CA2618050A1 - Antibodies directed against an ldl receptor - Google Patents
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Abstract
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, son utilisation comme médicament, une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son utilisation dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhoses, en western blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo. The present invention relates to a monoclonal antibody directed against human LDL receptor (Low Density Lipoprotein), binding to peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the sequence peptidic LDL receptor, its use as a medicament, a pharmaceutical composition containing this antibody, as well as its use in immunohistochemical analyzes of cancerous tissue, whether healthy or cirrhosis, western blot, ELISA or in vivo quantification test.
Description
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WO 2007/01499
2 PCT/FR2006/001807 Anticorps dirigés contre le récepteur du LDL
La présente invention concerne un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL, son utilisation comme médicament., une composition pharmaceutique contenant cet anticorps, ainsi que son*
utilisation dans les analyses immunohistochimiques 'de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Elot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
Le cholestérol est'un lipide fabriqué par le foie, l'intestin et les glandes corticosurrénales, mais il est aussi apporté par l'alimentation. Il intervient dans la fabrication des hormones sexuelles, des corticostéroïdes comme la cortisone nature-Ile et des composants de.la bile. Insoluble dans le sang, le cholestérol y est transporté par des lipoprotéines, notamment les LDL
(Low Density Lipoprotein).
Le cholestérol va ainsi pénétrer dans la cellule grâce à u:ne protéine cellulaire de surfa.cé capable de reconnaître les LDL : le récepteur du LDL (LDL-R). Le complexe LDL/LDL-R est alors internalisé par endocytose, et les LDL vont être digérées par les 1_,ysosomes, libérant le cholest-1:5.rol que la cellule va utiliser.
La cholestérolémie désigne le'taux de cholestérol dans le sang. Une hypocholestérolémie traduit une insuffisance de cholestérol dans le sang, alors qu'une hypercholestérolémie traduit un excès de cholestérol dans le sang.
Il a été montré qu'une hypercholestérolémie peut 2.
résulter d'un défaut de liaison entre les LDL et le LDL-R, ou encore d'un défaut d'internalisation des LDL, qui peuvent provenir d'une altération structurelle familiale du LDL-R chez ces patients (Beisiegel et al., 1981).
Par ailleurs, des études ont montré que des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux (Henricksson et al., 1989).
Il existe ainsi une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. On peut citer notamment le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies.
De plus, il est à présent connu que l'endocytose du virus de l'hépatite C est médiée par les LDL-R. Ainsi, le LDL-R pourrait servir de récepteur viral.
Ainsi,' il apparaît que le LDL-R est impliqué dans de nombreux mécanismes d'importance dans la vie cellulaire, ainsi que dans de nombreuses pathologies.
L'étude du LDL-R reste donc un enjeu majeur, tant pour comprendre son profil d'expression tissulaire dans les pathologies dans lesquelles il intervient, que pour la mise au point et l'étude de nouveaux outils thérapeutiques pour le traitement de ces pathologies.
C'est pour répondre à ce besoin que le Demandeur a cherché à mettre au point un nouvel outil présentant 2 PCT / FR2006 / 001807 Antibodies to the LDL receptor The present invention relates to a monoclonal antibody directed against the human LDL receptor (Low Density Lipoprotein), binding to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the sequence Peptide of the human LDL receptor, its use as a medicine., a composition pharmaceutical product containing this antibody, as well as its use in immunohistochemical analyzes of cancerous, healthy or cirrhosis tissues, or in Western Elot assays, ELISA or quantification in vivo.
Cholesterol is a lipid made by the liver, gut and adrenal glands, but is also brought by the diet. He took part in the manufacture of sex hormones, corticosteroids such as cortisone nature-Ile and components of the bile. Insoluble in the blood, cholesterol is there transported by lipoproteins, in particular LDL
(Low Density Lipoprotein).
Cholesterol will enter the cell thanks to to u: ne surfa.cé cellular protein capable of recognize LDL: the LDL receptor (LDL-R). The LDL / LDL-R complex is then internalized by endocytosis, and LDL will be digested by the 1_, ysosomes, releasing cholest-1: 5.rol as the cell goes use.
Cholesterolemia refers to the levels of cholesterol in the blood. Hypocholesterolemia translates a cholesterol deficiency in the blood, whereas a hypercholesterolemia reflects excess cholesterol in the blood.
It has been shown that hypercholesterolemia can 2.
result of a lack of connection between LDL and LDL-R, or a lack of internalization of the LDL, which can come from an alteration family structure of LDL-R in these patients (Beisiegel et al., 1981).
In addition, studies have shown that patients certain cancers have a Hypocholesterolemia. This hypocholesterolemia is the consequence of overuse of cholesterol by cancer cells. For their survival, these last induce an increase in the level expression of the LDL receptor (LDL-R) within the tumor organs (Henricksson et al., 1989).
There is thus a correlation between the increase the level of expression of LDL-R by cells and some cancers. We can notably mention the cancer of prostate, breast, liver, pancreas, ovaries, colon, lung, stomach and leukemia.
In addition, it is now known that endocytosis of Hepatitis C virus is mediated by LDL-R. So, LDL-R could serve as a viral receptor.
Thus, 'it appears that LDL-R is involved in many important mechanisms in life as well as in many pathologies.
The study of LDL-R therefore remains a major challenge, both for understand his tissue expression pattern in pathologies in which it intervenes, that for the development and study of new tools therapeutics for the treatment of these pathologies.
It is to meet this need that the Applicant has sought to develop a new tool presenting
3.
une sensibilité et une spécificité pour le LDL-R le rendant particulièrement adapté à l'étude de l'expression du LDL-R, notamment dans les analyses immunohistochimiques de tissus sains, tumoraux ou cirrhosés, en Western Blot, en ELISA, ou en tests de_ quantification in vivo ou encore pour la fabrication de nouveaux outils thérapeutiques, notamment pour leur mise en muvre dans le traitement contre le cancer.
Description détaillée de l'invention L'invention se rapporte à un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein).
Un premier objet de l'invention se rapporte à un anticôrps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
Le récepteur humain des LDL (LDL-R) est une protéine transmembranaire de 839 acides aminés qui comprend trois régions : la région extra-celli.ila:irë' - (1-76-8y, lâ
région transmembranaire (76~3-790) et la région cytoplasmique (790-839). La région extracellulaire est divisée en deux sous-régions : celle de liaison des LDL (1-322) et la sous-région en dehors de la zone de liaison des LDL (322-768).
L'anticorps selon l'invention a été produit de manière à se lier de manière spécifique au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du LDL-R. Ce peptide est situé dans la zone de liaison des LDL. Ce peptide a été choisi car il présente une bonne accessibilité à
l'anticorps selon l'invention, due à sa situation dans la zone de liaison des LDL, et à sa conformation 3.
sensitivity and specificity for LDL-R the making it particularly suitable for the study of the expression of LDL-R, especially in the analyzes immunohistochemistry of healthy, tumorous or cirrhosis, in Western Blot, in ELISA, or in tests of _ quantification in vivo or for manufacturing new therapeutic tools, particularly for their implemented in the treatment against cancer.
Detailed description of the invention The invention relates to a monoclonal antibody directed against the human LDL receptor (Low Density Lipoprotein).
A first object of the invention relates to a monoclonal antibodies directed against the human receptor LDL (Low Density Lipoprotein), binding to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO:
1) of the peptide sequence of the human LDL.
The human LDL receptor (LDL-R) is a protein transmembrane of 839 amino acids which includes three regions: the region extra-celli.ila: irë '- (1-76-8y, lâ
transmembrane region (76 ~ 3-790) and the region cytoplasmic (790-839). The extracellular region is divided into two sub-regions:
LDL (1-322) and the subregion outside the LDL binding (322-768).
The antibody according to the invention has been produced so to bind specifically to the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO:
1) of the peptide sequence of LDL-R. This peptide is located in the LDL binding zone. This peptide has chosen because it has good accessibility to the antibody according to the invention, due to its situation in the LDL binding zone, and its conformation
4.
tridimensionnelle. De plus, il présente la caractéristique d'être immunogène, de par sa composition en acides aminés.
Ainsi, ce peptide a été choisi comme cible des anticorps selon l'invention en vue de produire un anticorps spécifique du LDL-R humain et présentant donc une bonne affinité pour le LDL-R. De plus, ce peptide présente 85-'. d'homologie avec le LDL-R murin ce qui permet la production d'anticorps qui cross-réagissent chez l'homme et la souris, d'oû la possibilité de mettre en uvre à la fois des,tests (de toxicité notamment) chez la souris et une utilisation chez l'homme.
D'autres avantages concernant le choix de ce peptide particulier ressortiront à la lecture de la suite de la description.
Aux fins de l'invention, le peptide auquel se lie l'anticorps peut aussi correspondre à un peptide compris dans le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du LDL-R. Plus particulièrement, on entend par peptide toute molécule formée par l'enchaînement d'au moins 2 acides aminés; préférentiellement de 5 à 35 acides aminés',* et possiblement plus de 35 acides aminés.
Aux fins de l'invention, les expressions anticorps monoclonal ou composition d'anticorps monoclonal se réfèrent à une préparation de molécules d'anticorps possédant une spécificité identique et unique.
De plus, on entend par anticorps tout anticorps entier, ainsi que tout polypeptide, peptide ou protéine, comprenant au moins un domaine ou fragment d'immunoglobuline, ainsi"que tout dérivé d'anticorps.
Une molécul=e d'immunoglobuline est composée de 4 polypeptides : 2 chaînes lourdes (H, Heavy) identiques de 50 kDa chacune et 2 chaînes légères (L, Light) identiques de 25 kDa chacune. La chaîne légère ést 4.
three-dimensional. In addition, he presents the characteristic of being immunogenic, because of its amino acid composition.
Thus, this peptide has been chosen as the target of antibody according to the invention to produce a antibody specific for human LDL-R and presenting therefore a good affinity for LDL-R. In addition, this peptide present 85- '. of homology with murine LDL-R
which allows the production of antibodies that cross-react in humans and mice, hence the possibility to implement both, tests (of toxicity) in mice and use in humans.
Other advantages concerning the choice of this peptide particular will emerge from the reading of the following the description.
For purposes of the invention, the peptide to which the antibody can also be a peptide included in the peptide corresponding to the acids Amines 280-307 (SEQ ID NO: 1) of LDL-R. More particularly, we mean by peptide any molecule formed by the sequence of at least 2 acids amino; preferably from 5 to 35 amino acids', * and possibly more than 35 amino acids.
For the purpose of the invention, the expressions antibody monoclonal or monoclonal antibody composition refer to a preparation of antibody molecules possessing identical and unique specificity.
In addition, antibody is understood to mean any antibody whole, as well as any polypeptide, peptide or protein, comprising at least one domain or fragment immunoglobulin, as well as any antibody derivative.
An immunoglobulin molecule is composed of 4 polypeptides: 2 identical heavy (H, Heavy) chains 50 kD each and 2 light chains (L, Light) 25 kDa each. The light chain is
5-composée de 2 domaines, un domaine variable V et un domaine constant C, repliés indépendamment l'un de l'autre dans l'espace. On les appelle VL et CL. La chaîne lourde comporte également un domaine V noté VH
et 3 ou 4 domaines C noté de CH1 à CH4. Chaque domaine comprend environ 110 acides aminés et est structuré de manière comparable. Les 2 chaînes lourdes sont liées par des ponts disulfures et chaque chaîne lourde est liée à une chaîne légère par un pont disulfure également La région qui détermine la spécificité de l'anticorps pour l'antigène est portée par les parties variables, alors que les parties constantes peuvent interagir avec les récepteurs Fc des cellules effectrices ou des molécules comme le complément pour médier différentes propriétés fonctionnelles.
Ainsi, on entend par domaine d'immunoglobuline l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2, CH3, CH4. L'-anticorps selon l'invention pouvant avantageusement contenir un ou plusieurs de ces domaines, toutes les combinaisons entre les domaines précédemment cités font partie de l'invention.
On entend par fragment d'immunoglobuline un des fragments choisis parmi le fragment Fâb,Fab', F(ab' ) 2, Fc, - -un scFv ou yix~1 CDR (Compleméntarity Determining Region).
La digestion enzymatique des immunoglobulines par la papaïne génère 2 fragments identiques, qu'on appelle fragment Fab (Fragment Antigen Binding), et -'un fragment Fc (fragment cristallisable). Le fragment Fc est - le support des fonctions effectrices des immunoglobulines.
Par digestion à la pepsine, un fragment F(ab')2 est généré, où 'les deux fragments Fab restent liés par deux ponts disulfure, et le fragment Fc est scindé en plusieurs peptides. Le fragment F(ab')2 est formé de deux fragments Fab', liés par des ponts disulfure 5-composed of 2 domains, a variable domain V and a constant domain C, independently folded one of the other in space. They are called VL and CL. The heavy chain also has a V domain noted VH
and 3 or 4 C domains noted from CH1 to CH4. Each domain comprises about 110 amino acids and is structured comparable way. The 2 heavy chains are linked by disulfide bridges and each heavy chain is linked to a light chain by a disulfide bridge also The region that determines the specificity of the antibody for the antigen is carried by the variable parts, whereas constant parts can interact with the Fc receptors of the effector cells or molecules as the complement to mediate different functional properties.
Thus, the term immunoglobulin domain any of the domains VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3, CH4. The antibody according to the invention advantageously contain one or more of these domains, all combinations between domains previously mentioned are part of the invention.
By immunoglobulin fragment is meant one of the fragments selected from the Fab fragment, Fab ', F (ab ') 2, Fc, - a scFv or yix ~ 1 CDR (Complementarity) Determining Region).
Enzymatic digestion of immunoglobulins by the papain generates 2 identical fragments, which is called fragment (Fragment Antigen Binding), and Fc fragment (crystallizable fragment). The Fc fragment is - the support of the effector functions of the immunoglobulins.
By digestion with pepsin, an F (ab ') 2 fragment is generated, where the two Fab fragments remain bound by two disulfide bridges, and the Fc fragment is split into several peptides. The fragment F (ab ') 2 consists of two Fab 'fragments, linked by disulfide bridges
6.
intercaténaires pour former un F(ab')2.
Quant aux régions variables des chaînes lourdes et légères, on constate que la variabilité de séquence n'est pas distribuée de manière égale. En effet, les régions variables_ sont constituées d'une part de régions très peu variables nommées charpente ou framework (FR) au nombre de 4 (FR 1 à FR4) et d'autre part de régions dans lesquelles la variabilité
est extrême : il s'agit des régions hypervariables , ou CDR, au nombre de 3 (CDR1 à
CDR3 ) .
Un scFv (Single Chain Fragment Variable) est un fragment constitué uniquement des domaines variables VH et VL d'un anticorps monoclonal, et dont la structure est stabilisée par un court bras peptidique flexible placé entre les deux domaines (Billiald et al., 1995). De tels fragments peuvent être produits par, des bactéries. Ces molécules conservent la capacité à reconnaître de façon spécifique un antigène. De petite taille (29 kDa), ils sont peu immunogéniques et mieux tolérées que les anticorps entiers.
Ainsi, l'anticorps selon l,'invention pouvant avantageusenment. contenir un ou plusieurs de ces fragments, toùtes les combinei-s-ons entre les--fragmen.ts -précédemment cités font partie de l'invention.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon l'invention contient au moins un domaine d'immunoglobuline et au moins un fragment d'immunoglobuline, par exemple un fragment Fc et une ou plusieurs régions variables ou hypervariables.
Enfin, on entend par dérivé d'anticorps tout anticorps, cet anticorps pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés. 6.
intercatenaries to form an F (ab ') 2.
As for the variable regions of the heavy and light, we see that the sequence variability is not evenly distributed. Indeed, variable regions are on the one hand very little variable regions named framework or framework (FR) 4 in number (FR 1 to FR4) and on the other hand, regions in which the variability is extreme: these are the regions hypervariable, or CDR, 3 (CDR1 to CDR3).
A scFv (Single Chain Fragment Variable) is a fragment consisting only of variable domains VH and VL of a monoclonal antibody, and whose structure is stabilized by a short peptide arm between the two domains (Billiald and al., 1995). Such fragments can be produced by, bacteria. These molecules retain the ability to specifically recognize a antigen. Small (29 kDa), they are little immunogenic and better tolerated than antibodies integers.
Thus, the antibody according to the invention can avantageusenment. contain one or more of these fragments, all the combinations between the - fragmen.ts -previously mentioned are part of the invention.
In a particular aspect of the invention, the antibody according to the invention contains at least one domain immunoglobulin and at least one fragment immunoglobulin, for example an Fc fragment and a or multiple variable or hypervariable regions.
Finally, antibody derivative is understood to mean any antibody, which antibody may comprise one or several mutations, substitutions, deletions and / or additions of one or more amino acid residues.
7-Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps selon L'invention, qui possède la particularité de se lier au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) du récepteur humain des LDL, ainsi que les caractéristiques présentées ci-après, permet de manière avantageuse le recrutement de cellules effectrices. A cet égard, une cellule effectrice est une cellule qui provoque la destruction des cellules sur lesquelles - l'anticorps est lié
( cellules cibles ). Plus particulièrement, les cellules effectrices expriment à leur surface un récepteur du fragment Fc des anticorps. De plus, on entend par recrutement la faculté que possède l'anticorps selon l'invention à fixer des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles. La destruction peut être une lyse, c'est-à-dire une destruction des cellules-cibles avec libération de leurcontenu. Le peptide sur lequel se lie l'anticorps selon l'invention ( peptide-cible ), est situé dans la région de liaison des LDL (ligand naturel du LDL-R).
Par cette liaison, l'anticorps selon l'invention permet le recrutement de cellules capables de provoquer la destruction dë"'céllules"""sur lesquelles l'anticorps selon l'-invention- est lié, c',est-à-dire de cellules exprimant à leur surface le LDL-R
( cellules-cibles )-.
On entend par liaison la fixation de l'anticorps sur le peptide-cible, ainsi que la fixation des cellules capables de provoquer la destruction des cellules-cibles.
Les cellules effectrices peuvent être des cellules NK
(Natural Killer). Elles peuvent aussi être des macrophages,= des neutrophiles, le lymphocyte T4, le lymphocyte T8 ou l'éosinophile. Ces cellules possèdent à leur surface des récepteurs du fragment Fc des anticorps selon l'invention. Les anticorps selon 7-In a particular aspect of the invention, the antibody according to the invention, which has the particularity of bind to the peptide corresponding to the amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the human LDL receptor, as well as that the features presented below, allows advantageously the recruitment of cells effector. In this respect, an effector cell is a cell that causes the destruction of cells on which - the antibody is bound (target cells) In particular, effector cells express on their surface a receptor of the Fc fragment of the antibodies. In addition, means by recruitment the faculty possessed by the antibody according to the invention to fix cells capable of causing the destruction of cells targets. The destruction can be a lysis, that is, say a destruction of the target cells with release of their content. The peptide on which binds the antibody according to the invention (peptide-target), is located in the LDL binding region (ligand natural LDL-R).
By this binding, the antibody according to the invention allows the recruitment of cells capable of cause the destruction of "cellules""" on which the antibody according to the invention is bound, that is to say, cells expressing on their surface LDL-R
(target cells) -.
By binding is meant the binding of the antibody on the target peptide, as well as the fixation of cells capable of causing the destruction of target cells.
The effector cells may be NK cells (Natural Killer). They can also be macrophages, = neutrophils, the T4 lymphocyte, the T8 lymphocyte or eosinophil. These cells possess on their surface receptors Fc fragment of antibody according to the invention. Antibodies according to
8-l'invention se lient à la cellule-cible par leur fragment variable et se lient aux cellules effectrices par leur fragment constant. Cette relation dépendante des anticorps entre les cellules cibles et les cellules effectrices provoque la lyse des cellules cibles par un mécanisme de type ADCC (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity).
De manière avantageuse, les cellules cibles selon l'invention sont des cellules tumorales.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses ( cellules cible ). En effet, le recrutement des cellules effectrices engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps selon l'invention est lié. Or, des études ont montré qu'il existe une corrélation entre l'augmentation du niveau d'expression du LDL-R par les cellules et certains cancers. En effet, des patients atteints de certains cancers présentent une hypocholestérolémie. Cette hypocholestérolémie est la conséquence d'une sur-utilisation du cholestérol par les cellules cancéreuses. Pour leur survie, ces dernières induisent une augmentation du niveau d'expression du récepteur des LDL (LDL-R) au sein des organes tumoraux' (Henricksson et al.*, 19-89-) .- On peut -Liter -notamment --le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, des ovaires, du colon, du poumon, de l'estomac et les leucémies. Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention qui, par recrutement de cellules capables de détruire les cellules sur lesquelles l'anticorps est lié, provoquera la destruction de ces cellules cancéreusés.
L'invention a donc pour objet, un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur humain des LDL (Low Density Lipoprotein), se liant au peptide correspondant aux 8-the invention bind to the target cell by their variable fragment and bind to the effector cells by their constant fragment. This dependent relationship antibodies between the target cells and the effector cells causes cell lysis targets by an ADCC type mechanism (Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity).
Advantageously, the target cells according to the invention are tumor cells.
Advantageously, the antibody according to the invention allows the destruction of cancer cells (target cells) Indeed, the recruitment of effector cells causes destruction of cells on which the antibody according to the invention is linked. However, studies have shown that there is a correlation between the level increase expression of LDL-R by cells and some cancers. Indeed, patients with certain cancers have hypocholesterolemia. This hypocholesterolemia is the consequence of an over-use of cholesterol by cells cancerous. For their survival, these induce an increase in the expression level of the receptor LDL (LDL-R) within tumor organs (Henricksson et al. *, 19-89-) .- One can -Liter -in particular - the prostate cancer, breast, liver, pancreas, ovaries, colon, lung, stomach, and leukemia. Cancer cells overexpressing the LDL-R will therefore be preferred targets of the antibody according to the invention which, by recruitment of cells able to destroy the cells on which the antibody is bound, will cause the destruction of these cancer cells.
The subject of the invention is therefore a monoclonal antibody directed against the human LDL receptor (Low Density Lipoprotein), binding to the peptide corresponding to
9.
acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL.
De manière avantageuse, au moins une région CDR
(Complementarity Determining Region) de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et au moins une région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7.
Les régions CDR concernées sont les régions CDR CDR1 et/ou CDR2 et/ou CDR3.
De manière particulièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée- d'au moins 80%, 900-., 95%, 990-. et de manière encore plus préférentielle de 100% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé
en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide 'aminé
identique, ce nombre étant-, divisé pa-r le -nombre .- -d-'-a:c~ides - aminés total de la -séquenc~-c . En - tout état-- -de --cause, ces différences de séquences .n'.affectent.en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
De manière particulièrement avantageuse, chaque région CDR de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ
ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO 4 respectivement, et en ce que chaque région CDR de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70-'. d'identité avec les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 respectivement. Ainsi, la région CDR1 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 2, la région CDR2 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 3, la région CDR3 de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède une séquence. peptidique ayant au moins 7026 d'identité avec la séquence SEQ ID
NO : 4, et la région CDRl de chacune des chaînes lourdes de. l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID NO : 5, la région CDR2 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70%
d'identité avec lâ séquence SEQ ID NO : 6, la région CDR3 de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec la séquence SEQ ID
NO . 7.
De - maniè=re particulièrement avantageuse ~ 1' zdentité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70'-., de manière préférée d'au moins 80-0., 90-'., 95%, 99-. et de manière encore plus préférentielle de 100o d'identité.
Avantageusement, la région 'variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70-'. ' d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et, la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70-'. d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9.
De manière particùlièrement avantageuse, l'identité
avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70%, de manière préférée d_',au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95-0. ou 99-0.
d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un nucléotide identique, ce nombre étant divisé par le nombre de nucléotides total de la séquence. La dégénérescence. du code génétique peut être à l'origine du fait qu'un même acide aminé puisse être codé par plusieurs triplets de nucléotides différents. En tout état de cause, ces différences de séquences n'affectent en rien l'affinité de l'anticorps monoclonal pour sa cible, ni sa capacité à recruter des cellules immunitaires effectrices.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes- légères de l'anticorps selon l'invention est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par la 'séquence d'acidé nucléique SEQID NO- : -~ -.
De manière avantageuse, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède au moins 70-'. d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID NO : 10 et la, région variable de chacune de ses chaînes lourdes possède au moins 70-'.
d'identité avec la séquence en acides aminés SEQ ID
NO : 11. De manière particulièrement avantageuse, l'identité avec chacune des séquences citées ci-dessus est d'au moins 70 -0., et de manière préférée d'au moins 80%, et de manière encore plus préférentielle de 95%
ou 99% d'identité. Le pourcentage d'identité est calculé en alignant les 2 séquences à comparer et en comptant le nombre de positions possédant un acide aminé identique, ce nombre étant divisé par le nombre -d'acides aminés total de la séquence.
Préférentiellement, la région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 10 et la région variable de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention possède la séquence peptidique SEQ ID NO : 11. La séquence peptidique SEQ
ID NO : 10 est la séquence peptidique déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique SEQ ID NO : 11 est la séquence déduite de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 9.
L'anticorps selon l'invention s'entend aussi de tout anticorps modifié répondant aux caractéristiques de l'invention, dans lequel un ou plusieurs acides aminés ont_été ajouté(s), substitué(s) ou délété(s). Un tel ajout, substitution ou délétion peut être localisé à
n'importe quelle position dans la molécule. Dans le cas où plusieurs acides aminés ont été ajoutés, substitués ou délétés, toute combinaison d'ajout, de substitutiôn ou de délétion peut être considérée. De telles altérations de --la -- séquen.ce --cles régions variables de l'anticorps selon l'invention peuvent être effectuées dans le but d'augmenter le nombre de résidus susceptibles d'entrer en contact avec le pept.:-ide cible.
Avant'ageusement, un anticorps selon l'invention peut être, c'est-à-dire consister en un fragment F(ab')2, un fragment Fab', un fragment Fab, une région CDR ou toute version modifiée de l'un quelconque de ces fragments ou région.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps murin. De manière avantageuse, cet anticorps monoclonal murin est une IgGlkappa. Un tel anticorps peut être produit par immunisation d'un animal, en particulier d'une souris, avec le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1), ou avec tout autre peptide du LDL-R humain situé
dans la région de liaison aux LDL. Les méthodes de production d'anticorps sont connues de l'homme du métier. Selon un mode particulier de production des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO
1) du LDL-R, le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence du LDL-R
peut être injecté par voie intra péritonéale à des souris Balb/C en présence d'adjuvant de Freund.
Plusieurs rappels d'immunisation sont effectués en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Le suivi de la réponse immunitaire des souris est réalisé sur des prélèvements _sanguins. par ELISA contre le peptide SEQ
ID NO : 1. Des hybridomes sont obtenus à partir de la fusion des cellules spléniques des souris immunisées avec des cellules de myélomes de souris en présence de PEG (polyéthylèneglycol). Les cellules sont ensuite cultivées puis testées en ELISA pour leur réponse ..contrerle ~.eptide SEQ ID NO -: 1.
Avantageusement, l'anticorps selon l'invention est un anticorps chimérique, humanisé ou humain.
De manière préférentielle,,ï l'anticorps selon l'invention est chimérique.
On entend par anticorps chimérique un anticorps dont les régions variables des chaînes légères et des chaînes lourdes appartiennent à une espèce différente des régions= constantes ,des chaînes légères et des chaînes lourdes. Ainsi, l'anticorps selon l'invention possède en outre des régions variables murines et des régions constantes appartenant à une espèce non-murine. A cet égard, toutes les familles et espèces de mammifères non-murins sont susceptibles d'être utilisées, et en particulier l'homme, le singe, les muridés (sauf la souris), les suidés, les bovidés, les équidés, les félidés, les canidés, par exemple, ainsi que les oiseaux. De manière encore préférée, les régions constantes de chacune des chaînes légères et de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps selon l'invention sont des régions constantes humaines. Ce mode de réalisation préféré de l'invention permet de diminuer l'immunogénicité de l'anticorps chez l'homme et par là même d'améliorer son efficacité lors de son administration thérapeutique chez l'homme.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de -l'anticorps selon l'invention est de type K. Tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple Km(1), Km(l, 2), Km(l, 2, 3) ou Km(3).
Dans un autre mode de réalisation de l'invention, la région constante de chacune des chaînes légères de l'anticorps selon l'invention est de type A.
Dans un aspect particulier de l'invention, et notamment lorsque les régions constantes de chacune des chaînes- légères -et dè chacune des chaînes 'l:ôurdes ' de - l' anticorps selon -=l' invention - -scs-nt des régions-humaines, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type y. Selon cette variante, la région constante de chacune des chaînes ,.lourdes de l'anticorps peut être de type yl, de type y2, de type y3, ces trois types de régions constantes présentant la particularité de fixer le complément humain, ou encore de type y4. Les anticorps possédant une région constante de chacune des chaînes lourdes de type y appartiennent à la classe des IgG. Les immunoglobulines de type = G. (IgG), sont des hétérodimères constitués de 2 chaînes lourdes et de 2 chaînes légères, liées entre elles par des ponts disulfures. Chaque chaîne est constituée, en position N-terminale, d'une région ou domaine variable (codée par les gènes réarrangés V-J pour la chaîne légère et V-D-J pour'la chaîne lourde) spécifique de l'antigène contre lequel l'anticorps, est dirigé, et en position C-terminale, d'une région constante, constituée d'un seul domaine CL pour la chaîne légère ou de 3 domaines (CH1, CH2 et CH3) pour la chaîne lourde. L'association des domaines variables et des domaines CH1 et CL des chaînes lourdes et légères forme les parties Fab, qui sont connectées à la région Fc par une région charnière très flexible permettant -à chaque Fab de se fixer à sa cible antigénique tandis que la région Fc, médiatrice des propriétés effectrices de l'anticorps reste accessible aux molécules effectrices telles que les récepteurs Fc[]R et le Clq. La région Fc, constituée des 2 domaines globulaires CE12 et CE13, est glycosylée au niveau du domaine C02 avec la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un N-glycanne biantenné, lié à l'Asn 297.
De manière préférée, la région constante de chacune des chaînes lourdes de l'anticorps est de type yi, car un tel anticorps montre une capacité à engendrer une activité ADCC (Antibody-Dependënt Cellulâr Cytotoxicity) chez le plus- grand norribre- d'indivridus -(humains). A cet égard, tout allotype convient à la réalisation de l'invention, par exemple G1m(3), Glm (1, 2, 17), Glm(l, 17) ou Glm(1,3).
Les anticorps chimériques"selon l'invention peuvent être construits en utilisant les techniques standard de l'ADN recombinant, bien connues de l'homme du métier, et plus particulièrement en utilisant les techniques de construction des anticorps chimériques -décrites par'exemple dans Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 81 : b851-55 (1984), où la technologie de l'ADN recombinant est utilisée pour remplacer la région constante d'une chaîne lourde et/ou la région constante d'une chaîne légère d'un anticorps provenant d'un mammifère non-humain avec les régions correspondantes d'une immunoglobuline humaine.
De tels anticorps et leur mode de préparation ont également été décrits dans la publication brevet EP
173 494, dans le document Neuberger, M.S. et al., Nature 1985 Mar 21-27;314(6008) :268=70. , ainsi que dans le document EP 125 023 par exemple. Des méthodes pour générer des anticorps chimériques sont largement disponibles pour l'homme du métier. Par exemple, les chaînes lourdes. et légères de l'anticorps peuvent être exprimées séparément en utilisant un vecteur pour chaque chaîne, ou bien être intégrées dans un seul vecteur.
Un vecteur d'expression est une molécule d'acide nucléique dans laquelle la séquence d'acide nucléique murine codant pour le domaine variable de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps et/ou la séquence d'acide nucléique, de préférence humaine, codant pour la région constante de chacune des chaînes lourdes ou légères de l'anticorps ont été insérées, afin de les introduire et de les maintenir dans une cellule hôte. Il permet l'expression de ces fragments d'acide nucléique étrangers dans la cellule hôte car il pôssède des "séqu:ericës ' ifidïspënsâ.bles (promôtëur, séquence de polyadénylation, gène de sélection) à
cette expression. Le vecteur peut être par exemple un plasmide, un adénovirus, un rétrovirus ou un bactériophage, et la cellule hôte peut être toute'' cellule de mammifère, par exemple SP2/0, YB2/0, IR983F, le myélôme humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lec1, CHO-L,ec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, . Molt-4, COS-'7, 293-HEK,.BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653. ' Pour la construction de vecteurs d'expression des anticorps chimériques selon l'invention, des séquences signal synthétiques et des sites de restriction appropriés peuvent être fusionnés aux régions variables au cours des réactions d'amplification par PCR. Les régions variables sont ensuite combinées avec les régions constantes d'un anticorps, de manière préférentielle une IgGl humaine. Les gènes ainsi construits sont clonés sous le contrôle d'un promoteur (par exemple le promoteur RSV) et en amont d'un site de polyadénylation, en utilisant deux vecteurs séparés (un- pour chaque chaîne). Les vecteurs sont également munis de gènes de sélection connus de 1,'homme du métier, tels que par exemple le gène dhfr ou le gène de résistance à la néomycine.
Les anticorps chimériques selon l'invention peuvent être produits par co-transfection dans une cellule hôte du vecteur d'expression de la chaîne légère et du vecteur d'expression de la chaîne lourde en utilisant une méthode bien connue de l'homme du métier (par exemple,la co-précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la micro-injection, etc.). A
l'issue de la transfection, les cellules peuvent être mises en milieu sélectif, par exemple en milieu RPMI
(Invitrogen, ref 21875-034) contenant 5-. de sérum dialysé (Invitrogen, réf. 10603-017), 500 pg/ml de -G418 (Invitrogen, réf : 10131-027) - et 25 - -nM- -de methotrexate (Sigma, réf. M8407). Les surnageants des puits de transfection résistants sont criblés, pour la présence d'immunoglobuline (Ig) chimérique par dosage ELISA spécifique des., séquences Ig humaines. Les transfectants produisant le plus d'anticorps sont amplifiés et leur surnageant redosé par ELISA afin d'estimer leur productivité et de sélectionner les 3 meilleurs producteurs pour le clonage par dilution limite (40 cellules / plaque).
Par anticorps humanisé, on entend désigner un anticorps qui contient des régions CDRs dérivées d'un anticorps d'origine non humâine, les autres parties de la molécule d'anticorps étant dérivées d'un (ou de plusieurs) anticorps humains. De tels anticorps peuvent être préparés selon des méthodes de greffe de CDR ( CDR-grafting ) bien connues de l'homme ,du métier [publications brevet US 5,225,539, US
6,180,370 ; Jones et al., Nature 321(6069): 522-5.
(1986) ; Verhoeyen et al., Bioessays 8(2) : 74-8 (1988) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci U S A 86(24):10029-33 (1989) ; Lewis A.P. and Crowe J.S., Gene 101(2):297-302 (1991) ;' Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res 19(9):2471-6 (1991) ; Carter et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 89 :4285 (1992) ; Singer et al., J Immunol 150 (7) : 2844-57 (1993) ;' Presta et al., J. Immunol. , 151:2623 (1993')]. Le choix des domaines variables humains à greffer pour la production d'anticorps humanisés est important afin de réduire l'immunogénicité de l'anticorps sans altérer son af f inité pour sa cible. Dans une méthode de production d'un anticorps humanisé, la séquence du domaine variable d'un anticorps murin est comparée à une banque de séquences de régions variables humaines connues et -la séquence variable Yï.urnàine la plus proche' de -la- séquence murine est rettnué comme -région FR- de-l'anticorps humanisé [Riechmann et al., Nature 332:
323-7 (1988) ; Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA
86(24) :10029-33 (1989) ; Sims et al., J. Immunol., 151 :2296 (1993 )]. Une autre méthode de sélection de5~
régions FR humaines est la comparaison de la séquence de chaque sous-région de la séquence FR murine (FR1, FR2, FR3 et FR4) avec une banque de séquences FR
humaines connues, afin de choisir, pour chaque région FR, la séquence FR humaine la plus proche de la séquence murine [publication brevet US 2003/0040606 ;
Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993) ;
Sato K_ et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ; Leung S.O. et al., Mol Immunol 32(17-18):1413-27 (1995) ].
Une autre méthode utilise une région FR particulière dérivée d'une séquence consensus de tous les anticorps humains d'un sous-groupe particulier de chaîne lourde ou légère [Sato K. et al Mol Immunol 31(5):371-81 (1994) ]. La greffe de CDR est complétée dans la majorité des cas par la mutation de certains résidus clés localisés dans les FR humains afin de conserver une bonne affinité de l'anticorps humanisé pour sa cible [Holmes M.A. and Foote J., J Immunol 158 (5) :2192-201 (1997)].
Les anticorps humanisés selon l'invention sont préférés pour leur utilisation dans des méthodes de diagnostic in vitro, ou de traitement prophylactique et/ou thérapeutique in vivo.
L'anticorps selon l'invention ainsi chimérisé ou humanisé présente l'avantage d'être mieux toléré par l'organisme humain, et au moins aussi efficace que l'anticorps murin. De manière 'particulièrement avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé ou humanisé
est 2 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant. De manière encore plus- avantageuse, l'anticorps ainsi chimérisé y6u -.humanisé est 10 fois, -. .ou en.core 10O fois.- ou - de -maniè--re ---préférée-- p-lus --dE- 100 fois plus cytotoxique que l'anticorps murin correspondant.
Par anticorps humain,.~ on entend dé.signer un anticorps dont chaque région est dérivée d'un anticorps humain.
Ces anticorps peuvent être dérivés de souris transgéniques portant des gènes d'anticorps humains, ou de cellules humaines [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct;6(5):561-6 (1995) ; Lonberg N. and D.
Huszar. Internal Review of~ Immunology 13 :65-93 (1995) ; Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.
USA 97 (2) : 722-727 (2000)].
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention est couplé à une toxine. La toxine est, par exemple, la toxine diphtérique ou la ricine. La liaison entre l'anticorps selon l'invention et la toxine est suffisamment forte pour éviter la libération systémique de la toxine et aussi suffisamment labile, afin que la toxine soit libérée dans les cellules cibles.
Dans un autre aspect de l'invention, l'anticorps est couplé à un radio-isotope. La présence du radio-isotope accroît considérablement la cytotoxicité. Deux isotopes sont essentiellement utilisés l'iode 131 (émetteur bêta et gamma), dont la demi-vie est relativement longue (8 jours) et qui exerce un effet tumoricide sur environ 1 mm autour de la cellule tumorale ayant fixé l'anticorps selon l'invention.
L'iode 131 présente l'avantage de rendre possible la réalisation d'une imagerie, mais nécessite le respect des mesures de radio-protection. L'yttrium 90 (émetteur bêta), dont la demi-vie est plus brève (2,5 jours), exerce des effets tumoricides sur une distance de 5 mm.
-.De- manière- avantagëuse;~-1-'-anticorps - selon-- 1' invention permet le recrutement de cellules immunitaires effectrices. Un tel anticorps, de par sa bonne spécificité et sa bonne sensibilité, est un outil pouvant servir à médier des réactions d'ADCC (Ar,~:ibody Dependent Cellular Cytotoxicity). En effet, l'anticorps selon l'invention peut être modifié de manière à induire l'ADCC, par exemple en étant chimérisé ou humanisé. L'anticorps selon l'invention permet le = recrutement de çellules immunitaires effectrices.
De manière avantageuse, l'anticorps selon l'invention permet la destruction des cellules cancéreuses. En effet, le recrutement des cellules effectrices par l'anticorps selon l'invention engendre une destruction des cellules sur lesquelles l'anticorps est lié
(cellule cibl,e). Les cellules cancéreuses sur-exprimant le LDL-R seront donc des cibles préférées de l'anticorps selon l'invention. Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
Un anticorps préféré selon l'invention ést l'anticorps 5E5, susceptible d'être produit par l'hybridome H5E5 (déposé sous le numéro I-3488 à l.a CNCM, Collection Nationale de Culture des Microorganismes, 25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15). La région variable de chacune des chaînes légères de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 8, et la région variable de,chacune des chaînes lourdes de l'anticorps monoclonal produit par l'hybridome H5E5 est codée par la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO :-9.
Un objet particulier de l'invention concerne un anticorps monoclonal se liant* au LDL-R et permettant le recrutement de cellules effectrices. Cet anticorps est le 5E5, ou .,~out anticorps chimérique, humanisé ou humain possédant les parties variables de l'anticorps 5E5.
Dans un certain mode de réalisation, l'anticorps est produit dans= la lignée SP2/0-AG14 de souris (ATCC CRL-1581).
Un autre objet de l'invention se rapporte à urie lignée cellulaire stable produisant un anticorps selon l'invention tel que décrit précédemment.
De manière avantageuse, la lignée cellulaire stable selon l'invention est choisie parmi le groupe consistant en : SP2/0, YB2/0 (cellule YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, déposée à l'American Type Culture Collection sous le numéro ATCC CRL-1662), SP2/0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, le myélome humain Namalwa, PERC6, les lignées CHO, notamment CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653.
Un autre objet de l'invention se rapporte à
l'hybridome H5E5 déposé sous le numéro d'enregistrement CNCM I-3488 à la CNCM.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la région variable de la chaîne lourde d'un anticorps selon l'invention. Ce fragment d'ADN peut être utilisé
pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aininés 280-307' (SEQ
ID NO : 1)--, ce polypeptidê pouvant être -un anticorps., Un autre objet de l'invention* se rapporte à un fragment d'ADN de séquence SEQ ID NO : 8 codant pour la région variable de la Chaîne légère d'ury anticorps selon l'invention. De même, ce fragment d'ADN peut être utilisé pour la fabrication d'un polypeptide se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1), ce polypeptide pouvant être un anticorps.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un vecteur d'expression comprenant au moins un fragment d'ADN
choisi parmi les fragments de séquence SEQ ID NO : 9 ou SEQ ID NO : 8.
Un autre objet de l'invention est le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO :
1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL. =
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps selon l'invention, pour activer in vitro ou in vivo les récepteurs FcyRIII de , cellules immunitaires effectrices. En effet, les anticorps de l'invention peuvent être utilisés pour leur capacité à
activer par leur région Fc le récepteur FcyRIIIA. Ceci représente un intérêt considérable, car ce récepteur est exprimé à la surface de cellules appelées cellules effectrices : la liaison de la région Fc de l'anticorps à son récepteur porté par la cellule effectrice provoque l'activation du FcyRIIIA et la destruction des cellules cibles. Les cellules effectrices sont par exemple des cellules NK (Natural Killer), des macrophages, des neutrophiles, les lymphocytes CDB, les lymphocytes TyS, les cellules NKT, les éosinophiles, lés basophiles bu les mastocytës ." --Uri autre objet particulier de l'invention est un anticorps tel que décrit précédemment pour son utilisation comme médicament.
Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticorps utilisé se lie au récepteur humain des LDL, et permet le recrutement de cellules effectrices.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire, qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égard, l'anticorps selon ],'invention, se liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO 1) de la séquence peptidique du récepteur des LDL, est un mode de réalisation.. particulier de cet objet de l'invention.
Plus particulièrement, un objet de l'invention est l'utilisation d'un anticorps tel que décrit précédemment pour la fabrication d'un médicament.
Avantageusement, cet anticorps cytotoxique peut se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur des LDL, c'est-à-dire qu'il est capable de se lier à la région de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 1 à 322) ou à la région en dehors de la zone de liaison des LDL (correspondant aux acides aminés 322-768 du LDL-R). A cet égàrc3., l'anticorps selon l'invention, se' liant au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain. des LDL, est un mode de réalisation particulier de cet objet de l'invention.' Un autre objet de 1'invention -est l'u-tilisation d'un a.r.ltiçorps. tel . qzze, décrit. précéci.emment, c'est-à-d.ire possédant la capacité de se lier à tout ou partie de la région extracellulaire du récepteur humain des LDL
et avantageusement au peptide correspondant aux acides aminés 280-307 (SEQ ID NO : 1) de ~la séquence du récepteur humain des LDL, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement du cancer. En effet, l'anticorps selon l'invention cible le LDL-R de manière spécifique.. A cet égard, l'anticorps selon l'invention,, en se liant à ce récepteur, va engendrer une réaction de lyse des cellules cibles cancéreuses, notamment par ADCC contre les cellules cibles cancéreuses et permettre la lyse, de ces dernières.
Ainsi, les cellules lysées seront de manière quasi-spécifiques les cellules cancéreuses, les cellules saines ne sur-exprimant pas ou peu le LDL-R et étant ainsi préservées.
De manière avantageuse, les cancers traités au moyen de l'anticorps selon l'invention sont les cancers pour lesquels le récepteur des LDL est sur-exprimé à la surface des cellules cancéreuses, et ce par rapport aux cellules saines correspondantes.
De manière particulièrement avantageuse, le cancer traité est le cancer de la prostate, du sein, du foie, du pancréas, de l'estomac, des ovaires, du colon, du poumon ou des leucémies, pour lesquels on observe une augmentation de la densité de récepteurs au LDL sur la surface mémbranaire des cellulés cancéreuses. Les cellules cibles, cancéreuses, pourront être lysées par les cellules.effectrices recrutées lors de la réaction d'ADCC, les cellules saines étant préservées' puisqu'elles.ne sur-expriment pas le LDL-R.
De manière particulièrement avantageuse, l'anticorps -selon l'invention est utilisé "poùr- la préparation.' d' iiri -riédicâmént -destiné---au- traitement --des~ cancer-s-- incluant la leucémie myéloïde aiguë, les leucémies monocytaires aiguës, les leucémies myélomonocytiques, la leucémié
myeloïde chronique en crise blastique, les leucémies lympho3,des, les leucémies lymphoïdes chroniques, les tumeurs solides telles que le cancer épidermoïde cervical, l'adénocarcinome endométrial, le carcinome gastrique, le carcinome hépatocellulaire, le choriocarcinome, les tumeurs du cerveau.
Un autre objet de l'invention.concerne une composition pharmaceutique comprenant un anticorps selon l'invention tel que décrit ci-dessus et un excipient et/ou un véhicule pharmaceutiquement acceptables.
Cette composition pharmaceutique a pour vocation de cibler les cellules cancéreuses, notamment celles surexprimant le LDL-R. Ces cellules cancéreuses exprimant à leur surface une quantité de récepteurs au LDL supérieure à la quantité de récepteurs exprimés par les cellules saines, le médicament ainsi préparé
sera préférentiellement lié par les cellules cancéreuses.
L'excipient peut être toute solution, telle qu'une solution saline, physiologique, isotonique, tamponnée, etc., ainsi que toute suspension; gel, poudre, etc., compatible avec un usage pharmaceutique et connu de l'homme du métier. Les compositions selon l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs agents ou véhicules choisis parmi les dispersants, solubilisants, stabilisants, surfactants, conservateurs, etc. D'autre part, les compositions selon l'invention peuvent comprendre d'autres agents ou principes actifs.-Par ailleurs, les 'compositions peuvent être administrées de différentes manières et sous différentes formes. L'administration peut être --rëalisée par toute voie "classique pour 'cé type*
-d' approche ----thérâpeut 'ique, -co-mme - notamment - par- - voie-systémique, en, particulier par injection intraveineuse, intradermique, intra-tumorale, sous-cutanée, intra-péritonéale, intramusculaire, intra-artérielle, etc. On peut citer par., exemple l'injection intra-tumorale ou l'injection dans une zone proche de la tumeur ou irriguant la tumeur.
Les doses peuvent varier en fonction du nombre d'administrations, de l'association à d'autres principes actifs, du stade, d'évolution de la pathologie, etc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de l'anticorps selon l'invention dans les analyses immunohistochimiques de tissus cancéreux, sains ou cirrhosés, ou dans les analyses en Western Blot, en ELISA ou en test de quantification in vivo.
L'anticorps 5E5 est particulièrement approprié pour son utilisation en Western Blot, car il reconnaît de manière spécifique une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain.
L'anticorps 5E5 présente donc un avantage en tant qu'outil de diagnostique des pathologies impliquant le LDL-R, et plus particulièrement les cancers.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Légendes de figures Figure 1: Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses (résultats exprimés en unités arbi-traires de flubrescènce) .
Figure 2 : Liaison des LDL-Dil sur des cellules HepG2 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
p: .
Figure 3 : Criblage des lignées cellulaires du cancer du sein pour l'expression du LDL-R (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 4:-Liaison des anticorps anti-LDL~-R 5E5 sur des cellules A549 (résultats, exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes) . Les anticorps anti-LDL-R
5E5 sont produits par l'hybridome H5E5 et sont dirigés contre le peptide correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur des LDL (SEQ ID NO:
1).
Figure 5 Liaison des antiçorps anti-LDL-R SES sur des cellules MDA-MB-231 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6A : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
SES sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes).
Figure 6B : Cross-réactivité des anticorps anti-LDL-R
5E5 sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 (résultats exprimés en moyenne de fluorescence).
Figure 7 Compétition des anticorps anti-LDL-R 5ES
avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en moyenne de fluoresçence).
Figure 8 Cinétique d'internalisation des anticorps anti-LDL-R SES avec les LDL, sur des cellules A549 (résultats exprimés en pourcentage d'internalisation).
-FigurA*__.. 9- : Caractérisaaibn de l'. anticorps - 5E5 en:, Western Blot Exemples Exemple 1 Production, sélection et caractérisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence d'acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL (SEQ ID NO
1) Choix de la séquence peptidique a propriée Le fragment peptidique correspondant à la séquence SEQ
ID NO : 1 (correspondant aux acides aminés 280-307 de la séquence du récepteur humain des LDL) situé dans la région de liaison aux LDL a été synthétisé. La séquence SEQ ID NO : 1 choisie a été modifiée (remplacement des cystéines par des sérines) afin d'éviter la formation de ponts disulfures en cas d'oxydation du groupement thiol des cystéines (SEQ ID
NO : 17).
Synthèse peptidique Le peptide a été synthétisé par la méthode de synthèse en phase solide sur un synthétiseur automatique modèle ABI 433 A (Applied Biosystems Inc., Californie, USA), en utilisant une stratégie Boc/Bzl sur une résine MBHA
0,5 mmol.
Spectrométrie de masse La masse moléculaire a été déterminée en utilisant un spectromètre de masse à électrospray d'ions. Le spectre de l'électrospray a été obtenu en utilisant un appareil API (Perkin-Elmer-Sciex) sur un spectromètre de ma-sse par électrcispray- d' ions à qta.adripôlé simpl"e; "
. . .. .
équipé avec un spray-=d'.ions -(élec-t-r-osp-ray assisté d'urz-nébuliseur) (Sciex, Toronto, Canada).
Production d'anticor s monoclonaux Les anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID NO : 1 sont produits en immunisant des souris mâles BALB/c par injection intrapéritonéale du peptide correspondant à
la SEQ ID NO : 17, le peptide étant préalablement émulsifié avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund.
Trois injections ont ensuite été effectuées toutes les deux semaines en présence d'adjuvant incomplet de Freund. Quatre jours après la dernière injection, les rates des animaux sont prélevées, puis les cellules sont isolées et fusionnées avec des cellules dé
myélome de souris Sp 2/0-Ag14 en présence d'agent de fusion tel que le polyéthylène glycol. Les cellules fusionnées sont ensuite incubées dans. un milieu sélectif (milieu HAT) qui inhibe la croissànce de cellules malignes non fusionnées.
Afin de s'assurer du caractère monoclonal des hybridomes, des sous-clonages par dilution-limite ont été réalisés. A l'issue de ces sous-clonages, un hybridome dénommé HSE5 , producteur d'anticorps dirigés contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1 a été sélectionné.. Cet hybridome appartient à
la classe des IgG, de sous classe 1.
Les anticorps produits par l'hybridome H5E5 ont été
testés par un test ELISA, pour la sécrétion d'un anticorps monoclonal de spécificité recherchée, à
savoir contre le peptide correspondant à la SEQ ID
NO : 1.
Les ascites ont été obtenus à partir de souris BALB/c mâles ayant reçu au préalable une injection de pristane et auxquelles 2.106 cellules d'hybridome H5E5 ont été injectées.
Les -anticorps monoclonaux -ont étê- isolés --par-précipitation avec 27% de sulfate d'ammonium puis purifiés par chromatographie d'affinité sur gel de protéine A (colonnes HiTrap Protein A HP, Amersham Bioscience, Uppsala, Suède). Les protéines non retenues ont été éliminées par lavage avec une solution saline tamponnée (PBS : Phosphate 50 mmol/L, pH 7,2, NaCl 150 mmol/L). L'élution des Immunoglobulines IgG monoclonales spécifiques de l'anticorps =dirigé contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 a été accomplie en utilisant de la glycine à 0,2 M à pH2,8. Les anticorps purifiés ont été dialysés immédiatement contre 10 mmol/L de PBS, concentrés par lyophilisation, puis conservés par aliquots de 0.5 à 1 mg +/- BSA 1% à-20 C.
Ces anticorps seront dénommés ci-après Anti-LDL-R
5E5 .
Analyse en Western Blot Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été testés en Western Blot. Des extraits de protéines totales de cellules MDA-MB-231 ont été soumis à une électrophorèse dénaturante sur gel SDS-PAGE (10%) puis transférés sur une membrane de nitrocellulose et mis à réagir avec les anticorps Anti-LDL-R 5E5. Les protéines immunoréactives ont été visualisées avec un anticorps monoclonal anti-IgG conjugué à la peroxidase (Chemicon). Le développement de la réaction a été
effectué par chemiluminescence (Amersham, Biosciences).
L'analyse en Western Blot montre que l'anticorps anti-LDL-R 5E5 reconnaît une bande de 160 kDa et une bande de 120 kDa correspondant aux formes glycosylées et non glycosylées respectivement du LDL-R humain (Figure 9).
Isotypage L'isotypage des hybridomes a ét'é effëctüé par. - ELISA
avec- l-e kit SEA- ~lonotyping System/HRP, (SouthernBiotech) et avec l'Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test (Roche-référence 1493027).
L'anticorps 5E5 est une IgGl, kappa.
Exemple 2 : Criblage du niveau d'expression du LDL-R
dans des lignées cancéreuses Les lignées cellulaires cancéreuses suivantes ont été
criblées pour l'expression du LDL-R HepG2, HeLa, MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 et Hek293 par l'étude de la liaison de LDL marquées (Figures 1 et 2). Pour cela, les LDL (densité = 1.03-1.053 g/ml) ont été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7.4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-i.ndocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur des cellules à
des concentrations finales de 0, 10 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie au FACS
(Fluorescence-Activated Cell Sorting) c'est-à-dire que la fluorescence de chaque cellule à l'intérieur d'une population donnée est individuellement mesurée par cytométrie en flux sur un appareil Facscalibur (Becton Dickinson). Les paramètres mesurés sont le FSC
(Forward Scatter), SSC (Side Scatter) et la fluorescence émise à la longueur d'onde de 530 nm après excitation avec" un laser Argon à 488 nm. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 1).
*Les résultats présentés sur la figure 1 montrent que les cellules HepG2 et les cellules HeLa expriment le plus fortement le LDL-R.
De plus, plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231. L"expréssion dia. LDL-R sïa.r cès - lignées cellulaires cancéreuses humaines a été mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.03-1.053) ont été prépa'rées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH 7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'- dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules= à des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été
analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats 33' ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (figure 3) : les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R
équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau.
Exemple 3 : Tests fonctionnels in vitro des-anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à
la séquence SEQ ID NO : 1 sélectionnés à l'Exemple 1 La fonctionnalité des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide correspondant à la séquence SEQ ID
NO : 1 a été évaluée par l'étude de la liaison des anticorps au,LDL-R au niveau cellulaire (cellules A549 et cellules .MDA-MB-231), l'étude de la cross-réactivité des anticorps au LDL-R de cellules C2C12 (souris) , CHO-K1 (hamster) , YB2/0 (rat) , l'étude de la compétition entre ces anticorps et les LDL sur le LDL-R de cellules A459, l'étude de leur cinétique d'internalisation ai.xs.si_ que a..' ét-.ude du caractère pro-apoptotique aes anticorps.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules A549 La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R a été
évaluée par quantification du marquage de cellules A549 cultivées en présence de LPDS (lipoprotein Deficient Serum) pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps, Anti-LDL-R 5ES ont été incubés à des concentrations finales de (1, 3, 10, 30, 100 g/ml) pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl, ATCC-LGC
Promochem CRL-2224) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC
CRL-1691), préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été
effectuée en utilisant un anticorps secondaire anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 4).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules A549 de manière dose-dépendante.
Etude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R de cellules MDA-MB-231 La liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5 au LDL-R des cellules MDA-MB-231 a été évaluée selon le même protocole décrit pour l'étude de la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5ES au LDL-R de cellules A549, par quantification du marquage de cellules MDA-MB-231 cultivées en présence de LPDS pendant 24h, par cytométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à des concentrations finales de 1, 3, 10, 30, 100 ~ig/ml pendant 3 heures à 4 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R., IgG2b), _ . : r,_..___,._.. _ préparés 'ét~ incubés' dans les -mêmes conditions que les--Anti-LDL-R 5E5, ont servis d'anticorps contrôles, négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE.
Les résultats, ont,-été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 5).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 reconnaissent le LDL-R
des cellules MDA-MB-231 Etude de la cross-réactivité des anticorps Anti-LDL-R
5E5 au LDL-R de cellules C2C12, CHO-K1 et YB2/0 La cross-réactivité des anticorps anti LDL-R a été
testée chez la souris (cellules C2C12), chez le rat (cellules YB2/0) et chez le hamster (cellules CHO-K1).
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ont été incubés à une concentration finale de 30 }a.g/ml pendant 3, h:eures à
4 C sur des cellules C2C12, CHO-Kl et YB2/0 préalablement cultivées en conditions de LPDS pendant 24h. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R,, IgG2b) ont servis d'anticorps contrôles négatif et positif respectivement. La révélation de la liaison a été effectuée en utilisant un anti-IgG-PE. Les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes (Figure 6A) et en moyenne de fluorescence (Figure 6B).
Etude de la compétition des anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec les LDL sur des cellules A549 La compétition des LDL avec les anticorps Anti-LDL-R
SE5 a été étudiée en testant la liaison des anticorps Anti-LDL-R 5E5, à 30 pg/ml, en compétition avec des LDL non marquées à des concentrations croissantes (1, 4 et 16 fois la concentration des anticorps, exprimée en nM) sur des cellules A549 pendant 3 h à 4 C. La révélation de la liaison a été 'efféctué-e en ü.til=isant un- anti-I-gG-PE "'.-Lâ -l*ia.is n dés- anticorps' --au LDL-R -a été ensuite analysée par FACS et les résultats exprimés en moyenne de fluorescence (Figure 7).
Ce test de compétition des anticorps avec les LDL a permis. de mettre en évidence que la liaisQn de l'anticorps SES au LDL-R des cellules A549 n'est pas diminuée par l'addition de LDL à des concentrations physiologiques dans le milieu. Cela signifie que les anticorps 5E5 ne se lient pas au même site que les LDL. Cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R
La cinétique d'internalisation de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée sur 24 heures lors de l'incubation à 37 C de l'anticorps (30 pg/ml) marqué à
la rhodamine (NHS-rhodamine, Pierce, réf 46102) sur des cellules A549. Les cinétiques d'internalisation de l'anticorps contrôle C7 (30 l.zg/ml) marqué à la rhodamine et des LDL-Dil (30 }a.g/ml) ont été étudiées en parallèle. Après 2h, 4h, 6h et 24h d'incubation, les anticorps/LDL-Dil liés mais non internalisés ont été décrochés par du sulfate de dextran et quantifiés par fluorimétrie. Les cellules A549 ont ensuite été
lysées par de la soude (0.1 N) puis la quantité
d'ainticorps internalisés a été quantifiée par fluorimétrie. Le pourcentage d'internalisation a été
calculé selon la formule suivante : fluorescence des anticorps internalisés/(fluorescence des anticorps internalisés + fluorescence des anticorps liés mais non internalisés).
La cinétique d'internalisation des anticorps Anti-LDL-R 5E5 est intermédiaire entre celle des LDL (cinétique la plus rapide avec 60-'. d'internalisation à 4h) et celle du C7 qui s'internalise un peu plus lentement (Figure 8). Comme pour les LDL, la cinétique d'inter-nalisation des- anticorps -est- biphâsique avec . __ , .
une i,nterna,lisatïor? : ragide.-.au . cours--- des- 4- à.---5-premières heures. Après 6h d'incubation, les 3 anticorps testés montrent le même taux d'internalisation avec un plateau d'internalisation d'environ 60-0. à 2.4h.
Etude du caractère pro-apoptotique des anticorps Anti-La croissance des cellules A549 en présence et en l'absence d'=anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée par un double marquage FITC-annexine V (qui se lie à la phosphatidylsérine des cellules apoptotiques en phase précoce) et iodure de propidium (PI, qui ne marque que les cellules nécrotiques dont la membrane plasmique est lésée) par c tométrie en flux (FACS). Pour réaliser ce test, les anticorps Anti-LDL-R 5ES ont été
incubés à une concentration finale de 30 ug/ml pendant 16 heures (durée d'un test d'ADCC) à 37 C. Les anticorps commerciaux 1C6 (anti-SREBP2, IgGl) et C7 (anti-LDL-R, IgG2b), préparés et incubés dans les mêmes conditions que les Anti-LDL-R 5E5, ont servis de référence. Un contrôle négatif, cellules sans anticorps, et un contrôle positif, cellules incubées-avec de la camptothécine, ont été effectués parallèlement.
Les anticorps Anti-LDL-R 5E5 ne présentent pas d'effet fortement pro-apoptotique sur lés cellules A549 après 16h d'incubation.
Exemple 4 : Etudes in vivo Le modèle animal choisi est un modèle de xénogreffe de tissu tumoral humain sur des souris nude. La xénogreffe de cellules tumorales est implantée en sous-cutanée.
Choix de la lignée cellulaire cancéreuse humaine pour la xénog,ré f f e :,_ ... .
Cr blage- . -dés lignées cel-l-ul-aires - pour -l'expression du LDL-R
Plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein sont disponibles : MCF7-ras, MDA-MB-435 et MDA-MB-231 et,le choix de la lignée à implanter dépend pour n.~itre étude du niveau d'expression du LDL-R. L'expression du LDL-R
sur ces lignées cellulaires cancéreuses humaines a été
mise en évidence par l'étude de la liaison de LDL
marquées sur cette lignée cellulaire. Pour cela, les LDL (d=1.0à-1.053 g/ml) ont- été préparées par ultracentrifugation, dialysées dans un tampon PBS, pH
7,4 et validées par SDS-PAGE en conditions dénaturantes, puis marquées par le fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,31,3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). Les LDL-Dil ont été incubées sur les cellules à
des concentrations finales de 6,25, 12,5, 25, 50 et 100 pg/ml pendant 3 heures à 4 C. Après lavage au PBS, la liaison a été analysée par cytofluorométrie (FACS) et les résultats ont été exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes.
Ainsi, chaque lignée a été testée pour son niveau d'expression du LDL-R (Figures 2 et 3): les MCF7-ras ainsi que les MDA-MB-435 ont un niveau d'expression du LDL-R équivalent à la moitié de celui des HepG2. Les MDA-MB-231 représentent une population homogène qui exprime le LDL-R à haut niveau. Au vu de ces résultats, notre choix -sur la lignée à implanter s'est porté sur les MDA-MB-231.
= Détermination .du nombre de cellules à implanter pour la xénogreffe La vitesse d'apparition de la tumeur en fonction du nombre de cellules implantées chez des souris nude a été étudiée. L'étude porte sur l'"implantation de 0, 5. 106, 106, 2. 106 et 5. 106 cellules.
= Etude de la compétition de l'anticorps Anti-LDL-R
5ES avec les LDL sur des cellules MDA-MB-231 La compétition des LDL avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 a été étudiée en testant la liaison des LDL marquées au Dil, à 12.5 l.zg/ml en compétition avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 à des concentrations croissantes (6,25, 12,5, 25, 50., et 80 ~a.g/ml) sur des cellules MDA-MB-231 pendant 3 h à 4 C. La liaison des anticorps au LDL-R a été ensuite analysée par FACS et les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules fluorescentes..
Prôtocole in vivo Pour le traitement des souris avec l'anticorps Anti-LDL-R 5E5, l'approche choisie consiste à injecter la lignée cellulaire et l'anticorps simultanément (Test de Winn=). Cette approche permet d'évaluer la capacité
de l'anticorps à empêcher la formation de la tumeur.
Le premier groupe, groupe Contrôle, comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-ME-231 reprises dans 200~a.l d'un anticorps contrôle, de même isotype que l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 (TgG3,) qui ne reconnaît pas le LDL-R, sans traitement successif à
l'implantation des cellules.
Le deuxième groupe comprend 5- souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 r.eprises dans 200u1' d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, sans traitement successif à l'implantation des cellules.
Par ailleurs, une approche modifiée du test de Winn consistant à traiter les souris nude après implantation simultanée des cellules MDA-MB-231 et de l'anticorps Anti-LDL-R 5E5 avec 1'anticorps Anti-LDL-R
5E5, deux fois par semaine au cours des 4 semaines de l'étude (troisième groupe) a été mise en place. Le troisième groupe comprend 5 souris nude implantées avec 106 cellules MDA-MB-231 reprises dans 2001-i1 d'anticorps Anti-LDL-R 5E5, traitées en intra-pérïtoriéâle par 500 ug d'ain.ticorps An'ti-LDL=R SES, 2 ....
fois par semaine (le premier traitement par' 500 - g-ayant eu lieu 3 à 4 h après l'implantation des cellules).
Les souris sont contrôlées tous les jours avec mesure de la prise de poids et de la taille de.:la tumeur 3 fois par semaine. A la fin des 4 semaines de protocole, les souris sont sacrifiées et le foie, le coeur, les reins et la rate sont récupérés et congelés à - 80 C pour chacune des 5 souris de chaque groupe.
Par ailleurs, les sérums des, souris sont aussi récupérés et congelés.
Exemple 5 Etude de faisabilité thérapeutique.
L'étude de la faisabilité thérapeutique a eu pour but de mettre en évidence une sur-expression du LDL-R dans le tissu, cancéreux par rapport au tissu sain, dans différents types de cancers. Pour cela une analyse en Western B1ot (WB) de carcinomes hépatocellulaires a été réalisée.
Une analyse en Western Blot a été réalisée à partir de tissus issus de patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool (3 patients) ou sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C (15 patients). Deux prélèvements de tissu ont été fournis pour chaque patient: (i) un échantillon prélevé dans une zone non-tumorale mais cirrhosée et (ii) un échantillon prélevé dans du tissu tumoral, issu du même patient (avec un minimum de 70%
d'hépatocytes tumoraux).
Des analyses de type Western Blot, en utilisant un anticorps anti-LDL-R polyclonal de lapin (Research Diagnostics. Inc).,, ,_ont été r.éali.sées_..sur ces tissus.. _ Une bande à 160 kDa, qui correspond à la forme mature du LDL-R, a été observée à la fois sur les tissus cirrhosés et sur les tissus cancéreux. En plus de cette bande, une bande à 120 kDa, correspondant à la forme immature du LDL-R (non glycosylée), est présente."
La quantification de la bande correspondant au LDL-R
mature, normalisée par rapport à l'actine, a permis de mettre en évidence :
- Une sur-expression du LDL-R dans le tissu sain des 3 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose provoquée par l'alcool et dans le tissu sain de 2 patients sur les 15 atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C.
- Une sur-expression du LDL-R . dans le tissu cancéreux chez 7 patients sur les 15 patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus, de l'hépatite C
(niveau de sur-expression chez ces patients est entre 2 et 14 fois).
- Six patients atteints de CHC survenu sur une cirrhose ayant pour origine une infection par le virus de l'hépatite C n'ont pas présenté de' différentiel d'expression du LDL-R.
Exemple 6: étude de la spécificité de l'anticorps L'étude immunohistochimique a été réalisée sur des lames de tissue micro-array de tissus humains normaux, comportant 108 spots correspondants à 54 tissus humains normaux différents fixés en formol à 10%.
L'anticorps C7 et l'anticorps anti-LDL-R 5E5 ont ont été dilués au 1/10 (10pg/ml). La réactivation antigénique a été réalisée au micro-ondes, 3 fois 5 minutes à 750 Watts dans un tampon citrate lOmM, pH 6.
T1 a- -été observé une absence - de ' marquâ.ge '-dans le systëme hématôpcïétique (amygdale-, -rate et gangl-ie;n lymphoïde), le tissu musculaire (cceur et muscle strié
squelettique), le revêtement cutané et le tissu mammaire, quel que soit l'anticorps utilisé. Le système nerveux central (cortex cérébral, cervelet, noyaux gris centraux, hippocampe et moelle épinière), les glandes surrénales (cortex et médullaire), le foie et la vésicule biliaire ont été marqués par les 2 anticorps.
Ces résultats sont en accord avec la littérature sur la distribution tissulaire 'du LDL-R puisque les surrénales, le foie, le système nerveux central, les testicules et les reins ont été décrits comme dès tissus exprimant fortement le LDL-R.
LDL-R
Exemple 6 : Amplification et séquençage des régions variables des anticorps anti-LDL-R 5E5 1.Amplification des régions VH et VK
L'ARN total de l'hybridome murin 5E5, produisant une immunoglobuline de type IgGl,K, a été extrait (kit Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). Les domaines variables des chaînes légère (Vx) et lourde (VH) de 1-'anticorps 5E5 ont été amplifiées par la technique de 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) (kit 5'RACE, Invitrogen ref., 18374.041) en s'ancrant dans la région constante Kappa (CK) murine, pour la chaîne légère Kappa, ou G1 murine, pour la chaîne lourde.
Brièvement, une première étapé de transcription inverse a été tout d'abord réalisée en utilisant une amorce localisée dans la région 5' des régions constantes CK ou G1 murines. Une séquence poly-dC a été ensuite ajoutée en 3' dës ADNc synthétisés avarït de. réaliser l' amplification- des régions~ -VK- et - VH à
l'aide d'une amorce 5' reconnaissant la séquence poly-dC et d'une amorce 3', localisée dans les régions constantes CK ou G1 murines en 5' de l'amorce de tran~c*ription inverse. Afin d'améliorer la spécificité
de l'amplification une deuxième PCR semi-nested a été réalisée sur le produit de PCR VH en utilisant une amorce 3' située en 5' de l'amorce 3' de la première PCR.
Les amorces utilisées pour ces différents étapes sont les suivantes .
1) amorces de transcription inverse a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3' (SEQ ID NO
12) b. Amorce antisens spécifique Gi murin 5'- CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3' ,(SEQ ID NO : 13) 2) amorces de PCR 5'RACE
a. Amorce antisens spécifique Kappa murin 5'- TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3' (SEQ ID NO : 14.) b. Amorces antisens spécifiques G1 murin Amorce première PCR
5'- TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3' (SEQ ID NO
15) Amorce PCR semi-nested 5'-CACCATGGA.GTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA - 3' (SEQ ID NO
16) 2. Déterminationde la séquence des régions VH et VK
Après amplification les séquences Vx et VH de l'anticorps 5E5 ont été clonées dans le plasmide pCR4-TOPO (TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen, ref . 45-0030) . Les plasmidè"s" issus -*d' âü"' mixi.imum. 3 colonie-s -recombinantes ont été purifiés et -1-eur- insert-séquencé à l'aide des amorces universelles M13 uni et rev.
La séquence nucléotidique de,,' la région VK de l'anticorps murin 5E5 est indiquée sous la séquence SEQ ID NO : 8 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 10. Le gène VK appartient au sous-groupe VK4 (VK4/5, Almagro JC et al Immunogeneti~cs 1998, 47 : 355-363). Les séquences des CDR1, CDR2 et CDR3 de la région VK de -l'anticorps murin 5ES, définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH
Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3 et SEQ ID NO : 4, respectivement La séquence nucléotidique de la région VH de 5E5 est la séquence SEQ ID NO : 9 et la séquence peptidique déduite est la séquence SEQ ID NO : 11. Le gène VH
appartient au sous-groupe V'.H1 (Honjo T. and Matsuda F.
in Immunoglobulin genes . Honjo T. and Alt F.W.
eds, academic Press, London, 1996, pp145-171). Les séquences des CDRl, CDR2 et CDR3 de la région VH de l'anticorps murin 5E5, définies selon Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH Publication, 91-3242 (1991)] sont indiquées sous les séquences suivantes : SEQ ID NO
5, SEQ ID NO : 6 et SEQ ID NO : 7, respectivement.
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DEMANDE OU BREVET VOLUMINEUX
LA PRÉSENTE PARTIE DE CETTE DEMANDE OU CE BREVET COMPREND
PLUS D'UN TOME.
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NOTE POUR LE TOME / VOLUME NOTE: 9.
amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the sequence peptide of the human LDL receptor.
Advantageously, at least one CDR region (Complementarity Determining Region) of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70%
identity with a sequence selected from sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and at least one CDR region of each of the strings of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with a sequence chosen from the sequences SEQ ID NO
5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7.
The CDR regions concerned are the CDR CDR1 regions and / or CDR2 and / or CDR3.
In a particularly advantageous way, the identity with each of the sequences quoted above is from to at least 70%, preferably at least 80%, 900-, 95%, 990-. and even more preferentially 100% identity. The identity percentage is calculated aligning the 2 sequences to compare and counting the number of positions possessing an amino acid identical, this number being, divided by the number .- -d -'- a: c ~ ides - total amines of the -quick sequence ~ -c. In - any state-- -from cause, these differences in sequences .n'.affectent.in nothing the affinity of the monoclonal antibody for its target, or its ability to recruit cells immune effector.
In a particularly advantageous way, each region CDR of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70- '. identity with SEQ sequences ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO 4 respectively, and in that each CDR region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least minus 70- '. identity with the sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 respectively. So, the CDR1 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a sequence peptide having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 2, the CDR2 region of each of the light chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70%
with the sequence SEQ ID NO: 3, the region CDR3 of each of the light chains of the antibody according to the invention has a sequence. peptide having at least 7026 identity with the sequence SEQ ID
NO: 4, and the CDRl region of each of the strings heavy. the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID NO: 5, the CDR2 region of each heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70%
with the sequence SEQ ID NO: 6, the region CDR3 of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has a peptide sequence having at least 70% identity with the sequence SEQ ID
NO. 7.
De - manner is particularly advantageous ~ 1 'zdentité
with each of the sequences quoted above is from to at least 70%, preferably at least 80%, 90%, 95%, 99-. and even more preferentially 100o identity.
Advantageously, the variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by a nucleic acid sequence having at least minus 70- '. identity with the acid sequence SEQ ID NO: 8, and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention is encoded by an acid sequence nucleic acid having at least 70- '. identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9.
Particularly advantageous, the identity with each of the sequences quoted above is from to less than 70%, preferably at least 80%, and even more preferential way of 95-0. or 99-0.
identity. The percentage of identity is calculated in aligning the 2 sequences to compare and counting the number of positions with identical nucleotide, this number being divided by the number of nucleotides total of the sequence. Degeneration. code genetics may be at the origin of the fact that a single amino acid can be encoded by several triplets of different nucleotides. In any case, these Sequence differences do not affect in any way the affinity of the monoclonal antibody for its target, nor its ability to recruit immune cells effector.
Preferably, the variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention is encoded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8, and the variable region of each of its chains heavy is encoded by the nucleic acid sequence SEQID NO-: - ~ -.
Advantageously, the variable region of each light chains of the antibody according to the invention has at least 70- '. identity with the sequence in amino acids SEQ ID NO: 10 and the variable region of each of its heavy chains has at least 70- '.
identity with SEQ ID amino acid sequence NO: 11. In a particularly advantageous way, the identity with each of the sequences cited above is at least 70 -0., and preferably at least 70 -0.
80%, and even more preferentially 95%
or 99% identity. The percentage of identity is calculated by aligning the 2 sequences to be compared and counting the number of positions possessing an acid identical amino, this number being divided by the number -amino acid total of the sequence.
Preferably, the variable region of each of the light chains of the antibody according to the invention has the peptide sequence SEQ ID NO: 10 and the variable region of each of the heavy chains of the antibody according to the invention has the sequence Peptide SEQ ID NO: 11. The peptide sequence SEQ
ID NO: 10 is the peptide sequence deduced from the nucleotide sequence SEQ ID NO: 8 and the sequence Peptide SEQ ID NO: 11 is the sequence deduced from the nucleotide sequence SEQ ID NO: 9.
The antibody according to the invention also includes any modified antibody that meets the characteristics of the invention, wherein one or more amino acids have been added, substituted or deleted. Such addition, substitution or deletion can be located at any position in the molecule. In the case where several amino acids have been added, substituted or deleted, any combination of addition, substitution or deletion can be considered. Of such alterations of --la - sequen.these regions variables of the antibody according to the invention can be made in order to increase the number of residues likely to come into contact with the pept.:- target target.
Advantageously, an antibody according to the invention can to be, that is to say, consist of a fragment F (ab ') 2, an Fab 'fragment, an Fab fragment, a CDR region or any modified version of any of these fragments or region.
Advantageously, the antibody according to the invention is a murine antibody. Advantageously, this antibody Murine monoclonal is an IgGlkappa. Such an antibody can be produced by immunizing an animal, particular of a mouse, with the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO:
1), or with any other human LDL-R peptide located in the LDL binding region. The methods of production of antibodies are known to the man from job. According to a particular mode of production of monoclonal antibodies against the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO
1) LDL-R, the peptide corresponding to the acids Amines 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the LDL-R Sequence can be injected intraperitoneally to Balb / C mice in the presence of Freund's adjuvant.
Several immunization reminders are performed in presence of incomplete Freund's adjuvant. Follow-up the immune response of the mice is carried out on blood samples. by ELISA against SEQ peptide ID NO: 1. Hybridomas are obtained from the fusion of spleen cells of immunized mice with mouse myeloma cells in the presence of PEG (polyethylene glycol). The cells are then grown and then tested in ELISA for their response ..show the ~ .eptide SEQ ID NO -: 1.
Advantageously, the antibody according to the invention is a chimeric, humanized or human antibody.
Preferably, the antibody according to the invention is chimeric.
Chimeric antibody is understood to mean an antibody variable regions of the light chains and heavy chains belong to a different species constant = regions, light chains and heavy chains. Thus, the antibody according to the invention additionally has murine variable regions and constant areas belonging to a non-Murine. In this respect, all families and species of non-murine mammals are likely to be used, and in particular the man, the monkey, the murids (except the mouse), suidae, bovidae, equidae, felids, canids, for example, and than the birds. More preferably, the constant regions of each of the light chains and of each of the heavy chains of the antibody according to the invention are human constant regions. This preferred embodiment of the invention makes it possible to decrease the immunogenicity of the antibody in humans and thereby improve its efficiency during its therapeutic administration in humans.
In a preferred embodiment of the invention, the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type K.
allotype is suitable for carrying out the invention, for example Km (1), Km (1, 2), Km (1,2,3) or Km (3).
In another embodiment of the invention, the constant region of each of the light chains of the antibody according to the invention is of type A.
In a particular aspect of the invention, and especially when the constant regions of each light-chains - and each of the 'l: ôurdes' chains of the antibody according to the invention, human, the constant region of each of the chains Heavy antibodies are of type y. According to this variant, the constant region of each of the chains The antibodies of the antibody can be of type yl, of type y2, of type y3, these three types of constant regions having the particularity of fixing the complement human, or type y4. The antibodies possessing a constant region of each of the heavy chains of type belong to the class of IgG. The immunoglobulins of the type = G. (IgG), are heterodimers consisting of 2 heavy chains and 2 light chains, linked together by bridges disulfide. Each chain is constituted, in position N-terminal, region or variable domain (coded by the rearranged genes VJ for the light chain and VDJ for the heavy chain) specific for the antigen against which the antibody, is directed, and in position C-terminal, of a constant region, consisting of a single CL domain for light chain or 3 domains (CH1, CH2 and CH3) for the heavy chain. The association variable domains and CH1 and CL domains of heavy and light chains form the Fab parts, which are connected to the Fc region by a region very flexible hinge allowing each Fab to fix to its antigenic target while the Fc region, mediator of the effector properties of the antibody remains accessible to effector molecules such as Fc [] R receptors and Clq. The Fc region, composed of the 2 globular domains CE12 and CE13, is glycosylated at the C02 domain with the presence, on each of the two chains, a biantennary N-glycanne, related to Asn 297.
Preferably, the constant region of each heavy chains of the antibody is of type yi because such an antibody shows an ability to generate a ADCC activity (Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity) in the largest norivirus of indivi-(Humans). In this respect, any allotype is suitable for embodiment of the invention, for example G1m (3), Glm (1, 2, 17), Glm (1,17) or Glm (1,3).
The chimeric antibodies "according to the invention can be built using standard techniques recombinant DNA, well known to the human profession, and more particularly by using the construction techniques of chimeric antibodies described, for example, in Morrison et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 81: 851-55 (1984), where the recombinant DNA technology is used to replace the constant region of a heavy chain and / or the constant region of a light chain of a antibodies from a non-human mammal with corresponding regions of a human immunoglobulin.
Such antibodies and their method of preparation have also described in the EP patent publication 173,494, in Neuberger, MS et al., Nature 1985 Mar 21-27; 314 (6008): 268 = 70. , as well as in EP 125 023 for example. Methods to generate chimeric antibodies are largely available to those skilled in the art. For example, heavy chains. and light antibodies can be expressed separately using a vector for each channel, or be integrated into one vector.
An expression vector is an acid molecule nucleic acid in which the nucleic acid sequence murine coding for the variable domain of each of the heavy or light chains of the antibody and / or nucleic acid sequence, preferably human, coding for the constant region of each of the strings heavy or light antibodies have been inserted, in order to introduce and maintain them in a host cell. It allows the expression of these fragments foreign nucleic acid in the host cell because he has some "sequ: ericës' ifidïspënsâ.bles (Promoter, polyadenylation sequence, selection gene) to this expression. The vector may be for example a plasmid, an adenovirus, a retrovirus or a bacteriophage, and the host cell can be any '' mammalian cell, for example SP2 / 0, YB2 / 0, IR983F, Namalwa human myeloma, PERC6, lineages CHO, especially CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lec1, CHO-L, ec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, . Molt-4, COS-7, 293-HEK, .BHK, K6H6, NSO, SP2 / O-Ag 14 and P3X63Ag8.653. ' For the construction of expression vectors of chimeric antibodies according to the invention, sequences synthetic signal and restriction sites may be merged with the regions variables during amplification reactions by PCR. The variable regions are then combined with the constant regions of an antibody, so preferential human IgG1. The genes as well constructed are cloned under the control of a promoter (eg the RSV promoter) and upstream of a site of polyadenylation, using two separate vectors (one- for each string). Vectors are also equipped with selection genes known to the human such as for example the dhfr gene or the gene resistance to neomycin.
The chimeric antibodies according to the invention can to be produced by co-transfection in a cell host of the expression vector of the light chain and the expression vector of the heavy chain using a method well known to those skilled in the art (by for example, co-precipitation with calcium phosphate, electroporation, microinjection, etc.). AT
the outcome of the transfection, the cells can be put in a selective medium, for example in RPMI medium (Invitrogen, ref 21875-034) containing 5-. of serum dialysed (Invitrogen, ref 10603-017), 500 μg / ml -G418 (Invitrogen, ref: 10131-027) - and 25 - -nM- -de methotrexate (Sigma, M8407). The supernatants of resistant transfection wells are screened, for the presence of chimeric immunoglobulin (Ig) by assay ELISA specific for human Ig sequences. The transfectants producing the most antibodies are amplified and their supernatant redosed by ELISA so estimate their productivity and select the 3 best producers for dilution cloning limit (40 cells / plate).
By humanized antibody, we mean a antibody that contains CDR regions derived from a antibodies of non-human origin, the other parts of the antibody molecule being derived from a (or several) human antibodies. Such antibodies can be prepared according to transplantation methods of CDR (CDR-grafting) well known to humans, occupation [US Patent Publications 5,225,539, US
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(1986); Verhoeyen et al., Bioessays 8 (2): 74-8 (1988) ; Riechmann et al., Nature 332: 323-7 (1988); Queen C. et al., Proc Natl Acad Sci USA 86 (24): 10029-33 (1989); Lewis AP and Crowe JS, Gene 101 (2): 297-302 (1991); Daugherty BL et al., Nucleic Acids Res 19 (9): 2471-6 (1991); Carter et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 89: 4285 (1992); Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993); Presta et al., J. Immunol. , 151: 2623 (1993 ')]. The choice of variable domains grafting cells for the production of antibodies humanized is important in order to reduce immunogenicity of the antibody without altering its af f init for his target. In a production method of a humanized antibody, the sequence of the domain variable of a murine antibody is compared to a sequence library of human variable regions known and the variable sequence Yi.Numinine nearest ' of the murine sequence is classified as FR region.
the humanized antibody [Riechmann et al., Nature 332:
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86 (24): 10029-33 (1989); Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993)]. Another selection method of 5 ~
human FR regions is comparing the sequence each subregion of the murine FR sequence (FR1, FR2, FR3 and FR4) with a bank of FR sequences known human beings, in order to choose, for each region FR, the human FR sequence closest to the murine sequence [US Patent Publication 2003/0040606;
Singer et al., J Immunol 150 (7): 2844-57 (1993);
Sato K, et al Mol Immunol 31 (5): 371-81 (1994); Leung SO et al., Mol Immunol 32 (17-18): 1413-27 (1995)].
Another method uses a particular FR region derived from a consensus sequence of all antibodies humans from a particular subgroup of heavy chain or light [Sato K. et al Mol Immunol 31 (5): 371-81 (1994)]. The CDR transplant is completed in the majority of cases by mutation of certain residues keys located in human FRs in order to conserve good affinity of the humanized antibody for its target [Holmes MA and Foote J., J Immunol 158 (5): 2192-201 (1997)].
The humanized antibodies according to the invention are preferred for their use in methods of in vitro diagnosis, or prophylactic treatment and / or therapeutic in vivo.
The antibody according to the invention thus chimerised or humanized has the advantage of being better tolerated by the human organism, and at least as effective as the murine antibody. In particular advantageously, the antibody thus chimerised or humanized is twice as cytotoxic than murine antibody corresponding. Even more advantageously, the chimeric antibody thus chimerised is 10-fold, -. .or a.core 10O times-or-of-a-kind --- favorite-- p-lus --dE- 100 times more cytotoxic than the murine antibody corresponding.
By human antibody, we mean to deign an antibody each region of which is derived from a human antibody.
These antibodies can be derived from mice transgenics carrying human antibody genes, or human cells [Jakobovits et al., Curr Opin Biotechnol. Oct; 6 (5): 561-6 (1995); Lonberg N. and D.
Huszar. Internal Review of ~ Immunology 13: 65-93 (1995); Tomizuka K. et al., Proc. Natl. Acad, Sci.
USA 97 (2): 722-727 (2000)].
Advantageously, the antibody according to the invention is coupled to a toxin. The toxin is, for example, diphtheria toxin or ricin. The link between the antibody according to the invention and the toxin is strong enough to avoid release systemic toxin and also labile enough, so that the toxin is released into the cells targets.
In another aspect of the invention, the antibody is coupled to a radioisotope. The presence of radio isotope significantly increases cytotoxicity. Two isotopes are basically used iodine 131 (beta and gamma emitter), whose half-life is relatively long (8 days) and has an effect tumoricide about 1 mm around the cell tumor having fixed the antibody according to the invention.
Iodine 131 has the advantage of making possible the imaging, but requires respect radiation protection measures. Yttrium 90 (beta emitter), whose half-life is shorter (2.5 days), exerts tumoricidal effects over a distance of 5 mm.
Advantageously, the antibodies according to the invention allows the recruitment of immune cells effector. Such an antibody, because of its good specificity and its good sensitivity, is a tool can be used to mediate reactions of ADCC (Ar, ~: ibody Dependent Cellular Cytotoxicity). Indeed, the antibody according to the invention can be modified from to induce ADCC, for example by being chimerised or humanized. The antibody according to the invention allows the recruitment of immune cells effector.
Advantageously, the antibody according to the invention allows the destruction of cancer cells. In effect, the recruitment of effector cells by the antibody according to the invention causes destruction cells on which the antibody is bound (target cell). Cancer cells over-expressing LDL-R will therefore be preferred targets of the antibody according to the invention. Thus, the cells lysed will be in a quasi-specific way cancerous cells, healthy cells do not expressing little or no LDL-R and thus being preserved.
A preferred antibody according to the invention is the antibody 5E5, capable of being produced by the hybridoma H5E5 (filed under number I-3488 at the CNCM, Collection National Culture of Microorganisms, 25 rue du Dr. Roux, 75724 Paris Cedex 15). The region variable of each of the light chains of the antibody monoclonal produced by the hybridoma H5E5 is coded by the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 8, and the variable region of, each of the heavy chains of the monoclonal antibody produced by the hybridoma H5E5 is encoded by the SEQ ID nucleic acid sequence NO: -9.
A particular object of the invention relates to a monoclonal antibody binding to LDL-R and allowing the recruitment of effector cells. This antibody is the 5E5, or. ~ out chimeric antibody, humanized or human having the variable parts of the antibody 5E5.
In one embodiment, the antibody is produced in mouse strain SP2 / 0-AG14 (ATCC CRL-1581).
Another object of the invention relates to urie lineage stable cell producing an antibody according to the invention as described above.
Advantageously, the stable cell line according to the invention is selected from the group consisting of: SP2 / 0, YB2 / 0 (cell YB2 / 3HL.P2.G11.16Ag.20, deposited at the American Type Culture Collection under number ATCC CRL-1662), SP2 / 0-AG14 (ATCC CRL-1581), IR983F, human myeloma Namalwa, PERC6, CHO lines, including CHO-K-1, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO-Lec13, CHO Pro-5, CHO dhfr-, Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, BHK, K6H6, NSO, SP2 / 0-Ag14 and P3X63Ag8.653.
Another object of the invention relates to the hybridoma H5E5 deposited under the number CNCM I-3488 at the CNCM.
Another object of the invention relates to a DNA fragment of sequence SEQ ID NO: 9 coding for the variable region of the heavy chain of an antibody according to the invention. This DNA fragment can be used for the manufacture of a binding polypeptide peptide corresponding to amino acids 280-307 '(SEQ
ID NO: 1) - this polypeptide being able to be an antibody.
Another object of the invention * relates to a DNA fragment of sequence SEQ ID NO: 8 coding for the variable region of ury light chain antibodies according to the invention. Similarly, this DNA fragment can to be used for the production of a polypeptide binding to the peptide corresponding to the amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1), this polypeptide being able to be a antibody.
Another object of the invention relates to a vector expression medium comprising at least one DNA fragment selected from the fragments of sequence SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 8.
Another subject of the invention is the peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ ID NO:
1) of the peptide sequence of the human LDL. =
Another object of the invention is the use of a according to the invention, to activate in vitro or in vivo FcγRIII receptors, cells immune effector. Indeed, the antibodies of the invention can be used for their ability to activate by their region Fc the receiver FcyRIIIA. This is of considerable interest because this receiver is expressed on the surface of called cells effector cells: the binding of the Fc region from the antibody to its receptor carried by the cell effector causes the activation of FcyRIIIA and the destruction of the target cells. Cells effector are, for example, NK cells (Natural Killer), macrophages, neutrophils, CDB lymphocytes, TyS lymphocytes, NKT cells, eosinophils, basophils and mastocytas. "-Uri another particular object of the invention is a antibody as described above for its use as a medicine.
In a particular aspect of the invention, the antibody used binds to the human LDL receptor, and allows the recruitment of effector cells.
Advantageously, this cytotoxic antibody can bind to all or part of the extracellular region of the LDL receptor, that is to say, that it is capable of bind to the LDL binding region (corresponding to amino acids 1 to 322) or to the region outside the LDL binding zone (corresponding to the acids Amines 322-768 of LDL-R). In this respect, the antibody according to the invention, binding to the corresponding peptide amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the Peptide sequence of the LDL receptor, is a of realization .. particular of this object of the invention.
More particularly, an object of the invention is the use of an antibody as described previously for the manufacture of a drug.
Advantageously, this cytotoxic antibody can bind to all or part of the extracellular region of the LDL receptor, that is to say, it is capable of bind to the LDL binding region (corresponding to amino acids 1 to 322) or to the region outside the LDL binding zone (corresponding to the acids Amines 322-768 of LDL-R). At this point, the antibody according to the invention, binding to the corresponding peptide amino acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the Peptide sequence of the human receptor. LDL, is a particular embodiment of this object of the invention. ' Another object of the invention is the use of a arltiçorps. tel. qzze, described. precociously, that is, possessing the ability to relate to all or part of the extracellular region of the human LDL receptor and advantageously to the peptide corresponding to the acids 280-307 (SEQ ID NO: 1) of the sequence of human LDL receptor, for the manufacture of a drug for the treatment of cancer. Indeed, the antibody according to the invention targets the LDL-R of Specifically, in this respect, the antibody the invention, by binding to this receiver, will generate a lysis reaction of the cancerous target cells, especially by ADCC against target cells cancerous and allow lysis, of these.
Thus, the lysed cells will be almost specific cancer cells, cells healthy, not over-expressing LDL-R or not, and being thus preserved.
Advantageously, the cancers treated with of the antibody according to the invention are cancers for which the LDL receptor is over-expressed at the surface of the cancer cells, and this compared to the corresponding healthy cells.
Particularly advantageously, cancer treated is cancer of the prostate, breast, liver, pancreas, stomach, ovaries, colon, lungs or leukemias, for which there is evidence of increase in density of LDL receptors on the membranar surface of cancerous cells. The target cells, cancerous, may be lysed by the effector cells recruited during the reaction of ADCC, healthy cells being preserved ' since they do not over-express LDL-R.
Particularly advantageously, the antibody according to the invention is used "poùr- the preparation." of iiri -medicine -destination --- treatment - of ~ cancer-s-- including acute myeloid leukemia, monocytic leukemias acute, myelomonocytic leukemias, leukemia chronic myeloid blast crisis, leukemia lympho3, chronic lymphoid leukemias, solid tumors such as squamous cell cancer cervical, endometrial adenocarcinoma, carcinoma gastric carcinoma, hepatocellular carcinoma, choriocarcinoma, brain tumors.
Another object of the invention is a composition pharmaceutical composition comprising an antibody according to the invention as described above and an excipient and / or a pharmaceutically acceptable carrier.
This pharmaceutical composition is intended to target cancer cells, especially those overexpressing LDL-R. These cancer cells expressing on their surface a quantity of LDL greater than the amount of receptors expressed by healthy cells, the drug thus prepared will be preferentially bound by the cells cancerous.
The excipient may be any solution, such as a saline, physiological, isotonic, buffered, etc., as well as any suspension; gel, powder, etc., compatible with a pharmaceutical use and known to the skilled person. The compositions according to the invention may also contain one or more agents or vehicles selected from dispersants, solubilizers, stabilizers, surfactants, curators, etc. On the other hand, the compositions according to the invention may comprise other agents or active ingredients.-Moreover, the compositions can be administered in different ways and under different forms. The administration can be made by any conventional route for this type Approach ---- Therapeutics, -co-ms - especially - by way of systemic, in particular by injection intravenous, intradermal, intratumoral, subcutaneous, dermal, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, etc. One can quote by., Example the injection intra-tumor or injection into an area close to the tumor or irrigating the tumor.
Doses may vary depending on the number administrations, the association with other active ingredients, stage, evolution of the pathology, etc.
Another object of the invention is the use of the antibody according to the invention in the analyzes immunohistochemistry of cancerous tissue, whether healthy or cirrhosis, or in Western Blot analyzes, in ELISA or in vivo quantification test.
The antibody 5E5 is particularly suitable for its use in Western Blot because it recognizes specific way a band of 160 kDa and a band 120 kDa corresponding to glycosylated and non-glycosylated forms glycosylated respectively from human LDL-R.
The antibody 5E5 therefore has an advantage as diagnostic tool for pathologies involving the LDL-R, and more particularly cancers.
Other aspects and advantages of the invention will be described in the following examples, which should be considered illustrative and do not limit the scope of the invention.
Legends of figures Figure 1: Screening of LDL-R expression level in cancerous lines (results expressed in arbitrary units of flubrescene).
Figure 2: Binding of LDL-Dil on HepG2 cells (results expressed as a percentage of cells fluorescent).
p:.
Figure 3: Screening of cancer cell lines breast cancer for expression of LDL-R (expressed results as a percentage of fluorescent cells).
Figure 4: -Link of anti-LDL antibodies ~ -R 5E5 on A549 cells (results, expressed as a percentage fluorescent cells). Anti-LDL-R antibodies 5E5 are produced by the hybridoma H5E5 and are directed against the peptide corresponding to the amino acids 280-307 of the LDL receptor sequence (SEQ ID NO:
1).
Figure 5 Anti-LDL-R SES antibody binding on MDA-MB-231 cells (results expressed in percentage of fluorescent cells).
Figure 6A: Cross-reactivity of anti-LDL-R antibodies SES on C2C12, CHO-Kl and YB2 / 0 cells (results expressed as a percentage of fluorescent cells).
Figure 6B: Cross-reactivity of anti-LDL-R antibodies 5E5 on C2C12, CHO-K1 and YB2 / 0 cells (results expressed as mean fluorescence).
Figure 7 Anti-LDL-R 5ES antibody competition with LDL, on A549 cells (results expressed as average fluorescence).
Figure 8 Kinetics of internalization of antibodies anti-LDL-R SES with LDL, on A549 cells (results expressed as percentage of internalization).
Figure 9: Characterization of the. antibodies - 5E5 in :, Western blot Examples Example 1 Production, selection and characterization of monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the amino acid sequence 280-307 of the human LDL receptor sequence (SEQ ID NO
1) Choice of the proprietary peptide sequence The peptide fragment corresponding to the sequence SEQ
ID NO: 1 (corresponding to amino acids 280-307 of the human LDL receptor sequence) located in the LDL binding region was synthesized. The sequence SEQ ID NO: 1 chosen has been modified (replacement of cysteines with serines) to avoid the formation of disulfide bridges in case oxidation of the thiol group of cysteines (SEQ ID
NO: 17).
Peptide synthesis The peptide was synthesized by the synthesis method in solid phase on a model automatic synthesizer ABI 433A (Applied Biosystems Inc., California, USA), using a Boc / Bzl strategy on an MBHA resin 0.5 mmol.
Mass spectrometry The molecular mass was determined using a ion electrospray mass spectrometer. The spectrum of electrospray was obtained using a API device (Perkin-Elmer-Sciex) on a spectrometer of ion-electrospray-based electrons with simple "e;"
. . ..
equipped with a spray- = .ions - (elec-tr-osp-ray assisted by urz-nebulizer) (Sciex, Toronto, Canada).
Production of monoclonal antibodies Monoclonal antibodies against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 are products by immunizing BALB / c male mice by intraperitoneal injection of the peptide corresponding to SEQ ID NO: 17, the peptide being previously emulsified with an equal volume of complete adjuvant Freund.
Three injections were then made every two weeks in the presence of incomplete adjuvant Freund. Four days after the last injection, the the animals are taken, then the cells are isolated and fused with cells Sp 2/0-Ag14 mouse myeloma in the presence of fusion such as polyethylene glycol. Cells fused are then incubated in. an environment selective (HAT medium) which inhibits the growth of unfused malignant cells.
In order to ensure the monoclonal nature of hybridomas, dilution-limit subcloning been made. At the end of these subclonings, a hybridoma called HSE5, antibody producer directed against the peptide corresponding to SEQ ID
NO: 1 was selected. This hybridoma belongs to the class of IgG, of subclass 1.
The antibodies produced by the hybridoma H5E5 have been tested by an ELISA test, for the secretion of a monoclonal antibody of specificity sought, know against the peptide corresponding to SEQ ID
NO: 1.
Ascites were obtained from BALB / c mice males who received an injection of pristane and to which 2.106 HERCE hybridoma cells were injected.
Monoclonal antibodies have been isolated precipitation with 27% ammonium sulphate and purified by gel affinity chromatography Protein A (HiTrap Protein A HP Columns, Amersham Bioscience, Uppsala, Sweden). Non-proteins detentions were washed away with a buffered saline solution (PBS: Phosphate 50 mmol / L, pH 7.2, NaCl 150 mmol / L). The elution of Monoclonal IgG immunoglobulins specific for the antibody = directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 was accomplished using 0.2 M glycine at pH 2.8. Purified antibodies were dialyzed immediately against 10 mmol / L of PBS, concentrated by lyophilization, and then aliquots of 0.5 to 1 mg +/- BSA 1% at -20 C.
These antibodies will be referred to hereinafter as Anti-LDL-R
5E5.
Western blot analysis Anti-LDL-R 5E5 antibodies were tested in Western Blot. Total protein extracts from cells MDA-MB-231 were electrophoresed denaturing gel SDS-PAGE (10%) and then transferred to a nitrocellulose membrane and reacted with Anti-LDL-R 5E5 antibodies. The proteins immunoreactive were visualized with an antibody monoclonal anti-IgG conjugated with peroxidase (Chemicon). The development of the reaction has been performed by chemiluminescence (Amersham, Biosciences).
Western Blot analysis shows that the anti-LDL-R 5E5 recognizes a band of 160 kDa and a band 120 kDa corresponding to glycosylated and non-glycosylated forms glycosylated respectively from human LDL-R (Figure 9).
isotyping Isotyping of the hybridomas was effected by. - ELISA
with the SEA-lonotyping System / HRP kit, (SouthernBiotech) and with Isostrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Test (Roche-reference 1493027).
The 5E5 antibody is IgG1, kappa.
Example 2 Screening of the Level of Expression of LDL-R
in cancerous lines The following cancer cell lines have been screened for expression of LDL-R HepG2, HeLa, MCF-7, Jurkat, Ramos, HuH7 and Hek293 by studying the labeled LDL binding (Figures 1 and 2). For that, LDL (density = 1.03-1.053 g / ml) were prepared by ultracentrifugation, dialyzed in PBS buffer, pH 7.4 and validated by SDS-PAGE in conditions denaturants, then labeled with the fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-i.ndocarbocyanide (Dil). LDL-Dil were incubated on final concentrations of 0, 10 and 100 μg / ml for 3 hours at 4 C. After washing with PBS, the binding was analyzed by FACS cytofluorometry (Fluorescence-Activated Cell Sorting) that is to say that the fluorescence of each cell inside a given population is individually measured by flow cytometry on a Facscalibur device (Becton Dickinson). The measured parameters are the FSC
(Forward Scatter), SSC (Side Scatter) and the fluorescence emitted at the wavelength of 530 nm after excitation with an Argon laser at 488 nm.
results were expressed as percentage of cells fluorescent (Figure 1).
* The results presented in Figure 1 show that HepG2 cells and HeLa cells express the more strongly LDL-R.
In addition, several cancer cell lines breast are available: MCF7-ras, MDA-MB-435 and MDA-MB-231. The expression dia LDL-R is co-branded human cancer cells has been implemented evidence by studying the binding of LDL labeled on this cell line. For this, LDL (d = 1.03-1.053) were prepared by ultracentrifugation, dialysed in PBS buffer, pH 7.4 and validated by SDS-PAGE in denaturing conditions, then labeled by fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). LDL-Dil have were incubated on the cells = in concentrations final results of 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 μg / ml for 3 hours at 4 C. After washing with PBS, the binding was analyzed by cytofluorometry (FACS) and the results 33 ' were expressed as a percentage of cells fluorescent.
Thus, each line has been tested for its level expression of LDL-R (FIG. 3): MCF7-ras and that MDA-MB-435 has a level of expression of LDL-R
equivalent to half that of HepG2. MDA-MB-231 represent a homogeneous population that expresses high-level LDL-R.
Example 3 In Vitro Functional Tests of Antibodies monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID NO: 1 selected in Example 1 The functionality of monoclonal antibodies directed against the peptide corresponding to the sequence SEQ ID
NO: 1 was evaluated by the linkage study of antibodies to, LDL-R at the cellular level (A549 cells and cells .MDA-MB-231), the study of cross-reactivity of antibodies to LDL-R of C2C12 cells (mouse), CHO-K1 (hamster), YB2 / 0 (rat), the study of competition between these antibodies and LDL on LDL-R cells A459, studying their kinetics of internalization, so that the study of the character of apoptotic antibodies.
Study of the binding of Anti-LDL-R 5E5 antibodies to LDL-R cells A549 The binding of Anti-LDL-R 5E5 antibodies to LDL-R has been evaluated by quantification of cell labeling A549 grown in the presence of LPDS (lipoprotein Deficient Serum) for 24h, by flow cytometry (FACS). To carry out this test, the antibodies, Anti-LDL-R 5ES were incubated at final concentrations of (1, 3, 10, 30, 100 g / ml) for 3 hours at 4 ° C.
1C6 commercial antibodies (anti-SREBP2, IgG1, ATCC-LGC
Promochem CRL-2224) and C7 (anti-LDL-R, IgG2b, ATCC
CRL-1691), prepared and incubated in the same conditions that Anti-LDL-R 5E5, have served of antibodies controls, negative and positive respectively. The revelation of the bond was performed using a secondary antibody IgG-PE. The results were expressed as a percentage fluorescent cells (Figure 4).
Anti-LDL-R 5E5 antibodies recognize LDL-R
A549 cells in a dose-dependent manner.
Study of the binding of Anti-LDL-R 5E5 antibodies to LDL-R of MDA-MB-231 cells The binding of Anti-LDL-R 5E5 antibodies to LDL-R
MDA-MB-231 cells were evaluated according to the same protocol described for the study of the binding of Anti-LDL-R 5ES antibody to LDL-R of A549 cells, by quantification of MDA-MB-231 cell labeling grown in the presence of LPDS for 24 hours, by flow cytometry (FACS). To perform this test, the Anti-LDL-R 5E5 antibodies were incubated at final concentrations of 1, 3, 10, 30, 100 ~ ig / ml for 3 hours at 4 C. Commercial antibodies 1C6 (anti-SREBP2, IgG1) and C7 (anti-LDL-R, IgG2b), _. : r, _..___, ._ .. _ prepared 'and ~ incubated' under the same conditions as--Anti-LDL-R 5E5, served as control antibodies, negative and positive respectively. The revelation of binding was performed using anti-IgG-PE.
The results were expressed as a percentage of fluorescent cells (Figure 5).
Anti-LDL-R 5E5 antibodies recognize LDL-R
MDA-MB-231 cells Study of the cross-reactivity of Anti-LDL-R antibodies 5E5 to LDL-R of C2C12, CHO-K1 and YB2 / 0 cells The cross-reactivity of the anti-LDL-R antibodies has been tested in mice (C2C12 cells) in rats (YB2 / 0 cells) and in the hamster (CHO-K1 cells).
Anti-LDL-R 5E5 antibodies were incubated at a final concentration of 30 μg / ml for 3 hrs at 4 C on C2C12, CHO-K1 and YB2 / 0 cells previously grown under LPDS conditions during 24. Commercial antibodies 1C6 (anti-SREBP2, IgG1) and C7 (anti-LDL-R ,, IgG2b) served as antibodies Negative and positive controls respectively. The disclosure of the binding was performed using an anti-IgG-PE. The results were expressed in percent of fluorescent cells (Figure 6A) and average fluorescence (Figure 6B).
Anti-LDL-R 5E5 antibody competition study with LDL on A549 cells LDL competition with Anti-LDL-R antibodies SE5 was studied by testing antibody binding Anti-LDL-R 5E5, at 30 μg / ml, competing with Unlabeled LDL at increasing concentrations (1, 4 and 16 times the concentration of antibodies, expressed in nM) on A549 cells for 3 h at 4 C.
revelation of the link was effected by using it An anti-I-gG-PE "-L'-l * ia.is n de-antibodies' - to LDL-R -a was then analyzed by FACS and the results expressed as mean fluorescence (Figure 7).
This test of competition of antibodies with LDL has permit. to highlight that the relationship of SES antibody to LDL-R cells A549 is not decreased by the addition of LDL at concentrations physiological in the medium. This means that 5E5 antibodies do not bind to the same site as the LDL. Kinetics of internalization of Anti-LDL-R antibodies The kinetics of internalization of the Anti-LDL-R 5E5 was studied over 24 hours during incubation at 37 C of the antibody (30 μg / ml) labeled with rhodamine (NHS-Rhodamine, Pierce, ref 46102) on A549 cells. The kinetics of internalisation of C7 control antibody (30 μg / ml) labeled with rhodamine and LDL-Dil (30} ag / ml) were studied in parallel. After 2h, 4h, 6h and 24h incubation, antibodies / LDL-Dil bound but not internalized have were unhooked by dextran sulfate and quantified by fluorimetry. A549 cells were then lysed with sodium hydroxide (0.1 N) then the quantity of internalized antibodies has been quantified by fluorimetry. The percentage of internalisation has been calculated according to the following formula: fluorescence of internalized antibodies / (antibody fluorescence internalized + fluorescence bound antibodies but not internalized).
The kinetics of internalization of Anti-LDL-antibodies R 5E5 is intermediate between that of LDL (kinetic the fastest with 60- '. internalisation at 4h) and that of the C7 which is internalizing a little more slowly (Figure 8). As for LDL, kinetics of inter-normalization of antibodies-is-biphase with . __,.
an i, nterna, lisatïor? : ragide. course --- from 4- to 5-first hours. After 6 hours of incubation, the 3 tested antibodies show the same rate internalisation with an internalisation plateau about 60-0. at 2.4h.
Study of the proapoptotic nature of Anti-antibodies The growth of A549 cells in the presence and the absence of Anti-LDL-R 5E5 antibody was studied by a double FITC-annexin V labeling (which binds to the phosphatidylserine apoptotic cells in phase early) and propidium iodide (PI), which only marks necrotic cells including the plasma membrane is damaged) by flow cytometry (FACS). For perform this test Anti-LDL-R 5ES antibodies have been incubated at a final concentration of 30 μg / ml 16 hours (duration of an ADCC test) to 37 C.
commercial antibodies 1C6 (anti-SREBP2, IgG1) and C7 (anti-LDL-R, IgG2b), prepared and incubated in the same conditions as Anti-LDL-R 5E5, have been used as reference. A negative control, cells without antibodies, and a positive control, cells incubated with camptothecin, were performed in parallel.
Anti-LDL-R 5E5 antibodies have no effect highly pro-apoptotic on A549 cells after 16h incubation.
Example 4 In Vivo Studies The chosen animal model is a xenograft model of human tumor tissue on nude mice. The tumor cell xenograft is implanted in subcutaneous.
Choice of the human cancer cell line for the xenog, re ffe :, _ ....
Crushing. of cel-l-ul-aires lines - for -the expression of LDL-R
Several breast cancer cell lines are available: MCF7-ras, MDA-MB-435 and MDA-MB-231 and, the choice of the line to be implanted depends on the study the level of expression of LDL-R. The expression of LDL-R
on these human cancer cell lines has been highlighted by the LDL binding study labeled on this cell line. For this, LDL (d = 1.0 to 1.053 g / ml) were prepared by ultracentrifugation, dialysed in PBS buffer, pH
7.4 and validated by SDS-PAGE in conditions denaturants, then labeled with the fluorochrome 1,1'-dioctadecyl-3,3,31,3'-tetramethyl-indocarbocyanide (Dil). LDL-Dil were incubated on cells final concentrations of 6.25, 12.5, 25, 50 and 100 μg / ml for 3 hours at 4 ° C. After washing with PBS, the binding was analyzed by cytofluorometry (FACS) and the results were expressed in percentage of fluorescent cells.
Thus, each line has been tested for its level of expression of LDL-R (Figures 2 and 3): MCF7-ras as well as the MDA-MB-435 have a level of expression of LDL-R is half that of HepG2. The MDA-MB-231 represent a homogeneous population that expresses high-level LDL-R. In view of these results, our choice - on the lineage to be implanted was focused on the MDA-MB-231.
= Determination of the number of cells to be implanted for xenotransplantation The speed of appearance of the tumor as a function of number of implanted cells in nude mice been studied. The study focuses on the "implementation of 0, 5. 106, 106, 2. 106 and 5. 106 cells.
= Anti-LDL-R antibody competition study 5ES with LDL on MDA-MB-231 cells LDL competition with Anti-LDL-R 5E5 antibody has been studied by testing the binding of labeled LDL
with Dil, at 12.5 l.zg / ml in competition with the antibody Anti-LDL-R 5E5 at increasing concentrations (6.25, 12.5, 25, 50, and 80 ~ ag / ml) on MDA-MB-231 cells for 3 hours at 4 C. The binding of antibodies to LDL-R
was then analyzed by FACS and the results are expressed as a percentage of fluorescent cells.
Prostocole in vivo For the treatment of mice with Anti-Antibody LDL-R 5E5, the chosen approach is to inject the cell line and antibody simultaneously (Test from Winn =). This approach assesses capacity of the antibody to prevent the formation of the tumor.
The first group, Control group, includes 5 mice nude implanted with 106 cells MDA-ME-231 times in 200 ~ al of a control antibody, of the same isotype anti-LDL-R 5E5 antibody (TgG3), which does not recognize LDL-R, without subsequent treatment with the implantation of the cells.
The second group includes 5- implanted nude mice with 106 MDA-MB-231 cells taken up in 200u1 ' of Anti-LDL-R 5E5 antibody, without subsequent treatment to the implantation of the cells.
In addition, a modified approach to Winn consisting of treating nude mice after simultaneous implantation of MDA-MB-231 cells and Anti-LDL-R 5E5 Antibody with Anti-LDL-R Antibody 5E5, twice a week during the 4 weeks of the study (third group) was set up. The third group includes 5 implanted nude mice with 106 MDA-MB-231 cells taken up in 2001-i1 Anti-LDL-R 5E5 antibodies, treated intra-Periosteally with 500 μg of Antibody-LDL = R SES, 2 ....
once a week (the first treatment with '500 - g 3 to 4 hours after the implantation of cells).
Mice are monitored daily with measurement weight gain and the size of the tumor times per week. At the end of the 4 weeks of protocol, the mice are sacrificed and the liver, the heart, kidneys and spleen are salvaged and frozen at -80 C for each of the 5 mice in each group.
Moreover, the sera of the mice are also recovered and frozen.
Example 5 Therapeutic feasibility study.
The study of the therapeutic feasibility was aimed to highlight an over-expression of LDL-R in tissue, cancerous compared to healthy tissue, in different types of cancer. For this an analysis in Western B1ot (WB) Hepatocellular Carcinoma been realized.
Western blot analysis was performed from Tissues from patients with carcinoma hepatocellular disease (HCC) on cirrhosis caused by alcohol (3 patients) or on a cirrhosis caused by infection with the virus hepatitis C (15 patients). Two samples of tissue were provided for each patient: (i) a sample taken from a non-tumor area but cirrhosis and (ii) a sample taken from tissue tumor, from the same patient (with a minimum of 70%
tumor hepatocytes).
Western Blot analyzes, using a anti-LDL-R polyclonal rabbit antibody (Research Diagnostics. Inc). Have been realized on these tissues.
A band at 160 kDa, which corresponds to the mature form LDL-R, was observed both on the tissues cirrhosis and on cancerous tissues. In addition to this band, a 120 kDa band, corresponding to the Immature form of LDL-R (unglycosylated), is present."
Quantification of the band corresponding to LDL-R
mature, normalized to actin, highlight :
- Over-expression of LDL-R in the healthy tissue of 3 patients with HCC on cirrhosis caused by alcohol and in the healthy tissue of 2 patients in the 15 with CHC occurred on a cirrhosis caused by infection with hepatitis C virus - Over-expression of LDL-R. in the fabric cancer in 7 patients out of 15 patients CHC occurred in cirrhosis with the origin an infection with the virus, hepatitis C
(level of over-expression in these patients is between 2 and 14 times).
- Six patients with CHC occurred on a cirrhosis caused by infection with hepatitis C virus did not show any ' Differential expression of LDL-R.
Example 6: Study of the Specificity of the Antibody The immunohistochemical study was performed on microarray tissue slides of normal human tissue, with 108 spots corresponding to 54 tissues different normal humans fixed in 10% formalin.
The C7 antibody and the anti-LDL-R 5E5 antibody have diluted to 1/10 (10pg / ml). Reactivation antigen was made in the microwave, 3 times 5 minutes at 750 Watts in 10mM citrate buffer, pH 6.
T1 has been observed an absence of 'mark' in the hematopecetic system (amygdala-, -rate and gangl-ie;
lymphoid), muscle tissue (heart and striated muscle skeletal), skin and tissue mammary, regardless of the antibody used. The central nervous system (cerebral cortex, cerebellum, basal ganglia, hippocampus and spinal cord), the adrenal glands (cortex and medulla), the liver and gall bladder were marked by the 2 antibody.
These results are in agreement with the literature on the tissue distribution of LDL-R since the adrenal, liver, central nervous system, testes and kidneys have been described as soon tissues strongly expressing LDL-R.
LDL-R
Example 6: Amplification and Sequencing of Regions anti-LDL-R 5E5 antibody variables 1.Amplification of the VH and VK regions The total RNA of murine hybridoma 5E5, producing a Immunoglobulin type IgG1, K, was extracted (kit Nucleospin RNA Macherey-Nagel ref. 740609.250). The variable domains of light (Vx) and heavy chains (VH) of 1-antibody 5E5 were amplified by 5'RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) technique (5'RACE kit, Invitrogen ref., 18374.041) with anchoring in the constant Kappa region (CK) murine, for the Kappa light chain, or murine G1, for the chain heavy.
Briefly, a first transcription stage reverse was first performed using a primer located in region 5 'regions murine CK or G1 constants. A poly-dC sequence was then added in 3 'of synthesized cDNAs avarit of. to amplify regions ~ -VK- and -VH to using a 5 'primer recognizing the poly-dC and a 3 'primer, localized in the Murine CK or G1 constants in 5 'of the primer of reverse transference. In order to improve the specificity of amplification a second PCR semi-nested a was performed on the VH PCR product using a 3 'primer located 5' of the 3 'primer of the first PCR.
The primers used for these different steps are the following .
1) reverse transcription primers at. Murine Kappa specific antisense primer 5'- ACT GCC ATC AAT CTT CCA CTT GAC -3 '(SEQ ID NO
12) b. Murine Gi specific antisense primer 5'-CTGGACAGGGATCCAGAGTTCCA -3 ', (SEQ ID NO: 13) 2) 5'RACE PCR primers at. Murine Kappa specific antisense primer 5'-TTGTTCAAGAAGCACACGACTGAGGCAC -3 '(SEQ ID NO: 14.) b. G1 murine specific antisense primers PCR first primer 5'-TGTCACTGGCTCAGGGAAATAGCCCTTGAC -3 '(SEQ ID NO
15) Semi-nested PCR primer 5'-CACCATGGA.GTTAGTTTGGGCAGCAGATCCA-3 '(SEQ ID NO.
16) 2. Determination of the sequence of VH and VK regions After amplification, the Vx and VH sequences 5E5 antibody were cloned into the plasmid pCR4-TOPO-TA-cloning kit for sequencing, Invitrogen, ref. 45-0030). The plasmids "-" of - "mixi.imum.
colony-s-recombinants were purified and -1-eur- insert-sequenced using the universal primers M13 uni and rev.
The nucleotide sequence of the VK region of the murine antibody 5E5 is indicated under the sequence SEQ ID NO: 8 and the deduced peptide sequence is the sequence SEQ ID NO: 10. The VK gene belongs to the subgroup VK4 (VK4 / 5, Almagro JC et al Immunogenetics 1998, 47: 355-363). The sequences of CDR1, CDR2 and CDR3 of the VK region of the antibody murine 5ES, defined according to Kabat [Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", NIH
Publication 91-3242 (1991)] are indicated under following sequences: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4, respectively The nucleotide sequence of the VH region of 5E5 is the sequence SEQ ID NO: 9 and the peptide sequence deduced is the sequence SEQ ID NO: 11. The VH gene belongs to the subgroup V'.H1 (Honjo T. and Matsuda F.
in Immunoglobulin genes. Honjo T. and Alt FW
eds, Academic Press, London, 1996, pp145-171). The CDR1, CDR2 and CDR3 sequences of the VH region of murine antibody 5E5, defined according to Kabat [Kabat and al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest ", NIH Publication, 91-3242 (1991)] are indicated under the following sequences: SEQ ID NO
5, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively.
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Claims (28)
ID NO : 1) de la séquence peptidique du récepteur humain des LDL. 1. Monoclonal antibody directed against the receptor human LDL (Low Density Lipoprotein), binding to peptide corresponding to amino acids 280-307 (SEQ
ID NO: 1) of the peptide sequence of the receptor human LDL.
d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, et en ce qu' au moins une région CDR de chacune de ses chaînes lourdes possède une séquence peptidique ayant au moins 70% d'identité avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ
ID NO : 7. 2. Antibody according to claim 1, characterized in at least one CDR region (Complementarity Determining Region) of each of its light chains has a peptide sequence having at least 70%
identity with a sequence selected from sequences SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and in that at least one CDR region of each of its heavy chains has a peptide sequence having at least 70% identity with a chosen sequence among the sequences SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ
ID NO: 7.
d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID
NO : 8, et en ce que la région variable de chacune de ses chaînes lourdes est codée par une séquence d'acide nucléique possédant au moins 70% d'identité avec la séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 9. 4. Antibody according to any one of the claims preceding, characterized in that the variable region each of its light chains is coded by a nucleic acid sequence having at least 70%
identity with SEQ ID nucleic acid sequence NO: 8, and that the variable region of each of its heavy chains is encoded by an acid sequence nucleic acid possessing at least 70% identity with the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 9.
sous le numéro I-3488 à la CNCM. 13. Antibody according to any one of claims 1 to 11, characterized in that it is likely to be produced by the deposited H5E5 hybridoma under number I-3488 to the CNCM.
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