CA2416203C - Sequences d'adn codant pour un transporteur de polyols et leur utilisation, notamment pour la preparation de plantes transgeniques - Google Patents

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une châine principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le myo-inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques.

Description

SEQUENCES D'ADN CODANT POUR UN TRANSPORTEUR DE POLYOLS
ET LEUR UTILISATION, NOTAMMENT POUR LA PREPARATION DE
PLANTES TRANSGENIQUES

L'invention concerne des séquences d'ADN codant pour un transporteur de polyols et leur utilisation, notamment pour la préparation de plantes transgéniques.
Les plantes sont capables de synthétiser, par l'intermédiaire de la photosynthèse, des composés primaires comme les glucides en utilisant l'énergie lumineuse.
Seuls certains organes de la plante, principalement les feuilles adultes, sont aptes à fabriquer et à exporter les glucides vers les organes de réserve, comme les tubercules, les graines et les fruits, utilisés dans l'alimentation humaine et animale.

Chez la plupart des plantes, le principal glucide transporté est le saccharose, mais chez de très nombreux végétaux, d'autres composés sont également transportés comme les polyols dont le mannitol est un exemple.

Les polyols sont, comme le saccharose, des produits primaires de la photosynthèse. On a d'ailleurs estimé qu'environ 30% de la production globale de carbone primaire était utilisé pour la synthèse des polyols.
Les polyols, cycliques ou non, sont très répandus chez les plantes ; ce sont des composés de faible poids moléculaire, très solubles et non réducteurs. Les trois polyols non cycliques (alditols) les plus répandus chez les Angiospermes sont le galactitol, le sorbitol et le mannitol. Le sorbitol est le produit photosynthétique principal chez plusieurs espèces de Rosacées telles que la pomme, la poire, la pêche et la prune.
Le mannitol, le plus répandu des alditols, est présent chez plus de 100 espèces de végétaux supérieurs, en particulier chez les Rubiacées (café), les Oléacées (troène, frêne, olive) et les Apiacées (céleri, carotte, persil) (Lewis, 1984). Il est produit dans les cellules de mésophylle (cellules contenant la chlorophylle). Pour circuler, il doit rentrer dans les tubes criblés (nervures). Cependant, il n'y a pas de continuité entre les cellules mésophylles et les tubes criblés : on a donc besoin d'un transporteur de mannitol. Ainsi, le mannitol sort des cellules mésophylles et utilise le transporteur pour pénétrer dans les tubes criblés.

Les composés synthétisés dans les feuilles adultes sont transportés vers les organes de réserve et traversent un certain nombre de membranes à l'aide des protéines spécialisées que sont les transporteurs. Ces transporteurs jouent un rôle considérable dans la plante car ils sont indispensables à sa croissance.

L'existence d'un transporteur de mannitol chez une plante telle que le céleri a été
démontrée par différentes expériences biochimiques (Salmon et al., 1995).
Cette publication a démontré qu'il existait un transporteur de mannitol chez le céleri et que l'expression de ce transporteur était très importante dans les tissus du phloème.
Cependant, rien n'est dit quant à l'identification du transporteur de mannitol.
Si de nombreux transporteurs de sucres, comme le saccharose et les hexoses ont été clonés au cours des dernières années, aucun de ceux-ci n'est capable de transporter de polyol.

A l'heure actuelle, aucun transporteur de polyol linéaire n'a été identifié
chez un organisme vivant. Chez les bactéries, un système multienzymatique capable de transporter et de phosphoryler à la fois le mannitol a été décrit (Boer et al., 1994).
Toutefois, de tels systèmes n'ont jamais été décrits chez les organismes supérieurs.
L'invention a pour objet des transporteurs de polyols chez les plantes et les champignons, et leurs séquences d'ADN.
L'invention a également pour objet l'utilisation des séquences d'ADN de transporteur de polyol pour l'obtention de plantes transgéniques.
L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences d'ADN de transporteur de polyol, notamment dans le cadre de l'obtention de plantes résistantes aux pathogènes ou de plantes résistantes au stress salin.
L'invention a également pour objet l'utilisation de séquences d'ADN de transporteur de polyol dans le cadre d'une méthode de criblage de plantes génétiquement modifiées.
L'invention concerne l'utilisation d'une séquence d'ADN codant pour un transporteur de polyols linéaires, chez les plantes et les champignons, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, pour la préparation de plantes transgéniques.

Dans l'expression "plantes et champignons", on englobe les algues, les mousses (Bryophytes), les fougères (Ptéridophytes), les plantes supérieures (Gymnospermes et Angiospermes) et les champignons.
2 On rappelle que, par définition, un polyol est un "polyalcool" contenant autant de fonctions alcool que d'atomes de carbone. On précise également que les termes polyol, polyalcool et sucre alcool sont équivalents.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention concerne l'utilisation, pour la préparation de plantes transgéniques, d'une séquence d'ADN choisie parmi l'une des séquences suivantes : SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO :
5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10.
SEQ ID NO : 1 est une nouvelle séquence d'acide nucléique identifiée chez le céleri (Apium graveolens L.), codant pour un transporteur de mannitol.
SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9 et SEQ ID NO : 10 sont des séquences d'acides nucléiques codant pour des protéines de fonction jusqu'à ce jour inconnue.
SEQ ID NO : 3 (Beet 1) et SEQ ID NO : 4 (Beet 2) proviennent de la Betterave (Beta vulgaris).
SEQ ID NO: 5 (Pst 1), SEQ ID NO:6 (Pst 2), SEQ ID NO: 7 (Pst 3), SEQ ID NO : 8 (Pst 4) et SEQ ID NO : 9 (Pst 5) proviennent d'Arabidopsis thaliana.
SEQ ID NO : 10 (Bs) provient de Bacillus subtilis.
L'invention concerne également une nouvelle protéine, caractérisée par le fait qu'elle comprend ou est constituée par :

- la séquence SEQ ID NO : 2, - ou toute séquence dérivée de SEQ ID NO: 2, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ayant la propriété
de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols linéaires, tels que des polyols ayant une chaîne principale contenant 5 à 8 atomes de carbone, notamment 5 à 7 atomes de carbone, en particulier 6 atomes de carbone, lesquels polyols étant avantageusement choisis parmi le mannitol, le sorbitol, le dulcitol, le galactitol, l'inositol, le ribitol et le xylitol, et étant notamment le mannitol, - toute séquence homologue de SEQ ID NO : 2, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 50% avec la séquence SEQ ID NO : 2 et possédant la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus,
3 - ou tout fragment d'une des séquences définies ci-dessus, sous réserve qu'il possède la propriété de transporter, chez les plantes et les champignons, des polyols tels que définis ci-dessus, notamment tout fragment étant constitué
d'au moins environ 10 acides aminés contigus dans la séquence SEQ ID NO : 2.

La propriété de transport de polyols présentée par un transporteur de polyols peut être vérifiée par l'un ou l'autre des tests suivants :
- l'utilisation de levure S.cerevisiae ou - l'utilisation de membrane plasmique purifiée de vésicules du phloème.
L'utilisation de la levure Saccharomyces cerevisiae (Noiraud et al., 2000) comprend la transformation des levures avec la séquence nucléotidique à
tester, lesquelles levures sont capables de croître sur ledit polyol. Pour vérifier que le polyol est transporté dans ces levures, on peut utiliser du polyol marqué
radioactivement. Pour chaque expérience, un contrôle est mis au point avec une souche de levure incapable de pousser sur le polyol, et qui ne transporte pas ledit polyol.

Le test ayant recours à une membrane plasmique purifiée de vésicules du phloème est celui décrit par Salmon et al. (1995).

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine de l'invention, telle que définie ci-dessus, est caractérisée en ce qu'elle est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2.

L'invention concerne également les fragments de protéine telle que définie ci-dessus, choisis parmi les séquences suivantes :

- Ala Cys Ala Leu Leu Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Thr Gly Val Leu Ser Gly Ala Ser Ile (SEQ ID NO : 11) délimitée de l'acide aminé en position (26) à l'acide aminé en position (50) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Gln Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile Ile Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Gly Ser Ala Ile Ala Gly (SEQ ID NO : 12) délimitée de l'acide aminé en position (62) à l'acide aminé
en position (82) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Tyr Thr Met Val Leu Ala Gly Ile Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe Met Gly Leu Ala (SEQ ID NO : 13) délimitée de l'acide aminé en position (92) à l'acide aminé
en position (111) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala (SEQ ID NO : 14) délimitée de l'acide aminé en position (116) à
l'acide aminé en position (140) de la séquence SEQ ID NO : 2,
4 - Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala Phe Ala (SEQ ID NO : 15) délimitée de l'acide aminé en position (150) à l'acide aminé en position (174) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Ile Met Leu Gly Ile Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile Val Leu Tyr Met (SEQ ID NO : 16) délimitée de l'acide aminé en position (184) à l'acide aminé
en position (203) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Ala Ala Ile Thr Gly Ile Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Cys Gly Ile Asp Ala Val Val Leu (SEQ ID NO: 17) délimitée de l'acide aminé en position (281) à l'acide aminé en position (302) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val Phe Ile Leu Ile Ser Thr Phe (SEQ ID NO : 18) délimitée de l'acide aminé en position (320) à l'acide aminé
en position (339) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu Ala Gly Ser Leu Thr Val (SEQ ID NO : 19) délimitée de l'acide aminé en position (349) à
l'acide aminé en position (370) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Gly Gly Leu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe Ser Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Trp Val Tyr (SEQ ID NO: 20) délimitée de l'acide aminé en position (382) à l'acide aminé en position (407) de la séquence SEQ ID NO : 2, - Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn Arg Gly Met Ser Gly Ile Ile Gly Met Thr Phe Ile Ser (SEQ ID NO : 21) délimitée de l'acide aminé en position (421) à l'acide aminé
en position (441) de la séquence SEQ ID NO : 2, et - Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser Ile Gly Trp Val Phe Met Tyr Thr Met Phe (SEQ ID NO : 22) délimitée de l'acide aminé en position (451) à l'acide aminé
en position (470) de la séquence SEQ ID NO : 2, L'invention concerne également une. séquence nucléotidique codant pour une protéine telle que définie ci-dessus.
Une séquence d'ADN avantageuse de l'invention comprend ou est constituée par :
- la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, par dégénérescence du code génétique, de la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine représentée par SEQ
ID NO: 2, - ou toute séquence nucléotidique dérivée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, de la séquence SEQ ID
NO : 1 codant pour une protéine dérivée de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus, - ou toute séquence nucléotidique homologue de SEQ ID NO : 1, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 35% avec la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour une protéine homologue de SEQ ID NO : 2, telle que définie ci-dessus, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 ou des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué
d'au moins environ 30 nucléotides contigus dans ladite séquence, - ou toute séquence nucléotidique complémentaire des séquences ou fragments susmentionnés, - ou toute séquence nucléotidique susceptible d'hybrider dans des conditions stringentes avec la séquence complémentaire d'une des séquences ou d'un des fragments susmentionnés.
Par conditions stringentes d'hybridation on entend :
- température d'hybridation : 65 C, - milieu d'hybridation : tampon phosphate de sodium 250 mM, pH 7,2; 6,6%
(p/v) de SDS ; 1 mM EDTA ; 1% (p/v) d'albumine sérine de boeuf, - température de lavage : 65 C, - milieux de rinçage successifs :
2x SSC (1,75% NaC1 ; 0,88% citrate de sodium), SDS 0,1%
lx SSC (0,875% NaC1 ; 0,44% citrate de sodium), SDS 0,1%
0,5x SSC (0,44% NaCI ; 0,22% citrate de sodium), SDS 0,1%.
L'invention concerne également les fragments de séquences nucléotidiques telle que définies ci-dessus, choisis parmi les ségqences suivantes :
GCT TGT GCT CTT TTA GCT TCC ATG AAT TCC ATC TTA CTC GGC TAT
GAC ACC GGA GTG TTG AGT GGA GCA TCA ATA (SEQ ID NO: 23) délimitée du nucléotide en position (92) au nucléotide en position (166) de la séquence SEQ ID NO : 1, CAA ATC GAA ATA ATC ATC GGA ATC ATC AAC ATC TAC TCT CTT CTT
GGT TCG GCC ATA GCC GGA (SEQ ID NO: 24) délimitée du nucléotide en position (200) au nucléotide en position (262) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TAC ACC ATG GTA CTA GCT GGT ATC ATA TTT TTT CTA GGA GCC ATT
TTC ATG GGG CTT GCT (SEQ ID NO : 25) délimitée du nucléotide en position (290) au nucléotide en position (349) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TTT CTC ATG TTT GGT CGC TTT GTT GCT GGA ATT GGT GTC GGT TAT
GCC ATG ATG ATC GCT CCC GTC TAC ACT GCC (SEQ ID NO : 26) délimitée du nucléotide en position (362) au nucléotide en position (436) de la séquence SEQ
ID NO: 1, - TTC CTC ACT TCT TTT CCT GAG GTT TTC ATT AAT TCT GGT GTG TTG
CTC GGG TAT GTA TCC AAC TTT GCA TTT GCC (SEQ ID NO : 27) délimitée du nucléotide en position (464) au nucléotide en position (538) de la séquence SEQ
ID NO: 1, - ATT ATG CTG GGA ATT GGA GCA TTT CCT TCA GTT GCC TTG GCC ATA
ATT GTG TTA TAT ATG (SEQ ID NO : 28) délimitée du nucléotide en position (566) au nucléotide en position (625) de la séquence SEQ ID NO : 1, - GCT GCA ATT ACG GGT ATT GGT ATT CAT TTC TTC CAA CAG GCT TGT
GGT ATT GAT GCT GTT GTT TTA (SEQ ID NO : 29) délimitée du nucléotide en position (857) au nucléotide en position (922) de la séquence SEQ ID NO : 1, - CTC CTT GCG ACA ATT GCT GTT GGA GTC TGC AAA ACA GTC TTT ATT
CTG ATA TCA ACG TTT (SEQ ID NO : 30) délimitée du nucléotide en position (974) au nucléotide en position (1033) de la séquence SEQ ID NO : 1, - CTG ATG CTA ACA AGT ATG GGG GGT ATG GTT ATT GCT CTA TTT GTA
CTG GCA GGC TCA TTG ACG GTT (SEQ ID NO : 31) délimitée du nucléotide en position (1061) au nucléotide en position (1126) de la séquence SEQ ID NO : 1, TCA AGT GGC ATG GGT CCA ATT GCT TGG GTC TAT (SEQ ID NO : 32) délimitée du nucléotide en position (1160) au nucléotide en position (1237) de la séquence SEQ ID NO : 1, - TGT AGT ATC GGA GTG GCA GTT AAC CGT GGC ATG AGT GGC ATA ATT
GGA ATG ACA TTT ATA TCG (SEQ ID NO : 33) délimitée du nucléotide en position (1277) au nucléotide en position (1339) de la séquence SEQ ID NO : 1, - GCA TTC CTT TTA TTT GCT GTG GTT GCA TCT ATC GGA TGG GTC TTT
ATG TAC ACA ATG TTC (SEQ ID NO : 34) délimitée du nucléotide en position (1367) au nucléotide en position (1426) de la séquence SEQ ID NO : 1, La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 23 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO: M.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 24 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 12.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 25 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 13.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 26 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 14.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 27 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 15.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 28 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 16.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 29 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 17.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 30 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 18.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 31 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 19.
La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 32 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 20.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 33 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 21.

La séquence d'acide nucléique SEQ ID NO : 34 code pour le fragment de protéine SEQ ID NO : 22.

L'invention concerne également un vecteur recombinant, notamment plasmide, cosmide, phage ou ADN de virus, contenant une séquence nucléotidique telle que mentionnée ci-dessus.
L'invention concerne également un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte des polypeptides codés par les acides nucléiques tels que définis ci-dessus, insérés dans ledit vecteur.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant défini ci-dessus contient notamment un promoteur reconnu par l'ARN polymérase de la cellule hôte, en particulier un promoteur inductible et éventuellement une séquence de transcription, de terminaison, et éventuellement une séquence signal et/ou d'ancrage.

Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur recombinant, tel que défini ci-dessus, contient les éléments qui permettent l'expression d'une séquence nucléotidique, telle que définie ci-dessus, en tant que protéine mature ou protéine de fusion.

L'invention concerne également une cellule hôte, choisie notamment parmi les bactéries, les virus, les levures, les champignons, les plantes ou les cellules de mammifères, ladite cellule hôte étant transformée, notamment à l'aide d'un vecteur recombinant tels que définis ci-dessus.

Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la cellule hôte, telle que définie ci-dessus, contient les éléments de régulation permettant l'expression de la séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.

L'invention concerne également le produit de l'expression d'un acide nucléique exprimé par une cellule hôte transformée telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également un anticorps caractérisé en ce qu'il est dirigé
de manière spécifique contre une protéine de l'invention.

On ne se limite pas aux anticorps polyclonaux ; l'invention concerne également tout anticorps monoclonal produit par tout hybridome susceptible d'être formé
selon les méthodes classiques à partir, d'une part, de cellules de rate d'animaux, en particulier de souris ou de rat, les cellules -de l'animal étant immunisées contre la protéine de l'invention, et d'autre part de cellules d'une lignée cellulaire de myélome, ledit hybridome étant susceptible d'être choisi selon la capacité de la lignée cellulaire à
produire des anticorps monoclonaux reconnaissant la protéine utilisée au préalable pour l'immunisation des animaux.

L'invention concerne également une sonde nucléotidigqe capable d'hybrider avec l'une quelconque des séquences nucléiques de l'invention.
L'invention concerne également les oligonucléotides antisens ou ARN messager antisens dérivés des séquences nucléotidiques tels que définis ci-dessus.
Par modification de l'expression du transporteur de mannitol, en utilisant des oligonucléotides antisens, on peut alors déterminer si une diminution de l'expression du transporteur de mannitol a pour conséquence une diminution de la tolérance au stress salin.
L'invention concerne également les cellules de plantes contenant dans leur génome une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.

L'invention concerne également les plantes transgéniques, parties de plantes, semences de plantes ou matériel de propagation de plantes contenant des cellules telles que définies ci-dessus.
L'invention concerne en particulier les plantes transgéniques qui, à l'état natif, ne contiennent pas ou n'expriment pas le gène du transporteur de mannitol, dans le génome desquelles est introduit ladite séquence nucléotidique.

L'invention concerne en particulier les plantes transgéniques qui, à l'état natif, contiennent ou expriment le gène du transporteur de mannitol, dans le génome desquelles est introduit ladite séquence nucléotidique.

L'invention concerne également un procédé de préparation d'une protéine recombinante telle que définie ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :

- la culture dans un milieu approprié d'une cellule hôte qui a été auparavant transformée par un vecteur approprié contenant un acide nucléique de l'invention, et - la récupération de la protéine produite par la susdite cellule hôte transformée à partir du susdit milieu de culture ou à partir de la cellule hôte.
Par exemple, un procédé de préparation d'un céleri transgénique tel que défini ci-dessus, comprend les étapes suivantes :
- l'inoculation des tissus de Céleri, - la coculture des segments de Céleri et des bactéries A. tumefaciens, - l'élimination des bactéries A. tumefaciens, - la régénération des plants de Céleri transformés (Nadel et al., 1989).
Les séquences nucléotidiques de l'invention peuvent être introduites dans des plasmides et être combinées avec des éléments de régulation pour l'expression dans des cellules eucaryotes. Ces éléments de régulation sont d'une part des promoteurs de transcription et d'autre part des terminateurs de transcription. Avec les séquences nucléotidiques de l'invention contenues dans les plasmides, on peut transformer les cellules eucaryotes dans l'intention d'exprimer un ARNm traduisible qui rend possible la synthèse d'un transporteur de polyol dans les cellules ou dans l'intention d'exprimer un ARNm non traduisible, qui empêche la synthèse d'un transporteur de polyol endogène dans les cellules.
Les procédés de modification génétique des dicotylédones et monocotylédones sont déjà connus (Gasser et al., 1989). Pour l'expression dans les plantes, les séquences nucléotidiques de l'invention doivent être couplées avec des éléments de régulation de la transcription. De tels éléments, appelés promoteurs, sont déjà connus (EP
375091).

De plus, il faut fournir les régions codantes avec les signaux de terminaison de la transcription avec lesquels ils peuvent être correctement transcrits. De tels éléments sont également décrits (Gielen et al., 1989). La région d'initiation de la transcription peut être native et/ou homologue de même qu'étrangère et/ou hétérologue à la plante hôte. Si on le souhaite, les régions de terminaison sont interchangeables entre elles.
La séquence d'ADN des régions d'initiation et de terminaison de la transcription peut être préparée synthétiquement ou obtenue naturellement, ou obtenue à partir d'un mélange de constituants d'ADN naturel ou synthétique. Pour introduire des gènes étrangers dans des plantes supérieures, un grand nombre de vecteurs de clonage sont disponibles qui incluent un signal de réplication pour E.coli et un marqueur qui permet une sélection des cellules transformées.

Pour l'introduction des séquences nucléotidiques de l'invention dans un hôte cellulaire de plante, en plus de la transformation utilisant Agrobacteria, il existe beaucoup d'autres techniques. Ces techniques incluent la fusion de protoplastes, la microinjection d'ADN et l'électroporation, ainsi que des méthodes balistiques et l'infection de virus. A partir du matériel de plante transformé, les plantes entières peuvent être régénérées dans un milieu adapté, contenant des antibiotiques ou des biocides pour la sélection. Les plantes résultantes peuvent ensuite être testées pour la présence de l'ADN introduit. Il n'y a pas d'exigence particulière pour les plasmides en ce qui concerne l'injection et l'électroporation. On peut utiliser de simples plasmides tels que les dérivés pUC. La présence d'un gène marqueur est nécessaire pour la régénération de plantes entières à partir de telles cellules transformées. Les cellules transformées se développent dans les plantes de manière usuelle (McCormick et al., 1986). Ces plantes peuvent se développer normalement et être croisées avec des plantes qui possèdent les mêmes gènes transformés ou des gènes différents. Les hybrides résultants ont les propriété phénotypiques correspondantes.
Les séquences d'ADN de l'invention peuvent également être introduites dans des plasmides et être combinées avec des éléments de régulation pour une expression dans des cellules procaryotes.

Les séquences d'ADN de l'invention peuvent également être introduites dans des plasmides qui permettent une mutagenèse ou une modification de séquence au moyen d'une recombinaison des séquences d'ADN dans les systèmes procaryotes ou eucaryotes.

Les plantes transgéniques de l'invention sont notamment caractérisées par une augmentation de la capacité à transporter un polyol de l'invention et à
l'accumuler dans les organes à partir desquels il est extrait. Elles peuvent être utilisées pour orienter les flux dudit polyol à l'aide dudit transporteur vers les organes qui accumulent peu de sel, facilitant ainsi l'extraction.

L'invention concerne également un procédé de criblage de plantes génétiquement modifiées avec au moins une séquence nucléotidique d'intérêt qui comprend les étapes suivantes :

- la transformation de cellules végétales avec un vecteur contenant une séquence d'insertion, ladite séquence d'insertion comprenant la séquence nucléotidique d'intérêt et une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus, - la mise en culture des cellules ainsi transformées sur un milieu contenant ledit polyol comme unique source de carbone, pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques contenant ladite séquence d'insertion.
Ce procédé concerne les plantes ne synthétisant pas de polyol ou les plantes qui le synthétisent.

Il s'agit, plus particulièrement, de transformer des fragments ou des cellules de plantes avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol, notamment de mannitol.. Le criblage s'opère ensuite sur un milieu contenant ledit polyol comme seule source de carbone. Les plantes exprimant le transporteur de polyol ont ainsi un avantage de croissance sur les plantes non transformées. A ce stade, on peut supposer que toute plante est capable d'utiliser ledit polyol comme source de carbone.
Toutefois, il peut s'avérer nécessaire de faire une co-transformation avec un gène codant une protéine capable de dégrader ledit polyol. L'utilisation d'un promoteur actif uniquement dans les phases initiales de régénération ou inductible par un composé
simple permet de restreindre l'expression du transporteur de polyol aux phases de sélection.

Il s'agit donc d'un système de sélection simple basé sur un gène de plante qui n'est plus nécessaire une fois la sélection terminée et sur l'utilisation d'un produit naturel comme agent de sélection. Ce système évite d'avoir recours à
l'utilisation de produits susceptibles d'être toxiques, tels que des antibiotiques.

L'invention concerne également un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes, qui comprend les étapes suivantes :

- la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus, - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
Ce procédé concerne la transformation de plantes ne synthétisant pas de polyol ou de plantes qui le synthétisent, avec une séquence nucléotidique d'un transporteur de polyol, notamment de mannitol, placé soit sous le contrôle d'un promoteur ubiquiste (type CaMV 35S) soit sous le contrôle d'un promoteur inductible en réponse à
l'attaque du pathogène. L'intérêt réside en ce que la plante, en transportant vers ses propres cellules davantage de polyol, émis par le pathogène, supprime un des moyens de défense mis en place par le pathogène pour lutter contre l'oxygène activé
libéré par la plante en réponse à cette attaque.

On peut, pour augmenter l'efficacité du procédé, coupler l'expression du transporteur de polyol avec une enzyme dégradant ledit polyol.

L'invention concerne un procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes au stress salin, qui comprend les étapes suivantes :

- la transformation de cellules végétales avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol tel que défini ci-dessus, - la mise en culture-des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.

Ce procédé concerne la transformation de plantes ne synthétisant pas de polyol ou de plantes qui le synthétisent avec une séquence nucléotidique codant pour un transporteur de polyol placé sous contrôle d'un promoteur spécifique du phloème (ou du promoteur du transporteur de polyol). Si la plante synthétise ledit polyol, l'augmentation du transport dudit polyol pourrait conduire à une tolérance accrue au stress salin. Dans le cas contraire, il convient également d'introduire des gènes permettant la synthèse dudit polyol, mais en limitant cette synthèse aux feuilles afin d'éviter des effets néfastes sur la croissance de la plante.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 représente le test de croissance de la levure MaDH4 exprimant la séquence protéique AgMaT1. L'ADNc de AgMaT1, sous contrôle du promoteur ADH1, a été introduit dans les cellules de la souche MaDH4, et la croissance des cellules transformées sur mannitol a été étudiée. Les cellules transformées ont été
cultivées sur du milieu SC (synthétique complet) liquide sans tryptophane contenant soit du glucose 2% (SC-glu) soit du mannitol 2% (SC-mann).
MaDH4-YEP112A1XE : MaDH4 contenant le plasmide vide ;
MaDH4-AgMaTl : MaDH4 contenant le plasmide avec l'acide nucléique de AgMaTl.

Les carrés blancs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec le plasmide vide YEP112A1XE (défini ci-après) et cultivées sur du milieu SC-glucose.
Les carrés noirs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec le plasmide vide YEP112A1XE (défini ci-après) et cultivées sur du milieu SC-mannitol.
Les cercles blancs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec AgMaTl/YEP112AlXE (plasmide YEP112A1XE contenant l'acide nucléique de AgMaTl) et cultivées sur du milieu SC-glucose.
Les cercles noirs correspondent à des levures MaDH4 transformées avec AgMaTl/YEP112AlXE (plasmide YEP112A1XE contenant l'acide nucléique de AgMaTl) et cultivées sur du milieu SC-mannitol.
Les courbes représentent l'évolution en fonction du temps de l'absorbance (à

nm) des cultures de levure. Cette augmentation de l'absorbance correspond en fait à une augmentation du nombre de levures dans le milieu de culture et est représentative de la vitesse de croissance des levures. Ainsi les levures transformées avec les plasmides YEP112A1XE et AgMaTl/YEP112AlXE poussent sur du glucose mais seules les levures transformées avec le plasmide AgMaTl/YEP112A1XE sont capables de pousser sur du mannitol. Il s'agit donc d'une preuve que AgMaTl code un transporteur de mannitol.

La Figure 2 représente l'absorption de mannitol dans des cellules de S.
cerevisiae.

La concentration externe en mannitol H est de 500 M et le pH de 4,5. Les carrés représentent l'absorption dans des cellules transformées avec l'acide nucléique de AgMaTl tandis que les cercles représentent l'absorption dans des cellules témoins transformées avec le plasmide YEP112AIXE vide. Seules les cellules transformées avec le plasmide AgMaTl/YEP112AlXE sont capables d'absorber le mannitol 3H
placé
dans le milieu externe.

MATERIEL ET METHODES

Matériel végétal Des plants de Céleri (Apium graveolens L. variété dulce, cultivar Vert d'Elne) ont été cultivés en serres selon les conditions décrites par Davis et al. (1988).
Les faisceaux phloémiens ont été isolés à partir de pétioles adultes selon la technique décrite par Daie (1987).

Souches bactériennes et de levures Les souches suivantes ont été utilisées dans cette étude : Escherichia coli souches DH5a (supE44, AlacUl69 (080, lacZM15), hsdR17, recA, endA1, gyrA96, th!-1, reL4l) (souches commercialisées par Clontech). XL1Blue TM MRF' (Stratagene) et SOLRTM
(Stratagene) ont été cultivées selon les techniques standard (Sambrook et al., 1989). La souche de Saccharomyces cerevisiae MaDH4 (ura3, trpl, LEU2, gapl-1, put4-1, uga4-1), dont la préparation est indiquée ci-après, exprime le gène de la mannitol déshydrogénase de levure et a été utilisée pour la caractérisation fonctionnelle de l'ADNc de AgMaTJ. La souche 2a a été obtenue par croisement entre les souches â
(MATa, ura3, trpl, leu2) (Marcireau et al., 1992) et E22574d (MATa, ura3-1, gapl-1, put4-1, uga4-1) (Jauniaux et al., 1987).

Vecteur d'expression dans les levures On a utilisé le plasmide YIP 128A1, décrit dans Riesmeier et al. (1992). Le gène de la mannitol déshydrogénase de levure (YEL070) a été amplifié par PCR
(réaction de polymérisation en chaîne) en utilisant les oligonucléotides MDHPST5 (5-GACTCGA-GATGACAAAATCAGACGAAACAAC-3) et MDHBGL3 (5- GAAGATCTTCACA-CTTGGTCTAAA.ATTTCC-3) sur l'ADN génomique de la souche de Saccharomyces Da. Le produit de la PCR a été cloné dans le vecteur pBluescript SK digéré
préalablement par Pstl et BamHl. Après séquençage pour confirmer la séquence du gène amplifié, le produit de PCR a été digéré par Pstl et Xbal et cloné dans les sites Pstl/Xbal de YIP128A1. La construction a été intégrée dans le génome de S.
cerevisiae par le site EcoV dans le gène leu2 pour obtenir la souche MaDH4.
5'RACE-PCR (Amplification rapide des extrémités d'ADNc par PCR), Des ARN totaux de feuilles de céleri ont été isolés selon la méthode de Kay et al.
(1987). Le premier brin d'ADNc à été inversement transcrit à partir de l'ARN
total avec l'amorce dégénérée (5'-CCNACNCC(G/A)AANGGNA(G/A)NA(G/A)-3) dérivée de la séquence LLGFGVG en utilisant la transcriptase inverse SuperScript7m II
(Stratagène).
Après dégradation de la matrice ARN par la RNaseH (Eurogentec), une amorce d'accrochage (dC)16 a été créée à l'extrémité 3' de lADNc simple brin par une déoxynucleotydil transférase (GibcoBRL). Une amplification PCR a été réalisée en utilisant les amorces (dG)16 et LLGFGVG dans les conditions suivantes : 2 min à 95 C
puis 30 cycles comprenant une dénaturation de 2 min à 95 C, une fixation de 2 min à
55 C et une élongation de 2 min à 72 C. Les produits de la PCR ont été
analysés par électrophorèse en gel d'agarose puis clonés dans le plasmide pGEM-T EasyTM
(Promega).

Construction et criblage d'une banque d'ADNc de phloème de céleri Les ARN totaux des faisceaux de phloème ont été isolés selon la méthode décrite par Kay et al. (1987). Les ARN polyA+ ont été purifiés avec le système PolyATtract mRNA isolation (Promega). Une banque unidirectionnelle EcoRl/Xhol a été
construite dans le phage Uni-ZapXRTM(Stratagene).
Les phages recombinants (900 000) Qnt été criblés avectcomme sonde, le produit de 5'RACE-PCR marqué radioactivement, en accord avec le protocole du fabricant (Stratagene). Les filtres en nylon HybondTM-NTM (Amersham) ont été hybridés pendant une nuit à 42 C selon les conditions standard (Stratagene). Les filtres ont ensuite été
rincés pendant 15 min à 42 C dans du SSC 2x (SSC lx = 0,15 M NaCI ; 0,015 M
citrate de sodium) avec du SDS à 0,1%, puis 15 min dans le même milieu mais à 50 C et min à 50 C dans du SSC lx et du SDS à 0,1%. L'excision in vivo a été réalisée sur les 24 clones qui avaient donné un signal positif lors des 3 tours successifs de criblage. Les ADNc identifiés ont été partiellement séquencés. Les comparaisons de séquence ont été
réalisées sur le site du National Center for Biotechnology Information. Les régions transmembranaires ont été prédites avec le programme Tmpred (Hofinann et Stoffel, 1993).

Expression d'AgMaTl dans Saccharomyces cerevisiae L'ADNc de AgMaTl a été ligué dans les sites Pstl-XhoI du vecteur de levure YEP112A1XE (Riesmeier et al., 1992). Ce vecteur permet l'expression des ADNc sous le contrôle du promoteur de levure ADH1. Les cellules de levures MaDH4 ont été
rendues compétentes et transformées selon le protocole décrit par Dohmen et al. (1991).
Détermination de la vitesse de croissance Les cultures de levures ont poussé sur du milieu SC comprenant soit du glucose à
2%, soit du mannitol à 2%. Des fractions aliquotes ont été prélevées régulièrement dans les cultures et leur absorbance a été mesurée à 600 nm.

Détermination de l'activité mannitol déshydrogénase Les cellules ont été cultivées jusqu'en phase de croissance logarithmique, rincées dans de l'eau distillée et remises en suspension à 80% (poids/volume) dans du tampon d'extraction (phosphate de potassium 50 mM pH 7,5, DTT 1 mM et Triton X100 à
0,5%). Les cellules ont été cassées par vortex avec des billes de verre. Les débris cellulaires ont été éliminés par centrifugation et l'extrait brut utilisé pour le dosage enzymatique. L'activité mannitol deshydrogénase a été mesurée à 30 C selon Quain et Boulton (1987).

Mesure de transport de mannitol radiomarqué

Les cellules ont été cultivées jusqu'en début de phase logarithmique (correspondant à une absorbance de 0,6 à 600 nm), lavées dans de l'eau distillée et resuspendues à 1% (poids/volume) dans du milieu SC tamponné à pH 4,5 avec du MES
25 mM. Une fraction aliquote de 100 l de la suspension cellulaire a été
incubée pendant 60, 120, 180 et 300 s dans 100 l d'une solution contenant du [3H]-mannitol 500 M. La réaction a été arrêtée par addition de 8 ml d'eau à 4 C et par filtration sur des filtres en fibres de verre (Sertorius). La radioactivité incorporée dans les cellules de levure a été déterminée par comptage en scintillation liquide (Packard). Pour les expériences avec des inhibiteurs ou des compétiteurs, le produit a été ajouté
30s avant le mannitol radioactif.

Etude de l'expression d'AgMaTl par RT-PCR (transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérasel Des ARN totaux de phloème de céleri ont été isolés selon la méthode de Kay et al.
(1987). Le premier brin d'ADNc a été inversement transcrit à partir de l'ARN
total avec l'amorce oligo dT en utilisant la transcriptase inverse SuperScriptTM II
(Stratagène).
Après dégradation de l'ARN matrice par la RNaseH (Eurogentec), une amplification PCR a été effectuée en utilisant les amorces 5' (ATTCTGGTGTGTTGCTCG) et 3' (CAATGAACAGTATGATGTG) qui permettent l'amplification d'un fragment de 661 nucléotides. Les conditions de PCR sont les suivantes : 2 minutes à 95 C puis 30 cycles comprenant une dénaturation de 30 secondes à 95 C, une fixation d'une minute à

et une élongation de 45 secondes à 72 C. Les produits de la PCR ont été
analysés par électrophorèse en gel d'agarose et l'intensité du signal obtenu quantifié à
l'aide du logiciel Photoshop 5.0 (Adobe systems Inc.). Le facteur d'élongatiôn e1F4A(10) (Mandel et al., 1995) a été. utilisé comme gène de contrôle dont l'expression est invariable.

RESULTATS
Clonage moléculaire de AgMaTl Un certain nombre de protéines qui transportent des sucres ou des métabolites font preuve de similitudes dans leurs séquences. Il a été suggéré que ces protéines de transport ont évolué à partir de la duplication d'une protéine ancestrale avec
6 régions transmembranaires (Maiden et al., 1987). Plusieurs régions d'acides aminés conservés -ont été identifiées telles que les séquences d'acides aminés aux extrémités des 6e et 12e domaines transmembranaires, respectivement PESPR et PETKG (Griffith et al., 1992).
Une comparaison entre les différents transporteurs de glucose (MST1, STP1, STP4, HUP1, HUP3, GLUT1), le transporteur de D-xylose de L.brevis, le transporteur
7 PCT/FR01/01979 d'arabinose d'E.coli (ARAE), le transporteur de galactose d'E.coli (GALP) et les transporteurs de myo-inositol de levure (gènes ITR1 et ITR2) indique une région conservée LLGFGVG. On a choisi cette séquence comme matrice pour concevoir l'amorce dégénérée 5'RACE pour la PCR.

Le premier brin d'ADNc a été transcrit inversement à partir de l'ARN entier des feuilles de céleri mature, amorcé avec une amorce dégénérée LLGFGVG. Après amplification, on a observé une bande de 1 kb sur le gel d'agarose. On a cloné
tous les fragments de cette réaction de PCR dans un vecteur pGEM-T Easy (Promega), et on a obtenu plusieurs clones.

Pour obtenir un clone entier, on a construit une bibliothèque d'ADNc provenant de faisceaux de phloème isolés à partir de pétioles de céleri mature et on a criblé cette bibliothèque avec le clone 5'RACE-PCR. Après avoir criblé 900 000 transformants, on a identifié 24 clones positifs. Des transformants positifs avec des inserts d'approximativement 1,8-2,0 kb ont été choisis et partiellement séquencés.
L'un de ces clones, nommé AgMaTl, a été choisi pour une analyse détaillée. Il contient 1778 pbh avec un cadre ouvert de lecture qui code pour une protéine contenant 513 acides aminés avec une masse moléculaire estimée à 56 kDa. L'analyse hydropathique de la séquence déduite d'acides aminés indique que AgMaTl contient 12 domaines transmembranaires et une région centrale hydrophile longue de 77 résidus acides aminés. La séquence d'acides aminés de AgMaTl a été comparée avec celles des bases de données et on a trouvé que cette séquence était apparentée aux transporteurs de sucres dans de nombreux organismes. Le pourcentage d'identité des acides aminés est approximativement égal à 50%. Cependant, on a trouvé un plus grand pourcentage d'identité (65%) avec deux éventuels transporteurs de sucre de Beta vulgaris (Beet 1 et Beet 2). Un résidu d'asparagine, qui est une partie d'une séquence consensus de N-glycosylation (Asn372), est situé sur le côté externe et devrait ainsi être glycosylé. De plus, les séquences consensus, qui sont les caractéristiques communes du sous-groupe des transporteurs de sucre de la MFS, sont présentes dans AgMaTl. Nous avons trouvé
les séquences de PESPRXL et PETQGRXXXE respectivement aux extrémités des 6e et 12e domaines transmembranaires, ou le motif (R/K)XGR(R/K) entre le 2e et le 3e et également les 8e et 9e hélices transmembranaires (Griffith et al., 1992).

Remarque :

La principale difficulté rencontrée au cours du clonage a été l'absence totale de caractérisation d'un tel transporteur chez aucun organisme vivant. En effet le seul transporteur de mannitol est une mannitol-phospho-transférase de bactérie (Boer et al., 1994) qui effectue à la fois le transport et la phosphorylation du mannitol.
Ce système combiné est présent chez les bactéries pour de nombreux substrats mais il n'existe pas chez les organismes Eucaryotes. Toutefois, selon une première stratégie, un premier criblage de la banque d'ADNc a été effectué avec la partie du gène de la mannitol-phospho-transférase correspondant au domaine transmembranaire. Ce criblage n'a pas permis d'obtenir de résultat, ce qui se justifie a posteriori par l'absence d'homologie significative entre AgMaTI et la mannitol-phospho-transférase.
Une seconde stratégie, qui s'est révélée inopérationnelle, s'est inspirée de celle utilisée pour identifier le transporteur d'oligosaccharides chez les végétaux (brevet EP 0 647 273). Il s'agissait de complémenter des cellules de Saccharomyces cerevisiae avec une banque d'ADNc dans un vecteur d'expression. Les levures sont en effet capables d'utiliser le mannitol comme source de carbone, mais elles nécessitent une période d'induction assez longue sur mannitol. Comme il a déjà été précisé, aucun transporteur de mannitol n'a été identifié chez la levure. Le raisonnement était que si une levure exprimait un transporteur de mannitol. végétal, cela lui conférerait un avantage de croissance et que donc, elle pousserait plus vite sur un milieu contenant du mannitol. On a procédé ainsi mais aucun des ADNc obtenus ne présentait aucunes des caractéristiques de protéines membranaires et ressemblaient en fait à des facteurs de transcription. Le système de sélection permettait en fait d'identifier des ADNc qui intervenaient sur l'expression des gènes de la levure et non pas des transporteurs.
Devant les difficultés rencontrées, leà Inventeurs ont formulé une hypothèse a priori peu probable selon laquelle le transporteur de mannitol ferait partie de la super famille des transporteurs de glucides décrite par Marger et Saier (1993). Pour ce faire, on a utilisé une espèce, le céleri, chez laquelle l'existence d'un transporteur de mannitol avait été démontrée (Salmon et al., 1995) et à construire une banque d'ADNc à
partir du tissu (le phloème) dans lequel le transporteur est le plus exprimé. La seconde étape a été
la sélection des ADNc obtenus sur leur capacité à conférer à des levures la possibilité de transporter du mannitol. Dans ces expériences le témoin était la souche de levure transformée avec le plasmide d'expression vide. C'est ainsi que la fonction de transporteur de mannitol de l'ADNc de AgMaTl a été démontrée.

Lors de cette expérience, on a identifié d'autres séquences : on a en tout obtenu 24 clones. Parmi tous ces clones, on en a séquencé deux qui présentaient des profils d'hydropathie de transporteurs. Le premier, M22 (AgMaTl), conférait à des levures la capacité de transporter du mannitol alors que le second, M7, ne la conférait pas.

Construction d'une souche de levure susceptible de métaboliser le mannitol intracellulaire Des études initiales ont été réalisées afin de caractériser la capacité d'une levure à
absorber et à métaboliser le mannitol (Quain et Boulton, 1987). Sur les 40 souches polyploïdes de S. cerevisiae criblées, la moitié d'entre elles ont fait preuve d'une bonne croissance sur du mannitol 5% après une adaptation à long terme (Quain et Boulton, 1987). Par conséquent, on a décidé de tester différentes souches de levures pour leur capacité à transporter et à métaboliser le mannitol et on a retenu 2 souches.
Cela a d'abord été effectué en analysant les caractéristiques de croissance sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone. E22574d, en général déficiente en transporteur général d'acides aminés et en transporteur de proline, est incapable de croître sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone. Au contraire, àa était capable de croître sur du mannitol après une adaptation à long terme. Après adaptation, la souche pouvait être maintenue avec succès sur un milieu solide contenant du mannitol 5%. Mais le maintien de la souche adaptée Ma sur un milieu solide contenant seulement du glucose a conduit à la perte totale de la croissance adaptée. Une telle adaptation de la croissance sur du mannitol est probablement due à l'induction des enzymes clés de dégradation ou des perméases de transport. En accord avec les observations précédentes, on a pu détecter une D-mannitol déshydrogénase dépendante de NAD+ chez les levures /a (Tableau 1).

TABLEAU 1 : Activité de mannitol déshydrogénase dans différentes souches de levures.

Les souches se sont développées dans un milieu liquide contenant soit de glucose 2% soit du mannitol 2%. Les résultats sont les moyennes SD des trois expériences indépendantes. ND, non détecté.

Souche Activité ( mol de mannitol oxydé.(mg de protéine)-1.min 1) glucose mannitol Au 0,011 0,003 0,240 0,007 E22574d 0,006 0,002 ND
2a 0,001 0,001 ND
MaDH4 0,410 0,011 ND

Pour obtenir une auxotrophie au tryptophane, on a croisé la souche Aa (Trp) avec la souche E22574d (Trp+). On a choisi la levure 2a qui ne peut pas croître sur un milieu contenant du mannitol, avec une auxotrophie au tryptophane et à la leucine.
Aucune activité de mannitol déshydrogénase n'a été détectée dans les cellules 2a (Tableau 1). Il a fallu introduire une activité d'hydrolyse du mannitol limitée à l'intérieur de la levure.
On a cloné l'ADNc du gène de la mannitol déshydrogénase de la levure dans sous le contrôle du promoteur ADHI et on l'a intégré de manière stable dans le gène leu2 de 2a. Plusieurs transformants ont fait preuve d'une activité mannitol déshydrogénase. La souche avec l'activité la plus importante, nommée MaDH4, a été
utilisée pour des analyses ultérieures (Tableau 1).

Expression hétérologue de la protéine AgMaTl Pour une caractérisation ultérieure de la fonction de la protéine AgMaTl, il a été
nécessaire d'exprimer le transporteur de manière fonctionnelle dans un système hétérologue comme des cellules de levure. L'ADNc de AgMaTl a été souscloné
dans les sites PstI/XhoI du vecteur navette YEP 112A1XE qui a une boîte promoteur/terminateur du gène de l'alcool déshydrogénase ADHI de S. cerevisiae (Riesmeier et al., 1992). Les cellules de MaDH4 compétentes ont été
transformées avec cette construction et YEP 112A1XE a été utilisé comme témoin.

. Toutes les constructions ont d'abord été testées pour leur capacité à
croître sur du mannitol comme unique source de carbone. Comme indiqué dans la Figure 1, la souche MaDH4, transformée avec le plasmide vide YEP 112A1XE n'est pas capable de croître sur le mannitol. Les cellules exprimant AgMaTl pouvaient très bien croître sur ce polyol. Afin de tester directement la capacité des cellules transformées à
transporter le mannitol, les cellules de levure ont été incubées dans un milieu contenant du [3H]-mannitol pendant quelques secondes à plusieurs minutes, les cellules ont été
lavées et la radioactivité absorbée a été mesurée par comptage en scintillation électrique.
La Figure 2 indique que le transport du mannitol dans les cellules témoins de S.
cerevisiae est négligeable. Cependant, les souches de levure MaDH4, exprimant AgMaTl, transportent le [3H]-mannitol à des vitesses élevées lorsqu'elles croissent sur un milieu contenant du mannitol. On a obtenu le même résultat avec des cellules de levure transformées croissant sur du glycérol (donnée non indiquée).
D'autres polyols comme le dulcitol, le sorbitol, le xylitol, le myo-inositol semblent être capables d'inhiber de moitié l'absorption du mannitol. La forme oside du mannitol, le mannose, semble être reconnue par AgMaTl.

Variation de l'expression d'AgMaTl lors d'un stress salin L'expression d'AgMaTl a été suivie dans des plantes ayant été soumises à un stress salin pendant 4 semaines (arrosage quotidien avec 300 mM de NaC1, Noiraud et al., 2000). Le phloème de ces plantes ainsi que des plantes témoins correspondantes (arrosées avec de l'eau ne contenant pas de NaCl) a été prélevé pour extraire des ARN
qui ont été utilisés pour effectuer des réactions de RT-PCR.; Si l'on prend l'expression d'AgMaTl dans le phloème de plantes témoins comme base 100, l'expression d'AgMaTl dans le phloème de plantes traitées au NaCl est de 500%, ce qui représente une stimulation très importante et est en accord avec un rôle d'AgMaTl dans la tolérance au stress salin chez le céleri.

PROTOCOLE DE TRANSFORMATION DE PETIOLES OU DE FEUILLES DE
CELERIBRANCHE

Des plants de Céleri branche (environ 10 cm de hauteur) régénérés à partir de cellules embryogènes sont utilisés comme matériel végétal pour la transformation.
Inoculation des tissus de Céleri Des bactéries Agrobacterium tumefaciens sont cultivées pendant 24 h à 28 C
sous agitation dans du milieu LB (Liquid Broth : tryptone 1%, extrait autolytique de levure 0,5%, NaCl 0,5%)) avec l'antibiotique approprié.

Les pétioles des plants de Céleri sont fragmentés en section de 0,5 cm environ.
Pour chaque fragment, une section longitudinale est faite. Les segments de Céleri sont incubés dans du milieu MS (Murashige & Skoog) 1 X (concentration normale, c'est-à-dire pas de dilution) liquide contenant 1/25éme de la culture de bactéries Agrobacterium tumefaciens pendant 60 min à température ambiante.

Composition du milieu MS

Macro-éléments Vitamines CaC12 2,99 mM Glycine 26,64 mM
KH2PO4 1,25 mM Myo-inositol 0,56 mM
KNO3 18,79 mM Acide nicotinique 4,06 M
MgSO4 1,50 mM Pyridoxine-HC1 2,43 M
NH4NO3 20,61 mM Thiamine-HC1 ' 0,30 M
Micro-éléments CoC12, 6 H2O 0,11 M
CuSO4, 5 H2O 0,10 M
FeNaEDTA 0,10 M
H3Bo3 0,10 M
KI 5,00 M
MnS O4, H20 0,10 mm Na2MoO4, 2 H20 1,03 M
ZnSO4, 7 H2O 29,91 M

L'excès de bactéries est ensuite enlevé des segments de Céleri en les déposant sur du papier absorbant pendant 2-3 min.

Coculture des segments de Céleri et des bactéries A. turne aciens La face cambiale des segments de Céleri est déposée en contact du milieu de régénération RM gélosé. Durant 48 h, les boîtes de Pétri sont placées dans une chambre climatisée à 25 C et soumises à des cycles lumière/obscurité 16 h/ 8 h.

Élimination des bactéries A. turne aciens Après 48 h de coculture, les segments de Céleri sont prélevés des boîtes de milieu RM et transférés dans du MS 1 X liquide supplémenté avec de la céfotaxime à
une concentration finale de 250 g/mL. Après une incubation de 60 min, les segments de Céleri sont séchés sur du papier absorbant pendant 2-3 min.

Régénération de plants de Céleri transformés La face cambiale des segments de Céleri est déposée en contact du milieu d'initiation de la callogenèse CIM gélosé. Les boîtes de Pétri CIM sont placées dans une chambre climatisée à 25 C et soumises à des cycles lumière/obscurité 16 h/8 h jusqu'au développement de cals (2-3 semaines). Les segments de Céleri sont alors transférés sur un milieu d'induction de l'organogenèse OINT gélosé (2-3 semaines). Après l'apparition des bourgeons, ceux-ci sont prélevés et placés sur le milieu d'enracinement EM
gélosé.
Quelques semaines (3-4 semaines) sont nécessaires pour le développement de jeunes pousses de Céleri.

Composition des milieux Milieu de régénération RM

MS i X
Mannitol 3,0%
Saccharose 1,5 %
Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L
6-Benzylaminopurine (BAP) 1,0 mg/L
Acide a-naphtylacétique (NAA) 0,1 mg/L
Acide gibbérellique (GA3) 0,1 mg/L
Agar 0,8 %

Milieu d'initiation de la callogenèse (CIM) Mannitol 3,0 %
Saccharose 1,5 %
Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L
6-Benzylaminopurine (BAP) 1,0 mg/L
Acide a-naphtylacétique (NAA) 0,1 mg/L
Acide gibbérellique (GA3) 0,1 mg/L
Kanamycine 125,0 mg/L
Céfotaxime 200,0 mg/L
Agar 0,8%

Milieu d'induction de l'organogénèse (OIM) Mannitol 3,0%
Saccharose 1,5 %
Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L
6-Benzylaminopurine (BAP) 1,0 mg/L
Acide gibbérellique (GA3) 0,1 mg/L
Kanamycine 75,0 mg/L
Céfotaxime 200,0 mg/L
Agar 0,8 %

Milieu d'enracinement (EM) Mannitol 3,0%
Saccharose 1,5 %
Hydrolysat de caséine 100,0 mg/L
Acide a-indolyacétique (IAA) 0,1 mg/L
Kanamycine 75,0 mg/L
Céfotaxime 200,0 mg/L
Agar 0,8%

REFERENCES

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LISTE DE SEQUENCES

<110> CNRS

<120> SEQUENCES D'ADN CODANT POUR UN TRANSPORTEUR DE POLYOLS
ET LEUR UTILISATION, NOTAMMENT POUR LA PREPARATION DE
PLANTES TRANSGENIQUES

<130> IFBOO CNR APIU
<140> FR0009032 <141> 2000-07-11 <160> 34 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <221> 1766 <212> ADN
<213> Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (17)..(1555) <400>1 ggcacgagga gcttct atg att acc ggc gaa gtt tcc gtc gat tca tat gat 52 Met Ile Thr Gly Glu Val Ser Val Asp Ser Tyr Asp act aac aag cct aaa cct aaa agg aat aag tat gct ttt gct tgt gct 100 Thr Asn Lys Pro Lys Pro Lys Arg Asn Lys Tyr Ala Phe Ala Cys Ala ctt tta gct tcc atg âat tcc atc tta ctc ggc tat gac acc gga gtg 148 Leu Leu Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Thr Gly Val ttg agt gga gca tca ata tac ata aag gaa gat ctc cat ttc tcc gac 196 Leu Ser Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Lys Glu Asp Leu His Phe Ser Asp gtt caa atc gaa ata atc atc gga atc atc aac atc tac tct ctt ctt 244 Val Gln Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile. Ile Asn Ile Tyr Ser Leu Leu ggt tcg gcc ata gcc gga agg acc tcg gac tgg ata ggc aga cgt tac 292 Gly Ser Ala Ile Ala Gly Arg Thr Ser Asp Trp Ile Gly Arg Arg Tyr acc atg gta cta gct ggt atc ata ttt ttt cta gga gcc att ttc atg 340 Thr Met Val Leu Ala Gly Ile Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe Met ggg ctt gct acà aac ttt gcc ttt ctc atg ttt ggt cgc ttt gtt gct 388 Gly Leu Ala Thr Asn Phe Ala Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala gga att ggt gtc ggt tat gcc atg atg atc gct ccc gtc tac act gcc 436 Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala gag gtt gct ccg tcg tct tcc cgt ggt.ttc ctc act tct ttt cct gag 484 Glu Val Ala Pro Ser Ser Ser Arg Gly Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu gtt ttc att aat tct ggt gtg ttg ctc ggg tat gta tcc aac ttt gca 532 Val Phe Ile Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala ttt gcc aag tgc cca ctt tgg tta ggc tgg aga att atg ctg gga att 580 Phe Ala Lys Cys Pro Leu Trp Leu Gly Trp Arg Ile Met Leu Gly Ile 175' 180 185 gga gca ttt cct tca gtt gcc ttg gcc ata att gtg tta tat atg cca 628 Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile Val Leu Tyr Met Pro gag tcc cca cgt tgg ctc gtt atg cag ggt cga ctt ggt gaa gcg agg 676 Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Met Gln Gly Arg Leu Gly Glu Ala Arg act gta ctt gag aaa act tct act tcc aaa gaa gaa gct cac caa aga 724 Thr Val Leu Glu Lys Thr Ser Thr Ser Lys Glu Glu Ala His Gln Arg ctg tct gat att aag gaa gct gct ggg att gat aaà gat tgt aat gac 772 Leu Ser Asp Ile Lys Glu Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp Cys Asn Asp gat gtt gtt caa gtt cca aaa cgt acc aaa gac gaa gca gtg tgg aaa 820 Asp Val Val Gln Val Pro Lys Arg Thr Lys Asp Glu Ala Val Trp Lys gaa ttg att ctt cac cct aca aaa cct gtt cgc=cac gct gca att acg 868 Glu Leu Ile Leu His Pro Thr Lys Pro Val Arg His Ala Ala Ile Thr ggt att ggt att cat ttc ttc caa cag gct tgt ggt att gat gct gtt 916 Gly Ife Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Cys Gly Ile Asp Ala Val 'ü
gtt tta tac agc cct cga att ttt gaa aaa gct ggt atc aaa agt aat 964 Val Leu Tyr Ser Pro Arg Ile Phe Glu Lys Ala, Gly Ile Lys Ser Asn agt aaa aag ctc ctt gcg aca att gct gtt gga gtc tgc aaa aca gtc 1012 Ser Lys Lys Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val ttt att ct'g ata tca acg ttt cag ctg gac aaa att gga cga cgc ccc 1060 Phe Ile Leu Ile Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys Ile Gly Arg Arg Pro 335 340 .345 ctg atg cta aca agt atg ggg ggt atg gtt att gct cta ttt gta ctg 1108 Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu gca ggc tca ttg acg gtt att aac aaa tca cat cat act ggt cat tgg 1156 Ala Gly Ser Leu Thr Val Ile Asn Lys Ser His His Thr Gly His Trp gct ggt ggt ttg gca ata ttt aca gtg tat gct ttt gtg tcg ata tt.t 1204 Ala Gly Gly Léu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe tca agt ggc atg ggt cca att gct tgg gtc tat agc tcc gag gtg ttc 1252 Ser Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Trp Val Tyr Ser Ser Glu Val Phe cct ttg agg cta aga gct caa ggt tgt agt atc gga gtg gca gtt aac 1300 Pro Leu Arg Leu Arg Ala Gln Gly Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn cgt ggc atg agt ggc ata att gga atg aca ttt ata tcg atg tac aaa 1348 Arg Gly Met Ser Gly Ile Ile Gly Met Thr Phe Ile Ser Met Tyr Lys gcc atg act att ggt ggt gca ttc ctt tta ttt gct gtg gtt gca tct 1396 Ala Met Thr Ile Gly Gly Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser 445 450 45*5 460 atc gga tgg gtc ttt atg tac aca atg ttc ccc gag aca caa ggt aga 1444 Ife Gly Trp Val Phe Met Tyr Thr Met Phe Pro Glu Thr Gln Gly Arg aat ctc gaa gaa att gag tta ttg ttt ggc agc tac ttt ggc tgg agg 1492 Asn Leu Glu Glu Ile Glu Leu Leu Phe Gly Ser Tyr Phe Gly Trp Arg aag aca ttg aag gat ttg aag gca aaa gaa gct gct gaa gca aag agt 1540 Lys Thr Leu Lys Asp Leu Lys Ala Lys Glu Ala Ala Glu Ala Lys Ser cgc gag agt gaa gtt tagcagtcag atgaatttag ggttcaaaga tgttatatta 1595.
Arg Glu Ser Glu Val gctctgtgta gagggtagtt ttagagaagc ccttagtatg tgttggagta' tgtgtgatta 1655 ttaaccatca cccgataatt tagaataagg gtgtcaaaga acaattaccc âtttcttatg 1715 tggtaatcta ttgaaaagaa tttgcccaat ggtaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1766 <210> 2 <211> 513 <212>. PRT
<213> Apium graveolens <400> 2 Met -Ile Thr Gly Glu Val Ser Val Asp Ser Tyr Asp Thr Asn Lys Pro Lys Pro Lys Arg Asn Lys Tyr Ala Phe Ala Cys Ala Leu Leu Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Thr Gly Val Leu Ser Gly Ala Ser Ile Tyr Ile Lys Glu Asp Leu His Phe Ser Asp Val Gln Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile Ife Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Gly Ser Ala Ile Ala Gly Arg Thr Ser Asp Trp Ile Gly Arg Arg Tyr Thr Met Val Leu Ais Gly Ile Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe Met Gly Leu Ala Thr Asn Phe Ala Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala Glu Val Ala Pro 130 = 135 140 Sex Ser Ser Arg Gly Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile Asn Ser Gly Val Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala Phe Ala Lys Cys Pro Leu Trp Leu Gly Trp Arg Ile Met Leu Gly Ile Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile Val Leu Tyr Met Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Val Met Gln Gly Arg Leu Gly Glu Ala Arg Thr Val Leu Glu Lys Thr Ser Thr Ser Lys-Glu Glu Ala His Gln Arg Leu Ser Asp Ile Lys Glu Ala Ala Gly Ile Asp Lys Asp*Cys Asn Asp Asp Val Val Gln Val Pro Lys Arg Thr Lys Asp Glu Ala Val Trp Lys Glu Leu Ile Leu 260= 265 270.
His Pro Thr Lys Pro Val Arg His Ala Ala Ile Thr Gly Ile Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Cys Gly Ile Asp Ala Val Val Leu Tyr Ser Pro Arg Ile Phe Glu Lys Ala Gly Ile Lys'Ser Asn Se.r Lys Lys Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val Phe I-le Leu Ile Ser Thr Phe Gln Leu Asp Lys Ils Gly Arg Arg Pro Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu Ala Gly Ser Leu Thi Val Ile Asn Lys Ser His His Thr Gly His Trp Ala Gly Gly Leu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe Ser Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Trp Val Tyr Ser Ser Glu Val Phe Pro Leu Arg Leu Arg Ala Gln Gly Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn Arg Gly Met Ser Gly Ile Ile Gly Met Thr Phe Ile Ser Met Tyr Lys Ala Met Thr Ile Gly Gly Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser Ile Gly Trp Val Phe Met Tyr Thr Met.Phe Pro Glu Thr Gln Gly Arg Asn Leu Glu Glu Ile Glu Leu Leu Phe Gly Ser Tyr Phe Gly Trp Arg Lys Thr Leu Lys Asp Leu Lys Ala=Lys Glu Ala Ala Glu Ala Lys Ser Arg Glu Ser Glu Val <210> 3 <211> 2056 <212> ADN
<213> Betà vulgaris <400> 3 atcaatccaa aaaaatcaaa aggaaacaaa ttcccatctt tccttacttt ctctctcttt 60 ttctctctct tattggtgag aaataagtga gccatgagtg aaggaactaa taaagccatg 120 tcagacccac caccaacaac tgcaagcaaa gtaatagcag attttgatcc tttaaagaag 180 cctcctaaga gaaacaagtt tgcttttgct tgtgctactt tggcttctat,gacttctgtt 240 ttacttggtt atgacattgg agtaatgagt ggtgcaataa tctacctcaa âgaagactgg 300 cacattagtg acacacaaat aggagttcta ggtcggaatct taaacatcta ctgcctcttc 360 ggctctttcg cagctggtcg aacttccgat tggatcggac gacgttacac catcgtatta 420 gctggtgcaa tcttcttcgt tggcgcacta ctcatgggtt tcgccàcaaa ctadgcattt 480 ctcatggtag gccgttttgt aacaggà.ata ggtgttggtt atgcacttat gatcgcacct 540 gtttacactg cagaggtttc tcctgcttct tcaagaggat ttcttacctc ttttcctgag 600 gttttcatca atgcaggaat tttgcttgga tatatatcta accttgcatt ttcaagcctc 660 ccaactcatt tgagctggag gtttatgctc ggaatcgggg cgattccgag catatttttg 720 gctattggag tgcttgctat gcctgagtca ccgcggtggc ttgttatgca gggaaggctt 780' ggagatgcta agaaggtgct taatcgcata tctgactcgc ctgaggaggc tcaacttagg 840 ctcagtgaga ttaagcagac agcaggaatc ccagctgagt gtgatgaaga catctataag 900 gttgaaaaaa caaaaataaa atcagggaat gcagtttgga aagagctctt cttcaaccct 960 actcccgcag tgaggcgtgc agtgattgca ggtatcggaa ttcacttttt ccagcaagct 1020 tccggcatcg acgccgtggt tttatacagt ccaaggatct ttcagagtgc tggaatcaca 1080 aatgcacgta aacagttact tgcaacagta gctgtaggag ttgttaagac acttttcata 1140 ttagttgcta catttcaatt agacaagtât ggtagaaggc ctttactatt aacaagtgtt 1200 ggtggtatga tcatagccat cttaacctta gccatgtctt taactgttat tgatcactct 1260 catcacaaga ttacatgggc tatagccttg tgtataacca tggtttgtgc tgtcgttgcg 1320 tcgttttcga ttggtttagg accaattaca tgggtatata gttcagaggt tttcccctta 1380 aggttaaggg ctcaaggtac tagcatgggt gtggctgtta atagagttgt aagtggtgtt 1440 atttcaatat ttttcttgcc tttgtcacat aagattacaa caggtggtgc cttctttttg 1500 ttcggaggga ttgctattat tgcttggttc ttcttcttga cgtttcttcc tgagactaga 1560 gggcgtacac ttgagaatat gcatgagttg tttgaagatt ttagatggag ggagtcattt 1620 ccaggcaaca agtcaaataa tgatgagaat agcacaagaa aacaaagtaa tggtaatgac 1680 aagagtcaag tacaattggg agaaactact actagtagtg tacaagtata gttatgtacg 1740 gatgttatgt catgtatagc tgttcgactt ttaatgacga taattaatct caaatcgaac 1800 aagtttctaa gatgtgtgtg tataagatgt gcgtgatgta cgtacttgtt atacacatgt 1860 tgttcttaga atgtgatcct ctttattttc gcaaatacat tgtagcaaat taaagtaatc 1920 taattatagg ataccaaatg gttcaaaaaa caatgtcttt tgtgtgattt tgtatgatgc 1980 ttcatcattt gtcagtttac cctttttttg gtaatgaaga caaaataaat tcatgagttt 2040 agctttaaaa aaaagr 2056 <210> 4 <211> 1925 <212> ADN
<213> Beta vulgaris <400> 4 ctctttttct ctctcttatt ggtgagaaat aagtgagcca tgagtgaagg aactaataaa 60 gccatgtcag acccaccacc aacaactgca agcaaagtaa tagcagattt tgatccttta 120 aagaagcctc ctaagagaaa caagtttgct tttgcttgtg ctactttggc ttctatgact 180 tctgttttac ttggttatga cattggagta atgagtggtg caataatcta cctcaaagaa 240 gactggcaca ttagtgacac acaaatagga gttctagtcg gaatcttaaa catctactgc 300 ctcttcggct ctttcgcagc tggtagaaca tccgattgga tcggacgacg ttacactatc 360 gtgttagctg gtgcàatctt cttcgttggc gcactactca tgggtttcgc cacaaactac 420 gcatttctta tggtaggccg ttttgtaaca ggaataggtg ttggttatgc acttatgatc 480 gcacctgttt acactgcaga ggtttctcct gcttcttcaa gaggatttct tacctctttt 540 cctgaggttt tcatcaatgc aggaattttg cttggatata tatctaatct cgcattttca 600 agcctcccaa ctcatttgag ctggaggttt atgctcggaa tcggggcgat tccgagcata 660 tttttggcta ttggagtgct tgctatgcct gagtcaccga ggtggcttgt tatgcaggga 720 aggcttggag atgctaagaa ggtgcttaat cgaatatctg actcgcctga ggaggctcaa 780 cttaggctca gtgagattaa gcagacagca ggaatcccag ctgagtgtga tgaagacata 840 tataaggttg aaaaaacaaa gataaaatca.gggaatgcag tttggaaaga gctcttcttc 900 aaccctactc ccgcagtgag gcgtgcagtg attgcaggta tcggaattca ctttttccag 960 caagcttccg gcatcgacgc cgtggtttta tacagtccaa ggatctttca gagtgctgga 1020 atcacaaatg cacgtaaaca gttacttgca acagtagctg taggagttgt taagacactt 1080 ttcatattag ttgctacatt tcaattagac aagtatggta gaaggccttt actattaaca 1140 agtgttggtg gtatgatcat agccatctta accttagcca tgtctttaac tgttattgat 1200 cactctcatc acaagattac atgggctata gccttgtgta taaccatggt ttgtgctgtc 1260 gttgcgtcgt tttcgattgg tttaggacca attacatggg tatatagttc=agaggttttc 1320 cccttgaggt taagggctca aggtactagc atgggtgtgg ctgttaatag agttgtaagt 1380 ggtgttattt câatattttt cttgcctttg tcacataaga ttacaâcagg tggtgccttc 1440 tttttgttcg gagggattgc tattattact tggttcttct tcttgacgtt tcttcctgag 1500 actagagggc gtacacttga gaatatgcat gagttgtttgaagattttag atggagggag 1560 tcatttccag gcaacaagtc aaataatgat gagaatagta caagaaaaca aagcaatggt 1620 aatgacaaga gtcaagtaca attgggagaa actactacta gtactactgt tacaaatgac 1680 aatcactgag aaacaattgt tagtgtacaa gtatagttat gtacggatgt tatgtcatgt 1740 atagctgttc gacttttaat gataattaat cttaagtcga acaagcttct aagatgtgtg 1800 tgtataacat ggcgtgatgt acgcgcttgt tatacacatg ttgttcttâg aatgtgatcc 1860 tctttatttt cgcaaataca ttgtagcaaa ttaaagtaat ctaattatag gataccaaat 1920 ggaaa 1925 <210> 5 <211> 1715 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400> 5 tcattgtcca tccacaactt cattgtcttt gctcatagaa ttattcttct tgtttgcggt 60 gtagctcccg aagagagtct ccatctcctc tagaggtata ccacgtgtct ccgggaggaa 120 agtgaagaag aagacccatg cggcggcagc aactccggcg aatagaagga acgcaccgcc 180 gatggtgaga cctttagaaa gagataggaa tgtcattcca ataataccac tcattagtct 240 attcaacatc actcctaaac ttgccccttg ag.ctcttagc ctcacaggga atatctctga 300 gcagtagacc cacgtcacgg ggcctgcacc tattgagaat gttgccacaa aagtcagcac 360 cgtcgtaacg gcgagcccta tagcccactt gagtgtttgc ccggggttcc tgttgatcac 420 cgtgagacta gttccaagtg cggtcaagga aagaaacatt ccgcccatac tcgtaagcaa 480 caaggcacga cgtccgaacc gatccaccac acaagtccct accacgatga agagagtctt 540 gacaactccg acagcgaccg tagccaagag ctggtcattc ttggacttca gtccagcctt 600 tgagaagatt gtcggagagt aaagcacaac cgcatcaatt ccagaggctt gctgggcgâa 660 atgaatacca aggcatgcta tgaggatgtg tcgaacggac ggggttggtc gaacgagaag 720 gtccttccac acgccttttc cagcgctctt tttattcgga acgactataa catcgtctgt 780 catatcatcg gggattccaa ctgcgcgttt gatgtcatcg agcctagaga tagcttcttc 840 tttggtgttg gaggttttgt caaggacttt aaaagcatcc ccgagacgàc cctgaaggac 900 gagccaccga ggagactccg gcattgccaa cactccaatg gctaggaaca ccgagggaac 960 cgctcctaca cctaacatga acctccatcc gaggtgctcg ggaagcttgg agaagaagta 1020 attggatacg tatcccaaaa gtataccaat attgataaaa atctgcatac aaaaatcaca 1080 ttatcatcat caacctccgt tatcatttcc aatcatacat aaaaaaaaaa aaactttgga 1140 tcagttgaac ctcagggaaa gaggtaagga agcctcggga agaggcggga gcgacttcag 1200 cggtgtaaac aggcgcaatc atcatagcat aaccaacacc gataccggct acaaaacggc 1260 caaccattat gaaagggtag tttgtggcaa agcccattag tagggctccg caaaagaaga 1320 aggctcctgc caacactatt gtatatcgtc ttccgagcca atcagaagtt ctaccagctg 1380 cgccggaacc gacca:gagag tagatgttta gaattcccat aagaatctca agttgtacat 1440 cagacagttt caaatcgtct tttatgaaaa ttgaagctcc actcatcact ccaatgtctg 1500 taacatcccc aaacatgtaa gaatgattat ctaaatcgta aaaccaaacc aaatctgaat 1560 tgattgttaa tttaaaaaga agacgaaccg taaccaagga tgatagaagt catggaggct 1620 aagattgcac aagcaaaagc atatcggctt ctattccccc tcggtggctc tgactccgca 1680 atcacaacac cttgttcaac tcccgaggaa ttcat 1715 <210> 6 <211> 1722 <212> ADN
<213> Arabidopsîs thaliana <400> 6 atgagttcct caggagaaga acgaggtgtt gttgttgccg agtccgagcc gccaagaggg 60 aatagaagcc gatttgcttt tgcttgtgca atcttagcct ccatgacttc tatcatcctt 120 ggttatggtt ggtcttctaa tcattctcta acgatcaaat ttcagatttg gtttggttta 180 acggtttaga taatcatcct cacattttat ggatgttgca gatattggag tgatgagtgg 240 agctgcaatt ttcataaaag acgatttgaa gctgtcggac gtacaacttg..agattcttat 300 gggatttcta aatatctatt ctctgatcgg ttcaggagca gctggaagaa cttccgattg 360 gatcggaaga cgatatacca tagtgttggc aggattcttc ttcttttgtg ggccctact 420 aatgggtttt gccactaact accctttcat tatggtcggc cgttttgtag ccggtatcgg 480 tgtcggttac gctatgatga ttgc.gcctgt ttataccacg; gaagtcgctc cagcctcttc 540 tcgaggcttc cttagctctt tccctgàggt tcaatagatc'caaattttac tagtttatat 600 gatataaaaa aaaagaaaat taggtttata ttaatgtgat atgattttat atgcatgcag 660 atatttatca acattggtat actattggga tacgtatcca attacttctt cgccaagctt 720 ccagagcaca ttggatggag gttcatgtta ggtattggag ctgtgccctc agtgtttcta 780 gccattggag tgttggcaat gcccgagtct ccacggtggc tcgtcatgca"gggtcgtcta 840 ggggaçgctt ttaaagtcct tgacaaaacc tcaaacacca aagaagaagc catctcaagg 900 ctcaatgaca.tcaaacgcgc agttggaatc cccgatgata tgacagacga tgttatagtc 960 gttccgaata aaaagagcgc tggaaaaggc gtgtggaagg accttctcgt tcgaccaacc 1020 ccgtccgttc gacacatcct catagcatgc cttggtatcc atttctccca gcaagcctcc 1080 ggaattgatg ctgtcgtgct ttactctccg accatcttct caagggctgg actgaagtcc 1140 aagaatgacc agctcttggc tacggtcgct gtcggagttg tcaagactct cttcatcgta 1200 gtaggaactt gtttggtgga ccggtttgga cgtcgtgcct tgttgcttac gagtatgggt 1260 ggaatgtttt tttccttgac cgcccttgga actagtctca cggtgatcga caggaaçccc 1320 gggcaaacac tcaagtgggc tatagggctc gccgttacga cggtgatgac ttttgtcgca 1380 acattctcat taggtgcagg ccccgtgacg tgggtctacg cctcagagat attccccgtg 1440 aggctaagag cgcaaggagc aagtttggga gtgatgttga atagactaat gagtggtatt 1500 ataggaatga cattcctatc tctttctaag ggtctcacca tcggtggtgc attccttctc 1560 ttcgccggag ttgcggttgc cgcgtgggtc ttcttcttca ctttcctccc ggagacacgt 1620 ggtgtgcctt tagaagaaat agagagtctc ttcgggagct acagcgcaaa caaaaagaac 1680 aatgttatga gcaaagggaa acaagtagtt gatgaacaat ga 1722 <210> 7 <211> 1804 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400> 7 tagacttagg tgcaaaagga agctgtcata tcggtggaaa tgtttcaact aatgctggtg 60 gtttgcgtct aatccgttat ggctcacttc atggaactgt attgggtaat gacttacagt 120 tttagttact ttcgatccat ctgaaaacat ttggatttca tgttctcatc atttttattt 180 tcttcacctc aggtctagaa gctgtcacag caaatggcaa cgtgcttgac atgcttggaa 240 ctttacgcaa agacaatact gggtacgact taaaacattt gtttattggt aggtattata 300 ttggcttgtg cttgtacaat gatttcaagt atcacttcat cagcaaaata gactaaatca 360 tcttgatttt ttctctttac tggtttccac aggtagtgaa ggatcacttg gtattgtaac 420 taaagtttct attctcacac aaccaaaatt gtcttctgta aatttagcct tcattgcttg 480 caaagattat ctcagctgcc aggtttaata caatttcttt tgtactcctg taattgaatt 540 ctatctacag aggagatagt gcgtgaactg ttatctctca ttgggtttcc tttgtttgca 600 gaaacttctt gttgaagcaa agagaaatct tggagagata ctctcggctt tcgagtttct 660 tgataacaat tccatggatt tggtaagctt ttaggaagtt actaatagga actgtttgca 720 ttcctgacac tttatcttgt gcacaaggct ttgattttgc taaacccttt ctgtttttaa 780 ttcattcaac aggtactgaa ccacctagac ggtgtacgta atccagtttc ctcttcggag 840 aacttttata ttctgatcga gacaacaggg agtgatgaaa ctaatgaca'g gtattgagaa 900 ttttctggtc tttctgtgac tttcacaatt ttccagtacc atttaaatga attctaagta 960 tttcagatcc cttgagagag tttttgtctg attcaaaaac taatgcaggg agaagcttga 1020 agctttcctg ttgaagtcac tggaaaaagg tttagtttct gatggtgtaa tcgctcaaga 1080=
cattaaccag gcatcctcat tttggcgcat acgagaggta aaacacttga gagttatttc 1140 ctctgaaaaa gcttgatggt acacgacgaa taaagtcata atcataaccc tgcagggtat 1200 aacagaggcg ttacagaaag caggagctgt ttacaagtat gacttatagt taccggttga 1260 agaaatttac aatattgtta acgatcttcg agggagatta ggtaagatat atatcaatac 1320 attgtctcct aattatttga aaccgaaaga ttcaatgaaa actgcaacca aatatgcaat 1380 gcttcaggtg acttagcaaa tgttatggga tatggtcacc ttggagacgg aaatctacat 1440 ttaaacatct cagccgcgga atataacgat aaggtaaaat tctgatatcc atatgaaaca 1500 ttccaagatg ttcaagtgat cattcattcà ctcttttctt gcagctttta ggtttgatag 1560 agccttatgt çtatgagtgg acatcaaagc accgtggaag catcagtgcg gaacatggat 1620 taggtgtaat gaaagctaat gaaatcttct acagcaaatc acccgaaact gtaagttaac 1680 aacaaacaac gtatggaaac tatgtataga actatcgtgt cactctattc=.ttaccggaat 1740 ataatattat gcaggttgca ttaatggctt ccattaaaaa gttgctggac ccaaagggaa 1800 ttct 1804 <210> 8 <211> 1662 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400> 8 ttatgagaaa cccccaatag agatggtttt agtttgaatc tcaagtccgt cacgatcacc 60 acgaggaccc ccaccaccaa aaagcttctc catctcctcc aatggcaatc ctttcgtctc 120 cggcaaaata aagaagaaga accaccatgc cgcca.ccgct attccggcga atacgaa.gaa 180 cacgccccct gtcgtgatcg ccttcgtcat cgacagaaaa ctcattgaga ccgtcgcgtt 240 catgatccta ttaaccgcaa cacctatact cgctccctga gccctaagtc tcaacgggaa 300 tatctcggag ctgtacaccc atgtgatagg tccaagccct atggagaaaa aagctacaaa 360 tgcatacgta ga,gacgatgc ttaaactcaa tgcccacgct aaccgcccaa atcgctgaac 420 catcgtgaga ctaaccgcta aactggtcaa tgcgaagacc atcccacccg tactggtcaa 480 caggagcttt ctacgaccta ccttgtcgag caagaaagtg gctattâtta tgaaaaaggc 540
8 cttagttaaa cctacaccga ccgtggctag taagagcttg tctttcgaaa caactccggc 600 tttcttgaaa attctcgggc tgtacaacac gacggcctca atccccgtcg catgctcgaa 660 aaagtgtatc ccaacggccg ctatcaagat caaacgcacc gcaggtcgcg gttttatcac 720 caactccctc caaacacttt taccgtgatt cttcttctta acgccgccac caacttcttt 780 tatctctgtc acatctactt ccgcagcggt taagatgtct ctgaaccgtt cttcagcttc 840 ttcttccgta ttggatacca aaaccattat tttcttggct tcttctaacc taccttgcat 900 cacaagccac ctcggcgact cgggcattct tgtaatccca aaagccaata tcaaagacgg 960 gaacgctgcg attccaagca tcaatctcca tccaagtttc aacgtcagtt tcccaaaaca 1020 gtaattcgag acatagccta gtaaaatccc aagactaata caaagctcag gtagagaagt 1080 gagaaagcct ctatgtgacg cagaggatat ctcggcagag taaaccggag ctatcatgag 1140 agcaaaccct acaccaactc cggcaataca tcgtccgacc atcaaaacag gatagtttgg 1200 gccgtaaccc ataagaactg agcccactaa gaatatcacg gcggagagag ctatggtgta 1260 acgtcggccg atgacgtcag acgttttccc cgccgttagt gatccgacga gtgcacaaag 1320 attcaagatt ccggccaaaa cttcaatctg agtgtcgttt atttttagat catctcttat 1380 aaatatctga gctccgctca taactcccgt atctaaggac aacacaccat tacaaaaaaa 1440 aaaatattcg ttaatataaa atcattaata taattccatt gaatatatct ttatatgata 1500 tatgtagaaa acttttgttt gatatgtaga gaatgttagt atgttaccat atccaaagat 1560 gatagaaatg atggaagcaa caatggcaca cccgaaagcg aacttgttca tatgagggtt 1620 tggatccgaa ccgggaaaat tatgaccatc agcatgaacc at 1662 <210> 9 <211> 1690 <212> ADN
<213> Arabidopsis thaliana <400> 9 tcaaâactcc tgttccttgc gcacaagacg ctcagcatct ccaagctcaa cttcaccgtc 60 ttttctttcc agcccaccct gaaacatcaa ctctatctgc tccagtgact-tcccgcttgt 120 ctcggggact agcacataca cgaagataac tgagagtgca gacacgaggg agaaaacgaa 180 gaaggttcct ccaacagtga tggcacgtga cacagagagg aaggacatgg ccaccagacc 240 gctgcacacc ctgttcccaa ccgccccaag cgcagâtgcc tgggctctta atcgtaatgg 300 aaagatctct gatgtcaaga cccagcaaac aggtcccatt cctatggaga agaaggcaac 360 gtttccacaa acaaagagaa gcgccaaggt tatcccaagc gttccttggc cgaggaatgt 420 gagcgtaaag cttagacaaa agagacacag agtcattcct attgtgctca cataaagcag 480 cggtttccgg ccaacactat caatcaggaa ggtggcaaat agtatgaaca ctgttttcgt 540 gacaccaaca gcgacagttg cagcgagcag tttggtctcg tcttgtatcc cagcctcttt 600 caggatctct ggactatagt agactgtggc gtcaattcct gtgatctgct ggaaacactg 660 gattccaaat ccaacaatca gcattttccg tacaacagga gatgggctaa gaagctcacg 720 ccacacgggc' cggtcctcgc tgccttctgt atgtgcagcc gccagttgta tctctgcaag 780 ccgctcttcc gcttcgtcat ctcgctcatt cgttttcatg agcacctctc gtgcactgtc 840 cactcggcct ttcatcacca gccacctcgg cgactcaggg atcacacaca gcgcaaatcc 900 tatgaacacc gaaggaagaa tcccaactgc aagcatgatc ctccagctga.tatgcacgga 960 aagccccgag aaagcgtagt tcgaaacata gcccagcaag atccctagat ttatgaagat 1020 ctcagggaac gaagtgaaaa atcctctagc tacggtgggg gatatctcgg cgatgtagac 1080 aggagcgatc atgacaccaa gcccaatccc aatgccggct aaagttctcc ctatcatcaa 1140 aacctcgaaa gacggagcga cagccatcac ggcagcacca gtctggaaga cgagagcagc 1200 caaggccatg gtccattttc taccgataga gtcagaggtt.ctgccgccgg ctaagctgcc 1260 aaagagtgag atgatgctaa ggctaccaat gagcacttcc gtctgcacct ccgttatttt 1320 gagatcctgc tgtatgaaca acaccgcacc gctcattacc ccaacatctg=acaaatacca 1380 aaaacagagc acacatacct ttttgtaagt caacaaagta aagaagaaga agaagaatcc 1440 gattatataa gtaaaaccga ccgtagccga gaagaacatt gttcaaggat gcaaaaaagg 1500 cacaagccat aacgtatttt ctggttctac tgtttctagc ctctgcttca cgatgattct 1560 gcgattcctc cgcgtcggag tccattctct gatacttatt cttcttattt'ccgacagaga 1620 ccgccggaaa acccgagcca ccgccattac caacctccgg aagattcttc atcatctccc 1680 tccgccgagg 1690 <210> 10 <211> 1518 <212> ADN
9 <213> Bacillus subtilis <400> 10 aagggagtca tctttatgaa aaagcagtca aatatatggc tttatttttt cggagctctt 60 ggaggcgcgt tatatggcta tgataccgga gtgatttccg gagctatttt atttatgaaa 120 aaggagttag gcttaaacgc gtttacagaa ggtcttgttg tcagctcctt gctggttggg 180 gcgatattgg gctcaggagc ggccggcaag ctgactgacc gtttcggaag aaaaaaagca 240 aatatggcag ccgcgctgct gttttgtata ggcggtcttg gtgtggcact ggccccaaat 300 acaggagtca tggtgctgtt tcgcatcatt ttgggacttg cagtcggaac atcgacgaca 360 atcgtacccc tttatttatc tgaactggcg ccaaaacata aacgcggggc gctgtcatca 420 ctgaatcagc tgatgatcac ggtcggcatc cttctttctt acattttcaa ttacatattt 480 gccgatgccg aagcgtggcg ctggatgctt ggattggctg ctgtgccgtc attgctcttg 540 cttattggca ttttgtttat gccggagagc ccgcgctggc tgttcacgaa tggcgaagaa 600 agcaaagcga agaaaattct tgaaaaattg cgtggcacaa aagatattga tcaggaaata 660 catgatataa aagaagcgga aaagcaggat gaaggcggtc tgaaggagct gttcgatcca 720 tgggtgcgcc cagcgcttat tgcaggtttg ggactcgctt ttttgcagca atttatcgga 780 accaaaacga tcatctacta tgcgccaaag acctttacaa acgtcggatt cggaaactcc 840 gcttcgattt taggcacggt cggaatcggc acagtcaatg ttctcatgac attagtagcg 900 attaaaatca tcgacaagat tggaagaaag ccgttactgc tattcggaaa tgcgggcatg 960 gtgatcagct tgatcgttct cgctttagta aatctctttt tcaataacac tccggctgcc 1020 tcatggacga ccgtcatttg tttaggcgtg tttatcgttg tctttgcggt cagctgggga 1080 ccggttgtgt gggtgatgct tcctgaattg ttcccgcttc acgtcagagg aatcgggacc 1140 ggtgtttcga ccttaatgtt gcacgttggg acactgattg tttcattaac ctatccaata 1200 ttaatggaag cgatcggaat cagttattta ttcctgattt atgccgcgat cggtatcatg 1260 gcgttcttat ttgtccgatt taaagtgaca gagacaaagg gaagaagcct tgaagaaatt 1320 gagcaggatt.tacgggacaa aaacggacag ggaggagcgg ccggaaaaca gcagactgtc 1380 ggaacataaa aaacgttgcg cgatcatgcg cacccttttg attgcttact ttcccaccgt 1440 gccaaagtta atgattttaa aagaaatatc gtacttaaaa tcagtctcag aaaatatttc 1500 atcccaatgc ccttttac 1518 <210> 23 <211> 75 <212> ADN.
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaT1 d'Apium graveolens <220>
<221>' CDS
<222> (1) (75) <400> 23 ' gct tgt gct'ctt tta gct tcc atg aat tcc atc tta ctc ggc tat gac 48 Ala Cys Ala Leu Leu Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp acc gga gtg ttg agt gga gca tca ata .75 Thr Gly Val Leu Ser Gly Ala Ser Ife <210> 11 <211> 25 <212> PRT.
<213> Séquence artificielle .
<223>.Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 11 Ala Cys Ala Leu Leu Ala Ser Met Asn Ser Ile Leu Leu Gly Tyr Asp Thr Gly Val Leu Ser Gly Ala Ser Ile <210> 24 <211> 63 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de -la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) (63) <400> 24 caa atc gaa ata atc atc gga atc atc aac atc tac tct ctt Ott ggt 48 Gln Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile Ile Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Gly tcg gcc ata gcc gga 63 Ser Ala Ile Ala Gly <210> 12 <211> 21 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 12 Gln Ile Glu Ile Ile Ile Gly Ile Ile Asn Ile Tyr Ser Leu Leu Gly 1 5 10 e 15 Ser Ala Ile Ala Gly <210> 25 <211> 60 <212> ADN
<2.13> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTi d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1)'. . (60) <400> 25 tac acc atg gta cta gct ggt atc ata ttt ttt cta gga gcc att ttc 48 Tyr Thr Met Val Leu Ala Gly Ile Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe atg ggg ctt gct 60 Met Gly Leu Ala <210> 13 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens, <400> 13 Tyr Thr Met Val Leu Ala Gly Ife Ile Phe Phe Leu Gly Ala Ile Phe Met Gly Leu Ala <210> 26 <211> 75 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) (75) <400> 26 =
ttt ctc atg ttt ggt cgc ttt gtt gct gga att ggt gtc ggt tat gcc 48 Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala atg atg atc gCt CCC gtC tac act gCC 75 Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala <210> 14 <211> 25 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 14 Phe Leu Met Phe Gly Arg Phe Val Ala Gly Ile Gly Val Gly Tyr Ala Met Met Ile Ala Pro Val Tyr Thr Ala <210> 27 <211> 75 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <220>.
<221> CDS
<222> (1).. (75) <400> 27 ttc ctc act tct ttt cct gag gtt ttc att'aat tct ggt gtg ttg ctc 48 Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile Asn Ser Gly Val Leu Leu ggg tat gta tcc aac ttt gca ttt gcc 75 Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala Phe Ala 20= 25 <210> 15 <211> 25 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquenc.e artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaT1 d'Apium graveolens <400> 15 Phe Leu Thr Ser Phe Pro Glu Val Phe Ile ASn Ser Gly Val Leu Leu Gly Tyr Val Ser Asn Phe Ala Phe Ala <210> 28 <211>- 60 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (60) <400> 28 att atg ctg gga att gga gca ttt cct tca gtt gcc ttg gcc ata att 48 Ile Met Leu Gly Ile Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile gtg tta tat atg 60 Val Leu Tyr Met <210> 16 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant. pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 16 11e Met Leu Gly Ile Gly Ala Phe Pro Ser Val Ala Leu Ala Ile Ile Val Leu Tyr Met <210> 29 <211> 66 <212>.ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) (66) <400> 29 gct gca att acg ggt att ggt att cat ttc ttc caa cag gct tgt ggt 48 Ala Ala Ile Thr Gly Ile Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Cys Gly att gat gct gtt gtt tta 66 Ile Asp Ala Val Val Leu <210> 17 <211> 22 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 17 Ala Ala Ile Thr Gly Ile Gly Ile His Phe Phe Gln Gln Ala Cys Gly Ife Asp Ala Val Val Leu <210> 30 <211> 60 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens:

<220>
<221> CDS
<222> (1) .. (60) <400> 30 ctc ctt gcg aca att gct gtt gga gtc tgc aaa aca gtc ttt att ctg 48 Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val Phe Ile Leu ata tca acg ttt 60 11e Ser Thr Phe <210> 18 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de'la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 18 Leu Leu Ala Thr Ile Ala Val Gly Val Cys Lys Thr Val Phe,I1e Leu I1e Ser Thr Phe <210> 31 <211> 66 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTI d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (66) <400> 31 ctg atg cta aca agt atg ggg ggt atg gtt att gCt cta ttt gta ctg 48 Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu gca ggc t.ca ttg acg gtt 66 Ala Gly Ser Leu Thr Val <210> 19 <211> 22 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant'pour la protéine AgMaTI d'Apium graveolens <400> 19 Leu Met Leu Thr Ser Met Gly Gly Met Val Ile Ala Leu Phe Val Leu 1 5 10 15, Ala Gly Ser Leu Thr Val <210> 32 <211> 78 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence=artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTI d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (78) <400> 32 ggt ggt,ttg gca ata ttt aca gtg tat gct ttt gtg tcg ata ttt tca 48 Gly Gly Leu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe Ser agt ggc atg ggt cca att gct tgg gtc tat 78 Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Trp Val Tyr <210> 20 <211> 26 <212> PRT

<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaT1 d'Apium graveolens <400> 20 Gly Gly Leu Ala Ile Phe Thr Val Tyr Ala Phe Val Ser Ile Phe Ser Ser Gly Met Gly Pro Ile Ala Trp Val Tyr <210> 33 <211> 63 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>
<223> Description de la séquence artificielle: fragment de 'la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaT1 d'Apium graveolens' <220>
<221> CDS
<222> (1) = = (63) <400> 33 tgt agt atc gga gtg gca gtt aac cgt ggc atg agt ggc ata att gga 48 Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn Arg Gly Met Ser.Gly Ile Ile Gly atg aca ttt ata tcg 63 Met Thr Phe Ile Ser <210> 21 <211> 21 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <400> 21 Cys Ser Ile Gly Val Ala Val Asn Arg Gly met Ser Gly Ile Ile Gly Met Thr Phe Ile Ser <210> 34 <211> 60 <212> ADN
<213> Séquence artificielle <220>

<223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaTl d'Apium graveolens <220>
<221> CDS
<222> (1) .. (60) <400> 34 gca ttc c.tt tta ttt gct gtg gtt gca tct atc gga tgg gtc ttt atg 48 Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser 11e Gly Trp Val Phe Met tac aca atg ttc 60 Tyr Thr Met Phe <210> 22 <211> 20 <212> PRT
<213> Séquence artificielle <223> Description de la séquence artificielle: fragment de la séquence nucléotidique codant pour la protéine AgMaT1 d'Apium graveolens <400> 22 Ala Phe Leu Leu Phe Ala Val Val Ala Ser 11e Gly Trp Val Phe Met Tyr Thr Met Phe

Claims (11)

REVENDICATIONS
1. Utilisation de la SEQ ID NO : 1 codant pour un transporteur de SEQ ID
NO : 2 de mannitol, chez les plantes et les champignons, pour la préparation de plantes transgéniques.
2. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO : 2.
3. Polynucléotide qui comprend ou est constituée par :
- un polynucleotide de séquence SEQ ID NO : 1;

- un polynucléotide codant pour une protéine de séquence SEQ ID NO : 2, comprenant ou constitué d'une séquence homologue à la séquence SEQ ID NO : 1 par dégénérescence du code génétique ; ou - un polynucléotide complémentaire à la séquence SEQ ID NO : 1.
4. Vecteur recombinant, le vecteur étant un plasmide, un cosmide, un phage ou de l'ADN de virus, contenant un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3.
5. Vecteur recombinant selon la revendication 4, contenant les éléments nécessaires à l'expression dans une cellule hôte d'une protéine codée par un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3, insérés dans ledit vecteur.
6. Cellule hôte, ladite cellule étant une bactérie, un virus, une levure, un champignon, une plante ou une cellule de mammifère, et étant transformée, à
l'aide d'un vecteur recombinant tel que défini dans la revendication 4 ou 5.
7. Polynucléotide antisens ou ARN antisens complémentaire à un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3.
8. Cellule de plante contenant dans son génome un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3.
9. Procédé d'obtention de plantes génétiquement modifiées avec au moins une séquence nucléotidique d'intérêt qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec un vecteur contenant une séquence d'insertion, ladite séquence d'insertion comprenant la séquence nucléotidique d'intérêt et un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3, et - la mise en culture des cellules ainsi transformées sur un milieu contenant du mannitol comme unique source de carbone, pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques contenant ladite séquence nucléotidique d'intérêt.
10. Procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes aux pathogènes, qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3, ledit polynucléotide étant placé sous contrôle d'un promoteur ubiquiste inductible CaMV 35S ou d'un promoteur inductible en réponse à l'attaque dudit pathogène, et - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
11. Procédé d'obtention de plantes transgéniques résistantes au stress salin, qui comprend les étapes suivantes :
- la transformation de cellules végétales avec un polynucléotide tel que défini dans la revendication 3, et - la mise en culture des cellules ainsi transformées pour l'obtention de plantes ou de fragments de plantes transgéniques.
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