5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 1 CASSETTE ET AUTOMATE DE CULTURE CELLULAIRE La presente invention se rapporte a une cassette de culture cellulaire, ainsi qu’a un automate de culture cellulaire utilisant ladite cassette. L'invention porte ainsi ici sur un dispositif pour la culture cellulaire, notamment, designe sous Ie nom de cassette. Parmi les domaines faisant appel a la culture cellulaire, celui de la therapie cellulaire est Ie moins avance en termes d’industrialisation. II existe done un besoin important de trouver une technologie capable de produire des cellules en quantite suffisante et dans des conditions optimales et securisees en vue de I’utilisation de ces cellules pour des applications therapeutiques. Certains procedes de therapie cellulaire necessitent une culture ou amplification de cellules souches avant leur reinjection chez un patient, car les quantites prelevees sont parfois insuffisantes pour avoir un effet therapeutique. II est indispensable de garantir I’integrite des proprietes therapeutiques des cellules pendant leur culture. Dans la technique actuelle, les solutions proposees pour cultiver les cellules souches ex vivo sont artisanales, tres empiriques et peu efficaces. De plus, la technique actuelle ne permet pas de produire des cellules souches en quantite suffisante pour des applications therapeutiques. II existe done un reel besoin de developper une technologie du type bioreacteur ayant une geometrie compacte et permettant de cultiver des cellules en grande quantite. L’automation des procedes d’expansion de cellules souches pour des applications de production dans un cadre therapeutique ou Clinique necessite des dispositifs de production de cellules capables de fonctionner dans des zones d’activites controlees (salle blanche), en reduisant au maximum I’intervention humaine. Les procedes de culture de cellules souches sont relativement complexes car ils mettent en oeuvre de multiples etapes d’obtention de ces cellules a partir d’un prelevement issu d’un5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 2 patient, d’isolement des cellules, de purification avant mise en culture et enfin de collecte, de purification et de conditionnement apres culture avant envoi vers les centres de traitements cliniques. L’ensemble de ces etapes doit se faire dans Ie respect de normes de fabrication imposant des conditions de sterilite et de trapabilite strictes. La multiplication des etapes de fabrication, souvent manuelles necessitent (’utilisation de zones de confinement de classes differentes afin de maintenir la sterilite du procede. La bonne conduite du procede de preparation avant et apres la culture implique souvent Ie transfer! des produits intermediates du procede d’une zone a une autre, augmentant a la fois les risques de perte de sterilite et de melange des flux de production. On connait par exemple un systeme de culture cellulaire tel que celui decrit dans Ie document US2012/0308531. La realisation de cultures en continue destinees a la production de cellules souches s’effectue au moyen d’un systeme complexe de sous-ensembles amenant les differents reactifs, cellules et gaz au reacteur. La demanderesse a egalement propose un automate de culture cellulaire automatise dans Ie document WO/2013/135817. Si la culture cellulaire est effectuee au sein d’une seule et meme poche, la manipulation de celle-ci peut s’averer delicate du fait de sa structure souple. L’invention a notamment pour but d’apporter une solution simple, efficace et economique aux problemes de I’art anterieur decrit precedemment. A cet effet, elle propose une cassette de culture cellulaire comprenant : - un boTtier au moins partiellement rigide et definissant interieurement un espace interieur dans lequel est agencee et fixee une poche de culture cellulaire definissant un volume interieur, - des conduits relies chacun a une extremite au volume interieur de la poche et ayant chacun une seconde extremite situee a I’exterieur du boTtier, et5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 3 - des vannes d’ouverture/fermeture de la circulation de fluide au travers des conduits qui sont montees sur Ie boTtier. La manipulation de la poche et des vannes s’effectue au travers du boTtier de la cassette. Seules les secondes extremites des conduits necessitent une manipulation directe. Selon I’invention, la cassette ou dispositif de culture cellulaire integre tous les elements susceptibles de poser une difficulte en termes de sterilite et dont la manipulation directe doit etre limitee. Ces elements sont preassembles dans une cassette de culture cellulaire a usage unique. Apres utilisation, il est possible d’eliminer selon les regies de bonnes pratiques I’ensemble des conduits, vannes et poche de culture utilises. De preference, I’integration d’une poche souple dans un boTtier au moins partiellement rigide facilite grandement la manipulation de la poche qui est ainsi retenue dans Ie boTtier. De meme, I’integration des vannes dans Ie boTtier permet de faciliter Ie reperage des positions des vannes qui peuvent des lors etre plus aisement manipulees par des moyens de commande d’un incubateur comme cela apparaitra dans la suite de la description. La solution d’integration des vannes dans la cassette fluidique comme moyen d’occlusion des conduits de la cassette permet d’ameliorer I’automatisation de I’utilisation de la cassette dans un procede de culture cellulaire en evitant I’utilisation d’une part des « clamps » en plastique, souvent fragilises lors d’une etape de congelation, et manoeuvrables uniquement a la main, ou d’autre part d’electrovannes a pincement necessitant la mise en place manuelle des conduits dans la machoire de I’electrovanne. Cette solution permet done d’eviter la manipulation des conduits, et les erreurs liees a la mauvaise insertion des conduits dans les electrovannes. La cassette au sein de laquelle la poche comprend un milieu de culture cellulaire peut etre congelee aussi longtemps que necessaire. Selon une autre caracteristique de I’invention, les conduits sont formes par des tubulures souples et au moins certaines des vannes5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 4 comprennent un organe mobile de pincement de la tubulure sur un element de structure du boTtier. Comme decrit precedemment, I’integration des vannes dans la casette permet de garder de fagon autonome et securisee les voies fermees (temps de stockage ou culture) pendant un temps voulu sans que cela ne necessite d’energie exterieure. Selon encore une autre caracteristique de I’invention, chaque organe mobile comprend un axe de rotation et la Peripherie radialement externe de chaque organe mobile comprend au moins une surface en spirale autour de I’axe de rotation formant une surface de pincement de la tubulure de maniere a faire varier une section de passage de fluide au travers d’une tubulure au fur et a mesure de la rotation de I’organe. Avantageusement, les vannes sont aptes a conserver une position donnee. Plus specifiquement, les vannes sont conformees de maniere a ce que les organes mobiles puissent conserver une position donnee d’ouverture ou de fermeture en I’absence d’apport d’energie. Encore plus particulierement, cela peut etre obtenu en faisant en sorte que la perpendiculaire au point de contact de la surface en spirale avec une tubulure soit orientee vers I’axe de rotation de I’organe mobile, ce qui induit un couple nul autour dudit axe. Dans une realisation particuliere, les organes mobiles sont montes dans des logements d’une platine solidaire du boTtier, chaque logement recevant un organe mobile. Lorsque Ie boitier est realise en deux demicoque inferieure et superieure, il est ainsi possible de monter la poche de culture cellulaire sur la demi-coque inferieure, de monter les organes mobiles de pincement des tubulures sur la demi-coque inferieure puis de monter la platine qui assure un maintien simultane des organes mobiles. La platine peut etre, par exemple, solidarisee par exemple par vissage, a la demi-coque inferieure. La platine permet ainsi de securiser et de faciliter I’assemblage des differentes pieces precitees. Elle permet de garantir Ie maintien des vannes.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 5 Chaque organe mobile comprend une extremite accessible depuis I’exterieur du boTtier et pourvue de premiers moyens d’accouplement en rotation destines a cooperer avec des seconds moyens d’accouplement en rotation d’un actuateur qui peut etre electromecanique. L’acces aux organes mobiles des vannes depuis I’exterieur rend possible Ie montage de la cassette sur un support adequat d’un incubateur comportant des seconds moyens d’accouplement par exemple complementaires pour I’entrainement en rotation des premiers moyens d’accouplement des vannes pour realiser une ouverture/fermeture de la circulation de liquide selon les besoins. Cette accessibilite externe rend possible la manipulation manuelle des vannes en cas de defaillance des moyens d’entrainement des vannes. Preferentiellement, les organes mobiles sont centres et guides a rotation a une extremite dans un orifice du boTtier et a une extremite opposee dans un orifice de la platine. Lorsque Ie boTtier est forme de deux demi-coques, la platine peut etre serree a I’interieur du boTtier entre ces deux demi-coques. Selon une autre caracteristique de I’invention, la poche presente une forme sensiblement parallelepipedique comportant une premiere paroi souple et une seconde paroi souple sensiblement paralleles I’une a I’autre a I’etat vide et a I’etat remplit de liquide. La forme parallelepipedique est sensiblement plane de sorte que I’epaisseur mesuree entre la premiere et la seconde parois, dans une premiere direction sensiblement perpendiculaire aux premieres et secondes parois, est tres faible, c’est-a-dire tres nettement inferieure aux deux autres dimensions de la poche mesurees dans les deux autres directions de I’espace perpendiculaires I’une a I’autre et a ladite premiere direction. On entend par « tres nettement inferieur » au moins 10 fois inferieur comme il est communement admis en mathematique. De preference, Ie rapport de la somme des surfaces de la premiere paroi et de la seconde paroi sur Ie volume interne total de la poche est5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 6 compris entre 500 et 690 cm2/L, de preference est de I’ordre de 580 cm2/L. Ce ratio assure un echange de chaleur optimal entre la poche flexible et I’exterieur lorsque la cassette est agencee dans un incubateur a enceinte thermostatee. La distance separant la premiere paroi de la seconde paroi ou epaisseur de la poche a I’etat remplit de liquide, mesuree selon une direction perpendiculaire aux premiere et seconde parois, est avantageusement inferieure a 20 mm, de preference compris entre 10 et 20 mm et encore plus preferentiellement de I’ordre de 14 mm. L’utilisation d’une faible epaisseur permet encore de faciliter la diffusion de chaleur au sein du liquide de la poche. Cela permet egalement une congelation et une decongelation uniforme des differents constituants du milieu de culture, qui plus est rapide a temperature constante. La poche selon I’invention permet de maintenir la stabilite du milieu de culture lors d’une etape de congelation par surgelation. En effet, une vitesse de congelation elevee des produits biologiques derives du sang est une garantie de preservation des constituants, d’homogeneite du milieu apres decongelation, et d’absence d’effet de concentration des seis et des proteines en solution au cceur de la masse congelee. La poche selon I’invention favorise une surgelation rapide du milieu de culture grace a sa geometrie particuliere ayant un rapport surface I volume eleve, et une faible epaisseur. Selon une autre caracteristique de I’invention, les parois de la poche sont permeables aux gaz, en particulier au CO2, et ont de preference des proprietes limitant au maximum I’adherence des cellules avec les parois de la poche. La poche est de preference souple, c’est-a-dire deformable. Elle comprend, de preference, des parois souples permeables aux gaz et aptes a retenir Ie milieu de culture et son expansion cellulaire qui est liquide. En pratique, il s’agit de retenir tout liquide contenu dans la poche. Elle presente de preference une bonne permeabilite a I’oxygene et au dioxyde5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 7 de carbone, ce qui permet une bonne aeration du contenu de la poche sans ouverture de celle-ci et done sans risque de contamination de son contenu. Dans une realisation particuliere de I’invention, la poche comprend les caracteristiques suivantes de permeabilite (en cm3 par jour sous une pression d’une atmosphere, e’est-a-dire 1 bar, a 37°C) : pour Ie dioxygene 418 a 508, pour Ie dioxyde de carbone 699 a 1200, pour Ie diazote 157 a 200 et pour I’eau 0,05 a 0,1. La poche est par exemple formee d’un film mince qui peut etre realise en copolymere tel que du fluoropolymere et plus particulierement du fluoro-ethylene-propylene pouvant avoir une epaisseur par exemple de I’ordre 120pm. Dans une realisation preferee, la poche a une forme sensiblement parallelepipedique de faible epaisseur pouvant atteindre une largeur de 230 a 250 mm maximum a plat et une longueur de 230 a 250 mm a plat. L’utilisation d’un materiau appartenant a la famille des fluoropolymeres presente I’avantage d’etre permeable aux gaz et egalement de presenter une faible adherence par rapport aux liquides. Le boTtier presente de preference une forme correspondant sensiblement a celle d’un parallelepipede rectangle et peut comporter une demi-coque inferieure et une demi-coque superieure solidaires I’une de I’autre, la demie-coque inferieure etant rigide et la demi-coque superieure etant rigide ou flexible. Ainsi, le boTtier peut presenter une forme egalement sensiblement plane presentant une tres faible epaisseur en comparaison de sa longueur et de sa largeur. Le boTtier peut etre realise dans tout materiau thermoplastique elastomere tels que du SEBS designant du Styrene-Ethylene-ButadieneStyrene. La demi-coque inferieure peut etre rigide pour assurer un maintien optimal de la poche flexible tandis que la demi-coque superieure peut etre partiellement rigide et comporter une ou plusieurs zones flexibles realisees dans un materiau elastomere de maniere a faciliter la prehension et une5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 8 certaine deformabilite pour faciliter Ie montage de la cassette dans les moyens de support et d’agitation qui sera presente ci-apres. Bien evidemment, la demi-coque superieure peut egalement etre totalement rigide comme la demi-coque inferieure. Les deux demi-coques inferieure et superieure peuvent etre assemblies par clipsage, collage ou soudure de leurs rebords peripheriques. Les demi-coques peuvent avoir la meme epaisseur ou des epaisseurs differentes. Dans une realisation preferee de (’invention, la demi-coque superieure peut comprendre une ouverture ou evidement central dont la forme et la dimension sont determinees pour permettre la propagation d’une ondulation du liquide de la poche dans I’ouverture lorsque la cassette contenant un liquide subit une oscillation autour d’un axe horizontal, I’ouverture etant disposee vers Ie haut. La formation d’une ondulation est souhaitable pour realiser une homogeneisation rapide du liquide de la poche. La formation d’un evidement, qui pourrait encore etre qualifie de decoupe ou d’ajour, evite ainsi d’avoir a augmenter I’epaisseur du boTtier. Get evidement assure egalement une meilleure diffusion des gaz au contact de la poche. II peut avoir une dimension d’environ 210 mm de large et de I’ordre de 28 mm de long. Preferentiellement, la demi-coque inferieure comprend une pluralite d’orifices, ayant de preference un diametre par exemple inferieur a 20 mm. L’integration d’orifices permet de faciliter Ie transfer! de gaz de maniere similaire a I’ouverture de la demi-coque superieure mais assure egalement un maintien de la poche sur la demi-coque inferieure. Dans une realisation pratique de (’invention, la demi-coque inferieure peut comprendre environ 50 et 400 orifices ayant chacun un diametre compris entre 5 et 20 mm, par exemple de I’ordre de 10 mm. Les orifices peuvent etre repartis selon un maillage ayant un motif de base qui est celui d’un triangle equilateral de longueur unitaire comprise entre 5 et 40 mm et par exemple de 20 mm.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 9 Dans une realisation de la cassette selon I’invention, les conduits s’etendent au travers de I’un des rebords peripheriques de I’une des demicoques inferieure ou superieure. Les conduits peuvent etre loges dans des encoches de I’un des rebords peripheriques de I’une demi-coques inferieure ou superieure. La cassette comprend, de preference, une barrette de support des conduits, agencee a I’exterieur du boTtier et traversee par au moins certains des conduits. Cette barrette permet Ie support des conduits qui s’etendent a I’exterieur du boftier de la cassette, ce qui limite les mouvements intempestifs des extremites libres des conduits. De plus, Ie support est destine a former un element de passage etanche de la porte d’un incubateur comme cela apparaitra mieux dans la suite de la description. La cassette comprend de preference un milieu de culture cellulaire stocke dans la poche, Ie milieu de culture cellulaire pouvant etre a I’etat congele. Le milieu de culture cellulaire peut etre un milieu de culture cellulaire dont la composition est adaptee a la multiplication de cellules de mammifere, en particulier de cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines. Le milieu de culture peut comprendre, ou ne pas comprendre, de cellules en culture. Ces cellules, en particulier ces cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent avantageusement etre, ou comprendre, des cellules CD34+ (humaines), en particulier des cellules hematopoietiques CD34+ (humaines) ou des cellules CD34+ nonhematopoTetiques (humaines). Ces cellules CD34+ (humaines) peuvent par exemple etre des cellules du sang peripherique (humain) ou du cordon ombilical (humain) ou d’un tissu humain, en particulier du sang peripherique (humain). Ces cellules, en particulier ces cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent avantageusement etre,5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 10 ou comprendre, des cellules souches ou progenitrices, en particulier des cellules multipotentes ou pluripotentes. Ces cellules ne sont pas, ou ne comprennent pas, de cellules embryonnaires humaines. Ce milieu de culture cellulaire peut notamment comprendre des composants qui autorisent la multiplication de ces cellules, plus particulierement qui autorisent leur multiplication tout en les maintenant dans un etat non differencie, ou a tout Ie moins tout en ne leur faisant pas atteindre un etat de differentiation terminale. Ce milieu de culture cellulaire peut comprendre de I’insuline, de la transferrine et du plasma ou serum (humain). Ce milieu de culture cellulaire peut comprendre des cellules support (feeder cells), telles que des fibroblastes, ou en etre depourvu. Ce milieu de culture cellulaire peut par exemple etre, ou comprendre, Ie milieu de Dulbecco modifie par Iscove (milieu Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium ou IMDM ; voir, par exemple, Iscove, N.N. and Melchers, F. (1978) J. Exper. Med., 147:923), optionnellement complemente en glutamine ou en peptides contenantde la glutamine. Plus particulierement, ce milieu de culture cellulaire peut etre, ou comprendre, Ie milieu IMDM, optionnellement complemente en glutamine ou en peptides contenant de la glutamine, ce milieu etant depourvu de fibroblastes et comprenant de I’insuline (recombinante) humaine, de la transferrine (humaine) et du plasma ou serum (humain). Par exemple, Ie milieu de culture peut comprendre : - de 1 a 50 pg/mL, en particulier de 8 a 12 pg/mL, d’insuline, -de 100 a 2000 pg/mL, en particulier de 300 a 500 pg/mL, de transferrine, et -de 1 a 30%, en particulier de 4 a 12%, de serum ou plasma (humain). Le milieu de culture peut en outre comprendre de I’heparine, par exemple de 1,5 a 3,5 ILI/mL d’heparine.5 10 15 20 25 Date Re^ue/Date Received 2023-10-12 11 Le milieu de culture peut en outre comprendre de I’erythropoTetine, notamment de I’erythropoTetine (recombinante) humaine. Le milieu de culture peuten outre comprendre un ou plusieursfacteurs de croissance, notamment un ou plusieurs facteurs de croissance choisis parmi I’hydrocortisone, le SCF (Stem Cell Factor), I’interleukine 3 (IL-3), la thrombopoietine (TOP), la FLT3 (Fms-like tyrosine kinase 3), la BMP4 (Bone Morphogenetic Protein 4), la VEGF-A 165 (Vascular endothelial growth factor A 165), et l’IL-6. Le milieu de culture peut notamment comprendre - de I’hydrocortisone, ou - du SCF, ou - du SCF et de l’IL-3, ou - de I’hydrocortisone et du SCF, ou - de I’hydrocortisone, du SCF et de l’IL-3, ou - du SCF, de la TOP, de la FLT3, de la BMP4, de la VEGF-A165, de l’IL-3 et de l’IL-6. Le milieu de culture peut notamment etre un milieu de culture tel que decrit dans WO 2011/101468 (ou dans I’une des demandes de brevets US qui sont issues de, ou basees sur, cette demande internationale PCT, telle que notamment la demande US 2013/0078721 A1). La cassette peut comprendre le milieu de culture et/ou des cellules tels que ci-dessus decrits. Selon un mode de realisation, la cassette comprend le milieu de culture dans la poche, plus particulierement sous forme congelee, mais ne comprend pas de cellules. Selon un autre mode de realisation, la cassette comprend le milieu de culture dans la poche, plus particulierement sous forme non congelee, et comprend en outre des cellules, en particulier des cellules en culture, notamment des cellules CD34+ (humaines) telles que ci-dessus decrites.5 10 15 20 25 Date Re^ue/Date Received 2023-10-12 12 L’invention concerne encore un incubateur de culture cellulaire, comprenant une enceinte thermostatee et un dispositif de support et d’agitation d’une cassette de culture cellulaire selon I’un des modes de realisation precedent et des moyens de positionnement et de blocage de la cassette de culture cellulaire dans une position donnee dans Ie dispositif de support. Dans une realisation, Ie dispositif de support et d’agitation comprend un plateau de support de la cassette de culture cellulaire qui est monte rotatif autour d’un axe horizontal autour duquel Ie plateau est destine a osciller pour I’agitation et I’homogeneisation du contenu de la poche. Le dispositif de support et d’agitation peut comprendre une bielle dont une extremite superieure est reliee par I’intermediaire d’un oscillateur au plateau et dont I’extremite inferieure est reliee a une manivelle entrainee en rotation par I’arbre d’un moteur dont I’axe est sensiblement horizontal. L’incubateur peut comprendre des moyens de controle de la position de la cassette de culture cellulaire dans les moyens de support de maniere a verifier que la cassette est convenablement positionnee sur les moyens de support et que celle-ci peut etre utilisee. Le plateau peut porter des actuateurs electromecaniques d’ouverture/fermeture des vannes dont une sortie porte des seconds moyens d’accouplement destines a cooperer avec des premiers moyens d’accouplement des vannesde la cassette lorsque la cassette est dans ladite position donnee. Selon une autre caracteristique de l’invention, l’incubateur comprend une porte de fermeture etanche d’une ouverture de I’enceinte, cette ouverture comprenant un bord peripherique dans lequel est forme un renfoncement dont la forme est adaptee a recevoir la barrette de support des conduits, la barrette formant un organe d’etancheite entre la porte et le bord peripherique lorsque la porte est en position de fermeture de I’enceinte.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 13 L’integration d’une barrette de support des conduits permet de realiser de maniere simple et rapide I’operation de positionnement des conduits au niveau du passage de porte. En effet, contrairement a la technique connue qui consiste a integrer des gorges de logement des conduits directement dans Ie bord peripherique, et a les disposer une a une dans des gorges, I’invention propose de realiser un montage de tous les conduits en une seule etape. De plus, I’etancheite est realisee sur la barrette et non plus sur les conduits, ce qui permet de simplifier la realisation de la fermeture etanche puisque cette barrette peut presenter une structure rigide sur laquelle la porte peut venir s’appuyer. L’invention concerne egalement un automate de culture cellulaire comprenant au moins un incubateur du type decrit ci-dessus, et un systeme informatique de commande incluant des moyens de saisie et d’enregistrement de donnees et destine a reguler les conditions de culture dans une enceinte dudit au moins un incubateur et a piloter les vannes de la cassette logee dans I’enceinte. L’invention concerne egalement un procede de culture cellulaire au moyen d’un automate decrit ci-dessus, Ie procede comprenant les etapes consistant a : a) placer une cassette de culture cellulaire telle que decrite precedemment a I'interieur de I’enceinte de I'incubateur dans une position de decongelation sur Ie dispositif de support et d'agitation ; b) alimenter la poche en cellules a cultiver ; c) placer la cassette sur Ie dispositif de support et d’agitation dans une position de culture cellulaire ; d) agiter la cassette de culture cellulaire durant une periode de temps donnee pour homogeneiser son contenu ; e) maintenir la cassette de culture cellulaire dans des conditions d’incubation pendant une duree de plusieurs jours ; et f) recuperer Ie contenu de la cassette au moyen de I’une des tubulures de la cassette.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 14 Le procede comprend encore : - pendant I’etape d), une ou plusieurs etapes de prelevement d’echantillon du contenu de la poche, qui sont chacune precedees d’une etape de basculement du plateau de support d’une position horizontale de culture jusqu’a une position inclinee dans laquelle la zone de prelevement de la poche represente le point le plus bas de la poche. L’invention sera mieux comprise et d’autres details, avantages et caracteristiques de l’invention apparaTtront a la lecture de la description suivante faite a titre d’exemple non limitatif, en reference aux dessins annexes dans lesquels : - la figure 1 est une vue schematique en perspective de I’automate de culture cellulaire selon l’invention, cet automate comportant un incubateurs definissant une enceinte thermostatee qui est ouverte ; - la figure 2 est une vue schematique en perspective et isolee de I’incubateur ; - lesfigures3A et 3B sont des vues schematiquesde cotedesmoyens de support et d’agitation et de la cassette ; - la figure 4 est une vue schematique en perspective des moyens de support et d’agitation et de la cassette ; - la figure 5 est une vue schematique du dessus de la cassette reposant sur les moyens de support et d’agitation ; - les figures 6A a 6C representent differentes positions d’utilisation de la cassette dans I’enceinte thermostatee de I’automate ; - la figure 7 une vue schematique en perspective de la cassette selon l’invention, en direction de la demi-coque superieure ; - la figure 8 une vue schematique en perspective de la cassette selon l’invention, en direction de la demi-coque inferieure ; - la figure 9 est une vue schematique a plus grande echelle de la zone delimitee en pointillee sur la figure 8 ;5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 15 - la figure10estunevue schematiqueen perspectivedela cassettede la figure 7, la demi-coque superieure etant retiree ; - la figure 11 est une vue schematique en perspective et isolee de la demi-coque inferieure, - la figure 12 est une vue schematique en perspective a plus grande echelle de la zone delimitee pointillee sur la figure 11 ; - les figures 13 et 14 sont des vues schematiques en perspective de la demi-coque superieure ; - la figure 15A est une vue schematique en perspective d’une platine de reception des vannes d’ouverture/fermeture des conduits de la cassette ; - lesfigures 15B et 15C sont des vues schematiques en perspective et a plus grande echelle d’une partie seulement de la platine de la figure 15A; - lesfigures 16A, 16B et 16C representent une premiere variante d’une vanne utilisable avec la platine de la figure 15A ; - lesfigures17A et17Brepresententune seconde varianted’unevanne utilisable avec la platine de la figure 15A ; - la figure 18 est une vue schematique en perspective de moyens d’entrainement en rotation de la vanne des figures 16A, 16B et 16C ; - lesfigures 19A et 19B sont des vues schematiques enperspectived’un organe d’actionnement de la vanne des figures 17A et 17B ; - la figure 20 est une vue schematique en perspective d’un systeme de culture cellulaire forme d’une pluralite d’incubateurs et d’une centrifugeuse - lafigure21estunorganigrammemontrantdesetapesd’unprocedede culture cellulaire selon I’invention. On se refere tout d’abord aux figures 1 et 2 qui representent un exemple de realisation de I’automate 10 de culture cellulaire selon I’invention, cet automate 10 etant par exemple destine a la culture de5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 16 cellules souches, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines. Comme represents, I’automate 10 comprend essentiellement trois elements : - un incubateur 12 a enceinte thermostatee comprenant un dispositif de support et d’agitation 14 d’une cassette de culture cellulaire 16 selon I’invention (figures 1 et 3) ; - un bati 18 de support de I’incubateur 12 et d’une centrifugeuse 20, et - un systeme informatique relie a I’incubateur 12 et a la centrifugeuse 20 pour la commande de vannes et de pompes et porte par Ie bati 18. De fagon typique, Ie systeme informatique comprend des moyens de saisie et d’enregistrement de donnees, des moyens de traitement des donnees, des moyens d’affichage, et des moyens d’emission de signaux de commande et de pilotage de I’incubateur ainsi que des vannes de la cassette 16 et pompes. De preference, Ie systeme informatique comprend un ecran tactile d’affichage 22 et de saisie de donnees par un operateur ou utilisateur. Le controle et la tragabilite des etapes du protocole biologique peuvent etre assures par le systeme informatique et une interface hommemachine (IHM) appropriee, qui permettent notamment : d’assurer la traqabilite complete du procede de fabrication de chaque greffon de cellules souches, des etapes d’intervention des operateurs sur I’automate, des parametres de culture comme la temperature, le taux de C02, et le temps de deroulement de chaque etape et des actions de validation necessaires a certaines etapes du procede, d’assurer la tragabilite des consommables et reactifs utilises dans le procede, via une interface de saisie, des moyens de lecture et de stockage de donnees de code-barres, et d’etiquettes RFID, et une verification de coherence des informations recueillies vis-a-vis d’une base de donnee interne. Cette traqabilite pouvant s’appliquer a la5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 17 totalite de la chaine de fabrication, de stockage et de transport des consommables et reactifs, ainsi que sur les conditions materielles de maintien en temperature de ces composants. d’indiquer de fagon systematique a I’utilisateur Ie detail des etapes du protocole a travers des animations et images illustrant Ie deroulement des etapes du procede, d’enregistrer de fagon securisee des donnees d’identification du patient, les donnees biologiques liees a la caracterisation des greffons de cellules souches, de piloter chacune des fonctions de commande des actionneurs, d’enregistrer et interpreter les donnees des differents capteurs presents sur I’automate ou la cassette fluidique. Comme represente en figure 2, I’incubateur 12 comprend deux portes, une premiere porte 22 interne destinee a venir s’appliquer sur une premiere surface 24 de contact entourant I’ouverture 26 de I’enceinte 28 de I’incubateur 12 et une seconde porte 30 externe destinee a venir s’appliquer sur une seconde surface 31 de contact entourant la premiere surface de contact 24. Les premiere 22 et seconde 30 portes sont par exemple chacune pivotable autour d’un meme axe vertical. L’enceinte 28 loge des moyens de ventilation 33 qui sont agences en partie superieure de l’enceinte 28 (figures 1, 6A, 6B et 6C). Ces moyens de ventilation 33 sont dimensionnes et configures pour permettre une repartition uniforme de la temperature et des gaz dans l’enceinte de I’incubateur necessaires a une culture cellulaire efficace et d’avoir une temperature adaptee (figures 1, 6A, 6B et 6C). Pendant la decongelation du milieu de culture qui est contenu dans la poche, la chaleur dans l’enceinte est ainsi uniformement repartie pour permettre une decongelation rapide du milieu de culture cellulaire. La porte interne 22 peut etre realisee en verre transparent de fagon a permettre une observation du contenu de l’enceinte 28 de I’incubateur 12 tout en conservant I’incubateur 12 en position fermee. L’ouverture 26 de l’enceinte 28 comprend un bord peripherique 24, correspondant a la5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 18 premiere surface de contact, dont Ie bord inferieur 24a comporte un renfoncement 32 destine a recevoir une barrette 34 de maintien des tubulures ou conduits 36, 38 de la cassette 16 qui sera decrite plus en details ulterieurement, notamment en reference aux figures 7 et 8. La barrette 34, qui est visible aux figures 4, 5, 7 et 8, forme une coque rigide qui peut presenter une forme sensiblement parallelepipedique. Elle peut egalement comporter deux flancs 40 opposes et relies I’un a I’autre par des faces 42 inferieure et superieure. Les conduits ou tubulures 36, 38 s’etendent a etancheite au travers d’orifices de la barrette 34. Ces orifices sont formes dans des parois 44 sensiblement perpendiculaires aux flancs 40 et aux parois 42 inferieure et superieure. Chaque flanc 40 de la barrette 34 comprend une rainure 46 parallele aux faces 42 inferieure et superieure. Les rainures 46 des flancs 40 sont disposees de maniere dissymetrique I’une par rapport a I’autre par rapport a un plan median de la barrette 34 et parallele aux deux flancs 40. Ces rainures 46 sont destinees a recevoir des nervures (non visibles) des flancs du renfoncement 32 du bord peripherique inferieure 24a de I’incubateur 12 de maniere a assurer un positionnement de la barrette 34 dans Ie renfoncement 32. Le positionnement dissymetrique des rainures 46 permet de realiser un detrompage au montage de la barrette 34 dans le renfoncement 32 de I’incubateur 12. Ainsi, de maniere plus generale, la barrette peut comprendre des moyens de detrompage au montage de celle-ci dans un renfoncement d’un bord peripherique d’une ouverture de I’incubateur. L’ouverture peut alors etre obturee par un organe mobile, telle qu’une porte ou une trappe, qui est deplagable entre une position d’ouverture de I’incubateur et une position de fermeture de l’ouverture de I’incubateur. La barrette ou coque rigide 34 a de preference une forme complementaire a celle du renfoncement 32. Cette forme complementaire peut etre telleque lorsque la barrette 34 est en position dans le renfoncement 32, sa face inferieure 42 vient en contact avec la face de fond du renfoncement 32 et la face superieure 42 affleure le reste du bord peripherique 24 de l’ouverture 26 de I’enceinte 28 de5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 19 I’incubateur 12 afin de former une surface sensiblement plane sur laquelle la premiere porte 22 peut venir en appui a etancheite. De cette maniere, I’etancheite de la porte interne 22 sur Ie bord peripherique 24 de I’ouverture 26 de I’enceinte 28 de I’incubateur 12 peut etre realisee de maniere simple. De plus, Ie passage des tubulures 36, 38 ou conduits au travers de la premiere porte 22 peut etre realise de maniere simple sans qu’il soit necessaire de manipuler les conduits 36, 38 un a un. Enfin, lorsque la premiere porte 22 est appliquee sur la barrette 34, I’effort de fermeture s’exerce sur la structure rigide de la barrette 34 et non pas sur les tubulures 36, 38, ce qui evite tout ecrasement des tubulures 36, 38 et permet de garantir leur section de passage de fluide. De preference, Ie renfoncement 32 peut comprendre un capteur de presence 47 de la barrette 34 permettant de confirmer Ie bon positionnement de la barrette dans Ie renfoncement 32 de maniere a autoriser la fermeture de la premiere porte 22 puis de la seconde porte 30. Comme cela est visible sur la figure 2, la fagade de I’enceinte de I’incubateur 12 comprend un autre renfoncement 48 debouchant dans Ie renfoncement 32 du bord peripherique 24 de I’ouverture 26 de I’enceinte 28. Ce renfoncement 48 est destine a permettre Ie passage des conduits 36, 38 ou tubulures au-dela du renfoncement 32 de la premiere porte 22 et de la seconde porte 30 jusqu’a la centrifugeuse. En pratique, ce second renfoncement 48 peut etre obture par une trappe (non representee), par exemple coulissante. Comme represente en figure 3A, I’enceinte thermostatee 28 comprend un dispositif de support et d’agitation 14 d’une cassette 16 de culture cellulaire selon I’invention. Ce dispositif peut se decomposer en un dispositif de support 50 et un dispositif d’agitation 52 relies I’un a I’autre. Le dispositif de support 50 comprend un plateau 54 de support ou berceau de support de la cassette 16 et une embase 60. Le plateau 54 comporte une premiere extremite 56 agencee au fond de I’enceinte 28 thermostatee et une seconde extremite 58 opposee a la premiere extremite qui est relie a5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 20 rotation autour d’un axe horizontal 63 a I’embase 60 s’etendant sensiblement verticalement et qui est portee par la paroi 62 formant Ie plancher de I’enceinte thermostatee 28 (figures 3A et 4). Plus precisement et comme cela est represente en figure 3B, la premiere extremite 56 du plateau 54 est portee et articulee a rotation autour de I’axe 63 sur deux bras 65 s’etendant verticalement depuis Ie plancher 62 de I’enceinte 28 et forme de part et d’autre du plateau 54. Le dispositif d’agitation 52 comprend un systeme du type bielle/manivelle comportant une bielle 64 dont une extremite superieure est reliee a une extremite inferieure d’un oscillateur ou tige verticale oscillante 66 supportant a son extremite superieure opposee le plateau 54 par sa face inferieure. L’extremite inferieure de la bielle 64 est reliee a une manivelle 68 entrainee en rotation par un arbre d’un moteur dont I’axe 70 de rotation est sensiblement horizontal. Get axe 70 est perpendiculaire a I’axe 63. L’extremite superieure 66 de I’oscillateur est reliee au plateau de maniere a permettre un deplacement de I’oscillateur dans un plan perpendiculaire a I’axe de rotation 70. Egalement, l’extremite superieure de I’oscillateur 66 est reliee a deplacement relativement au plateau support 54 dans la direction de I’axe 70, cette liaison pouvant etre realisee par le montage a coulissement d’un doigt, de l’extremite superieur de I’oscillateur 66, dans une fente 71 ou rainure du plateau 54. Comme represente sur les figures 3, 4 et 5, I’oscillateur 64 traverse la paroi de plancher 62 de I’enceinte 28 de I’incubateur 12. De preference, des moyens d’etancheite, tels qu’un soufflet, sont prevus autour de I’oscillateur 66, au niveau de la zone de traversee de la paroi de plancher 62 de maniere a eviter les transferts de chaleur et d’humidite en dehors de I’enceinte 28 thermostatee qui pourraient endommager les elements mecanique du dispositif d’agitation 52. Les figures 6A, 6B et 6C representent trois positions prises par le plateau 54 au cours de son deplacement par les moyens d’agitation. En figure 6A est representee la position haute du plateau 54 et la figure 6B5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 21 representant la position basse du plateau 54. Dans I’une et l’autre de ces deux positions Ie plateau est incline par rapport a un plan horizontal. La figure 6C represente une position mediane dans laquelle Ie plateau 54 est sensiblement horizontal. En fonctionnement, Ie plateau 54 de support de la cassette est ainsi apte a effectuer une angulation entre ses positions extremes (figures 6A et 6C) autour de I’axe 63 (figure 4). Comme represente en figure 2, Ie plateau 54 de support de la cassette 16 est forme d’un cadre 72 comportant une ouverture 74 ou partie creuse et une partie pleine 76. La partie creuse 74, agencee au voisinage de la premiere extremite 56 du plateau 54, est destinee a venir en vis-a-vis de la demi-coque inferieure de la cassette qui sera decrite ci-apres. La partie pleine 76 est agencee au voisinage de la seconde extremite 58 du plateau 54. Cette partie pleine 76 comprend des moyens de positionnement et de blocage de la cassette de culture cellulaire dans une position donnee sur Ie plateau 54 correspondant a une position dans laquelle la cassette 16 repose sur Ie cadre 72 et permet de realiser une phase d’incubation. Les moyens de positionnement comprennent deux pions 78 en saillie vers Ie haut destines a cooperer avec deux trous borgnes de la cassette 16 (decrit ci-apres). Les moyens de blocage de la cassette 16 comprennent un crochet de clipsage 80 ou d’encliquetage avec un crochet de la cassette qui sera decrit ci-apres de maniere a bloquer la cassette 16 sur Ie plateau 54. Le crochet 80 de la partie pleine 46 du cadre 72 du plateau 54 est agence entre les deux pions 78. Comme cela est visible sur la figure 2, le plateau comprend trois actuateurs electromecaniques 82 d’ouverture/fermeture de vannes, chaque actuateur 82 comprenant une sortie comportant des seconds moyens d’accouplement destines a cooperer avec des premiers moyens d’accouplement des vannes de la cassette lorsque la cassette 16 repose sur le cadre 72 du plateau 54. Le cadre 72 est surmonte d’une structure 84 de support de la cassette 16 a distance du cadre 72. Cette structure 84 de support permet5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 22 de supporter la casette 16 dans une seconde position correspondant a une phase de decongelation. Cette structure support 84 comprend deux ailettes 86 laterales reliees I’une a I’autre par une paroi plane 88 et forment ensemble un plan commun de support de la cassette 16 dans la seconde position. On remarque que les plans de support de la cassette 16 dans la premiere position et dans la seconde position sont inclines I’un par rapport a I’autre. La seconde position permet de supporter la cassette 16, emballee hermetiquement sous vide dans une enveloppe, a distance du cadre 72 afin d’eviter toute dechirure de I’enveloppe, generalement realisee en matiere plastique, par les pions 78 lors de la phase de decongelation. On se refere maintenant aux figures 7 et 8 qui representent une cassette 16 de culture cellulaire selon I’invention comprenant un boTtier 90 presentant une forme correspondant sensiblement a celle d’un parallelepipede rectangle comportant une premiere extremite 92 et une seconde extremite 94 en reference au positionnement de la cassette 16 sur Ie plateau 54. Le boTtier 90 comporte une demi-coque inferieure 96 (figures 9 a 12) et une demi-coque superieure 98 (figures 13 et 14) solidaires I’une de I’autre, la demi-coque inferieure 96 etant rigide et la demi-coque superieure 98 etant rigide ou partiellement rigide, c’est-a-dire comprenant des parties flexibles. Les deux demi-coques inferieure 96 et superieure 98 definissent ensemble un logement dans lequel est fixee une poche 100 souple de culture cellulaire definissant un volume interieur destine a etre remplit d’un milieu de culture cellulaire. Les demi-coques inferieure 96 et superieure 98 sont reliees I’une a I’autre par quatre rebords peripheriques 102a, 102b. Les deux demi-coques inferieure 96 et superieure 98 peuvent etre assemblees par clipsage, collage ou soudure de leurs rebords peripheriques 102a, 102b. Dans une realisation preferee, les deux demi-coques inferieure 96 et superieure 98 sont toutes les deux rigides. La demi-coque inferieure 96 comprend une pluralite d’orifices 104 ayant de preference un diametre inferieur a 20 mm. La cassette 16 a par5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 23 exemple des dimensions de 405 mm de longueur, 305 mm de largeur et une epaisseur de 25 mm. Elle comprend egalement deux trous borgnes 106 espaces I’un de I’autre et encadrant une ouverture 107 traversante ou debouchante. Les trous borgnes 106 sont formes par un renfoncement 109 de la demi-coque inferieure 96, s’etendant vers la demi-coque superieure 98 (figures 11 et 12). La demi-coque superieure 98 comprend une ouverture ou evidement 108 dont la forme et la dimension sont determinees pour permettre la propagation d’une ondulation du liquide de la poche 100 dans I’ouverture lorsque la cassette 16 contenant un liquide subit une oscillation autour de I’axe horizontal 63, I’ouverture 108 ou ajour (ou decoupe) etant disposee vers Ie haut (figures 7, 13, 14). Comme cela a ete evoque precedemment, la formation d’un evidement 108 permet de former une ondulation de la surface de la poche 100 situee a I’interieur du boTtier lorsque la cassette 16 est montee dans la seconde position sur Ie plateau 54 et que celui-ci est deplace a oscillation comme decrit en reference aux figures 6A, 6B et 6C. La demi-coque superieure 98 comprend une languette elastique 110 portant un crochet de clipsage 112 avec Ie crochet 80 du cadre 72 du plateau 54 comme cela a ete deja evoque precedemment. Le crochet 112 de la demi-coque superieure 98 est ainsi configure pour traverser I’ouverture 107 de la demi-coque inferieure 96. Enfin, la demi-coque superieure 98 comprend egalement un orifice circulaire 114 d’insertion d’un bouchon d’actionnement 116 manuel d’une vanne dont (’utilisation apparaitra plus clairement en reference aux figures 17 et 18. On remarque que le rebord peripherique 102a de la demi-coque inferieure 96, situe au niveau de la premiere extremite 92 du boTtier 90, comporte une nervure rectiligne 116 qui est destinee a cooperer avec une fente 118 de la structure support 84 du plateau 54 lorsque la cassette 16 de culture cellulaire est montee dans sa premiere position sur le plateau 54 dans I’enceinte 28 de I’incubateur 12 (figures 8, 9, 11, 12). Dans cette premiere position, le crochet de clipsage 112 de la demi-coque superieure5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 24 98 traverse I’ouverture 107 de la demi-coque inferieure 96 et coopere avec Ie crochet 80 du cadre 72 du plateau 54 pour assurer Ie blocage de la cassette 16 dans cette premiere position (figures 3, 4 et 5). Pour liberer la cassette 16 et la retirer de I’enceinte 28 d’incubation, il suffit d’appuyer sur la languette 110, ce qui conduit a desengager Ie crochet 110 de la demicoque superieure 98 d’avec Ie crochet 80 de la du plateau 54. Une plaquette 120 est fixee par encliquetage dans la demi-coque superieure et est apte a permettre un maintien des tubulures 36, 38 de la 16 cassette en position repliees sur la face externe de la demi-coque superieure 98. La figure 10 represente I’interieur du boTtier 90, la demi-coque superieure 98 n’etant pas representee. Comme cela est visible, la poche 100 de culture de cellulaire presente une forme sensiblement parallelepipedique comportant une premiere paroi 122 et une seconde paroi (non visible) sensiblement paralleles I’une a I’autre a I’etat vide et a I’etat remplit de liquide. La premiere paroi 122 et la seconde paroi sont reliees et rendues solidaires I’une a I’autre par leurs bords peripheriques 123, par tout moyen tel que par exemple par soudure ou collage. Dans une realisation particuliere de I’invention, Ie rapport de la surface de I’une des premiere paroi 122 ou seconde paroi sur Ie volume interne de la poche est compris entre 540 et 600 cm2/L, et est de preference de I’ordre de 580 cm2/L. La distance separant la premiere paroi 122 de la seconde paroi est inferieure a 20 mm, de preference compris entre 10 et 20 mm et encore plus preferentiellement de I’ordre de 14 mm. La poche 100 de culture cellulaire est fixee sur la demi-coque inferieure 96 par I’intermediaire de pion 124 en saillie sur la face interne de la demi-coque inferieure 96. Ces pions 124 traversent des orifices des bords 123 peripheriques de la poche 100 de culture cellulaire. Le volume interieur de la poche 100 est en communication avec I’exterieur par I’intermediaire d’une pluralite de conduits. En particulier, la cassette 16 peut comprendre quatre conduits 36, 38 ou tubulures souples dont trois 36 sont5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 25 solidaires de la barrette 34 precedemment decrite et un quatrieme 38 est independant. Plus particulierement, la cassette 16 comprend une premiere 36a et une seconde tubulure 36b dites de prelevement et une tubulure 36c de vidange. La tubulure 38 correspond a une tubulure d’injection des cellules d’interet. Comme cela est visible sur les figures 5, 7, 8, 9 et 10, la cassette comprend egalement une tubulure 39 de remplissage initial de la poche 100 en milieu de culture. Dans une configuration preferee de la cassette 16 selon I’invention, les quatre tubulures 36a, 36b, 36c, 38 sont equipees de connecteurs pouvant etre des connecteurs aseptiques et/ou de soutirage sans aiguille, ces connecteurs pouvant encore comprendre des moyens anti-retour. Dans la suite de la description, lorsque Ie numero de reference 36 est utilise seul, il designera indifferemment I’une au moins des tubulures 36a, 36b ou 36c. Comme represente en figure 10, les tubulures 36, 38 s’etendent au travers d’encoches 126 d’un meme rebord peripherique 102a de la demicoque inferieure 96, a savoir Ie rebord peripherique 102a forme au niveau de la seconde extremite 94 du boTtier 90. La tubulure 39 de remplissage s’etend sur I’un des cotes adjacents au cote traverse par les tubulures 36, 38 et est reliee a son extremite agencee a I’interieur du boTtier 90 dans une portion de la tubulure 36 agencee fluidiquement entre une vanne 128 et la poche 100. Chacune des tubulures 36, 38 traverse des vannes 128, 130a, 130b, 130c d’ouverture/fermeture de la circulation de fluide au travers des conduits 36, 38, ces vannes a pincement 128, 130 etant agencees dans Ie boTtier 90. Dans I’exemple represente, les trois tubulures 36 traversent un premier type de vanne 130, la tubulure 36a traversant la vanne 130a, la tubulure 36b traversant la vanne 130b et la tubulure 36c traversant la vanne 130c, tandis que la quatrieme tubulure 38 traverse un second type de vanne 128 (figures 10 et 15A). Plus precisement, Ie boTtier 90 comprend une platine 132 (figures 15A, 15B et 15C) comportant une pluralite de5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 26 logement 134 sensiblement cylindrique recevant chacun un organe mobile 136, 138 de pincement d’une tubulure 36, 38 (figures 16 et 17). Cette platine forme ainsi Ie corps ou partie statorique des vannes 128, 130. Chaque logement 134 de la platine 132 comprend une paroi annulaire de fond 140 delimitant un orifice central 142 aligne avec un orifice 144 de la demi-coque inferieure 96 lorsque la platine 132 est montee dans Ie boTtier 90 (figures 10et 12). Chaque organe mobile 136, 138 comprend une extremite inferieure 136a, 138a et une extremite superieure 136b, 138b en reference aux demicoques inferieure 96 et superieure 98 et en reference a I’agencement de la cassette par rapport a la verticale. Bien entendu, il serait possible de designer de maniere plus generale I’extremite inferieure comme etant une premiere extremite et I’extremite superieure comme etant une seconde extremite opposee a la premiere extremite. Ainsi, I’extremite superieure 136b, 138b de chaque organe mobile 136, 138 comprend un epaulement annulaire 146b destine a venir en appui selon I’axe de rotation 136c, 138c sur Ie pourtour d’un orifice 142 d’un logement 134 de la platine 132 et entourant une paroi cylindrique 148b destinee a s’inserer dans I’orifice 142 du logement. Dans Ie cas present, la surface 146b de I’organe 136 est en appui sur la surface de fond 140 d’un logement 134 d’une vanne 130a, 130b, 130c. II est ainsi possible de realiser un guidage en rotation et un centrage des secondes extremites 136b, 136a des organes mobiles 136, 138 dans les logements 134 de la platine 132. L’extremite inferieure 136a, 138a de chaque organe mobile 136, 138 comprend un epaulement annulaire 146a destine a venir en appui selon I’axe de rotation 136c, 138c sur Ie pourtour d’un orifice 144 de la demi-coque inferieure 96 et une paroi cylindrique 148a destinee a s’inserer dans I’orifice 144 de la demi-coque inferieure 96. Dans Ie cas present, la surface 146b de I’organe 138 est en appui sur la surface de fond 140 d’un logement 134 de la vanne 128. De cette maniere, on assure un guidage en rotation et un centrage de chacun des organes mobiles 136, 138 sur la demi-coque inferieure 96 et la platine5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 27 142 qui est elle-meme solidaire de la demi-coque inferieure 96 par I’intermediaire d’oreilles 150 traversees par des plots 152 de la face interne de la demi-coque inferieure 96 et grace a la demi-coque superieure 98 dont les rebords peripheriques 102b sont solidarises aux rebords peripheriques 102a de la demi-coque inferieure 96. Les extremites inferieures 136a, 138a des organes mobiles 136, 138 debouchent ainsi au travers de la demicoque inferieure 96 et sont ainsi accessibles depuis la face externe de la demi-coque inferieure 96 comme cela est visible sur la figure 9. Les organes mobiles 136, tels que representes en figure 16A, 16B, 16C associes aux tubulures 36, comprennent a leur extremite inferieure 136a des premiers moyens d’accouplement accessibles depuis I’exterieur du boTtier de maniere a cooperer avec les seconds moyens d’accouplement des actuateurs 82 des organes mobiles 136, agences dans I’incubateur. Les premiers moyens d’accouplement, formes sur la face inferieure de I’organe 136, comprennent ici une fente 151 radiale dont une extremite radialement interne est traversee par I’axe de rotation 136c et une gorge semi-circulaire 153 centre sur I’axe de rotation 136cLes seconds moyens d’accouplement des actuateurs 82 peuvent par exemple comprendre deux tiges 155a, 155b dont une premiere 155a est centree sur I’axe de rotation de I’actuateur 82 et une seconde 155b est decalee radialement par rapport a la premiere 155a. Lorsque la cassette 16 est montee sur Ie cadre 72, comme en figure 3A, la premiere tige 155a s’engage dans I’extremite radialement interne de la fente 151, la seconde tige 155b s’engageant dans la gorge semi-circulaire 153. On comprend que I’utilisation d’une gorge semi-circulaire 153 permet de garantir une cooperation de la seconde tige 153b avec la gorge 153 quelle que soit la position angulaire de I’organe mobile 136 prealablement au montage de la cassette 16 sur Ie cadre 72. L’integration d’une fente radiale 151 sur les organes mobiles 136 permet d’actionner manuellement au besoin I’organe mobile 136. Dans Ie cas de la vanne 138 des figures 17A et 17B associee a la tubulure 38, les premiers moyens d’accouplement sont formes a I’extremite5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 28 superieure 138b de I’organe mobile 138. Contrairement aux trois organes mobiles 136 des vannes 130, I’organe mobile 138 de la vanne 128 n’est pas actionne par un actuateur electromecanique mais manuellement par un organe ou bouton 154 rotatif comme celui represents aux figures 18A et 18B. L’accouplement est ici realise par un evidement en croix 157 a I’extremite superieure 138b de I’organe mobile 138 dans lequel vient s’engager une forme complementaire 156 en croix du bouton d’actionnement 154. Le bouton 154 est rendu solidaire de la demi-coque superieure 98 au moyen d’une pluralite de crochets 158 elastiquement deformables venant s’accrocher sur le pourtour interne de I’orifice 114 circulaire de la demi-coque superieure 98. Pour realiser le pincement des tubulures 36, 38, chaque organe mobile 136, 138 comprend une excroissance en spirale 160 autour de I’axe de rotation 136c, 138c de I’organe mobile 136, 138. La surface radialement exteme de chaque excroissance 160 forme une surface d’appui sur une tubulure 36, 38. Chaque excroissance 160 presente un plan de symetrie selon un plan perpendiculaire a I’axe de rotation 136c, 138c. Chaque tubulure 36, 38 est logee pour partie dans une gorge rectiligne 162 a section semi-circulaire de la demi-coque inferieure 96 et pour une autre partie dans une gorge rectiligne 164 a section semi-circulaire de la platine 132 de maniere a traverser la peripherie d’un logement 134 de la platine 132 dans une direction perpendiculaire a I’axe de rotation 136c, 138c de I’organe mobile (figures 11, 12, 15A, 15B, 15C). Ainsi, au fur et a mesure de la rotation d’un organe mobile 136, 138 d’une vanne 128, 130 I’excroissance 160 assure une ouverture ou une fermeture progressive de la section d’une tubulure 36, 38 selon le sens de rotation de I’organe mobile 136, 138. Chaque paroi 140 annulaire de fond d’un logement de la platine 132 porte deux organes 166a, 166b de butee en saillie a I’interieurdu logement 134 et qui sont espaces angulairement I’un de I’autre. Une decoupe 167 est formee dans chaque paroi 140 annulaire de fond d’un logement 134 de5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 29 maniere a delimiter une lamelie elastique 168 comportant one extremite libre portant une excroissance en saillie dans Ie logement 134, cette excroissance comportant une portion convexe 171 destine a cooperer a glissement avec les organes mobiles 136, 138 (figures 15B, 15C). L’excroissance 170 coopere a glissement avec une gorge 172, ayant une forme en arc de cercle et un fond incurve concave, de chacun des organes mobiles 136, 138. Pour ce qui concerne I’organe mobile 136 des figures 16A, 16B et 16C, la gorge 172 est farmee sur une collerette annulaire radiale 174 agencee axialement entre l’excroissance 160 et I’epaulement annulaire superieure 146b et sur la face orientee vers I’extremite superieure 136b de I’organe mobile 136. De meme, pour ce qui concerne I’organe mobile 138 des figures 17A et 17B, la gorge 172 est farmee sur une collerette annulaire radiale 174 agencee axialement entre l’excroissance 160 et I’epaulement annulaire superieure 146b et sur la face orientee vers I’extremite superieure 138b de I’organe mobile 138. Une cavite semi-spherique 176a, 176b est farmee aux extremites angulaires de chaque gorge 170, 172 de maniere a former des positions d’arret de I’organe mobile 136, 138 pour I’une correspondant a la position d’ouverture ou Ie fluide peut circuler et pour I’autre correspondant a une position de fermeture ou Ie fluide ne peut pas circuler. On note egalement que chaque organe mobile 136, 138 comprend un doigt radial 178 prolongeant lateralement I’epaulement superieur 146b et est en contact avec la face de la collerette 174 portant la gorge 172. . Ainsi, dans la position de blocage de I’ecoulement au travers des tubulures 36, 38, I’organe mobile 136, 138 est positionne de sorte que l’excroissance 170 de la lamelle elastique 168 est engagee dans la cavite ou logement 176a de I’organe mobile 136, 138, Ie doigt radial 178 de I’organe mobile 136, 138 etant agence en butee en rotation dans Ie sens anti-horaire, sur la figure 15, contre I’organe 166a de butee. Dans la position de passage de I’ecoulement au travers des tubulures 36, 38, I’organe mobile 136, 138 est positionne de sorte que l’excroissance 170 de la lamelle elastique 168 est5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 30 engage dans la cavite ou logement 176b de I’organe mobile 136, 138, Ie doigt radial 178 de I’organe mobile 136, 138 etant agence en butee en rotation dans Ie sens horaire, sur la figure 15, contre I’organe 166b de butee. On comprend que la cooperation de I’excroissance 170 avec les cavites 176a, 176b permet d’assurer un verrouillage par encliquetage elastique des organes mobiles 136, 138 en position de fermeture ou en position d’ouverture. On comprend aisement que les vannes decrites precedemment pourraient tout a fait etre utilisees dans d’autres dispositifs necessitant des organes d’ouverture/fermeture de la circulation d’un fluide au travers d’une tubulure. Par consequent, la presente description vise egalement tout dispositif integrant les vannes decrites, tel que par exemple un dispositif comprenant une platine 132 comportant une pluralite de logements 134 dans lesquels des organes rotatifs sont engages. II serait possible d’equiper la cassette 16 et/ou I’incubateur de moyens de verification automatique du bon positionnement de la cassette 16 dans chacune de ses premiere et seconde positions. A cette fin, un aimant pourrait etre dispose a I’interieur du boTtier 90, sur la face interne de la demi-coque inferieure 96, cet aimant cooperant avec deux capteurs a effet Hall positionnes sur Ie plateau de maniere adequate en relation avec les premiere et seconde positions a detecter. La figure 20 represente un systeme 180 de culture cellulaire comprenant une pluralite d’incubateurs 12 tels que decrits precedemment et une centrifugeuse 20. Les incubateurs 12 et la centrifugeuse 20 sont commandos par Ie systeme informatique. La figure 21 est un organigramme representant des etapes du procede de culture cellulaire selon I’invention. Au prealable du procede decrit ci-apres, la cassette 16 de culture cellulaire est remplit avec un milieu de culture cellulaire en utilisant la tubulure 39 laterale. Cette tubulure 39 est apres remplissage immediatement obturee, par soudure par exemple. La cassette 16 de5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 31 culture cellulaire est ensuite congelee a plat, c’est-a-dire en position horizontal, pour stockage et utilisation ulterieure. Une premiere etape 182 du procede consiste a saisir et enregistrer au moyen du systeme informatique des parametres de culture propres au protocole biologique. La saisie est realisee par un operateur, les parametres saisis etant par exemple I’identification du patient, I’identification de la cassette, etc. Pour faciliter la saisie de ces parametres, Ie systeme informatique peut etre equipe d’un lecteur de codes-barres, la cassette pouvant comprendre un code-barres renseignant directement Ie systeme informatique avec Ie numero et la nature de la cassette. II est ensuite effectuer une saisie par lecture de code barre ou par saisie manuelle via I’ecran tactile des donnees d’identifications personnelles indiquees sur une etiquette d’un conteneur, telle qu’une poche, des cellules a cultiver. Dans une seconde etape 184, Ie systeme informatique attribue un incubateur donne a l’operateur apres verification de la disponibilite de I’incubateur en fonction d’un planning de culture cellulaire. L’operateur installe la cassette 16 de culture cellulaire comprenant un liquide de culture cellulaire dans ledit incubateur designe, les autres incubateurs etant alors, de preference, non accessibles, c’est-a-dire les portes 22, 30 des autres incubateurs 12 etant verrouillees. Dans une troisieme etape 186, Ie procede consiste a effectuer la decongelation du milieu de culture loge dans la poche souple d’une cassette de culture telle que decrite precedemment. Pour cela, la cassette 16 de culture cellulaire, emballee hermetiquement sous vide dans une enveloppe de protection sterile, est montee dans la seconde position sur Ie dispositif 52 de support et d’agitation de I’incubateur designe par Ie systeme informatique, c’est-a-dire sur la structure support 84 (figures 3A et 3B). L’operateur referme les deux portes 22 et 30 et Ie systeme informatique initie la procedure de decongelation, les portes 22, 30 etant alors automatiquement verrouillees. Le dispositif de support et d’agitation5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 32 est actionne de maniere a positionner la cassette 16 en position horizontale. Dans une quatrieme etape 188, apres decongelation, la cassette 16 de culture cellulaire est extraite de I’incubateur et I’enveloppe externe est retiree dans une zone a activite controlee adequate. Dans une cinquieme etape 190, des cellules d’interet, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, sont injectees dans la cassette. Pour cela, la vanne manuelle 128 est positionnee en position ouverte. II est rappele que les tubulures 36, 38 sont equipees de moyens anti-retour empechant Ie liquide de la poche 100 de s’ecouler vers I’exterieur. Les cellules sont injectees dans la poche 100 au moyen de la tubulure 38 puis la vanne 128 est positionnee en position de fermeture et la tubulure 38 obturee avec un bouchon etanche. Dans une sixieme etape 192, la cassette 16 remplit du milieu de culture et des cellules d’interet est montee dans sa premiere position correspondant a la position d’incubation. La barrette 34 est montee dans I’ouverture 32 de la porte 22, les extremites des tubulures 36 opposees a la poche 100 s’etendant dans I’ouverture 38 et etant reliees au circuit fluidique du systeme represente en figure 20. Le procede selon I’invention comprend ensuite une etape d’incubation 194 qui peut durer plusieurs jours et par exemple une dizaine de jours. Periodiquement, selon les parametres du protocole, le contenu de la poche 100 peut etre homogeneise, en deplapant en oscillation le plateau 54 autour de I’axe 63 comme explique precedemment. Cette homogeneisation (durees, frequence de repetition, amplitude) est determinee par les parametres du protocole choisi. Pendant I’etape d’incubation, I’operateur peut effectuer un ou plusieurs prelevements 196 dans la poche 100 (figures 14 et 22). Certains de ces prelevements peuvent etre imposes par le systeme informatique. Les prelevements sont realises au moyen des tubulures 36a et 36b. Pour effectuer un premier prelevement, le systeme informatique5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 33 actionne I’organe mobile 136 associe a la vanne associee 130a de maniere a autoriser la circulation de fluide au travers de la tubulure 36a. Lorsque Ie prelevement est effectue par Ie systeme informatique, une operation d’obturation definitive de la tubulure 36a est effectuee de maniere a garantir I’asepsie et eviter toute utilisation ulterieure de la tubulure de prelevement deja utilisee. Le second prelevement est effectue de la meme fapon mais au moyen de la tubulure 36b. Apres chaque sous-etape de prelevement 196 d’un echantillon dans la poche 100, I’operateur peut proceder a des analyses dudit echantillon, les resultats de ces analyses pouvant etre saisis et enregistres dans le systeme informatique par I’operateur ou bien automatiquement. Dans une derniere etape du procede 198, le systeme informatique procede a une recuperation ou vidange du contenu de la poche 100 de la cassette 16. Enfin, le contenu de la poche subit une etape de purification et de conditionnement dans des seringues steriles en vue d’une utilisation ulterieure. La demande est egalement relative a un procede de culture cellulaire, en particulier de culture de cellules de mammifere, en particulier de cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines. Ces cellules, en particulier ces cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent avantageusement etre, ou comprendre, des cellules CD34+ (humaines), en particulier des cellules hematopoTetiques CD34+ (humaines) ou des cellules CD34+ nonhematopoTetiques (humaines). Ces cellules CD34+ (humaines) peuvent par exemple etre des cellules du sang peripherique (humain), ou du cordon ombilical (humain) ou d’un tissu humain, en particulier du sang peripherique (humain). Ces cellules, en particulier ces cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent avantageusement etre,5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 34 ou comprendre, des cellules souches ou progenitrices, en particulier des cellules multipotentes ou pluripotentes. Ces cellules ne sont pas, ou ne comprennent pas, de cellules embryonnaires humaines. Ces cellules, en particulier ces cellules humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent avantageusement etre, ou comprendre, des cellules souches ou progenitrices humaines CD34+ (multipotentes ou pluripotentes) du sang peripherique mobilisees par un facteur de croissance tel que Ie G-CSF (Growth Colony Stimulating Factor). Ces cellules, en particulier ces cellules humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent etre ou avoir ete prelevees d’un sujet ou patient humain (nouveau-ne, enfant, adolescent, adulte ou personne agee). L’invention est en effet specialement adaptee aux cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes) que I’on peut prelever du sang peripherique d’un sujet ou patient humain. Si Ie patient est destine a recevoir une chimiotherapie, ces cellules peuvent avoir ete collectees avant ou au debut de cette chimiotherapie. Un echantillon biologique contenant les cellules qui sont destinees a etre cultivees (par exemple un echantillon de sang (humain), en particulier un echantillon de sang peripherique (humain), de sang de cordon ombilical (humain) ou de tissu humain, en particulier un echantillon de sang peripherique humain) est ou a ete preleve d’un sujet ou patient humain. Les moyens de la demande presentent I’avantage de ne pas requerir la mise en oeuvre d’une leucapherese : un simple echantillon sanguin, par exemple un echantillon de 200 a 250 mL de sang, en particulier de 220 mL de sang, suffit a obtenir un nombre important de cellules, notamment un nombre de cellules qui soit suffisant pour un traitement therapeutique et/ou preventif, plus particulierement pour une therapie cellulaire autologue ou allogenique d’un sujet ou patient (humain), plus particulierement pour une therapie cellulaire autologue du sujet ou patient (humain).5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 35 C’est notamment Ie cas pour les cellules CD34+ humaines destinees a un traitement therapeutique et/ou preventif, plus particulierement a une therapie cellulaire autologue ou allogenique du sujet ou patient, plus particulierement a une therapie cellulaire autologue du sujet ou patient. Les cellules CD34+ humaines peuvent etre des cellules CD34+ humaines non embryonnaires, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines. Les cellules CD34+ humaines ne sont pas ou ne comprennent pas de cellules CD34+ embryonnaires. Les moyens de culture cellulaire de la demande permettent d’obtenir, a partir d’un petit volume de sang (par exemple un echantillon de 200 a 250 mL de sang, en particulier de 220 mL de sang), une population d’au moins 107, ou d’au moins 108, cellules comprenant au moins 70% de cellules CD34+ humaines (non embryonnaires). Par comparaison, pour obtenir une telle quantite de cellules CD34+ humaines directement (sans culture cellulaire) a partir du sang d’un seul sujet ou patient, il serait necessaire de traiter un volume de 7 a 10 L de sang par leucapherese. Les cellules qui sont destinees a etre cultivees, en particulier les cellules CD34+ humaines (non embryonnaires), peuvent etre purifiees ou isolees de I’echantillon biologique collecte, notamment d’un echantillon de sang, en particulier d’un echantillon de sang peripherique (par exemple un echantillon de 200 a 250 mL de sang peripherique, en particulier de 220 mL de sang peripherique). Les cellules peuvent etre purifiees de sorte a atteindre un taux minimal en un certain type cellulaire. Par exemple, elles peuvent etre purifiees jusqu’a comprendre au moins 70% ou au moins 80% ou au moins 85% ou au moins 90% en cellules CD34+ humaines (non embryonnaires ), en particulier en cellules hematopoTetiques humaines CD34+ (non embryonnaires). Cet isolement ou purification peut etre fait a I’aide de tout moyen connu de la personne du metier.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 36 Par example, pour les cellules CD34+ humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, cet isolement ou purification peut etre fait a I’aide d’un anticorps monoclonal anti-CD34 humain, par exemple I’anticorps monoclonal murin anti-CD34 humain commercialise sous Ie nom de clone QBEnd-10 (code M7165) par DAKO DANEMARK AS (Produktionsvej 42 ; DK-2600 Glostrup ; Danemark). Des systemes d’isolement ou purification de cellules CD34+ (humaines) sont par ailleurs disponibles dans Ie commerce, par exemple, Ie separateur cellulaire magnetique ISOLEX 300i commercialise par BAXTER (Deerfield, IL, U.S.A.), ou Ie kit de microbilles CD34 commercialise par MILTENYI BIOTECH (2303 Lindbergh Street, Auburn, CA 95602, U.S.A.). Les cellules purifiees ou isolees sont placees sur ou dans un milieu de culture dont la composition est adaptee a la multiplication de ces cellules. Des exemples de tels milieux de culture, notamment de milieux adaptes a la culture de cellules CD34+ humaines, ont ete decrits ci-dessus. II peut par exemple s’agir d’un milieu de culture tel que ci-dessus decrit, notamment un milieu comprenant de I’insuline humaine, de la transferrine humaine et du plasma ou serum humain. Ce milieu de culture peut etre contenu dans la poche de la cassette de la demande. Les cellules sont alors placees en incubation, par exemple en plagant la poche, ou la cassette contenant la poche, dans un incubateur, notamment dans un incubateur de la demande. Le temps d’incubation peut par exemple etre de plusieurs jours, notamment de 8 a 10 jours, en particulier de 9 jours, notamment lorsqu’il s’agit d’une culture de cellules CD34+ humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines. La demande est egalement relative a des cellules, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, a une population cellulaire comprenant ces cellules, ainsi qu’a une composition pharmaceutique comprenant ces cellules ou cette population de cellules.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 37 Ces cellules ou populations de cellules peuvent etre obtenues par culture conforme a la demande, telle que decrit ci-dessus. Des cellules de la demande peuvent notamment etre, ou comprendre, des cellules CD34+ (humaines), a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, en particulier des cellules CD34+ hematopoTetiques (humaines) ou des cellules CD34+ nonhematopoTetiques (humaines). Ces cellules CD34+ (humaines) peuvent par exemple etre des cellules du sang peripherique (humain), ou du cordon ombilical (humain) ou d’un tissu humain, en particulier du sang peripherique (humain). Ces cellules peuvent avantageusement etre, ou comprendre, des cellules souches ou progenitrices, en particulier des cellules multipotentes ou pluripotentes, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines. Ces cellules ne sont pas, ou ne comprennent pas, de cellules embryonnaires humaines. Ces cellules peuvent notamment etre, ou comprendre, des cellules souches ou progenitrices humaines CD34+ (multipotentes ou pluripotentes) du sang peripherique mobilisees par un facteur de croissance tel que Ie GCSF (Growth Colony Stimulating Factor). Les cellules de la demande, notamment les cellules CD34+ (humaines) de la demande, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, peuvent etre sous forme pure ou isolee, ou bien etre comprise dans une population cellulaire. Une population cellulaire de la demande peut ainsi etre une population de cellules humaines non embryonnaires, qui comprend des cellules CD34+ humaines de la demande. Plus particulierement, les cellules de la demande peuvent notamment etre (une population de) des cellules humaines non embryonnaires, qui sont caracterisees en ce que :5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 38 - elles sont au nombre d’au moins 107 cellules humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules humaines, et - elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires). Ces cellules humaines peuvent en outre presenter toutes Ie meme typage HLA, plus particulierement Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR. Par exemple, les cellules de la demande peuvent notamment etre (une population de) des cellules humaines hematopoTetiques non embryonnaires, qui sont caracterisees en ce que : - elles sont au nombre d’au moins 107 cellules hematopoTetiques humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules hematopoTetiques humaines, et - elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires). Ces cellules hematopoTetiques humaines peuvent en outre presenter toutes Ie meme typage HLA, plus particulierement Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR. Les cellules de la demande peuvent presenter une ou plusieurs caracteristiques, qui les distinguent de cellules naTves. Le terme « naive » signifie dans ce contexte qu’il s’agit de cellules qui ont ete directement obtenues d’un sujet ou patient humain, et qui ont eventuellement pu etre purifiees, mais qui n’ont pas ete cultivees.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 39 En effet, il a ete observe qu’apres culture conforme a la demande (par exemple sur un milieu de culture et/ou dans une poche ou cassette tels que decrits ci-dessus), la population de cellules humaines obtenue differe de la population naTve initialement placee en culture, par un ou plusieurs des aspects suivants : - un plus grand diametre moyen (diametres de 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm), - une plus forte proportion de cellules CD34- CD14+ (monocytes, lesquels peuvent avoir un impact positif sur I’efficacite d’une greffe cellulaire), - une proportion plus forte (mais qui n’atteint pas 100%) de cellules CD34+ CD33- (CD33 etant Ie marqueur de la lignee myeloTde), - une proportion plus faible (mais restant neanmoins superieure a 10%) de cellules CD34+ CD133+ (marqueur des progeniteurs endotheliaux). Plus particulierement, les cellules de la demande peuvent etre des cellules humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, qui presentent une ou plusieurs des caracteristiques suivantes : 1/ elles sont au nombre d’au moins 107 cellules humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1.5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules humaines, 2/ elles presentent toutes Ie meme typage HLA, plus particulierement Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR, 3/ elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), 4/ elles presentent un diametre cellulaire 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm,5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 40 5/ elles comprennent des cellules CD34- CD14+ (humaines) dans une proportion de 1 a 12%, en particulier de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%, 6/ elles comprennent des cellules CD34+ CD33- (humaines) dans une proportion de plus de 10% ou de plus de 20% ou de plus de 25% (et avantageusement de moins de 100%, en particulier de moins de 60% ou de moins de 50% ou de moins de 40% ou de moins de 35%), 7/ elles comprennent des cellules CD34+ CD133+ (humaines) dans une proportion de moins de 60% ou de moins de 50% (et avantageusement de plus de 20%, en particulier de plus de 25% ou de plus de 30%). Selon un mode de realisation, les cellules de la demande sont des cellules humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, qui presentent au moins deux de ces sept caracteristiques, en particulier au moins trois, ou au moins quatre, ou au moins cinq, ou au moins six de ces sept caracteristiques, ou bien presentent les sept caracteristiques. Par exemple, les cellules de la demande peuvent etre des cellules hematopoietiques humaines, qui presentent une ou plusieurs des caracteristiques suivantes : 1/ elles sont au nombre d’au moins 107 cellules hematopoietiques humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules hematopoietiques humaines, 2/ elles presentent toutes Ie meme typage HLA, plus particulierement Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR, 3/ elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), 4/ elles presentent un diametre cellulaire 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm,5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 41 5/ elles comprennent des cellules CD34- CD14+ (humaines) dans une proportion de 1 a 12%, en particulier de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%, 6/ elles comprennent des cellules CD34+ CD33- (humaines) dans une proportion de plus de 10% ou de plus de 20% ou de plus de 25% (et avantageusement de moins de 100%, en particulier de moins de 60% ou de moins de 50% ou de moins de 40% ou de moins de 35%), 7/ elles comprennent des cellules CD34+ CD133+ (humaines) dans une proportion de moins de 60% ou de moins de 50% (et avantageusement de plus de 20%, en particulier de plus de 25% ou de plus de 30%). Selon un mode de realisation, les cellules de la demande sont des cellules hematopoTetiques humaines, qui presentent au moins deux de ces sept caracteristiques, en particulier au moins trois, ou au moins quatre, ou au moins cinq, ou au moins six de ces sept caracteristiques, ou bien presentent les sept caracteristiques. Notamment, les cellules de la demande peuvent etre des cellules humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, qui presentent une ou plusieurs des caracteristiques suivantes : 1/ elles sont au nombre d’au moins 107 cellules humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules humaines, 2/ elles presentent toutes Ie meme typage HLA, plus particulierement Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR, 3/ elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), 4/ elles presentent un diametre cellulaire 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm, 5/ elles comprennent des cellules CD34- CD14+ (humaines) dans une proportion de 1 a 12%, en particulier de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%.5 10 15 20 25 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 42 Selon un mode de realisation, les cellules de la demande sont des cellules humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, qui presentent au moins deux de ces cinq caracteristiques, en particulier au moins trois, ou au moins quatre de ces cinq caracteristiques, ou bien presentent les cinq caracteristiques. Par exemple, les cellules de la demande peuvent etre des cellules hematopoTetiques humaines, qui presentent une ou plusieurs des caracteristiques suivantes : 1/ elles sont au nombre d’au moins 107 cellules hematopoTetiques humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules hematopoTetiques humaines, 2/ elles presentent toutes Ie meme typage HLA, plus particulierement Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR, 3/ elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), 4/ elles presentent un diametre cellulaire 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm, 5/ elles comprennent des cellules CD34- CD14+ (humaines) dans une proportion de 1 a 12%, en particulier de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%. Selon un mode de realisation, les cellules de la demande sont des cellules hematopoTetiques humaines, qui presentent au moins deux de ces cinq caracteristiques, en particulier au moins trois, ou au moins quatre de ces cinq caracteristiques, ou bien presentent les cinq caracteristiques. Plus particulierement, les cellules de la demande peuvent etre des cellules humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, qui presentent les caracteristiques suivantes :5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 43 - elles sont au nombre d’au moins 107 cellules humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules humaines, et - elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), et qui presentent en outre au moins I’une des (ou les deux) caracteristiques suivantes : - elles presentent un diametre cellulaire 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm, - elles comprennent des cellules CD34- CD14+ (humaines) dans une proportion de 1 a 12%, en particulier de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%. Par exemple, les cellules de la demande peuvent etre des cellules hematopoTetiques humaines, qui presentent les caracteristiques suivantes : - elles sont au nombre d’au moins 107 cellules hematopoTetiques humaines, plus particulierement au nombre d’au moins 108, ou d’au moins 1,5.108, ou de 107 a 1,7.108 cellules hematopoTetiques humaines, et - elles comprennent au moins 70% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), plus particulierement au moins 80%, ou au moins 85% ou au moins 90% de cellules CD34+ humaines (multipotentes ou pluripotentes, et non embryonnaires), et qui presentent en outre au moins I’une des (ou les deux) caracteristiques suivantes : - elles presentent un diametre cellulaire 11,2 ± 0,5 pm, en particulier de 11,18 ± 0,49 pm, - elles comprennent des cellules CD34- CD14+ (humaines) dans une proportion de 1 a 12%, en particulier de 2 a 10% ou de 3,8 a 10%.5 10 15 20 25 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 44 Les cellules de cette population peuvent toutes presenter Ie meme typage HLA-A, HLA-B, HLA-C et HLA-DR. Les cellules de cette population peuvent en outre comprendre : - des cellules CD34+ CD33- (humaines) dans une proportion de plus de 10% ou de plus de 20% ou de plus de 25% (et avantageusement de moins de 100%, en particulier de moins de 60% ou de moins de 50% ou de moins de 40% ou de moins de 35%), - des cellules CD34+ CD133+ (humaines) dans une proportion de moins de 60% ou de moins de 50% (et avantageusement de plus de 20%, en particulier de plus de 25% ou de plus de 30% de cellules CD34+ CD133+). Alternativement ou complementairement, les cellules de la demande peut presenter une ou plusieurs caracteristiques identiques (ou non significativement differentes) de celles de cellules naTves, notamment de cellules humaines naTves, notamment de cellules hematopoTetiques humaines naTves. En effet, il a ete observe qu’apres culture conforme a la demande (par exemple sur un milieu de culture et/ou dans une poche cassette tels que decrits ci-dessus), la population de cellules humaines obtenue (notamment la population de cellules hematopoTetiques humaines obtenue) peut presenter des caracteristiques communes a celles de la population naive de cellules (hematopoTetiques) initialement placee en culture. Plus particulierement, les cellules de la demande peuvent etre des cellules (notamment des cellules hematopoTetiques), qui, par rapport a des cellules naTves (notamment des cellules hematopoTetiques naTves), plus particulierement par rapport aux cellules (naTves) initialement placees en culture, presentent une ou plusieurs des caracteristiques suivantes : 1/ un nombre ou proportion identique (ou non significativement different) d’epitopes CD34,5 10 15 20 25 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 45 2/ une capacite identique (ou non significativement differente) a se diviser, en particulier une longueur relative de telomere identique (ou non significativement differente), 3/ une meme absence d’anomalie chromosomique et de polyploTdie (ou bien les memes anomalies chromosomiques ou polyploidies, dans les memes proportions), 4/ une viabilite identique (ou non significativement differente), en particulier une viabilite des cellules CD34+ identique (ou non significativement differente), par exemple une viabilite d’au moins 90% ou d’au moins 95% des cellules CD34+, 5/ une proportion identique (ou non significativement differente) de cellules CD34- CD2+/CD3+, 6/ une proportion identique (ou non significativement differente) de cellules CD34- CD19+/CD20+, 7/ une proportion identique (ou non significativement differente) de cellules CD34- CD56+, 8/ une proportion identique (ou non significativement differente) de cellules CD34- CD15+. Selon un mode de realisation, les cellules de la demande presentent au moins deux, ou au moins trois, ou au moins quatre, ou au moins cinq, ou au moins six, ou au moins sept de ces huit caracteristiques, ou bien presentent ces huit caracteristiques. Plus particulierement, les cellules de la demande peuvent etre des cellules (notamment des cellules hematopoTetiques), qui, par rapport a des cellules (hematopoTetiques) naTves, plus particulierement par rapport aux cellules (naTves) initialement placees en culture, presentent une ou plusieurs des caracteristiques suivantes : 1/ un nombre ou proportion identique (ou non significativement different) d’epitopes CD34,5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 46 2/ une capacite identique (ou non significativement differente) a se diviser, en particulier une longueur relative de telomere identique (ou non significativement differente), 3/ une meme absence d’anomalie chromosomique et de polyploTdie (ou bien les memes anomalies chromosomiques ou polyploidies, dans les memes proportions). Selon un mode de realisation, les cellules de la demande presentent au moins deux de ces trois caracteristiques, ou bien presentent les trois caracteristiques. La demande englobe explicitement toute combinaison de caracteristiques de cellules parmi celles ici decrites, et englobe notamment la combinaison de : - caracteristiques qui different les cellules de la demande de cellules naTves, et de - caracteristiques qui sont identiques a celles de cellules naTves. Les moyens de culture cellulaire de la demande correspondent essentiellement a des moyens d’amplification cellulaire ex vivo. Ils presentent I’avantage d’apporter un nombre important (plus particulierement un nombre therapeutiquement suffisant) de cellules autologues ou allogeniques, en particulier de cellules autologues (notamment de cellules CD34+ autologues ou allogeniques, en particulier de cellules CD34+ autologues) a partir d’un petit echantillon de sang peripherique d’un patient ou sujet, sans introduire de modifications deleteres sur ces cellules. Le Tableau 1 ci-dessous donne une illustration des caracteristiques d’une population de cellules obtenues du sang peripherique d’une cohorte de volontaires sains humains avant et apres mise en oeuvre d’une culture dans une poche de culture conforme a la demande (culture de 9 jours sur le milieu IMDM complemente en glutamine et depourvu de fibroblastes, et contenant 0,01mg/mL d’insuline, 330 pg/ml de transferrine, et 5% (V/V) deCA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 47 serum humain, de cellules isolees par sedimentation et purifiees par immuno-affinite sur les billes magnetiques anti-CD34): Tableau 1 : Cohorte de 71 volontaires sains humains males ages de 21 a 57 ans Echantillon biologique = 220 mL de sang peripherique par patient Population de cellules CD34+ Population naive (telle qu’obtenue sans culture des cellules) Exemple de population obtenue apres culture conforme a la demande (valeur moyenne par patient, apres culture des cellules) Nombre de cellules CD34+ * De 5,1.106 a 40,9.106 De 1.107 a 1,7.108 Viabilite des cellules CD34+ Superieure a 95% Superieure a 95% Diametre cellulaire des CD34+ 8,8 ± 0,1 pm 11,18 ± 0,49 pm Pourcentage de cellules CD34+ (apres purification) Au moins 70% (ou au moins 80%, ou au moins 85%, ou au moins 90%) Au moins 70% (ou au moins 80%, ou au moins 85%, ou au moins 90%) Cellules CD34- CD14+ De 0,2 a 0,8% De 3,8 a 10% Cellules CD34+ 4,2% 33%CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 48 : valeurs issues d’une cohorte de 8 volontaires. CD33- Cellules CD34+ CD133+ 75,8% 44,5% Nombre d’epitopes CD34+ par cellule 14 804 ±2 294 15 36312 730 Longueur relative des telomeres 9,17 ± 1,32 % 8,35 ± 2,07 % Anomalie chromosomique aucune aucune PolyploTdie aucune aucune Cellules CD34- CD2+/CD3+ De 0 a 0,3 % De 0 a 1 % Cellules CD34- CD19+/CD20+ De 0 a 0,6 % De 0,1 a 1 % Cellules CD34- CD56+ 0 % De 0 a 1 % Cellules CD34- CD15+ De 2 a 5,8 % De 2,5 a 5 % Une fois la culture terminee, les cellules obtenues, plus particulierement les cellules CD34+ (humaines) obtenues, peuvent etre collectees. 5 Les cellules collectees peuvent etre purifiees ou isolees, plus particulierement purifiees. Notamment, les cellules CD34+ peuvent etre purifiees, par exemple a I’aide des moyens de purifications disponibles a la personne du metier tels que ci-dessus indiques. Les cellules collectees et eventuellement purifiees peuvent etre 10 placees dans une composition, notamment une composition pharmaceutique, en particulier une composition pharmaceutique liquide, par exemple une solution pharmaceutique non-toxique et isotonique pour5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 49 l’etre humain. La composition ou solution qui en resulte est un objet de la demande. La composition peut comprendre un vehicule physiologiquement acceptable pour I’etre humain. La composition peut etre formulee pour etre administrable, plus particulierement injectable, dans un etre humain. Elle peut done etre liquide et comprendre des composes non-toxiques pour I’etre humain, de preference des composes non-toxiques a une concentration isotonique pour I’etre humain. Ainsi, en sus des cellules, la composition peut par exemple comprendre une solution tampon non-toxique pour I’etre humain, telle qu’une solution de tampon phosphate salin (Phosphate Buffer Saline ou PBS), ou une solution tampon de gluconate et/ou acetate. La composition peut en outre comprendre au moins un additif non toxique pour I’etre humain, par exemple une proteine du serum humain ou du plasma humain, notamment de I’albumine de serum humain (Human Serum Albumin ou HSA). La composition ou solution de la demande peut etre conservee jusqu’a utilisation, par exemple par conservation au froid (congelation). Les moyens de la demande peuvent etre utilises pour un traitement cellulaire (a visee therapeutique et/ou preventive), notamment pour un traitement cellulaire autologue ou allogenique, avantageusement un traitement cellulaire autologue. Ce traitement cellulaire peut comprendre I’administration a un patient ou sujet : - de cellules de la demande, notamment de cellules humaines comprenant des cellules CD34+ (humaines), a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines, telles que ci-dessus decrites, ou - d’une composition ou solution pharmaceutique contenant ces cellules.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 50 Ce patient ou sujet peut etre Ie meme que celui sur lequel les cellules ont ete initialement prelevees pour proceder a la culture cellulaire (traitement ou therapie cellulaire autologue). Alternativement, ce patient ou sujet peut etre different de celui sur lequel les cellules ont ete initialement prelevees pour proceder a la culture cellulaire (traitement ou therapie cellulaire allogenique). Le traitement cellulaire, plus particulierement Ie traitement cellulaire autologue ou allogenique (en particulier autologue), peut notamment etre le traitement ou la prevention d’une insuffisance cardiaque ou d’une pathologie non cardiaque. L’insuffisance cardiaque peut notamment etre : - une insuffisance cardiaque qui comprend une insuffisance ventriculaire, plus particulierement une insuffisance ventriculaire gauche, - plus particulierement une insuffisance cardiaque avec alteration de la fonction systolique, - plus particulierement une insuffisance cardiaque avec alteration de la fonction contractile d’un ventricule, en particulier du ventricule gauche, - plus particulierement une insuffisance cardiaque avec augmentation du volume telesystolique associe a une diminution de la fraction d'ejection du ventricule gauche (Left Ventricular Ejection Fraction ou LVEF). II peut notamment s’agir d’une insuffisance cardiaque de niveau II ou superieur selon la classification de la New York Heart Association (NYHA) [The Criteria Committee of the New York Heart Association. 1994. Nomenclature and Criteria for Diagnosis of Diseases of the Heart and Great Vessels. (9®me edition). Boston : Little, Brown & Co., pages 253-256], plus particulierement d’une insuffisance cardiaque de niveau II ou superieur (selon la classification de la NYHA) qui est induite par regurgitation mitrale. L’insuffisance cardiaque peut notamment etre une insuffisance cardiaque induite par - une hypertension arterielle, - une atteinte valvulaire,5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 51 - une maladie congenitale, - une angine de poitrine refractaire (par exemple, une angine de poitrine refractaire au traitement par ContrePulsion ExtraCorporelle Amelioree (CPECA) ou au traitement de neurostimulation (en particulier a la NeuroStimulation Transcutanee (NST) ou a la Stimulation de la Moelle Epiniere (SME), ou au traitement par chelation (en particulier au traitement par administration d’EDTA), - une cardiomyopathie, en particulier - une cardiomyopathie ischemique, en particulier un infarctus du myocarde, plus particulierement un infarctus aigu du myocarde, - une cardiomyopathie dilatee, - une cardiomyopathie hypertrophique, - une cardiomyopathie restrictive, - une Cardiomyopathie Ventriculaire Droite Arythmogene (CVDA). L’insuffisance cardiaque peut notamment etre une insuffisance cardiaque induite par une cardiomyopathie, en particulier par - une cardiomyopathie ischemique, en particulier un infarctus du myocarde, plus particulierement un infarctus aigu du myocarde, - une cardiomyopathie dilatee, - une cardiomyopathie hypertrophique, - une cardiomyopathie restrictive, - une Cardiomyopathie Ventriculaire Droite Arythmogene (CVDA). L’insuffisance cardiaque peut notamment etre une insuffisance cardiaque induite par une cardiomyopathie, en particulier par une cardiomyopathie ischemique, en particulier un infarctus du myocarde, plus particulierement un infarctus aigu du myocarde. L’insuffisance cardiaque peut etre traitee ou prevenue, notamment en diminuant voire supprimant l’insuffisance cardiaque et/ou en limitant Ie developpement de l’insuffisance cardiaque. Une insuffisance cardiaque induite par une cardiomyopathie ischemique, en particulier par un infarctus du myocarde, plus5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 52 particulierement par un infarctus aigu du myocarde, peut etre traitee ou prevenue notamment en diminuant voire supprimant cette insuffisance cardiaque et/ou en limitant Ie developpement de cette insuffisance cardiaque. En effet, les cellules (notamment les cellules CD34+) obtenues par culture conforme a la demande et eventuellement par purification, ou une composition ou solution pharmaceutique contenant ces cellules, peuvent etre utilisees pour un ou plusieurs des buts suivants : - diminuer voire faire disparaTtre des dommages myocardiques postischemiques, notamment la necrose post-infarctus et/ou la faille de la cicatrice post-infarctus, - regenerer partiellement ou completement la structure et/ou revasculariser Ie myocarde ou la zone infarcie, - ameliorer voire restaurer la fonction ventriculaire, en particulier la fonction ventriculaire gauche, notamment la contractilite ventriculaire, en particulier la contractilite ventriculaire gauche, par exemple pour diminuer Ie volume telesystolique en association avec une augmentation de la fraction d'ejection du ventricule gauche (Left Ventricular Ejection Fraction ou LVEF) (notamment pour atteindre une LVEF de plus de 45%). Est plus particulierement visee Ie traitement ou la prevention d’une insuffisance cardiaque induite par un infarctus (aigu) du myocarde, plus particulierement un infarctus (aigu) du myocarde du a une maladie coronarienne ou a une crise cardiaque. Cette utilisation est plus particulierement destinee : - aux patients qui presentent une alteration de la fonction ou contractilite ventriculaire gauche, et - aux patients - qui presentent un infarctus aigu du myocarde survenant de novo apres un premier incident ou syndrome cardiaque (ce premier incident ou syndrome cardiaque ayant eventuellement donne lieu a une implantation de stent(s) et a une angioplastie coronarienne transluminale percutanee5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 53 (Percutaneous Transluminal Coronary Angioplasty ou PTCA), et/ou eventuellement a un pontage aorto-coronarien (Coronary Artery Bypass Graft Surgery ou CABG) et - qui au moins 10 jours apres ce premier incident cardiaque (par exemple, au moins 3 mois ou au moins 6 mois apres ce premier incident ou syndrome cardiaque) presentent une fraction d'ejection du ventricule gauche (Left Ventricular Ejection Fraction ou LVEF) egale ou inferieure a 45%. L’administration des cellules, de cellules ou d’une composition ou solution pharmaceutique de la demande peut etre par exemple pratiquee quelques semaines, notamment de 3 a 6 semaines apres, un accident ischemique. Le traitement ou la prevention d’une insuffisance cardiaque peut comprendre une cardiomyoplastie cellulaire (par implantation des cellules administrees dans la zone cardiaque infarcie). Ce traitement ou prevention peut comprendre l’administration d’une population de cellules de la demande (notamment d’une population de cellules humaines comprenant des cellules CD34+, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines), de cellules (notamment CD34+ humaines, a I’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines) de la demande, ou d’une composition ou solution de la demande, en les injectant par chirurgie ou par catheter. L’injection par chirurgie peut etre une injection directement dans la zone infarcie, par exemple a I’occasion d’un pontage aorto-coronarien (Coronary Artery Bypass Graft Surgery ou CABG). L’injection par catheter peut notamment etre une injection par voie percutanee transfemorale. Le catheter peut notamment etre un catheter d’injection ou de perfusion intracoronarienne, epicardique ou transendocardique. Le catheter d’injection ou de perfusion peut par exemple etre muni etre muni d’une aiguille sous forme d’helice tel que le catheter HELIX®5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 54 commercialise par BIOCARDIA® (125 Shoreway Road, Suite B, San Carlos, CA 94070, U.S.A.), qui peut etre couple a un systeme de guidage a 2 dimensions (2D) tel que un guidage 2D fluoroscopique. Le catheter d’injection ou de perfusion peut par exemple etre Ie catheter MYOSTAR® commercialise par BIOSENSE WEBSTER, INC. (15715 Arrow Highway; Irwindale ; CA91706 ; U.S.A.). Le catheter d’injection ou de perfusion peut par exemple etre couple a un systeme de guidage a 3 dimensions (3D) tel que le systeme de cartographie cardiaque 3D electromagnetique NOGA® XP commercialise par BIOLOGICS DELIVERY SYSTEMS GROUP (CORDIS Corp., Diamond Bar, CA, U.S.A.). Une ou plusieurs chimiokines, en particulier une ou plusieurs chimiokines de la famille CXC, en particulier la (ou au moins la) chimiokine CXCL12 (Stromal cell-Derived Factor-1 ou SDF-1), peuvent etre administrees, plus particulierement injectees au patient ou sujet. Cette administration ou injection peut etre simultanee, conjointe ou differee dans le temps par rapport a I’administration, plus particulierement a I’injection, d’une population de cellules de la demande (notamment d’une population de cellules humaines comprenant des cellules CD34+, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines), de cellules (notamment CD34+ humaines, a (’exclusion des cellules souches embryonnaires humaines) de la demande, ou d’une composition ou solution de la demande. Les utilisations des moyens de la demande ne sont pas limitees au traitement ou a la prevention d’une insuffisance cardiaque induite par une cardiomyopathie ischemique, ou d’une insuffisance cardiaque induite par un traitement chimio-therapeutique. Les moyens de la demande (notamment les moyens CD34+ de la demande) peuvent alternativement etre utilises pour traiter ou prevenir des pathologies non cardiaques. II peut s’agir d’une pathologie non cardiaque, qui n’est pas induite par une intervention cardiaque.5 10 15 20 25 30 CA 03029072 2018-12-21 WO 2017/220948 PCT/FR2017/051703 55 Les moyens de la demande peuvent en effet etre utilises pour traiter une myelosuppression, notamment une myelosuppression induite par Ie traitement d’un lymphome, plus particulierement d’un lymphome non hodgkinien, d’un lymphome hodgkinien, d’une leucemie lymphoTde chronique. Les moyens de la demande peuvent alors etre utilises pour implanter chez Ie patient, notamment dans sa moelle osseuse, par voie intraveineuse des cellules hematopoTetiques (autologues ou provenant d’un autre sujet) de la demande, notamment une population de cellules hematopoTetiques (autologues ou allogeniques) comprenant des cellules CD34+, telle que ci-dessus decrite. Les cellules implantees sont alors destinees a regenerer la moelle osseuse du patient. Les moyens de la demande peuvent alternativement etre utilises pour traiter ou prevenir une pathologie induisant une degenerescence du cartilage, telle que I’arthrose. Les moyens de la demande peuvent alors etre utilises pour implanter chez Ie patient, notamment dans la zone arthrosique, des cellules (autologues ou provenant d’un autre sujet) de la demande, notamment une population de cellules comprenant des cellules CD34+, telle que ci-dessus decrite. Les cellules implantees sont alors destinees a regenerer Ie cartilage du patient. Les moyens de la demande peuvent alternativement etre utilises pour traiter ou prevenir une insuffisance hepatique, notamment une insuffisance hepatique chronique, en particulier une insuffisance hepatique chronique non alcoolique (par exemple pour prevenir Ie developpement d’un carcinome hepatocellulaire). Les moyens de la demande peuvent alors etre utilises pour implanter chez Ie patient, notamment dans la zone hepatique, des cellules (autologues ou provenant d’un autre sujet) de la demande, notamment une population de cellules (autologues) comprenant des cellules CD34+, telle que ci-dessus decrite. Les cellules implantees sont alors destinees a regenerer Ie foie du patient. Le terme "comprenant", avec lequel "incluant" ou "contenant" est synonyme, est un terme ouvert, et n'exclut pas la presence d’un ou5 10 15 20 25 30 Date Re^ue/Date Received 2023-10-12 56 plusieurs element(s), ingredients) ou etape(s) de methode additionnel(s) qui ne serait(seraient) pas explicitement indique(s), tandis que Ie terme "consistant" ou "constitue" est un terme ferme, qui exclut la presence de tout autre element additionnel, etape, ou ingredient qui ne serait pas explicitement expose. Le terme "consistant essentiellement" ou " essentiellement constitue" est un terme partiellement ouvert, qui n'exclut pas la presence d’un ou plusieurs element(s), ingredient(s) ou etape(s) additionnel(s), dans la mesure ou ce(s) element(s), ingredient(s) ou etape(s) additionnel(s) n'affecte(nt) pas materiellement les proprietes de base de I'invention. Par consequent, le terme "comprenant" (ou "comprend(comprennent)") indut les termes "consistant", "constitue", aussi bien que les termes "consistant essentiellement" et " essentiellement constitue". Selon certains aspects, des incarnations de la presente invention telles que decrites incluent les objets suivants : 1. Cassette de culture cellulaire comprenant : - un boltier au moins partiellement rigide et definissant interieurement un espace interieur dans lequel est agencee et fixee une poche de culture cellulaire definissant un volume interieur, - des conduits relies chacun a une extremite au volume interieur de la poche et ayant chacun une seconde extremite situee a I’exterieur du boltier, et - des vannes d’ouverture/fermeture de la circulation de fluide au travers des conduits qui sont montees sur le boltier. 2. Cassette selon I’objet 1, dans laquelle les conduits sont formes par des tubulures souples et au moins certaines des vannes comprennent un organe mobile de pincement d’une des tubulures souples sur un element de structure du boltier.5 10 15 20 25 30 Date Re^ue/Date Received 2023-10-12 57 3. Cassette selon I’objet 2, dans laquelle chaque organe mobile comprend un axe de rotation et la Peripherie radialement externe de chaque organe mobile comprend au moins une surface en spirale autour de I’axe de rotation formant une surface de pincement de I’une des tubulures souples de maniere a faire varier une section de passage de fluide au travers de I’une des tubulures souples au fur et a mesure de la rotation de I’organe. 4. Cassette selon I’objet 3, dans laquelle les organes mobiles sont montes dans des logements d’une platine agencee a I’interieur du bottier et solidaire du boTtier, chaque logement recevant un organe mobile. 5. Cassette selon I’un quelconque des objets 2 a 4, dans laquelle chaque organe mobile comprend une extremite accessible depuis I’exterieur du bottier et pourvue de premiers moyens d’accouplement en rotation destines a cooperer avec des seconds moyens d’accouplement en rotation d’un actuateur. 6. Cassette selon I’objet 4 ou 5, caracterisee en ce que les organes mobiles sont centres et guides a rotation a une extremite dans un orifice du bottier et a une extremite opposee dans un orifice de la platine. 7. Cassette selon I’un quelconque des objets 2 a 6, dans laquelle la poche presente une forme sensiblement parallelepipedique comportant une premiere paroi souple et une seconde paroi souple sensiblement paralleles I’une a I’autre a I’etat vide et a I’etat remplit de liquide. 8. Cassette selon I’un quelconque des objets 1 a 7, dans laquelle Ie bottier presente une forme correspondant sensiblement a celle d’un parallelepipeds rectangle et comporte une demi-coque inferieure et une demi-coque superieure solidaires I’une de I’autre, la demie-coque inferieure etant rigide et la demi-coque superieure etant rigide ou flexible. 9. Cassette selon I’objet 8, dans laquelle la demi-coque superieure comprend une ouverture ou evidement central dont la forme et la dimension sont determinees pour permettre la propagation d’une ondulation du liquide de la poche dans I’ouverture lorsque la cassette contenant un liquide subit5 10 15 20 25 30 Date Re^ue/Date Received 2023-10-12 58 cine oscillation autour d’un axe horizontal, I’ouverture etant disposee vers Ie haut. 10. Cassette selon I’objet 8 ou 9, dans laquelle les conduits s’etendent au travers de I’un des rebords peripheriques de I’une des demi-coques inferieure ou superieure. 11. Cassette selon I’un quelconque des objets 1 a 10, comprenant une barrette de support des conduits, agenceea I’exterieurdu bottierettraversee par au moins certains des conduits. 12. Incubateur de culture cellulaire, comprenant une enceinte thermostatee et un dispositif de support et d’agitation d’une cassette de culture cellulaire selon I’un quelconque des objets 1 a 11 et des moyens de positionnement et de blocage de la cassette de culture cellulaire dans une position donnee dans Ie dispositif de support, Ie dispositif de support et d’agitation comprenant un plateau de support de la cassette de culture cellulaire, Ie plateau portant des actuateurs electromecaniques d’ouverture/fermeture des vannes dont une sortie porte des seconds moyens d’accouplement destines a cooperer avec des premiers moyens d’accouplement des vannesde la cassette lorsque la cassette estdans ladite position donnee. 13. Incubateur selon I’objet 12, dans lequel Ie plateau de support de la cassette de culture cellulaire est monte rotatif autour d’un axe horizontal autour duquel Ie plateau est destine a osciller pour I’agitation et I’homogeneisation du contenu de la poche. 14. Incubateur selon I’objet 13, dans lequel Ie dispositif de support et d’agitation comprend une bielle dont une extremite superieure est reliee par I’intermediaire d’un oscillateur au plateau et dont I’extremite inferieure est reliee a une manivelle entrainee en rotation par I’arbre d’un moteurdont I’axe est sensiblement horizontal. 15. Incubateur selon I’un quelconque desobjets 12 a 14, comprenant une porte de fermeture etanche d’une ouverture de I’enceinte, cette ouverture comprenant un bord peripherique dans lequel est forme un renfoncement5 10 15 20 25 30 Date Re^ue/Date Received 2023-10-12 59 dont la forme est adaptee a recevoir la barrette de support des conduits d’une cassette selon I’objet 11, la barrette formant un organe d’etancheite entre la porte et Ie bord peripherique lorsque la porte est en position de femneture de I’enceinte. 16. Automate de culture cellulaire comprenant au moins un incubateur selon I’un quelconque des objets 12 a 15, et un systeme informatique de commande incluant des moyens de saisie et d’enregistrement de donnees et destine a reguler les conditions de culture dans une enceinte dudit au moins un incubateur et a piloter les vannes de la cassette logee dans I’enceinte. 17. Procede de culture cellulaire au moyen d’un automate selonI’objet 16, caracterise en ce qu’il comprend les etapes suivantes : a) placer une cassette de culture cellulaire selon I’un quelconque des objets 2 a 7 a I’interieurde I’enceinte de I’incubateur dans une position de decongelation sur Ie dispositif de support et d’agitation; b) alimenter la poche en cellules a cultiver ; c) placer la cassette sur Ie dispositif de support et d’agitation dans une position de culture cellulaire ; d) agiter la cassette durant une periode de temps donnee pour homogeneiser son contenu ; e) maintenir la cassette dans des conditions d’incubation pendant une duree de plusieurs jours ; et f) recuperer Ie contenu de la cassette au moyen de I’une des tubulures souples de la cassette. 18. Procede selon I’objet 17, caracterise en ce qu’il comprend: - pendant I’etape d), une ou plusieurs etapes de prelevement d’echantillon du contenu de la poche, qui sont chacune precedees d’une etape de basculement d’un plateau de support d’une position horizontale de culture jusqu’a une position inclinee dans laquelle la zone de prelevement de la poche represente Ie point Ie plus bas de la poche.