CA2132345A1 - Transporteur d'oxygene - Google Patents
Transporteur d'oxygeneInfo
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- CA2132345A1 CA2132345A1 CA002132345A CA2132345A CA2132345A1 CA 2132345 A1 CA2132345 A1 CA 2132345A1 CA 002132345 A CA002132345 A CA 002132345A CA 2132345 A CA2132345 A CA 2132345A CA 2132345 A1 CA2132345 A1 CA 2132345A1
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
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Abstract
2132345 9319089 PCTABS00163 La présente invention concerne un transporteur d'oxygène du type comportant quatre chaînes polypeptidiques de type globine, pratiquement identiques, susceptibles de s'associer ou d'être associées entre elles afin d'assurer une activité de fixation réversible de l'oxygène.
Description
WO 93/19089 ~ 5 PCr/FR93/00273 TR~lSPORTElJR D'OXYÇE\iE.
La présente Inventlon concerne des transporteurs d'oxygène ayant une structure simllalre à l'hémogloblne et qui peuvent être utlllsés comme substltut sanguln possédant une affinlté rédulte pour l'oxy~ène.
La médeclne d'ur~ence requiert de grandes quantltés de sang 5 en vue de la transfuslon. Outre le problème d'approvlsionnement et de stocka~e pouvant se poser, les transfusions font courir des rlsques de transmisslon de maladies Infectleuses Identiflées ou non et nécessltent, par là même, I'utllisation de procédés d'inactivation virale toujours délicats à
mettre en oeuvre sur des protéines.
11 est donc souhaitable de pouvoir disposer d'un transporteur d'oxygène artificiel pouvant être substitué au sang dans un usage transf usionnel .
C'est l'objet de la présente invention qui propose des transporteurs d'oxygène ayant des structures proches de celle de 15 I'hémoglobine humaine (HbA).
L'hémo~lobine est le constituant principal du globule rouge, elle a pour fonction essentielle de fixer, transporter et délivrer la quantlté
d'oxygène nécessaire au fonctionnement normal des tissus.
La molécule d'hémo~lobine comporte deux par~ies, une partie 20 protéique, la globine, et des ~roupements qui abritent des atomes de fer ferreux responsables de la fixation de l'oxy~ène, l'hème. La globine est un tétramère csmposé de quatre chaînes identiques deux à deux qul sont nommées, pour les ~haînes pep~idiques de 141 amino-acides, alpha, et pour les chaînes de 14~ amins-acides, cha~nes de ~ype bêta; pour cette ralson 25 la globinc humaine normale est notée ~Ipha2 b~ta2.
- Le terme de chaîne de type bêta, ou "non alpha", recouvre, non seulement les chaînes bêta, mais é~alement les chaînes dénommées epsilon, gamma ou delta.
A chacune des chaînes polypeptidiques est lié un groupe 30 héminique.
Normalement chez l'adulte, plus de 95 % de l'hémo~loblne sonr constitués par du tétramère alpha2 bêta2, c'est-à-dire l'associatlon de deux dimeres hétérologues alpha-bêta, associés au complexe catalytlque, WO 93/19089 PCl /FR93/00273 I'hème, c'est-à-dlre, I'hémo~loblne A. On trouve 2 % à 3 % d'une hémoglob~ne constltuée de té~ramères alpha2 delta2, et des traces d'hémogloblne foetale alpha2 gamma2.
La globlne étant constltuee par des chaînes protélques, 11 étalt 5 tentant d'essayer de préparer ces chaînes par des technlques mettant en oeuvre les ADN recomblnants.
Les technlques mlses en oeuvre ont eu essentiellement pour but de falre synthétlser, par des organismes dlvers, les chaînes alpha et bêta, ce gui condult à des procédés lourds d'expresslon séparée de chacune 10 des chaînes ou des procédés mettant en oeuvre des systèmes de co-expresslon dont les résultats so'nt souvent peu satlsfaisants.
Alnsi, la demande de brevet WO 8~/09179 a proposé ce type d'approche, à savoir la synthèse séparée des chaînes alpha et des chaînes beta, en particulier sous forme de mutants non naturels.
L'approche s'étant révélée relatlvement lourde, une demande de brevet plus récente, WO 90/13645, a proposé d'utiliser directement un dimère notamment de chaînes alpha destinées à être combinées avec des chaînes bêta.
Bien que cette approche soit intéressante, elJe nécessl~e, là
20 encore, l'obtention séparée de séquences alpha et de séquences bêta qul doivent etre recombinées, même Sl celles-ci peuvent se présenter chacune sous forme de dimère afin de permettre la formarlon d'un tétramère stable La présente Inventlon a pour objet un transporteur d'oxvgène qui ne nécessite la synthèse que d'un seul type de chaîne, ce type de chaîne 25 pouvant atre associé sous forme d'un tétramère portant l'hème et capable de ~ixer de façon réverslble l'oxygène.
Plus particullèrernent, la présente inventlon concerne un transporteur d'oxygène du type comportant au moins quatre chaînes polypeptidiques de type globlne pratlquement identiques, susceptlbles de 30 s'assocler ou d'être assoclées entre elles en Incorporant l'hème, af In d'assurer une activité de fixatlon réversible de 1'o%ygène.
~ ~23 :~ i Dans la deflnltlon précedente, 1l faut entendre que par la terminologle "chaînes polypeptldlques de type globlne" on se refère aux chaines de ~ype alpha ou aux chaînes de type beta, et que ces chaînes sont pratlquement identlques, de préférence sont totalement Identlques.
Ce type de transporteur se distlngue donc des transporteurs de la technlque antérleure dans lesquels on prévoit toujours deux types de chaînes distlnctes qui sont susceptibles de s'associer, comme par exemple des chaines alpha et bêta, même sl, au demeurant, ces chaines comportent certalnes modificatlons ou se présentent sous forme de dimère.
Le transporteur d'oxygène selon la présente inventlon peut présenter deux modes de réallsation différents.
Dans un premler mode de réalisation, les quatre chaînes polypeptldiques sont Identlques et leur structure qui emprunte aux chaînes alpha et aux cha;nes de type beta, est telle qu'elles vont pouvolr s'associer lS en reconstituant une interface similaire à l'interface alphal,bêta2 qul intervient dans l'association des chaînes alpha et des chaines bêta de l'HbA
naturelle.
Dans un second mode de réalisation, les chaînes sont identiques et sont, en partlculier, toutes des chaînes bêta qui vont être 2G associées, sous forme d'un tétramère.
Plus partlculièrement, dans le prcmier mode de réalisatlon, la présente Invention concerne des transporteurs d'oxygène artificiels tels que déits précédemment, comportant au moir.s quatre chaînes polypeptldlques incorporant l'hème et ayant chacune une structure de type globlne séquencée:
V - (W) - X - (Y) - Z
dans laquelle:
- V, X, et Z sont des séque7lces ps~lypeptldiques de type globine, et - (W) et (Y) sont deux séquences polypeptidiques complémen-taires susceptibles d'interaglr pour constituer une interface qui, lorsqu'elle appartient à deux chaînes dlsctlnctes, est au moins en partie slmllalre a ~ ~ 3 ~ 4 I'lnterface alpha I be~ta2, lesdltes chaînes pouvant s'assocler en recons~
~uant ladlte Interface simllalre à l'mterface alphal beta2 afln d'assurer une actlvlsé de flxatlon réverslble et coopératlve de l'oxygène.
Dans ce type de transporteur d'oxygène selon l'inven~lon, les 5 quatre chaînes polypeptidiques associées dans un tétramère, sont assoclées "tête-bêche" afin que la mlse en re8ard des séquences W 1 de l'une des chaînes avec la séquence Y2 de l'autre chaîne condulse, parallèlement, à la mlse en rapport de la séquence Yl de la première avec la séquence W2 de la seconde pour reconstituer au molns en partie l'interface alphal,bêta2 de 10 I'hémogloblne naturelle.
Cette interface entre res chaînes alpha et les chaînes beta est Impllquée dans la transition conformationnelle responsable en partie de la flxatlon et de la libération de l'oxygène., sa reconstitution permet d'obtenlr des transporteurs d'oxygène ayant des propriétés satisfaisantes.
E~ien entendu, les chaînes polypeptidiques devront présenter des structures qui les rapprochent des chaînes de type alpha ou des chaînes de type beta.
Ainsi, notamment, la séquence polypeptidique de type globlne X comportera un ou plusieurs segments hélicoldaux choisis parml les 20 segments hélicoidaux D, E et F des chaînes de type alpha ou beta, lesdlts segments pourront être reliés entre eux par des segments non héllcoïdaux ou par des liaisons simples.
La séquence polypeptidique de type globine V comportera un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux ~, Z5 a et C des chaînes de type alpha ou be~ta, lesdits segments pourront être reliés entre eux par des segments non hélicoldaux ou par des lla~sons slmples~
La séguence polypeptidique de type globine Z comportera un ou plusieurs segments hélicoldaux choisis parmi les se~ments hélicoïdaux G
30 et H des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pourront ê~re rellés entre eux par des segments non hélicoldaux ou par des I lal sons simples.
WO 93/19089 PCI'/FR93/00273 ~23~
.~lals, s'il est clalr que les segments hélico'idaux jouent un rôle Important dans la structure du ~étramère normal et qu'il faudra retrouver ce Iype de structure dans le tétramère synthétlque, 11 est toutefols posslble de prévoir l'assoclatlon de segments hélico'l'daux d'origlne dlfférente, 5 c'est-à-dire soit de type alpha, solt de type beta, quant aux segments non hélicoïdaux, ils peuvent être des segments ayant la structure de leurs homologues naturels et/ou être de nature différente même sl, au demeurant, I'utilisation de séquences homogènes tout alpha ou tout bêta peut être préférée.
De façon préférentielle, les segments de la formule générale seront choisis de la manière suivante:
V al pha = NA + A ~ AB + B + C
W alpha = CE (interface alphal/beta2) 15 X alpha = E + EF + F
Y alpha = FG (interface alphal/beta2) Z alpha = G I GH + H ~ HC
V be~a = NA + A + B + C
20 W beta = CD (interface alpha l/bêta2) X b~ta = D ~ E + EF + F
Y beta = FG (interface alphal/beta2) Z bêta ~ G + GH + H, HC
Enfin, I'interface alpha I beta2 telle qu'elle peut etre reconstituée par les chaines séquencées selon la présente inventlon est de préférence la suivante:
( C2 36Pro Yal96 G3 ) 30( C3 37Trp Pro95 G2 ) W(bêta-alpha)l ( C6 40Arg Asp91 Gl ) Y(beta-alpha)2 C7 41 Phe Val93 FG5) Arg92 FG4) Leu9 1 FG3) WO 93J19OB9 PCl /FR93/00273 3J ~ J 6 ~J~ ~
( FG3 91Leu ~ FG4 92Arg ( FG5 93Val Phe41 C7 ) Y(bêta-alpha)l ( Gl 94Asp Ar~40 C6 ) W(bêta-alpha)2 ( G2 95Pro Trp37 C3 ) ( G3 96Val Pro36 C2 ) En outre, les différents segments hélicoïdaux ou non pourront également comporter des mutatlons par rapport à leurs homologues naturels, comme cela sera décrlt cl-après.
Ces mutatlons concernent de manière préférée la sous-unlté
de type bêta, plus stable. On peut Clter plus particulièrement les mutations suivantes de la chaîne de type bêta:
- remplacement de His en positlon 2 par Met - remplacement de Val en position 23 par lle (Pagnier et al, 1 99û) - remplacement de Ala en position 27 par Ser (Baklouti et al, 1986; Fessas et al, 1982 ; Huang et al, 1990) - remplacement de Phe en position 41 par Tyr - remplacement de His en position 63 par Phe (Lin et al, 1990; Nzgai et al, 1 987, 1 988) - remplacement de His en positlon 63 par lle (Lin et al, 1990; Nagal et al, 1 987, 1 9883 - remplacement de Val en posi~ion 67 par Phe (Lin et al, 1990; Nagal et al, 1 987, 1 9~8) - remplacernent de Val en position 67 par lle (Lin et al, 1990; Na~al e~ al,
La présente Inventlon concerne des transporteurs d'oxygène ayant une structure simllalre à l'hémogloblne et qui peuvent être utlllsés comme substltut sanguln possédant une affinlté rédulte pour l'oxy~ène.
La médeclne d'ur~ence requiert de grandes quantltés de sang 5 en vue de la transfuslon. Outre le problème d'approvlsionnement et de stocka~e pouvant se poser, les transfusions font courir des rlsques de transmisslon de maladies Infectleuses Identiflées ou non et nécessltent, par là même, I'utllisation de procédés d'inactivation virale toujours délicats à
mettre en oeuvre sur des protéines.
11 est donc souhaitable de pouvoir disposer d'un transporteur d'oxygène artificiel pouvant être substitué au sang dans un usage transf usionnel .
C'est l'objet de la présente invention qui propose des transporteurs d'oxygène ayant des structures proches de celle de 15 I'hémoglobine humaine (HbA).
L'hémo~lobine est le constituant principal du globule rouge, elle a pour fonction essentielle de fixer, transporter et délivrer la quantlté
d'oxygène nécessaire au fonctionnement normal des tissus.
La molécule d'hémo~lobine comporte deux par~ies, une partie 20 protéique, la globine, et des ~roupements qui abritent des atomes de fer ferreux responsables de la fixation de l'oxy~ène, l'hème. La globine est un tétramère csmposé de quatre chaînes identiques deux à deux qul sont nommées, pour les ~haînes pep~idiques de 141 amino-acides, alpha, et pour les chaînes de 14~ amins-acides, cha~nes de ~ype bêta; pour cette ralson 25 la globinc humaine normale est notée ~Ipha2 b~ta2.
- Le terme de chaîne de type bêta, ou "non alpha", recouvre, non seulement les chaînes bêta, mais é~alement les chaînes dénommées epsilon, gamma ou delta.
A chacune des chaînes polypeptidiques est lié un groupe 30 héminique.
Normalement chez l'adulte, plus de 95 % de l'hémo~loblne sonr constitués par du tétramère alpha2 bêta2, c'est-à-dire l'associatlon de deux dimeres hétérologues alpha-bêta, associés au complexe catalytlque, WO 93/19089 PCl /FR93/00273 I'hème, c'est-à-dlre, I'hémo~loblne A. On trouve 2 % à 3 % d'une hémoglob~ne constltuée de té~ramères alpha2 delta2, et des traces d'hémogloblne foetale alpha2 gamma2.
La globlne étant constltuee par des chaînes protélques, 11 étalt 5 tentant d'essayer de préparer ces chaînes par des technlques mettant en oeuvre les ADN recomblnants.
Les technlques mlses en oeuvre ont eu essentiellement pour but de falre synthétlser, par des organismes dlvers, les chaînes alpha et bêta, ce gui condult à des procédés lourds d'expresslon séparée de chacune 10 des chaînes ou des procédés mettant en oeuvre des systèmes de co-expresslon dont les résultats so'nt souvent peu satlsfaisants.
Alnsi, la demande de brevet WO 8~/09179 a proposé ce type d'approche, à savoir la synthèse séparée des chaînes alpha et des chaînes beta, en particulier sous forme de mutants non naturels.
L'approche s'étant révélée relatlvement lourde, une demande de brevet plus récente, WO 90/13645, a proposé d'utiliser directement un dimère notamment de chaînes alpha destinées à être combinées avec des chaînes bêta.
Bien que cette approche soit intéressante, elJe nécessl~e, là
20 encore, l'obtention séparée de séquences alpha et de séquences bêta qul doivent etre recombinées, même Sl celles-ci peuvent se présenter chacune sous forme de dimère afin de permettre la formarlon d'un tétramère stable La présente Inventlon a pour objet un transporteur d'oxvgène qui ne nécessite la synthèse que d'un seul type de chaîne, ce type de chaîne 25 pouvant atre associé sous forme d'un tétramère portant l'hème et capable de ~ixer de façon réverslble l'oxygène.
Plus particullèrernent, la présente inventlon concerne un transporteur d'oxygène du type comportant au moins quatre chaînes polypeptidiques de type globlne pratlquement identiques, susceptlbles de 30 s'assocler ou d'être assoclées entre elles en Incorporant l'hème, af In d'assurer une activité de fixatlon réversible de 1'o%ygène.
~ ~23 :~ i Dans la deflnltlon précedente, 1l faut entendre que par la terminologle "chaînes polypeptldlques de type globlne" on se refère aux chaines de ~ype alpha ou aux chaînes de type beta, et que ces chaînes sont pratlquement identlques, de préférence sont totalement Identlques.
Ce type de transporteur se distlngue donc des transporteurs de la technlque antérleure dans lesquels on prévoit toujours deux types de chaînes distlnctes qui sont susceptibles de s'associer, comme par exemple des chaines alpha et bêta, même sl, au demeurant, ces chaines comportent certalnes modificatlons ou se présentent sous forme de dimère.
Le transporteur d'oxygène selon la présente inventlon peut présenter deux modes de réallsation différents.
Dans un premler mode de réalisation, les quatre chaînes polypeptldiques sont Identlques et leur structure qui emprunte aux chaînes alpha et aux cha;nes de type beta, est telle qu'elles vont pouvolr s'associer lS en reconstituant une interface similaire à l'interface alphal,bêta2 qul intervient dans l'association des chaînes alpha et des chaines bêta de l'HbA
naturelle.
Dans un second mode de réalisation, les chaînes sont identiques et sont, en partlculier, toutes des chaînes bêta qui vont être 2G associées, sous forme d'un tétramère.
Plus partlculièrement, dans le prcmier mode de réalisatlon, la présente Invention concerne des transporteurs d'oxygène artificiels tels que déits précédemment, comportant au moir.s quatre chaînes polypeptldlques incorporant l'hème et ayant chacune une structure de type globlne séquencée:
V - (W) - X - (Y) - Z
dans laquelle:
- V, X, et Z sont des séque7lces ps~lypeptldiques de type globine, et - (W) et (Y) sont deux séquences polypeptidiques complémen-taires susceptibles d'interaglr pour constituer une interface qui, lorsqu'elle appartient à deux chaînes dlsctlnctes, est au moins en partie slmllalre a ~ ~ 3 ~ 4 I'lnterface alpha I be~ta2, lesdltes chaînes pouvant s'assocler en recons~
~uant ladlte Interface simllalre à l'mterface alphal beta2 afln d'assurer une actlvlsé de flxatlon réverslble et coopératlve de l'oxygène.
Dans ce type de transporteur d'oxygène selon l'inven~lon, les 5 quatre chaînes polypeptidiques associées dans un tétramère, sont assoclées "tête-bêche" afin que la mlse en re8ard des séquences W 1 de l'une des chaînes avec la séquence Y2 de l'autre chaîne condulse, parallèlement, à la mlse en rapport de la séquence Yl de la première avec la séquence W2 de la seconde pour reconstituer au molns en partie l'interface alphal,bêta2 de 10 I'hémogloblne naturelle.
Cette interface entre res chaînes alpha et les chaînes beta est Impllquée dans la transition conformationnelle responsable en partie de la flxatlon et de la libération de l'oxygène., sa reconstitution permet d'obtenlr des transporteurs d'oxygène ayant des propriétés satisfaisantes.
E~ien entendu, les chaînes polypeptidiques devront présenter des structures qui les rapprochent des chaînes de type alpha ou des chaînes de type beta.
Ainsi, notamment, la séquence polypeptidique de type globlne X comportera un ou plusieurs segments hélicoldaux choisis parml les 20 segments hélicoidaux D, E et F des chaînes de type alpha ou beta, lesdlts segments pourront être reliés entre eux par des segments non héllcoïdaux ou par des liaisons simples.
La séquence polypeptidique de type globine V comportera un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux ~, Z5 a et C des chaînes de type alpha ou be~ta, lesdits segments pourront être reliés entre eux par des segments non hélicoldaux ou par des lla~sons slmples~
La séguence polypeptidique de type globine Z comportera un ou plusieurs segments hélicoldaux choisis parmi les se~ments hélicoïdaux G
30 et H des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pourront ê~re rellés entre eux par des segments non hélicoldaux ou par des I lal sons simples.
WO 93/19089 PCI'/FR93/00273 ~23~
.~lals, s'il est clalr que les segments hélico'idaux jouent un rôle Important dans la structure du ~étramère normal et qu'il faudra retrouver ce Iype de structure dans le tétramère synthétlque, 11 est toutefols posslble de prévoir l'assoclatlon de segments hélico'l'daux d'origlne dlfférente, 5 c'est-à-dire soit de type alpha, solt de type beta, quant aux segments non hélicoïdaux, ils peuvent être des segments ayant la structure de leurs homologues naturels et/ou être de nature différente même sl, au demeurant, I'utilisation de séquences homogènes tout alpha ou tout bêta peut être préférée.
De façon préférentielle, les segments de la formule générale seront choisis de la manière suivante:
V al pha = NA + A ~ AB + B + C
W alpha = CE (interface alphal/beta2) 15 X alpha = E + EF + F
Y alpha = FG (interface alphal/beta2) Z alpha = G I GH + H ~ HC
V be~a = NA + A + B + C
20 W beta = CD (interface alpha l/bêta2) X b~ta = D ~ E + EF + F
Y beta = FG (interface alphal/beta2) Z bêta ~ G + GH + H, HC
Enfin, I'interface alpha I beta2 telle qu'elle peut etre reconstituée par les chaines séquencées selon la présente inventlon est de préférence la suivante:
( C2 36Pro Yal96 G3 ) 30( C3 37Trp Pro95 G2 ) W(bêta-alpha)l ( C6 40Arg Asp91 Gl ) Y(beta-alpha)2 C7 41 Phe Val93 FG5) Arg92 FG4) Leu9 1 FG3) WO 93J19OB9 PCl /FR93/00273 3J ~ J 6 ~J~ ~
( FG3 91Leu ~ FG4 92Arg ( FG5 93Val Phe41 C7 ) Y(bêta-alpha)l ( Gl 94Asp Ar~40 C6 ) W(bêta-alpha)2 ( G2 95Pro Trp37 C3 ) ( G3 96Val Pro36 C2 ) En outre, les différents segments hélicoïdaux ou non pourront également comporter des mutatlons par rapport à leurs homologues naturels, comme cela sera décrlt cl-après.
Ces mutatlons concernent de manière préférée la sous-unlté
de type bêta, plus stable. On peut Clter plus particulièrement les mutations suivantes de la chaîne de type bêta:
- remplacement de His en positlon 2 par Met - remplacement de Val en position 23 par lle (Pagnier et al, 1 99û) - remplacement de Ala en position 27 par Ser (Baklouti et al, 1986; Fessas et al, 1982 ; Huang et al, 1990) - remplacement de Phe en position 41 par Tyr - remplacement de His en position 63 par Phe (Lin et al, 1990; Nzgai et al, 1 987, 1 988) - remplacement de His en positlon 63 par lle (Lin et al, 1990; Nagal et al, 1 987, 1 9883 - remplacement de Val en posi~ion 67 par Phe (Lin et al, 1990; Nagal et al, 1 987, 1 9~8) - remplacernent de Val en position 67 par lle (Lin et al, 1990; Na~al e~ al,
2 5 1 9~7, 1 9~8) De telles mutations permettent de diminuer l'afflnlté
intrinsèque du transporteur pour l'oxypène, tout en maintenant un effet de coopérativité.
D'autres mutations ont également été décri~es et peuvent très bien être incorporées dans les hémoglobines selon la présente inventlon. Il peut s'agir notamment de l'une ou de plusieurs des mutations fi~urant au tableau 1 ci-après.
Wo 93/19089 PCr/FR93/00273 2 ~ 5 Tableau I
Variants naturels de l'Hb humaine présentant une diminution de l'affinité pour l'oxygène Mutants de la chaîne I o Hémoglobine muta~on Réferenccs Tonno a43 (CEI) Phe ~ Val Berettaetal, 1968 Hirosa~ a43 (CEI) Phe ~ Lcu Ohbaetal, 1975a Moabit ~86 (F7) Leu ~ Arg Knuth etal, 1979 Sédf a94 (G1) Asp Tyr Wajcmanetal, 1972 rltusville a94 (Gl) Asp ~ Asn Schncidcr eral, 1975a Mutants de la chaîne ~
Hémoglobine muta~on Réf~rences Raleigh ~ l (NA 1 ) Val ~ Ala Moo-Penn et al, 1977 COMCCOCUt ,B21 (B3) Asp ~ Gly Moo Penn etal, 1981 Moscva ,B24 (B6)Gly ~ Asp Idclsone~al, 1974 Auclcland ~ B7~Gly ~ Asp William~ne~al, 1987 Knossos ,B27 (B9~ Ala Scr Baklou~ et al, 1986; Fessas et al. 1982
intrinsèque du transporteur pour l'oxypène, tout en maintenant un effet de coopérativité.
D'autres mutations ont également été décri~es et peuvent très bien être incorporées dans les hémoglobines selon la présente inventlon. Il peut s'agir notamment de l'une ou de plusieurs des mutations fi~urant au tableau 1 ci-après.
Wo 93/19089 PCr/FR93/00273 2 ~ 5 Tableau I
Variants naturels de l'Hb humaine présentant une diminution de l'affinité pour l'oxygène Mutants de la chaîne I o Hémoglobine muta~on Réferenccs Tonno a43 (CEI) Phe ~ Val Berettaetal, 1968 Hirosa~ a43 (CEI) Phe ~ Lcu Ohbaetal, 1975a Moabit ~86 (F7) Leu ~ Arg Knuth etal, 1979 Sédf a94 (G1) Asp Tyr Wajcmanetal, 1972 rltusville a94 (Gl) Asp ~ Asn Schncidcr eral, 1975a Mutants de la chaîne ~
Hémoglobine muta~on Réf~rences Raleigh ~ l (NA 1 ) Val ~ Ala Moo-Penn et al, 1977 COMCCOCUt ,B21 (B3) Asp ~ Gly Moo Penn etal, 1981 Moscva ,B24 (B6)Gly ~ Asp Idclsone~al, 1974 Auclcland ~ B7~Gly ~ Asp William~ne~al, 1987 Knossos ,B27 (B9~ Ala Scr Baklou~ et al, 1986; Fessas et al. 1982
3~
Rothschild ~37 (C3) Trp ~ Arg Gacon e~al, 1977 Hazebrouck ~38 (C4) Thr ~ Pro Blouquit et ~, 1984 Hammcrsmith ~42 (CD1) Phe ~ S D~ic e~al, 1967; Ohba et al, 1975b 3S Bucurcs~ ,B42 (CD1) Phe ~ Lcu Bratu e~al, 1971; Keeling e~ al, 1971 WO 93/t9089 P(~/FR93/00273 Tableau 1 (suite) Sendagi ~42 (CD l ) Phe ~ Val Oga~a et al, 1986 Chervely ~45 (CD4) Phe ~ Se~ Yeager et al, 1983 Okaloosa ~48 (CD7)Leu ~ Arg Cha~chee~al, 1973 Bologna ,B61 (5) Lys ) Met Marinucci eral, 1981 J-Cairo ~65 (E9) Lys ~ Gln Garel e~al, 1976 Chico ~66 (E10) Lys ~ Thr Shih etal, 1987 I 0 Bristol ~67 (E11) Val ~ Asp Steadman etal, 1970 Seattle ~70 (E14) Ala , Asp Ku~chi et al. 1973 Vancouver ~73 (E17) Asp ~ Tyr Jones e~al, 1976 Korlc-Bu ~73 (E17) Asp ~ Asn Konotey-Ahulu etal, 1968;
l 5 Wajcman & Joncs, 1977 Mobile ~73 (E17) Asp ~ Val Schneider etal, 1975b rlburg ~73 (E17) Asp ~ Gly Bcmini & Gior~ano, 1988 Aalborg ~74 (E18) Gly ~ Ar& Williamson etal, 1990 Calais ,B76 (E20) Ala ~ Pro Wajcman aal, 1991 Providcnce ~82 (EF63 Lys ~ Asn ~ Asp Bonavcnn~a etal, Moo Penn e~al, 1976 Pyrgos ~83 ~7) Cily ~ Asp Tatsis ~tal, 1976 Agenogi ~90 (F6) Glu ~ Lys Miyaji etal, 1966 2 5 Roseau-Point-.e ~ 90 (F6) Glu ~ Gly M~rault etal, 1985 Canbbean ,B91 IF7) Leu ~ Arg Ahcrn e~al, 1976 Kansas ,B102 (G4) Asn ~ Thr Bonavennlra & Riggs, 1968 Beth Israel ~102 (G4~ Asn ~ S~r Nagel eral, 1976 Saint- Mandé ~102 (G43 Asn ~ Tyr Arous ~al, 1981 Bur~e ~107 (G9) Gly ~ Arg Turneretal, 1976 Yoshizuka ~108 (G10) Asn ~ Asp Imamura etal, 1969 Prcsbytcrian ~108 (G10) Asn ~ Lys Moo Penn etal, 1978 Wo 93/l9089 ~ pcr/FRs3/oo273 Tableau 1 (suite) Pcterborough ,B 1 11 (G13) Val ~ Phe King etal, 1972 New-York ~113 (G15) Val ~ Glu Ranney etal, 1967 D-Punjab ~121 (GH4)GIu aln Baglioni, 1962 LaDesirade ~129 (H7) Ala ~ Val Méraultetal, 1986 Yamagata ~132 (H10) Lys ~ Asn Harano eral, 1990 Hope ,B136 (H14) Gly~ Asp Minnich etal, 1965 Himeji ~140 (H18) Ala ~ Asp Ohba e~al, 1986 NB : n'ont ~té pris en compte que les hémoglobines contenant une seule mutation soit dans la sous-unit~CX , soit dans la sous-unité ~.
WO 93/19089 PCI`/FR93/00273 J
Comme cela a été indiqué précédemment, les séquences W et Y doivent permettre de reconstltuer une Interface alphal bêta2 de HbA ou similalre qul est Impllquée dans la transltlon R ~ T. C'est pourquol, les segments (W) et (Y) seront similalres aux segments ClCD et FGtG de 5 I'interface alphal bêta2 de l'hémoglobine humaine, mais il est posslble de la modifier si besoin est en prévoyant certalnes mutations ponctuelles.
Les éléments essentiels impliqués dans la structure de l'interface alpha I bêta2 sont les suivants Chaîne Chaîne Chaîne Chaîne Bêta Alpha Bêta Alpha 37Trp38Thr Tyr 145 Tyr 140 40Arg41Thr AsnlO2 Asn97 41 Phe42Tyr Glu 101 Val96 96Leu91 Leu Asp99 Asp94 97His92Arg His97 Arg92 98Val93Val Phe41 Tyr42 99Asp94Asp Ar~40 Thr41 l OOPro95Pro Gln39 Lys40 lOlGlu96Val Trp37 Thr3~
145Tyr140Tyr Pro36 Pro37 On peut prevoir les mutatlons flgurant au tableau 2 ci-après.
W O 93/19089 ~ ~ Jt ~. ~ PC~r/FR93/00273 Tableau 2 Exemples de mu~tions de résidus situés à l'interface a l ~2 Site mutation par~cularité de la mutation . .
~40 (C6) Arg~ Asp charge négative encombrcment plus faible que Arg Arg~ Val hydr~phobe fort encombrement sterique Arg~ Ala hydrophobe faible encombrement stérique Arg~ Ser groupement hydroxyle faible cncombremem stérique Arg ) Lys propriétés proches de celle dc Arg 341 (C7) Phe~ Tyr groupemcnt hydroxylc possibilité dc liaison H
~101 (G3) Glu~ Ala hydrophobc faible encombraTlcnt stérique 2~
~102 (G4) Asn ) Ala hydropbobe faible encombremerlt stérique Asn ) Gly encomt~men~ st~rique nul ~ . .
3~
WO 93/19089 PCI`/FR93/00273 Parmi les chalnes polypep~idiques plus partlculièremen~
Intéressanles, 1l faut cller les chaînes mlxtes alpha,bêta, c'est-à-dlre notamment les chaînes constltuées de l'extrémlté N-termlnale d'une chaîne de type bêta de la globine, et de l'extrémlté C-termlnale de la chaîne 5 alpha de la globlne; ou, réclproquement, une chaîne constltuée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne alpha de la globlne et de l'extréml~é
C-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine.
Ces sous-unltés chlmérlques seront notées, respectlvement, NH2bêta-alphaCOOH ou NH2alpha-bêtaCOOH.
La jonctlon alpha-bêta se sltuera de préférence au n~veau de la zone flexible de la poche de l'.hème, c'est-à-dire dans le segment EF.
Le polypeptlde le plus Intéressant comporte l'extrémlté
N-terminale de la chaîne bêta de la globine fusionnée jusqu'à l'amlno-acide 73 compris à la partie C-termlnale de la chaîne alpha de la globlne à partir 15 de l'amino-acide 69 comprls.
Ce type de molécule chimérique associée sous forme tétramérique est représenté à la figure 8 sur laquelle on a visuallsé les interfaces alphalbêta2 reconstituées dans le tétramère.
Il est possible de prévoir que deux chaines polypeptldlques 20 soient reliées par une séquence, de préférence peptidique, située entre la séquence Z de l'une et la séquence V de l'autre, les deux chaînes sont alns solidaires, ce qui favorlse la stabilité du tétramère.
Les deux chaînes peuven~ également être rellées par réticulation ou par tout type d'interaction biochimique comme par exemple 25 des liaisons de pontage covalent (dérivés de diaspirine ou de pyrldoxal phosphate).
Le transporteur d'oxygène selon l'invention comportera une structure héminique; il peut s'aglr d'une molécule d'hème naturel ou blen d'une métalloporphyrine dans laquelle l'alome de fer est remplacé par un 30 autre métal notamment le cobalt.
WO 93/19089 PCr/FR93/00273 fv 3 ~ ~
Dans le second mode de réallsation de l'lnventlon, le ~étramère est constltué essentlellement de quatre polypeptldes Iden~lques ayant chacun une structure de type bêta-globlne. Ce type de tétramère dénommé bêta4 sera, de préférence, constitué par des chaînes de type beta comportant l'une des mutations citées précédemment.
Il pourra, comme cela a été décrit, être préparé par association de dimères, ces dlmères étant formés par llalson des extrémltés N et C termlnales de deux sous-unités.
Le transporteur d'oxygène selon l'invention présente en général une affinité pour l'oxygène diminuée par rapport à l'hémo~loblne naturelle, de préférence, cette afflnité est dirninuée d'au molns 20 '0 par rapport à celle de l'hémoglobine naturelle.
Le transporteur selon la présente invention est, de préférence, obtenu par culture d'un organlsme transformé produisant ladite chaîne, 1l peut s'agir de cellules eucaryotes comportant une séquence d'Al:)N codant pour ladite chaîne sous la dépendance d'éléments d'expression assurant I'expression de ladite séquence dans ladite cellule hôte.
La technologie des ADN recombinants permettant l'expresslon d'une séquence peptidigue est maintenant largement connue et n'a pas à
être décrite en détail.
La cellule hôte est de préference une cellule eucaryote et de préférence une levure et/ou une cellule eucaryote supérieure ou un anlmal transgénigue. Quant au système d'expression, il peut s'agir SOIt de plasmides à réplication autonome, soit de plasmides permettant l'lntégra-tion dans le génome de la cellule hôte. Les séquences codantes pouvant être sous la dépendance d'un promoteur hétérologue mais efficace dans l'h~te ou bicn d'un promoteur homologue, ou bien encore d'un promoteur chromosomique. Il est possible é~alement de prevoir des systèmes assurant, par exemple, la secrétion de ces chaînes polypeptidiques.
Dans ce qui SUIt~ on donnera des exemples de systeme d'expression des chaînes polypeptldiques selon la présente inventlon qul ne pourront, en aucun cas, être considérées comme des limitations.
I 'obtention des tétramères est, la plupart du lemps spontanée, elle peut être favorlsée suivant la structure exacte du té~ramere WO 93/19089 PCr/~R93/00~73 , i~, 1 4 par des conditions partlcullères de mise en solutlon, notamment dans certalnes condltlons de pH et/ou de force lonlque.
L'lntroduction d'un groupe hémlnlque peut être spontanée, en partlculler chez les eucaryotes, et les tétramères obtenus sont "hémlnlsés~
sans qu'il y ait lleu de prévolr une étape spéclfique. La plupart du temps l'hème sera rajouté lors d'une étape ultérleure.
La présente Inventlon concerne également des procédés permettant la préparatlon de ces chaînes polypeptldiques par des technlques mettant en oeuvre les ADN recomblnants et l'éventuelle formation du tétramère, comme cela a été décrlt précédemment (Hoffman et al, 1990; Nagal ~ Thogersen, 1984, 1987; Nagai et al, 1985; Tame et al, 1991 ; Wagenbach et al, 1991).
Enfin, la présente Inventlon concerne l'utllisatlon des chaînes à tltre de médicament, notamment pour le transport d'oxygène en comblnaison avec un support acceptable dans le domalne transfuslonnel.
Les exemples cl-après permettront de mleux mettre en évidence certaines caractéristiques et avantages de la présente Inventlon.
Dans ce qui suit:
- la Figure 1 schématlse la séquence nucléotid?que et en amlno-acides de la chaîne alpha, - la Figure 2 schématise la séquence nucléotidique et en amlno-acides de la cha~ne bêta, - la Figure 3 schématlse la structure spatiale de la chaîne bêta, avec indicatlon de la nomenclature des hélices, - la Figure 4 représente le schéma du plasmide pATPrTet, - la Flgure 5 représente le schéma du plasmlde pATPr cllFX
bêta, - les Flgures 6 et 7 schématisent la préparatlon du vecteur pATPr cllFX bêta Gb, - la Flgure 8 représente le schéma de la structure spatlale d'un dimère selon l'inventlon, notamment la reconstltution de l'lnterface alpha I bêta2.
- la Figure 9 schématlse les étapes de la constructlon du vecteur pATPr Chlm bêta73-alpha6~.
W093/19089 ;~ t ~ PCI/FR93/00273 Afln de mieux comprendre la structure de l'hémogloblne, on pourra se reporter à des artlcles tels que celul de ~/lax F. Perutz (1987) m .~olecular aasls of ~lood Dlseases alnsl qu'à des ouvrages tels ceux de Dlckerson ~ Gels (1983) et Ferml ~ Perutz (1981).
Sur la figure I on a représenté la structure en amlno-acldes de la chaîne alpha et sur la figure 2 la structure en amino-acldes de la chaîne bêta.
La configuration spatiale de la chaîne bêta est représentée à
la figure 3 avec la nomenclature des différents segments qui vont de I'extrémité NH~ terminale vers l'extrémlté COOH terminale :
NA, A, B, C, CD, D, E, EF, F, FG G, GH, H et HC;
quant à la chaîne alpha elle présente la structure:
NA, A, AB, a, c, CE, E, EF, F, FG, G, GH, H et HC.
Les se~ments A, ~, C, E, F, G et H présentent une structure sensiblement hélicoldale alors que les segments de jonctlon ne présentent pas une telle structure.
Les acides aminés sont numérotés soit à partir de l'extrémlté
N-terminale par ordre croissant, soit en affectant à un acide amlné la désignation de son hélice et son rang dans celle-ci.
Le 36ème aclde aminé de la cha;ne bêta est la Proline, 1l est bêta 36(C2) Pro, c'est-à-dire le deuxième aclde aminé de l'héllce C.
PRODUCTION DE LA PROTEINE DE FUSION DANS E. COLI
Les manipulations portant sur 1' ADN ont été effec~uées en utilisant essentiellement les techniques classiques décrites par Sambrook et al dans le manuel "Molecular Cloning". Sauf indication contralre, les digestions par les enzymes de restriction ou de modification sont réallsées selon les indica~ions des fabricants (Amersham, ~oehringer Manhelm; New 30 England aiolabs~. L' ADNc codant pour la protéine de fusion clIFX bêta globine a été cloné par Nagai et al (1985) dans le phage M13 rnpl~. La construction M13 mplO clIFX bêta nous a été fournie sur demande au Medlcal Reseàrch Council (Cambridge, Grande-aretagne).
WO 93/19089 PCI /FR93~00273 `3 1 6 EXEMPLE 1: Construction du vecteur d'expression p AT Pr CIIFX bêta Gb Le vecteur de base pAT Pr Tet présente une orlglne de répllcatlon dérlvée de pBR 322 et porte le gène de réslstance à la tétracycllne. Il permet l'expresslon de protélnes hétérologues sous le contrôle du promoteur Pr du phage lambda. L'actlvlté de ce promoteur est réprimée par le répresseur Cl (allèle C1857, thermosensible). Le promoteur Pr est bloqué à 30 C. L'élévatlon de la température à 42 C Inactlve le répresseur et Indult la transcrlptlon à partir du promoteur Pr (flgure 4).
Préparatlon de 1' ADN plasmldlque Les bactérles E. coll CAG 1139 portant le plasmlde sont mlses en culture à 37 C (I L milieu L~) jusqu'à obtentlon d'une DO à 600 nm d'envlron 0,4. On ajoute du chloramphénlcol à une concentratlon flnale de 170 ~g/ml, et on continue l'incubation à 37 C pendant 12-16 heures. Les bactéries sont Iysées par traitement avec une solution de NaOH-SDS, et l'ADN plasmidlque est puriflé à partir du culot bactérien par préclpltatlon avec le polyéthylène glycol. Le protocole u~ilisé est très exactement celu décrit par Sambrook et al ( 1989).
10 ~g d' ADN plasmidique pAT Pr Tet ainsi purlflé sont Incubés en présence de 5 unités d'endonucléase de restrlction BamHlt I G
mlnl~tes à 37 C (digestion ménagée). La forme linéaire du plasmlde est séparée sur gel d'agarose 0,8 %, et recueillie par électroélution. L'ADN est précipité par l'éthanol après extractlon au phénolfchloroforme. Le préclpllé
est reprls dans 90 ul d'eau dlstillée et traité par la nucléase de harlcot mung (mung bean nuclease, New England Biolabs) de façon à obtenlr le codon d'inltlatlon ATG sous forme d'extrémlté franche. Après extractlon au phénol/chloroforme et préclpltatlon par l'éthanol, I' ADN est dlssout dans 3G 90 1ll d'eau et incubé en présence de 100 unltés d'endonucléase de restrictlon Xhol (fi~ure 6~. Le fragment BamH1/Xho de 4500 bp est séparé
par électrophorèse sur gel d'agarose, recuellll par électroélullon, et préciplté par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme.
W O 93/19089 PC~r/FR93/00273 ~) '. ,', ,;, ~)) . J
Préparatlon de la séquence à Insérer La séquence codant pour la protélne de fus~on a été obtenue par la technlque de PCR à partlr de la forme répllcatlve double brln du 5 phage M l 3 mpl 0 ( l ~ ng). La forme répllcatlve double brln est préparée selon la technlque Indlquée cl-dessus pour 1' ADN plasrnldlque, à partlr d'un culot bactérlen E. coll, souche JM 101. I~n slte reconnu par l'endonucléase de restrlctlon Sna~l est Introdult à l'extrémlté 5' de la séquence codan~e.
La coupure par cette enzyme génére une extrémité franche correspondant I G au premler nucléotlde du premler codon de la protélne de fuslon. Un slte reconnu par l'endonucléase de restrrlctlon Xhol est créé à l'extrémlté 3'.
Immédlatement après le codon stop (Flg. 7). Le proault de PCR est préclplté par l'éthanol après extractlon au phénol/chloroforme. Le préclplté
est reprls par 90 ul de tarnpon Trls-HCI l 0 mM/ EDTA l rnl\1. L'AD~' est tralté par les endonucléases de restrlctlon SnaBI (15 unités, 2 heures, 37 C) pUlS Xhol ~25 unités, 2 heures, 37 C). Il est préclpité par l'éthanol après extractlon au phénol/chloroforme. Le préciplté est repris dans l ~ ,ul de tampon Tris-HCI l0 mM/EDTA I mM. L'insertion dans le \,ecteur d'expresslon est réallsée en utlllsant un rapport vecteur/lnsert de 1!5 (SOlt 20 3 ~I de la solutlon d'ADN vecteur et 3 ,ul de la solutlon d'lnsert). Le mélan~e est incubé en présence de T4 ADN ll~ase, 4 heures à température amblante.
Le mélange réactionnel est utllisé pour transformer des bactérles CA(; 1139 compétentes (traitement CaCI2). Les baclérles 25 transformées sélectlonnées par la réslstance à la tétracycllne sont testées pour l'expresslon de la protélne de fuslon.
Le vecteur alnsl obtenu pAT Pr cllFX bêta dlrlge la syn~hese d'une protélne de fuslon cllFX bêta globlne contenant:
- les 31 résidus l~i-termlnaux de la protélne Cll du phage lambda:
3~ - le tétrapeptlde lle-Glu-Gly-Arg, séquence reconnue par le facteur de coagulatlon X actl~é. ce qul permet de libérer la sous-unlté bêta globlne après purlflcatlon de la protéine de fuslon:
- la bêta globlne 3~
WO 93/19089 PCI/FR93~00273 EXEMPLE 2: Expression de la protéine dans Escherichia coli La souche E. coll CAG 1139 portant le plasmlde pAT Pr cllFX
bêta est Incubée à 30 C dans du mllleu tl9 (~a2HPO4 50 mMlKH2PO420 mM/NaCI 8,5 m~.l/NH4C125mM/MgSO4 0,1mM) contenant 2 g de glucose, 20g d'extralt de levure et 0.5 g de vltamlne ~I par litre) en présence de tétracycline (10 mg par lltre). Lorsque l'absorbance à 600 nm a~elnt 0,~-1,2, on élève rapldement la température à 42 C, et l'on con~lnue l'lncubation pendant 3-4 heures. Le culot bactérlen est congelé à -~ C.
EXEMPLE 3: Extraction et purification de la protéine de fusion Le culot bactérlen (100 g polds humlde) est décongelé et mls en suspension dans 100 ml Tris-HCI 50 mM, pH 8/ saccharose 25 %
(p/v)tEDTA 1 mM. Les bactérles sont Iysées par incubation en présence de 200 mg de Iysozyme (30 mlnutes dans la glace). On ajoute du MgC12, du .UnC12 et de la DNase I de façon à obtenir des concentratlons flnales respectives de 10 mM, I mM et 10 ~g/ml. Après 30 min d'incubatlon à
température ambiante, on ajoute au Iysat 200 ml de NaCl 0,2M/ aclde désoxycholique 1 % (p/v)/Nonldet P-40 1,6 % (v/v)/Tris-HCI 20 m~, pH
7,5/EDTA 2 mM. Le préclplté est recueilll par centrifugation à 5000 g, 10 mln, remis en suspenslon dans du Triton X-100 i % (v/v)/EDTA I m M et centrifu~é à nouveau. Les lava~es dans la solution de Triton X- 155 sont renouve~és jusqu'à obtentlon d'un précipité compact.
Le precipité de protélne est dlssout dans une solutlon de guanidine-HCl 6M/Tris-AcOH 25 mM, pH 5,0/DTA I mM/dlthlothre~tol mM. La solution est équlllbrée dans un tampon urée 8M/Trls-AcOH 2 5 mM, pH 5,0/EDTA 1 mM/dithlothreltol 1 mM par filtratlon sur une colonne de Sephadex G-25, pUlS déposée sur une colonne de CM-Sepharose (4 X 1~) 30 cm) équilibrée avec le même tampon. La pro~éine de fusion est éluée à
l'aide d'un ~radient linéaire formé par 500 ml d'urée 8M/Tris-AcOH 25 m~1, WO 93/19089 % f ~ 5 PCrtFR93/00273 pH ~.~/EDTA Im.~/dlthlo~hreltol I m,~l et 500 ml du meme lampon ~ddl~lonné de l~laCI qsp une concentratlon de ~,2 .~l. La protélne de fuslon est ensulte purlflée par fll~ratlon sur colonne de Sephacryl S-?~0 (5 x 65 cm) en mllleu guanldlne-HCI 5 .~l/Trls-HCI 50 m.~l, pH ~,G/EDT.~ I
5 m.~l/dlthlothreltol I m.~1. Les fractlons contenant la protélne sont rassemblées, dialysées contre de l'eau et Iyophillsées, ou dlalysées contre le tampon de cllvage pour être traltées immédlatement par le facteur Y
actlve.
.~près purlficatlon de la protéine de fuslon et hydrolyse lO trypslque, la présence de la mutatlon et le profil peptldique sont vérlflés par cnromatographle llqulde haute ~erformance (Baudin-Chlch et al, 19~7).
EXEMPLE 4: ClivaRe de la protéine de fusion par le facteur Xa I S La protéine Iyophllisée est dissoute dans une solutlon d'urée 8M/Tris-HCI 50 mM, pH 8.0/EDTA l mM/dithiothreitol l mM, pUlS dlalvSée contre le tampon de clivage: urée 0,5M/Tris-HCl 50mM, pH 8,0/CaCI2 1 mM. La protéine de fusion est incubée à 0 C en présence de facteur X
activé par le venin de vipère de Russel immobilisé sur Sepharose 6B actlvé
20 au bromure de cyanogène (rapport enzyme/substrat 1,5 % p/p). La quallté
du cliva~e est vérifiée par électrophorese sur gel de polyacrylamlde-SDS.
Après dialyse contre de l'eau, la protéine est Iyophllisée.
EXEMPLE 5: Construction du mutant bétaH2M
La mutation est Introdulte dans l'ADN en utlllsant un oli~onucleotide initiateur synthétlque de séquence dC AGG AGT C.~G C.~T
CAC CCT ACC C. Cette séquence est complémentalre à celle de l'.~D~c codant pour la sous-unlté beta de globine encadrant le codon de l'hlstldme 3G bêta (NA2). Le triplet Introdult CAT (au lieu de GTG) est altéré de telle sorte à coder pour une méthlonlne. La muta~énèse est réalisée en utlllsant WO 93/I9089 PCr/FR93/00273 ~" ~
la répllca~lon du phage ~113 dans lequel est mséré l'ADNc codant pour la chaîne bè~a de globme (Nagal ~c Thogersen, 1984), par la méthode de Nakamaye ~ Eckstem (19~6) précomsée par Amersham (Klt Amersham). Le prodult de la réaCTIon de mutagénèse est utlllsé pour transformer des bactérles compétentes E. coll, souche J~ 101 selon les méthodes classlques (,Nagai ~ Thogersen, 1987 ; Sambrook et al, 1989). Les phages portant la mutatlon sont détectés par séquençage de 1' ADN (méthode de Sanger, 1977). La séquence complete de l'ADNc codant pour la pro~élne de fuslon est vérlfiée de façon à s'assurer de l'lntégrlté de la séquence codante.
La séquence codante contenant la mutation est traitée comme décrlt ci-dessus pour être Insérée ~ans le vecteur d'expresslon.
EXEMPLE 6 : Construction du mutant betaH2 1 La mutatlon est Introduite dans l'ADNc en utilisant l'oligo-nucléotide initiateur dAGG AGT CAG GAT CAC CCT ACC C. Le trlplet GAT (pour GTG) permet de coder pour une isoleucine.
EXEMPLE 7: Construction du mutant bêtaF41Y
La mutatlon est introduite dans l'ADNc en utilisant l'oll~o-nucléotlde initiateur dGGA CTC AAA GTA CCT CTG GGT. Le trlplet GT~
(pour GAA) perrnet de coder pour une tyrosine.
EXEMPLE 8: Construction du vecteur pAT Pr Chim bêta73-alpha69 La construction codant pour la chimère bêta-alpha globlne es~
construite par PCR à partir de deux plasmides:
- le plasmide pAT Pr bêta,- portant le gène bêta globine (exemple 1),0 _ un plasmide portant l'ADNc alpha globine: alphal.
On utilise les amorces suivantes:
2 1 ' ~
:~ISI : 5' GCA TTT .~T GC.~ TTG ATG CC 3' Ch : 5' TTT CTC GAG TT.~ ACG GTA TTT GGA 3' D : 5' GTG CCT TTA GTG ATG CCG TGG CGC .~CG TGG
.'~CG .'lCA TGC C 3' D Inv : 5' TCC ACG TGC GCC ACG GCA TCA CTA .~AG GC.'~
C 3' Le fragment codant pour CIIFX NH2(1-73)bêta est ampllflé à
partlr du vecteur pAT Pr beta en utllisant les amorces Nsi et DlnY. Les conditlons sont les sulvantes:
Tampon PCR 5 ~1 x 12 ~1 Amorce Nsi 5 ~1 (à 10 ,uM) Amorce Dinv 5 IJI (à 10 ,uM) Plasmlde pAT Pr bêta 10 ng ( 1 ;JI) Taq polymérase (Cetus) 1 1ll H2O qsp 50 ~1 On réalise 27 cycles:
97~ C: 30 sec 58 C: I mn 70 C: 2 mn = (2 sec/cycle~
Le produit de PCR est précipité par J'éthanol après extractlon au p~énol/chloroforme. Le fragment correspondant à la tallle recherchée est recueilli par électroélutlon après électrophorèse sur gel d'agarose.
Le fragment codant pour alpha(69-141)COOH de l'alpha globlne est amplifié à partlr du plasmide alphalpJW101 (Wilson et al, 1978) en utilisant les amorces D et Ch. Les conditions sont les suivantes:
WO 93/t9089 PCI/FR93/00273 ~ v 2 2 Tampon PCR 5 ~1 x 1 2 ~ 1 .~morce D 5 ~1 (à 10 l~ltl) Amorce Cnlm6 5 ~1 (à 10 ~
Plasmlde alphal I ~1 ( 10 n~) Taq polymérase (Cetus) I IJI
H20 qsp 50 ,ul On reallse 27 cycles de la même manière que pour la premlère 10 amplificatlon.
Il esl purlflé comrne~ précédemment.
Une trolsleme ampllflcatlon est effectuée à partlr des deux fragments puriflés en utlllsant les amorces Nsi et Ch. Les conditlons sont les sulvantes:
Tampon PCR 5 .Uix 1 2 1~l Amorce Chim6 5 IJI (à 10 ~M) Amorce Nsi 5 IJI (à 10 ~M) ADN obtenu par la première PCR I 1~l lenviron 50 ng) ADN obtenu par la deuxième PCR 3 1~l (envlron 50 ng) Taq polymérase (Cetus) I 1~1 H2O qsp 50 ~1 On effectue 35 cycles:
97 C: 30 sec 55 C: 1 mn 70 C: 2 mn + (2 sectcycle) W O 93/19089 P ~ /FR93/00273 Le prodult de PCR est préclplté par l'éthanol après extractlon au phénol/chloroforme, puls purlflé. Il esl Inséré dans le plasmlde pAT Pr Tet aux sltes Nsl I et Xho 1. Ce vecteur permet d'expr~mer une protélne de fuslon comprenant:
5 - les 31 acldes amlnés N-termlnaux de la protélne Cll du phage lambda, - la séquence lle-Glu-Gly-Ar~ reconnue par le facteur Xa, - une sous-unlté chlmérlque de 146 acldes amlnés, constltuée par les résldus ~' termlnaux I à 73 Inclus de la chaîne bêta de globlne et les résldus C
termlnaux 69 à 141 de la chaîne alpha (chlmère NH2(1-73)bêta-alpha(69-10 141 )COOH). La flgure 9 schématlse les étapes de la constructlon.
Ce plasmlde est exprltné chez E. colJ, souche C ~G 1139(Grossman et al, 1983, Cell, 32~ 151-1 59). Cette souche de phénotype: F
thl leu thr LacY Ton~ SupE galK Lon 100 est transformée par la méthode conventlonnelle de traltement au CaC12.
La culture est effectuée en mllleu L~ en présence de tétracycllne 5G ,ug/ml à 30 C; quand la DO attelnt 0,8-1,2, I'expresslon de Ia protélne d'ADN est Induite par passage à 42 C. Après 2 heures~ 1l est posslble de mettre en évldence la synthèse de la chaîne (bêta-alpha) sur gel de SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie par comparaison avec un 20 échantlllon de culture de CAG I 139 non transformée. On estlme que la quant~té en chaîne bêta-alpha atteint 20 % des protélnes totales. La constructlon a été séquencée pour vérlIler qu'll n'y avait pas de mutatlon lors des PCR successlfs.
25 EXEMPLE 9: Caracterlsation fonctionnelle des hémoglobines recombinantes Mesures dans les conditions d'équilibre:
Après purlficatlon des solutlons d'Hb, les spectres d'absorbance sont 3~ enreglstrés et comparés au spectre de l'Hb A native oxygénée (spectropho-tometre Cary 219. Varlan, Palo Alto. Ca~ USA). Ces spectres permettent de tester la présence de méthémogloblne ou d'hémichrome (Szebem et al.
I 984 ).
WO 93/19089 PCI`/FR93~00273 `~t ~ 24 Les mesures de l'affinité pour l'oxygène à l'équillbre sont effectuées à l'alde d'un système automatlque commerclal (Hemox analyzer, TCS, Southamplon P~ SA) (Asakura, 1979) assoclant la mesure slmultanée de l'absorbance à deux longueurs d'onde par spectrophotométrle et celle de 5 la pression partlelle de l'oxygène par polarographle à l'alde d'une électrode à oxygène (YSI 5331). Dans les conditlons habltuelles les courbes de désoxygénatlon sont enreglstrées dans des solutlons d'Hb (60 à 100 ~1 en hème) dans un tampon 50 m,~/l blsTrls, 100 mM NaCl, pH 7,2 à 25C, 50 ~1 d'EDTA et 20 IJg/ml de catalase sont ajoutés au tampon pour llmlter 10 1'o%ydatlon de l'hémogloblne. La concentration de NaCI, le pH peuvent etre modifiés pour tester les différentes proprlétés de l'Hb recombmante (effet Bohr, effecteurs anlonlques). D'autres effecteurs naturels (2,3 dlphosphogly-cérate) ou non naturels (IHP, dérlvés du clofibrate) peuvent être ajoutés à
la solution au début de l'enre~lstrement. Typiquement la ~olutlon est 15 d'abord équilibrée sous un mélan~e ~azeux dont la pression partlelle en oxy~ène est d'au moins 350-4S0 mmHg pour assurer une saturatlon Inltlale quasi-cornplète de l'hémoglobine. La solution est alors désoxygénée lentement en adm~ttant de l'azote pur dans la cuvette de mesure. La duree de l'enregistrement est de 45 à 60 min pour assurer les condltlons 2G d'équilibre. Ces conditlons d'équilibre sont démontrées par la superposltlon des courbes de désoxygénation et de ré-oxygénation. La concentratlon d'Hb est mesurée après transformation en cyanmethémogloblne ~epsilons4~
mM lcm 1). La quantlté de methémoglobine (Hb oxydée) formée pendant l'enregistrement est mesurée par spectrophotométrie selon la méthode de 25 Benesh et al (1973).
200 à 300 couples de valeurs (Abs/PO2) sont en ~énéral enrcgistrés-et stockés sur bande magnétlque à l'alde d'un calculateur. Les valeurs de P50 (PO2 de deml-saturation et Index de l'affinIté pour l'oxy~ène) et n50 (index de la coopérativité) sont calculés à partlr des 30 mesures enre~istrées entre 40 et 60 % de saturation par ré~resslon llnéalre selon l'équa$ion empirlque de Hill; I'ensemble des données des courbes d'équilibre sont ajustées à l'équatlon du modèle allostérique à deux états quaternaires (Monod et al, 1965) à l'alde de l'algorithrne de régresslon WO 93/19089 PCr/FR93/00273 Iteratlve non-llnealre par molndres carrés (~evln~ton, 1969) comme décrlt en détall dans Klster. et al, ~1 987).
La Vltesse d'au~o-oYydatlon de l'hémoglobme est mesurée par spec~rophotométrle de ia solutlon ( 1 G0 ~ I hème~ Incubée dans un ~ampon 1~0 ml~1 Phosphate a 37 C en fonctlon du temps (0~24 h). La stablllté
thermlque est mesurée par Incubatlon des solutlons (300 ~J~1 hème) a 65 C
en fonctlon du temps (0--> 120 min).
î Mesures cinétiques Les mesures clnétlques sont effectuées dans les solutlons d~Hb recomblnantes équllibrées sous 1 ou 0,1 atm de monoxyde de carbone (CO).
Dans ~es études on mesure spéc~flguement la vltesse de recomblnalson du CO à l'hémoglobine après sa photodisssociation par un éclalr de lumlère laser (Marden et al, 1988).
Les études de photodissociation sont pratiquées à l'alde d~un système laser 10-ns (Quantel YG 585) délivrant 160 mJ à 532 nm. L'énergle du faisceau de photodissoclatlon peut etre modifiée pour étudler les conditions de photolyse partlelle.
Les échantillons sant é~udiés dans des cuvettes de I ou 2 mm de traje~ optique. Le fa~sceau de détection à 436 nm est quasl collnéalre avec le faisceau dc photodlssoclatlon. L'intensité de lumière transm~se est détectée par un photomultlplicateur (lP2~ Hamamatsu, Japon) et enregistrée sur un oscilloscope digltal (Lecroy 9400). Les données son~
25 ensuite transféries dans un mlcrocalculateur IBM pour les calculs des changemcnts d'absorbance et l'analyse des donnécs. Les slrnula~lons cinétiquff-~ont basees sur le modèle allostérique à deux états. Typlquemen~
la courbc cn~egis~rée pour l'Hb A native montre l'exlstence de deux vltesses de recombinaison du CO à l'hémoglobine: l'une est raplde et 30 correspond à la recombinalson à l'état R de forte affinité pour le llgand;
la deuxième est plus lentc et correspond à la recombinalson à l'état T de faible affinité. Les expérlences de cinétiques permettent de tester tres rapidement la fonctionallté des Hb recombinantes avec le m1n1mum d'échantillon.
W O 93/19089 P ~ /FR93/00273 ? ~ ~ 2 't, 3, "
En présence d'hémlne, les sous-unltés chlmérlques obtenues selon les exemples s'assemblent en tétramère qul flxe l'oxygène de façon réverslble pratlquement sans coopératlvlté mals avec une afflnlté
légèrement Inférleure à celle observée pour l'Hb A nat~ve et trente fols 5 Inférleure à celle du tétramère ~ 4.
. .
WO 93/19089 PCr/FR93/00273 27 .~ i REFERE~CES
Ahern ctal, FEBS Lelt 1976, 69, 99~102.
Arous etal, FEBS Lett 1981,126.1 14 116.
Asakura, C~i~ic~l Care Medicine 1979, 7, 391-39S
Baudin Chich elal. Ac~a Haematol. 198~, 78, 127~129.
Bihoreau aal. Protein Scicnce, sous presse.
Baetioni, Biochim. Biophys. Acta 1962, S9. 437 449.
Bakbu~ c~al, Blood ~986. 67. 9S7-961.
Benesch aal, Anal. Biochcm. 1973, SS. 245-248.
Be~cltactal, Naturc 1968, 217, 1016 1018.
Bctnini & Ciordano. Biochim. Biophys. Acta 1988, 9S7, 281-285.
Blouquit cral, F~BS Lctt. 1984, 172, I SS-158.
Bevington, in Datared~c~ion andcrror~nabscs, l969.
Bonavcntura & Riggs, 1. Biol. Chem 1968, 243, 980 991.
", Bonaventura cta~, J. Biol. Chem 1976, 2S1, ~S63 7571.
Bratu etal, Biochim. Biophys. Acta 1971, 251, 1-6.
Charachee~at. 1. Clin. Invcst.1973, 52,~858-2864.
D~;.~ !U!"- 106? 21~. fi63-665.
Dickcrson & Gcis."Hcmoglobin: Structure, Punclion, Evoll1tion, and Pathology l9~3, Thc Bcnjamin/ Cummines Publishing Company lnc. California.
Fcssas ctal. Br. ~. Hllematol. Ig82, S 1. S77.
F~nni & Pcmtz."Atlas of Molccular St~uctures in Biolo~y. Hacmoglobin and Myoglobin"
1981, D.C. PhiltiDs and F.M. Richards ~ds, Ciarcndon Prcss, Oxhrd.
G~ c al. FEBS Lett. 1977, 82, 243-246.
Gar~t aal, Biochim. Biophys. Acta 1976, 420, 97-104.
H~ano aal, Hcmoglobln 1990, 14, 217~222.
Hoffm~n ctal, P~c. N~tl. Ac~t. Sci. USA ~990,87,8S21-8S25.
Hu~mg aa~, Biochem. 1~, 29, 702~7023.
Idclson aal~ Naturc 1974, 249, 768-7~0.
~mamur~ctal, J. Clin. Invest 1969, 48, 2341-2348.
Joncs ~al, ~. Mol. E~vol. 19~6, 9, 37-44.
Kecling aal, J. Clin. Invest.1971. S0, 2395-2442.
King c~al, Br. 1. Hacmatol.lg7~, 22, 12S 134.
Kister, 1. ctal, ~. Biol. Chem. 1987, 262, 1208S-12091.
Knuth c~al, Acta Haematol Ig79, 61, 121 124.
KoJIotcy-Ahl~lu e~al, 3. Mcd. Gcnet. 1968, 5, 107-111.
Kura~h~ eta~, Naturc ~cw Biol.1973, 243, 27S 276.
Un et a~, Biochem. lg90, 29, SS62-5566 ~arten aal, Biochcmis~ry 1988, 27, 1659~1664).
Mannwci etal, Biochim. Biophys. Acta 1981, 668, 209-21 u;i ~( ~, ~B~ ~;; 1''85, 1 84, ! 0- ! 3.
Mérault ctal, Hcmo~lobin 1986. 10, S93-605.
Minnich ctal. Bloo~ 1965, 25, 830 R38.
Miyaji ctal, CJin. Chim. Acta 1966. 14, 624-629.
3~ Mono~J. ctetal, J. Mol. Biol. 196S, 12, 88-118) Moo Pcnn ctal, ~. Biol. Chcm.1976, ~S1. 7SS7-7562.
Moo-Pcnnc~al,Biochem. 1977, 16,4872-4879.
Moo-Penn aat, FEBS Lctt 1918, 92, S3-56.
Moo Pcnn aal. Am. J. Hematol. 1981, 11, 137 145.
Nagsi & Thogcrscn, Naturc I984, 309, 810-812.
Nag~li & Thogcrscn, Meth. E~nzymol. 1987, 153, 461-~81.
Nagai aal, Proc. Nstl. Acad. Sci. VSA 1985, 82, 7252-7255.
Nagai c~al, Naturc 1987, 329, 858 860.
Nagai c~a~, BioEssays 1988, 8, 79 8~.
WO 93/19089 PCr/FR93/00273 ~ ~ 28 ~".
N~ eletal, ~. Engl.J. M~d.-1976. 295, 125-130.
Na~ama~e & Eckstein, ~uclcic Ac. Res. 1986,14, 9679-9698.
Ogala ct~l, Hcmoglobin 1986, 10. 469-481.
Ohbaetal, Biochim. Biophys. Act~ 197Sa, 405, lSS-160.
Ohb~ aal, Acta Hacma~ol.3ap. 1975b, 38, 53-S8.
Ohba ctal, Hcmoglobin 1986, 10, 109-125.
Pagnicrctal, Br. ~. H~cn~ol. 1990, 74, S31-S34.
Ranney aal. Nat~lrc 1967. 213. 876~878.
Sambrook ct al, Molccul~r Cloning. Cold Spr~ng ~larbour Laborato~ Prcss, Ncw-York, 20nd cdition, 1989.
San~crc~al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, '~4, 5463-5467.
Schndderclal. Biochim. Biophys. Acta 197Sa, 400, 365 373.
Schneidcre~al, Biochcm Gcnet.1975b, 13, 411 415.
Shih c~al, Hcmogtobin 1987, 11, 453~464.
Stadnun e~al, Bri~. J. Hacmato~.1970, ~18, 435-446.
Szebcni etal" Biochcm. 1. 1984, 220, 695 692.
I~mcctal, ~. Mol. Biol. 1991, 218. 761-767.
l)ltsisaal, ~lood 1976, 47, 827-832.
Tumeretal, Biochcm Genet 1~76, 14, S77-S~S.
Wa~cnbach ct al, Biotechnology 1991, 9, 57~61.
Wa~3~nan ctal, FEBS Lcn 1972, 27, 298 ~00.
Wajcman & Joncs, INSBRM 1977, 70, 269-276 Waicman ctal, ~iochim. Biophys. Acta 1991, 1096, 60-66.
YVilliam~on ctal, Hcmoglobin l987, 11, Z21-230.
Williamson etal, Hcmoglobin 1990, 14, 137-14S.
Wilson aal, Nuclcic Ac. Rcs.1978, S, S63-S81.
Ycager etal, Pedi~s. Rc~.1983, 17, S03-S07.
Rothschild ~37 (C3) Trp ~ Arg Gacon e~al, 1977 Hazebrouck ~38 (C4) Thr ~ Pro Blouquit et ~, 1984 Hammcrsmith ~42 (CD1) Phe ~ S D~ic e~al, 1967; Ohba et al, 1975b 3S Bucurcs~ ,B42 (CD1) Phe ~ Lcu Bratu e~al, 1971; Keeling e~ al, 1971 WO 93/t9089 P(~/FR93/00273 Tableau 1 (suite) Sendagi ~42 (CD l ) Phe ~ Val Oga~a et al, 1986 Chervely ~45 (CD4) Phe ~ Se~ Yeager et al, 1983 Okaloosa ~48 (CD7)Leu ~ Arg Cha~chee~al, 1973 Bologna ,B61 (5) Lys ) Met Marinucci eral, 1981 J-Cairo ~65 (E9) Lys ~ Gln Garel e~al, 1976 Chico ~66 (E10) Lys ~ Thr Shih etal, 1987 I 0 Bristol ~67 (E11) Val ~ Asp Steadman etal, 1970 Seattle ~70 (E14) Ala , Asp Ku~chi et al. 1973 Vancouver ~73 (E17) Asp ~ Tyr Jones e~al, 1976 Korlc-Bu ~73 (E17) Asp ~ Asn Konotey-Ahulu etal, 1968;
l 5 Wajcman & Joncs, 1977 Mobile ~73 (E17) Asp ~ Val Schneider etal, 1975b rlburg ~73 (E17) Asp ~ Gly Bcmini & Gior~ano, 1988 Aalborg ~74 (E18) Gly ~ Ar& Williamson etal, 1990 Calais ,B76 (E20) Ala ~ Pro Wajcman aal, 1991 Providcnce ~82 (EF63 Lys ~ Asn ~ Asp Bonavcnn~a etal, Moo Penn e~al, 1976 Pyrgos ~83 ~7) Cily ~ Asp Tatsis ~tal, 1976 Agenogi ~90 (F6) Glu ~ Lys Miyaji etal, 1966 2 5 Roseau-Point-.e ~ 90 (F6) Glu ~ Gly M~rault etal, 1985 Canbbean ,B91 IF7) Leu ~ Arg Ahcrn e~al, 1976 Kansas ,B102 (G4) Asn ~ Thr Bonavennlra & Riggs, 1968 Beth Israel ~102 (G4~ Asn ~ S~r Nagel eral, 1976 Saint- Mandé ~102 (G43 Asn ~ Tyr Arous ~al, 1981 Bur~e ~107 (G9) Gly ~ Arg Turneretal, 1976 Yoshizuka ~108 (G10) Asn ~ Asp Imamura etal, 1969 Prcsbytcrian ~108 (G10) Asn ~ Lys Moo Penn etal, 1978 Wo 93/l9089 ~ pcr/FRs3/oo273 Tableau 1 (suite) Pcterborough ,B 1 11 (G13) Val ~ Phe King etal, 1972 New-York ~113 (G15) Val ~ Glu Ranney etal, 1967 D-Punjab ~121 (GH4)GIu aln Baglioni, 1962 LaDesirade ~129 (H7) Ala ~ Val Méraultetal, 1986 Yamagata ~132 (H10) Lys ~ Asn Harano eral, 1990 Hope ,B136 (H14) Gly~ Asp Minnich etal, 1965 Himeji ~140 (H18) Ala ~ Asp Ohba e~al, 1986 NB : n'ont ~té pris en compte que les hémoglobines contenant une seule mutation soit dans la sous-unit~CX , soit dans la sous-unité ~.
WO 93/19089 PCI`/FR93/00273 J
Comme cela a été indiqué précédemment, les séquences W et Y doivent permettre de reconstltuer une Interface alphal bêta2 de HbA ou similalre qul est Impllquée dans la transltlon R ~ T. C'est pourquol, les segments (W) et (Y) seront similalres aux segments ClCD et FGtG de 5 I'interface alphal bêta2 de l'hémoglobine humaine, mais il est posslble de la modifier si besoin est en prévoyant certalnes mutations ponctuelles.
Les éléments essentiels impliqués dans la structure de l'interface alpha I bêta2 sont les suivants Chaîne Chaîne Chaîne Chaîne Bêta Alpha Bêta Alpha 37Trp38Thr Tyr 145 Tyr 140 40Arg41Thr AsnlO2 Asn97 41 Phe42Tyr Glu 101 Val96 96Leu91 Leu Asp99 Asp94 97His92Arg His97 Arg92 98Val93Val Phe41 Tyr42 99Asp94Asp Ar~40 Thr41 l OOPro95Pro Gln39 Lys40 lOlGlu96Val Trp37 Thr3~
145Tyr140Tyr Pro36 Pro37 On peut prevoir les mutatlons flgurant au tableau 2 ci-après.
W O 93/19089 ~ ~ Jt ~. ~ PC~r/FR93/00273 Tableau 2 Exemples de mu~tions de résidus situés à l'interface a l ~2 Site mutation par~cularité de la mutation . .
~40 (C6) Arg~ Asp charge négative encombrcment plus faible que Arg Arg~ Val hydr~phobe fort encombrement sterique Arg~ Ala hydrophobe faible encombrement stérique Arg~ Ser groupement hydroxyle faible cncombremem stérique Arg ) Lys propriétés proches de celle dc Arg 341 (C7) Phe~ Tyr groupemcnt hydroxylc possibilité dc liaison H
~101 (G3) Glu~ Ala hydrophobc faible encombraTlcnt stérique 2~
~102 (G4) Asn ) Ala hydropbobe faible encombremerlt stérique Asn ) Gly encomt~men~ st~rique nul ~ . .
3~
WO 93/19089 PCI`/FR93/00273 Parmi les chalnes polypep~idiques plus partlculièremen~
Intéressanles, 1l faut cller les chaînes mlxtes alpha,bêta, c'est-à-dlre notamment les chaînes constltuées de l'extrémlté N-termlnale d'une chaîne de type bêta de la globine, et de l'extrémlté C-termlnale de la chaîne 5 alpha de la globlne; ou, réclproquement, une chaîne constltuée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne alpha de la globlne et de l'extréml~é
C-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine.
Ces sous-unltés chlmérlques seront notées, respectlvement, NH2bêta-alphaCOOH ou NH2alpha-bêtaCOOH.
La jonctlon alpha-bêta se sltuera de préférence au n~veau de la zone flexible de la poche de l'.hème, c'est-à-dire dans le segment EF.
Le polypeptlde le plus Intéressant comporte l'extrémlté
N-terminale de la chaîne bêta de la globine fusionnée jusqu'à l'amlno-acide 73 compris à la partie C-termlnale de la chaîne alpha de la globlne à partir 15 de l'amino-acide 69 comprls.
Ce type de molécule chimérique associée sous forme tétramérique est représenté à la figure 8 sur laquelle on a visuallsé les interfaces alphalbêta2 reconstituées dans le tétramère.
Il est possible de prévoir que deux chaines polypeptldlques 20 soient reliées par une séquence, de préférence peptidique, située entre la séquence Z de l'une et la séquence V de l'autre, les deux chaînes sont alns solidaires, ce qui favorlse la stabilité du tétramère.
Les deux chaînes peuven~ également être rellées par réticulation ou par tout type d'interaction biochimique comme par exemple 25 des liaisons de pontage covalent (dérivés de diaspirine ou de pyrldoxal phosphate).
Le transporteur d'oxygène selon l'invention comportera une structure héminique; il peut s'aglr d'une molécule d'hème naturel ou blen d'une métalloporphyrine dans laquelle l'alome de fer est remplacé par un 30 autre métal notamment le cobalt.
WO 93/19089 PCr/FR93/00273 fv 3 ~ ~
Dans le second mode de réallsation de l'lnventlon, le ~étramère est constltué essentlellement de quatre polypeptldes Iden~lques ayant chacun une structure de type bêta-globlne. Ce type de tétramère dénommé bêta4 sera, de préférence, constitué par des chaînes de type beta comportant l'une des mutations citées précédemment.
Il pourra, comme cela a été décrit, être préparé par association de dimères, ces dlmères étant formés par llalson des extrémltés N et C termlnales de deux sous-unités.
Le transporteur d'oxygène selon l'invention présente en général une affinité pour l'oxygène diminuée par rapport à l'hémo~loblne naturelle, de préférence, cette afflnité est dirninuée d'au molns 20 '0 par rapport à celle de l'hémoglobine naturelle.
Le transporteur selon la présente invention est, de préférence, obtenu par culture d'un organlsme transformé produisant ladite chaîne, 1l peut s'agir de cellules eucaryotes comportant une séquence d'Al:)N codant pour ladite chaîne sous la dépendance d'éléments d'expression assurant I'expression de ladite séquence dans ladite cellule hôte.
La technologie des ADN recombinants permettant l'expresslon d'une séquence peptidigue est maintenant largement connue et n'a pas à
être décrite en détail.
La cellule hôte est de préference une cellule eucaryote et de préférence une levure et/ou une cellule eucaryote supérieure ou un anlmal transgénigue. Quant au système d'expression, il peut s'agir SOIt de plasmides à réplication autonome, soit de plasmides permettant l'lntégra-tion dans le génome de la cellule hôte. Les séquences codantes pouvant être sous la dépendance d'un promoteur hétérologue mais efficace dans l'h~te ou bicn d'un promoteur homologue, ou bien encore d'un promoteur chromosomique. Il est possible é~alement de prevoir des systèmes assurant, par exemple, la secrétion de ces chaînes polypeptidiques.
Dans ce qui SUIt~ on donnera des exemples de systeme d'expression des chaînes polypeptldiques selon la présente inventlon qul ne pourront, en aucun cas, être considérées comme des limitations.
I 'obtention des tétramères est, la plupart du lemps spontanée, elle peut être favorlsée suivant la structure exacte du té~ramere WO 93/19089 PCr/~R93/00~73 , i~, 1 4 par des conditions partlcullères de mise en solutlon, notamment dans certalnes condltlons de pH et/ou de force lonlque.
L'lntroduction d'un groupe hémlnlque peut être spontanée, en partlculler chez les eucaryotes, et les tétramères obtenus sont "hémlnlsés~
sans qu'il y ait lleu de prévolr une étape spéclfique. La plupart du temps l'hème sera rajouté lors d'une étape ultérleure.
La présente Inventlon concerne également des procédés permettant la préparatlon de ces chaînes polypeptldiques par des technlques mettant en oeuvre les ADN recomblnants et l'éventuelle formation du tétramère, comme cela a été décrlt précédemment (Hoffman et al, 1990; Nagal ~ Thogersen, 1984, 1987; Nagai et al, 1985; Tame et al, 1991 ; Wagenbach et al, 1991).
Enfin, la présente Inventlon concerne l'utllisatlon des chaînes à tltre de médicament, notamment pour le transport d'oxygène en comblnaison avec un support acceptable dans le domalne transfuslonnel.
Les exemples cl-après permettront de mleux mettre en évidence certaines caractéristiques et avantages de la présente Inventlon.
Dans ce qui suit:
- la Figure 1 schématlse la séquence nucléotid?que et en amlno-acides de la chaîne alpha, - la Figure 2 schématise la séquence nucléotidique et en amlno-acides de la cha~ne bêta, - la Figure 3 schématlse la structure spatiale de la chaîne bêta, avec indicatlon de la nomenclature des hélices, - la Figure 4 représente le schéma du plasmide pATPrTet, - la Flgure 5 représente le schéma du plasmlde pATPr cllFX
bêta, - les Flgures 6 et 7 schématisent la préparatlon du vecteur pATPr cllFX bêta Gb, - la Flgure 8 représente le schéma de la structure spatlale d'un dimère selon l'inventlon, notamment la reconstltution de l'lnterface alpha I bêta2.
- la Figure 9 schématlse les étapes de la constructlon du vecteur pATPr Chlm bêta73-alpha6~.
W093/19089 ;~ t ~ PCI/FR93/00273 Afln de mieux comprendre la structure de l'hémogloblne, on pourra se reporter à des artlcles tels que celul de ~/lax F. Perutz (1987) m .~olecular aasls of ~lood Dlseases alnsl qu'à des ouvrages tels ceux de Dlckerson ~ Gels (1983) et Ferml ~ Perutz (1981).
Sur la figure I on a représenté la structure en amlno-acldes de la chaîne alpha et sur la figure 2 la structure en amino-acldes de la chaîne bêta.
La configuration spatiale de la chaîne bêta est représentée à
la figure 3 avec la nomenclature des différents segments qui vont de I'extrémité NH~ terminale vers l'extrémlté COOH terminale :
NA, A, B, C, CD, D, E, EF, F, FG G, GH, H et HC;
quant à la chaîne alpha elle présente la structure:
NA, A, AB, a, c, CE, E, EF, F, FG, G, GH, H et HC.
Les se~ments A, ~, C, E, F, G et H présentent une structure sensiblement hélicoldale alors que les segments de jonctlon ne présentent pas une telle structure.
Les acides aminés sont numérotés soit à partir de l'extrémlté
N-terminale par ordre croissant, soit en affectant à un acide amlné la désignation de son hélice et son rang dans celle-ci.
Le 36ème aclde aminé de la cha;ne bêta est la Proline, 1l est bêta 36(C2) Pro, c'est-à-dire le deuxième aclde aminé de l'héllce C.
PRODUCTION DE LA PROTEINE DE FUSION DANS E. COLI
Les manipulations portant sur 1' ADN ont été effec~uées en utilisant essentiellement les techniques classiques décrites par Sambrook et al dans le manuel "Molecular Cloning". Sauf indication contralre, les digestions par les enzymes de restriction ou de modification sont réallsées selon les indica~ions des fabricants (Amersham, ~oehringer Manhelm; New 30 England aiolabs~. L' ADNc codant pour la protéine de fusion clIFX bêta globine a été cloné par Nagai et al (1985) dans le phage M13 rnpl~. La construction M13 mplO clIFX bêta nous a été fournie sur demande au Medlcal Reseàrch Council (Cambridge, Grande-aretagne).
WO 93/19089 PCI /FR93~00273 `3 1 6 EXEMPLE 1: Construction du vecteur d'expression p AT Pr CIIFX bêta Gb Le vecteur de base pAT Pr Tet présente une orlglne de répllcatlon dérlvée de pBR 322 et porte le gène de réslstance à la tétracycllne. Il permet l'expresslon de protélnes hétérologues sous le contrôle du promoteur Pr du phage lambda. L'actlvlté de ce promoteur est réprimée par le répresseur Cl (allèle C1857, thermosensible). Le promoteur Pr est bloqué à 30 C. L'élévatlon de la température à 42 C Inactlve le répresseur et Indult la transcrlptlon à partir du promoteur Pr (flgure 4).
Préparatlon de 1' ADN plasmldlque Les bactérles E. coll CAG 1139 portant le plasmlde sont mlses en culture à 37 C (I L milieu L~) jusqu'à obtentlon d'une DO à 600 nm d'envlron 0,4. On ajoute du chloramphénlcol à une concentratlon flnale de 170 ~g/ml, et on continue l'incubation à 37 C pendant 12-16 heures. Les bactéries sont Iysées par traitement avec une solution de NaOH-SDS, et l'ADN plasmidlque est puriflé à partir du culot bactérien par préclpltatlon avec le polyéthylène glycol. Le protocole u~ilisé est très exactement celu décrit par Sambrook et al ( 1989).
10 ~g d' ADN plasmidique pAT Pr Tet ainsi purlflé sont Incubés en présence de 5 unités d'endonucléase de restrlction BamHlt I G
mlnl~tes à 37 C (digestion ménagée). La forme linéaire du plasmlde est séparée sur gel d'agarose 0,8 %, et recueillie par électroélution. L'ADN est précipité par l'éthanol après extractlon au phénolfchloroforme. Le préclpllé
est reprls dans 90 ul d'eau dlstillée et traité par la nucléase de harlcot mung (mung bean nuclease, New England Biolabs) de façon à obtenlr le codon d'inltlatlon ATG sous forme d'extrémlté franche. Après extractlon au phénol/chloroforme et préclpltatlon par l'éthanol, I' ADN est dlssout dans 3G 90 1ll d'eau et incubé en présence de 100 unltés d'endonucléase de restrictlon Xhol (fi~ure 6~. Le fragment BamH1/Xho de 4500 bp est séparé
par électrophorèse sur gel d'agarose, recuellll par électroélullon, et préciplté par l'éthanol après extraction au phénol/chloroforme.
W O 93/19089 PC~r/FR93/00273 ~) '. ,', ,;, ~)) . J
Préparatlon de la séquence à Insérer La séquence codant pour la protélne de fus~on a été obtenue par la technlque de PCR à partlr de la forme répllcatlve double brln du 5 phage M l 3 mpl 0 ( l ~ ng). La forme répllcatlve double brln est préparée selon la technlque Indlquée cl-dessus pour 1' ADN plasrnldlque, à partlr d'un culot bactérlen E. coll, souche JM 101. I~n slte reconnu par l'endonucléase de restrlctlon Sna~l est Introdult à l'extrémlté 5' de la séquence codan~e.
La coupure par cette enzyme génére une extrémité franche correspondant I G au premler nucléotlde du premler codon de la protélne de fuslon. Un slte reconnu par l'endonucléase de restrrlctlon Xhol est créé à l'extrémlté 3'.
Immédlatement après le codon stop (Flg. 7). Le proault de PCR est préclplté par l'éthanol après extractlon au phénol/chloroforme. Le préclplté
est reprls par 90 ul de tarnpon Trls-HCI l 0 mM/ EDTA l rnl\1. L'AD~' est tralté par les endonucléases de restrlctlon SnaBI (15 unités, 2 heures, 37 C) pUlS Xhol ~25 unités, 2 heures, 37 C). Il est préclpité par l'éthanol après extractlon au phénol/chloroforme. Le préciplté est repris dans l ~ ,ul de tampon Tris-HCI l0 mM/EDTA I mM. L'insertion dans le \,ecteur d'expresslon est réallsée en utlllsant un rapport vecteur/lnsert de 1!5 (SOlt 20 3 ~I de la solutlon d'ADN vecteur et 3 ,ul de la solutlon d'lnsert). Le mélan~e est incubé en présence de T4 ADN ll~ase, 4 heures à température amblante.
Le mélange réactionnel est utllisé pour transformer des bactérles CA(; 1139 compétentes (traitement CaCI2). Les baclérles 25 transformées sélectlonnées par la réslstance à la tétracycllne sont testées pour l'expresslon de la protélne de fuslon.
Le vecteur alnsl obtenu pAT Pr cllFX bêta dlrlge la syn~hese d'une protélne de fuslon cllFX bêta globlne contenant:
- les 31 résidus l~i-termlnaux de la protélne Cll du phage lambda:
3~ - le tétrapeptlde lle-Glu-Gly-Arg, séquence reconnue par le facteur de coagulatlon X actl~é. ce qul permet de libérer la sous-unlté bêta globlne après purlflcatlon de la protéine de fuslon:
- la bêta globlne 3~
WO 93/19089 PCI/FR93~00273 EXEMPLE 2: Expression de la protéine dans Escherichia coli La souche E. coll CAG 1139 portant le plasmlde pAT Pr cllFX
bêta est Incubée à 30 C dans du mllleu tl9 (~a2HPO4 50 mMlKH2PO420 mM/NaCI 8,5 m~.l/NH4C125mM/MgSO4 0,1mM) contenant 2 g de glucose, 20g d'extralt de levure et 0.5 g de vltamlne ~I par litre) en présence de tétracycline (10 mg par lltre). Lorsque l'absorbance à 600 nm a~elnt 0,~-1,2, on élève rapldement la température à 42 C, et l'on con~lnue l'lncubation pendant 3-4 heures. Le culot bactérlen est congelé à -~ C.
EXEMPLE 3: Extraction et purification de la protéine de fusion Le culot bactérlen (100 g polds humlde) est décongelé et mls en suspension dans 100 ml Tris-HCI 50 mM, pH 8/ saccharose 25 %
(p/v)tEDTA 1 mM. Les bactérles sont Iysées par incubation en présence de 200 mg de Iysozyme (30 mlnutes dans la glace). On ajoute du MgC12, du .UnC12 et de la DNase I de façon à obtenir des concentratlons flnales respectives de 10 mM, I mM et 10 ~g/ml. Après 30 min d'incubatlon à
température ambiante, on ajoute au Iysat 200 ml de NaCl 0,2M/ aclde désoxycholique 1 % (p/v)/Nonldet P-40 1,6 % (v/v)/Tris-HCI 20 m~, pH
7,5/EDTA 2 mM. Le préclplté est recueilll par centrifugation à 5000 g, 10 mln, remis en suspenslon dans du Triton X-100 i % (v/v)/EDTA I m M et centrifu~é à nouveau. Les lava~es dans la solution de Triton X- 155 sont renouve~és jusqu'à obtentlon d'un précipité compact.
Le precipité de protélne est dlssout dans une solutlon de guanidine-HCl 6M/Tris-AcOH 25 mM, pH 5,0/DTA I mM/dlthlothre~tol mM. La solution est équlllbrée dans un tampon urée 8M/Trls-AcOH 2 5 mM, pH 5,0/EDTA 1 mM/dithlothreltol 1 mM par filtratlon sur une colonne de Sephadex G-25, pUlS déposée sur une colonne de CM-Sepharose (4 X 1~) 30 cm) équilibrée avec le même tampon. La pro~éine de fusion est éluée à
l'aide d'un ~radient linéaire formé par 500 ml d'urée 8M/Tris-AcOH 25 m~1, WO 93/19089 % f ~ 5 PCrtFR93/00273 pH ~.~/EDTA Im.~/dlthlo~hreltol I m,~l et 500 ml du meme lampon ~ddl~lonné de l~laCI qsp une concentratlon de ~,2 .~l. La protélne de fuslon est ensulte purlflée par fll~ratlon sur colonne de Sephacryl S-?~0 (5 x 65 cm) en mllleu guanldlne-HCI 5 .~l/Trls-HCI 50 m.~l, pH ~,G/EDT.~ I
5 m.~l/dlthlothreltol I m.~1. Les fractlons contenant la protélne sont rassemblées, dialysées contre de l'eau et Iyophillsées, ou dlalysées contre le tampon de cllvage pour être traltées immédlatement par le facteur Y
actlve.
.~près purlficatlon de la protéine de fuslon et hydrolyse lO trypslque, la présence de la mutatlon et le profil peptldique sont vérlflés par cnromatographle llqulde haute ~erformance (Baudin-Chlch et al, 19~7).
EXEMPLE 4: ClivaRe de la protéine de fusion par le facteur Xa I S La protéine Iyophllisée est dissoute dans une solutlon d'urée 8M/Tris-HCI 50 mM, pH 8.0/EDTA l mM/dithiothreitol l mM, pUlS dlalvSée contre le tampon de clivage: urée 0,5M/Tris-HCl 50mM, pH 8,0/CaCI2 1 mM. La protéine de fusion est incubée à 0 C en présence de facteur X
activé par le venin de vipère de Russel immobilisé sur Sepharose 6B actlvé
20 au bromure de cyanogène (rapport enzyme/substrat 1,5 % p/p). La quallté
du cliva~e est vérifiée par électrophorese sur gel de polyacrylamlde-SDS.
Après dialyse contre de l'eau, la protéine est Iyophllisée.
EXEMPLE 5: Construction du mutant bétaH2M
La mutation est Introdulte dans l'ADN en utlllsant un oli~onucleotide initiateur synthétlque de séquence dC AGG AGT C.~G C.~T
CAC CCT ACC C. Cette séquence est complémentalre à celle de l'.~D~c codant pour la sous-unlté beta de globine encadrant le codon de l'hlstldme 3G bêta (NA2). Le triplet Introdult CAT (au lieu de GTG) est altéré de telle sorte à coder pour une méthlonlne. La muta~énèse est réalisée en utlllsant WO 93/I9089 PCr/FR93/00273 ~" ~
la répllca~lon du phage ~113 dans lequel est mséré l'ADNc codant pour la chaîne bè~a de globme (Nagal ~c Thogersen, 1984), par la méthode de Nakamaye ~ Eckstem (19~6) précomsée par Amersham (Klt Amersham). Le prodult de la réaCTIon de mutagénèse est utlllsé pour transformer des bactérles compétentes E. coll, souche J~ 101 selon les méthodes classlques (,Nagai ~ Thogersen, 1987 ; Sambrook et al, 1989). Les phages portant la mutatlon sont détectés par séquençage de 1' ADN (méthode de Sanger, 1977). La séquence complete de l'ADNc codant pour la pro~élne de fuslon est vérlfiée de façon à s'assurer de l'lntégrlté de la séquence codante.
La séquence codante contenant la mutation est traitée comme décrlt ci-dessus pour être Insérée ~ans le vecteur d'expresslon.
EXEMPLE 6 : Construction du mutant betaH2 1 La mutatlon est Introduite dans l'ADNc en utilisant l'oligo-nucléotide initiateur dAGG AGT CAG GAT CAC CCT ACC C. Le trlplet GAT (pour GTG) permet de coder pour une isoleucine.
EXEMPLE 7: Construction du mutant bêtaF41Y
La mutatlon est introduite dans l'ADNc en utilisant l'oll~o-nucléotlde initiateur dGGA CTC AAA GTA CCT CTG GGT. Le trlplet GT~
(pour GAA) perrnet de coder pour une tyrosine.
EXEMPLE 8: Construction du vecteur pAT Pr Chim bêta73-alpha69 La construction codant pour la chimère bêta-alpha globlne es~
construite par PCR à partir de deux plasmides:
- le plasmide pAT Pr bêta,- portant le gène bêta globine (exemple 1),0 _ un plasmide portant l'ADNc alpha globine: alphal.
On utilise les amorces suivantes:
2 1 ' ~
:~ISI : 5' GCA TTT .~T GC.~ TTG ATG CC 3' Ch : 5' TTT CTC GAG TT.~ ACG GTA TTT GGA 3' D : 5' GTG CCT TTA GTG ATG CCG TGG CGC .~CG TGG
.'~CG .'lCA TGC C 3' D Inv : 5' TCC ACG TGC GCC ACG GCA TCA CTA .~AG GC.'~
C 3' Le fragment codant pour CIIFX NH2(1-73)bêta est ampllflé à
partlr du vecteur pAT Pr beta en utllisant les amorces Nsi et DlnY. Les conditlons sont les sulvantes:
Tampon PCR 5 ~1 x 12 ~1 Amorce Nsi 5 ~1 (à 10 ,uM) Amorce Dinv 5 IJI (à 10 ,uM) Plasmlde pAT Pr bêta 10 ng ( 1 ;JI) Taq polymérase (Cetus) 1 1ll H2O qsp 50 ~1 On réalise 27 cycles:
97~ C: 30 sec 58 C: I mn 70 C: 2 mn = (2 sec/cycle~
Le produit de PCR est précipité par J'éthanol après extractlon au p~énol/chloroforme. Le fragment correspondant à la tallle recherchée est recueilli par électroélutlon après électrophorèse sur gel d'agarose.
Le fragment codant pour alpha(69-141)COOH de l'alpha globlne est amplifié à partlr du plasmide alphalpJW101 (Wilson et al, 1978) en utilisant les amorces D et Ch. Les conditions sont les suivantes:
WO 93/t9089 PCI/FR93/00273 ~ v 2 2 Tampon PCR 5 ~1 x 1 2 ~ 1 .~morce D 5 ~1 (à 10 l~ltl) Amorce Cnlm6 5 ~1 (à 10 ~
Plasmlde alphal I ~1 ( 10 n~) Taq polymérase (Cetus) I IJI
H20 qsp 50 ,ul On reallse 27 cycles de la même manière que pour la premlère 10 amplificatlon.
Il esl purlflé comrne~ précédemment.
Une trolsleme ampllflcatlon est effectuée à partlr des deux fragments puriflés en utlllsant les amorces Nsi et Ch. Les conditlons sont les sulvantes:
Tampon PCR 5 .Uix 1 2 1~l Amorce Chim6 5 IJI (à 10 ~M) Amorce Nsi 5 IJI (à 10 ~M) ADN obtenu par la première PCR I 1~l lenviron 50 ng) ADN obtenu par la deuxième PCR 3 1~l (envlron 50 ng) Taq polymérase (Cetus) I 1~1 H2O qsp 50 ~1 On effectue 35 cycles:
97 C: 30 sec 55 C: 1 mn 70 C: 2 mn + (2 sectcycle) W O 93/19089 P ~ /FR93/00273 Le prodult de PCR est préclplté par l'éthanol après extractlon au phénol/chloroforme, puls purlflé. Il esl Inséré dans le plasmlde pAT Pr Tet aux sltes Nsl I et Xho 1. Ce vecteur permet d'expr~mer une protélne de fuslon comprenant:
5 - les 31 acldes amlnés N-termlnaux de la protélne Cll du phage lambda, - la séquence lle-Glu-Gly-Ar~ reconnue par le facteur Xa, - une sous-unlté chlmérlque de 146 acldes amlnés, constltuée par les résldus ~' termlnaux I à 73 Inclus de la chaîne bêta de globlne et les résldus C
termlnaux 69 à 141 de la chaîne alpha (chlmère NH2(1-73)bêta-alpha(69-10 141 )COOH). La flgure 9 schématlse les étapes de la constructlon.
Ce plasmlde est exprltné chez E. colJ, souche C ~G 1139(Grossman et al, 1983, Cell, 32~ 151-1 59). Cette souche de phénotype: F
thl leu thr LacY Ton~ SupE galK Lon 100 est transformée par la méthode conventlonnelle de traltement au CaC12.
La culture est effectuée en mllleu L~ en présence de tétracycllne 5G ,ug/ml à 30 C; quand la DO attelnt 0,8-1,2, I'expresslon de Ia protélne d'ADN est Induite par passage à 42 C. Après 2 heures~ 1l est posslble de mettre en évldence la synthèse de la chaîne (bêta-alpha) sur gel de SDS-PAGE coloré au bleu de Coomassie par comparaison avec un 20 échantlllon de culture de CAG I 139 non transformée. On estlme que la quant~té en chaîne bêta-alpha atteint 20 % des protélnes totales. La constructlon a été séquencée pour vérlIler qu'll n'y avait pas de mutatlon lors des PCR successlfs.
25 EXEMPLE 9: Caracterlsation fonctionnelle des hémoglobines recombinantes Mesures dans les conditions d'équilibre:
Après purlficatlon des solutlons d'Hb, les spectres d'absorbance sont 3~ enreglstrés et comparés au spectre de l'Hb A native oxygénée (spectropho-tometre Cary 219. Varlan, Palo Alto. Ca~ USA). Ces spectres permettent de tester la présence de méthémogloblne ou d'hémichrome (Szebem et al.
I 984 ).
WO 93/19089 PCI`/FR93~00273 `~t ~ 24 Les mesures de l'affinité pour l'oxygène à l'équillbre sont effectuées à l'alde d'un système automatlque commerclal (Hemox analyzer, TCS, Southamplon P~ SA) (Asakura, 1979) assoclant la mesure slmultanée de l'absorbance à deux longueurs d'onde par spectrophotométrle et celle de 5 la pression partlelle de l'oxygène par polarographle à l'alde d'une électrode à oxygène (YSI 5331). Dans les conditlons habltuelles les courbes de désoxygénatlon sont enreglstrées dans des solutlons d'Hb (60 à 100 ~1 en hème) dans un tampon 50 m,~/l blsTrls, 100 mM NaCl, pH 7,2 à 25C, 50 ~1 d'EDTA et 20 IJg/ml de catalase sont ajoutés au tampon pour llmlter 10 1'o%ydatlon de l'hémogloblne. La concentration de NaCI, le pH peuvent etre modifiés pour tester les différentes proprlétés de l'Hb recombmante (effet Bohr, effecteurs anlonlques). D'autres effecteurs naturels (2,3 dlphosphogly-cérate) ou non naturels (IHP, dérlvés du clofibrate) peuvent être ajoutés à
la solution au début de l'enre~lstrement. Typiquement la ~olutlon est 15 d'abord équilibrée sous un mélan~e ~azeux dont la pression partlelle en oxy~ène est d'au moins 350-4S0 mmHg pour assurer une saturatlon Inltlale quasi-cornplète de l'hémoglobine. La solution est alors désoxygénée lentement en adm~ttant de l'azote pur dans la cuvette de mesure. La duree de l'enregistrement est de 45 à 60 min pour assurer les condltlons 2G d'équilibre. Ces conditlons d'équilibre sont démontrées par la superposltlon des courbes de désoxygénation et de ré-oxygénation. La concentratlon d'Hb est mesurée après transformation en cyanmethémogloblne ~epsilons4~
mM lcm 1). La quantlté de methémoglobine (Hb oxydée) formée pendant l'enregistrement est mesurée par spectrophotométrie selon la méthode de 25 Benesh et al (1973).
200 à 300 couples de valeurs (Abs/PO2) sont en ~énéral enrcgistrés-et stockés sur bande magnétlque à l'alde d'un calculateur. Les valeurs de P50 (PO2 de deml-saturation et Index de l'affinIté pour l'oxy~ène) et n50 (index de la coopérativité) sont calculés à partlr des 30 mesures enre~istrées entre 40 et 60 % de saturation par ré~resslon llnéalre selon l'équa$ion empirlque de Hill; I'ensemble des données des courbes d'équilibre sont ajustées à l'équatlon du modèle allostérique à deux états quaternaires (Monod et al, 1965) à l'alde de l'algorithrne de régresslon WO 93/19089 PCr/FR93/00273 Iteratlve non-llnealre par molndres carrés (~evln~ton, 1969) comme décrlt en détall dans Klster. et al, ~1 987).
La Vltesse d'au~o-oYydatlon de l'hémoglobme est mesurée par spec~rophotométrle de ia solutlon ( 1 G0 ~ I hème~ Incubée dans un ~ampon 1~0 ml~1 Phosphate a 37 C en fonctlon du temps (0~24 h). La stablllté
thermlque est mesurée par Incubatlon des solutlons (300 ~J~1 hème) a 65 C
en fonctlon du temps (0--> 120 min).
î Mesures cinétiques Les mesures clnétlques sont effectuées dans les solutlons d~Hb recomblnantes équllibrées sous 1 ou 0,1 atm de monoxyde de carbone (CO).
Dans ~es études on mesure spéc~flguement la vltesse de recomblnalson du CO à l'hémoglobine après sa photodisssociation par un éclalr de lumlère laser (Marden et al, 1988).
Les études de photodissociation sont pratiquées à l'alde d~un système laser 10-ns (Quantel YG 585) délivrant 160 mJ à 532 nm. L'énergle du faisceau de photodissoclatlon peut etre modifiée pour étudler les conditions de photolyse partlelle.
Les échantillons sant é~udiés dans des cuvettes de I ou 2 mm de traje~ optique. Le fa~sceau de détection à 436 nm est quasl collnéalre avec le faisceau dc photodlssoclatlon. L'intensité de lumière transm~se est détectée par un photomultlplicateur (lP2~ Hamamatsu, Japon) et enregistrée sur un oscilloscope digltal (Lecroy 9400). Les données son~
25 ensuite transféries dans un mlcrocalculateur IBM pour les calculs des changemcnts d'absorbance et l'analyse des donnécs. Les slrnula~lons cinétiquff-~ont basees sur le modèle allostérique à deux états. Typlquemen~
la courbc cn~egis~rée pour l'Hb A native montre l'exlstence de deux vltesses de recombinaison du CO à l'hémoglobine: l'une est raplde et 30 correspond à la recombinalson à l'état R de forte affinité pour le llgand;
la deuxième est plus lentc et correspond à la recombinalson à l'état T de faible affinité. Les expérlences de cinétiques permettent de tester tres rapidement la fonctionallté des Hb recombinantes avec le m1n1mum d'échantillon.
W O 93/19089 P ~ /FR93/00273 ? ~ ~ 2 't, 3, "
En présence d'hémlne, les sous-unltés chlmérlques obtenues selon les exemples s'assemblent en tétramère qul flxe l'oxygène de façon réverslble pratlquement sans coopératlvlté mals avec une afflnlté
légèrement Inférleure à celle observée pour l'Hb A nat~ve et trente fols 5 Inférleure à celle du tétramère ~ 4.
. .
WO 93/19089 PCr/FR93/00273 27 .~ i REFERE~CES
Ahern ctal, FEBS Lelt 1976, 69, 99~102.
Arous etal, FEBS Lett 1981,126.1 14 116.
Asakura, C~i~ic~l Care Medicine 1979, 7, 391-39S
Baudin Chich elal. Ac~a Haematol. 198~, 78, 127~129.
Bihoreau aal. Protein Scicnce, sous presse.
Baetioni, Biochim. Biophys. Acta 1962, S9. 437 449.
Bakbu~ c~al, Blood ~986. 67. 9S7-961.
Benesch aal, Anal. Biochcm. 1973, SS. 245-248.
Be~cltactal, Naturc 1968, 217, 1016 1018.
Bctnini & Ciordano. Biochim. Biophys. Acta 1988, 9S7, 281-285.
Blouquit cral, F~BS Lctt. 1984, 172, I SS-158.
Bevington, in Datared~c~ion andcrror~nabscs, l969.
Bonavcntura & Riggs, 1. Biol. Chem 1968, 243, 980 991.
", Bonaventura cta~, J. Biol. Chem 1976, 2S1, ~S63 7571.
Bratu etal, Biochim. Biophys. Acta 1971, 251, 1-6.
Charachee~at. 1. Clin. Invcst.1973, 52,~858-2864.
D~;.~ !U!"- 106? 21~. fi63-665.
Dickcrson & Gcis."Hcmoglobin: Structure, Punclion, Evoll1tion, and Pathology l9~3, Thc Bcnjamin/ Cummines Publishing Company lnc. California.
Fcssas ctal. Br. ~. Hllematol. Ig82, S 1. S77.
F~nni & Pcmtz."Atlas of Molccular St~uctures in Biolo~y. Hacmoglobin and Myoglobin"
1981, D.C. PhiltiDs and F.M. Richards ~ds, Ciarcndon Prcss, Oxhrd.
G~ c al. FEBS Lett. 1977, 82, 243-246.
Gar~t aal, Biochim. Biophys. Acta 1976, 420, 97-104.
H~ano aal, Hcmoglobln 1990, 14, 217~222.
Hoffm~n ctal, P~c. N~tl. Ac~t. Sci. USA ~990,87,8S21-8S25.
Hu~mg aa~, Biochem. 1~, 29, 702~7023.
Idclson aal~ Naturc 1974, 249, 768-7~0.
~mamur~ctal, J. Clin. Invest 1969, 48, 2341-2348.
Joncs ~al, ~. Mol. E~vol. 19~6, 9, 37-44.
Kecling aal, J. Clin. Invest.1971. S0, 2395-2442.
King c~al, Br. 1. Hacmatol.lg7~, 22, 12S 134.
Kister, 1. ctal, ~. Biol. Chem. 1987, 262, 1208S-12091.
Knuth c~al, Acta Haematol Ig79, 61, 121 124.
KoJIotcy-Ahl~lu e~al, 3. Mcd. Gcnet. 1968, 5, 107-111.
Kura~h~ eta~, Naturc ~cw Biol.1973, 243, 27S 276.
Un et a~, Biochem. lg90, 29, SS62-5566 ~arten aal, Biochcmis~ry 1988, 27, 1659~1664).
Mannwci etal, Biochim. Biophys. Acta 1981, 668, 209-21 u;i ~( ~, ~B~ ~;; 1''85, 1 84, ! 0- ! 3.
Mérault ctal, Hcmo~lobin 1986. 10, S93-605.
Minnich ctal. Bloo~ 1965, 25, 830 R38.
Miyaji ctal, CJin. Chim. Acta 1966. 14, 624-629.
3~ Mono~J. ctetal, J. Mol. Biol. 196S, 12, 88-118) Moo Pcnn ctal, ~. Biol. Chcm.1976, ~S1. 7SS7-7562.
Moo-Pcnnc~al,Biochem. 1977, 16,4872-4879.
Moo-Penn aat, FEBS Lctt 1918, 92, S3-56.
Moo Pcnn aal. Am. J. Hematol. 1981, 11, 137 145.
Nagsi & Thogcrscn, Naturc I984, 309, 810-812.
Nag~li & Thogcrscn, Meth. E~nzymol. 1987, 153, 461-~81.
Nagai aal, Proc. Nstl. Acad. Sci. VSA 1985, 82, 7252-7255.
Nagai c~al, Naturc 1987, 329, 858 860.
Nagai c~a~, BioEssays 1988, 8, 79 8~.
WO 93/19089 PCr/FR93/00273 ~ ~ 28 ~".
N~ eletal, ~. Engl.J. M~d.-1976. 295, 125-130.
Na~ama~e & Eckstein, ~uclcic Ac. Res. 1986,14, 9679-9698.
Ogala ct~l, Hcmoglobin 1986, 10. 469-481.
Ohbaetal, Biochim. Biophys. Act~ 197Sa, 405, lSS-160.
Ohb~ aal, Acta Hacma~ol.3ap. 1975b, 38, 53-S8.
Ohba ctal, Hcmoglobin 1986, 10, 109-125.
Pagnicrctal, Br. ~. H~cn~ol. 1990, 74, S31-S34.
Ranney aal. Nat~lrc 1967. 213. 876~878.
Sambrook ct al, Molccul~r Cloning. Cold Spr~ng ~larbour Laborato~ Prcss, Ncw-York, 20nd cdition, 1989.
San~crc~al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1977, '~4, 5463-5467.
Schndderclal. Biochim. Biophys. Acta 197Sa, 400, 365 373.
Schneidcre~al, Biochcm Gcnet.1975b, 13, 411 415.
Shih c~al, Hcmogtobin 1987, 11, 453~464.
Stadnun e~al, Bri~. J. Hacmato~.1970, ~18, 435-446.
Szebcni etal" Biochcm. 1. 1984, 220, 695 692.
I~mcctal, ~. Mol. Biol. 1991, 218. 761-767.
l)ltsisaal, ~lood 1976, 47, 827-832.
Tumeretal, Biochcm Genet 1~76, 14, S77-S~S.
Wa~cnbach ct al, Biotechnology 1991, 9, 57~61.
Wa~3~nan ctal, FEBS Lcn 1972, 27, 298 ~00.
Wajcman & Joncs, INSBRM 1977, 70, 269-276 Waicman ctal, ~iochim. Biophys. Acta 1991, 1096, 60-66.
YVilliam~on ctal, Hcmoglobin l987, 11, Z21-230.
Williamson etal, Hcmoglobin 1990, 14, 137-14S.
Wilson aal, Nuclcic Ac. Rcs.1978, S, S63-S81.
Ycager etal, Pedi~s. Rc~.1983, 17, S03-S07.
Claims (16)
1) Transporteur d'oxygène du type comportant quatre chaînes polypeptidiques de type globine, pratiquement identiques, lesdites chaînes incorporant l'hème et ayant chacune une structure de type globine séquencée :
V - (W) - X - (Y) - Z
dans laquelle :
- V, X, et Z sont des séquences polypeptidiques de type globine, et - (W) et (Y) sont deux séquences polypeptidiques complémen-taires susceptibles d'interagir pour constituer une interface qui, lorsqu'elle appartient à deux chaînes distinctes, est au moins en partie similaire à
l'interface alpha1 bêta2, et pouvant s'associer en reconstituant ladite interface similaire à
l'interface alpha1 bêta2. afin d'assurer une activité de fixation réversible de l'oxygène.
V - (W) - X - (Y) - Z
dans laquelle :
- V, X, et Z sont des séquences polypeptidiques de type globine, et - (W) et (Y) sont deux séquences polypeptidiques complémen-taires susceptibles d'interagir pour constituer une interface qui, lorsqu'elle appartient à deux chaînes distinctes, est au moins en partie similaire à
l'interface alpha1 bêta2, et pouvant s'associer en reconstituant ladite interface similaire à
l'interface alpha1 bêta2. afin d'assurer une activité de fixation réversible de l'oxygène.
2) Transporteur d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé
en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à X
comporte un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux D, E et F des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pouvant être reliés ente eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples.
en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à X
comporte un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux D, E et F des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pouvant être reliés ente eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples.
3) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à Z comporte un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments hélicoïdaux G et H des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pouvant être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples.
4) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la séquence polypeptidique de type globine correspondant à V comporte au moins un ou plusieurs segments hélicoïdaux choisis parmi les segments A, B et C des chaînes de type alpha ou bêta, lesdits segments pouvant être reliés entre eux par des segments non hélicoïdaux ou par des liaisons simples.
5) Transporteur d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé
en ce que chaque chaîne est constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine comportant le segment CD. et de l'extrémité C-terminale de la chaîne de type alpha de la globine comportant le segment FG.
en ce que chaque chaîne est constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine comportant le segment CD. et de l'extrémité C-terminale de la chaîne de type alpha de la globine comportant le segment FG.
6) Transporteur d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé
en ce que chaque chaîne est constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type alpha de la globine et de l'extrémité C-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine.
en ce que chaque chaîne est constituée de l'extrémité N-terminale d'une chaîne de type alpha de la globine et de l'extrémité C-terminale d'une chaîne de type bêta de la globine.
7) Transporteur d'oxygène selon la revendication 5, caractérisé
en ce que l'extrémité N-terminale de la chaîne bêta de la globine est fusionnée jusqu'à l'amino-acide 73 compris à la partie C-terminal de la chaîne alpha de la globine à partir de l'amino-acide 69 compris.
en ce que l'extrémité N-terminale de la chaîne bêta de la globine est fusionnée jusqu'à l'amino-acide 73 compris à la partie C-terminal de la chaîne alpha de la globine à partir de l'amino-acide 69 compris.
8) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que deux chaînes polypeptidiques sont reliées, notamment par une séquence peptidique, entre la séquence Z de l'une et V de l'autre.
9) Transporteur d'oxygène selon la revendication 1, caractérisé
en ce que les quatre chaînes polypeptidiques sont des chaînes de type bêta globine.
en ce que les quatre chaînes polypeptidiques sont des chaînes de type bêta globine.
10) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à
9, caractérisé en ce qu'il comporte des séquences provenant de globine de type alpha ou bêta humaine ayant subi au moins une mutation.
9, caractérisé en ce qu'il comporte des séquences provenant de globine de type alpha ou bêta humaine ayant subi au moins une mutation.
11) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à
10, caractérisé en ce que l'hème comporte une substitution de l'atome de fer par un autre métal.
10, caractérisé en ce que l'hème comporte une substitution de l'atome de fer par un autre métal.
12) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à
11, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour l'oxygène diminuée par rapport à l'hémoglobine naturelle.
11, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour l'oxygène diminuée par rapport à l'hémoglobine naturelle.
13) Transporteur d'oxygène selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il présente une affinité pour l'oxygène diminuée d'au moins 20 % par rapport à l'hémoglobine naturelle.
14) Transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à
13, caractérisé en ce que la chaîne peptidique est obtenue par culture d'un organisme transformé produisant ladite chaîne.
13, caractérisé en ce que la chaîne peptidique est obtenue par culture d'un organisme transformé produisant ladite chaîne.
15) Transporteur d'oxygène selon la revendication 14, caractérisé en ce que l'organisme transformé est une cellule eucaryote comportant une séquence d'ADN codant pour ladite chaîne sous la dépendance d'éléments d'expression assurant l'expression de ladite séquence dans ladite cellule hôte.
16) Composition pharmaceutique, caractérisé en ce qu'elle contient un transporteur d'oxygène selon l'une des revendications 1 à 13, dans un véhicule acceptable physiologiquement.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9203224A FR2688784B1 (fr) | 1992-03-18 | 1992-03-18 | Transporteur d'oxygene. |
| FR92/03224 | 1992-03-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2132345A1 true CA2132345A1 (fr) | 1993-09-30 |
Family
ID=9427797
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002132345A Abandoned CA2132345A1 (fr) | 1992-03-18 | 1993-03-18 | Transporteur d'oxygene |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0633895A1 (fr) |
| JP (1) | JPH07507543A (fr) |
| AU (1) | AU4809093A (fr) |
| CA (1) | CA2132345A1 (fr) |
| FR (1) | FR2688784B1 (fr) |
| WO (1) | WO1993019089A2 (fr) |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| ATE142692T1 (de) * | 1989-05-10 | 1996-09-15 | Somatogen Inc | Herstellung von hämoglobin und analogen davon durch bakterien oder hefen |
| WO1991013158A1 (fr) * | 1990-02-28 | 1991-09-05 | Delta Biotechnology Limited | Production de proteines dans la levure |
| US5239061A (en) * | 1990-06-20 | 1993-08-24 | Research Corporation Technologies, Inc. | Modified human hemoglobin, blood substitutes containing the same, and vectors for expressing the modified hemoglobin |
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1992
- 1992-03-18 FR FR9203224A patent/FR2688784B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-03-18 CA CA002132345A patent/CA2132345A1/fr not_active Abandoned
- 1993-03-18 EP EP93920553A patent/EP0633895A1/fr not_active Withdrawn
- 1993-03-18 AU AU48090/93A patent/AU4809093A/en not_active Abandoned
- 1993-03-18 WO PCT/FR1993/000273 patent/WO1993019089A2/fr not_active Application Discontinuation
- 1993-03-18 JP JP5516327A patent/JPH07507543A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FR2688784B1 (fr) | 1995-06-30 |
| FR2688784A1 (fr) | 1993-09-24 |
| AU4809093A (en) | 1993-10-21 |
| EP0633895A1 (fr) | 1995-01-18 |
| WO1993019089A3 (fr) | 1993-10-28 |
| WO1993019089A2 (fr) | 1993-09-30 |
| JPH07507543A (ja) | 1995-08-24 |
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Dead |