FR2767323A1 - LINEAR PEPTIDES DERIVED FROM ANTIBIOTIC PEPTIDES, THEIR PREPARATION AND THEIR USE FOR VECTORIZING ACTIVE SUBSTANCES - Google Patents
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Abstract
Description
PEPTIDES LINÉAIRES DÉRIVÉS DE PEPTIDES
ANTIBIOTIQUES, LEUR PRÉPARATION ET LEUR UTILISATION POUR
VECTORISER DES SUBSTANCES ACTIVES.LINEAR PEPTIDES DERIVED FROM PEPTIDES
ANTIBIOTICS, THEIR PREPARATION AND THEIR USE FOR
VECTORIZING ACTIVE SUBSTANCES.
La présente invention concerne des peptides linéaires dérivés de peptides antibiotiques et leur utilisation pour vectoriser des substances actives. Plus particulièrement l'invention a pour objet de nouveaux composés formés d'un dérivé linéaire d'un peptide antibiotique lié à au moins une substance active, ainsi que la préparation de ces composés et les compositions les contenant. The present invention relates to linear peptides derived from antibiotic peptides and their use for vectorizing active substances. More particularly, the subject of the invention is new compounds formed from a linear derivative of an antibiotic peptide linked to at least one active substance, as well as the preparation of these compounds and the compositions containing them.
A côté de leur système immunitaire responsable de mécanismes spécifiques de défense contre les agents infectieux, les vertébrés possèdent de nombreux peptides à activité antimicrobienne (Nicolas,
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304). In addition to their immune system responsible for specific defense mechanisms against infectious agents, vertebrates have many peptides with antimicrobial activity (Nicolas,
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).
Ces peptides sont seulement présents chez les invertébrés à courte durée de vie et à taux de renouvellement élevé, chez lesquels un système immunitaire à mémoire, long à s'établir et à développer une réponse appropriée, serait inadapté.These peptides are only present in short-lived, high-turnover invertebrates, in which a long-established immune system with memory and in developing an appropriate response would be inadequate.
Les peptides antimicrobiens des vertébrés, quelque soit leur origine, vertébrés inférieurs ou supérieurs, tissus myéloïdes ou non myéloïdes, possèdent un certain nombre de propriétés communes
- Une forte basicité due à la présence de nombreuses arginines et lysines.Antimicrobial peptides of vertebrates, whatever their origin, lower or higher vertebrates, myeloid or non-myeloid tissues, have a number of common properties
- Strong basicity due to the presence of many arginines and lysines.
- La capacité de former des structures amphipatiques. On entend par structure amphipatique des structures dans lesquelles les résidus hydrophobes sont spatialement séparés des résidus hydrophiles. - The ability to form amphipathic structures. The term “amphipatic structure” is understood to mean structures in which the hydrophobic residues are spatially separated from the hydrophilic residues.
- Un très large spectre d'activité. Ils sont capables de détruire rapidement des bactéries (Gram+ et
Gram-), des champignons, quelques protozoaires, des virus à membrane et même certaines lignées de cellules cancéreuses. - A very broad spectrum of activity. They are able to quickly destroy bacteria (Gram + and
Gram-), fungi, a few protozoa, membrane viruses and even some cancer cell lines.
Selon leur structure, ils peuvent être classés en trois grandes familles
- Les peptides antibiotiques à hélices a amphipatiques : cécropines et maganines (Maloy, W. L. et al., 1995, BioPolymer 37, 105-122).According to their structure, they can be classified into three main families
- Antibiotic peptides with amphipatic helices: cecropins and maganins (Maloy, WL et al., 1995, BioPolymer 37, 105-122).
- Les peptides antibiotiques à feuillets ss réunis par des ponts disulfures : défensines (Lehrer, R. - Antibiotic peptides with ss sheets united by disulfide bridges: defensins (Lehrer, R.
I. et al., 1991, Cell 64:229-230 ; Lehrer, R. I. et al., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11:105-128), protégrines
(Kokryakov, V. N. et al., 1993, FEBS 337:231-236), tachyplésines (Nakamura, T. et al., 1988, J. Biol. Chem.I. et al., 1991, Cell 64: 229-230; Lehrer, RI et al., 1993, Ann. Rev. Immunol. 11: 105-128), proteines
(Kokryakov, VN et al., 1993, FEBS 337: 231-236), tachyplesins (Nakamura, T. et al., 1988, J. Biol. Chem.
263:16709-16713 ; Miyata, T et al., 1989, J. Biochem.263: 16709-16713; Miyata, T et al., 1989, J. Biochem.
106:663-668).106: 663-668).
- les peptides antibiotiques à chaînes déstructurées contenant de nombreux coudes liés à la présence de multiples prolines bacténécines et PR39
(Frank, R. W. et al., 1991, Eur. J. Biochem. 202, 849854).- antibiotic peptides with destructured chains containing numerous bends linked to the presence of multiple bactenecin prolines and PR39
(Frank, RW et al., 1991, Eur. J. Biochem. 202, 849854).
Malgré la diversité de leurs séquences, la plupart des peptides antibiotiques agissent par lyse directe de la membrane des cellules pathogènes. Leur nature basique facilite leur interaction avec les phospholipides chargés négativement, et leur caractère amphipatique leur permet ensuite de s'incorporer dans la membrane où ils s'agrègent pour former des pores par lesquels la cellule perd sa substance. I1 est généralement admis que leur sélectivité préférentielle pour les cellules procaryotes, est due à la composition particulière de leurs membranes qui contiennent davantage de phospholipides anioniques que celles d'eucaryotes. De plus, les membranes plasmiques de cellules de mammifères contiennent toutes du cholestérol, dont le rôle est d'en moduler la fluidité et qui pourrait gêner l'incorporation des peptides antibiotiques. Toutefois, la spécificité de ces derniers pour les microorganismes est faible si bien qu'ils présentent une forte cytotoxicité ce qui en limite l'utilisation. Despite the diversity of their sequences, most antibiotic peptides act by direct lysis of the membrane of pathogenic cells. Their basic nature facilitates their interaction with negatively charged phospholipids, and their amphipatic nature then allows them to be incorporated into the membrane where they aggregate to form pores through which the cell loses its substance. It is generally accepted that their preferential selectivity for prokaryotic cells is due to the particular composition of their membranes which contain more anionic phospholipids than those of eukaryotes. In addition, the plasma membranes of mammalian cells all contain cholesterol, whose role is to modulate its fluidity and which could hinder the incorporation of antibiotic peptides. However, the specificity of the latter for microorganisms is low so that they have a high cytotoxicity which limits their use.
La présence de peptides antibiotiques chez les vertébrés et plus particulièrement chez les mammifères soulève de nombreuses questions. Les immunologistes supposent que les composés à activité antimicrobienne non-spécifique que l'on rencontre au niveau des invertébrés constituent un moyen ancestral de défense qui a ensuite évolué pour conduire aux systèmes à mémoire beaucoup plus complexes. Quel est donc l'intérêt pour les mammifères, par exemple, d'avoir conservé certains peptides à activité antibiotique ? On admet que ces petites molécules toujours présentes dans les fluides biologiques, ou encore séquestrées dans certaines structures lymphocytaires, pourraient constituer une première ligne de défense en attendant que les anticorps spécifiques soient sécrétés (Nicolas,
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).The presence of antibiotic peptides in vertebrates and more particularly in mammals raises many questions. Immunologists assume that the compounds with non-specific antimicrobial activity found in invertebrates constitute an ancestral defense which has then evolved to lead to much more complex memory systems. So what is the advantage for mammals, for example, of having preserved certain peptides with antibiotic activity? We admit that these small molecules always present in biological fluids, or even sequestered in certain lymphocyte structures, could constitute a first line of defense while waiting for specific antibodies to be secreted (Nicolas,
P. et al., 1995, Annual Rev. Microbiol. 49, 277-304).
Ils pourraient également participer au sein des macrophages, à la destruction des membranes plasmiques des organismes pathogénes.They could also participate within macrophages, in the destruction of the plasma membranes of pathogenic organisms.
Quelque soit leur rôle exact, les peptides antibiotiques ont un intérêt considérable du fait de leur large spectre d'action et de la difficulté que les microorganismes ont à mettre en place des stratégies d'inactivation. De ce fait de très nombreuses recherches sont entreprises pour essayer de trouver de nouvelles molécules et d'obtenir des analogues plus performant que les peptides parents. I1 se peut que dans l'avenir, ces peptides antibiotiques soient appelés à remplacer les antibiotiques issus de bactéries ou de champignons. Whatever their exact role, antibiotic peptides are of considerable interest because of their broad spectrum of action and the difficulty that microorganisms have in implementing inactivation strategies. As a result, a great deal of research is undertaken to try to find new molecules and to obtain analogues which are more efficient than the parent peptides. In the future, these antibiotic peptides may be called upon to replace antibiotics derived from bacteria or fungi.
Ainsi les demandes de brevet internationales PCT publiées sous les numéros W095/03325, W096/37508 et
W097/02287 décrivent une nouvelle classe de peptides antibiotiques, désignés "protégrines", isolés de leucocytes de porcs ou encore préparés par synthèse chimique ou par génie génétique et présentant des activités antibactériennes, antivirales et antifongiques.Thus PCT international patent applications published under the numbers W095 / 03325, W096 / 37508 and
WO97 / 02287 describe a new class of antibiotic peptides, designated "protectins", isolated from pig leukocytes or else prepared by chemical synthesis or by genetic engineering and exhibiting antibacterial, antiviral and antifungal activities.
Actuellement, les peptides antibiotiques à feuillets ss réunis par des ponts disulfures (défensines, protégrines, tachyplésines) sont particulièrement étudiés étant donné leur puissante activité antimicrobienne (bactéries, certains virus, champignons et parasites). Dans cette famille, les protégrines et les tachyplésines sont certainement les molécules les plus prometteuses étant donné la simplicité de leur structure et la facilité relative de leur synthèse. Currently, ss-sheet antibiotic peptides joined by disulfide bridges (defensins, protectins, tachyplines) are particularly studied given their powerful antimicrobial activity (bacteria, certain viruses, fungi and parasites). In this family, protectins and tachyplines are certainly the most promising molecules given the simplicity of their structure and the relative ease of their synthesis.
On désigne sous le nom de protégrines un ensemble de cinq peptides désignés PG-1, PG-2, PG-3,
PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V.N. Kokryakov & col. FEBS lett. 327, 231-236)
PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV..-NH2
PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-4 : RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2
PG- 5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993,
Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41, 978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA
Found. Sym. 186, 160-174), désignées P1 et P2, dont les séquences sont données ci-dessous, sont des peptides homologues isolés de l'hémolymphe de deux crabes,
Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines T1, T2 et
T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines P1 et
P2.A group of five peptides designated PG-1, PG-2, PG-3 is designated under the name of protectins.
PG-4 and PG-5, the sequences of which are given below, closely related and isolated from pig leukocytes (VN Kokryakov & col. FEBS lett. 327, 231-236)
PG-1: RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-2: RGGRLCYCRRRFCICV ..- NH2
PG-3: RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2
PG-4: RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2
PG- 5: RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2
Tachyplesins (Tamura, H. et al., 1993,
Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41, 978-980), designated Tl, T2 and T3 and the polyphemusines (Muta, T., 1994, CIBA
Found. Sym. 186, 160-174), designated P1 and P2, the sequences of which are given below, are homologous peptides isolated from the hemolymph of two crabs,
Tachyplesus tridentatus for tachyplesins T1, T2 and
T3 and Limmulus polyphemus for polyphemusins P1 and
P2.
P1 : RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2
P2 : RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2
T1 : KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2
T2 : RWCFRVCYRGICYRKCR-NH2
T3 : KWCFRVCYRGICYKRCR-NH2
Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possédent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures paralléles. Ces trois familles de peptides présentent également des homologies avec certaines défensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993,
Febs Let. 327, 231-236). P1: RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2
P2: RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2
T1: KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2
T2: RWCFRVCYRGICYRKCR-NH2
T3: KWCFRVCYRGICYKRCR-NH2
Proteins, tachyplesins and polyphemusines contain a high proportion of basic residues (lysines and arginines) and have four cysteines which form two parallel disulfide bridges. These three families of peptides also exhibit homologies with certain defensins and in particular with human defensin NP-1 (Kokryakov, VN et al., 1993,
Febs Let. 327, 231-236).
Tachyplésines et protégrines possédent une structure tridimensionnelle voisine. I1 s'agit d'un feuillet ss antiparalléle stabilisé par les deux ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité antibactérienne des protégrines et des tachyplésines. Leur suppression, soit en protégeant les groupements SH par des acétamidométhyles, soit en remplaçant les cystéines par des alanines ou des glycines, conduit à des analogues pratiquement dénués d'activité in vivo (Lehrer, R. I. et al., 1996, Eur. J. Tachyplesins and protectins have a similar three-dimensional structure. It is an anti-parallel sheet stabilized by the two disulphide bridges. These bridges play an important role in the antibacterial activity of protectins and tachyplesins. Their removal, either by protecting the SH groups with acetamidomethyls, or by replacing the cysteines with alanines or glycines, leads to analogs practically devoid of activity in vivo (Lehrer, R. I. et al., 1996, Eur. J.
Biochem. 240:352-357).Biochem. 240: 352-357).
Comme indiqué précédemment, les protégrines et les tachyplésines ont une importante activité lytique sur les cellules procaryotes. Les travaux de recherche réalisés par la Demanderesse sur la cytotoxicité de ces peptides sur des cellules de mammifère en culture, ont permis de mettre en évidence, avant la mort des cellules, des quantités non-négligeables de protégrines et de tachyplésines dans le cytoplasme desdites cellules. Il a été envisagé que la présence des peptides dans le cytoplasme pouvait résulter d'un transport par le biais de pores, mais ces pores ne sont perméables qu'aux ions et aux petites molécules et leur diamètre est trop petit pour permettre le passage des peptides antibiotiques. I1 semblerait que les protégrines et tachyplésines, en plus de perforer la membrane plasmique, soient capables de la traverser. As indicated previously, the protectins and the tachyplesins have an important lytic activity on the prokaryotic cells. The research carried out by the Applicant on the cytotoxicity of these peptides on cultured mammalian cells has made it possible to demonstrate, before the death of the cells, non-negligible amounts of protectins and tachyplesins in the cytoplasm of said cells. . It has been envisaged that the presence of peptides in the cytoplasm could result from transport through pores, but these pores are only permeable to ions and small molecules and their diameter is too small to allow the passage of peptides. antibiotics. It would seem that the protectins and tachyplesins, in addition to perforating the plasma membrane, are capable of crossing it.
Il est connu que la cytotoxicité et l'activité antimicrobienne des protégrines et des tachyplésines sont dus à leur capacité de s'agréger à l'intérieur de la membrane pour former des canaux multimèriques (Mangoni, M. et al., 1996, Febs Let. 383, 93-98) . La Demanderesse a alors envisagé que cette agrégation soit reliée à la structure tertiaire de ces peptides antibiotiques qui comportent plusieurs résidus cystéines, et des dérivés linéaires des protégrines et des tachyplésines dans lesquels les cystéines sont remplacées par divers acides aminés naturels, ont été synthétisés. Ces peptides ont été couplés, par leur extrémité C-terminale, à une molécule fluorescente ou la biotine et la répartition de ces marqueurs à l'intérieur de la cellule a été observée par microscopie confocale. It is known that the cytotoxicity and the antimicrobial activity of protectins and tachyplesins are due to their capacity to aggregate inside the membrane to form multimeric channels (Mangoni, M. et al., 1996, Febs Let 383, 93-98). The Applicant then envisaged that this aggregation be linked to the tertiary structure of these antibiotic peptides which contain several cysteine residues, and linear derivatives of the protectins and tachyplines in which the cysteines are replaced by various natural amino acids, have been synthesized. These peptides were coupled, by their C-terminal end, to a fluorescent molecule or biotin and the distribution of these markers inside the cell was observed by confocal microscopy.
I1 a ainsi maintenant été trouvé que ces peptides sont non-toxiques et sans activité lytique mais sont par contre capables de traverser rapidement les membranes des cellules de mammifères par un mécanisme passif. It has thus now been found that these peptides are non-toxic and without lytic activity but are on the other hand capable of rapidly crossing the membranes of mammalian cells by a passive mechanism.
Ces dérivés linéaires des peptides antibiotiques constituent donc un nouveau système de vectorisation de substances actives qui est non toxique. These linear derivatives of antibiotic peptides therefore constitute a new vectorization system for active substances which is non-toxic.
Par système de vectorisation, on entend selon l'invention, un processus capable de transporter ladite substance active jusqu'à une cible, comme par exemple
- de faire traverser la membrane cellulaire à une substance active et de permettre la distribution de celle-ci dans le cytoplasme et/ou dans le compartiment nucléaire,
- d'amener une substance active au niveau d'un organe particulier, par exemple de faire franchir à cette substance active la barrière hémato-encéphalique,
- de forcer cette substance active à interagir spécifiquement avec un type cellulaire donné, comme par exemple les hématies.The term “vectorization system” is understood to mean, according to the invention, a process capable of transporting said active substance to a target, such as for example
- to make an active substance cross the cell membrane and to allow its distribution in the cytoplasm and / or in the nuclear compartment,
- to bring an active substance to a particular organ, for example to make this active substance cross the blood-brain barrier,
- to force this active substance to interact specifically with a given cell type, such as red blood cells, for example.
La présente invention a donc pour objet des peptides dérivés des peptides antibiotiques ou d'analogues de ceux-ci, caractérisés en ce qu'ils sont dépourvus de pont disulfure. The present invention therefore relates to peptides derived from antibiotic peptides or analogues thereof, characterized in that they lack the disulfide bridge.
L'absence de pont disulfure dans les peptides de l'invention peut être obtenue par tout moyen connu de l'homme du métier. Par exemple
- en supprimant ou en remplaçant par d'autres acides aminés les résidus de cystéine de la séquence du peptide antibiotique,
- en bloquant les groupes -SH des résidus cystéines de façon à ce qu'ils ne forment pas de pont di su fure,
dès lors bien entendu que le peptide obtenu présente les propriétés de vectorisation sans toxicité pour les cellules décrites précédemment
Ces modifications peuvent être réalisées lors de la préparation des peptides de l'invention, plus particulièrement par synthèse chimique ou par expression d'un gène codant pour ledit peptide, ou directement sur un peptide antibiotique par action d'agents chimiques permettant d'ouvrir et de bloquer les groupes -SH des résidus de cystéine.The absence of a disulfide bridge in the peptides of the invention can be obtained by any means known to those skilled in the art. for example
- by removing or replacing with other amino acids the cysteine residues of the antibiotic peptide sequence,
- by blocking the -SH groups of the cysteine residues so that they do not form a bridging,
therefore of course that the peptide obtained has the vectoring properties without toxicity to the cells described above
These modifications can be carried out during the preparation of the peptides of the invention, more particularly by chemical synthesis or by expression of a gene coding for said peptide, or directly on an antibiotic peptide by the action of chemical agents making it possible to open and to block the -SH groups of cysteine residues.
Les modifications ci-dessus concernent avantageusement tous les résidus de cystéines du peptide antibiotique, mais dès lors que la présence d'un unique résidu de cystèine ne permet pas la formation de pont disulfure, les peptides de l'invention peuvent contenir une seule cystéine. Les peptides antibiotiques naturels présentent généralement 4 ou 6 résidus de cystéine capables de former deux ou trois ponts disulfures, aussi dans les peptides de l'invention, l'une seulement de ces cystéines peut être maintenue et les trois ou cinq autres sont modifiées. The above modifications advantageously relate to all the cysteine residues of the antibiotic peptide, but as soon as the presence of a single cysteine residue does not allow the formation of a disulfide bridge, the peptides of the invention can contain a single cysteine. Natural antibiotic peptides generally have 4 or 6 cysteine residues capable of forming two or three disulfide bridges, also in the peptides of the invention, only one of these cysteines can be maintained and the other three or five are modified.
Les peptides d'antibiotiques dont dérivent les peptides de l'invention peuvent être des défensines, des protégrines, des tachyplésines ou leurs analogues, dont les propriétés antibiotiques leur sont conférées par leur structure tertiaire résultant de la présence de ponts disulfures. The antibiotic peptides from which the peptides of the invention are derived can be defensins, protectins, tachyplesins or their analogs, the antibiotic properties of which are imparted to them by their tertiary structure resulting from the presence of disulfide bridges.
Des peptides préférés selon l'invention répondent à l'une des formules suivantes
BXXBXXXXBBBXXXXXXB (I)
BBXXXBXXXBXXXXBBXB (I I)
qui peuvent être aussi représentées par la formule unique (III) suivante B(XB)X(XB)X(XB)XX(XB)B(XB)(XB)X(XB)(XB)XB
dans lesquelles
- les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidus d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et
- les groupes X, identiques ou différents, représentent un résidus d'acide aminé aliphatique ou aromatique.Preferred peptides according to the invention correspond to one of the following formulas
BXXBXXXXBBBXXXXXXB (I)
BBXXXBXXXBXXXXBBXB (II)
which can also be represented by the following unique formula (III) B (XB) X (XB) X (XB) XX (XB) B (XB) (XB) X (XB) (XB) XB
in which
the groups B, which are identical or different, represent an amino acid residue whose side chain carries a basic group, and
- Groups X, identical or different, represent an aliphatic or aromatic amino acid residue.
B et X peuvent être des acides aminés naturels ou non, y compris des acides aminés de configuration D. On peut citer comme exemple, les significations de B et X suivantes
- B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, 1' acide diaminopropionique, l'ornithine. B and X can be natural or non-natural amino acids, including amino acids of configuration D. As an example, the meanings of B and X may be cited
- B is chosen from arginine, lysine, diaminoacetic acid, diaminobutyric acid, 1 diaminopropionic acid, ornithine.
- X est choisi parmi la glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéineAcm, la penicillamine, la méthionine, la serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-l-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2aminotétraline carboxylique, la 4-bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la ss- cyclohexylalanine, la 3,4-dichlorophénylalanine, la 4 fluorophénylalanine, 1 'homoleucine, la B-homoleucine, l'homophénylalanine, la 4-méthylphénylalanine, la 1naphtylalanine, la 2-naphtylalanine, la 4nitrophénylalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3-pyridylalanine, la [2thiényl]alanine. - X is chosen from glycine, alanine, valine, norleucine, isoleucine, leucine, cysteine, cysteineAcm, penicillamine, methionine, serine, threonine, asparagine, glutamine, phenylalanine, histidine, tryptophan, tyrosine, proline, Abu, amino-1-cyclohexane carboxylic acid, Aib, 2 aminotetralin carboxylic, 4-bromophenylalanine, tert-Leucine, 4- chlorophenylalanine, ss-cyclohexylalanine, 3,4-dichlorophenylalanine, 4 fluorophenylalanine, 1 homoleucine, B-homoleucine, homophenylalanine, 4-methylphenylalanine, 1naphthylalanine, 2-nanylenyl, naphthylanine nitrotyrosine, norvaline, phenylglycine, 3-pyridylalanine, [2thienyl] alanine.
L'invention concerne aussi l'utilisation des peptides ci-dessus pour la vectorisation d'une ou plusieurs substances actives tant pour des applications thérapeutiques que de diagnostic. A titre de substance active, l'invention envisage notamment des proteines ou fragments de protéines, comme des polypeptides ou peptides, des anticorps ou partie d'anticorps, des acides nucléiques et oligonucléotides ou des ribozymes, ou encore, bien entenu des molécules chimiques actives pour le traitement ou la prévention de pathologies humaines ou animales, comme par exemple et de manière non limitative des antitumoraux, des antiviraux, des agents anti-inflammatoires, des agents empêchant la dégradation d'organes et/ou de tissus, etc... The invention also relates to the use of the above peptides for the vectorization of one or more active substances both for therapeutic and diagnostic applications. As active substance, the invention envisages in particular proteins or protein fragments, such as polypeptides or peptides, antibodies or part of antibodies, nucleic acids and oligonucleotides or ribozymes, or, of course, active chemical molecules for the treatment or prevention of human or animal pathologies, such as for example and without limitation antitumor, antiviral, anti-inflammatory agents, agents preventing the degradation of organs and / or tissues, etc ...
Dans le domaine du diagnostic, la substance active peut être un marqueur radioactif, un marqueur coloré, ou tout autre moyen ou substance capable de révéler un métabolisme ou une pathologie. In the diagnostic field, the active substance can be a radioactive marker, a colored marker, or any other means or substance capable of revealing a metabolism or a pathology.
L'invention a donc également pour objet des composés de formule (IV) suivante, ainsi que les compositions les contenant (u tff A )( Z (1V)
dans laquelle
- A représente un peptide linéaire dérivé d'un peptide antibiotique conforme à l'invention,
- Z représente une substance active, comme défini ci-dessus,
- Y représente un agent signal,
- n est 0 et ou plus, et avantageusement 0 ou 1,
- m est 1 ou plus, et de préférence jusqu'à 10 avantageusement jusqu'à 5,
Ainsi, les composés de formule (IV) cidessus sont formés à partir d'un peptide de l'invention couplé à une ou plusieurs substances actives, identiques ou différentes, représentées par le groupe (Z) dans la formule (IV), et éventuellement un ou plusieurs agents de signal, représentés par le groupe (Y) dans la formule
(IV), ayant un rôle d'adressage du composé de formule
(IV) vers un type cellulaire, un site ou compartiment de la cellule ou un tissus particulier. Plus particulièrement, l'agent signal (Y) est un oligopeptide ou une protéine, comme un peptide signal, un signal de localisation nucléaire, un fragment d'anticorps, ou une molécule chimique ligand ou anti-ligand d'un récepteur.The invention therefore also relates to compounds of formula (IV) below, as well as the compositions containing them (u tff A) (Z (1V)
in which
A represents a linear peptide derived from an antibiotic peptide in accordance with the invention,
- Z represents an active substance, as defined above,
- Y represents a signal agent,
- n is 0 or more, and advantageously 0 or 1,
- m is 1 or more, and preferably up to 10 advantageously up to 5,
Thus, the compounds of formula (IV) above are formed from a peptide of the invention coupled to one or more active substances, identical or different, represented by the group (Z) in formula (IV), and optionally one or more signal agents, represented by group (Y) in the formula
(IV), having a role of addressing the compound of formula
(IV) to a cell type, a site or compartment of the cell or a particular tissue. More particularly, the signal agent (Y) is an oligopeptide or a protein, such as a signal peptide, a nuclear localization signal, an antibody fragment, or a chemical molecule ligand or anti-ligand of a receptor.
Dans une forme toute particulière de réalisation des composés de formule (IV), le groupe (Y) est fixé au groupe (Z). In a very particular embodiment of the compounds of formula (IV), the group (Y) is attached to the group (Z).
Le couplage, symbolisé par les traits horizontaux dans la formule (IV), peut être réalisé par tout moyen de liaison acceptable compte tenu de la nature chimique, de l'encombrement et du nombre de groupes (Z) et (Y) dans les composés de formule (IV), comme des liaisons covalentes, hydrophobes ou ioniques, clivables ou non-clivables dans les milieux physiologiques. Le couplage peut être effectué en n'importe quel site du peptide (A), dans lequel des groupements fonctionels tels que -OH, -SH, -COOH, -NH2
sont naturellement présents ou ont été introduits.The coupling, symbolized by the horizontal lines in the formula (IV), can be carried out by any acceptable means of connection taking into account the chemical nature, the bulk and the number of groups (Z) and (Y) in the compounds of formula (IV), such as covalent, hydrophobic or ionic bonds, cleavable or non-cleavable in physiological media. The coupling can be carried out at any site of the peptide (A), in which functional groups such as -OH, -SH, -COOH, -NH2
are naturally present or have been introduced.
L'invention envisage aussi la fixation de plusieurs groupes (Z) sur un même site du peptide (A), soit directement, si ce site comporte plusieurs groupements fonctionnels, comme dans le cas d'une lysine
C- ou N-terminale, soit indirectement via un groupe
intermédiaire portant plusieurs groupements réactionnels permettant d'y fixer plusieurs groupes (Z).The invention also envisages the attachment of several groups (Z) to the same site of the peptide (A), either directly, if this site comprises several functional groups, as in the case of a lysine
C- or N-terminal, either indirectly via a group
intermediate carrying several reaction groups making it possible to fix therein several groups (Z).
Les positions de couplage préférées pour la substance active sont au niveau de l'extrémité C
terminale ou bien au niveau des groupements amines primaires portés par les chaînes latérales des lysines du peptide (A). Dans le cas où l'on utilise l'extrémité
C-terminale du peptide (A) pour accrocher la substance active (Z), l'extrémité N-terminale est disponible pour le couplage éventuel à un agent signal (Y) permettant l'adressage du composé de l'invention soit vers le noyau, soit encore vers un type tissulaire particulier.The preferred coupling positions for the active substance are at the C end
terminal or else at the level of the primary amine groups carried by the side chains of the lysines of peptide (A). In the case where the end is used
C-terminal of the peptide (A) to hook the active substance (Z), the N-terminal end is available for possible coupling to a signal agent (Y) allowing the addressing of the compound of the invention either to the nucleus , or again towards a particular tissue type.
En effet, par exemple dans le cas du couplage à l'extrémité C-terminale d'un peptide linéaire de l'invention, d'une substance active constituée par un marqueur fluorescent, comme la biotine, ou une molécule médicamenteuse telle que la doxorubicine, le complexe covalent peptide-drogue après administration se répartit dans le cytoplasme de la cellule cible. I1 est possible d'amener ce complexe dans le compartiment nucléaire en couplant à l'extrémité N-terminale du peptide une courte séquence basique, par exemple d'environ 7 acides aminés, correspondant à un signal de localisation nucléaire. Dans ces conditions, la biotine ou la doxorubicine se retrouvent dans le noyau de la cellule. Indeed, for example in the case of the coupling at the C-terminal end of a linear peptide of the invention, of an active substance constituted by a fluorescent marker, such as biotin, or a drug molecule such as doxorubicin , the covalent peptide-drug complex after administration is distributed in the cytoplasm of the target cell. It is possible to bring this complex into the nuclear compartment by coupling to the N-terminal end of the peptide a short basic sequence, for example of about 7 amino acids, corresponding to a nuclear localization signal. Under these conditions, biotin or doxorubicin is found in the nucleus of the cell.
De la même manière, il est possible de vectoriser une drogue vers un type cellulaire donné, en ajoutant à l'extrémité N-terminale du peptide linéaire de l'invention couplé à son extrémité C-terminale à un médicament, une séquence peptidique capable de reconnaitre spécifiquement un déterminant présent à la surface de type cellulaire. Ainsi, le pentadecapeptide aM2 (Swolapenko, G. B. et al., 1995, The Lancet 346, 1662-65) synthétique, fragment d'un anticorps monoclonal, dirigé contre un antigéne exprimé par les cellules de cancer du sein (Tumour Associated Antigen
Polymorphic Epithelial Mucin), conserve une bonne affinité pour ces cellules. I1 est donc possible en associant aM2 à un ensemble peptide linéaire-médicament, d'amener cet ensemble préférentiellement vers les cellules qui expriment la caractéristique antigénique liée au cancer mammaire.Likewise, it is possible to vectorize a drug towards a given cell type, by adding to the N-terminal end of the linear peptide of the invention coupled to its C-terminal end to a drug, a peptide sequence capable of specifically recognize a determinant present on the cell-like surface. Thus, the pentadecapeptide aM2 (Swolapenko, GB et al., 1995, The Lancet 346, 1662-65) synthetic, fragment of a monoclonal antibody, directed against an antigen expressed by breast cancer cells (Tumor Associated Antigen
Polymorphic Epithelial Mucin), maintains a good affinity for these cells. It is therefore possible, by combining aM2 with a linear peptide-drug set, to bring this set preferentially towards the cells which express the antigenic characteristic linked to breast cancer.
Les composés de formule (IV) peuvent être préparés par synthèse chimique ou en utilisant des techniques de biologie moléculaire. The compounds of formula (IV) can be prepared by chemical synthesis or by using molecular biology techniques.
On peut utiliser pour les synthèses chimiques des appareils commerciaux permettant d'incorporer des acides aminés non-naturels, tels que les énantiomères D et des résidus ayant des chaînes latérales ayant des hydrophobicités et des encombrements différents de ceux de leurs homologues naturels. Au cours de la synthèse, il est évidemment possible de réaliser un large éventail de modifications, par exemple introduire sur le N-terminal un lipide (prenyl ou myristyl) de façon à pouvoir ancrer le peptide de
l'invention et donc le composé de formule (IV) à une membrane lipidique telle que celle d'un liposome constitué de lipides chargés positivement. I1 est également possible de remplacer une ou plusieurs
liaisons peptidiques (-CO-NH-) par des structures équivalentes comme -CO-N(CH3)-, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, ou bien d'intercaller des groupes comme -CH2-, -NH-, -O-.It is possible to use for chemical syntheses commercial devices making it possible to incorporate non-natural amino acids, such as the D enantiomers and residues having side chains having hydrophobicities and bulkings different from those of their natural counterparts. During the synthesis, it is obviously possible to make a wide range of modifications, for example introducing a lipid (prenyl or myristyl) onto the N-terminal so as to be able to anchor the peptide of
the invention and therefore the compound of formula (IV) to a lipid membrane such as that of a liposome consisting of positively charged lipids. It is also possible to replace one or more
peptide bonds (-CO-NH-) by equivalent structures such as -CO-N (CH3) -, -CH2-CH2-, -CO-CH2-, or to intercalate groups such as -CH2-, -NH- , -O-.
On peut également obtenir les composés de formule (IV) ou partie de ceux-ci de nature protéique à partir d'une séquence d'acide nucléique codant pour celui-ci. La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour un peptide linéaire dérivé de peptide antibiotique. Plus particulièrement l'invention concerne une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour un composé de formule (IV) ou une partie de celui de nature protéique. Ces séquences d'acides nucléiques peuvent être des ADN ou ARN et être associées à des séquences de contrôle et/ou être insérées dans des vecteurs. Le 'vecteur utilisé est choisi en fonction de l'hôte dans lequel il sera transféré; il peut s'agir de tout vecteur comme un plasmide. Ces acides nucléiques et vecteurs sont utiles pour produire les peptides linéaires et les composés de formule (IV) ou partie de ceux-ci de nature protéique dans un hôte cellulaire. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des peptides linéaires ou des composés de formule (IV) peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier. It is also possible to obtain the compounds of formula (IV) or part of these of a protein nature from a nucleic acid sequence coding for it. The present invention also relates to a nucleic acid molecule comprising or consisting of a nucleic sequence coding for a linear peptide derived from antibiotic peptide. More particularly, the invention relates to a nucleic acid molecule comprising at least one sequence coding for a compound of formula (IV) or part of that of a protein nature. These nucleic acid sequences can be DNA or RNA and be associated with control sequences and / or be inserted into vectors. The vector used is chosen according to the host to which it will be transferred; it can be any vector such as a plasmid. These nucleic acids and vectors are useful for producing linear peptides and the compounds of formula (IV) or part of them of protein nature in a cellular host. The preparation of these vectors as well as the production or the expression in a host of the linear peptides or of the compounds of formula (IV) can be carried out by the techniques of molecular biology and genetic engineering well known to those skilled in the art.
A titre d'exemple, un tel procédé de production d'un peptide selon l'invention consiste
- à transférer une molécule d'acide nucléique ou un vecteur contenant ladite molécule dans un hôte cellulaire,
- à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant la production du peptide,
- à isoler, par tous moyens appropriés les peptides de l'invention.By way of example, such a process for producing a peptide according to the invention consists
- transferring a nucleic acid molecule or a vector containing said molecule to a cell host,
- cultivating said cell host under conditions allowing the production of the peptide,
- to isolate, by any appropriate means, the peptides of the invention.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans ce type de procédé peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou d'insectes. L'invention concerne donc aussi les cellules transformées exprimant les peptides linéaires ou les composés de formule (IV) ou partie de ceux-ci de nature protéique. The cell host used in this type of process can be chosen from prokaryotes or eukaryotes and in particular from bacteria, yeasts, mammalian, plant or insect cells. The invention therefore also relates to the transformed cells expressing the linear peptides or the compounds of formula (IV) or part of these of a protein nature.
L'invention se rapporte aussi
- aux compositions pharmaceutiques comprenant comme principe actif au moins un composé de formule (IV) éventuellement associé à un véhicule ou support acceptable.The invention also relates
- pharmaceutical compositions comprising as active ingredient at least one compound of formula (IV) optionally combined with an acceptable vehicle or support.
- aux agents de diagnostic constitués d'au moins un composé de formule (IV). - diagnostic agents consisting of at least one compound of formula (IV).
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans la description qui suit se rapportant à la préparation de composés de formule (IV) ainsi qu aux travaux de recherche ayant mené à la mise en évidence des propriétés de vectorisation des peptides
linéaires de l'invention dérivés de peptides
antibiotiques.Other characteristics and advantages of the invention will appear in the following description relating to the preparation of compounds of formula (IV) as well as to research work which has led to the demonstration of vectorization properties of peptides
linear of the invention derived from peptides
antibiotics.
Exemnle 1 Fixation de la biotine et de la doxorubicine sur un analogue linéaire de la srotégrine. Exemnle 1 Fixation of biotin and doxorubicin on a linear analogue of srotégrine.
1) Préparation des peptides linéaires. 1) Preparation of linear peptides.
Les trois peptides de séquences ci-dessous ont été synthétisés RGGRLXYXRRRFXVXVGR - NH2
RRWXFRVXYRGFXYRKXR-NH2 KWXFRVXYRG TXYRRXR- NH2
dans lesquels X représente les résidus
serine, thréonine ou alanine.The three peptides of sequences below have been synthesized RGGRLXYXRRRFXVXVGR - NH2
RRWXFRVXYRGFXYRKXR-NH2 KWXFRVXYRG TXYRRXR- NH2
in which X represents the residues
serine, threonine or alanine.
Ces peptides dérivent repectivement des
séquences de le protégrine PG-1 de formule
RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2,
de la tachyplésine 1 de formule KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2,
de la polyphémusine de formule KWXFRVXYRGIXYRRXR-NH2. These peptides are respectively derived from
protectin PG-1 sequences of formula
RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2,
tachyplesin 1 of formula KWCFRVCYRGICYRRCR-NH2,
of the polyphemusine of formula KWXFRVXYRGIXYRRXR-NH2.
Ces trois peptides peuvent être préparés indifféremment soit à partir d'une chimie BOC, soit à partir d'une chimie FMOC, par des procédés classiques de synthèse en phase solide ou homogène. These three peptides can be prepared either from a BOC chemistry or from a FMOC chemistry, by conventional methods of synthesis in solid or homogeneous phase.
2) Fixation de la biotine sur les sentides linéaires. 2) Fixation of biotin on linear sentides.
Le peptide est synthétisé en phase solide et après incorporation de l'arginine N-terminale on ajoute l'acide 5-aminopentanoïque. Le Fmoc ou le Boc N
terminal est enlevé et on fait réagir sur le peptide toujours accroché à la résine le N-hydroxy succimido ester de la biotine dans le diméthylformamide. Après 15 heures de réaction à température ambiante, le peptide biotinilé est coupé du support par action de l'acide trifluoroacétique ou de l'acide fluorohydrique selon des protocoles bien établis dans la chimie des peptides. Le peptide est ensuite purifié par chromatographie liquide à haute pression.The peptide is synthesized in the solid phase and after incorporation of the N-terminal arginine, 5-aminopentanoic acid is added. Fmoc or Boc N
terminal is removed and the N-hydroxy succimido ester of biotin in dimethylformamide is reacted on the peptide still attached to the resin. After 15 hours of reaction at room temperature, the biotinilated peptide is cut from the support by the action of trifluoroacetic acid or hydrofluoric acid according to protocols well established in peptide chemistry. The peptide is then purified by high pressure liquid chromatography.
3) Fixation de la doxorubicine sur un peptide linéaire
Pour fixer la doxorubicine, on synthétise en phase solide le peptide de formule RGGRLXYXRRRFXVXVGR -NH2
Après clivage du support de purification, le peptide est traité par l'anhydre glutarique en présence de triéthylamine. Le peptide est alors purifié et le groupement -COOH porté par le glutaryl en N-terminal est activé par le mélange diisopropylcarbodiimide et 1hydroxybenzotriazole. Après deux heures de réaction à température ambiante, de la doxorubicine est ajoutée et le mélange est agité pendant 12 heures à OOC. L'ensemble peptide-doxorubicine est alors purifié par chromatographie liquide à haute pression.3) Fixation of doxorubicin on a linear peptide
To fix doxorubicin, the peptide of formula RGGRLXYXRRRFXVXVGR -NH2 is synthesized in solid phase.
After cleavage of the purification support, the peptide is treated with glutaric anhydride in the presence of triethylamine. The peptide is then purified and the -COOH group carried by the glutaryl at the N-terminal is activated by the mixture of diisopropylcarbodiimide and 1hydroxybenzotriazole. After two hours of reaction at room temperature, doxorubicin is added and the mixture is stirred for 12 hours at OOC. The peptide-doxorubicin assembly is then purified by high pressure liquid chromatography.
Exemple 2 : Capacité des peptides linéaires dérivés de peptides antibioticues à sasser les membranes de cellules. Example 2: Ability of linear peptides derived from antibiotic peptides to shatter cell membranes.
1) Modèles cellulaires. 1) Cellular models.
La capacité des peptides à passer les membranes a été testée sur divers types cellulaires (MCF7, MCF7R, HL60, HL6OR, HeLa). The ability of peptides to pass membranes has been tested on various cell types (MCF7, MCF7R, HL60, HL6OR, HeLa).
Les cellules sont cultivées sur RPMI 1640 (Gibco) auquel on ajoute 10% (v/v) de serum veau foetal, 2mM glutamine and 2mM penicilline/streptomycine, a 370C. The cells are cultured on RPMI 1640 (Gibco) to which 10% (v / v) of fetal calf serum, 2mM glutamine and 2mM penicillin / streptomycin are added at 370C.
30 000 cellules sont ensemencées dans des chambres Lab
Tek et cultivées pendant 1 jour. 30,000 cells are seeded in Lab chambers
Tek and grown for 1 day.
2) Traitement par les DeDtides linéairesbiotine préparés conformément à l'exemple 1 (2). 2) Treatment with linear DeDtidesbiotin prepared in accordance with Example 1 (2).
Les cellules sont incubées dans de lOpti- Mem (Gibco) pendant une heure avant d'être traitées pendant des temps variables avec les peptides marqués à la biotine. The cells are incubated in Opti-Mem (Gibco) for one hour before being treated for variable times with the peptides labeled with biotin.
Ces derniers sont obtenus conformément à l'exemple 1(2) en traitant 1 équivalent de peptide linéaire par 2 équivalents d'ester de Nhydroxysuccinimide de la biotine, puis purifié par chromatographie liquide à haute pression. The latter are obtained in accordance with Example 1 (2) by treating 1 equivalent of linear peptide with 2 equivalents of Nhydroxysuccinimide ester of biotin, then purified by high pressure liquid chromatography.
Les cellules sont ensuite fixées avec une solution à 3.78 de paraformaldéhyde pendant 5 minutes à 250C, puis rincées trois fois avec du PBS. Elles sont ensuite perméabilisées par du Triton 0.1% (1 min, température ambiante). Après trois rinçages au PBS, les cellules sont incubées 10 min avec 200 Fl d'anticorps
TexRed dilué au 300éme et rincées trois fois au PBS. Les lames sont enfin montées avec une solution Mowiol-Dabco et observées au photomicroscope Axiophot.The cells are then fixed with a solution at 3.78 of paraformaldehyde for 5 minutes at 250C, then rinsed three times with PBS. They are then permeabilized with 0.1% Triton (1 min, room temperature). After three rinses with PBS, the cells are incubated for 10 min with 200 μl of antibody
TexRed diluted to 300th and rinsed three times with PBS. The slides are finally mounted with a Mowiol-Dabco solution and observed with the Axiophot photomicroscope.
3) Traitement car les nettides linéairesdoxorubicine préparés conformément à exemple 1 (3)
Les cellules sont incubées pendant 15 minutes, puis rincées avec du PBS et ensuite la doxorubicine présente dans la cellule est dosée par chromatographie.3) Treatment because the linear nettoroxoxubin prepared in accordance with Example 1 (3)
The cells are incubated for 15 minutes, then rinsed with PBS and then the doxorubicin present in the cell is determined by chromatography.
4) Résultats.
a) Parmi les peptides étudiés, ceux qui passent le plus facilement les membranes sont ceux répondant aux formules suivantes RXXRXUXCTRRRXUXUXXR-NH2 ( V )
RRXUXRXDXRXXUXRRUR-NH2 (VI)
dans lesquelles
- U représente la sérine ou la thréonine,
- R représente l'arginine, et
- les groupes X identiques ou différents
représentent un acide aminés naturel ou non (y compris
acides aminés de configuration D) aliphatiques ou
aromatiques, comme la glycine, l'alanine, la valine, la
norleucine, l'isoleucine, la leucine, la cystéine, la cystéine , la penicillamine, la méthionine, la serine,
la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la
phénylalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine,
la proline, 1 'au, l'acide amino-l-cyclohexane
carboxylique, 1 'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique,
la 4-bromophénylalanine, tert-Leucine, la 4
chlorophénylalanine, la ss-cyclohexylalanine, la 3,4
dichlorophénylalanine, la 4-fluorophénylalanine,
l'homoleucine, la ss-homoleucine, l'homophénylalanine, la
4-méthylphénylalanine, la l-naphtylalanine, la 2
naphtylalanine, la 4) Results.
a) Among the peptides studied, those which pass the membranes most easily are those corresponding to the following formulas RXXRXUXCTRRRXUXUXXR-NH2 (V)
RRXUXRXDXRXXUXRRUR-NH2 (VI)
in which
- U represents serine or threonine,
- R represents arginine, and
- identical or different groups X
represent a natural or unnatural amino acid (including
amino acids of configuration D) aliphatic or
aromatic, such as glycine, alanine, valine,
norleucine, isoleucine, leucine, cysteine, cysteine, penicillamine, methionine, serine,
threonine, asparagine, glutamine,
phenylalanine, histidine, tryptophan, tyrosine,
proline, 1 'au, amino-1-cyclohexane acid
carboxylic, 1 Aib, 2-aminotetralin carboxylic,
4-bromophenylalanine, tert-Leucine, 4
chlorophenylalanine, ss-cyclohexylalanine, 3,4
dichlorophenylalanine, 4-fluorophenylalanine,
homoleucine, ss-homoleucine, homophenylalanine,
4-methylphenylalanine, l-naphthylalanine, 2
naphthylalanine, the
- Traitement de la cellule pendant 30 minutes avec un complexe biotine-peptide linéaire de
l'invention.- Treatment of the cell for 30 minutes with a linear biotin-peptide complex of
the invention.
On observe dans ces clichés que la biotine
seule ne rentre pas dans la cellule et s'accumule
faiblement autour de celle-ci. A l'inverse, avec le
complexe de l'invention, on constate que la biotine est
entraînée rapidement par le peptide linéaire de
l'invention à l'intérieur de la cellule où elle est présente dans le cytoplasme et dans le noyau de la cellule.We observe in these pictures that biotin
alone does not enter the cell and accumulates
weakly around it. Conversely, with the
complex of the invention, it can be seen that biotin is
quickly driven by the linear peptide of
the invention inside the cell where it is present in the cytoplasm and in the nucleus of the cell.
Dans les séquences peptidiques rapportées
ci-dessus, les acides aminés sont représentés par leur
code à une lettre, mais ils peuvent être aussi
représentés par leur code à trois lettres selon la nomenclature ci-dessous.In reported peptide sequences
above, the amino acids are represented by their
one-letter code but they can also be
represented by their three-letter code according to the nomenclature below.
A Ala alanine
C Cys cystéine
D Asp acide aspartique
E Glu acide glutamique
F Phe phénylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I Ile isoleucine
K Lys lysine
L Leu leucine
M Met méthionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine
R Arg arginine
S Ser sérine
T Thr thréonine
V Val valine w W Trp tryptophane
Y Tyr tyrosine To Ala alanine
C Cysteine
D Asp aspartic acid
E Glu glutamic acid
F Phe phenylalanine
G Gly glycine
H His histidine
I isoleucine island
K lysine lysine
L Leu leucine
M Met methionine
N Asn asparagine
P Pro proline
Q Gln glutamine
R Arg arginine
S Ser serine
T Threonine Thr
V Val valine w W Trp tryptophan
Y Tyr tyrosine
Claims (13)
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