CA2433606A1

CA2433606A1 - Amphipathic peptides and their use for transferring substances of interest into cells

Info

Publication number: CA2433606A1
Application number: CA002433606A
Authority: CA
Inventors: Jamal Temsamani; Philippe Clair
Original assignee: Individual
Current assignee: Synt EM SA
Priority date: 2001-01-03
Filing date: 2002-01-03
Publication date: 2002-07-11
Also published as: IL156672A0; FR2818981A1; EP1347991A2; WO2002053583A2; WO2002053583A3

Abstract

The invention concerns a peptide capable of transferring a substance of interest bearing negative charges inside cells and/or inside cell nuclei, characterised in that said peptide corresponds to the following formula: (RLLR)¿p?(L)¿n?(R)¿n?, wherein: L represents leucine, R represents arginine, p is an integer ranging between 2 and 4, n is 1 or 2. The invention also concerns a composition comprising said peptide and a substance of interest, more particularly a nucleic acid molecule.

Description

PEPTIDES AMPHIPATHIQUES ET LEUR UTILISATION
POUR LE TRANSFERT DE SUBSTANCES D'INTÉR~T DANS LES
CELLULES.
La présente invention concerne des peptides amphipathiques et leur utilisation dans le domaine du transfert de substances d'intérêt, plus particulièrement de molécules d'acide nucléique, dans les cellules.
Le transfert de séquences d'acides nucléiques dans les cellules constitue l'objectif majeur des protocoles de thérapie génique à intérêt thérapeutique visant la guérison de maladies graves, comme les déficiences géniques létales, les cancers et les maladies infectieuses.
L'un des aspects essentiels du transfert de séquences d'acides nucléiques dans les cellules est la pénétration desdites séquences, jusqu'à leur cible finale.
Celle-ci peut-être le noyau pour de l'ADN plasmidique, et/ou le cytoplasme pour des oligonucléotides.
Les acides nucléiques sont des molécules hydrophiles de grande taille. A titre d'exemple, un plasmide de 6 kilobases représente 4.106daltons. Il ne s'agit donc pas de molécules propices au passage des membranes cellulaires, et le transfert des séquences d'acides nucléiques constitue un problème technique majeur à la mise en oeuvre des méthodes de thérapie génique . De nombreuses compositions utiles pour transfecter efficacement les cellules eucaryotes avec un matériel génétique sélectionné ont été décrites dans l'art antérieur.
Parmi ces compositions, la présente invention s'intéresse tout particulièrement à celles comprenant des vecteurs de transfection. Il existe essentiellement deux grands types de vecteurs . AMPHIPATHIC PEPTIDES AND THEIR USE
FOR THE TRANSFER OF SUBSTANCES OF INTEREST IN THE
CELLS.
The present invention relates to peptides amphipathic drugs and their use in the field of transfer of substances of interest, in particular from nucleic acid molecules in cells.
Transfer of nucleic acid sequences in cells is the major objective of gene therapy protocols of therapeutic interest aimed at healing serious illnesses such as lethal gene deficiencies, cancers and diseases infectious.
One of the essential aspects of the transfer of nucleic acid sequences in cells is the penetration of said sequences, up to their final target.
This may be the nucleus for plasmid DNA, and / or the cytoplasm for oligonucleotides.
Nucleic acids are molecules large hydrophilic. For example, a 6 kilobase plasmid represents 4.106daltons. He ... not these are therefore not molecules conducive to the passage of cell membranes, and sequence transfer of nucleic acids is a major technical problem the implementation of gene therapy methods. Of numerous compositions useful for transfection effectively eukaryotic cells with material selected genetics have been described in the art prior.
Among these compositions, the present invention is particularly interested in those comprising transfection vectors. There are basically two major types of vectors.

2 - les vecteurs de transfection naturels, tels que les virus (les rétrovirus, les adénovirus, les virus adéno-associés, les virus herpes-simplex) qui sont efficaces mais qui présentent des limites d'utilisation du f ait d'une non-spécificité tissulaire et de risques potentiels de toxicité qui nécessitent de mettre en place des infrastructures cliniques coûteuses.
- Les vecteurs synthétiques, du type liposomes, lipides cationiques, etc., capables de transférer les 0 acides nucléiques dans les cellules eucaryotes de manière plus ou moins toxique.
Ces vecteurs synthétiques doivent présenter essentiellement trois fonctions . (i) condenser l'ADN à
transfecter, (ii) promouvoir sa fixation cellulaire et 5 ( iii ) permettre le passage de l'ADN à travers la membrane cellulaire et éventuellement aussi son passage dans le compartiment nucléaire. Le but de la présente invention est d'offrir un nouveau système de vectorisation présentant ces trois fonctions de manière optimale et ne présentant 0 pas les inconvénients des vecteurs viraux.
Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse sur des séquences peptidiques capables de transférer in vitro ou in vivo des substances d'intérêt et tout particulièrement des molécules d'acide nucléique, lui .5 ont permis de mettre au point des peptides de transfection dérivant de peptides amphipathiques. La Demanderesse a en effet démontré que ces séquences peptidiques cationiques pouvaient former des interactions ioniques avec les groupements phosphates des acides nucléiques et que ces .0 complexes étaient capables de pénétrer dans les cellules.
On entend par peptide amphipathique, des peptides qui présente un pôle hydrophobe et un pôle hydrophile. De tels peptides constitués essentiellement d'acides aminés hydrophiles et hydrophobes ont notamment .5 décrits dans la demande de brevet français publiée sous le No. 2 715 847.

WO 02/053582 - natural transfection vectors, such that viruses (retroviruses, adenoviruses, viruses adeno-associated, herpes-simplex viruses) which are effective but which have limits on the use of f has non-specific tissue and risks toxicity potentials that require setting up costly clinical infrastructure.
- Synthetic vectors, of the liposome type, cationic lipids, etc., capable of transferring 0 nucleic acids in eukaryotic cells so more or less toxic.
These synthetic vectors must present basically three functions. (i) condense the DNA to transfect, (ii) promote its cell fixation and (Iii) allow DNA to pass through the membrane cell and possibly also its passage in the nuclear compartment. The object of the present invention is to offer a new vectoring system presenting these three functions optimally and not presenting 0 not the disadvantages of viral vectors.
The research work carried out by the Applicant on peptide sequences capable of transfer substances of interest in vitro or in vivo and especially nucleic acid molecules, .5 were used to develop transfection peptides derived from amphipathic peptides. The Applicant has in demonstrated effect that these cationic peptide sequences could form ionic interactions with nucleic acid phosphates and that these .0 complexes were able to penetrate cells.
By amphipathic peptide is meant peptides that have a hydrophobic pole and a pole hydrophilic. Such peptides consisting essentially hydrophilic and hydrophobic amino acids have in particular .5 described in the French patent application published under No. 2,715,847.

WO 02/05358

3 PCT/FR02/00016 L'invention a donc pour objet un peptide capable de transférer une substance d'intérêt portant des charges négatives à l'intérieur des cellules et/ou à
l'intérieur du noyau des cellules, caractérisé en ce que ledit peptide est un peptide amphipathique d'environ 10 à
30, de préférence de 15 à 25, acides aminés et répondant à
la formule suivante .
(L)m(R)n(L)n(R)n(L)m, dans laquelle L représente la leucine, .0 R représente l'arginine, m est un nombre entier compris entre 0 et 2, n est 1 ou 2.
Des peptides préférés selon l'invention répondent à la formule suivante .
L5 (RLLR)P(L)n(R)n, dans laquelle L représente la leucine, R représente l'arginine, p est un nombre entier compris entre 2 et 4, n est 1 ou 2.
?0 Un peptide tout préféré selon l'invention répond à la formule suivante représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEg ID NO.1 RLLRRLLRRLLRLLRR.
?5 L'invention a également pour objet des vecteurs capables de transporter in vitro ou in vivo une substance d'intérêt portant des charges négatives à l'intérieur des cellules et/ou à l'intérieur du noyau des cellules, ledit 30 vecteur étant constitué d'au moins un peptide décrit précédemment couplé à au moins un composé présentant une affinité pour les membranes cellulaires ou capable de condenser la substance d'intérêt portant des charges négatives.
35 L'invention envisage tout particulièrement à
titre de composé capable de condenser une substance 3 PCT / FR02 / 00016 The subject of the invention is therefore a peptide capable of transferring a substance of interest carrying negative charges inside the cells and / or at inside the cell nucleus, characterized in that said peptide is an amphipathic peptide of about 10 to 30, preferably from 15 to 25, amino acids and corresponding to the following formula.
(L) m (R) n (L) n (R) n (L) m, in which L represents leucine, .0 R represents arginine, m is an integer between 0 and 2, n is 1 or 2.
Preferred peptides according to the invention meet the following formula.
L5 (RLLR) P (L) n (R) n, in which L represents leucine, R represents arginine, p is an integer between 2 and 4, n is 1 or 2.
? 0 An all-preferred peptide according to the invention responds to the following formula represented in the list of sequences in the appendix under the number SEg ID NO.1 RLLRRLLRRLLRLLRR.
? 5 The invention also relates to vectors capable of transporting a substance in vitro or in vivo interest bearing negative charges within cells and / or inside the cell nucleus, said cell 30 vector consisting of at least one peptide described previously coupled to at least one compound having a affinity for cell membranes or capable of condense the load-bearing substance of interest negative.
The invention particularly contemplates title of compound capable of condensing a substance

4 d'intérêt portant des charges négatives comme un acide nucléique, un groupe polylysine comprenant environ au moins et jusqu'à 25 résidus de lysine.
L'invention envisage tout particulièrement à 4 of interest carrying negative charges like an acid nucleic acid, a polylysine group comprising approximately at least and up to 25 lysine residues.
The invention particularly contemplates

5 titre de composé présentant une affinité pour les membranes cellulaires, une chaîne d'acide gras, saturé ou insaturé, comme par exemple le palmitoyle.
Dans les vecteurs de l'invention, le groupe polylysine ou le reste d'acide gras peut être couplé à
l'extrémité N ou C-terminale du peptide, soit directement, soit par l'intermédiaire d'un bras de liaison.
Les peptides de l'invention et lesdits peptides couplés à un groupe polylysine peuvent être préparés par synthèse chimique ou par des technique d'expression génétique. Le couplage des composés du type acide gras sur un peptide de l'invention peut être réalisé par des réactions chimiques connues de l'homme du métier.
L'invention a encore pour objet des compositions comprenant un peptide ou un vecteur comme décrit précédemment et une substance d'intérêt portant des charges négatives. Avantageusement, le rapport .
Charges positives du peptide ou du vecteur Charges négatives de la substance d'intérêt dans ladite composition, est égal ou supérieur à 1.
Ainsi, plus l'acide nucléique est long, plus le nombre de charges positives apportées par le peptide doit être élevé pour obtenir un effet maximum.
Ces compositions sont utiles pour la préparation de compositions pharmaceutiques, cosmétiques ou de diagnostic selon la nature de la substance d'intérêt. En effet, les peptides de l'invention sont remarquables en ce qu'ils sont capables de s'associer par des liaisons de type ionique avec une grande variété de substance d'intérêt et de transporter celles-ci dans les cellules.
Ainsi, la substance d'intérêt portant des charges négatives peut être tout type d'entité chimique ou 5 biologique portant des charges négatives et dont la charge globale peut être positive, négative ou neutre. Il peut s'agir de substances thérapeutiques, cosmétiques, alimentaire ou de diagnostic. L'invention s'intéresse notamment à la vectorisation de protéines et tout particulièrement au transfert de molécules d'acide nucléique dans le cytoplasme et/ou le noyau des cellules.
On entend par molécule d'acide nucléique tant des molécules d'ADN que d'ARN. Il peut s'agir bien-entendu de gènes ou de parties de gène, éventuellement insérés dans un plasmide et placés sous le contrôle de séquences d'expression adaptées à l'hôte transfecté. Ces gènes ou parties de gène codent des protéines thérapeutiques. I1 peut aussi s'agir de courtes séquences d'acide nucléique, comme des oligonucléotides ou des ribozymes, utiles dans des stratégies de thérapie génique antisens.
Les peptides, vecteurs et compositions de l'invention sont utiles pour transporter in vivo ou i n vitro des substances d'intérêt et tout particulièrement des acides nucléiques dans des cellules, notamment eucaryotes.
In vitro, ils peuvent permettre de transférer des acides nucléiques ou des protéines dans des lignées cellulaires spécifiques, par exemple dans le but d'exprimer une protéine ou d'inhiber sa production. Ils peuvent être utilisés pour l'administration directe de l'acide nucléique ou de la protéine dans un organisme. Ils peuvent être également utilisés ex vivo pour le transfert de l'acide nucléique ou de la protéine dans une cellule spécifique pour lui conférer une nouvelle propriété avant de la réadministrer à un organisme. L'invention a donc également pour objet ces cellules comprenant des peptides, vecteurs et compositions décrits précédemment. I1 s'agit tout 5 title compound with affinity for membranes cellular, a fatty acid chain, saturated or unsaturated, like for example palmitoyl.
In the vectors of the invention, the group polylysine or the rest of the fatty acid can be coupled to the N or C-terminal end of the peptide, either directly, either through a link arm.
The peptides of the invention and said peptides coupled to a polylysine group can be prepared by chemical synthesis or by expression techniques genetic. The coupling of fatty acid type compounds on a peptide of the invention can be produced by chemical reactions known to those skilled in the art.
The invention also relates to compositions comprising a peptide or a vector such as described above and a substance of interest bearing negative charges. Advantageously, the report.
Positive peptide or vector charges Negative charges of the substance of interest in said composition, is equal or greater at 1.
Thus, the longer the nucleic acid, the more number of positive charges brought by the peptide must be high for maximum effect.
These compositions are useful for preparation of pharmaceutical, cosmetic or according to the nature of the substance of interest. In indeed, the peptides of the invention are remarkable in that that they are able to associate by type links ionic with a wide variety of substance of interest and to transport these in the cells.
So the substance of interest carrying negative charges can be any type of chemical entity or 5 biological carrying negative charges and whose charge overall can be positive, negative or neutral. he can be therapeutic, cosmetic substances, food or diagnostic. The invention is concerned including protein vectorization and everything particularly the transfer of acid molecules nucleic acid in the cytoplasm and / or the nucleus of cells.
By nucleic acid molecule is meant so much molecules of DNA than RNA. It can of course be genes or parts of genes, possibly inserted in a plasmid and placed under the control of sequences of expression adapted to the transfected host. These genes or parts of the gene encode therapeutic proteins. I1 can also be short nucleic acid sequences, such as oligonucleotides or ribozymes, useful in antisense gene therapy strategies.
Peptides, vectors and compositions of the invention are useful for transporting in vivo or in in vitro substances of interest and especially nucleic acids in cells, especially eukaryotes.
In vitro, they can transfer acids nucleic acids or proteins in cell lines specific, for example in order to express a protein or inhibit its production. They can be used for direct administration of nucleic acid or protein in an organism. They can be also used ex vivo for acid transfer nucleic acid or protein in a specific cell to give it a new property before the re-administer to an organism. The invention therefore also for object these cells comprising peptides, vectors and compositions described above. It is all

6 particulièrement de cellules transfectées au moyen d'un peptide ou d'un vecteur de l'invention. Ces cellules sont obtenues soient in vitro par incubation dans des conditions adéquates desdites cellules avec une composition selon l'invention, soit in vivo en administrant, par tout moyen approprié, lesdites compositions à un organisme ou partie d'organisme. Les compositions de l'invention peuvent être utilisées libres ou incorporées dans des particules ou nanoparticules comme des liposomes.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence à la figure 1 qui représente les migrations d'ADN plasmidique obtenues sur un gel de retardement en fonction de la quantité de peptide associée audit ADN.
I - CONDITIONS EXPÉRIMENTALES.
1) Peptides.
Les peptides préparés et utilisés pour la transfection dans le cadre de la présente invention sont donnés dans le tableau 1.
Tableau 1 PeptidePM Squence SEQ ID NO.

No.1 2508 RLLRRLLRRLLRLLRR SEQ ID NO.1 No.2 3323 KKKKKKKKKRLLRRLLRRLLRLLRR SEQ ID N0.2 No.3 2876 Palm-Orn(Palm)Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRRSEQ ID N0.1 En ce qui concerne la synthèse du peptide N°3, le peptide H-Orn-Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 est assemblé sur phase solide en utilisant un protocole Fmoc-tBu. L'ornitine introduite sous forme Fmoc-Orn(Fmoc)-OH est débloquée par traitement du peptidyl-résine à la pipéridine (20~ dans Diméthylformamide DMF). Après rinçage par DMF la résine est 6 particularly cells transfected with a peptide or vector of the invention. These cells are obtained either in vitro by incubation under conditions of said cells with a composition according to the invention, either in vivo by administering, by any means appropriate, said compositions to an organism or part agency. The compositions of the invention can be used free or incorporated into particles or nanoparticles like liposomes.
Other advantages and characteristics of the invention will appear from the following examples in which will be referred to in Figure 1 which represents the migrations of plasmid DNA obtained on a delay gel depending on the amount of peptide associated with said DNA.
I - EXPERIMENTAL CONDITIONS.
1) Peptides.
Peptides prepared and used for the transfection in the context of the present invention are given in table 1.
Table 1 PeptidePM Squence SEQ ID NO.

No.1 2508 RLLRRLLRRLLRLLRR SEQ ID NO.1 No.2 3323 KKKKKKKKKRLLRRLLRRLLRLLRR SEQ ID N0.2 No.3 2876 Palm-Orn (Palm) Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRRSEQ ID N0.1 Regarding the synthesis of peptide No. 3, the H-Orn-Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 peptide is assembled on solid phase using an Fmoc-tBu protocol. The ornithine introduced in Fmoc-Orn (Fmoc) -OH form is unlocked by piperidine peptidyl-resin treatment (20 ~ in Dimethylformamide DMF). After rinsing with DMF the resin is

7 incubée 2 fois 30 min dans DMF contenant 6 équivalents de DIEA (Diisopropylamine) et 6 équivalents de Chlorure d'acide palmitique. Le peptide est ensuite clivé/déprotégé
3 heures dans TFA/H20/Phénol/Triisopropylsilane 86/5/5/4.
Le peptide Palm-Orn(Palm)-Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 est ensuite purifié par une sêrie de précipitations successives, suivi d'une chromatographie d'exclusion, puis lyophilisé.
2) Oligonucléotide.
Un oligonucléotide couplé à la fluorescéine (Fluo) de PM 6154 et de séquence SEQ ID N0.3 dans la liste de séquences en annexe suivante a été utilisé .
GTG CCG GGG TCT TCG GGC - Fluo 3) Gel de retardement.
Un microgramme d'ADN plasmidique, contenant le gène reporter Luciferase, est incubé pendant 45 min avec des concentrations croissantes de peptide dans 100 ~.l de milieu Optimem afin de former un complexe peptide-DNA.
Vingt microlitres de chaque complexe sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'agarose 0,8~ préparé dans un tampon TBE. Après électrophorèse, l'ADN coloré au bromure d'éthidium est visualisé en UV.
4) Transfection de l'ADN plasmidique.
L'agent transfectant DMRIE ou des quantités croissantes de peptide sont rajoutés au plasmide (1 ~g) dans du DMSO. Après 45 min d' incubation, 300 cul de milieu Optimem sont rajoutés et le tout est étalé dans des plaques à 12 puits. Les cellules K562 sont rajoutées aux plaques à
une densité de 7.105 cellules/puit et le tout est incubé
pendant 4 heures à 37°C. Après incubation, 3 ml de milieu RPMI contenant 12, 5 ~ sérum de veau foetal sont rajoutés et l'incubation est poursuivie pendant 48 heures. Les cellules sont centrifugées, lavées et incubées avec un tampon de 7 incubated 2 times 30 min in DMF containing 6 equivalents of DIEA (Diisopropylamine) and 6 equivalents of Chloride palmitic acid. The peptide is then cleaved / deprotected 3 hours in TFA / H2O / Phenol / Triisopropylsilane 86/5/5/4.
The Palm-Orn (Palm) -Ahx-RLLRRLLRRLLRLLRR-NH2 peptide is then purified by a series of precipitations successive, followed by exclusion chromatography, then lyophilized.
2) Oligonucleotide.
An oligonucleotide coupled to fluorescein (Fluorescent) of PM 6154 and sequence SEQ ID N0.3 in the list of sequences in the following appendix was used.
GTG CCG GGG TCT TCG GGC - Fluo 3) Delay freeze.
A microgram of plasmid DNA, containing the Luciferase reporter gene, is incubated for 45 min with increasing concentrations of peptide in 100 ~ .l of Optimem medium to form a peptide-DNA complex.
Twenty microliters of each complex are then analyzed by 0.8 ~ agarose gel electrophoresis prepared in a TBE buffer. After electrophoresis, DNA stained with bromide of ethidium is viewed in UV.
4) Transfection of plasmid DNA.
DMRIE transfecting agent or quantities of peptide are added to the plasmid (1 ~ g) in DMSO. After 45 min of incubation, 300 ass of medium Optimem are added and the whole is spread out in plates 12 wells. K562 cells are added to the plates to a density of 7.105 cells / well and the whole is incubated for 4 hours at 37 ° C. After incubation, 3 ml of medium RPMI containing 12, 5 ~ fetal calf serum are added and incubation is continued for 48 hours. Cells are centrifuged, washed and incubated with a buffer of

8 lyse. Après centrifugation, le surnageant est testé pour l'activité luciférase en utilisant le test Promega Luciferase Assay System.
5) Transfection des oligonucléotides.
Des quantités croissantes de peptides sont rajoutées à l'oligonucléotide marqué au fluorochrome FITC
( 1 ~ug) dans du PBS. Après 30 minutes d' incubation sous la hotte, le mélange est rajouté aux cellules K562 dans 500 ~,1 .0 de milieu Optimem et le tout est incubé pendant 1 heure sous l'étuve à 37°C. Après l'incubation, les cellules sont centrifugées, lavées et ensuite resuspendues dans 0,5 ml de PBS froid. La transfection de l'oligonucléotide a été
ensuite analysée par cytométrie de flux (FACS).
.5 L'oligonucléotide étant couplé au FITC, l'acquisition se fait à l'aide du filtre FL1H (525 nm). Un histogramme de l'intensité de fluorescence (pour 1x104cellules) est obtenu et la moyenne de distribution était considérée comme représentative de la quantité d'oligonucléotide associé aux '.0 cellules.
II - Résultats.
1) Capacité des peptides à condenser l'ADN
?5 plasmidique.
Dans un premier temps, la capacité des peptides à condenser l'ADN plasmidique a été testée.
Des concentrations croissantes de peptides ont été incubées avec l'ADN et le complexe a été analysé par 30 électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%.
La Figure 1 représente les migrations obtenues sur un gel de retardement, en fonction de la quantité de peptide de transfection. L'incubation avec 0,32 nmoles (0,7 ug) de peptide entraîne un retardement de la migration de 35 l'ADN et l'addition de 0,8 nmoles (1,75 ~,g) stoppe complètement sa migration. 8 lysis. After centrifugation, the supernatant is tested for luciferase activity using the Promega test Luciferase Assay System.
5) Transfection of the oligonucleotides.
Increasing amounts of peptides are added to the FITC fluorochrome-labeled oligonucleotide (1 ~ ug) in PBS. After 30 minutes of incubation under the hood, the mixture is added to the K562 cells in 500 ~, 1 .0 Optimem medium and the whole is incubated for 1 hour under the oven at 37 ° C. After incubation, the cells are centrifuged, washed and then resuspended in 0.5 ml of PBS cold. The transfection of the oligonucleotide was then analyzed by flow cytometry (FACS).
.5 The oligonucleotide being coupled to the FITC, the acquisition made using the FL1H filter (525 nm). A histogram of the fluorescence intensity (for 1x104 cells) is obtained and the distribution mean was considered representative of the quantity of oligonucleotide associated with '. 0 cells.
II - Results.
1) Ability of peptides to condense DNA
? 5 plasmid.
First, the capacity of peptides to condense the plasmid DNA was tested.
Increasing concentrations of peptides have were incubated with DNA and the complex was analyzed by 0.8% agarose gel electrophoresis.
Figure 1 represents the migrations obtained on a delay gel, depending on the amount of transfection peptide. Incubation with 0.32 nmoles (0.7 ug) of peptide causes a delay in the migration of 35 DNA and the addition of 0.8 nmoles (1.75 ~, g) stops completely migration.

9 2) Capacité des peptides à transfecter l'ADN
plasmidique dans les cellules K562.
Dans un second temps, la capacité de ces peptides à transfecter l'ADN plasmidique dans les cellules K562 a été testée. Le tableau 2 ci-dessous rapporte l'efficacité de transfection mesurée en fonction du rapport de charges. L'efficacité de transfection du peptide 1 a été
également comparée avec celle du DMRIE qui est un agent 0 transfectant commercial.
Tableau 2 Produit Peptide ( ~,g ADN ( ~,g Ratio ) ) charges +l-6,65 1 7 1 Peptide 5,70 1 6 2 4,75 1 5 10 3,8 1 4 5 L'efficacité de transfection la plus importante 5 est observée lorsque l'on a un excès de l'ordre de 5 de charges neutralisantes peptidiques (charges positives) par rapport à l'ADN (charges négatives). Ces résultats confirment que le transfert du gène n'intervient qu'en présence d'un excès de charges positives. Le rapport de 0 charges 5 correspond à une concentration de 1 ~,g de plasmide pour 4,75 ~,g de peptide.
Afin d'améliorer le rendement de transfection, une chaîne de poly-lysine ou deux chaînes d'un acide gras (palmitoyl) a été couplé au peptide l'invention. Comme le 5 montre le tableau 3 ci-dessous, l'addition de ces chaînes au peptide 1 permet une meilleure condensation de l'ADN
plasmidique ainsi qu'une meilleure interaction avec la membrane cellulaire. Deux peptides ont été donc synthétisés . Peptide 2 contenant la poly-L-lysine et Peptide 3 contenant deux palmitoyls.
Tableau 3 Produit Peptide ( ~,g DNA ( ~,g Ratio ) ) charges +/-6,65 1 7 1 Peptide 5,70 1 6 2 4,75 1 5 10 3,8 1 4 5 3,92 1 7 38 Peptide 3,36 1 6 23 2,8 1 5 54 2,24 1 4 17 7,63 1 7 52 Peptide 6,54 1 6 17 5,45 1 5 24 4,36 1 4 6 5 I1 ressort de ces expériences que l'addition d'une queue de poly-Lysine ou de deux chaînes d'acide gras comme le palmitoyl au N-terminal du peptide améliore de façon significative le transfert du plasmide.
_0 3) Transfert d'oligonucélotides.
La capacité de ces peptides pour le transfert de petites séquences d'acides nucléiques tels que les oligonucléotides a ensuite été testée. Les peptides ont été
incubés avec l'oligonucléotide de séquence SEQ ID N0.3 et L5 le transfert à travers la cellule a été mesuré par cytométrie de flux. L'oligonucélotide était fluorescent, le pourcentage de cellules transfectées, c'est-à-dire celles qui contiennent de la fluorescence, a été mesuré.

Les résultats du tableau 4 ci-dessous montrent que l'oligonucléotide seul ne peut pas transfecter les cellules. Par contre, l'addition du peptide 1 résulte en une augmentation significative de cellules transfectées.
Cette augmentation est proportionnelle au rapport de charges. Ainsi pour un rapport de charge de 30, environ 24~
de cellules étaient transfectées par l'oligonucléotide.
Comme observé auparavant pour l'ADN plasmidique, l'addition d'une queue de poly-L-lysine au peptide (Peptide 2) ou de LO deux chaînes d'acide gras (Peptide 3) permet d'améliorer encore plus la transfection. Ainsi, à tous les rapports de charge utilisés, plus de 90 ~ de cellules ont été
transfectées.
Tableau 4 Peptide Peptide Oligo Ratio % de cellules ( ~,g ) ( ~,g Charge +/- transfectes ) aucun 1 - 0 Peptide 13 1 30 24 Peptide 20,8 1 30 96 17,3 1 25 97 Peptide 20,8 1 30 97 17,3 1 25 95 Dans le tableau 4 ci-dessus .
1 ~g oligo = 0,00018 mole Rapport 20 = 0,0036 ~Cmole de peptide Rapport 25 = 0,0045 mole de peptide Rapport 30 = 0,0054 umole de peptide SEQUENCE LISTING I
<110> SYNT-EM
<120> Peptides amphipathiques et leur utilisation pour le transfert de substances d'intérêt dans les cellules <130> 10261PCT
<140> PCT/FR02/XXXXXX
<141> 2002-01-03 <150> FR01/00043 <151> 2001-O1-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT
<213> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(l6) <223> Peptide N°1 <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(16) <223> Peptide N°3 = peptide avec deux chaînes d'acides gras (palmitoyl) ajoutées en N-terminal <400> 1 Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Arg <210> 2 <211> 25 <212> PRT
<213> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(25) <223> Peptide N°2 <400> 2 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Arg <210> 3 <211> 18 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Oligonucléotide couplé à la fluorescéine de PM 6154 <400> 3 gtgccggggt cttcgggc 18 9 2) Ability of peptides to transfect DNA
plasmid in K562 cells.
In a second step, the capacity of these peptides to transfect plasmid DNA into cells K562 has been tested. Table 2 below reports transfection efficiency measured as a function of the ratio of charges. The transfection efficiency of peptide 1 was also compared with that of DMRIE which is an agent 0 commercial transfectants.
Table 2 Peptide Product (~, g DNA (~, g Ratio )) charges + l-6.65 1 7 1 Peptide 5.70 1 6 2 4.75 1 5 10 3.8 1 4 5 The most important transfection efficiency 5 is observed when there is an excess of the order of 5 of neutralizing peptide charges (positive charges) by compared to DNA (negative charges). These results confirm that gene transfer only occurs presence of an excess of positive charges. The report of 0 charges 5 corresponds to a concentration of 1 ~, g of plasmid for 4.75 ~, g of peptide.
In order to improve the transfection yield, a poly-lysine chain or two chains of a fatty acid (palmitoyl) was coupled to the peptide of the invention. As the 5 shows table 3 below, the addition of these chains to peptide 1 allows better DNA condensation as well as better interaction with the cellular membrane. Two peptides were therefore synthesized. Peptide 2 containing poly-L-lysine and Peptide 3 containing two palmitoyls.
Table 3 Peptide Product (~, g DNA (~, g Ratio ))) charges +/-6.65 1 7 1 Peptide 5.70 1 6 2 4.75 1 5 10 3.8 1 4 5 3.92 1 7 38 Peptide 3.36 1 6 23 2.8 1 5 54 2.24 1 4 17 7.63 1 7 52 Peptide 6.54 1 6 17 5.45 1 5 24 4.36 1 4 6 5 It emerges from these experiences that the addition a poly-Lysine tail or two fatty acid chains as palmitoyl at the N-terminal of the peptide improves significantly transfer of the plasmid.
_0 3) Transfer of oligonucélotides.
The capacity of these peptides for transfer small nucleic acid sequences such as oligonucleotides was then tested. The peptides have been incubated with the oligonucleotide of sequence SEQ ID N0.3 and L5 the transfer through the cell was measured by flow cytometry. The oligonucelotide was fluorescent, the percentage of transfected cells, i.e. those which contain fluorescence, was measured.

The results in Table 4 below show that the oligonucleotide alone cannot transfect cells. On the other hand, the addition of peptide 1 results in a significant increase in transfected cells.
This increase is proportional to the ratio of loads. So for a charge ratio of 30, around 24 ~
of cells were transfected with the oligonucleotide.
As previously observed for plasmid DNA, the addition a tail of poly-L-lysine with the peptide (Peptide 2) or LO two fatty acid chains (Peptide 3) improves even more transfection. So, to all reports of charge used, more than 90 ~ cells were transfected.
Table 4 Peptide Peptide Oligo Ratio% of cells (~, g) (~, g Load +/- transfects ) none 1 - 0 Peptide 13 1 30 24 Peptide 20.8 1 30 96 17.3 1 25 97 Peptide 20.8 1 30 97 17.3 1 25 95 In table 4 above.
1 ~ g oligo = 0.00018 mole Ratio 20 = 0.0036 ~ Cmole of peptide Ratio 25 = 0.0045 mole of peptide Ratio 30 = 0.0054 umole of peptide SEQUENCE LISTING I
<110> SYNT-EM
<120> Amphipathic peptides and their use for the transfer of substances of interest in cells <130> 10261PCT
<140> PCT / FR02 / XXXXXX
<141> 2002-01-03 <150> FR01 / 00043 <151> 2001-O1-03 <160> 3 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 16 <212> PRT
<213> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1) .. (l6) <223> Peptide N ° 1 <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1) .. (16) <223> Peptide N ° 3 = peptide with two chains of fatty acids (palmitoyl) added in N-terminal <400> 1 Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Arg <210> 2 <211> 25 <212> PRT
<213> unidentified <220>
<221> PEPTIDE
<222> (1) .. (25) <223> Peptide N ° 2 <400> 2 Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Arg Arg <210> 3 <211> 18 <212> DNA
<213> unidentified <220>
<221> misc_feature <222> (1) .. (18) <223> Oligonucleotide coupled to fluorescein from PM 6154 <400> 3 gtgccggggt cttcgggc 18

Claims

1) Peptide capable of transferring a substance interest bearing negative charges inside the cells and/or inside the cell nucleus, characterized in that said peptide corresponds to the formula next :
(RLLR)p(L)n(R)n, in which:
L represents leucine, R represents arginine, p is an integer between 2 and 4, n is 1 or 2.

2) Peptide according to claim 1, characterized in that it corresponds to the following formula represented in the attached sequence listing under the number SEQ ID NO.1: RLLRRLLRRLLRLLRR.

3) Vector capable of transporting a substance interest bearing negative charges inside the cells and/or inside the cell nucleus, characterized in that it consists of at least one peptide according to any one of claims 1 or 2 coupled to at least one compound having an affinity for cell membranes or capable of condensing the substance interest bearing negative charges.

4) Vector according to claim 3, characterized in that the compound capable of condensing a substance of interest bearing negative charges is a polylysine group comprising about at least 5 and up to 25 lysine residues.

5) Vector according to claim 3, characterized in that the compound exhibiting an affinity for cell membranes is a fatty acid chain saturated or unsaturated.

6) Vector according to any of claims 3 to 5, characterized in that the group polylysine or fatty acid compounds are coupled to the N or C-terminal end of the peptide, either directly, or via a link arm.

7) Composition comprising a peptide according to any one of claims 1 or 2 or a vector according to any one of claims 3 to 6 and a substance of interest bearing negative charges.

8) Composition according to claim 7, characterized in that the ratio:

Positive charges of the peptide or vector Negative charges of the substance of interest in said composition, is equal to or greater than to 1.

9) Composition according to one of claims 7 or 8, characterized in that the substance of interest bearing negative charges is a protein.

10) Composition according to one of the claims 7 or 8, characterized in that the substance of interest carrying negative charges is an acid molecule nucleic.

11) Composition according to claim 10, characterized in that the nucleic acid molecule is of DNA.

12) Composition according to claim 10, characterized in that the nucleic acid molecule is of RNA.

13) Composition according to one of the claims or 11, characterized in that the acid molecule nucleus is a plasmid.

14) Composition according to one of the claims

10 to 12, characterized in that the acid molecule nucleic acid is an oligonucleotide.