Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12. Vitamin B12, dessen Vorkommen in Leber bekannt ist, wird auch von einer Reihe von 2Tikroorganismen gebildet. Man hat Vitamin B1.) bereits aus Kulturfiltraten solcher Mikro organismen, insbesondere von Actinomyceten, 21ewonnen.
Es wurde nun gefunden, dass man zu be sonders reinen Vitamin-B12-Präparaten ge langt, wenn man nicht von den Kulturfil traten ausgeht, sondern von den Zellen der Mikroorganismen selbst. Gegenstand der Er findung ist somit ein Verfahren zur Gewin nung von Vitamin Bit, dadurch gekennzeich net, dass man Actinomyceten in einer Nähr lösung kultiviert, dann, ehe ein überwiegen der Teil des Vitamins B12 in die Nährlösung übergetreten ist, die Zellen abtrennt und aus den Zellen das Vitamin B12 extrahiert.
Man kommt zu besonders hohen Ausbeuten, wenn man das Wachstum der Zellen abbricht, bevor ein überwiegender Teil des Vitamins B12 in die Nährlösung übergegangen ist. Dieses Ver fahren hat den Vorteil, dass man bei der Kul tur der Mikroorganismen mit kürzeren Zeiten auskommt und infolgedessen in der gleichen Apparatur mehr Ansätze durchführen kann.
Überraschenderweise hat sich nämlich ge zeigt, dass das Vitamin B12 nicht sofort, nach dem es gebildet ist, in die Nährlösung über tritt, sondern dass es zunächst in den Zellen gespeichert bleibt. Zu einer Zeit, zu der in der Nährlösung noch kaum Vitamin B12 ge funden wird, ist der Gehalt der Zellen an Vitamin B12 bereits hoch. Erst später geht das Vitamin, vermutlich infolge Alterungs- und Autolyseprozessen, in die Nährlösung über und kann dort aufgefunden werden.
Wenn man die Zellen abtrennt, bevor ein überwiegender Teil des Vitamins in die Nährlösung übergegangen ist, und dann das Vitamin aus den abgetrennten Zellen extra hiert, umgeht man die Schwierigkeiten, die sich bei der Gewinnung des Vitamins aus der Nährlösung infolge der darin enthaltenen Ballaststoffe ergeben.
A115 den Zellen lässt sich das Vitamin B12 leicht extrahieren, z. B. in an sich üblicher Weise.
Man kann so vorgehen, dass man die Zel len, gegebenenfalls nachdem man sie bei nor malen Temperaturen mit Wasser gewaschen hat, einer Extraktion mit Wasser bei Tem peraturen über 50 unterwirft. Man kann das Vitamin B12 aber auch dadurch in Lösung bringen, dass man die Zellen mit organischen Lösungsmitteln behandelt und dann mit Was ser oder wasserhaltigen organischen Lösungs mitteln extrahiert.
Als Mikroorganismen sind z. B. Actino- myces griseus und Actinomyces antibioticus gut geeignet.
Aus den Extraktionslösungen lässt sich das Vitamin B12 nach den über die Anreicherung des Antiperniciosafaktors aus Leber bekann ten Methoden in gereinigter Form gewinnen. Hierfür kommen Adsorptionsverfahren in Be- tracht, wie z. B. Adsorption an Kohle und Elut.ion mit wässrigen Alkoholen, oder Fä.l- lungsverfahren, wie z. B. eine Ausfällung mit Neutralsalzen, insbesondere Ammoniumsulfat.
Die so gewonnenen Präparate lassen sieh therapeutisch, insbesondere als Mittel gegen pernieiöse Anämie anwenden.
<I>Beispiel.:</I> 300 Liter sterile wässrige Nährlösung ent haltend
EMI0002.0014
900 <SEP> g <SEP> Rohrzucker,
<tb> 1500 <SEP> g <SEP> Invertzucker,
<tb> 1500 <SEP> g <SEP> CTly <SEP> cerin,
<tb> 1"00g <SEP> (NH.1)2HP0.1,
<tb> 1500 <SEP> g <SEP> N <SEP> aCl,
<tb> 600 <SEP> g <SEP> K.HP0.1,
<tb> 300 <SEP> g <SEP> M-S0.1. <SEP> 711.0,
<tb> 120 <SEP> g <SEP> CaCld <SEP> . <SEP> 6H.0,
<tb> 6 <SEP> g <SEP> FeS04. <SEP> 7<B>1</B>1.0,
<tb> 3 <SEP> g <SEP> ZnS04. <SEP> 7H0,
<tb> 0,3 <SEP> g <SEP> CoS0.1. <SEP> 7H00,
<tb> ?000 <SEP> g <SEP> Eiweisshydrolysat, werden mit. Sporen von Actinomyces griseus beimpft.
Unter Wahrung der Sterilität. bläst man in die gut gerührte Nährlösung pro Mi nute 300 Liter Luft ein. Nach 70 Stunden wird das gebildete llyeel abgeschleudert. Man erhält 6000 g Myeel mit insgesamt 180 ing Vitamin B12. Das feuchte Mycel wird unter Rühren in 60 Liter Wasser von 90 eingetra gen. Dabei sinkt die Temperatur auf 80 . Man kühlt schnell auf Zimmertemperatur ab und schleudert die Zellbestandteile ab.
Die Lösung wird unter vermindertem Druck auf ? Liter eingeengt und mit 4 Liter 96 % igeni Alkohol versetzt. Der dabei auftretende Niederschlag wird durch Abschleudern beseitigt und mit 6@i ,ö igeni Alkohol gewaschen. Die Lösung wird mit der Wasehflüssigkeit vereinigt,
durch Abdestillieren unter vermindertem Druck von Alkohol befreit und mit Wasser auf ein Volumen von 3 Liter gebracht. Man rührt die trübe Lösung eine Stunde lanb mit 1.20 g Carboraffin (Markenprodukt), schleudert die Kohle ab, wäseht sie mit. Was ser und eluiert sie zweimal mit. je 6 Liter 65%igem Alkohol. Die vereinigten Eluate werden eingeengt. auf ? Liter.
Die so gewon nene rötlichgelbe Lösung enthält nach den Ergebnissen des mikrobiologischen Testes 60m- Vitamin B1. in einem Reinheitsgrad, der für die klinische Anwendung vollkommen ausreicht.
Das Vitamin 1312 kann von wei teren Ballaststoffen befreit werden, indem man beispielsweise die .Lösung mit Ammon- sulfat sättigt und den dabei entstehenden Niederschlag, der fast das gesamte Vitamin enthält, abtrennt. Man kann die so erhaltenen Präparate auch nach den Methoden der chro- matographisehen Adsorptionsanalyse weiter reinigen.
Process for obtaining vitamin B12. Vitamin B12, which is known to be found in the liver, is also produced by a number of microorganisms. Vitamin B1.) Has already been obtained from culture filtrates of such microorganisms, in particular from actinomycetes.
It has now been found that particularly pure vitamin B12 preparations are obtained if one does not proceed from the culture files, but from the cells of the microorganisms themselves. The object of the invention is thus a method for obtaining vitamin bit , characterized in that actinomycetes are cultivated in a nutrient solution, then, before most of the vitamin B12 has passed into the nutrient solution, the cells are separated off and the vitamin B12 is extracted from the cells.
Particularly high yields are achieved if the growth of the cells is stopped before a major part of the vitamin B12 has passed into the nutrient solution. This process has the advantage that you can manage the culture of the microorganisms with shorter times and as a result, more approaches can be carried out in the same apparatus.
Surprisingly, it has been shown that vitamin B12 does not pass into the nutrient solution immediately after it is formed, but that it initially remains stored in the cells. At a time when hardly any vitamin B12 is found in the nutrient solution, the vitamin B12 content of the cells is already high. Only later does the vitamin go into the nutrient solution, presumably as a result of aging and autolysis processes, and can be found there.
If the cells are separated off before a major part of the vitamin has passed into the nutrient solution, and the vitamin is then extracted from the separated cells, one avoids the difficulties that arise in extracting the vitamin from the nutrient solution as a result of the dietary fiber it contains .
A115 the cells can easily extract the vitamin B12, e.g. B. in a conventional manner.
One can proceed in such a way that the cells, if necessary after they have been washed with water at normal temperatures, are subjected to an extraction with water at temperatures above 50. The vitamin B12 can also be dissolved by treating the cells with organic solvents and then extracting them with water or water-based organic solvents.
As microorganisms, for. B. Actinomyces griseus and Actinomyces antibioticus are well suited.
The vitamin B12 can be obtained in purified form from the extraction solutions according to the methods known from the enrichment of the antiperniciosa factor from the liver. For this purpose, adsorption processes come into consideration, such as B. Adsorption on charcoal and Elut.ion with aqueous alcohols, or Fä.l- lungsverfahren such. B. a precipitation with neutral salts, especially ammonium sulfate.
The preparations obtained in this way can be used therapeutically, in particular as a remedy for pernicious anemia.
<I> Example .: </I> Contains 300 liters of sterile aqueous nutrient solution
EMI0002.0014
900 <SEP> g <SEP> cane sugar,
<tb> 1500 <SEP> g <SEP> invert sugar,
<tb> 1500 <SEP> g <SEP> CTly <SEP> cerin,
<tb> 1 "00g <SEP> (NH.1) 2HP0.1,
<tb> 1500 <SEP> g <SEP> N <SEP> aCl,
<tb> 600 <SEP> g <SEP> K.HP0.1,
<tb> 300 <SEP> g <SEP> M-S0.1. <SEP> 711.0,
<tb> 120 <SEP> g <SEP> CaCld <SEP>. <SEP> 6H.0,
<tb> 6 <SEP> g <SEP> FeS04. <SEP> 7 <B> 1 </B> 1.0,
<tb> 3 <SEP> g <SEP> ZnS04. <SEP> 7H0,
<tb> 0.3 <SEP> g <SEP> CoS0.1. <SEP> 7H00,
<tb>? 000 <SEP> g <SEP> protein hydrolyzate, with. Inoculated spores of Actinomyces griseus.
While maintaining sterility. one blows 300 liters of air per minute into the well-stirred nutrient solution. After 70 hours, the llyeel formed is spun off. 6000 g of Myeel with a total of 180 mg of vitamin B12 are obtained. The moist mycelium is added to 60 liters of 90 liters of water while stirring. The temperature drops to 80. You cool down quickly to room temperature and throw off the cell components.
The solution is under reduced pressure to? Liter and mixed with 4 liters of 96% alcohol. The resulting precipitate is removed by centrifuging and washed with 6 @ i, igeni alcohol. The solution is combined with the washing liquid,
freed from alcohol by distilling off under reduced pressure and brought to a volume of 3 liters with water. The cloudy solution is stirred for one hour with 1.20 g of carboraffin (branded product), the charcoal is spun off and washed with it. Water and it elutes twice with. 6 liters of 65% alcohol per 6 liters. The combined eluates are concentrated. on ? Liter.
According to the results of the microbiological test, the reddish-yellow solution obtained in this way contains 60m-vitamin B1. in a degree of purity that is completely sufficient for clinical use.
Vitamin 1312 can be freed from further dietary fiber by, for example, saturating the solution with ammonium sulfate and separating off the precipitate that forms, which contains almost all of the vitamin. The preparations obtained in this way can also be further purified by the methods of chromatographic adsorption analysis.