CA2407504A1

CA2407504A1 - Medicament contenant des substances polysaccharidiques pour l'activation de l'apoptose

Info

Publication number: CA2407504A1
Application number: CA002407504A
Authority: CA
Inventors: Jean-Claude Yvin; Andre Patrick Arrigo
Original assignee: Individual
Current assignee: Laboratoires Goemar SA
Priority date: 2000-04-27
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2001-11-01
Also published as: WO2001080807A3; FR2808687B1; US20030166609A1; AU2001256441A1; WO2001080807A2; FR2808687A1; EP1276484A2

Abstract

L'invention porte sur l'utilisation d'au moins une substance polysaccharidiq ue présentant au moins cinq unités saccharidiques et comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupemen ts sulfate, acétate, phosphate, phosphonate, pour la préparation d'un médicamen t pour l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs d'apoptose à la surface cellulaire, lesdits récepteurs étant ceux du groupe comprenant les récepteurs Fas, TNF, TRAIL, CD40, de préférence Fas et TNF. L es Pathologies traitees appartiennent au groupe des maladies auto-immunes des cancers et de l'asthme, et la substance polysaccharidique est de préférence du dextrane sufaté ou de l'iotacarraghénane.

Description

MEDICAMENT CONTENANT DES SUBSTANCES POLYSACCHARTDIQUES
POUR L'ACTIVATION DE L'APOPTOSE
L'invention a pour objet un médicament à base de certaines substances polysaccharidiques pour le traitement des dérèglements et plus particulièrement pour l'activation de l'apoptose.
Elle consiste en l'utilisation de ces substances polysaccharidiques pour la préparation d'un médicament pour l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs apoptotiques à la surface des cellules dont on souhaite induire l'apoptose.
On rappelle que le terme apoptose désigne la mort cellulaire programmée ou suicide cellulaire.
Cette mort correspond à une auto-élimination des cellules suivant un programme défini.
Elle se traduit tout d'abord par des renflements au niveau de la membrane plasmatique, renflements qui sont accompagnés d'un changement structurel de la membrane, puis par une perte de volume de la cellule qui semble se contracter et s'effondrer sur elle-même.
Le noyau se condense et l'ADN est clivé en petits morceaux (Raff, Nature, 356, 397, 1992; Bortner et al., "Trends in Cell. Biol." 5, 21, 1995).
In vivo, la cellule en apoptose est reconnue par les macrophages qui vont la phagocyter et l'éliminer en l'absence de tout processus inflammatoire.
In vivo toujours, l'apoptose est largement utilisée par les organismes vivants pour contrôler les populations cellulaires, en particulier les lymphocytes suite à leur activation.
Par ailleurs, l'apoptose joue, au cours du développement des organismes, un rôle primordial dans l'élimination des tissus embryonnâires non nécessaires (queue du lézard, ébauche des organes génitaux d'un sexe

2 ou de l'autre), et dans la sculpture de l'organisme (élimination des palmures interdigitales entre les futurs doigts et autres).
Certains composés présents dans les organismes vivants induisent spécifiquement un phénomène apoptotique.
Ainsi, par exemple chez les mammifères, la liaison du ligand Fas au récepteur membranaire Fas, également désigné par APO-1 ou CD95, induit spécifiquement une apoptose ; cette apoptose est utilisée par l'organisme vivant pour contrôler les populations de lymphocytes, notamment de lymphocytes T.
Les susdits récepteur et ligand représentent un système physiologique extrêmement intéressant qui est impliqué dans l'élimination spécifique de cellules qui ne IS sont plus désirées dans l'organisme.
On peut citer en particulier l'élimination cellulaire au cours de la maturation et de l'activation des lymphocytes T. En fait, le système Fas, c'est-à-dire Fas ligand/Fas récepteur, joue un rôle primordial dans "°l'homéostasie du système immunitaire.
Le récepteur Fas est un membre d'une famille de protéines qui agissent comme récepteurs à la surface des cellules et qui comprennent également les récepteurs TNF
(facteur de nécrose tumorale), TRAIL (Tumor Related Apoptosis Induced Ligand), CD40 et NGF (facteur de croissance des nerfs).
Le récepteur Fas est exprimé dans de nombreuses cellules ; il s'accumulerait au niveau de l'appareil de Golgi.
Le mécanisme par lequel le système Fas induit la mort cellulaire est inconnu mais fait appel à l'activation des protéases connues sous l'appellation ICE-like ("interleukine-1 béta-converting enzyme" en anglais) ou caspases.

3 On peut noter que le ligand Fas peut être sécrété
par les cellules pour induire leur propre suicide ; mais étant donné que ce ligand se retrouve aussi à la surface de cellules activatrices, celles-ci vont de ce fait 5' induire le suicide de cellules cibles par simple contact.
Une fois activé, le récepteur Fas interagit avec de nombreuses protéines intracellulaires pour transmettre le signal déclenchant l'apoptose.
In vitro, il existe d'autres moyens pour induire une apoptose, par exemple en inhibant l'activité de certaines kinases, et en particulier la kinase C; dans ce cas, on peut avoir recours à la staurosporine.
Ce produit est trés efficace pour induire la mort des cellules par apoptose.
I1 est néanmoins à remarquer que la transduction des signaux induits par la staurosporine est différente de celle faisant intervenir le récepteur Fas.
Toutefois, si les moyens d'activer l'apoptose sont différents, l'exécution du programme de mort induit par ces deux modes d'activation est équivalente et caractérisée par une activation de la cascade des caspases et un déréglement de la mitochondrie qui relâche des composés (par exemple le cytochrome C) qui vont promouvoir la destruction programmée de la cellule. Ce phénomène est énergie-dépendant mais ne requiert pas la synthèse de nouvelles protéines. En fait, tout est prêt dans une cellule pour assurer sa propre destruction.
In vivo, la régulation du phénomène apoptotique a une importance considérable.
En effet, de nombreuses pathologies sont associées à son dérèglement, en particulier à sa déficience.
On peut citer, par exemple, le cas des maladies auto-immunes dans lesquelles l'apoptose est déficiente et celui de l'accumulation de cellules cancéreuses dont

4 l'apoptose semblerait dépendre du système Fas("Green", Science, vo1.278, 1246, 1997).
Il est connu que les récepteurs apoptotiques sont pour une partie présents à la surface des cellules et pour une autre partie situés à l'intérieur des cellules ; il est également connu que seuls les récepteurs apoptotiques présents à la surface cellulaire permettent de déclencher l'apoptose, les récepteurs situés à l'intérieur des cellules n'ayant pas d'activité apoptotique.
Et la Société Demanderesse a eu le mérite de trouver que les substances polysaccharidiques présentant au moins cinq unités saccharidiques et comportant sur au moins certains de Leurs motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate étaient propres à
induire une augmentation du nombre de récepteurs apoptotiques à la surface des cellules dont l'apoptose doit être activée.
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une substance polysaccharidique présentant ~ au moins cinq unités saccharidiques et comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate, pour 1a préparation d'un médicament pour l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre des récepteurs d'apoptose à la surface cellulaire, lesdits récepteurs étant ceux du groupe comprenant les. récepteurs Fas, TNF, TRAIL, CD40, de préférence Fas.
Selon un mode de réalisation avantageux, la substance polysaccharidique est choisie dans le groupe comprenant:
- les oligosaccharides dérivés par voie enzymatique ou chimique des polymères du groupe comprenant les ~3 1-3 glucans comportant éventuellement des ramifications (3 1-6, et comportant sur au moins . certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative

5 choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate, - les oligosaccharides dérivés par voie enzymatique ou chimique des galactanes sulfatés, notamment les IO carraghénanes, Ies agars et les porphyranes.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la substance polysaccharidique répond à la formule:
Gluc a1

6 m Giuc -- ~ -~ Gluc ~ Gluc dans laquelle Gluc représente le glucose, n représente un nombre entier de 2 à 50, de préférence de 5 à 10 et dans laquelle le nombre de branchements varie de 0 à 3 par unité de répétition, et comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la substance polysaccharidique est un disaccharide de répétition répondant à la formule:

7 PCT/FRO1/01323 Gal ~ Gal ~ Gal (Ils dans laquelle Gal représente le galactose et n représente un nombre entier de 2 à 50, de préférence de 2 à 20, au moins certains des disaccharides de répétition de formule (II) pouvant comporter un ou plusieurs groupes sulfate.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, la substance polysaccharidique est un dextrane comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate, de préférence un dextrane sulfaté, et avantageusement un dextrane sulfaté commercialisé par la Société SIGMA.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la substance polysaccharidique est un polysaccharide naturel du type iotacarraghénane extrait d'algues rouges et commercialisé par la société HERCULES qui présente la formule ~ GAL - ~ 1 3 , 6 anhydro GAL ~ ( I I I ) ' 4 n dans laquelle .
- GAL représente le galactose , - 3,6 anhydro GAL représente le 3,6 anhydrogalactose lié
par une liaison (3 1 -~4, et - n représente un nombre entier de 2 à 300, de préférence de 2 à 200, les disaccharides de répétition pouvant porter 2 esters sulfates.

Plus particulièrement, l'inventïon vise l'utilisation d'une des susdites substances polysaccharïdiques pour la fabrication d'un médicament pour l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs apoptotiques à la surface cellulaire dans le traitement des maladies appartenant au groupe des cancers, des maladies auto-immunes et de l'asthme.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention est relative à l'utïlisation des susdites substances polysaccharidiques pour la préparation d'un médicament se présentant sous la forme d'un aérosol, notamment pour le traitement de l'asthme.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'invention est relative à
l'utilisation d'une des susdites substances polysaccharidiques en combinaison avec un anticorps antirécepteur apoptotique pour la préparation d'un médicament pour l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs apoptotiques à la surface cellulaire.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet l'utilisation des susdits polysaccharides pour la préparation d'un médicament auquel on fait comporter des adjuvants choisis en fonction du mode d'administration et de la posologie retenus.
En particulier, notamment dans le cas du traitement de l'asthme, les adjuvants sont choisis parmi ceux qui permettent d'obtenir un médicament susceptible d'être administré par inhalation.
Dans le cas d' une apoptose qui est induite par le rayonnement ultra-violet (W A et B), qui est dépendante du récepteur Fas comme décrit dans Aragane et al. in J.
Cell Biol 140, 171-182(1998), Kulms et al. pros. Natl.
Acad. Sci. USA 96,7974=7979 (1999), Schwarz et al. J.
ïmmunol. 160,4262-4270 (1998)), les adjuvants sont choisis

8 parmi ceux qui permettent d'obtenir un médicament pour application topique pouvant par exemple être incorporé
dans une pommade.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, 'S la substance polysaccharidique est mise en ouvre sous la forme d'une solution physiologique d'une concentration de 0,005 mg/ml à 0,5 mg/ml, de préférence de 0,01 à 0,2 mg/ml et plus préférentiellement encore de 0,02 mglml.
Il s'ensuit que le médicament obtenu grâce à l'utilisation conforme à l'invention des susdites substances polysaccharidiques se présente généralement sous la forme d'une solution destinée à être administrée sous forme externe pour application topique (pommade), sous forme d'aérosol ou sous forme injectable.
L'invention sera encore mieux comprise à l'aide du complément de description qui suit et des exemples qui ne sont nullement limitatifs mais correspondent à des modes de réalisation avantageux.
Dans les expériences qui vont être décrites ci après, on a travaillé sur des cultures cellulaires dans lesquelles on a déclenché un processus apoptotique en ayant recours au système Fas; dans le cadre de ces expériences, on a déterminé qualitativement à la surface cellulaire l'augmentation du nombre de récepteurs Fas ou TNF obtenue avec les substances polysaccharidiques définies plus haut.
Toujours dans le cadre de ces expériences, on a déterminé, d'une part, les doses de substances polysaccharidiques devant être mises en ouvre dans le traitement des maladies à l'aide des médicaments obtenus en utilisant les susdites substances polysaccharidiques et, d'autre part, la durée d'activité de ces substances polysaccharidiques, autrement dit la durée de l'effet recherché à savoir l'augmentation du nombre de récepteurs

9 apoptotiques à la surface des cellules dont on souhaite activer l'apoptose via le ligand Fas endogène (de l'hôte).

S La substance étudiée est le sulfate de dextrane.
On a travaillé sur une culture de cellules humaines immortalisées constituées de lymphocytes T (type Jurkat ) .
Le milieu utilisé pour la culturé des cellules de type Jurkat est celui commercialisê par la Société Life Technologies sous l'appellation « RPMI 1640 Medium » ; ce milieu est décrit par Moore et al. dans la publication « A.M.A.~» 199, 519 (1967).
Dans 5 ml de ce milieu on met en suspension 106 lymphocytes T de type Jurkat. La culture a été effectuée dans un incubateur à une température de 37°C et dans une atmosphère contenant 5% de CO~.
Après une incubation de 24 heures, les cellules se sont multipliées jusqu'à atteindre le nombre de 2.106 cellules.
On recueille ces cellules par centrifugation, on les lave dans un tampon PBS isotonique. On procède alors à
une nouvelle incubation de ces 2.106 cellules dans 1 ml du milieu mentionné ci-dessus à 4°C et dans une atmosphère contenant 5~ de CO2, pendant 45 minutes en présence d'un anti-récepteur Fas, vendu sous le numéro de catalogue 05-201 par Euromédex, dilué à 1/50 dans PBS contenant 1% de sérum albumine de bbuf (BSA).
A la fin de cette incubation, on recueille les cellules et on les lave avec le tampon PBS isotonique. On procède à une nouvelle incubation des cellules après lavage, pendant 45 minutes à 4°C en présence d'un anticorps reconnaissant les immunoglobulines (IgG) de hamster (et fabriqué chez la chèvre)et qui est couplé à de l'isothiocyanate de fluorescéine, dilué au 1150 dans PBS
contenant 1% de BSA (commercialisé Euromédex, n°AP128F).
Des témoins ont été réalisés en incubant les lymphocytes T de type Jurkat uniquement avec le second 5 anticorps (chèvre antihamster IgG couplé à
l'isothiocyanate de fluorescéine).
II s'agit alors de déterminer l'augmentation à la surface des cellules du nombre de récepteurs Fas sous l'action du sulfate de dextrane .

10 On détermine par conséquent la fluorescence des cellules (qui est proportionnelle au nombre de récepteurs présents à la surface) en l'absence de sulfate de dextrane et en présence de sulfate de dextrane pour un certain nombre de solutions à différentes concentrations. On calcule ensuite le rapport entre la fluorescence en l'absence de sulfate de dextrane et la fluorescence avec du sulfate de dextrane. Dans ce qui suit, le résultat de ce calcul est appelé « rapport ».
On réalise différents essaïs en introduisant, au temps t=0 de l'expérience, dans le milieu de culture du sulfate de dextrane aux doses suïvantes . 0,2 mg/ml, 0,1 mg/ml, 0,02 mg/ml et 0,002 mg/ml ; le sulfate de dextrane est celui commercialisé par la Société Sigma.
Après diffêrents temps d'incubation avec le dextrane sulfate, la présence de récepteurs Fas à la surface des cellules est détectée par fluorescence. Cette fluorescence est induite par l'isç~thiocyanate de fluorescéine couplé aux anticorps anti-récepteurs Fas qui se sont fixés sur les récepteurs Fas, et a été mesurée en faisant passer un échantillon de cellules contenant 104 cellules dans un appareil du type de ceux qui fonctionnent par cytométrie de flux, en l'occurrence celui commercialisé par la Société Beckton Dickinson sous l'appellation « FACS Scan Flow Cytometer ». L'intensïté de la fluorescence, qui est exprimée en unités arbitraires,

11 est donc fonction du nombre de récepteurs Fas présents à
la surface des cellules constitutives de l'échantillon.
Pour chaque échantillon, on construit sur un graphique sur l'axe des abcisses duquel on porte la fluorescence (unité arbitraire) et sur l'axe des ordonnées duquel on porte le nombre de cellules (à un facteur multiplicatif près) présentant des récepteurs à leur surface, la courbe représentant la variation de la fluorescence en fonction dudit nombre de cellules présentant des récepteurs à leur surface; cette courbe traduit une distribution de type gaussienne de la fluorescence.
En effet, dans la population de cellules présentes dans un échantillon donné, toutes les cellules n'ont pas la méme fluorescence, ce qui provient du fait qu'elles ne présentent pas le même nombre de récepteurs à leur surface.
Les diffrents essais raliss permettent de classer les populations cellulaires en fonction de la 20fluorescence, c'est dire en fonction du nombre de rcepteurs prsents la surface des cellules.

Les valeurs maximales de fluorescence diffrentes pour chaque essai qui traduisent les nombres diffrents de rcepteurs prsents en surface dpendent des produits 25actifs mis en ouvre dans les diffrents essais. Plus le principe actif mis en oeuvre est efficace plus le nombre de rcepteurs en surface sera important, et plus la valeur maximale de fluorescence est leve.

Sur les figures 1 4, la courbe C2 reprsente la 30distribution gaussienne de la fluorescence de l'chantillon de cellules tmoins (sns sulfate de dextrane) (chantillon 1).

Sur la figure 1, la courbe C2 reprsente la distribution . gaussienne de la fluorescence de 35l'chantillon de cellules dont l'incubation a t ralise

12 en prsence de 0,2 mg/ml de sulfate de dextrane (chantillon 2).

Sur la figure 2, la courbe C3 reprsente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'chantillon 'incubation a t ralise de cellules dont l en prsence de 0,1 mg/ml de sulfate de dextrane (chantillon 3).

Sur la figure 3, la courbe C4 reprsente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'chantillon 'incubation a t ralise de cellules dont l en prsence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (chantillon 4).

Sur la figure 4, la courbe C5 reprsente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'chantillon 'incubation a t ralise de cellules dont l en prsence de 0,002 mg/ml de sulfate de dextrane (chantillon 5).

Les valeurs maximales valeur du ( pic de chacune des courbes C1 C5) ainsi que le rapport correspondant sont repris -aprs .
dans le tableau I ci manr.x~arr r Fluorescence ' Concentration S
lf t d en Valeur mesure Rapport u a e e dextrane 0 (courbe C1) 80 1 0,2mg/ml 250 3,13 (courbe CZ) 0,lmg/ml 250 3,13 (courbe C3) 0,02mg/ml 200 2,50 ( courbe C4 ) 0,002mg/ml 90 1,13 (courbe CS)

13 A l'examen des résultats réunis dans le tableau I, il apparait que la concentration minimum en sulfate de dextrane est de 0,02mg/ml, qu'à plus grande dilution l'effet est trop atténué et qu'une concentration supérieure n'améliore pas l'effet.
On a ensuite réalisé une autre série d'essais afin de mesurer la durée de l'effet d'augmentation du nombre de rêcepteurs Fas en surface des cellules provoqué par 0,02mg/ml de sulfate de dextrane.
Pour ce faire on a introduit la dose de sulfate de dextrane dans le milieu de culture et on a mesuré le nombre de récepteurs en surface à l'aide du susdit apparei l FACS Scan Flow Cytometer immédiatement après l'introduction, puis 6h, 24h, 48h et 72h après l'introduction.
Les résultats sont exprimés comme précédemment, respectivement sur les figures 1 et 5 à 8.
Sur les figures 5 à 8, la courbe C1. représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules témoins (sans sulfate de dextrane) (échantillon 1').
Sur la figure 5, la courbe C41 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 4) pendant 6h.
Sur la figure 6, la courbe C42 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 4) pendant 24h.
Sur la figure 7, la courbe C43 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée

14 en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 4) pendant 48h.
Sur la figure 8, la courbe C44 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en prêsence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 4) pendant 72h.
Les valeurs maximales (valeurs du pic de chacune des courbes)et le rapport correspondant sont repris dans le tableau II suivant.
TABLEAU TI
Fluorescence dure Valeur mesure Rapport (Courbe Cl. ) 6h 100 2 (Courbe C41) .

24h 120 2,4 (Courbe C42) 48h 150 3 (Courbe C43) 72h 80 1,6 ( Courbe C44 ., ) L'examen de ces résultats montre qu'on obtient le maximum d'effet d'augmentation du nombre de récepteurs Fas à la surface des cellules après 48h d'incubation.
Avant, l'effet du sulfate de dextrane n'est pas à son maximum. Et après 48h, les récepteurs se trouvant à la surface sont dégradés ou retournent au cour de la cellule.

Utilisation d'un iotacarraghénane commercialisé
par la Société HERCULES.
Dans cet exemple on procède comme dans l'exemple 1 pour les essais de durée d'activité mais on remplace le sulfate de dextrane par du iotacarraghénane (Ic) commercialisé par la Société HERCULES et répondant à la formule (III) ci-dessus mentionnée. On introduit donc dans le milieu de culture 0,2 mg/ml de Ic, seule concentration testée. On prépare également un témoin comme dans l'exemple 1 ainsi qu'au rapport correspondant.
On mesure le nombre de récepteurs~Fas en surface à
l'aide de l'appareil FACS Scan Flow Cytometer, d'abord 6h, puis 24h, 48h, et 72h après l'introduction de Tc. Des mesures ont été faites en même temps sur le témoin.
Les rësultats obtenus sont rassemblés dans le tableau III suivant; ils correspondent à la valeur du pic de la courbe de distribution gaussienne de la fluorescence, comme dans l' exemple 1 ainsi que le rapport correspondant.
TABLEAU III
6h 24h 48h 72h ValeurRapportValeurRapportValeurRapportValeurRapport mesure mesure mesure mesure Tmoin 60 1 60 1 60 ~. 60 Ic 80 1,3 180 2,7 125 2,1 100 1,7 X0,2 mg/ml) A l'examen des résultats réunis dans Ie tableau II, il apparaît que l'on obtient le maximum d'effet d'augmentation du nombre de récepteurs Fas à la surface des cellules après 24h d'incubation. Ceci représente un effet mémoire car s'il y a plus de récepteurs à la surface, l'apoptose induite par un anticorps anti-récepteur Fas sera plus intense.
L~Y'G~Mfl1_L~ Z
La substance étudiée est le sulfate de dextrane.
On a travaillé sur une culture de cellules de foie désignée par Hep-G2 (commercialisée par ECACC(European collectiôn of human genetic cell fines)).
On procède de la même façon que dans l'exemple 1, en remplaçant les lymphocytes T de type Jurkat par des cellules de foie Hep-G2.
La présence de récepteurs Fas à la surface des cellules a été mesurée par fluorescence, comme dans l'exemple 1 et les résultats obtenus sont exprimés comme 20, dans l'exemple 1 sous la forme des figures 9 à 12.
Sur les figures 9 à 12, la courbe CT représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules témoins (sans sulfate de dextrane) (échantillon 1).
Sur la figure 9, la courbe C9 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,2 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 9).
Sur la figure 10, la courbe C~0 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de .0,1 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 10).

Sur la figure 11, 1a courbe C11 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 11).
Sur la figure 12, la courbe C12 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,002 mg/m1 de sulfate de dextrane (échantillon 12).
Les valeurs maximales (valeur du pic de chacune des courbes CT, C9 à C12) et le rapport correspondant sont repris dâns Ie tableau IV ci-après .
TABLEAU IV
Concentration en sulfate Fluorescence de dextrane , .

Valeur mesure Rapport ( Courbe CT ) 0,2 mg/ml 160 2,7 (Courbe C9) 0,1 mg/ml 140 2,3 (Courbe C10) 0,02 mg/ml 120 2 (Courbe C11) 0,002 mg/ml 60 1 (Courbe C12) A l'examen des résultats réunis dans le tableau IV, il apparait que Ia concentration minimum en sulfate de . dextrane est de 0,02mg/ml, qu'à plus ''grande dilution l'effet est trop atténué et que la concentration optimale est de 0,lmg/ml.

L'efficacité du sulfate de dextrane sur les cellules de foie Hep-G2 se retrouve de façon analogue à
celle rencontrée sur les lymphocytes T de type Jurkat.
On a ensuite réalisé une nouvelle série d'essais afin de mesurer la durée de l'effet d'augmentation du nombre de récepteurs Fas en surface des cellules provoqué
par 0,2 mg/ml de sulfate de dextrane.
Pour cela, on a procédé de la même façon que dans l'exemple 1.
Les résultats sont exprimés respectivement sur les figures 13 à 16 Sur les figures 13 à 16, la courbe C'T représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules témoins (sans sulfate de dextrane) Sur la figure 13, la courbe C13 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 13) pendant 6h.
Sur la figure 14, la courbe C14 représente la dïstribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 14) pendant 24h.
Sur la figure 15, la courbe C15 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 15) pendant 48h.
Sur la figure 16, la courbe C16 représente la distribution gaussienne de la fluorescence de l'échantillon de cellules dont l'incubation a été réalisée en présence de 0,02 mg/ml de sulfate de dextrane (échantillon 16) pendant 72h.

Les valeurs maximales (valeurs du pic de chacune des courbes) ainsi que le rapport correspondant sont repris dans le tableau V suivant.
TABLEAU v Dure Fluorescence Valeur mesure rapport 0 ( Courbe C ' T 2 5 1 ) 6h (Courbe C13) 40 1,6 24h (Courbe C14) 50 2 48h (Courbe C15) 70 2,8 72h (courbe C16) 50 2 A l'examen des résultats réunis dans le tableau V, il apparaît que l'on obtient le maximum d'effet d'augmentation du nombre de récepteurs Fas à la surface des cellules après 48h d'incubation. Ceci représente l'effet mémoire car s'il y a plus de récepteurs à la surface, l'apoptose induite par un anticorps agoniste Fas sera plus intense.

Dans cet exemple, on a mesuré l'effet du sulfate de dextrane à une concentration de 0,1 mg/ml sur l'augmentation du nombre de récepteurs TNF alpha sur des cellules de type Jurkat.
Le milieu utilisé pour la culture des cellules de type Jurkat est celui commercialisé par la Société Life Technologies sous l'appellation « RPMI 1640 Medium » ; ce milieu est décrit par Moore et al. dans la publication « A.M.A. » 199, 519 (1967).
Dans 5 ml de ce milieu on met en suspension 106 lymphocytes T. La culture a été effectuée dans un incubateur à une température de 37°C et dans une atmosphère contenant 5% de COZ.
Après une incubation de 24 heures, les cellules se sont multipliées jusqu'à atteindre le nombre de 2.106 5 cellules.
On recueille ces cellules par centrifugation, on - les lave dans un tampon PBS isotonique. On procède alors à
une nouvelle incubation dans 1 ml du milieu mentionné ci dessus à 4°C et dans une atmosphère contenant 5°s de CO~, 10 pendant 45 minutes en présence d'un anti-récepteur TNF p55 humain clone MR1-2, réf. MON9062 fabriqué chez la souris par Genzyme SA dilué à 1/50 dans PBS contenant 1% de sérum albumine de boeuf (BSA) .
On recueille les cellules et on 3.es lave avec le

15 tampon PBS isotonique. On procède à une nouvelle incubation d'un anticorps reconnaissant les immunoglobulines (IgG) de souris (et fabriqué chez la chèvre) couplé à de l'isothicyanate de fluorescéine, dilué
à 1/50 dans PBS contenant 1% de BSA.
20 Des témoins ont été réalisés en incubant les cellules uniquement avec le second anticorps couplé à
l'isothiocyanate de fluorescéine.
On détermine l'influence du sulfate de dextrane en introduisant dans le milieu de culture 0,1 mg de sulfate de dextrane par ml.
La présence de récepteurs TNF alpha à la surface des cellules a été mesurée par fluorescence comme dans les exemples précédents.
Sur la figure 17, dont l'axè des ordonnées représente le nombre (à un facteur multiplicatif près) de récepteurs TNF alpha à la surface des cellules et dont l'axe des abscisses représente l'intensité de fluorescence (unité arbitraire), on a représenté sous forme de courbe la distribution gaussienne de la fluorescence pour l'échantillon témoin (courbe T1) et pour l'échantillon qui a été incubé en présence de 0,1 mg/ml de sulfate de dextrane (courbe C17).
Les valeurs maximales (valeurs du pic de chacune des courbes) ainsi que le rapport correspondant sont repris dans le tableàu VI suivant:
TABLEAU VI
Concentration en Fluorescence sulfate de dextrane Valeur mesure rapport 0,1 mg/ml 200 1,14 L'effet d'augmentation du nombre de récepteurs TNF
alpha en surface est faible (10°s d'augmentation).
Sur la base des renseignements fournis par les exemples 1 à 4, il est possible de mettre au point des médicaments propres à l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs d'apoptose à la surface des cellules en leur faisant comporter comme principe actif une substance polysaccharidique telle que définie ci-avant, de préférence un sulfate de dextrane, éventuellement en combinaison avec un anticorps antirécepteur apoptotique.
La quantité de principe actif administrée par jour est d'environ 0,1 à 0,01 mg/kg de poids corporel.
Les médicaments en question se présentent avantageusement sous la forme d'aérosol, solution injectable, présentation pour applicatiôn topique telle que des pommades, gels, etc.
Tls peuvent être administrés par inhalation, voie orale, application cutanée.

Ces médicaments permettent d'obtenir une activation ou stimulation de l'apoptose dans le cas des affections du groupe comprenant les maladies auto-immunes, les cancers et l'asthme ainsi que dans le cas où par suite d'un endommagement ou d'une modification de l'ADN des cellules de la peau soumises à des rayonnements W il se forme par mutations au niveau de l'ADN en particulier des dimères de thymidine ou de 8-oxo-guanosine, mutations qui peuvent déclencher l'apparition de tumeurs.
A titre d'exemples, on donne ci-après des compositions possibles de pommade, solution injectable, aérosol et lait après-soleil illustrant des utilisations conformes à l'invention.
Dans les exemples qui suivent, la substance polysaccharidique mise en ouvre est le iotacarraghénane Ic.
EXEMPLE 5 . pommade Lanoline 36g Vaseline 36g Huile d'amande douce 22g Oxyde de zinc 5g Ic 1g EXEMPLE 6 . solution injectable Ic 0,0068 Eau pour préparation injectable QSP 10m1 EXEMPLE 7 . solution pour aérosol IC 0,25mg Edétate de sodium 2,5mg H drox de de sodium Y Y QSP pH=7 Eau pour préparation injectable QSP 5 ml EXEMPLE 8 . lait après-soleil ..
( ~) PEG-30 dipolyhydroxystéarate (Arlacel P135) 2,0 CyClométhicone et PPG-15 stéaryl éther (Arlamol S7) 6,0 Isohexadécane (Arlamol HD) 12,0 Sorbeth-30 (Atlas G-2330) 4,0 Sulfate de magnésium heptahydraté 0,7 IC O,2 Bisabolol 0,2 Eau déminéralisée 73,8 Mélange de propylène glycol, diazolidinyl urée, méthylparaben et propylparaben (Germaben II) 1,0 Parfum 0,1

Claims

REVENDICATIONS

1. Utilisation d'au moins une substance polysaccharidique présentant au moins cinq unités saccharidiques et comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate, pour la préparation d'un médicament pour l'activation de l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs d'apoptose à la surface cellulaire, lesdits récepteurs étant ceux du groupe comprenant les récepteurs Fas, TNF, TRAIL, CD40, de préférence Fas.

2.Utilisation selon la revendication 1 d'une substance polysaccharidique du groupe comprenant:
- les oligosaccharides dérivés par voie enzymatique ou chimique des polymères du groupe comprenant les .beta. 1-3 glucans comportant éventuellement des ramifications .beta. 1-6, et comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate:
- les oligosaccharides dérivés par voie enzymatique ou chimique des galactanes sulfatés, notamment les carraghénanes, les agars et les porphyranes.

3. Utilisation selon la revendication 1 d'une substance polysaccharidique répondant à la formule dans laquelle Gluc représente le glucose et n représente un nombre entier de 1 à 50, de préférence de 5 à 10 et dans laquelle le nombre de branchements varie de 0 à 3 par unité de répétition, et comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate.

4. Utilisation selon la revendication 1 d'une substance polysaccharidique un disaccharide de répétition répondant à la formule dans laquelle Gal représente le galactose et n représente un nombre entier de 1 à 50, de préférence de 1 à 20, au moins certains des disaccharides de répétition de formule (II) pouvant comporter un ou plusieurs groupes sulfate.

5. Utilisation selon 1a revendication 1 de dextrane comportant sur au moins certains de ses motifs unitaires, au moins un substituant porteur d'au moins une charge négative choisi dans le groupe comprenant notamment les groupements sulfate, acétate, phosphate, phosphonate, de préférence de dextrane sulfaté, et plus préférentiellement encore du dextrane sulfaté commercialisé par la Société
SIGMA.

6. Utilisation selon la revendication 1 d'un polysaccharide naturel extrait d'algue rouge de type iotacarraghénane commercialisé par la société HERCULES et présentant la formule dans laquelle:
- GAL représente le galactose, - 3,6 anhydro GAL représente le 3;6 anhydrogalactose lié
par une liaison .beta. 1.fwdarw.4, et - n représente un nombre entier de 2 à 300, de préférence de 2 à 200, les disaccharides de répétition pouvant porter 2 esters sulfates.

7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, d'une substance polysaccharidique en combinaison avec un anticorps antirécepteur apoptotique pour la préparation d'un médicament pour activer l'apoptose par augmentation du nombre de récepteurs d'apoptose à la surface cellulaire.

8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, pour la préparation d'un médicament pour le traitement des maladies appartenant au groupe des maladies auto-immunes, des cancers et de l'asthme.

9. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8 d'une substance polysaccharidique pour la préparation d'un médicament se présentant sous la forme d'un aérosol.

10. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 9 de 0,1 à 0,01 mg/kg de poids corporel de la substance polysaccharidique.

11. Médicament caractérisé par le fait qu'il comprend une quantité efficace d'au moins une substance 27~

polysaccharidique telle qu'utilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et qu'il est propre à une administration par inhalation.

12. Aérosol caractérisé par le fait qu'il comprend une quantité efficace d'au moins une substance polysaccharidique telle qu'utilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.

13. Médicament caractérisé par 1e fait qu'il comprend une quantité efficace d'au moins une substance polysaccharidique telle qu'utilisée selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 et qu'il est propre à une administration par voie topique notamment cutanée, et en particulier sous forme de pommade ou de gel.