Verfahren zur Herstellung der kristallinen Modifikation der Farbstoffkomponente des gelben Oxydationsfermentes. Im Schweiz. Patent Nr. 178815 ist ein Verfahren zur Herstellung des in tierischem und pflanzlichem Zellmaterial vorkommenden gelben Oxydationsfermentes aus seinen aus den genannten Produkten erhältlichen wäs serigen Rohlösungen beschrieben.
Es wurde festgestellt, dass dieses Ferment aus einem gelben Farbstoff besteht, der an eine Eiweisskomponente gebunden ist und durch Umlagerung in alkalischem Medium in eine kristallisierte Modifikation übergeht.
Gegenstand vorliegenden Patentes ist nun ein Verfahren zur Herstellung der kristalli nen Modifikation der Farbstoffkomponente des gelben Oxydationsfermentes, die als acces- sorischer Nährstoff Verwendung finden soll.
Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, d@ass man gelbes Oxydationsferment mit einem eiweissdenaturierenden, mit Wasser misch baren Lösungsmittel für die Farbstoffkom- ponente unter Bedingungen behandelt, bei denen eine Koagulierung des Eiweissanteils des Fermentes erfolgt und aus der erhaltenen eiweissfreien Lösung den gelben Farbstoff in alkalische Lösung bringt,
nach erfolgter Um lagerung ansäuert und mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel das Umlage- rungsprodukt extrahiert.
Als Ausgangsmaterial für das Verfah ren kann man sowohl das vorgängig aus tierischen oder pflanzlichem Zellmaterial, das man zweckmässig vorher gewaschen, getrock net oder zerkleinert hat, wie zum Beispiel Unterhefe, isolierte gelbe Oxydationsferment, als auch direkt das Ferment enthaltendes Zellmaterial verwenden.
Als Lösungsmittel, die den Farbstoff lösen und Eiweiss koagulieren und denaturie- ren, können zum Beispiel organische wasser lösliche Lösungsmittel, wie Methyl-, Äthyl- und andere Alkohole, Aceton usw., für sich oder in Mischung mit Wasser, zur Anwen dung gelangen. Dem eiweissdenaturierenden Lösungsmit tel oder Lösungsmittelgemisch für den Farb stoff, kann man auch Säuren oder saure Salze zusetzen, wodurch die Zerlegung des Oxyda tionsfermentes beschleunigt wird.
Man kann auch mit sauer reagierenden wässerigen Lösungen, zum Beispiel verdünn ten Säuren oder Lösungen saurer Salze die Abspaltung des Farbstoffes unter Koagulie- rung der Eiweisskomponente bewirken.
In allen Fällen empfiehlt es sich bei der Zerlegung des Fermentes erhöhte Tempera turen anzuwenden, da dadurch die Koagu- lierung der Eiweisskomponente begünstigt wird.
Die bei der Zerlegung des gelben Oxyda tionsfermentes erhaltenen Lösungen der Farbstoffkomponente sind, wie sich zeigte, katalytisch unwirksam, weisen aber bei grüner im Sichtbaren ein Ab sorptionsspektrum auf, das dem der ursprüng lichen Fermentlösung sehr ähnlich ist. Gegen das Absorptionsspektrum des Fermentes sind seine Banden um 15 bis 20 ,u nach Blau ver schoben. Aus diesen eiweissfreien Lösungen kann die nicht kristallisierbare Form des Farbstoffes durch vorsichtige Verdampfung zur Trockne, zweckmässig im Vakuum in Form eines gelben Pulvers isoliert werden.
Die Umlagerung des Farbstoffes in seinen alkalischen Lösungen, die entweder ,durch Zugabe von Alkali zu den vom Eiweiss be freiten Lösungen oder durch Lösen der isolierten Farbstoffkomponente in Lauge er halten werden können, in die kristallisier bare, in mit Wasser nicht mischbaren Lö sungsmitteln, wie Chloroform, lösliche Modi fikation erfolgt zum Beispiel schon durch blosses Stehenlassen der alkalischen Lösung; man kann sie jedoch :durch Erwärmung oder durch Bestrahlung mit Licht sehr beschleu nigen.
Die Extraktion des Umlagerungspro- duktes aus dieser Lösung erfolgt dann nach dem Ansäuern .derselben am besten mit Chloroform, nach dessen Eindampfen die reine kristallisierte Modifikation des Farb stoffes zurückbleibt, die aus Wasser um- kristallisiert werden kann. <I>Beispiel 1:
</I> Das gelbe Oxydationsferment, wie es ge mäss dem Verfahren des Schweiz. Patentes Nr. 178815 erhalten werden kann, wird bei 3,8 mit einer Mischung von 1 Vol. Wasser und 3 Vol. Methanol gesehüttelt. Dadurch wird das Eiweiss denaturiert, während -deT Farbstoff in Lösung geht. Nach der Ent fernung des ungelösten Eiweisses (zum Bei spiel durch Zentrifugieren) kann :die eiweiss freie Lösung des Farbstoffes, die grün fluo resziert, im Vakuum eingedampft werden, wobei ein ,gelbes Pulver erhalten wird, das den Farbstoff des Oxydationsfermentes dar stellt.
Der eiweissfreie Farbstoff wird in n(2 Natronlauge gelöst und mit einer Metall fadenlampe belichtet. Dabei wird er um gelagert und geht beim Ansäuern in ein Pro dukt über, das man durch Extraktion mit Chloroform von der wässerigen Lösung ab trennt. Die Chloroformlösung wird dann vor sichtig konzentriert, wobei sich der um gelagerte Farbstoff abscheidet. Er wird durch Umkristallisation aus Wasser in schön gelb gefärbten Nadeln erhalten. Das Produkt kann im Hoehvakuum unzersetzt sublimiert werden. Der Farbstoff schmilzt unter Zer setzung bei<B>320'.</B>
Statt zu belichten, kann man die eiweiss freie Lösung,des Farbstoffes mit Alkali auf eine Konzentration von i/2 normal bis normal NaOH bringen und 48 Stunden stehen lassen. Hierauf erfolgt die Aufarbeitung wie oben.
Statt die alkalische Lösung stehen zu las sen, kann man sie auch etwa. 2 Stunden lang auf etwa 50 bis 60 erwärmen. <I>Beispiel 2:</I> 50,0 g Unterhefe (Trockenhefe) werden mit Methanolwasser (1 Vol. Wasser, 3 Vol. Methanol) 3 X \?4 Stunden bei 318' geschüt telt, wobei :der Farbstoff in Lösung geht. Nun wird filtriert, abgesaugt und :gegebenen falls mehrfach wiederholt.
Dann wird im Vakuum auf 5'00 .cm' eingeengt, die wässe rige Lösung mit Chloroform ausgeschüttelt, mit Salzsäure wieder kongosauer .gemacht, mit Chloroform;
ausgeschüttelt, dann mit zehnfach normal Natronlauge so alkalisiert, dass sie halb normal in bezug auf Na.0H wird, dann 2 Stunden im Licht einer starken Metallfadenlampe belichtet, unter Eisküh- lung mit Chloroform unterschichtet, bis zur korrbwauren Reaktion angesäuert und aus geschüttelt. Hierbei geht der grünfluoreszie rende Farbstoff ins Chloroform.
Setzt man dem zur Extraktion verwende- ten Gemisch von Wasser und Methanol so viel Salzsäure zu, dass das Lösungsgemisch etwa 5 % freie Säure enthält, so ist die Ex traktion schon nach etwa '/3 der sonst not wendigen Zeit beendet. Allerdings sind die so erhaltenen Lösungen nicht ganz so rein wie die ohne Säurezusatz erhaltenen.
Statt wässerigem Methanol lä.sst sich auch wässeriger Äthylalkohol oder Aceton oder wässeriger Alkohol mit Zusatz einer kleinen Menge von mit Wasser wenig oder nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie 4ther, Essigäther oder dergleichen, verwen den. An Stelle der Salzsäure können auch Schwefelsäure, Phosphorsäure oder saure Salze, wie beispielsweise Bisulfat, benutzt werden.
<I>Beispiel 3:</I> 10 kg Hefe werden mit 20 Liter einer 10%igen Salzsäure in einem geeigneten Ge fäss so lange .gerührt, bis eine gleichmässige Masse .entstanden ist. Dann wird langsam auf etwa 3'0 bis<B>60'</B> erwärmt und bei dieser Temperatur einige Stunden gehalten. Nun wird,die :gesamte Reaktionsmasse abgesaugt.
In der Flüssigkeit, die eine schöne grünlich- gelbe Farbe aufweist, findet man den gröss ten Teil des gelben Farbstoffes aus dem Oxydationsferment in verhältnismässig reiner Form vor. Er wird aus derselben, wie oben beschrieben, isoliert.
<I>Beispiel J:</I> 2 kg Hefe werden mit 4 Liter einer 10 % i.gen Trichloressigsäurelösung im Mörser gut durchgerieben, bis eine homogene Masse entstanden ist. Dann wird bei Zimmer- temperatur etwa 10 Stunden stehen gelassen und, nun abfiltriert. Die erhaltenen Lösungen werden dann, wie in Beispiel 2 erwähnt., weiter auf gearbeitet.
Process for the production of the crystalline modification of the dye component of the yellow oxidizing ferment. In Switzerland. Patent No. 178815 describes a process for the production of the yellow oxidizing ferment found in animal and vegetable cell material from its aqueous raw solutions obtainable from the products mentioned.
It was found that this ferment consists of a yellow dye that is bound to a protein component and changes into a crystallized modification through rearrangement in an alkaline medium.
The subject of the present patent is a process for the production of the crystalline modification of the dye component of the yellow oxidizing ferment, which is to be used as an accessory nutrient.
This process is characterized in that yellow oxidation ferment is treated with a protein-denaturing, water-miscible solvent for the dye component under conditions in which the protein content of the ferment coagulates and the protein-free solution obtained turns the yellow dye into alkaline Brings solution,
acidified after rearrangement and extracted the rearrangement product with a water-immiscible solvent.
The starting material for the process can be the cell material previously made of animal or plant material, which has been appropriately washed, dried or crushed beforehand, such as lower yeast, isolated yellow oxidizing ferment, and cell material directly containing the ferment.
Organic water-soluble solvents such as methyl, ethyl and other alcohols, acetone, etc., alone or in a mixture with water, can be used as solvents that dissolve the dye and coagulate and denature protein. Acids or acidic salts can also be added to the protein-denaturing solvent or solvent mixture for the dye, which accelerates the decomposition of the oxidizing ferment.
It is also possible to use acidic aqueous solutions, for example dilute acids or solutions of acidic salts, to cause the dye to be split off with coagulation of the protein component.
In all cases, it is advisable to use increased temperatures when breaking down the ferment, as this promotes the coagulation of the protein components.
The solutions of the dye component obtained during the decomposition of the yellow oxidizing fermentation are, as has been shown, catalytically ineffective, but when greener in the visible they have an absorption spectrum that is very similar to that of the original fermentation solution. Against the absorption spectrum of the ferment, its bands are shifted by 15 to 20 u towards blue. The non-crystallizable form of the dye can be isolated from these protein-free solutions by careful evaporation to dryness, expediently in vacuo in the form of a yellow powder.
The rearrangement of the dye in its alkaline solutions, which can be kept either by adding alkali to the solutions freed from the protein or by dissolving the isolated dye component in lye, in the crystallizable, water-immiscible solvents such as Chloroform, soluble modification takes place, for example, by simply letting the alkaline solution stand; however, it can be accelerated: by heating or by exposure to light.
The rearrangement product is extracted from this solution after acidification, preferably with chloroform, after which the pure crystallized modification of the dye remains, which can be recrystallized from water. <I> Example 1:
</I> The yellow oxidizing ferment, as it is according to the Swiss method. Patent No. 178815 is shaken at 3.8 with a mixture of 1 vol. Water and 3 vol. Methanol. This denatures the protein, while -deT dye goes into solution. After the undissolved protein has been removed (for example by centrifugation): the protein-free solution of the dye, which fluoresces green, is evaporated in vacuo to give a yellow powder that represents the dye of the oxidizing ferment.
The protein-free dye is dissolved in n (2 sodium hydroxide solution and exposed to a metal filament lamp. During this process, it is stored and, when acidified, turns into a product which is separated from the aqueous solution by extraction with chloroform. The chloroform solution is then preceded The dyestuff is visibly concentrated and the dyestuff deposited around it. It is obtained by recrystallization from water in beautifully yellow-colored needles. The product can be sublimed without decomposition under high vacuum. The dyestuff melts with decomposition at <B> 320 '. </B>
Instead of exposure, the protein-free solution of the dye can be brought to a concentration of 1/2 normal to normal NaOH with alkali and left to stand for 48 hours. This is followed by working up as above.
Instead of letting the alkaline solution stand, it can also be used. Heat to about 50 to 60 hours for 2 hours. <I> Example 2: </I> 50.0 g of lower yeast (dry yeast) are shaken with methanol water (1 vol. Water, 3 vol. Methanol) for 3 × 4 hours at 318 °, where: the dye in solution goes. It is then filtered, suctioned off and: if necessary repeated several times.
Then it is concentrated in vacuo to 5'00 cm ', the aqueous solution is shaken out with chloroform, made Congo acid again with hydrochloric acid, with chloroform;
Shaken out, then alkalized with tenfold normal sodium hydroxide solution so that it is half normal with respect to Na.0H, then exposed for 2 hours in the light of a strong metal filament lamp, covered with chloroform while cooling with ice, acidified until a corrosive reaction and shaken off. Here the green fluorescent dye goes into chloroform.
If so much hydrochloric acid is added to the mixture of water and methanol used for the extraction that the mixed solution contains about 5% free acid, the extraction is completed after about 1/3 of the otherwise necessary time. However, the solutions obtained in this way are not quite as pure as those obtained without the addition of acid.
Instead of aqueous methanol, it is also possible to use aqueous ethyl alcohol or acetone or aqueous alcohol with the addition of a small amount of organic solvents that are not very miscible or immiscible with water, such as ether, acetic ether or the like. Instead of hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or acid salts, such as bisulfate, can also be used.
<I> Example 3: </I> 10 kg of yeast are stirred with 20 liters of 10% hydrochloric acid in a suitable vessel until a uniform mass is obtained. Then it is slowly heated to about 3'0 to <B> 60 '</B> and held at this temperature for a few hours. Now the entire reaction mass is sucked off.
In the liquid, which has a beautiful greenish-yellow color, most of the yellow dye from the oxidizing ferment is found in a relatively pure form. It is isolated from the same as described above.
<I> Example J: </I> 2 kg of yeast are rubbed thoroughly with 4 liters of a 10% i.gen trichloroacetic acid solution in a mortar until a homogeneous mass is formed. The mixture is then left to stand at room temperature for about 10 hours and then filtered off. The solutions obtained are then, as mentioned in Example 2, worked up further.