Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin- nionophosphorsäureesters und zur Isolierung des bekannten Lactoflavin-5'-monophosphor- säureesters aus den Mischungen desselben mit andern Isomeren des Lactoflavin-monophos- pliorsäureesters, welche bei der Herstellung desselben entstehen.
Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters, dadurch gekennzeichnet, dass Dihydrolactoflavin mit einer Chlorphosphorsäure phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylierten Dihydrolactoflavin hydrolysiert, dieses durch Oxydation in das phosphorylierte Lactoflavin umwandelt und aus dem erhaltenen Isomeren, Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.
Der Ausdruck Chlorphosphorsäure , wie er hier gebraucht wird, bezeichnet zwei Ver bindungen, das heisst Monochlorphosphor- säure und Dichlorphosphorsäure, deren Fbr- meln die folgenden sind: (HO)2POC1 und HOPOCl2. Die Bildung dieser zwei Verbin dungen erfolgt durch Umsetzung zwischen Phosphoroxyehlorid und Wasser oder zwi schen Phosphoroxychlorid und Phosphor säure.
Die Chlorphosphorsäuren werden leicht durch Umsetzen von Phosphoroxychlorid mit 1-2 Mol Wasser gewonnen. Die Reaktion nimmt folgenden Verlauf
EMI0001.0032
POCls <SEP> -I- <SEP> <B>1E120</B> <SEP> ) <SEP> F10POC1z <SEP> -I- <SEP> FICl
<tb> POCls <SEP> -I- <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP> -<U>--></U> <SEP> (HO)aPOCI <SEP> -I- <SEP> 2 <SEP> HCl Die zwei Verbindungen bilden sich auch bei der Umsetzung von Phosphoroxychlorid mit ortho-Phosphorsäure. Beispielsweise kann ein geeignetes Chlorphosphorsäure-Reagens durch langsamen Zusatz von 61,3 g (0,4 Mo1) Phosphoroxychlorid zu 19,6 g (0,2 Mol)
wasserfreier ortho-Phosphorsäure, wobei ge rührt und auf Raumtemperatur gekühlt wer den muss, erhalten werden. Die Reaktions mischung wird während etwa 1 Stunde ge rührt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an Chlorphosphorsäure zu gewinnen, lässt man das Produkt über Nacht stehen. Die Warte- zeit ist jedoch nicht unerlässlich, denn die Chlorphosphorsäure bildet sich leicht und in guter Ausbeute, sobald Phosphoroxychlorid mit Wasser oder Phosphorsäure reagiert.
Es versteht sich, dass die Phosphorsäure auch wässerig sein kann, in welchem Fall beide Reaktionen zur Bildung der Chlorphosphor säure beitragen, .das heisst eine Reaktion zwi schen dem Phosphoroxychlorid und Wasser, und eine Reaktion zwischen dem' Phosphor- oxychlorid und der ortho-Phosphorsäure. Die Chlorphosphorsäure kann selbstverständlich auch in Gegenwart des zu phösphorylierenden Körpers gebildet werden, wobei sie dann so fort mit letzterem reagiert.
Die Produkte der Phosphorylierung mit der Chlorphosphorsäure umfassen die mono- (chlorphosphorsauren Salze und die mono- (dichlorphosphorsauren) Salze der Dihy dro- lactoflavinester . mit Phosphorsäure, Poly phosphorsäuren, chlorenthaltende Phosphor säure und chlorenthaltende Polyphosphor säuren. Cyclische Phosphorsäureester der Zwischenprodukte können auch gebildet wer den.
Der Grad der Phosphorylierung ist ab hängig von der Zeitdauer, während der die Ausgangsverbindungen mit der Chlorphos phorsäure reagieren können. Die hier ange gebenen Reaktionen stellen eine Synthese mit hypothetischen Zwischenprodukts-Strukturen dar. Obwohl das vorangehende und das nach stehende Reaktionsschema auf dem gründen, was als der wahrscheinlichste Reaktionsver- lauf angesehen wird, versteht es sich, dass die Erfindung keinesfalls auf irgendeine Reak tionstheorie oder Zwischenprodukts-Struktur beschränkt ist.
Im Falle der Dichlorphosphorsäure kann die Reaktion wie folgt formuliert werden:
EMI0002.0021
Das obige monochlorphosphorylierte Produkt kann weiter chlorphosphoryliertwerden,
EMI0002.0024
je <SEP> nach <SEP> Reaktionszeit <SEP> wie <SEP> folgt:
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> fi <SEP> i(a) <SEP> -i- <SEP> HOPOC12 <SEP> RO-P-O-P-OH <SEP> HOPOC12 <SEP> (b)
<tb> C1 <SEP> C1
<tb> 0 <SEP> -0
<tb> und/oder <SEP> RO-P-O-P-CI <SEP> HOPOC12 <SEP> (c)
<tb> OH <SEP> Cl Die Verbindungen (b) und (c) können weiter phosphoryliert werden.
Im Falle der MonochlorphosphorsäLtre sind die entsprechenden Reaktionen die folgenden
EMI0002.0027
Nach weiterer Behandltmg mit Monochlorphosphorsäure ergibt. sich folgendes:
EMI0002.0030
Die Verbindung (e) kann weiter phosphoryliert werden. In den obigen Formeln bedeutet ROH Di- hydrolactoflavin.
Die Hydrolyse der Zwischenprodukte der Reaktion mit den Chlorphosphorsäuren be wirkt je nachdem zuerst die Abspaltung der salzbildenden HOP0C.12 oder (H0)2P0C1, gefolgt von der Freisetzung des Monophos- phorsäureesters, welcher entsprechend als ROPO(OH)2 bezeichnet werden kann. Der Phosphorylierungsgrad ist belanglos, da das Endprodukt der Hydrolyse in jedem Falle der Monophosphorsäureester des Zwischen produktes ist.
Das Hauptprodukt ist ein 5'-Ester, doch besteht eine kleine Menge aus den andern Isomeren, das heisst den 2'-, 3' und V-Isomeren. Obwohl die vorgenannten Estersalze der Zwischenprodukte isoliert werden können, z. B. um sie zu reinigen, ist es nicht erforder lich, .diese Isolierung vorzunehmen, bevor man dieselben in Lactoflavin-monophosphorsäure- ester umwandelt. Die durch Phosphorylierung erhaltene Reaktionsmischung kann einfach in mehrere Volumen Wasser gegossen und für einige Stunden stehengelassen werden.
Wäh rend dieser Zeit hydrolysieren die restlichen nicht -umgesetzten Chlorphosphorsäuren voll ständig zu Phosphorsäure und Salzsäure, und die Zwischenestersalze erleiden ebenfalls eine Hydrolyse, welche zu den Monophosphorsäure- estern des Dihydrolactoflavins führt. Die letz teren können dann leicht in Lactoflavin- monophosphorsäure überführt werden.
So kann der durch Hydrolyse, während der er sich in Lösung befindet, erhaltene Dihydro- lactoflavin-monophosphorsäureester, beispiels weise mit Wasserstoffperoxyd, zum stabilen Lactoflavin-monophosphorsäureester oxydiert werden.
Wie oben hervorgehoben, entstehen neben dem Hauptprodukt, nämlich dem Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureester, eine kleine Menge der Lactoflavin-2'-, -3'- oder -4'-monaphos- phorsäureester. Von diesen Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters ist allein der 5'-Isomere biologisch voll wirksam. Es ist daher wünschenswert, diese Substanz in reiner Form, frei von den andern Isomeren, zu ge winnen.
Die Eigenschaften der verschiedenen Isomeren sind allerdings so weitgehend ähn- lich,-dass die Abtrennung des 5'-Isomeren von den andern schwierig ist.
Es ist festgestellt worden, dass die Di- äthanolamin-, und Morpholinsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters in ihren Löslichkeitseigenschaften so weit verschieden sind von den entsprechenden Salzen der an dern Isomeren, dass die Abtrennung des ge wünschten 5'-Isomeren in reiner Form zweck mässig über diese Aminsalze erfolgt.
Diese neuen Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters sind auch an sich physiologisch wertvolle Verbin dungen, denn sie enthalten den biologisch aktiven 5'-Isomeren in einer leicht löslichen, nicht toxischen Form, die sich für therapeu tische Verwendung eignet. Diese Salze können mühelos in den freien 5'-Monophosphorsäure- ester durch einfaches Ansäuern ihrer wässe rigen Lösung, z. B. mit einer Mineralsäure, umgewandelt werden, wobei der 5'-Ester in reiner Form kristallisiert.
Die den Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- ester und die andern Isomeren enthaltende Mischung wird z. B. einfach mit Diäthanol- amin oder Morpholin umgesetzt, wobei sich eine Mischung der entsprechenden Aminsälze der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters bildet.
Die Aminsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters werden so dann von der Mischung abgetrennt, bäispiels- weise durch fraktionierte Kristallisation. Letztere kann so durchgeführt. werden, dass ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Isopropanol oder Aceton, einer wässerigen Lösung der -Mischung der Amin salze der Isomeren zugesetzt wird.
Die ent sprechenden Aminsalze der andern Isonieren bleiben in der Mutterlauge in Lösung, Die abgetrennten Diäthanolamin- und Morpholin- salze des .Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- esters werden dann leicht durch Behandlung rnit einer geeigneten Säure in den freien Laetoflavin-5'-monophosphorsäureester umge wandelt.
Während der Umsetzung der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters mit den vorgenannten Aminen bilden sich entweder die Mono- oder die Di- äminsalze, oder Mischungen derselben, - je nach Menge des verwendeten Amins.
Bei der Titration mit Diäthanolamin oder Morpholin zeigt die potentiometrische Titrationskurve des Lactoflavin-monophosphorsäureesters ein scharfes Knie bei ungefähr pH 4, in dem Augenblick, wo ein Mol des Amins pro Mol des Lactoflavin-monophosphorsäureesters ad diert worden ist.
Wenn ein weiteres Mol Amin -zugesetzt wird, steigt das pH langsam auf etwa 7; wo ein kaum wahrnehmbares Knie in der Kurve zeigt, dass das zweite 1M1 Amin in dem Di-salz nur sehr schwach gebunden ist. Beim Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z.
B. Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zur wässerigen Lösung der Aminsalze, fällt ein Salz aus, das je nach dem pH, an dem die Ausfällung erfolgt, aus dem Mono- oder Diaminsalz, oder einer Mi schung derselben, besteht. Bei einem PH von etwa 4 ist das ausgefällte Salz praktisch aus schliesslich ein Monoaminsalz, während bei einem pH von mindestens etwa 9 das ausge fällte Salz zur Hauptsache ein Diaminsalz ist.
Bei dazwischenliegenden p11-Werten werden Mischungen der Mono- und Diaminsalze er halten, wobei allerdings bei pH 7 zur Haupt sache das Monoaminsalz gewonnen wird.
Unabhängig davon, ob das Mono- oder Di- aminsalz oder Mischungen derselben erhalten werden, erlaubt die-fraktionierte Kristallisa tion die Abtrennung des entsprechenden Aminsalzes .des gewünschten V-Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Infolge ihrer Stabilität werden indessen die Mond aminsalze bevorzugt.
Gemäss einer empfehlenswerten Ausfüh rungsform dieses Isolierungsverfahrens für den 5'-Isomeren wird eine wässerige Lösung, die sowohl den Lactoflavin-5'-monopliosphor- säureester und die andern Isomeren enthält, auf ein pH von mindestens etwa 4 und mit Vorteil innerhalb eines p,1-Intervalles von etwa 4-10 mittels Diätlisnolamin oder Mor- pholin gebracht, worauf die Lösung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, z. ss. ;
Äthanol, Isopropanol oder Aceton, fraktio niert kristallisiert wird, um die entsprechen den Salze des Lactoflavin-5'-nioi@ophosphor- säureesters zu gewinnen.
Wie oben hervor gehoben, werden entweder die Mono- oder Di= ; aminsalze oder Mischungen derselben erhal ten, je nach dem verwendeten PH- Die Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin - 5'- monophosphorsäureesters können durch Behandlung mit einer geeigne-, ten Säure in den freien Lactoflavin-5'-moiio- phosphorsäureester übergeführt werden.
Da bei ist zu beachten, dass bei den Monosalzen wenigstens ein Äquivalent der Säure und bei den Di-salzen wenigstens zwei Äquivalente , verwendet werden.
<I>Beispiel:</I> Zu 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxychlorid werden langsam, unter gutem Schütteln und Kühlen auf Zimmertemperatur, 7,2 g (0,4 Mol) -, Wasser zugegeben. Die Mischung wird ge rührt, bis die Entwicklung von Chlorwasser stoff beendet ist, und während ungefähr 1.6 Stunden stehengelassen.
Dann werden 3,78 g Dihydrolactoflavin unter Rühren zugesetzt. Letzteres löst sich nach kurzer Zeit auf unter Entwicklung von Chlorwasserstoff. Die Lö sung wird während 5 Stunden bei Raum temperatur gerührt und hernach in 600 em3 @Vasser gegossen.
Der so erhaltenen Lösung i von Dihydrolactoflavin - monophosphorsäur e- ester wird so viel Wasserstoffperoxyd zuge geben, dass Oxydation eintritt, was ersichtlich ist am Farbwechsel auf typisch gelb und am Erscheinen der typischen Fluoreszen7 des i Lactoflavin - monophosphorsäureesters. Nach Stehen kristallisiert der Lactoflavin-mono- phosphorsäureester aus. Die Verbindung schmilzt bei ungefähr 195 C.
Deren Analyse stimmt auf die Formel C17H19N406P03H2. , Die optische Drehung einer 2 /aigen Lösung in konzentrierter Salzsäure ist. [a]181- -I-44,5 . Bei potentiometrischer Titration mit Natrium- hydroxyd zeigt die Titrationskurve nach Zu gabe von einem genauen Äquivalent Alkali , bei pH 4,5 ein wohldefiniertes Knie. Ein zweites Knie bei pH 8,5 zeigt die Kurve nach Zugabe eines zweiten Äquivalenten Alkali.
2,0 g der so erhaltenen Lactoflavin-5'- nionophosphorsäureester und andere Lacto- i'lavin-moiiophosphorsäureester-isomere enthal tenden Mischung werden in 20 cm3 Wasser aufgeschlämmt Lind mit so viel Diäthanolamin -ersetzt, dass das PH auf 8,8 steigt und Auf lösung erfolgt. Die Lösung wird von -tuigelö- stem Material filtriert. Durch Zusatz einer kleinen Menge Essigsäure wird das pn auf -1,8 gebracht. Man gibt 5 Volumen Äthanol zu.
Der dadurch erzeugte Niederschlag wird abfiltriert und in 10 Teilen Wasser durch Zusatz von Diäthanolamin bei einem pH von 8,0 wieder gelöst. Die Lösung wird von ein wenig ungelöstem Material abfiltriert. Das p$ wird durch Zusatz von Essigsäure auf 4,8 gebracht. Beim Versetzen mit 5 Volumen Äthanol fällt das Monodiäthanolaminsalz des Lactoflavin-monophosphorsäureesters aus. Das Produkt -wird abfiltriert, mit Äthanol ge waschen und getrocknet.
Es besteht im wesent lichen aus reinem Lactoflavin-5'-monophos- phorsäureester - monodiäthanolaminsalz. Eine Mischung der Monodiäthanolaminsalze der andern Isomeren ist in der Mutterlauge ent- halten und kann daraus durch Verdampfen im Vakuum isoliert werden.
Das Lactoflavin - 5' - monophosphorsäure- ester-monodiäthanolaminsalz wird als gut wasserlösliehes gelbes Pulver erhalten, wel ches 2 Moleküle Kristallwasser enthält. Das px seiner wässerigen Lösung ist ungefähr 4 bis 5.
Die Verbindung wird beim Erhitzen dunkel und schmilzt bei 201-203 C unter Zersetzung. ' 5 g des Monodiäthanolaminsalzes des Lactoflavin-monophosphorsäureesters werden in 75 cm3 Wasser gelöst und mit 7 ems kon zentrierter .Salzsäure versetzt. Lactoflavin-5'- monophosphorsäureester fällt aus und wird abfiltriert.
Process for the preparation of a lactoflavin monophosphoric acid ester. The invention relates to a novel process for producing a lactoflavin ionophosphoric acid ester and for isolating the known lactoflavin 5'-monophosphoric acid ester from the mixtures of the same with other isomers of lactoflavin monophosphoric acid ester which are formed during the production thereof.
The subject of the present patent is a process for the preparation of the lactoflavin-5'-monophosphoric acid ester, characterized in that dihydrolactoflavin is phosphorylated with a chlorophosphoric acid, the reaction product is hydrolyzed to the monophosphorylated dihydrolactoflavin, this is converted into the phosphorylated lactoflavin by oxidation and from the isomer obtained, Mixture the 5'-isomer is isolated.
The term chlorophosphoric acid, as used here, denotes two compounds, that is, monochlorophosphoric acid and dichlorophosphoric acid, the terms of which are the following: (HO) 2POC1 and HOPOCl2. The formation of these two connec tions takes place by reaction between phosphorus oxychloride and water or between phosphorus oxychloride and phosphoric acid.
The chlorophosphoric acids are easily obtained by reacting phosphorus oxychloride with 1-2 moles of water. The reaction takes the following course
EMI0001.0032
POCls <SEP> -I- <SEP> <B> 1E120 </B> <SEP>) <SEP> F10POC1z <SEP> -I- <SEP> FICl
<tb> POCls <SEP> -I- <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP> - <U> -> </U> <SEP> (HO) aPOCI <SEP> -I- <SEP> 2 < SEP> HCl The two compounds are also formed when phosphorus oxychloride is reacted with orthophosphoric acid. For example, a suitable chlorophosphoric acid reagent can be prepared by slowly adding 61.3 g (0.4 mol) of phosphorus oxychloride to 19.6 g (0.2 mol)
anhydrous orthophosphoric acid, with stirring and cooling to room temperature who must be obtained. The reaction mixture is stirred for about 1 hour. In order to obtain the highest possible yield of chlorophosphoric acid, the product is left to stand overnight. The waiting time is not essential, however, because chlorophosphoric acid forms easily and in good yield as soon as phosphorus oxychloride reacts with water or phosphoric acid.
It goes without saying that the phosphoric acid can also be aqueous, in which case both reactions contribute to the formation of the chlorophosphoric acid, i.e. a reaction between the phosphorus oxychloride and water, and a reaction between the phosphorus oxychloride and the orthophosphoric acid . The chlorophosphoric acid can of course also be formed in the presence of the body to be phosphorylated, in which case it then immediately reacts with the latter.
The products of phosphorylation with chlorophosphoric acid include the mono- (chlorophosphoric acid salts and the mono- (dichlorophosphoric acid) salts of the dihydrolactoflavin esters with phosphoric acid, polyphosphoric acids, chlorine-containing phosphoric acid and chlorine-containing polyphosphoric acids. Cyclic phosphoric acid esters of the intermediates can also be formed the.
The degree of phosphorylation depends on the length of time during which the starting compounds can react with the chlorophosphoric acid. The reactions given here represent a synthesis with hypothetical intermediate structures. Although the foregoing and the following reaction schemes are based on what is considered the most likely course of the reaction, it is understood that the invention is in no way based on any reaction theory or Intermediate structure is limited.
In the case of dichlorophosphoric acid, the reaction can be formulated as follows:
EMI0002.0021
The above monochlorophosphorylated product can be further chlorophosphorylated,
EMI0002.0024
each <SEP> after <SEP> response time <SEP> as <SEP> follows:
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> fi <SEP> i (a) <SEP> -i- <SEP> HOPOC12 <SEP> RO-P-O-P-OH <SEP> HOPOC12 <SEP> (b)
<tb> C1 <SEP> C1
<tb> 0 <SEP> -0
<tb> and / or <SEP> RO-P-O-P-CI <SEP> HOPOC12 <SEP> (c)
<tb> OH <SEP> Cl The compounds (b) and (c) can be further phosphorylated.
In the case of the monochlorophosphorus salts, the corresponding reactions are as follows
EMI0002.0027
After further treatment with monochlorophosphoric acid results. the following:
EMI0002.0030
The compound (e) can be further phosphorylated. In the above formulas, ROH denotes dihydrolactoflavin.
The hydrolysis of the intermediate products of the reaction with the chlorophosphoric acids first causes the splitting off of the salt-forming HOP0C.12 or (H0) 2P0C1, followed by the release of the monophosphoric acid ester, which can accordingly be referred to as ROPO (OH) 2. The degree of phosphorylation is irrelevant, since the end product of the hydrolysis is in each case the monophosphoric acid ester of the intermediate product.
The main product is a 5 'ester, but a small amount consists of the other isomers, i.e. the 2', 3 'and V isomers. Although the aforementioned ester salts of the intermediates can be isolated e.g. B. in order to clean them, it is not necessary. This isolation before they are converted into lactoflavin monophosphoric acid ester. The reaction mixture obtained by phosphorylation can simply be poured into several volumes of water and left to stand for a few hours.
During this time, the remaining unreacted chlorophosphoric acids hydrolyze completely to phosphoric acid and hydrochloric acid, and the intermediate ester salts also undergo hydrolysis, which leads to the monophosphoric acid esters of dihydrolactoflavin. The latter can then easily be converted into lactoflavin monophosphoric acid.
Thus, the dihydrolactoflavin monophosphoric acid ester obtained by hydrolysis, during which it is in solution, for example with hydrogen peroxide, can be oxidized to the stable lactoflavin monophosphoric acid ester.
As emphasized above, in addition to the main product, namely the lactoflavin 5'-monophosphoric acid ester, a small amount of the lactoflavin 2'-, -3'- or -4'-monaphosphoric acid ester is formed. Of these isomers of lactoflavin monophosphoric acid ester, only the 5'-isomer is fully biologically active. It is therefore desirable to obtain this substance in a pure form, free from the other isomers.
However, the properties of the various isomers are so largely similar that it is difficult to separate the 5'-isomer from the others.
It has been found that the diethanolamine and morpholine salts of lactoflavin-5'-monophosphoric acid ester are so different in their solubility properties from the corresponding salts of the other isomers that the separation of the desired 5'-isomer in pure form is expediently carried out via these amine salts.
These new diethanolamine and morpholine salts of lactoflavine-5'-monophosphoric acid ester are also physiologically valuable compounds, because they contain the biologically active 5'-isomers in a readily soluble, non-toxic form which is suitable for therapeutic use. These salts can easily be converted into the free 5'-monophosphoric acid ester by simply acidifying their aqueous solution, eg. B. with a mineral acid, where the 5'-ester crystallizes in pure form.
The mixture containing the lactoflavine 5'-monophosphoric acid ester and the other isomers is z. B. simply reacted with diethanolamine or morpholine, a mixture of the corresponding amine salts of the isomers of the lactoflavine monophosphoric acid ester being formed.
The amine salts of the lactoflavin-5'-monophosphoric acid ester are then separated off from the mixture, for example by fractional crystallization. The latter can be done like this. that a water-miscible solvent, such as ethanol, isopropanol or acetone, is added to an aqueous solution of the mixture of the amine salts of the isomers.
The corresponding amine salts of the other isonates remain in solution in the mother liquor. The separated diethanolamine and morpholine salts of the lactoflavin-5'-monophosphoric acid ester are then easily converted into the free ethoflavin-5'-monophosphoric acid ester by treatment with a suitable acid converted.
During the reaction of the mixture of the isomers of the lactoflavin monophosphoric acid ester with the aforementioned amines, either the mono- or the diamine salts or mixtures thereof are formed, depending on the amount of amine used.
When titrating with diethanolamine or morpholine, the potentiometric titration curve of the lactoflavin monophosphoric acid ester shows a sharp knee at about pH 4, at the moment when one mole of the amine per mole of the lactoflavin monophosphoric acid ester has been added.
When another mole of amine is added, the pH slowly rises to about 7; where a barely perceptible knee in the curve shows that the second 1M1 amine is only very weakly bound in the di-salt. When adding a water-miscible solvent, e.g.
B. ethanol, isopropanol or acetone, for the aqueous solution of the amine salts, a salt precipitates which, depending on the pH at which the precipitation takes place, consists of the mono- or diamine salt, or a mixture of the same. At a pH of around 4, the precipitated salt is practically exclusively a monoamine salt, while at a pH of at least around 9 the precipitated salt is mainly a diamine salt.
With p11 values in between, mixtures of the mono and diamine salts are obtained, although at pH 7 the main thing is that the monoamine salt is obtained.
Regardless of whether the mono- or diamine salt or mixtures thereof are obtained, the fractional crystallization permits the separation of the corresponding amine salt of the desired V-isomer of the lactoflavin monophosphoric acid ester. Due to their stability, however, the moon amine salts are preferred.
According to a recommended embodiment of this isolation process for the 5'-isomer, an aqueous solution containing both the lactoflavin-5'-monophosphoric acid ester and the other isomers is brought to a pH of at least about 4 and advantageously within a p.1 -Intervales of about 4-10 brought by means of diet lisnolamine or morpholine, whereupon the solution with a water-miscible solvent, z. ss. ;
Ethanol, isopropanol or acetone, is crystallized in fractional form in order to obtain the corresponding salts of the lactoflavin-5'-nioi @ ophosphoric acid ester.
As pointed out above, either the Mono- or Di =; amine salts or mixtures thereof are obtained, depending on the PH used. The diethanolamine and morpholine salts of lactoflavin 5'-monophosphoric acid ester can be converted into the free lactoflavin 5'-moiio-phosphoric acid ester by treatment with a suitable acid.
It should be noted that at least one equivalent of the acid is used for the monosalts and at least two equivalents for the di-salts.
<I> Example: </I> To 61.3 g (0.4 mol) of phosphorus oxychloride are slowly added 7.2 g (0.4 mol) of water, with good shaking and cooling to room temperature. The mixture is stirred until the evolution of hydrogen chloride has ended and left to stand for about 1.6 hours.
Then 3.78 g of dihydrolactoflavin are added with stirring. The latter dissolves after a short time with evolution of hydrogen chloride. The solution is stirred for 5 hours at room temperature and then poured into 600 em3 @Vasser.
The resulting solution of dihydrolactoflavin-monophosphoric acid ester is added so much hydrogen peroxide that oxidation occurs, which is evident from the color change to typically yellow and the appearance of the typical fluorescence7 of the lactoflavin-monophosphoric acid ester. After standing, the lactoflavin monophosphoric acid ester crystallizes out. The compound melts at about 195 C.
Their analysis agrees with the formula C17H19N406P03H2. , Is the optical rotation of a 2 / aigen solution in concentrated hydrochloric acid. [a] 181- I-44.5. With potentiometric titration with sodium hydroxide, the titration curve shows a well-defined knee at pH 4.5 after the addition of an exact equivalent of alkali. A second knee at pH 8.5 shows the curve after adding a second equivalent of alkali.
2.0 g of the lactoflavin-5'-ionophosphoric acid ester and other lactoflavin-moiiophosphoric acid ester isomers obtained in this way are slurried in 20 cm3 of water and replaced with so much diethanolamine that the pH rises to 8.8 and Dissolution takes place. The solution is filtered from thoroughly dissolved material. The pn is brought to -1.8 by adding a small amount of acetic acid. 5 volumes of ethanol are added.
The resulting precipitate is filtered off and redissolved in 10 parts of water by adding diethanolamine at a pH of 8.0. The solution is filtered off from a little undissolved material. The p $ is brought to 4.8 by adding acetic acid. When 5 volumes of ethanol are added, the monodiethanolamine salt of the lactoflavin monophosphoric acid ester precipitates. The product is filtered off, washed with ethanol and dried.
It essentially consists of pure lactoflavin 5'-monophosphoric acid ester - monodiethanolamine salt. A mixture of the monodiethanolamine salts of the other isomers is contained in the mother liquor and can be isolated therefrom by evaporation in vacuo.
The lactoflavin - 5 '- monophosphoric acid ester monodiethanolamine salt is obtained as a readily water-soluble yellow powder, which contains 2 molecules of crystal water. The px of its aqueous solution is about 4 to 5.
The compound darkens on heating and melts at 201-203 C with decomposition. '5 g of the monodiethanolamine salt of the lactoflavin monophosphoric acid ester are dissolved in 75 cm3 of water and 7 ems of concentrated hydrochloric acid are added. Lactoflavin-5'-monophosphoric acid ester precipitates and is filtered off.