueous solutions containing the dextran to be cleaved and the filtrate at various intervals after addition of the filtrate and in calculating the corresponding viscosity.
For this purpose, portions of the filtrate are introduced into a Fenske-Ostwald No. 200 viscometer containing a 4.5% aqueous solution of dextran with a molecular weight of the order of several million.
The results are shown in the table below. The duration of water flow in the viscometers used for these measurements is 14.0 seconds. The relative viscosity for each flow time of the solutions shown in this table can be obtained by dividing this flow time by 14.0.
EMI0004.0045
<I> Table </I>
<tb> Duration <SEP> of flow <SEP> of the <SEP> filtrate
<tb> Time <SEP> in <SEP> seconds
<tb> after <SEP> addition <SEP> Dextran <SEP> Starch <SEP> Glycogen
<tb> of the <SEP> filtrate
<tb> minutes <SEP> ground. <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 100 <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP>: <SEP> 10 <SEP> sol. <SEP> 1 <SEP>:
<SEP> 10
<tb> 0 <SEP> 158.0 <SEP> 158.0 <SEP> 158.0
<tb> 4 <SEP> 126.5 <SEP> 122.6 <SEP> 112.4
<tb> 10 <SEP> 94.4 <SEP> 92.7 <SEP> 77.2
<tb> 20 <SEP> 70.4 <SEP> 70.0 <SEP> 55.9
<tb> 30 <SEP> 59.0 <SEP> 56.0 <SEP> 45.2
<tb> 40 <SEP> 50.0 <SEP> 47.2 <SEP> 38.8
<tb> 60 <SEP> - <SEP> 40.2 <SEP> 38.8 <SEP> 32.2
<tb> 80 <SEP> 35.8 <SEP> 34.5 <SEP> 30.5
<tb> 100 <SEP> 33.5 <SEP> 32.3 <SEP> 29.4
<tb> 120 <SEP> 31.4 <SEP> 30.4 <SEP> 28.4
<tb> 140 <SEP> 30.1 <SEP> 29.5 <SEP> 28.0
<tb> 30 <SEP> hours <SEP> 24.2 <SEP> 24.5 <SEP> 23.9 The gradual decrease in the flow time and, consequently,
the relative viscosity of the solution with the duration of the action of endodextranase on the dextran being split is evidence that endodextranase attacks the alpha-1,6 bonds of high molecular weight dextran molecules to split these molecules into smaller fragments.
It will be noted that the endodextranase filtrates obtained from cultures containing soluble starch or glycogen have a greater dextran cleavage capacity than culture filtrates containing dextran. The comparison with the filtrate from a culture medium containing starch is particularly striking if one refers to the data in the literature according to which the culture of other kinds of molds in media containing starch is not does not allow to obtain a dextranase or a
enzyme capable of splitting the glucosic bonds of dextran. Contrary therefore to the dextranase prepared by means of the molds used until now, the endodextranase obtained by the process according to the invention is not formed adaptively.
It goes without saying that the culture medium for Aspergillus molds and the conditions of this culture can vary and that either the filtrate or the endodextranase isolated from this filtrate, or an aqueous dilution of the filtrate or endodextranase precipitated can be introduced into an aqueous medium containing the dextrin to be cleaved, in any suitable concentration, for example as a 4% to 10% solution.