Verfahren zur Herstellung einer Blutplasma-Ersatzflüssigkeit Es ist schon verschiedentlich versucht wor den, Gelatine wegen ihrer günstigen kolloid chemischen und physiologischen Eigenschaften als Blutplasma-Ersatz zu verwenden, doch steht der Verabreichung grösserer Mengen die zu rasche Ausscheidü-ng aus dem Organismus und die damit verbundene Überlastung der Nierenfunktionen entgegen. Diese Erscheinung ist wohl auf die linearmolekulare Struktur dieses Eiweissstoffes zurückzuführen.
Durch Einbau geeigneter Gruppen lässt sich jedoch bekanntlich eine Vernetzung dIer Gelatine herbeiführen, z. B. durch Umsetzung dersel ben mit Formaldehyd. Indessen erfährt die Gelatine durch diese Härtung infolge Poly- merisa,tionserscheinungen hinsichtlich einer Verwendung als Blutersatz-Flüssigkeit uner wünschte Änderungen ihrer kolloidalen Eigen- seha.ften.
Gegenstand vorliegender Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstellung einer ver netzte und abgebaute Gelatine enthaltenden Blutplasma-Ersatzflüssigkeit, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf Gelatine einerseits Formaldehyd zur Einwirkung bringt und anderseits mittels eiweissspaltender Agen- tien einen, partiellen Abbau vornimmt, derart, d'ass die Löslichkeit (bzw.
Sol-Gel-Reversibi- lität) der so behandelten Gelatine derjenigen der unbehandelten Gelatine entspricht, jedoch das mittlere Molekulargewicht den Wert von 20 000 nicht unterschreitet, und dass man hier auf aus dem erhaltenen Produkt eine etwa 0,9 1/o Kochsalz enthaltende wässrige Lösung bildet und diese sterilisiert.
Durch Wahl der die Abbaureaktion bestim menden Faktoren. - nämlich Art, und Menge des eiweissspaltenden Mittels, Dauer seiner Einwirkung, Temperatur und pH-Wert des Milieus - hat man es in der Hand, den Dispersionsgrad auf den, gewünschten Wert einzustellen. Der jeweilige Zustand lässt sich unter Anwendung bekannter Methoden (u. a. Messung der Viskosität und, des kolfoidosmo- tischen Druckes) leicht verfolgen.
Der Abbau kann sowohl mittels verdünnter Alkalien oder Säuren als auch auf fermenta- tivem Wege durch Einwirkung proteolytisch wirksamer Enzyme vorgenommen werden, wobei in letzterem Falle natürlich dafür ge sorgt werden muss, dass während der Pro teolyse ein dem Wirkungsoptimum des jeweili gen Enzyms entsprechender pH-Bereich einge halten wird.
Als besonders günstig für die Durchführung des erfindhmgsgemässen Ver fahrens haben sich Fermentgemische erwiesen, wie sie zum Beisspiel nach dem Verfahren der deutschen Patentschrift Nr.939682 erhalten werden.
Insoweit der Abbau mit einer ge wissen Streuung hinsichtlich der Molekül grösse der einzelnen Abbauprodukte behaftet ist, kann eine Fraktionierung derselben in!. Sinne einer gegenüber dem Spaltungsgut ver grösserten Gleichförmigkeit in der Molekül grösse oft wünschenswert sein; sie kann in üblicher Weise (z. B. durch- Fällung mittels mit Wasser mischbarer Lösungsmittel) vorge nommen werden. Man kann die Behandlung mit Formaldehyd teilweise gleichzeitig mit der Spaltung vornehmen. Häufig, z.
B. bei Ver wendung solcher Enzyme, deren Wirkungs bereich im alkalischen Milieu liegt, kann es sogar zweckmässig sein, mit= der Vernetzung und der Desaggregation gleichzeitig zu begin nen.
Es wurde weiter gefunden, dass es günstig ist, die Kondensation -mit Formaldehyd in Gegenwart mehrwertiger - gegebenenfalls substituierter - Phenole, wie z. B. Resorcin, Phloroglucin oder Methylresorcin usw., vorzu nehmen.
Hierdurch tritt überraschenderweise eine starke Beschleunigung des mit der Form- a.ldehydbehandlung verbundenen Vernetzungs vorganges ein, wie sich aus der folgenden Tabelle ergibt, aus welcher der Einflu.ss von Formaldehyd allein bzw. von Formaldehyd in Gegenwart der genannten Phenole auf die so genannte Intrinsic-viscosity [il] einer abge bauten, aber noch vernetzten Gel.atinelösung ergibt:
EMI0002.0026
W
<tb> Ohne <SEP> Zusatz <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25
<tb> Mit <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 18 <SEP> mg <SEP> CH20 <SEP> pro <SEP> 30 <SEP> cm3
<tb> Lösung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,48
<tb> Mit <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 18 <SEP> mg <SEP> CH20 <SEP> -f- <SEP> 9 <SEP> g
<tb> Resorcin <SEP> pro <SEP> 30 <SEP> cm3 <SEP> Lösung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,53
<tb> Mit <SEP> Zusatz <SEP> von <SEP> 18 <SEP> mg <SEP> CH20 <SEP> -I- <SEP> 9 <SEP> mg
<tb> Phloroglucin <SEP> pro <SEP> 30 <SEP> cm3 <SEP> Lösung <SEP> .
<SEP> 0,61 Für diesen Vergleichsversuch wurde eine 4'%ige, bis zu einer relativen Viskosität von 2,8 abgebaute und sodann mit Phosphatpuffer auf ein pH von 8,0: eingestellte Gelatinelösung verwendet; die Messungen wurden bei 40 C.' nach jeweils 1.8 Stunden Einwirkungsdauer und Neutralisation vorgenommen.
Die auf diese Weise behandelte Gelatine liefert nach Einstellung auf die erforderliche Konzentration an Kochsalz und nach Anwen dung geeigneter Sterilisierungsmassnahmen Blutersatzflüssigkeiten, die sieh in vieler Hinsicht (Verträglichkeit, Verweildauer im Organismus, Resorptionsverhältnisse usw. ) gegenüber den bisher angewandten Ersatz stoffen als überlegen erweisen.
<I>Beispiel 1</I> Eine Aufschlämmung von 10 g feingepul- verter, durch mehrtägige Einwirkung von Formaldehyddämpfen gehärteter Gelatine in 200 cm3 0,4n-Salzsä.ttre wird auf dem Was serbad; unter Rühren auf 90 C erwärmt. So bald sieh die Formolgelatine gelöst hat (nach etwa 30 Minuten), wird das PH der Mischung durch Zugabe von 2n-Natronlauge auf 5,0 eingestellt, worauf auf 0 C abgekühlt wird.
Man versetzt. nun die Lösung mit so viel Aceton, dass die Konzentration daran 70 Vol. 1/o beträgt, und lä.sst das Gemisch 2 Stunden lang bei 0 C stehen. Der durch das Aeeton ge fällte Anteil (etwa. 50 Gew.O/o der eingesetzten Gelatine) wird abgetrennt und vom anhaften den Aceton befreit. Man löst diesen Anteil in der 20fachen Menge physiologischer Kochsalz lösung und filtriert und sterilisiert die Lösung, welche eine gut verträgliche Blutplasma- Ersatzflüssigkeit darstellt.
<I>Beispiel 2</I> 224 g Knochen-Gefatine (110/0 H20 und etwa. 0,9 % Asche, meist Caleiumsalze) werden in 2 Liter destilliertem Wasser gelöst; die Lö sung wird durch Zugabe von 11 cms 2n Natronlauge auf ein pH von 7,2 eingestellt.
Es wird eine Lösung von 40 mg eines gereinigten Pilzproteinase-Präparates von insgesamt 24 000 Baumann Einheiten, erhalten zum Beispiel nach dem Verfahren der deutschen Patent schrift Nr. 939682, in 2 em3 physiologischer Kochsalzlösung zugegeben, worauf man lang- sam 5,15 cm3 einer 38 %igen. Formalinlösung (= 2 g CH=,,0) einrührt. Nun lässt man bei einer Temperatur von 35 bis 40 C unter wei terem kräftigen Rühren ln-Natronlauge hin zulaufen.
Sobald das pl, der Lösung den Wert von 7,5 übersteigt, macht sieh eine deutliche Zunahme der Viskosität bemerkbar, bis sich schliesslich die Masse zu versteifen beginnt, worauf man die Zugabe von Lauge unter bricht. Nach einigen Minuten hat sich der Ansatz infolge des enzymatischen Abbaus wieder verflüssigt, wobei auch das PH etwas abgenommen hat.
Durch weiteren vorsichtigen Zusatz von In-Natronlauge wird die Konden sation wieder gefördert, bis sich der Ansatz aufs neue gallertartig versteift, worauf nach Unterbrechung der Laugenzugabe erneut Ver flüssigung eintritt.
Nachdem man diesen Vor gang der Versteifung und Wiederverflüssi gung 5- bis 8mal sich hat wiederholen lassen (wobei darauf zu achten ist, dass die oben angegebene Temperatur erhalten bleibt), wird der Ansatz auch bei weiterer Zugabe von Lauge nicht mehr fest, da die ursprünglich zugegebene Menge Formaldehyd inzwischen verbraucht. worden ist.
Jetzt wird durch schnelles Erwärmen im Wasserbad auf 65-70 C eine Abtötung der Fermente bewirkt und das Gemisch durch Zu gabe von verdünnter Salzsäure neutralisiert. Vorhandene Calciumionen werden sodann mit tels eines Kationenaustausehers oder auf che mischem Wege entfernt. Die Testreaktion auf Formaldehyd mittels fuchsinschwefliger Säure soll nach schwachem Ansäuern einer Probe negativ oder höchstens ganz schwach positiv sein; gegebenenfalls wird etwa vorhandener überschüssiger Formaldehyd durch Dialysie ren oder alkalische Behandlung mit.
Wasser stoffperoxyd aus dem Ansatz beseiti#-,t. Nachdem man. in einem aliquoten Teil der Lösung den Gelatüiegehalt (Stiekstoffbest.im- mung nach Kjeldahl) und den Gehalt. an Cl- Tonen festgestellt hat, wird das Gut durch Zugabe von destilliertem W ausser bzw.
Koch salzlösung auf einen Gehalt an organischen Bestandteilen von 5 % und einen solchen an NaCl von 0,9 eingestellt. Man filtriert. durch ein Seitzfilter und sterilisiert durch 20minü tiges Erhitzen auf 115 C im Autoklaven. Die so' hergestellte Blutplasma-Ersatzflüssigkeit erstarrt erst unter 30 C und. besitzt eine rela tive Viskosität. von 2-5 bei 37 C.
<I>Beispiel 3</I> Eine Lösung von 100 g Gelatine in 1 Liter destilliertem Wasser wird unter kräftigem Rühren mit 2,5 em3 einer 40 %igen Formalin- lösung und 10 em3 2n-Natronlauge versetzt. Das hierbei schnell erstarrende Gemisch wird noch 2 Stunden auf dem Wasserbad auf 80 C gehalten, worauf man noch 24 Stunden stehen lässt.
Die gewonnene Gallerte wird in geeigne ter Weise zerkleinert und mit 600 cm3 0,4n- Salzsäure versetzt. Man erhitzt das Gemisch unter kräftigem Rühren im Wasserbad auE & 5 C, wobei nach etwa 15 Minuten Lösung eintritt. Jetzt wird mittels verdünnter Natron lauge auf ein pH von 5,0 eingestellt.
Man ver setzt in der Kälte mit so viel Aceton, dass die Konzentration daran 45 Vol.% beträgt. Der hierbei ausgefällte Anteil (etwa 700/0) wird abgetrennt, von Aceton befreit und in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst.
Aus dieser Lösung entfernt man die Calciumionen, beispielsweise mittels eines Kationenaustauschers. Schliess lieh wird die Lösung auf einen NaCluGehalt von 0,85% eingestellt, in Ampullen abgefüllt und sterilisiert.
<I>Beispiel 4</I> 1 Liter 100/aige neutrale ('Telatinelösung wird bei 40 C mit 2 cm3 eines gereinigten Pankreatinpräparates versetzt, worauf 2,5 cm3 einer 40 %igen Formalinlesung hinzugefügt werden.
Die Kondensation wird durch Zugabe von 20 cm3 2n-NatrittmcaTbonatlösung in Gang gebracht, wobei sich der Ansatz vorübergehend verfestigt. Nach 2 Minuten wird der Ansatz infolge der Fermentwirkung wieder flüssig, worauf man weitere 10 cm3 Natriumcarbonat- lösung hinzufügt. Nachdem man in Abständen von jeweils 5 Minuten viermal je 5 em3 2n- Natriumcarbonatlösung zugegeben hat, wird das Gemisch rasch auf 60 C erhitzt.
Hierauf versetzt man mit 7 em3 2n-Natronlauge auf ?,5 g Tierkohle, worauf filtriert wird. Das Filtrat wird .auf ein pl, von 7,2 eingestellt, mit Kochsalz bis zu einer Kochsalzkonzentra- tion von 0;85 /o versetzt und sterilisiert, und man erhält auf diese Weise wie nach den vorigen Beispielen eine als Blutplasma-Ersatz gut geeignete Flüssigkeit.
Process for the production of a blood plasma substitute liquid Attempts have already been made on various occasions to use gelatin as a blood plasma substitute because of its favorable colloidal chemical and physiological properties, but the administration of larger amounts is precluded by the rapid excretion from the organism and the associated effects Against overloading the kidney functions. This phenomenon is probably due to the linear molecular structure of this protein.
However, as is known, by incorporating suitable groups it is possible to bring about crosslinking of the gelatin, e.g. B. by implementing the same ben with formaldehyde. However, as a result of this hardening as a result of polymerization, the gelatine undergoes undesired changes in its colloidal properties with regard to its use as a blood substitute fluid.
The present invention now relates to a process for the production of a blood plasma replacement fluid containing cross-linked and degraded gelatin, which is characterized in that formaldehyde is brought into action on gelatin on the one hand and partial degradation is carried out on the other by means of protein-splitting agents, such as the solubility (resp.
Sol-gel reversibility) of the gelatin treated in this way corresponds to that of the untreated gelatin, but the average molecular weight does not fall below the value of 20,000, and that an aqueous sodium chloride containing about 0.9 1 / o sodium chloride is obtained from the product obtained Solution forms and this sterilizes.
By choosing the factors that determine the degradation reaction. - namely the type and amount of the protein-splitting agent, duration of its action, temperature and pH value of the environment - it is up to you to adjust the degree of dispersion to the desired value. The respective state can easily be tracked using known methods (including measuring the viscosity and the colloidal osmotic pressure).
The degradation can be carried out both by means of dilute alkalis or acids and by fermentative means by the action of proteolytically active enzymes, whereby in the latter case it must of course be ensured that during the pro teolysis a pH corresponding to the optimal action of the respective enzyme must be ensured. Area is kept.
Ferment mixtures such as those obtained, for example, according to the method of German Patent No. 939682, have proven to be particularly favorable for carrying out the process according to the invention.
Insofar as the breakdown is subject to a certain spread with regard to the molecule size of the individual breakdown products, a fractionation of the same in !. In the sense of greater uniformity in the molecule size compared to the cleavage material, this may often be desirable; it can be carried out in the customary manner (for example by precipitation using water-miscible solvents). The treatment with formaldehyde can sometimes be carried out simultaneously with the cleavage. Often, e.g.
B. when using such enzymes, whose range of action is in an alkaline environment, it may even be useful to begin with the crosslinking and disaggregation at the same time.
It has also been found that it is advantageous to condensation with formaldehyde in the presence of polyhydric - optionally substituted - phenols, such as. B. resorcinol, phloroglucinol or methylresorcinol, etc., vorzu take.
This surprisingly greatly accelerates the crosslinking process associated with the formaldehyde treatment, as can be seen from the following table, from which the influence of formaldehyde alone or of formaldehyde in the presence of the phenols mentioned on the so-called intrinsic -viscosity [il] of a degraded but still cross-linked gelatin solution gives:
EMI0002.0026
W.
<tb> Without <SEP> addition <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.25
<tb> With <SEP> addition <SEP> of <SEP> 18 <SEP> mg <SEP> CH20 <SEP> per <SEP> 30 <SEP> cm3
<tb> Solution <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.48
<tb> With <SEP> addition <SEP> of <SEP> 18 <SEP> mg <SEP> CH20 <SEP> -f- <SEP> 9 <SEP> g
<tb> Resorcin <SEP> per <SEP> 30 <SEP> cm3 <SEP> solution <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.53
<tb> With <SEP> addition <SEP> of <SEP> 18 <SEP> mg <SEP> CH20 <SEP> -I- <SEP> 9 <SEP> mg
<tb> Phloroglucin <SEP> per <SEP> 30 <SEP> cm3 <SEP> solution <SEP>.
<SEP> 0.61 For this comparative experiment, a 4% strength gelatin solution, degraded to a relative viscosity of 2.8 and then adjusted to a pH of 8.0 with phosphate buffer: was used; the measurements were made at 40 C. ' carried out after 1.8 hours of exposure and neutralization.
The gelatine treated in this way, after setting the required concentration of table salt and applying suitable sterilization measures, supplies blood substitute fluids which in many respects (compatibility, retention time in the organism, absorption ratios, etc.) prove to be superior to the substitutes used previously.
<I> Example 1 </I> A slurry of 10 g of finely powdered gelatin hardened by the action of formaldehyde vapors for several days in 200 cm3 of 0.4N hydrochloric acid is placed on the water bath; heated to 90 ° C. with stirring. As soon as the formol gelatine has dissolved (after about 30 minutes), the pH of the mixture is adjusted to 5.0 by adding 2N sodium hydroxide solution, whereupon it is cooled to 0 C.
One transfers. Now add the solution with so much acetone that the concentration in it is 70 vol. 1 / o, and let the mixture stand at 0 C for 2 hours. The fraction precipitated by the acetone (about 50% by weight of the gelatin used) is separated off and freed from adhering acetone. This portion is dissolved in 20 times the amount of physiological saline solution and the solution, which is a well tolerated blood plasma replacement fluid, is filtered and sterilized.
<I> Example 2 </I> 224 g bone Gefatine (110/0 H20 and about 0.9% ash, mostly calcium salts) are dissolved in 2 liters of distilled water; the solution is adjusted to a pH of 7.2 by adding 11 cms of 2N sodium hydroxide solution.
A solution of 40 mg of a purified fungal proteinase preparation totaling 24,000 Baumann units, obtained for example according to the method of German Patent No. 939682, in 2 em3 of physiological saline solution is added, whereupon 5.15 cm3 of a 38%. Stir in formalin solution (= 2 g CH = ,, 0). In sodium hydroxide solution is now allowed to run in at a temperature of 35 to 40 ° C. with continued vigorous stirring.
As soon as the pI of the solution exceeds 7.5, a significant increase in viscosity becomes noticeable until finally the mass begins to stiffen, whereupon the addition of lye is interrupted. After a few minutes, the batch has liquefied again as a result of the enzymatic breakdown, and the pH has also decreased somewhat.
By further careful addition of sodium hydroxide solution, the condensation is promoted again until the approach stiffens again like a gel, whereupon liquefaction occurs again after the addition of lye is interrupted.
After this process of stiffening and reliquefaction has been repeated 5 to 8 times (it is important to ensure that the temperature specified above is maintained), the batch will no longer solidify even with further addition of lye, since the original added amount of formaldehyde has been used up. has been.
The ferments are now killed by rapid heating in a water bath to 65-70 C and the mixture is neutralized by adding dilute hydrochloric acid. Existing calcium ions are then removed by means of a cation exchanger or chemically. The test reaction to formaldehyde using fuchsin sulphurous acid should be negative or at most very weakly positive after weak acidification of a sample; if necessary, any excess formaldehyde present is removed by dialysing or alkaline treatment with.
Hydrogen peroxide is removed from the batch. After one. in an aliquot part of the solution the gelatin content (determination of substance according to Kjeldahl) and the content. found on Cl clays, the material is removed by adding distilled W except or
Saline solution adjusted to a content of organic components of 5% and that of NaCl of 0.9. Filter. through a Seitz filter and sterilized by heating to 115 C for 20 minutes in an autoclave. The blood plasma substitute fluid produced in this way only solidifies below 30 C and. has a relative viscosity. from 2-5 at 37 C.
<I> Example 3 </I> A solution of 100 g of gelatin in 1 liter of distilled water is mixed with 2.5 em3 of a 40% formalin solution and 10 em3 of 2N sodium hydroxide solution while stirring vigorously. The mixture, which solidifies rapidly, is kept at 80 ° C. for a further 2 hours on the water bath, after which it is left to stand for a further 24 hours.
The jelly obtained is crushed in a suitable manner and 600 cm3 of 0.4N hydrochloric acid are added. The mixture is heated to 5 ° C. in a water bath while stirring vigorously, and solution occurs after about 15 minutes. Now is adjusted to a pH of 5.0 using dilute sodium hydroxide solution.
So much acetone is added in the cold that the concentration is 45% by volume. The precipitated portion (about 700/0) is separated off, freed from acetone and dissolved in 1 liter of distilled water.
The calcium ions are removed from this solution, for example by means of a cation exchanger. Finally, the solution is adjusted to a NaClu content of 0.85%, filled into ampoules and sterilized.
<I> Example 4 </I> 1 liter of 100% neutral ('Telatine solution is mixed with 2 cm3 of a purified pancreatin preparation at 40 C, whereupon 2.5 cm3 of a 40% formalin reading are added.
The condensation is started by adding 20 cm3 of 2N sodium carbonate solution, during which the mixture temporarily solidifies. After 2 minutes the batch becomes liquid again due to the fermentation effect, whereupon another 10 cm3 sodium carbonate solution is added. After adding 5 cubic meters of 2N sodium carbonate solution four times at 5 minute intervals, the mixture is quickly heated to 60.degree.
7 cubic meters of 2N sodium hydroxide solution are then added to 1.5 g of animal charcoal, and it is filtered. The filtrate is adjusted to a pH of 7.2, mixed with common salt up to a common salt concentration of 0.85 / o and sterilized, and in this way, as in the previous examples, a well-suited blood plasma substitute is obtained Liquid.