CA2618050A1 - Anticorps diriges contre le recepteur du ldl - Google Patents
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, son utilisation comme médicament, une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son utilisation dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhoses, en western blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
Description
DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
NOTE : Pour les tomes additionels, veuillez contacter le Bureau canadien des brevets JUVIBO APPLICATIONS/PATENTS
THIS SECTION OF THE APPLICATION/PATENT CONTAINS MORE THAN ONE
VOLUME
NOTE: For additional volumes, please contact the Canadian Patent Office NOM DU FICHIER / FILE NAME:
NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
2 PCT/FR2006/001807 Anticorps dirigés contre le récepteur du LDL
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL, son utilisation comme médicament., une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son*
utilisation dans les analyses immunohistochimiques 'de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Elot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
Le cholestérol est'un lipide fabriqué par le foie, l'intestin et les glandes corticosurrénales, mais il est aussi apporté par l'alimentation. Il intervient dans la fabrication des hormones sexuelles, des corticostéroïdes comme la cortisone nature-Ile et des composants de.la bile. Insoluble dans le sang, le cholestérol y est transporté par des lipoprotéines, notamment les LDL
(Low Density Lipoprotein).
Le cholestérol va ainsi pénétrer dans la cellule grâce à u:ne protéine cellulaire de surfa.cé capable de reconnaître les LDL : le récepteur du LDL (LDL-R). Le complexe LDL/LDL-R est alors internalisé par endocytose, et les LDL vont être digérées par les 1_,ysosomes, libérant le cholest-1:5.rol que la cellule va utiliser.
La cholestérolémie désigne le'taux de cholestérol dans le sang. Une hypocholestérolémie traduit une insuffisance de cholestérol dans le sang, alors qu'une hypercholestérolémie traduit un excès de cholestérol dans le sang.
Il a été montré qu'une hypercholestérolémie peut 2.
résulter d'un défaut de liaison entre les LDL et le LDL-R, ou encore d'un défaut d'internalisation des LDL, qui peuvent provenir d'une altération structurelle familiale du LDL-R chez ces patients (Beisiegel et al., 1981).
Par ailleurs, des études ont montré que des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux (Henricksson et al., 1989).
Il existe ainsi une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. On peut citer notamment le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies.
De plus, il est à présent connu que l'endocytose du virus de l'hépatite C est médiée par les LDL-R. Ainsi, le LDL-R pourrait servir de récepteur viral.
Ainsi,' il apparaît que le LDL-R est impliqué dans de nombreux mécanismes d'importance dans la vie cellulaire, ainsi que dans de nombreuses pathologies.
L'étude du LDL-R reste donc un enjeu majeur, tant pour comprendre son profil d'expression tissulaire dans les pathologies dans lesquelles il intervient, que pour la mise au point et l'étude de nouveaux outils thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
C'est pour répondre à ce besoin que le Demandeur a cherché à mettre au point un nouvel outil présentant
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL, son utilisation comme médicament., une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son*
utilisation dans les analyses immunohistochimiques 'de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Elot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
Le cholestérol est'un lipide fabriqué par le foie, l'intestin et les glandes corticosurrénales, mais il est aussi apporté par l'alimentation. Il intervient dans la fabrication des hormones sexuelles, des corticostéroïdes comme la cortisone nature-Ile et des composants de.la bile. Insoluble dans le sang, le cholestérol y est transporté par des lipoprotéines, notamment les LDL
(Low Density Lipoprotein).
Le cholestérol va ainsi pénétrer dans la cellule grâce à u:ne protéine cellulaire de surfa.cé capable de reconnaître les LDL : le récepteur du LDL (LDL-R). Le complexe LDL/LDL-R est alors internalisé par endocytose, et les LDL vont être digérées par les 1_,ysosomes, libérant le cholest-1:5.rol que la cellule va utiliser.
La cholestérolémie désigne le'taux de cholestérol dans le sang. Une hypocholestérolémie traduit une insuffisance de cholestérol dans le sang, alors qu'une hypercholestérolémie traduit un excès de cholestérol dans le sang.
Il a été montré qu'une hypercholestérolémie peut 2.
résulter d'un défaut de liaison entre les LDL et le LDL-R, ou encore d'un défaut d'internalisation des LDL, qui peuvent provenir d'une altération structurelle familiale du LDL-R chez ces patients (Beisiegel et al., 1981).
Par ailleurs, des études ont montré que des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux (Henricksson et al., 1989).
Il existe ainsi une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. On peut citer notamment le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies.
De plus, il est à présent connu que l'endocytose du virus de l'hépatite C est médiée par les LDL-R. Ainsi, le LDL-R pourrait servir de récepteur viral.
Ainsi,' il apparaît que le LDL-R est impliqué dans de nombreux mécanismes d'importance dans la vie cellulaire, ainsi que dans de nombreuses pathologies.
L'étude du LDL-R reste donc un enjeu majeur, tant pour comprendre son profil d'expression tissulaire dans les pathologies dans lesquelles il intervient, que pour la mise au point et l'étude de nouveaux outils thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
C'est pour répondre à ce besoin que le Demandeur a cherché à mettre au point un nouvel outil présentant
3.
une sensibilité et une spécificité pour le LDL-R le rendant particulièrement adapté à l'étude de l'expression du LDL-R, notamment dans les analyses immunohistochimiques de tissus sains, tumoraux ou cirrhosés, en Western Blot, en ELISA, ou en tests de_ quantification in vivo ou encore pour la fabrication de nouveaux outils thérapeutiques, notamment pour leur mise en muvre dans le traitement contre le cancer.
Description détaillée de l'invention L'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein).
Un premier objet de l'invention se rapporte à un anticôrps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend trois régions : la région extra-celli.ila:irë' - (1-76-8y, lâ
région transmembranaire (76~3-790) et la région cytoplasmique (790-839). La région extracellulaire est divisée en deux sous-régions : celle de liaison des LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de liaison des LDL (322-768).
L'anticorps selon l'invention a été produit de manière à se lier de manière spécifique au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du LDL-R. Ce peptide est situé dans la zone de liaison des LDL. Ce peptide a été choisi car il présente une bonne accessibilité à
l'anticorps selon l'invention, due à sa situation dans la zone de liaison des LDL, et à sa conformation
une sensibilité et une spécificité pour le LDL-R le rendant particulièrement adapté à l'étude de l'expression du LDL-R, notamment dans les analyses immunohistochimiques de tissus sains, tumoraux ou cirrhosés, en Western Blot, en ELISA, ou en tests de_ quantification in vivo ou encore pour la fabrication de nouveaux outils thérapeutiques, notamment pour leur mise en muvre dans le traitement contre le cancer.
Description détaillée de l'invention L'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein).
Un premier objet de l'invention se rapporte à un anticôrps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend trois régions : la région extra-celli.ila:irë' - (1-76-8y, lâ
région transmembranaire (76~3-790) et la région cytoplasmique (790-839). La région extracellulaire est divisée en deux sous-régions : celle de liaison des LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de liaison des LDL (322-768).
L'anticorps selon l'invention a été produit de manière à se lier de manière spécifique au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du LDL-R. Ce peptide est situé dans la zone de liaison des LDL. Ce peptide a été choisi car il présente une bonne accessibilité à
l'anticorps selon l'invention, due à sa situation dans la zone de liaison des LDL, et à sa conformation
4.
tridimensionnelle. De plus, il présente la caractéristique d'être immunogène, de par sa composition en acides aminés.
Ainsi, ce peptide a été choisi comme cible des anticorps selon l'invention en vue de produire un anticorps spécifique du LDL-R humain et présentant donc une bonne affinité pour le LDL-R. De plus, ce peptide présente 85-'. d'homologie avec le LDL-R murin ce qui permet la production d'anticorps qui cross-réagissent chez l'homme et la souris, d'oû la possibilité de mettre en uvre à la fois des,tests (de toxicité notamment) chez la souris et une utilisation chez l'homme.
D'autres avantages concernant le choix de ce peptide particulier ressortiront à la lecture de la suite de la description.
Aux fins de l'invention, le peptide auquel se lie l'anticorps peut aussi correspondre à un peptide compris dans le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R. Plus particulièrement, on entend par peptide toute molécule formée par l'enchaînement d'au moins 2 acides aminés; préférentiellement de 5 à 35 acides aminés',* et possiblement plus de 35 acides aminés.
Aux fins de l'invention, les expressions anticorps monoclonal ou composition d'anticorps monoclonal se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique.
De plus, on entend par anticorps tout anticorps entier, ainsi que tout polypeptide, peptide ou protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment d'immunoglobuline, ainsi"que tout dérivé d'anticorps.
Une molécul=e d'immunoglobuline est composée de 4 polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy) identiques de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light) identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère ést
tridimensionnelle. De plus, il présente la caractéristique d'être immunogène, de par sa composition en acides aminés.
Ainsi, ce peptide a été choisi comme cible des anticorps selon l'invention en vue de produire un anticorps spécifique du LDL-R humain et présentant donc une bonne affinité pour le LDL-R. De plus, ce peptide présente 85-'. d'homologie avec le LDL-R murin ce qui permet la production d'anticorps qui cross-réagissent chez l'homme et la souris, d'oû la possibilité de mettre en uvre à la fois des,tests (de toxicité notamment) chez la souris et une utilisation chez l'homme.
D'autres avantages concernant le choix de ce peptide particulier ressortiront à la lecture de la suite de la description.
Aux fins de l'invention, le peptide auquel se lie l'anticorps peut aussi correspondre à un peptide compris dans le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R. Plus particulièrement, on entend par peptide toute molécule formée par l'enchaînement d'au moins 2 acides aminés; préférentiellement de 5 à 35 acides aminés',* et possiblement plus de 35 acides aminés.
Aux fins de l'invention, les expressions anticorps monoclonal ou composition d'anticorps monoclonal se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique.
De plus, on entend par anticorps tout anticorps entier, ainsi que tout polypeptide, peptide ou protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment d'immunoglobuline, ainsi"que tout dérivé d'anticorps.
Une molécul=e d'immunoglobuline est composée de 4 polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy) identiques de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light) identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère ést
5-composée de 2 domaines, un domaine variable V et un domaine constant C, repliés indépendamment l'un de l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH
et 3 ou 4 domaines C noté de CH1 à CH4. Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure également La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, alors que les parties constantes peuvent interagir avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des molécules comme le complément pour médier différentes propriétés fonctionnelles.
Ainsi, on entend par domaine d'immunoglobuline l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2, CH3, CH4. L'-anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces domaines, toutes les combinaisons entre les domaines précédemment cités font partie de l'invention.
On entend par fragment d'immunoglobuline un des fragments choisis parmi le fragment Fâb,Fab', F(ab' ) 2, Fc, - -un scFv ou yix~1 CDR (Compleméntarity Determining Region).
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle fragment Fab (Fragment Antigen Binding), et -'un fragment Fc (fragment cristallisable). Le fragment Fc est - le support des fonctions effectrices des immunoglobulines.
Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est généré, où 'les deux fragments Fab restent liés par deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de deux fragments Fab', liés par des ponts disulfure
et 3 ou 4 domaines C noté de CH1 à CH4. Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure également La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, alors que les parties constantes peuvent interagir avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des molécules comme le complément pour médier différentes propriétés fonctionnelles.
Ainsi, on entend par domaine d'immunoglobuline l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2, CH3, CH4. L'-anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces domaines, toutes les combinaisons entre les domaines précédemment cités font partie de l'invention.
On entend par fragment d'immunoglobuline un des fragments choisis parmi le fragment Fâb,Fab', F(ab' ) 2, Fc, - -un scFv ou yix~1 CDR (Compleméntarity Determining Region).
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle fragment Fab (Fragment Antigen Binding), et -'un fragment Fc (fragment cristallisable). Le fragment Fc est - le support des fonctions effectrices des immunoglobulines.
Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est généré, où 'les deux fragments Fab restent liés par deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de deux fragments Fab', liés par des ponts disulfure
6.
intercaténaires pour former un F(ab')2.
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et légères, on constate que la variabilité de séquence n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les régions variables_ sont constituées d'une part de régions très peu variables nommées charpente ou framework (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité
est extrême : il s'agit des régions hypervariables , ou CDR, au nombre de 3 (CDR1 à
CDR3 ) .
Un scFv (Single Chain Fragment Variable) est un fragment constitué uniquement des domaines variables VH et VL d'un anticorps monoclonal, et dont la structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible placé entre les deux domaines (Billiald et al., 1995). De tels fragments peuvent être produits par, des bactéries. Ces molécules conservent la capacité à reconnaître de façon spécifique un antigène. De petite taille (29 kDa), ils sont peu immunogéniques et mieux tolérées que les anticorps entiers.
Ainsi, l'anticorps selon l,'invention pouvant avantageusenment. contenir un ou plusieurs de ces fragments, toùtes les combinei-s-ons entre les--fragmen.ts -précédemment cités font partie de l'invention.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l'invention contient au moins un domaine d'immunoglobuline et au moins un fragment d'immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une ou plusieurs régions variables ou hypervariables.
Enfin, on entend par dérivé d'anticorps tout anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés.
intercaténaires pour former un F(ab')2.
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et légères, on constate que la variabilité de séquence n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les régions variables_ sont constituées d'une part de régions très peu variables nommées charpente ou framework (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité
est extrême : il s'agit des régions hypervariables , ou CDR, au nombre de 3 (CDR1 à
CDR3 ) .
Un scFv (Single Chain Fragment Variable) est un fragment constitué uniquement des domaines variables VH et VL d'un anticorps monoclonal, et dont la structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible placé entre les deux domaines (Billiald et al., 1995). De tels fragments peuvent être produits par, des bactéries. Ces molécules conservent la capacité à reconnaître de façon spécifique un antigène. De petite taille (29 kDa), ils sont peu immunogéniques et mieux tolérées que les anticorps entiers.
Ainsi, l'anticorps selon l,'invention pouvant avantageusenment. contenir un ou plusieurs de ces fragments, toùtes les combinei-s-ons entre les--fragmen.ts -précédemment cités font partie de l'invention.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l'invention contient au moins un domaine d'immunoglobuline et au moins un fragment d'immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une ou plusieurs régions variables ou hypervariables.
Enfin, on entend par dérivé d'anticorps tout anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés.
7-Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon L'invention, qui possède la particularité de se lier au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du récepteur humain des LDL, ainsi que les caractéristiques présentées ci-après, permet de manière avantageuse le recrutement de cellules effectrices. A cet égard, une cellule effectrice est une cellule qui provoque la destruction des cellules sur lesquelles - l'anticorps est lié
( cellules cibles ). Plus particulièrement, les cellules effectrices expriment à leur surface un récepteur du fragment Fc des anticorps. De plus, on entend par recrutement la faculté que possède l'anticorps selon l'invention à fixer des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles. La destruction peut être une lyse, c'est-à-dire une destruction des cellules-cibles avec libération de leurcontenu. Le peptide sur lequel se lie l'anticorps selon l'invention ( peptide-cible ), est situé dans la région de liaison des LDL (ligand naturel du LDL-R).
Par cette liaison, l'anticorps selon l'invention permet le recrutement de cellules capables de provoquer la destruction dë"'céllules"""sur lesquelles l'anticorps selon l'-invention- est lié, c',est-à-dire de cellules exprimant à leur surface le LDL-R
( cellules-cibles )-.
On entend par liaison la fixation de l'anticorps sur le peptide-cible, ainsi que la fixation des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles.
Les cellules effectrices peuvent être des cellules NK
(Natural Killer). Elles peuvent aussi être des macrophages,= des neutrophiles, le lymphocyte T4, le lymphocyte T8 ou l'éosinophile. Ces cellules possèdent à leur surface des récepteurs du fragment Fc des anticorps selon l'invention. Les anticorps selon
( cellules cibles ). Plus particulièrement, les cellules effectrices expriment à leur surface un récepteur du fragment Fc des anticorps. De plus, on entend par recrutement la faculté que possède l'anticorps selon l'invention à fixer des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles. La destruction peut être une lyse, c'est-à-dire une destruction des cellules-cibles avec libération de leurcontenu. Le peptide sur lequel se lie l'anticorps selon l'invention ( peptide-cible ), est situé dans la région de liaison des LDL (ligand naturel du LDL-R).
Par cette liaison, l'anticorps selon l'invention permet le recrutement de cellules capables de provoquer la destruction dë"'céllules"""sur lesquelles l'anticorps selon l'-invention- est lié, c',est-à-dire de cellules exprimant à leur surface le LDL-R
( cellules-cibles )-.
On entend par liaison la fixation de l'anticorps sur le peptide-cible, ainsi que la fixation des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles.
Les cellules effectrices peuvent être des cellules NK
(Natural Killer). Elles peuvent aussi être des macrophages,= des neutrophiles, le lymphocyte T4, le lymphocyte T8 ou l'éosinophile. Ces cellules possèdent à leur surface des récepteurs du fragment Fc des anticorps selon l'invention. Les anticorps selon
8-l'invention se lient à la cellule-cible par leur fragment variable et se lient aux cellules effectrices par leur fragment constant. Cette relation dépendante des anticorps entre les cellules cibles et les cellules effectrices provoque la lyse des cellules cibles par un mécanisme de type ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity).
De manière avantageuse, les cellules cibles selon l'invention sont des cellules tumorales.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses ( cellules cible ). En effet, le recrutement des cellules effectrices engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention est lié. Or, des études ont montré qu'il existe une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. En effet, des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux' (Henricksson et al.*, 19-89-) .- On peut -Liter -notamment --le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies. Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention qui, par recrutement de cellules capables de détruire les cellules sur lesquelles l'anticorps est lié, provoquera la destruction de ces cellules cancéreusés.
L'invention a donc pour objet, un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux
De manière avantageuse, les cellules cibles selon l'invention sont des cellules tumorales.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses ( cellules cible ). En effet, le recrutement des cellules effectrices engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention est lié. Or, des études ont montré qu'il existe une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. En effet, des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux' (Henricksson et al.*, 19-89-) .- On peut -Liter -notamment --le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies. Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention qui, par recrutement de cellules capables de détruire les cellules sur lesquelles l'anticorps est lié, provoquera la destruction de ces cellules cancéreusés.
L'invention a donc pour objet, un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux
9.
acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
De manière avantageuse, au moins une région CDR
(Complementarity Determining Region) de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et au moins une région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7.
Les régions CDR concernées sont les régions CDR CDR1 et/ou CDR2 et/ou CDR3.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée- d'au moins 80%, 900-., 95%, 990-. et de manière encore plus préférentielle de 100% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé
en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide 'aminé
identique, ce nombre étant-, divisé pa-r le -nombre .- -d-'-a:c~ides - aminés total de la -séquenc~-c . En - tout état-- -de --cause, ces différences de séquences .n'.affectent.en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
De manière particulièrement avantageuse, chaque région CDR de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ
ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO 4 respectivement, et en ce que chaque région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement. Ainsi, la région CDR1 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, la région CDR2 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, la région CDR3 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence. peptidique ayant au moins 7026 d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 4, et la région CDRl de chacune des chaînes lourdes de. l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, la région CDR2 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec lâ séquence SEQ ID NO : 6, la région CDR3 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO . 7.
De - maniè=re particulièrement avantageuse ~ 1' zdentité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70'-., de manière préférée d'au moins 80-0., 90-'., 95%, 99-. et de manière encore plus préférentielle de 100o d'identité.
Avantageusement, la région 'variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70-'. ' d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et, la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70-'. d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
De manière particùlièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée d_',au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95-0. ou 99-0.
d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un nucléotide identique, ce nombre étant divisé par le nombre de nucléotides total de la séquence. La dégénérescence. du code génétique peut être à l'origine du fait qu'un même acide aminé puisse être codé par plusieurs triplets de nucléotides différents. En tout état de cause, ces différences de séquences n'affectent en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes- légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la 'séquence d'acidé nucléique SEQID NO- : -~ -.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède au moins 70-'. d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 10 et la, région variable de chacune de ses chaînes lourdes possède au moins 70-'.
d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID
NO : 11. De manière particulièrement avantageuse, l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70 -0., et de manière préférée d'au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95%
ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide aminé identique, ce nombre étant divisé par le nombre -d'acides aminés total de la séquence.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 11. La séquence peptidique SEQ
ID NO : 10 est la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9.
L'anticorps selon l'invention s'entend aussi de tout anticorps modifié répondant aux caractéristiques de l'invention, dans lequel un ou plusieurs acides aminés ont_été ajouté(s), substitué(s) ou délété(s). Un tel ajout, substitution ou délétion peut être localisé à
n'importe quelle position dans la molécule. Dans le cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés, substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de substitutiôn ou de délétion peut être considérée. De telles altérations de --la -- séquen.ce --cles régions variables de l'anticorps selon l'invention peuvent être effectuées dans le but d'augmenter le nombre de résidus susceptibles d'entrer en contact avec le pept.:-ide cible.
Avant'ageusement, un anticorps selon l'invention peut être, c'est-à-dire consister en un fragment F(ab')2, un fragment Fab', un fragment Fab, une région CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de ces fragments ou région.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps murin. De manière avantageuse, cet anticorps monoclonal murin est une IgGlkappa. Un tel anticorps peut être produit par immunisation d'un animal, en particulier d'une souris, avec le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1), ou avec tout autre peptide du LDL-R humain situé
dans la région de liaison aux LDL. Les méthodes de production d'anticorps sont connues de l'homme du métier. Selon un mode particulier de production des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO
1) du LDL-R, le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence du LDL-R
peut être injecté par voie intra péritonéale à des souris Balb/C en présence d'adjuvant de Freund.
Plusieurs rappels d'immunisation sont effectués en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le suivi de la réponse immunitaire des souris est réalisé sur des prélèvements _sanguins. par ELISA contre le peptide SEQ
ID NO : 1. Des hybridomes sont obtenus à partir de la fusion des cellules spléniques des souris immunisées avec des cellules de myélomes de souris en présence de PEG (polyéthylèneglycol). Les cellules sont ensuite cultivées puis testées en ELISA pour leur réponse ..contrerle ~.eptide SEQ ID NO -: 1.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle,,ï l'anticorps selon l'invention est chimérique.
On entend par anticorps chimérique un anticorps dont les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente des régions= constantes ,des chaînes légères et des chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention possède en outre des régions variables murines et des régions constantes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. De manière encore préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de -l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(l, 2), Km(l, 2, 3) ou Km(3).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type A.
Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes- légères -et dè chacune des chaînes 'l:ôurdes ' de - l' anticorps selon -=l' invention - -scs-nt des régions-humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes ,.lourdes de l'anticorps peut être de type yl, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type = G. (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour'la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps, est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant -à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs Fc[]R et le Clq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CE12 et CE13, est glycosylée au niveau du domaine C02 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yi, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC (Antibody-Dependënt Cellulâr Cytotoxicity) chez le plus- grand norribre- d'indivridus -(humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1m(3), Glm (1, 2, 17), Glm(l, 17) ou Glm(1,3).
Les anticorps chimériques"selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps chimériques -décrites par'exemple dans Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 81 : b851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine.
De tels anticorps et leur mode de préparation ont également été décrits dans la publication brevet EP
173 494, dans le document Neuberger, M.S. et al., Nature 1985 Mar 21-27;314(6008) :268=70. , ainsi que dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour générer des anticorps chimériques sont largement disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les chaînes lourdes. et légères de l'anticorps peuvent être exprimées séparément en utilisant un vecteur pour chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul vecteur.
Un vecteur d'expression est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et/ou la séquence d'acide nucléique, de préférence humaine, codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il pôssède des "séqu:ericës ' ifidïspënsâ.bles (promôtëur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à
cette expression. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute'' cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélôme humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lec1, CHO-L,ec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, . Molt-4, COS-'7, 293-HEK,.BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. ' Pour la construction de vecteurs d'expression des anticorps chimériques selon l'invention, des séquences signal synthétiques et des sites de restriction appropriés peuvent être fusionnés aux régions variables au cours des réactions d'amplification par PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec les régions constantes d'un anticorps, de manière préférentielle une IgGl humaine. Les gènes ainsi construits sont clonés sous le contrôle d'un promoteur (par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés (un- pour chaque chaîne). Les vecteurs sont également munis de gènes de sélection connus de 1,'homme du métier, tels que par exemple le gène dhfr ou le gène de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être produits par co-transfection dans une cellule hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du vecteur d'expression de la chaîne lourde en utilisant une méthode bien connue de l'homme du métier (par exemple,la co-précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la micro-injection, etc.). A
l'issue de la transfection, les cellules peuvent être mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI
(Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5-. de sérum dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 pg/ml de -G418 (Invitrogen, réf : 10131-027) - et 25 - -nM- -de methotrexate (Sigma, réf. M8407). Les surnageants des puits de transfection résistants sont criblés, pour la présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des., séquences Ig humaines. Les transfectants produisant le plus d'anticorps sont amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules / plaque).
Par anticorps humanisé, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humâine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de CDR ( CDR-grafting ) bien connues de l'homme ,du métier [publications brevet US 5,225,539, US
6,180,370 ; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5.
(1986) ; Verhoeyen et al., Bioessays 8(2) : 74-8 (1988) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86(24):10029-33 (1989) ; Lewis A.P. and Crowe J.S., Gene 101(2):297-302 (1991) ;' Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res 19(9):2471-6 (1991) ; Carter et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 89 :4285 (1992) ; Singer et al., J Immunol 150 (7) : 2844-57 (1993) ;' Presta et al., J. Immunol. , 151:2623 (1993')]. Le choix des domaines variables humains à greffer pour la production d'anticorps humanisés est important afin de réduire l'immunogénicité de l'anticorps sans altérer son af f inité pour sa cible. Dans une méthode de production d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine variable d'un anticorps murin est comparée à une banque de séquences de régions variables humaines connues et -la séquence variable Yï.urnàine la plus proche' de -la- séquence murine est rettnué comme -région FR- de-l'anticorps humanisé [Riechmann et al., Nature 332:
323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA
86(24) :10029-33 (1989) ; Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993 )]. Une autre méthode de sélection de5~
régions FR humaines est la comparaison de la séquence de chaque sous-région de la séquence FR murine (FR1, FR2, FR3 et FR4) avec une banque de séquences FR
humaines connues, afin de choisir, pour chaque région FR, la séquence FR humaine la plus proche de la séquence murine [publication brevet US 2003/0040606 ;
Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993) ;
Sato K_ et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ; Leung S.O. et al., Mol Immunol 32(17-18):1413-27 (1995) ].
Une autre méthode utilise une région FR particulière dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde ou légère [Sato K. et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ]. La greffe de CDR est complétée dans la majorité des cas par la mutation de certains résidus clés localisés dans les FR humains afin de conserver une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa cible [Holmes M.A. and Foote J., J Immunol 158 (5) :2192-201 (1997)].
Les anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par l'organisme humain, et au moins aussi efficace que l'anticorps murin. De manière 'particulièrement avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé
est 2 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant. De manière encore plus- avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé y6u -.humanisé est 10 fois, -. .ou en.core 10O fois.- ou - de -maniè--re ---préférée-- p-lus --dE- 100 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant.
Par anticorps humain,.~ on entend dé.signer un anticorps dont chaque région est dérivée d'un anticorps humain.
Ces anticorps peuvent être dérivés de souris transgéniques portant des gènes d'anticorps humains, ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct;6(5):561-6 (1995) ; Lonberg N. and D.
Huszar. Internal Review of~ Immunology 13 :65-93 (1995) ; Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.
USA 97 (2) : 722-727 (2000)].
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention est couplé à une toxine. La toxine est, par exemple, la toxine diphtérique ou la ricine. La liaison entre l'anticorps selon l'invention et la toxine est suffisamment forte pour éviter la libération systémique de la toxine et aussi suffisamment labile, afin que la toxine soit libérée dans les cellules cibles.
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est couplé à un radio-isotope. La présence du radio-isotope accroît considérablement la cytotoxicité. Deux isotopes sont essentiellement utilisés l'iode 131 (émetteur bêta et gamma), dont la demi-vie est relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention.
L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect des mesures de radio-protection. L'yttrium 90 (émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5 jours), exerce des effets tumoricides sur une distance de 5 mm.
-.De- manière- avantagëuse;~-1-'-anticorps - selon-- 1' invention permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices. Un tel anticorps, de par sa bonne spécificité et sa bonne sensibilité, est un outil pouvant servir à médier des réactions d'ADCC (Ar,~:ibody Dependent Cellular Cytotoxicity). En effet, l'anticorps selon l'invention peut être modifié de manière à induire l'ADCC, par exemple en étant chimérisé ou humanisé. L'anticorps selon l'invention permet le = recrutement de çellules immunitaires effectrices.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses. En effet, le recrutement des cellules effectrices par l'anticorps selon l'invention engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps est lié
(cellule cibl,e). Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention. Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
Un anticorps préféré selon l'invention ést l'anticorps 5E5, susceptible d'être produit par l'hybridome H5E5 (déposé sous le numéro I-3488 à l.a CNCM, Collection Nationale de Culture des Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de,chacune des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO :-9.
Un objet particulier de l'invention concerne un anticorps monoclonal se liant* au LDL-R et permettant le recrutement de cellules effectrices. Cet anticorps est le 5E5, ou .,~out anticorps chimérique, humanisé ou humain possédant les parties variables de l'anticorps 5E5.
Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est produit dans= la lignée SP2/0-AG14 de souris (ATCC CRL-1581).
Un autre objet de l'invention se rapporte à urie lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'invention tel que décrit précédemment.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable selon l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662), SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Un autre objet de l'invention se rapporte à
l'hybridome H5E5 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3488 à la CNCM.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention. Ce fragment d'ADN peut être utilisé
pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aininés 280-307' (SEQ
ID NO : 1)--, ce polypeptidê pouvant être -un anticorps., Un autre objet de l'invention* se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour la région variable de la Chaîne légère d'ury anticorps selon l'invention. De même, ce fragment d'ADN peut être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1), ce polypeptide pouvant être un anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN
choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 8.
Un autre objet de l'invention est le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL. =
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour activer in vitro ou in vivo les récepteurs FcyRIII de , cellules immunitaires effectrices. En effet, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à
activer par leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées cellules effectrices : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer), des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CDB, les lymphocytes TyS, les cellules NKT, les éosinophiles, lés basophiles bu les mastocytës ." --Uri autre objet particulier de l'invention est un anticorps tel que décrit précédemment pour son utilisation comme médicament.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet le recrutement de cellules effectrices.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire, qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps selon ],'invention, se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, est un mode de réalisation.. particulier de cet objet de l'invention.
Plus particulièrement, un objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égàrc3., l'anticorps selon l'invention, se' liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain. des LDL, est un mode de réalisation particulier de cet objet de l'invention.' Un autre objet de 1'invention -est l'u-tilisation d'un a.r.ltiçorps. tel . qzze, décrit. précéci.emment, c'est-à-d.ire possédant la capacité de se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur humain des LDL
et avantageusement au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de ~la séquence du récepteur humain des LDL, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En effet, l'anticorps selon l'invention cible le LDL-R de manière spécifique.. A cet égard, l'anticorps selon l'invention,, en se liant à ce récepteur, va engendrer une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses, notamment par ADCC contre les cellules cibles cancéreuses et permettre la lyse, de ces dernières.
Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
De manière avantageuse, les cancers traités au moyen de l'anticorps selon l'invention sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport aux cellules saines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, le cancer traité est le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, de l'estomac, des ovaires, du colon, du poumon ou des leucémies, pour lesquels on observe une augmentation de la densité de récepteurs au LDL sur la surface mémbranaire des cellulés cancéreuses. Les cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par les cellules.effectrices recrutées lors de la réaction d'ADCC, les cellules saines étant préservées' puisqu'elles.ne sur-expriment pas le LDL-R.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps -selon l'invention est utilisé "poùr- la préparation.' d' iiri -riédicâmént -destiné---au- traitement --des~ cancer-s-- incluant la leucémie myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémié
myeloïde chronique en crise blastique, les leucémies lympho3,des, les leucémies lymphoïdes chroniques, les tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde cervical, l'adénocarcinome endométrial, le carcinome gastrique, le carcinome hépatocellulaire, le choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
Un autre objet de l'invention.concerne une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
Cette composition pharmaceutique a pour vocation de cibler les cellules cancéreuses, notamment celles surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés par les cellules saines, le médicament ainsi préparé
sera préférentiellement lié par les cellules cancéreuses.
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée, etc., ainsi que toute suspension; gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.-Par ailleurs, les 'compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être --rëalisée par toute voie "classique pour 'cé type*
-d' approche ----thérâpeut 'ique, -co-mme - notamment - par- - voie-systémique, en, particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra-artérielle, etc. On peut citer par., exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur.
Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade, d'évolution de la pathologie, etc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
L'anticorps 5E5 est particulièrement approprié pour son utilisation en Western Blot, car il reconnaît de manière spécifique une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain.
L'anticorps 5E5 présente donc un avantage en tant qu'outil de diagnostique des pathologies impliquant le LDL-R, et plus particulièrement les cancers.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Légendes de figures Figure 1: Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses (résultats exprimés en unités arbi-traires de flubrescènce) .
Figure 2 : Liaison des LDL-Dil sur des cellules HepG2 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
p: .
Figure 3 : Criblage des lignées cellulaires du cancer du sein pour l'expression du LDL-R (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 4:-Liaison des anticorps anti-LDL~-R 5E5 sur des cellules A549 (résultats, exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) . Les anticorps anti-LDL-R
5E5 sont produits par l'hybridome H5E5 et sont dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur des LDL (SEQ ID NO:
1).
Figure 5 Liaison des antiçorps anti-LDL-R SES sur des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6A : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
SES sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6B : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
5E5 sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en moyenne de fluorescence).
Figure 7 Compétition des anticorps anti-LDL-R 5ES
avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en moyenne de fluoresçence).
Figure 8 Cinétique d'internalisation des anticorps anti-LDL-R SES avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en pourcentage d'internalisation).
-FigurA*__.. 9- : Caractérisaaibn de l'. anticorps - 5E5 en:, Western Blot Exemples Exemple 1 Production, sélection et caractérisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence d'acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL (SEQ ID NO
1) Choix de la séquence peptidique a propriée Le fragment peptidique correspondant à la séquence SEQ
ID NO : 1 (correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL) situé dans la région de liaison aux LDL a été synthétisé. La séquence SEQ ID NO : 1 choisie a été modifiée (remplacement des cystéines par des sérines) afin d'éviter la formation de ponts disulfures en cas d'oxydation du groupement thiol des cystéines (SEQ ID
NO : 17).
Synthèse peptidique Le peptide a été synthétisé par la méthode de synthèse en phase solide sur un synthétiseur automatique modèle ABI 433 A (Applied Biosystems Inc., Californie, USA), en utilisant une stratégie Boc/Bzl sur une résine MBHA
0,5 mmol.
Spectrométrie de masse La masse moléculaire a été déterminée en utilisant un spectromètre de masse à électrospray d'ions. Le spectre de l'électrospray a été obtenu en utilisant un appareil API (Perkin-Elmer-Sciex) sur un spectromètre de ma-sse par électrcispray- d' ions à qta.adripôlé simpl"e; "
. . .. .
équipé avec un spray-=d'.ions -(élec-t-r-osp-ray assisté d'urz-nébuliseur) (Sciex, Toronto, Canada).
Production d'anticor s monoclonaux Les anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 sont produits en immunisant des souris mâles BALB/c par injection intrapéritonéale du peptide correspondant à
la SEQ ID NO : 17, le peptide étant préalablement émulsifié avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund.
Trois injections ont ensuite été effectuées toutes les deux semaines en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Quatre jours après la dernière injection, les rates des animaux sont prélevées, puis les cellules sont isolées et fusionnées avec des cellules dé
myélome de souris Sp 2/0-Ag14 en présence d'agent de fusion tel que le polyéthylène glycol. Les cellules fusionnées sont ensuite incubées dans. un milieu sélectif (milieu HAT) qui inhibe la croissànce de cellules malignes non fusionnées.
Afin de s'assurer du caractère monoclonal des hybridomes, des sous-clonages par dilution-limite ont été réalisés. A l'issue de ces sous-clonages, un hybridome dénommé HSE5 , producteur d'anticorps dirigés contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1 a été sélectionné.. Cet hybridome appartient à
la classe des IgG, de sous classe 1.
Les anticorps produits par l'hybridome H5E5 ont été
testés par un test ELISA, pour la sécrétion d'un anticorps monoclonal de spécificité recherchée, à
savoir contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris BALB/c mâles ayant reçu au préalable une injection de pristane et auxquelles 2.106 cellules d'hybridome H5E5 ont été injectées.
Les -anticorps monoclonaux -ont étê- isolés --par-précipitation avec 27% de sulfate d'ammonium puis purifiés par chromatographie d'affinité sur gel de protéine A (colonnes HiTrap Protein A HP, Amersham Bioscience, Uppsala, Suède). Les protéines non retenues ont été éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée (PBS : Phosphate 50 mmol/L, pH 7,2, NaCl 150 mmol/L). L'élution des Immunoglobulines IgG monoclonales spécifiques de l'anticorps =dirigé contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 a été accomplie en utilisant de la glycine à 0,2 M à pH2,8. Les anticorps purifiés ont été dialysés immédiatement contre 10 mmol/L de PBS, concentrés par lyophilisation, puis conservés par aliquots de 0.5 à 1 mg +/- BSA 1% à-20 C.
Ces anticorps seront dénommés ci-après Anti-LDL-R
5E5 .
Analyse en Western Blot Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été testés en Western Blot. Des extraits de protéines totales de cellules MDA-MB-231 ont été soumis à une électrophorèse dénaturante sur gel SDS-PAGE (10%) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose et mis à réagir avec les anticorps Anti-LDL-R 5E5. Les protéines immunoréactives ont été visualisées avec un anticorps monoclonal anti-IgG conjugué à la peroxidase (Chemicon). Le développement de la réaction a été
effectué par chemiluminescence (Amersham, Biosciences).
L'analyse en Western Blot montre que l'anticorps anti-LDL-R 5E5 reconnaît une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain (Figure 9).
Isotypage L'isotypage des hybridomes a ét'é effëctüé par. - ELISA
avec- l-e kit SEA- ~lonotyping System/HRP, (SouthernBiotech) et avec l'Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test (Roche-référence 1493027).
L'anticorps 5E5 est une IgGl, kappa.
Exemple 2 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été
criblées pour l'expression du LDL-R HepG2, HeLa, MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 et Hek293 par l'étude de la liaison de LDL marquées (Figures 1 et 2). Pour cela, les LDL (densité = 1.03-1.053 g/ml) ont été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7.4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-i.ndocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur des cellules à
des concentrations finales de 0, 10 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie au FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorting) c'est-à-dire que la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur d'une population donnée est individuellement mesurée par cytométrie en flux sur un appareil Facscalibur (Becton Dickinson). Les paramètres mesurés sont le FSC
(Forward Scatter), SSC (Side Scatter) et la fluorescence émise à la longueur d'onde de 530 nm après excitation avec" un laser Argon à 488 nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 1).
*Les résultats présentés sur la figure 1 montrent que les cellules HepG2 et les cellules HeLa expriment le plus fortement le LDL-R.
De plus, plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231. L"expréssion dia. LDL-R sïa.r cès - lignées cellulaires cancéreuses humaines a été mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.03-1.053) ont été prépa'rées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules= à des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été
analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats 33' ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (figure 3) : les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R
équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau.
Exemple 3 : Tests fonctionnels in vitro des-anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 sélectionnés à l'Exemple 1 La fonctionnalité des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 1 a été évaluée par l'étude de la liaison des anticorps au,LDL-R au niveau cellulaire (cellules A549 et cellules .MDA-MB-231), l'étude de la cross-réactivité des anticorps au LDL-R de cellules C2C12 (souris) , CHO-K1 (hamster) , YB2/0 (rat) , l'étude de la compétition entre ces anticorps et les LDL sur le LDL-R de cellules A459, l'étude de leur cinétique d'internalisation ai.xs.si_ que a..' ét-.ude du caractère pro-apoptotique aes anticorps.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules A549 La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R a été
évaluée par quantification du marquage de cellules A549 cultivées en présence de LPDS (lipoprotein Deficient Serum) pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps, Anti-LDL-R 5ES ont été incubés à des concentrations finales de (1, 3, 10, 30, 100 g/ml) pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl, ATCC-LGC
Promochem CRL-2224) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC
CRL-1691), préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été
effectuée en utilisant un anticorps secondaire anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 4).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules A549 de manière dose-dépendante.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules MDA-MB-231 La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R des cellules MDA-MB-231 a été évaluée selon le même protocole décrit pour l'étude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5ES au LDL-R de cellules A549, par quantification du marquage de cellules MDA-MB-231 cultivées en présence de LPDS pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à des concentrations finales de 1, 3, 10, 30, 100 ~ig/ml pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R., IgG2b), _ . : r,_..___,._.. _ préparés 'ét~ incubés' dans les -mêmes conditions que les--Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE.
Les résultats, ont,-été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 5).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules MDA-MB-231 Etude de la cross-réactivité des anticorps Anti-LDL-R
5E5 au LDL-R de cellules C2C12, CHO-K1 et YB2/0 La cross-réactivité des anticorps anti LDL-R a été
testée chez la souris (cellules C2C12), chez le rat (cellules YB2/0) et chez le hamster (cellules CHO-K1).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à une concentration finale de 30 }a.g/ml pendant 3, h:eures à
4 C sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 préalablement cultivées en conditions de LPDS pendant 24h. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R,, IgG2b) ont servis d'anticorps contrôles négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 6A) et en moyenne de fluorescence (Figure 6B).
Etude de la compétition des anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec les LDL sur des cellules A549 La compétition des LDL avec les anticorps Anti-LDL-R
SE5 a été étudiée en testant la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5, à 30 pg/ml, en compétition avec des LDL non marquées à des concentrations croissantes (1, 4 et 16 fois la concentration des anticorps, exprimée en nM) sur des cellules A549 pendant 3 h à 4 C. La révélation de la liaison a été 'efféctué-e en ü.til=isant un- anti-I-gG-PE "'.-Lâ -l*ia.is n dés- anticorps' --au LDL-R -a été ensuite analysée par FACS et les résultats exprimés en moyenne de fluorescence (Figure 7).
Ce test de compétition des anticorps avec les LDL a permis. de mettre en évidence que la liaisQn de l'anticorps SES au LDL-R des cellules A549 n'est pas diminuée par l'addition de LDL à des concentrations physiologiques dans le milieu. Cela signifie que les anticorps 5E5 ne se lient pas au même site que les LDL. Cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R
La cinétique d'internalisation de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée sur 24 heures lors de l'incubation à 37 C de l'anticorps (30 pg/ml) marqué à
la rhodamine (NHS-rhodamine, Pierce, réf 46102) sur des cellules A549. Les cinétiques d'internalisation de l'anticorps contrôle C7 (30 l.zg/ml) marqué à la rhodamine et des LDL-Dil (30 }a.g/ml) ont été étudiées en parallèle. Après 2h, 4h, 6h et 24h d'incubation, les anticorps/LDL-Dil liés mais non internalisés ont été décrochés par du sulfate de dextran et quantifiés par fluorimétrie. Les cellules A549 ont ensuite été
lysées par de la soude (0.1 N) puis la quantité
d'ainticorps internalisés a été quantifiée par fluorimétrie. Le pourcentage d'internalisation a été
calculé selon la formule suivante : fluorescence des anticorps internalisés/(fluorescence des anticorps internalisés + fluorescence des anticorps liés mais non internalisés).
La cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R 5E5 est intermédiaire entre celle des LDL (cinétique la plus rapide avec 60-'. d'internalisation à 4h) et celle du C7 qui s'internalise un peu plus lentement (Figure 8). Comme pour les LDL, la cinétique d'inter-nalisation des- anticorps -est- biphâsique avec . __ , .
une i,nterna,lisatïor? : ragide.-.au . cours--- des- 4- à.---5-premières heures. Après 6h d'incubation, les 3 anticorps testés montrent le même taux d'internalisation avec un plateau d'internalisation d'environ 60-0. à 2.4h.
Etude du caractère pro-apoptotique des anticorps Anti-La croissance des cellules A549 en présence et en l'absence d'=anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée par un double marquage FITC-annexine V (qui se lie à la phosphatidylsérine des cellules apoptotiques en phase précoce) et iodure de propidium (PI, qui ne marque que les cellules nécrotiques dont la membrane plasmique est lésée) par c tométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5ES ont été
incubés à une concentration finale de 30 ug/ml pendant 16 heures (durée d'un test d'ADCC) à 37 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b), préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis de référence. Un contrôle négatif, cellules sans anticorps, et un contrôle positif, cellules incubées-avec de la camptothécine, ont été effectués parallèlement.
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ne présentent pas d'effet fortement pro-apoptotique sur lés cellules A549 après 16h d'incubation.
Exemple 4 : Etudes in vivo Le modèle animal choisi est un modèle de xénogreffe de tissu tumoral humain sur des souris nude. La xénogreffe de cellules tumorales est implantée en sous-cutanée.
Choix de la lignée cellulaire cancéreuse humaine pour la xénog,ré f f e :,_ ... .
Cr blage- . -dés lignées cel-l-ul-aires - pour -l'expression du LDL-R
Plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231 et,le choix de la lignée à implanter dépend pour n.~itre étude du niveau d'expression du LDL-R. L'expression du LDL-R
sur ces lignées cellulaires cancéreuses humaines a été
mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL
marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.0à-1.053 g/ml) ont- été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH
7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,31,3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules à
des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (Figures 2 et 3): les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau. Au vu de ces résultats, notre choix -sur la lignée à implanter s'est porté sur les MDA-MB-231.
= Détermination .du nombre de cellules à implanter pour la xénogreffe La vitesse d'apparition de la tumeur en fonction du nombre de cellules implantées chez des souris nude a été étudiée. L'étude porte sur l'"implantation de 0, 5. 106, 106, 2. 106 et 5. 106 cellules.
= Etude de la compétition de l'anticorps Anti-LDL-R
5ES avec les LDL sur des cellules MDA-MB-231 La compétition des LDL avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée en testant la liaison des LDL marquées au Dil, à 12.5 l.zg/ml en compétition avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 à des concentrations croissantes (6,25, 12,5, 25, 50., et 80 ~a.g/ml) sur des cellules MDA-MB-231 pendant 3 h à 4 C. La liaison des anticorps au LDL-R a été ensuite analysée par FACS et les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes..
Prôtocole in vivo Pour le traitement des souris avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5, l'approche choisie consiste à injecter la lignée cellulaire et l'anticorps simultanément (Test de Winn=). Cette approche permet d'évaluer la capacité
de l'anticorps à empêcher la formation de la tumeur.
Le premier groupe, groupe Contrôle, comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-ME-231 reprises dans 200~a.l d'un anticorps contrôle, de même isotype que l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 (TgG3,) qui ne reconnaît pas le LDL-R, sans traitement successif à
l'implantation des cellules.
Le deuxième groupe comprend 5- souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 r.eprises dans 200u1' d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, sans traitement successif à l'implantation des cellules.
Par ailleurs, une approche modifiée du test de Winn consistant à traiter les souris nude après implantation simultanée des cellules MDA-MB-231 et de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec 1'anticorps Anti-LDL-R
5E5, deux fois par semaine au cours des 4 semaines de l'étude (troisième groupe) a été mise en place. Le troisième groupe comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 2001-i1 d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, traitées en intra-pérïtoriéâle par 500 ug d'ain.ticorps An'ti-LDL=R SES, 2 ....
fois par semaine (le premier traitement par' 500 - g-ayant eu lieu 3 à 4 h après l'implantation des cellules).
Les souris sont contrôlées tous les jours avec mesure de la prise de poids et de la taille de.:la tumeur 3 fois par semaine. A la fin des 4 semaines de protocole, les souris sont sacrifiées et le foie, le coeur, les reins et la rate sont récupérés et congelés à - 80 C pour chacune des 5 souris de chaque groupe.
Par ailleurs, les sérums des, souris sont aussi récupérés et congelés.
Exemple 5 Etude de faisabilité thérapeutique.
L'étude de la faisabilité thérapeutique a eu pour but de mettre en évidence une sur-expression du LDL-R dans le tissu, cancéreux par rapport au tissu sain, dans différents types de cancers. Pour cela une analyse en Western B1ot (WB) de carcinomes hépatocellulaires a été réalisée.
Une analyse en Western Blot a été réalisée à partir de tissus issus de patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool (3 patients) ou sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C (15 patients). Deux prélèvements de tissu ont été fournis pour chaque patient: (i) un échantillon prélevé dans une zone non-tumorale mais cirrhosée et (ii) un échantillon prélevé dans du tissu tumoral, issu du même patient (avec un minimum de 70%
d'hépatocytes tumoraux).
Des analyses de type Western Blot, en utilisant un anticorps anti-LDL-R polyclonal de lapin (Research Diagnostics. Inc).,, ,_ont été r.éali.sées_..sur ces tissus.. _ Une bande à 160 kDa, qui correspond à la forme mature du LDL-R, a été observée à la fois sur les tissus cirrhosés et sur les tissus cancéreux. En plus de cette bande, une bande à 120 kDa, correspondant à la forme immature du LDL-R (non glycosylée), est présente."
La quantification de la bande correspondant au LDL-R
mature, normalisée par rapport à l'actine, a permis de mettre en évidence :
- Une sur-expression du LDL-R dans le tissu sain des 3 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool et dans le tissu sain de 2 patients sur les 15 atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C.
- Une sur-expression du LDL-R . dans le tissu cancéreux chez 7 patients sur les 15 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus, de l'hépatite C
(niveau de sur-expression chez ces patients est entre 2 et 14 fois).
- Six patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C n'ont pas présenté de' différentiel d'expression du LDL-R.
Exemple 6: étude de la spécificité de l'anticorps L'étude immunohistochimique a été réalisée sur des lames de tissue micro-array de tissus humains normaux, comportant 108 spots correspondants à 54 tissus humains normaux différents fixés en formol à 10%.
L'anticorps C7 et l'anticorps anti-LDL-R 5E5 ont ont été dilués au 1/10 (10pg/ml). La réactivation antigénique a été réalisée au micro-ondes, 3 fois 5 minutes à 750 Watts dans un tampon citrate lOmM, pH 6.
T1 a- -été observé une absence - de ' marquâ.ge '-dans le systëme hématôpcïétique (amygdale-, -rate et gangl-ie;n lymphoïde), le tissu musculaire (cceur et muscle strié
squelettique), le revêtement cutané et le tissu mammaire, quel que soit l'anticorps utilisé. Le système nerveux central (cortex cérébral, cervelet, noyaux gris centraux, hippocampe et moelle épinière), les glandes surrénales (cortex et médullaire), le foie et la vésicule biliaire ont été marqués par les 2 anticorps.
Ces résultats sont en accord avec la littérature sur la distribution tissulaire 'du LDL-R puisque les surrénales, le foie, le système nerveux central, les testicules et les reins ont été décrits comme dès tissus exprimant fortement le LDL-R.
LDL-R
Exemple 6 : Amplification et séquençage des régions variables des anticorps anti-LDL-R 5E5 1.Amplification des régions VH et VK
L'ARN total de l'hybridome murin 5E5, produisant une immunoglobuline de type IgGl,K, a été extrait (kit Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). Les domaines variables des chaînes légère (Vx) et lourde (VH) de 1-'anticorps 5E5 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit 5'RACE, Invitrogen ref., 18374.041) en s'ancrant dans la région constante Kappa (CK) murine, pour la chaîne légère Kappa, ou G1 murine, pour la chaîne lourde.
Brièvement, une première étapé de transcription inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une amorce localisée dans la région 5' des régions constantes CK ou G1 murines. Une séquence poly-dC a été ensuite ajoutée en 3' dës ADNc synthétisés avarït de. réaliser l' amplification- des régions~ -VK- et - VH à
l'aide d'une amorce 5' reconnaissant la séquence poly-dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions constantes CK ou G1 murines en 5' de l'amorce de tran~c*ription inverse. Afin d'améliorer la spécificité
de l'amplification une deuxième PCR semi-nested a été réalisée sur le produit de PCR VH en utilisant une amorce 3' située en 5' de l'amorce 3' de la première PCR.
Les amorces utilisées pour ces différents étapes sont les suivantes .
1) amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO
12) b. Amorce antisens spécifique Gi murin 5'- CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3' ,(SEQ ID NO : 13) 2) amorces de PCR 5'RACE
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 14.) b. Amorces antisens spécifiques G1 murin Amorce première PCR
5'- TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3' (SEQ ID NO
15) Amorce PCR semi-nested 5'-CACCATGGA.GTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA - 3' (SEQ ID NO
16) 2. Déterminationde la séquence des régions VH et VK
Après amplification les séquences Vx et VH de l'anticorps 5E5 ont été clonées dans le plasmide pCR4-TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen, ref . 45-0030) . Les plasmidè"s" issus -*d' âü"' mixi.imum. 3 colonie-s -recombinantes ont été purifiés et -1-eur- insert-séquencé à l'aide des amorces universelles M13 uni et rev.
La séquence nucléotidique de,,' la région VK de l'anticorps murin 5E5 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient au sous-groupe VK4 (VK4/5, Almagro JC et al Immunogeneti~cs 1998, 47 : 355-363). Les séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VK de -l'anticorps murin 5ES, définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH
Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4, respectivement La séquence nucléotidique de la région VH de 5E5 est la séquence SEQ ID NO : 9 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH
appartient au sous-groupe V'.H1 (Honjo T. and Matsuda F.
in Immunoglobulin genes . Honjo T. and Alt F.W.
eds, academic Press, London, 1996, pp145-171). Les séquences des CDRl, CDR2 et CDR3 de la région VH de l'anticorps murin 5E5, définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, respectivement.
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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
De manière avantageuse, au moins une région CDR
(Complementarity Determining Region) de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et au moins une région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7.
Les régions CDR concernées sont les régions CDR CDR1 et/ou CDR2 et/ou CDR3.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée- d'au moins 80%, 900-., 95%, 990-. et de manière encore plus préférentielle de 100% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé
en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide 'aminé
identique, ce nombre étant-, divisé pa-r le -nombre .- -d-'-a:c~ides - aminés total de la -séquenc~-c . En - tout état-- -de --cause, ces différences de séquences .n'.affectent.en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
De manière particulièrement avantageuse, chaque région CDR de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ
ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO 4 respectivement, et en ce que chaque région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement. Ainsi, la région CDR1 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, la région CDR2 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, la région CDR3 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence. peptidique ayant au moins 7026 d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 4, et la région CDRl de chacune des chaînes lourdes de. l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, la région CDR2 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec lâ séquence SEQ ID NO : 6, la région CDR3 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO . 7.
De - maniè=re particulièrement avantageuse ~ 1' zdentité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70'-., de manière préférée d'au moins 80-0., 90-'., 95%, 99-. et de manière encore plus préférentielle de 100o d'identité.
Avantageusement, la région 'variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70-'. ' d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et, la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70-'. d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
De manière particùlièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée d_',au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95-0. ou 99-0.
d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un nucléotide identique, ce nombre étant divisé par le nombre de nucléotides total de la séquence. La dégénérescence. du code génétique peut être à l'origine du fait qu'un même acide aminé puisse être codé par plusieurs triplets de nucléotides différents. En tout état de cause, ces différences de séquences n'affectent en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes- légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la 'séquence d'acidé nucléique SEQID NO- : -~ -.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède au moins 70-'. d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 10 et la, région variable de chacune de ses chaînes lourdes possède au moins 70-'.
d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID
NO : 11. De manière particulièrement avantageuse, l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70 -0., et de manière préférée d'au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95%
ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide aminé identique, ce nombre étant divisé par le nombre -d'acides aminés total de la séquence.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 11. La séquence peptidique SEQ
ID NO : 10 est la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9.
L'anticorps selon l'invention s'entend aussi de tout anticorps modifié répondant aux caractéristiques de l'invention, dans lequel un ou plusieurs acides aminés ont_été ajouté(s), substitué(s) ou délété(s). Un tel ajout, substitution ou délétion peut être localisé à
n'importe quelle position dans la molécule. Dans le cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés, substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de substitutiôn ou de délétion peut être considérée. De telles altérations de --la -- séquen.ce --cles régions variables de l'anticorps selon l'invention peuvent être effectuées dans le but d'augmenter le nombre de résidus susceptibles d'entrer en contact avec le pept.:-ide cible.
Avant'ageusement, un anticorps selon l'invention peut être, c'est-à-dire consister en un fragment F(ab')2, un fragment Fab', un fragment Fab, une région CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de ces fragments ou région.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps murin. De manière avantageuse, cet anticorps monoclonal murin est une IgGlkappa. Un tel anticorps peut être produit par immunisation d'un animal, en particulier d'une souris, avec le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1), ou avec tout autre peptide du LDL-R humain situé
dans la région de liaison aux LDL. Les méthodes de production d'anticorps sont connues de l'homme du métier. Selon un mode particulier de production des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO
1) du LDL-R, le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence du LDL-R
peut être injecté par voie intra péritonéale à des souris Balb/C en présence d'adjuvant de Freund.
Plusieurs rappels d'immunisation sont effectués en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le suivi de la réponse immunitaire des souris est réalisé sur des prélèvements _sanguins. par ELISA contre le peptide SEQ
ID NO : 1. Des hybridomes sont obtenus à partir de la fusion des cellules spléniques des souris immunisées avec des cellules de myélomes de souris en présence de PEG (polyéthylèneglycol). Les cellules sont ensuite cultivées puis testées en ELISA pour leur réponse ..contrerle ~.eptide SEQ ID NO -: 1.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle,,ï l'anticorps selon l'invention est chimérique.
On entend par anticorps chimérique un anticorps dont les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente des régions= constantes ,des chaînes légères et des chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention possède en outre des régions variables murines et des régions constantes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. De manière encore préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de -l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(l, 2), Km(l, 2, 3) ou Km(3).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type A.
Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes- légères -et dè chacune des chaînes 'l:ôurdes ' de - l' anticorps selon -=l' invention - -scs-nt des régions-humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes ,.lourdes de l'anticorps peut être de type yl, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type = G. (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour'la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps, est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant -à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs Fc[]R et le Clq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CE12 et CE13, est glycosylée au niveau du domaine C02 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yi, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC (Antibody-Dependënt Cellulâr Cytotoxicity) chez le plus- grand norribre- d'indivridus -(humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1m(3), Glm (1, 2, 17), Glm(l, 17) ou Glm(1,3).
Les anticorps chimériques"selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps chimériques -décrites par'exemple dans Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 81 : b851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine.
De tels anticorps et leur mode de préparation ont également été décrits dans la publication brevet EP
173 494, dans le document Neuberger, M.S. et al., Nature 1985 Mar 21-27;314(6008) :268=70. , ainsi que dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour générer des anticorps chimériques sont largement disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les chaînes lourdes. et légères de l'anticorps peuvent être exprimées séparément en utilisant un vecteur pour chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul vecteur.
Un vecteur d'expression est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et/ou la séquence d'acide nucléique, de préférence humaine, codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il pôssède des "séqu:ericës ' ifidïspënsâ.bles (promôtëur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à
cette expression. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute'' cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélôme humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lec1, CHO-L,ec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, . Molt-4, COS-'7, 293-HEK,.BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. ' Pour la construction de vecteurs d'expression des anticorps chimériques selon l'invention, des séquences signal synthétiques et des sites de restriction appropriés peuvent être fusionnés aux régions variables au cours des réactions d'amplification par PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec les régions constantes d'un anticorps, de manière préférentielle une IgGl humaine. Les gènes ainsi construits sont clonés sous le contrôle d'un promoteur (par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés (un- pour chaque chaîne). Les vecteurs sont également munis de gènes de sélection connus de 1,'homme du métier, tels que par exemple le gène dhfr ou le gène de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être produits par co-transfection dans une cellule hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du vecteur d'expression de la chaîne lourde en utilisant une méthode bien connue de l'homme du métier (par exemple,la co-précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la micro-injection, etc.). A
l'issue de la transfection, les cellules peuvent être mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI
(Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5-. de sérum dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 pg/ml de -G418 (Invitrogen, réf : 10131-027) - et 25 - -nM- -de methotrexate (Sigma, réf. M8407). Les surnageants des puits de transfection résistants sont criblés, pour la présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des., séquences Ig humaines. Les transfectants produisant le plus d'anticorps sont amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules / plaque).
Par anticorps humanisé, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humâine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de CDR ( CDR-grafting ) bien connues de l'homme ,du métier [publications brevet US 5,225,539, US
6,180,370 ; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5.
(1986) ; Verhoeyen et al., Bioessays 8(2) : 74-8 (1988) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86(24):10029-33 (1989) ; Lewis A.P. and Crowe J.S., Gene 101(2):297-302 (1991) ;' Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res 19(9):2471-6 (1991) ; Carter et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 89 :4285 (1992) ; Singer et al., J Immunol 150 (7) : 2844-57 (1993) ;' Presta et al., J. Immunol. , 151:2623 (1993')]. Le choix des domaines variables humains à greffer pour la production d'anticorps humanisés est important afin de réduire l'immunogénicité de l'anticorps sans altérer son af f inité pour sa cible. Dans une méthode de production d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine variable d'un anticorps murin est comparée à une banque de séquences de régions variables humaines connues et -la séquence variable Yï.urnàine la plus proche' de -la- séquence murine est rettnué comme -région FR- de-l'anticorps humanisé [Riechmann et al., Nature 332:
323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA
86(24) :10029-33 (1989) ; Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993 )]. Une autre méthode de sélection de5~
régions FR humaines est la comparaison de la séquence de chaque sous-région de la séquence FR murine (FR1, FR2, FR3 et FR4) avec une banque de séquences FR
humaines connues, afin de choisir, pour chaque région FR, la séquence FR humaine la plus proche de la séquence murine [publication brevet US 2003/0040606 ;
Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993) ;
Sato K_ et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ; Leung S.O. et al., Mol Immunol 32(17-18):1413-27 (1995) ].
Une autre méthode utilise une région FR particulière dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde ou légère [Sato K. et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ]. La greffe de CDR est complétée dans la majorité des cas par la mutation de certains résidus clés localisés dans les FR humains afin de conserver une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa cible [Holmes M.A. and Foote J., J Immunol 158 (5) :2192-201 (1997)].
Les anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par l'organisme humain, et au moins aussi efficace que l'anticorps murin. De manière 'particulièrement avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé
est 2 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant. De manière encore plus- avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé y6u -.humanisé est 10 fois, -. .ou en.core 10O fois.- ou - de -maniè--re ---préférée-- p-lus --dE- 100 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant.
Par anticorps humain,.~ on entend dé.signer un anticorps dont chaque région est dérivée d'un anticorps humain.
Ces anticorps peuvent être dérivés de souris transgéniques portant des gènes d'anticorps humains, ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct;6(5):561-6 (1995) ; Lonberg N. and D.
Huszar. Internal Review of~ Immunology 13 :65-93 (1995) ; Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.
USA 97 (2) : 722-727 (2000)].
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention est couplé à une toxine. La toxine est, par exemple, la toxine diphtérique ou la ricine. La liaison entre l'anticorps selon l'invention et la toxine est suffisamment forte pour éviter la libération systémique de la toxine et aussi suffisamment labile, afin que la toxine soit libérée dans les cellules cibles.
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est couplé à un radio-isotope. La présence du radio-isotope accroît considérablement la cytotoxicité. Deux isotopes sont essentiellement utilisés l'iode 131 (émetteur bêta et gamma), dont la demi-vie est relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention.
L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect des mesures de radio-protection. L'yttrium 90 (émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5 jours), exerce des effets tumoricides sur une distance de 5 mm.
-.De- manière- avantagëuse;~-1-'-anticorps - selon-- 1' invention permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices. Un tel anticorps, de par sa bonne spécificité et sa bonne sensibilité, est un outil pouvant servir à médier des réactions d'ADCC (Ar,~:ibody Dependent Cellular Cytotoxicity). En effet, l'anticorps selon l'invention peut être modifié de manière à induire l'ADCC, par exemple en étant chimérisé ou humanisé. L'anticorps selon l'invention permet le = recrutement de çellules immunitaires effectrices.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses. En effet, le recrutement des cellules effectrices par l'anticorps selon l'invention engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps est lié
(cellule cibl,e). Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention. Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
Un anticorps préféré selon l'invention ést l'anticorps 5E5, susceptible d'être produit par l'hybridome H5E5 (déposé sous le numéro I-3488 à l.a CNCM, Collection Nationale de Culture des Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de,chacune des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO :-9.
Un objet particulier de l'invention concerne un anticorps monoclonal se liant* au LDL-R et permettant le recrutement de cellules effectrices. Cet anticorps est le 5E5, ou .,~out anticorps chimérique, humanisé ou humain possédant les parties variables de l'anticorps 5E5.
Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est produit dans= la lignée SP2/0-AG14 de souris (ATCC CRL-1581).
Un autre objet de l'invention se rapporte à urie lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'invention tel que décrit précédemment.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable selon l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662), SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Un autre objet de l'invention se rapporte à
l'hybridome H5E5 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3488 à la CNCM.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention. Ce fragment d'ADN peut être utilisé
pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aininés 280-307' (SEQ
ID NO : 1)--, ce polypeptidê pouvant être -un anticorps., Un autre objet de l'invention* se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour la région variable de la Chaîne légère d'ury anticorps selon l'invention. De même, ce fragment d'ADN peut être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1), ce polypeptide pouvant être un anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN
choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 8.
Un autre objet de l'invention est le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL. =
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour activer in vitro ou in vivo les récepteurs FcyRIII de , cellules immunitaires effectrices. En effet, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à
activer par leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées cellules effectrices : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer), des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CDB, les lymphocytes TyS, les cellules NKT, les éosinophiles, lés basophiles bu les mastocytës ." --Uri autre objet particulier de l'invention est un anticorps tel que décrit précédemment pour son utilisation comme médicament.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet le recrutement de cellules effectrices.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire, qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps selon ],'invention, se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, est un mode de réalisation.. particulier de cet objet de l'invention.
Plus particulièrement, un objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égàrc3., l'anticorps selon l'invention, se' liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain. des LDL, est un mode de réalisation particulier de cet objet de l'invention.' Un autre objet de 1'invention -est l'u-tilisation d'un a.r.ltiçorps. tel . qzze, décrit. précéci.emment, c'est-à-d.ire possédant la capacité de se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur humain des LDL
et avantageusement au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de ~la séquence du récepteur humain des LDL, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En effet, l'anticorps selon l'invention cible le LDL-R de manière spécifique.. A cet égard, l'anticorps selon l'invention,, en se liant à ce récepteur, va engendrer une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses, notamment par ADCC contre les cellules cibles cancéreuses et permettre la lyse, de ces dernières.
Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
De manière avantageuse, les cancers traités au moyen de l'anticorps selon l'invention sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport aux cellules saines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, le cancer traité est le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, de l'estomac, des ovaires, du colon, du poumon ou des leucémies, pour lesquels on observe une augmentation de la densité de récepteurs au LDL sur la surface mémbranaire des cellulés cancéreuses. Les cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par les cellules.effectrices recrutées lors de la réaction d'ADCC, les cellules saines étant préservées' puisqu'elles.ne sur-expriment pas le LDL-R.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps -selon l'invention est utilisé "poùr- la préparation.' d' iiri -riédicâmént -destiné---au- traitement --des~ cancer-s-- incluant la leucémie myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémié
myeloïde chronique en crise blastique, les leucémies lympho3,des, les leucémies lymphoïdes chroniques, les tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde cervical, l'adénocarcinome endométrial, le carcinome gastrique, le carcinome hépatocellulaire, le choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
Un autre objet de l'invention.concerne une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
Cette composition pharmaceutique a pour vocation de cibler les cellules cancéreuses, notamment celles surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés par les cellules saines, le médicament ainsi préparé
sera préférentiellement lié par les cellules cancéreuses.
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée, etc., ainsi que toute suspension; gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.-Par ailleurs, les 'compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être --rëalisée par toute voie "classique pour 'cé type*
-d' approche ----thérâpeut 'ique, -co-mme - notamment - par- - voie-systémique, en, particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra-artérielle, etc. On peut citer par., exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur.
Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade, d'évolution de la pathologie, etc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
L'anticorps 5E5 est particulièrement approprié pour son utilisation en Western Blot, car il reconnaît de manière spécifique une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain.
L'anticorps 5E5 présente donc un avantage en tant qu'outil de diagnostique des pathologies impliquant le LDL-R, et plus particulièrement les cancers.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Légendes de figures Figure 1: Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses (résultats exprimés en unités arbi-traires de flubrescènce) .
Figure 2 : Liaison des LDL-Dil sur des cellules HepG2 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
p: .
Figure 3 : Criblage des lignées cellulaires du cancer du sein pour l'expression du LDL-R (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 4:-Liaison des anticorps anti-LDL~-R 5E5 sur des cellules A549 (résultats, exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) . Les anticorps anti-LDL-R
5E5 sont produits par l'hybridome H5E5 et sont dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur des LDL (SEQ ID NO:
1).
Figure 5 Liaison des antiçorps anti-LDL-R SES sur des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6A : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
SES sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6B : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
5E5 sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en moyenne de fluorescence).
Figure 7 Compétition des anticorps anti-LDL-R 5ES
avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en moyenne de fluoresçence).
Figure 8 Cinétique d'internalisation des anticorps anti-LDL-R SES avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en pourcentage d'internalisation).
-FigurA*__.. 9- : Caractérisaaibn de l'. anticorps - 5E5 en:, Western Blot Exemples Exemple 1 Production, sélection et caractérisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence d'acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL (SEQ ID NO
1) Choix de la séquence peptidique a propriée Le fragment peptidique correspondant à la séquence SEQ
ID NO : 1 (correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL) situé dans la région de liaison aux LDL a été synthétisé. La séquence SEQ ID NO : 1 choisie a été modifiée (remplacement des cystéines par des sérines) afin d'éviter la formation de ponts disulfures en cas d'oxydation du groupement thiol des cystéines (SEQ ID
NO : 17).
Synthèse peptidique Le peptide a été synthétisé par la méthode de synthèse en phase solide sur un synthétiseur automatique modèle ABI 433 A (Applied Biosystems Inc., Californie, USA), en utilisant une stratégie Boc/Bzl sur une résine MBHA
0,5 mmol.
Spectrométrie de masse La masse moléculaire a été déterminée en utilisant un spectromètre de masse à électrospray d'ions. Le spectre de l'électrospray a été obtenu en utilisant un appareil API (Perkin-Elmer-Sciex) sur un spectromètre de ma-sse par électrcispray- d' ions à qta.adripôlé simpl"e; "
. . .. .
équipé avec un spray-=d'.ions -(élec-t-r-osp-ray assisté d'urz-nébuliseur) (Sciex, Toronto, Canada).
Production d'anticor s monoclonaux Les anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 sont produits en immunisant des souris mâles BALB/c par injection intrapéritonéale du peptide correspondant à
la SEQ ID NO : 17, le peptide étant préalablement émulsifié avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund.
Trois injections ont ensuite été effectuées toutes les deux semaines en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Quatre jours après la dernière injection, les rates des animaux sont prélevées, puis les cellules sont isolées et fusionnées avec des cellules dé
myélome de souris Sp 2/0-Ag14 en présence d'agent de fusion tel que le polyéthylène glycol. Les cellules fusionnées sont ensuite incubées dans. un milieu sélectif (milieu HAT) qui inhibe la croissànce de cellules malignes non fusionnées.
Afin de s'assurer du caractère monoclonal des hybridomes, des sous-clonages par dilution-limite ont été réalisés. A l'issue de ces sous-clonages, un hybridome dénommé HSE5 , producteur d'anticorps dirigés contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1 a été sélectionné.. Cet hybridome appartient à
la classe des IgG, de sous classe 1.
Les anticorps produits par l'hybridome H5E5 ont été
testés par un test ELISA, pour la sécrétion d'un anticorps monoclonal de spécificité recherchée, à
savoir contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris BALB/c mâles ayant reçu au préalable une injection de pristane et auxquelles 2.106 cellules d'hybridome H5E5 ont été injectées.
Les -anticorps monoclonaux -ont étê- isolés --par-précipitation avec 27% de sulfate d'ammonium puis purifiés par chromatographie d'affinité sur gel de protéine A (colonnes HiTrap Protein A HP, Amersham Bioscience, Uppsala, Suède). Les protéines non retenues ont été éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée (PBS : Phosphate 50 mmol/L, pH 7,2, NaCl 150 mmol/L). L'élution des Immunoglobulines IgG monoclonales spécifiques de l'anticorps =dirigé contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 a été accomplie en utilisant de la glycine à 0,2 M à pH2,8. Les anticorps purifiés ont été dialysés immédiatement contre 10 mmol/L de PBS, concentrés par lyophilisation, puis conservés par aliquots de 0.5 à 1 mg +/- BSA 1% à-20 C.
Ces anticorps seront dénommés ci-après Anti-LDL-R
5E5 .
Analyse en Western Blot Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été testés en Western Blot. Des extraits de protéines totales de cellules MDA-MB-231 ont été soumis à une électrophorèse dénaturante sur gel SDS-PAGE (10%) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose et mis à réagir avec les anticorps Anti-LDL-R 5E5. Les protéines immunoréactives ont été visualisées avec un anticorps monoclonal anti-IgG conjugué à la peroxidase (Chemicon). Le développement de la réaction a été
effectué par chemiluminescence (Amersham, Biosciences).
L'analyse en Western Blot montre que l'anticorps anti-LDL-R 5E5 reconnaît une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain (Figure 9).
Isotypage L'isotypage des hybridomes a ét'é effëctüé par. - ELISA
avec- l-e kit SEA- ~lonotyping System/HRP, (SouthernBiotech) et avec l'Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test (Roche-référence 1493027).
L'anticorps 5E5 est une IgGl, kappa.
Exemple 2 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été
criblées pour l'expression du LDL-R HepG2, HeLa, MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 et Hek293 par l'étude de la liaison de LDL marquées (Figures 1 et 2). Pour cela, les LDL (densité = 1.03-1.053 g/ml) ont été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7.4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-i.ndocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur des cellules à
des concentrations finales de 0, 10 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie au FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorting) c'est-à-dire que la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur d'une population donnée est individuellement mesurée par cytométrie en flux sur un appareil Facscalibur (Becton Dickinson). Les paramètres mesurés sont le FSC
(Forward Scatter), SSC (Side Scatter) et la fluorescence émise à la longueur d'onde de 530 nm après excitation avec" un laser Argon à 488 nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 1).
*Les résultats présentés sur la figure 1 montrent que les cellules HepG2 et les cellules HeLa expriment le plus fortement le LDL-R.
De plus, plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231. L"expréssion dia. LDL-R sïa.r cès - lignées cellulaires cancéreuses humaines a été mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.03-1.053) ont été prépa'rées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules= à des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été
analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats 33' ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (figure 3) : les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R
équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau.
Exemple 3 : Tests fonctionnels in vitro des-anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 sélectionnés à l'Exemple 1 La fonctionnalité des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 1 a été évaluée par l'étude de la liaison des anticorps au,LDL-R au niveau cellulaire (cellules A549 et cellules .MDA-MB-231), l'étude de la cross-réactivité des anticorps au LDL-R de cellules C2C12 (souris) , CHO-K1 (hamster) , YB2/0 (rat) , l'étude de la compétition entre ces anticorps et les LDL sur le LDL-R de cellules A459, l'étude de leur cinétique d'internalisation ai.xs.si_ que a..' ét-.ude du caractère pro-apoptotique aes anticorps.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules A549 La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R a été
évaluée par quantification du marquage de cellules A549 cultivées en présence de LPDS (lipoprotein Deficient Serum) pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps, Anti-LDL-R 5ES ont été incubés à des concentrations finales de (1, 3, 10, 30, 100 g/ml) pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl, ATCC-LGC
Promochem CRL-2224) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC
CRL-1691), préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été
effectuée en utilisant un anticorps secondaire anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 4).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules A549 de manière dose-dépendante.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules MDA-MB-231 La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R des cellules MDA-MB-231 a été évaluée selon le même protocole décrit pour l'étude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5ES au LDL-R de cellules A549, par quantification du marquage de cellules MDA-MB-231 cultivées en présence de LPDS pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à des concentrations finales de 1, 3, 10, 30, 100 ~ig/ml pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R., IgG2b), _ . : r,_..___,._.. _ préparés 'ét~ incubés' dans les -mêmes conditions que les--Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE.
Les résultats, ont,-été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 5).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules MDA-MB-231 Etude de la cross-réactivité des anticorps Anti-LDL-R
5E5 au LDL-R de cellules C2C12, CHO-K1 et YB2/0 La cross-réactivité des anticorps anti LDL-R a été
testée chez la souris (cellules C2C12), chez le rat (cellules YB2/0) et chez le hamster (cellules CHO-K1).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à une concentration finale de 30 }a.g/ml pendant 3, h:eures à
4 C sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 préalablement cultivées en conditions de LPDS pendant 24h. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R,, IgG2b) ont servis d'anticorps contrôles négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 6A) et en moyenne de fluorescence (Figure 6B).
Etude de la compétition des anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec les LDL sur des cellules A549 La compétition des LDL avec les anticorps Anti-LDL-R
SE5 a été étudiée en testant la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5, à 30 pg/ml, en compétition avec des LDL non marquées à des concentrations croissantes (1, 4 et 16 fois la concentration des anticorps, exprimée en nM) sur des cellules A549 pendant 3 h à 4 C. La révélation de la liaison a été 'efféctué-e en ü.til=isant un- anti-I-gG-PE "'.-Lâ -l*ia.is n dés- anticorps' --au LDL-R -a été ensuite analysée par FACS et les résultats exprimés en moyenne de fluorescence (Figure 7).
Ce test de compétition des anticorps avec les LDL a permis. de mettre en évidence que la liaisQn de l'anticorps SES au LDL-R des cellules A549 n'est pas diminuée par l'addition de LDL à des concentrations physiologiques dans le milieu. Cela signifie que les anticorps 5E5 ne se lient pas au même site que les LDL. Cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R
La cinétique d'internalisation de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée sur 24 heures lors de l'incubation à 37 C de l'anticorps (30 pg/ml) marqué à
la rhodamine (NHS-rhodamine, Pierce, réf 46102) sur des cellules A549. Les cinétiques d'internalisation de l'anticorps contrôle C7 (30 l.zg/ml) marqué à la rhodamine et des LDL-Dil (30 }a.g/ml) ont été étudiées en parallèle. Après 2h, 4h, 6h et 24h d'incubation, les anticorps/LDL-Dil liés mais non internalisés ont été décrochés par du sulfate de dextran et quantifiés par fluorimétrie. Les cellules A549 ont ensuite été
lysées par de la soude (0.1 N) puis la quantité
d'ainticorps internalisés a été quantifiée par fluorimétrie. Le pourcentage d'internalisation a été
calculé selon la formule suivante : fluorescence des anticorps internalisés/(fluorescence des anticorps internalisés + fluorescence des anticorps liés mais non internalisés).
La cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R 5E5 est intermédiaire entre celle des LDL (cinétique la plus rapide avec 60-'. d'internalisation à 4h) et celle du C7 qui s'internalise un peu plus lentement (Figure 8). Comme pour les LDL, la cinétique d'inter-nalisation des- anticorps -est- biphâsique avec . __ , .
une i,nterna,lisatïor? : ragide.-.au . cours--- des- 4- à.---5-premières heures. Après 6h d'incubation, les 3 anticorps testés montrent le même taux d'internalisation avec un plateau d'internalisation d'environ 60-0. à 2.4h.
Etude du caractère pro-apoptotique des anticorps Anti-La croissance des cellules A549 en présence et en l'absence d'=anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée par un double marquage FITC-annexine V (qui se lie à la phosphatidylsérine des cellules apoptotiques en phase précoce) et iodure de propidium (PI, qui ne marque que les cellules nécrotiques dont la membrane plasmique est lésée) par c tométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5ES ont été
incubés à une concentration finale de 30 ug/ml pendant 16 heures (durée d'un test d'ADCC) à 37 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b), préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis de référence. Un contrôle négatif, cellules sans anticorps, et un contrôle positif, cellules incubées-avec de la camptothécine, ont été effectués parallèlement.
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ne présentent pas d'effet fortement pro-apoptotique sur lés cellules A549 après 16h d'incubation.
Exemple 4 : Etudes in vivo Le modèle animal choisi est un modèle de xénogreffe de tissu tumoral humain sur des souris nude. La xénogreffe de cellules tumorales est implantée en sous-cutanée.
Choix de la lignée cellulaire cancéreuse humaine pour la xénog,ré f f e :,_ ... .
Cr blage- . -dés lignées cel-l-ul-aires - pour -l'expression du LDL-R
Plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231 et,le choix de la lignée à implanter dépend pour n.~itre étude du niveau d'expression du LDL-R. L'expression du LDL-R
sur ces lignées cellulaires cancéreuses humaines a été
mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL
marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.0à-1.053 g/ml) ont- été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH
7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,31,3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules à
des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (Figures 2 et 3): les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau. Au vu de ces résultats, notre choix -sur la lignée à implanter s'est porté sur les MDA-MB-231.
= Détermination .du nombre de cellules à implanter pour la xénogreffe La vitesse d'apparition de la tumeur en fonction du nombre de cellules implantées chez des souris nude a été étudiée. L'étude porte sur l'"implantation de 0, 5. 106, 106, 2. 106 et 5. 106 cellules.
= Etude de la compétition de l'anticorps Anti-LDL-R
5ES avec les LDL sur des cellules MDA-MB-231 La compétition des LDL avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée en testant la liaison des LDL marquées au Dil, à 12.5 l.zg/ml en compétition avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 à des concentrations croissantes (6,25, 12,5, 25, 50., et 80 ~a.g/ml) sur des cellules MDA-MB-231 pendant 3 h à 4 C. La liaison des anticorps au LDL-R a été ensuite analysée par FACS et les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes..
Prôtocole in vivo Pour le traitement des souris avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5, l'approche choisie consiste à injecter la lignée cellulaire et l'anticorps simultanément (Test de Winn=). Cette approche permet d'évaluer la capacité
de l'anticorps à empêcher la formation de la tumeur.
Le premier groupe, groupe Contrôle, comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-ME-231 reprises dans 200~a.l d'un anticorps contrôle, de même isotype que l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 (TgG3,) qui ne reconnaît pas le LDL-R, sans traitement successif à
l'implantation des cellules.
Le deuxième groupe comprend 5- souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 r.eprises dans 200u1' d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, sans traitement successif à l'implantation des cellules.
Par ailleurs, une approche modifiée du test de Winn consistant à traiter les souris nude après implantation simultanée des cellules MDA-MB-231 et de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec 1'anticorps Anti-LDL-R
5E5, deux fois par semaine au cours des 4 semaines de l'étude (troisième groupe) a été mise en place. Le troisième groupe comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 2001-i1 d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, traitées en intra-pérïtoriéâle par 500 ug d'ain.ticorps An'ti-LDL=R SES, 2 ....
fois par semaine (le premier traitement par' 500 - g-ayant eu lieu 3 à 4 h après l'implantation des cellules).
Les souris sont contrôlées tous les jours avec mesure de la prise de poids et de la taille de.:la tumeur 3 fois par semaine. A la fin des 4 semaines de protocole, les souris sont sacrifiées et le foie, le coeur, les reins et la rate sont récupérés et congelés à - 80 C pour chacune des 5 souris de chaque groupe.
Par ailleurs, les sérums des, souris sont aussi récupérés et congelés.
Exemple 5 Etude de faisabilité thérapeutique.
L'étude de la faisabilité thérapeutique a eu pour but de mettre en évidence une sur-expression du LDL-R dans le tissu, cancéreux par rapport au tissu sain, dans différents types de cancers. Pour cela une analyse en Western B1ot (WB) de carcinomes hépatocellulaires a été réalisée.
Une analyse en Western Blot a été réalisée à partir de tissus issus de patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool (3 patients) ou sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C (15 patients). Deux prélèvements de tissu ont été fournis pour chaque patient: (i) un échantillon prélevé dans une zone non-tumorale mais cirrhosée et (ii) un échantillon prélevé dans du tissu tumoral, issu du même patient (avec un minimum de 70%
d'hépatocytes tumoraux).
Des analyses de type Western Blot, en utilisant un anticorps anti-LDL-R polyclonal de lapin (Research Diagnostics. Inc).,, ,_ont été r.éali.sées_..sur ces tissus.. _ Une bande à 160 kDa, qui correspond à la forme mature du LDL-R, a été observée à la fois sur les tissus cirrhosés et sur les tissus cancéreux. En plus de cette bande, une bande à 120 kDa, correspondant à la forme immature du LDL-R (non glycosylée), est présente."
La quantification de la bande correspondant au LDL-R
mature, normalisée par rapport à l'actine, a permis de mettre en évidence :
- Une sur-expression du LDL-R dans le tissu sain des 3 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool et dans le tissu sain de 2 patients sur les 15 atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C.
- Une sur-expression du LDL-R . dans le tissu cancéreux chez 7 patients sur les 15 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus, de l'hépatite C
(niveau de sur-expression chez ces patients est entre 2 et 14 fois).
- Six patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C n'ont pas présenté de' différentiel d'expression du LDL-R.
Exemple 6: étude de la spécificité de l'anticorps L'étude immunohistochimique a été réalisée sur des lames de tissue micro-array de tissus humains normaux, comportant 108 spots correspondants à 54 tissus humains normaux différents fixés en formol à 10%.
L'anticorps C7 et l'anticorps anti-LDL-R 5E5 ont ont été dilués au 1/10 (10pg/ml). La réactivation antigénique a été réalisée au micro-ondes, 3 fois 5 minutes à 750 Watts dans un tampon citrate lOmM, pH 6.
T1 a- -été observé une absence - de ' marquâ.ge '-dans le systëme hématôpcïétique (amygdale-, -rate et gangl-ie;n lymphoïde), le tissu musculaire (cceur et muscle strié
squelettique), le revêtement cutané et le tissu mammaire, quel que soit l'anticorps utilisé. Le système nerveux central (cortex cérébral, cervelet, noyaux gris centraux, hippocampe et moelle épinière), les glandes surrénales (cortex et médullaire), le foie et la vésicule biliaire ont été marqués par les 2 anticorps.
Ces résultats sont en accord avec la littérature sur la distribution tissulaire 'du LDL-R puisque les surrénales, le foie, le système nerveux central, les testicules et les reins ont été décrits comme dès tissus exprimant fortement le LDL-R.
LDL-R
Exemple 6 : Amplification et séquençage des régions variables des anticorps anti-LDL-R 5E5 1.Amplification des régions VH et VK
L'ARN total de l'hybridome murin 5E5, produisant une immunoglobuline de type IgGl,K, a été extrait (kit Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). Les domaines variables des chaînes légère (Vx) et lourde (VH) de 1-'anticorps 5E5 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit 5'RACE, Invitrogen ref., 18374.041) en s'ancrant dans la région constante Kappa (CK) murine, pour la chaîne légère Kappa, ou G1 murine, pour la chaîne lourde.
Brièvement, une première étapé de transcription inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une amorce localisée dans la région 5' des régions constantes CK ou G1 murines. Une séquence poly-dC a été ensuite ajoutée en 3' dës ADNc synthétisés avarït de. réaliser l' amplification- des régions~ -VK- et - VH à
l'aide d'une amorce 5' reconnaissant la séquence poly-dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions constantes CK ou G1 murines en 5' de l'amorce de tran~c*ription inverse. Afin d'améliorer la spécificité
de l'amplification une deuxième PCR semi-nested a été réalisée sur le produit de PCR VH en utilisant une amorce 3' située en 5' de l'amorce 3' de la première PCR.
Les amorces utilisées pour ces différents étapes sont les suivantes .
1) amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO
12) b. Amorce antisens spécifique Gi murin 5'- CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3' ,(SEQ ID NO : 13) 2) amorces de PCR 5'RACE
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 14.) b. Amorces antisens spécifiques G1 murin Amorce première PCR
5'- TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3' (SEQ ID NO
15) Amorce PCR semi-nested 5'-CACCATGGA.GTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA - 3' (SEQ ID NO
16) 2. Déterminationde la séquence des régions VH et VK
Après amplification les séquences Vx et VH de l'anticorps 5E5 ont été clonées dans le plasmide pCR4-TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen, ref . 45-0030) . Les plasmidè"s" issus -*d' âü"' mixi.imum. 3 colonie-s -recombinantes ont été purifiés et -1-eur- insert-séquencé à l'aide des amorces universelles M13 uni et rev.
La séquence nucléotidique de,,' la région VK de l'anticorps murin 5E5 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient au sous-groupe VK4 (VK4/5, Almagro JC et al Immunogeneti~cs 1998, 47 : 355-363). Les séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VK de -l'anticorps murin 5ES, définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH
Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4, respectivement La séquence nucléotidique de la région VH de 5E5 est la séquence SEQ ID NO : 9 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH
appartient au sous-groupe V'.H1 (Honjo T. and Matsuda F.
in Immunoglobulin genes . Honjo T. and Alt F.W.
eds, academic Press, London, 1996, pp145-171). Les séquences des CDRl, CDR2 et CDR3 de la région VH de l'anticorps murin 5E5, définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, respectivement.
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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE:
Claims (28)
1. Anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ
ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
2. Anticorps selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'au moins une région CDR (Complementarity Determining Region) de chacune de ses chaînes légères possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et en ce qu' au moins une région CDR de chacune de ses chaînes lourdes possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ
ID NO : 7.
d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et en ce qu' au moins une région CDR de chacune de ses chaînes lourdes possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ
ID NO : 7.
3. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qué chaque region CDR de chacune de ses chaînes légères possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4 respectivement, et en ce que chaque région CDR de chacune de ses chaînes lourdes possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement.
4. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70%
d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO : 8, et en ce que la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO : 8, et en ce que la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
5. Anticorps selon la revendication 4, caractérisé en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes légères est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et en ce que ladite région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
6. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un fragment F(ab')2, d'un fragment Fab', d'un fragment Fab, d'une région CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de ces fragments ou région.
7. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est murin.
8. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est chimérique, humanisé ou humain.
9. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est couplé à une toxine.
10. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices.
11. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il permet la destruction des cellules cancéreuses.
12. Anticorps selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il est produit dans la lignée cellulaire SP2/0-AG14 de souris.
13. Anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à il, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être produit par l'hybridome H5E5 déposé
sous le numéro I-3488 à la CNCM.
sous le numéro I-3488 à la CNCM.
14. Lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 11.
15. Lignée cellulaire stable selon la revendication 14 choisie parmi le groupe consistant en : YB2/0, SP2/0-AG14, IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-Lec10, CHO-Lec1, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
16. Hybridome H5E5 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3488 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM).
17. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
18. Fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour la région variable de la chaîne légère d'un anticorps selon l'une des revendications 1 à 13.
19. Vecteur d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 8.
20. Peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
21. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, pour activer in vitro les récepteurs Fc.gamma.RIII de cellules immunitaires effectrices.
22. Utilisation d'un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 pour la fabrication d'un médicament.
23. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 22 pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer.
24. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 ou 23, caractérisée en ce que les cancers traités sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la surface des cellules cancéreuses.
25. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 à 24, caractérisée en ce que ledit cancer est le cancer de la prostate, du pancréas, du foie, du sein, de l'estomac, des ovaires, du colon, du poumon ou des leucémies.
26. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 22 à 24 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers incluant la leucémie myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémie myeloïde chronique en crise blastique, les leucémies lymphoïdes, les leucémies lymphoïdes chroniques, les tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde cervical, l'adénocarcinome endométrial, le carcinome gastrique, _ le carcinome hépatocellulaire, le choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
27. Composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'une quelconque des revendications 1 à 13 et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
28. Utilisation de l'anticorps selon l'une des revendications 1 à 13 dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
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