CA2132218A1 - Sequence peptidique apte a induire une reaction d'hypersensibilite de type retarde en presence de bacteries vivantes du complexe mycobacterium tuberculosis et ses applications - Google Patents
Sequence peptidique apte a induire une reaction d'hypersensibilite de type retarde en presence de bacteries vivantes du complexe mycobacterium tuberculosis et ses applicationsInfo
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Abstract
2132218 9319093 PCTABS00163 La présente invention concerne une séquence peptidique apte à initier des réactions d'hypersensibilité retardée d'intensité différente en présence de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas plus de 0,5 % en poids d'acides aminés tyrosine, phénylalanine, méthionine, histidine, arginine et cystéine, ainsi que les applications diagnostiques et thérapeutiques d'un peptide ou d'une protéine comprenant ladite séquence.
Description
W093/19093 w~ 18 PCT/FR93/00268 - Sequence pe~tidique aDte à induire une reaction d'hy-persensibilité de type retardé en présence de bacteri~s vivantes - du oomplexe MYcobacterium tuberculosis et ses applications.
. La présente invention concerne une nouvelle protéine antigénique apte à provoquer des réactions . d'hypersensibilités retard~es d'intensité diff~rente en présence de bactéries du eomplexe Mycobacterium tubercu-losis ~ivantes ou mortes, ses applications diagnostiques et thérapeutiques notamment comme vaccin.
Ce complexe MycQbacterium tuberculosis - comprend quatre espèces : Mycobacte~ium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacte~ium af~icanum, Mycobacte-rium microti (le Minor et Ve~on; bact~r~ologie Médicale 1990, 2~me ed. p. 966).
La réaction d'hypersensibilité de type retardé (HSR) à la tuberculine, est utilisée de façon ~ courante comme moyen de diagnostic de la tuberculose.
- 15 Cette epreuve à la tuberculine est particulièrement ' utilisée ~omme moyen de diagnostic aux Etats-Unis ou aux ¦ Pays-Bas, pays où il n'existe pas ~u plus de vaccination ¦ par le BCG. Une recente mise au point (1990) de l'Ameri-I can Thoracic Society préconise en particulier l'utilisa-tion de ce test diagnostique et en précise les limites pour la campagne nationale d'éradication totale de la tuberculose qui se met en place aux Etats-Unis. Pour la France la pratique médicale est un peu différente du fait de l'utilisation large du BCG et de la fréquence encore relativement élevée de la tuberculose. La réaction à la tuberculine est utilisée pour suivre la sensibilisation secondaire à la vaccination et aussi pour apporter des arguments en faveur de l'existence d'une infection tuberculeuse. Cette indication diagnostique est basee sur l'augmentation nette de l'intensité de la réaction chez un sujet donne ou sur l'intensite très elevee de la reac~ion. .!~ai~ cette noLion quantitative est di~f~cile _ apprécier ~vec exactitude lorsque _es reac~ions WO93/19093 ~ PC~/FR93/00268 tuberculiniques sont pratiquees et/ou lues par des personnes différentes.
En fait, la réaction cutanée d'hypersensibi-lité de type retard;e à la tuberculine ne permet pas 5actuellement de différencier de façon certaine les sujets malades présentant une tubercu~ose en évo1ution des sujets sensibilisés antérieurement. En effet des sujets porteurs de bacilles vivants nombreux ~malades tubercu-leux ou sujets récemment va~cines) peuvent presenter la 10meme réactivite cutanée à la tuberculine que des su~ets ayant éte; sensibilisés antérieurement par une primo-infection guérie spontanement ou ayant souffert d'une tuberculose actuellement guérie.
Les inventeurs ont isolé et purifié une 15protéine nouvelle, dénommée LIP-DTH à partir du milieu de culture de BCG qui se révèle apte à provoquer une hypersensibilité de type retardé chez des cobayes ne . presentant pas de consanguini~é immunisès avec des :! bacilles (BCG) vivants, sans à l'inverse provoquer de j 20r~action importante chez des cobayes immunisés avec des ! bacilles (BC~) morts.
Cett~e différence de réactivité a également eté observée chez des souris de deux lignées differentes (C57BI/6 et C3H/He).
25De même, les cobayes et les souris ayant reçu des bacilles virulents de la tuberculose (souche H37Rv) . montrent une réactivité vis-à-vis de cette protéine identique à la réaction observée chez les animaux ayant recu le BCG vivant.
30L'etude de la composition en acides aminés de LIP-DTH a révele une protéine ayant une composition très inhabituelle en acides aminés, de nombreux aminoacides tels que la t-` rosine, la phenylalanine, la methionine, l'histidine :'~rginine e~ la c~steine etant absents ou '- presents en q~antites on détec~a~les.
-WO93/19093 ~ PCT/FR93/00268 La presente invention a ainsi pour objet une - séquence peptidique apte à initier des reactions d'hyper-sensibilité retardée d'intensit~ dif~érente en présence I de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes ! . 5 du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle ne contient pas plus de 0,5 % en poids des acides amin~s tyrosine, ph~nylala~ine, méthionine, histidine, arginine et cystéine.
L'inYenti~n a également pour objet un peptide ou une protéine apte à induire une réponse immunitaire chez l'hôte humain ou animal auquel elle est administrée, ayant une séquence peptidique telle que définie ci-dessuc et caractérisée en ce que sa composition globale en acides aminés, exprimée en pourcenta~e par rapport au poids moléculaire total est sensiblement la suivante :
, ~ Asp/Asn : 1,2 . Thr : 12,2 , Ser : 2,5 Glu/Gln : 11,5 Gly : 7,7 Ala : 8,9 . Val - : 9,8 ! Ile : 2,8 ! Leu : 1,8 Lys : 1,6 . Pro : 40,0 . La protéine selon l'invention peut être obtenue à partir ~ de surnageant de cultures de BCG par les etapes de ,i - i purification consistant en :
(a) une filtration sùr tamis moleculaire, et, (b) une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE et (c) une chromatographie de phases .nverses.
La proteine selon l'invention induit une hypersensibilité de type retardé tres intense en présence de bacilles vivants et beaucoup mo~ns intense en presence .
W093/19093 ~ PCT/FR93/00268 de bacilles morts.
L'acti~ité "tuberculine" de cette protéine - est ainsi équivalente à environ 415 000 Unit~s Interna-tionales de Tuberculine (UIT) par mg chez les cobayes immunisés avec des bacilles vivants, et à 3 000 UIT par mg che~ les cobayes immunisés avec des bacilles morts.
La prés~nte invention a donc également pour objet une composition de diagnostic caractéris~e en ce qu'elle comprend une proteine selon l'invention.
Cette composition e~t utilisée pour détecter la présence de bact~ries virulentes notamment pour le diagnostic in vitro ou in vivo de la tuberculose, chez 1'homme ou chez 1'animal (mamm~fère~.
Pour le diagnostic in vivo de la ~ubercu-lose, la composi~i~n comprend par exemple de 1 ng à 1 ~g de protéine/ml. Avantageusement, la composition de diagnostic comprend également une solution saline contenant un agent tensio-actif destiné ~ ~viter l'adhé-I rence de la protéine antigénique au recipient de condi-~ 20 tionnement ou à la seringue utilisée pour 1'injection.
', Un excipient particulièrement préféré pour la composition selon l'inv~ntion comprend :
- 75 g/l de glycocolle - 20 g/l de NaCl
. La présente invention concerne une nouvelle protéine antigénique apte à provoquer des réactions . d'hypersensibilités retard~es d'intensité diff~rente en présence de bactéries du eomplexe Mycobacterium tubercu-losis ~ivantes ou mortes, ses applications diagnostiques et thérapeutiques notamment comme vaccin.
Ce complexe MycQbacterium tuberculosis - comprend quatre espèces : Mycobacte~ium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacte~ium af~icanum, Mycobacte-rium microti (le Minor et Ve~on; bact~r~ologie Médicale 1990, 2~me ed. p. 966).
La réaction d'hypersensibilité de type retardé (HSR) à la tuberculine, est utilisée de façon ~ courante comme moyen de diagnostic de la tuberculose.
- 15 Cette epreuve à la tuberculine est particulièrement ' utilisée ~omme moyen de diagnostic aux Etats-Unis ou aux ¦ Pays-Bas, pays où il n'existe pas ~u plus de vaccination ¦ par le BCG. Une recente mise au point (1990) de l'Ameri-I can Thoracic Society préconise en particulier l'utilisa-tion de ce test diagnostique et en précise les limites pour la campagne nationale d'éradication totale de la tuberculose qui se met en place aux Etats-Unis. Pour la France la pratique médicale est un peu différente du fait de l'utilisation large du BCG et de la fréquence encore relativement élevée de la tuberculose. La réaction à la tuberculine est utilisée pour suivre la sensibilisation secondaire à la vaccination et aussi pour apporter des arguments en faveur de l'existence d'une infection tuberculeuse. Cette indication diagnostique est basee sur l'augmentation nette de l'intensité de la réaction chez un sujet donne ou sur l'intensite très elevee de la reac~ion. .!~ai~ cette noLion quantitative est di~f~cile _ apprécier ~vec exactitude lorsque _es reac~ions WO93/19093 ~ PC~/FR93/00268 tuberculiniques sont pratiquees et/ou lues par des personnes différentes.
En fait, la réaction cutanée d'hypersensibi-lité de type retard;e à la tuberculine ne permet pas 5actuellement de différencier de façon certaine les sujets malades présentant une tubercu~ose en évo1ution des sujets sensibilisés antérieurement. En effet des sujets porteurs de bacilles vivants nombreux ~malades tubercu-leux ou sujets récemment va~cines) peuvent presenter la 10meme réactivite cutanée à la tuberculine que des su~ets ayant éte; sensibilisés antérieurement par une primo-infection guérie spontanement ou ayant souffert d'une tuberculose actuellement guérie.
Les inventeurs ont isolé et purifié une 15protéine nouvelle, dénommée LIP-DTH à partir du milieu de culture de BCG qui se révèle apte à provoquer une hypersensibilité de type retardé chez des cobayes ne . presentant pas de consanguini~é immunisès avec des :! bacilles (BCG) vivants, sans à l'inverse provoquer de j 20r~action importante chez des cobayes immunisés avec des ! bacilles (BC~) morts.
Cett~e différence de réactivité a également eté observée chez des souris de deux lignées differentes (C57BI/6 et C3H/He).
25De même, les cobayes et les souris ayant reçu des bacilles virulents de la tuberculose (souche H37Rv) . montrent une réactivité vis-à-vis de cette protéine identique à la réaction observée chez les animaux ayant recu le BCG vivant.
30L'etude de la composition en acides aminés de LIP-DTH a révele une protéine ayant une composition très inhabituelle en acides aminés, de nombreux aminoacides tels que la t-` rosine, la phenylalanine, la methionine, l'histidine :'~rginine e~ la c~steine etant absents ou '- presents en q~antites on détec~a~les.
-WO93/19093 ~ PCT/FR93/00268 La presente invention a ainsi pour objet une - séquence peptidique apte à initier des reactions d'hyper-sensibilité retardée d'intensit~ dif~érente en présence I de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes ! . 5 du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle ne contient pas plus de 0,5 % en poids des acides amin~s tyrosine, ph~nylala~ine, méthionine, histidine, arginine et cystéine.
L'inYenti~n a également pour objet un peptide ou une protéine apte à induire une réponse immunitaire chez l'hôte humain ou animal auquel elle est administrée, ayant une séquence peptidique telle que définie ci-dessuc et caractérisée en ce que sa composition globale en acides aminés, exprimée en pourcenta~e par rapport au poids moléculaire total est sensiblement la suivante :
, ~ Asp/Asn : 1,2 . Thr : 12,2 , Ser : 2,5 Glu/Gln : 11,5 Gly : 7,7 Ala : 8,9 . Val - : 9,8 ! Ile : 2,8 ! Leu : 1,8 Lys : 1,6 . Pro : 40,0 . La protéine selon l'invention peut être obtenue à partir ~ de surnageant de cultures de BCG par les etapes de ,i - i purification consistant en :
(a) une filtration sùr tamis moleculaire, et, (b) une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE et (c) une chromatographie de phases .nverses.
La proteine selon l'invention induit une hypersensibilité de type retardé tres intense en présence de bacilles vivants et beaucoup mo~ns intense en presence .
W093/19093 ~ PCT/FR93/00268 de bacilles morts.
L'acti~ité "tuberculine" de cette protéine - est ainsi équivalente à environ 415 000 Unit~s Interna-tionales de Tuberculine (UIT) par mg chez les cobayes immunisés avec des bacilles vivants, et à 3 000 UIT par mg che~ les cobayes immunisés avec des bacilles morts.
La prés~nte invention a donc également pour objet une composition de diagnostic caractéris~e en ce qu'elle comprend une proteine selon l'invention.
Cette composition e~t utilisée pour détecter la présence de bact~ries virulentes notamment pour le diagnostic in vitro ou in vivo de la tuberculose, chez 1'homme ou chez 1'animal (mamm~fère~.
Pour le diagnostic in vivo de la ~ubercu-lose, la composi~i~n comprend par exemple de 1 ng à 1 ~g de protéine/ml. Avantageusement, la composition de diagnostic comprend également une solution saline contenant un agent tensio-actif destiné ~ ~viter l'adhé-I rence de la protéine antigénique au recipient de condi-~ 20 tionnement ou à la seringue utilisée pour 1'injection.
', Un excipient particulièrement préféré pour la composition selon l'inv~ntion comprend :
- 75 g/l de glycocolle - 20 g/l de NaCl
- 2,37~ ml/l de Brij 35 à 10 - 30 ml/l de Na2HPO4 lM pH7,1 - équilibre : eau distillée apyrogène, l'excipient étant autoclavé pendant 20 min à 120 C.
La composition est administrée de préférence par voie intradermique à raison de 0,1 ml de solution dosée à 2 UIT (unités internationales de tuberculine) en utilisant une serin~ue à tuberculine munie d'une aiguille de 4/10~ sur 'a face antérieure de l'avant-bras selon la méthode u~iiisee pour le test à 1~ tuberculine.
La composition est administrée de préférence par voie intradermique à raison de 0,1 ml de solution dosée à 2 UIT (unités internationales de tuberculine) en utilisant une serin~ue à tuberculine munie d'une aiguille de 4/10~ sur 'a face antérieure de l'avant-bras selon la méthode u~iiisee pour le test à 1~ tuberculine.
3~ 3'autres '~eieâ d'admin~sl-ation telles que WO 93/19093 i ~ 3 PCI`/FR93/OOZ68 - l'application d'une bague, une scarification ou l'appli-cation per cutanée sont également envisageables.
, Après une période d'environ 48 à 96 heures, s~lon l'espèce, (environ 48 à 72 heures chez 1'homme), , 5 on regarde l'apparition d'une réaction locale se tradui-sant par un éryth~me et/ou une induration. L'apparition d'une telle réaction permet d'~tablir le diagnostic d'une sensibilisation en mettant en oeuvre une réaction immunologique ayant pour origine des lymphocytes T
senslbillsés par des antigènes de bactéries du complexe Mycobacterium tube~culos~s~
L'inj~ction de la proteine LIP-DTH, de pr~fé-rence en intradermique dans les memes conditions qu'une injection de tuberculine permet, pour les faibles con-centrations de cette protéine, de msttre en evidence une réaction de type tuberculine seulement chez les sujets porteurs de bacilles vivants, c'est à dire les sujets inf ectés récemment, les malades présentant une tubercu-lose ou les sujets récemment vaccin~s, et non chez les su~ets t~moins, cependant sensibilisés vis-à~vis de la tubercul~ne classique.
; La présente invention a égalemen~ pour ob~et une composition immunogène comprenant un peptide ou une proteine selon 1'invention, destinee à permettre une st~mulation du système immunitaire afin d'obtenlr une reponse de type 8 ou T chez un sujet humain ou animal (mammifère) en vue de le protéger contre une infection ultérieure par les bacteries du complexe Mycobacterium tuberculosis.
Avantageusement, la composition immunogène selon l'invention comprend comme principe actif de 1 ng à 1 mg de proteine LIP-DTH.
La voie d'administration comprend toutes celies classiquement u~ilisees pour les vaccins, ?ar _- exemple les voies orale, intraveineuse, intraàermique, intramusculaire, sous-cutanée, aércsol ou sublinguale.
Cette composition peut ou non comprendre un adjuYant doué de propri~tés immunostimulantes, tel que les sels minéraux, par exemple 1'hydroxyde d'aluminium, des composés hydrophobes ou des surfactants, par exemple l'adjuvant inc~mplet de Freund chez l~animal, le squalène ou des liposomes, des polynucléotides synthetiques, des j microorganismes ou composants de microorganismes, par exemple le murabutide, des molécules artificielles lQ synthéti~ues, ou encore des cytokines, par exemple les ¦ interférons a, ~, y ou des interleukines naturelles ou ! obtenues par expression d'hotes recombinants.
La composition i~munog~ne selon l'invention peut également etre utilisée comme composition de désen-lS sibilisation.
Certains auteurs considèrent en effet que la maladie provoquée par les bactéries du complexe Mycobac-terium tuberculosis peut être, en part$e, due à la reponse immunitaire massive, à lymphocytes T, en réponse à la st~mulation par les antigènes de ces bactéries.
Il peut donc etre intéressant dans certains cas de desensibiliser un sujet humain ou animal en lui I - administrant à intervalles répétés, par exemple de 8 à
¦ 15 jours une composition telle que d~crite ci-dessus.
Des essais réalisés avec la protéine LIP-DTH
; ont montre une intensité très forte de la réaction d'hypersensibilité de type retardé, y compris avec de petites quantités de bactéries vivantes injectées (de l'ordre de 2x103) lorsque l'épreuve était effectuée plus de 20 jours après 1'immunisation. D'autre part, la réponse immunitaire induite par la protéine LIP-DTH est une reponse thymodépendante 'pure", la reponse en anti-corps vis a vis de cette protéine étant très faible ou nulle lors de " immunisa~ion par des bactéries vivantes ~_ ! OU mor~es l ~_omme lors de l immunisa~ion avec la pro~éine WO93/l9093 PCT/FR93~00268 . ~ i J ~ 1 &' purifiée.
Ces résultats amènent à proposer la prot~ine I LIP-DTH comme moléculeuse "porteuse" d'épitopes vis-à-vis ¦ desquels est privil~ ée une réponse des lymphocytes T.
i 5 L'invention a donc également pour objet une composition immunogène comportant une protéine selon I l'invention sur laquelle est ajouté ou fixé un épitope ¦ contre leguel une réponse de type T est souhaitée.
Cet épitope peut etre d'origine bact~rienne I 10 (par exemple de mycobacteries), parasitaire, (par exemple I . de Leishmania, Trypanosoma ou Toxoplasma) ou viral (virus du Sida (VIH), virus d'Epstein-Barr ou virus de l'hépa-; tite B (HBV).
Parmi les épitopes préférés, on peut citer les antigènes gag et/ou l'antigène nef du VIH ou tout ou . partie de l'enveloppe gp 120 du VIH 1 ou gp 140 du VIH
2, la toxine diphtérique ou des frayments de celle-ci, la toxine t~tanique, l'antigène HBS du virus HBV ou encore l'antigène VP1 du virus de la polyomyélite.
L'épitope peut ~tre coupl~ ~ la protéine porteuse au moyen d'agents de pontage bifonctionnels tels que le glutaraldeh~de, la benzoquinone ou le N-bromo succinimide, bien connus pour leurs propriétes de couplage des protéines entre elles ou tel que l'hydrazide : 25 permettant le couplage de résidus glycosylés avec des ¦ protéines.
3, L'invention a également pour objet l'utilisa-' tion d'une composition immunogène selo~ l'invention à des }
fins de diagnostic chez l'homme ou l'animal d'une réponse à lymphocytes T~
; L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition immunogène selon l'invention chez l'homme ou l'animai pour la stimulation des lymphocytes T, soit générale, soit spécifique et di-icee contre ur.
épitope Dar~-culi2~ dans ie c~s 3U la ~ro-eine seion ~32~1~
l'invention est couplée à un épitope tel que défini précédemment.
L'invention a en outre pour objet un proc~dé
in vltro de mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux chez un hôte humain ou animal, caracté-risé en ce qu'il comporte les ~tapes suivantes :
- mise en culture sur un milieu artificiel de cellules mononucle~es de l'hOte contenant des concentrations variables du pept1de ou de la protéine, tel que d~fini prec~demment, et - mise en évidence de l'activation des cellules mononu-cl~ées de l'hôte.
A cet effet, des cellules mononucléées provenant de sujets sensibilisés ou non sont mises en culture dans un milieu tel ~ue le RPMI 1640 ou MEM
contenant 2 a 20 % de sérum homologue ou hétérologue à
une concentration variant de 10 ~ 106 cellules/ml, milieu ¦ contenant des concentrations variables du peptide ou de ¦ la prot~ine tel que d~fini précédemment (1 ng à lO ~g/ml ¦ 20 par exemple). Seules les cellules provenant de sujets I sensibilises seront activées pour des concentrations choisies du peptide ou de la protéine. Cette activation pourra etre observée par l~examen direct des cellules au microscope (transformation lymphoblastique), incorpora-tion élev~e de précurseurs radioactifs (thymidine, uridine ou autre), par la présence dans le milieu de culture de différentes cytokines (IL2, INFy, etc~..) ou par l'apparition sur la surface des cellules de récep-teurs à ces cytokines.
Avantageusement, la mise en évidence de l'activation des cellules est realisée par la detection d'interféron ~ libéré par les cellules sensibilisées, au moyen d'un immuno-essai enzymatique utilisant un an~i-corps monoclona'.
3~ L'invention a egaiement Dour objet un xit de WO93/19093 ~ ~ i 8 PCT/FR93/00268 ~ diagnostic pour la mise en evidence d'une réponse T
i contre un agent infectieux chez 1'homme ou 1'animal, caracterisé en ce qu'il comprend :
- un milieu de cul~ure pour cellules mononucléées, conte-nant des concentrations variables du peptide ou de la protéine selon l'invention, et - des moyens de mise en evidence de l'activation des cellules mononucl~ées d'un hote.
On d~crira plus en d~tail ci-après la puri-ficat~on de la proteine LIP-DTH ainsi que ses caracte-r~stiques en se r~férant aux figures annex~,es sur les-quelles :
- la fig. l represente les résultats des réactlons HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (symboles blancs) ou des bactéries mortes (symboles noirs) et testés avec un PPD (Puri~ied - Protein Derivative) standard (ronds) ou le filtrat de culture (carrés);
I - la fig. 2 représen~e les résultats de filtration moléculaire de la substance présente dans le milieu de culture apr~s 14 jours de croissance du BCG et l'activité HSR des fractions majeures test~es sur des cobayes immunisés avec des bacteries vivantes (carrés blancs) et des bactéries mortes (carres noirs);
: 2S - la fig. 3 repré~ente les résultats de pur~fication sur la colonne DEAE des molécules présentes dans la fraction 4 obtenue après filtration sur gel et l'activité HSR des fractions majeures testées sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (carrés blancs) et des bacteries mortes (carres noirs);
- - la fig. 4 représente les resultats de purification sur colonne en phase inverse des molecules présentes dans la fraction 1 de la séparation sur DEAE
et ''activité HSR des frac~ions majeures testées sur des ~5 cobayes immunisés avec des bacteries vivantes ~carrés WO93/19093 ~,~ PCT/FK93/00268 blancs) et des bactéries mor~es (carrés noirs);
- la fig. 5 représente les résultats de l'activité HSR des fractions majeures tes~es sur des co~ayes immunisés avec des bactéries vivan~es (carrés blancs) et des bactéries mortes (carrés noirs) et testés avec un PPD (Purified Protein Derivative) standard (ronds) ou la fractton 3 de l'~tape de chromatographie en phase inverse ~carrés);
- la fig. 6 représente les r~sultats de détermination du poids mol~culaire de la ~lol~cule apte à r~véler une réactivité HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes.
- la fig. 7 représente les résultats de détermination du point isoélectrique de la molécule apte - à révéler une réactivi~é HSR chez des cobayes immunisés - avec des bactéries vivantes.
i I - Purification de la prot~ine hIP-D'rH
La purification de la protéine LIP-DTH a été
contrôléP par la mesure des réactions d'hypersensibilité
de type retardé (HSR).
Un groupe de 20 cobayes femelles (lignée hétérozygo~e albinos Hartley, pesant de 250 à 300 g) a ete immunisé avec des BCG vivants ou des BCG tués par chauffage.
Les BCG vivants (2xlO' unites viables dans 0,1 ml de solution saline) on ete injectés par voie intradermique en 2 sites dans les flancs de l'animal.
2 mg de BCG tues par chauffage (120C, 30 mn) on~ éte mélanges aans 0,5 ml d'un melange ~1,'1! de tampon saiin et d ' aa; uvan incompie~ ~e ~reund lDIFC0) et injectés pa~
'5 ~ole ~ rzm~sc_ i 2` re . ' cS ^oba~es sensibilises des deux W093/t9093 ~iS~zi~ PCT/FR93/00268 :
groupes ont éte utilisés pour tester la réactivité HSR
entre 2 et 10 mois apres l'immunisation. Généralement les cobayes sensibilises ont ~té testés 5 ou 6 fois pendant cette période avec un in~ervalle d'au moins un mois entre deux essais.
Les réactions HS~ ont été effectuées sur les flancs des cobayes sensibilisés et épilés 24 h avant l'injection. Quatre injections intradermiques ont été
réalisées dans chaque flanc dans le but d'administrer à
chaque animal différentes dilutions de la su~stance à
tester et différentes dilutions ~'un PPD témoin, af in d'obtenir une mesure du niveau de sensibilisation de chaque animal.
Des dilutions contenant 1, 0,50, 0,25 et 0,125 ~g de PPD pour 0,1 ml ont éte préparees dans une solution saline contenant du ~ween 80 (0,0005%) comme d~crit par Laudi et coll. (Develop. biol. ~tandard.
29:393-411). Des quantites déterminées de la substance à tester ont été préparées de la même manière dans 4 dilutions succes-sives dans la meme solution saline.
La substance à tester a été administrée dans 0,1 ml et à differentes dilutions à 2 à 4 animaux qui recevaient en même temps différentes dilutions du - sta~dard de PPD titré à 40 000 unités de tuberculine (UIT) par mg.
La réaction a été lue après 28 heures. Les diametres longitudinal et transversal de l'érythème ont été reportés en mm. La valeur de la moyenne pour une dilution donnée a été portee sur un diagramme et une courbe a pu etre tracée en utilisant une analyse de régression standard. ~ne comparaison des valeurs obser-vées pour le PPD standard a permis de transformer 1es résultats en unites ~e ~u~er~uiine conven~ionnelles (UIT).
3_ ~ ! ( `.`.'_ ur~ du._3~~-''~' ~1'' ,,, Les cultures de BCG (souche 1173P2) ont été
realisees dans les ballons contenant 130 ml de milieu synthétique de Sauton selon la méthode d~crite par Gheorghiu et coll. (Bull. Inst. Pasteur 81:281-288). Le milieu de culture a été récolté après 14 jours à 37C, filtré sur une gaze et a travers un filtre de 0~2~ ~m.
Le milieu a ét~é lavé soigneusement à 4C avec de l'eau désionisée contenant du butanol (4%) sur une membrane Amicon PMlo et concentré environ 10 fois, Le milieu concentré contenant des mol~cules d'un poids mol~culaire sup~rieur à 10 kDa a ét~ lyophilisé et conservé à -20C.
! Le produit lyophilisé possède une activit~
HSR dix fois supérieure chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes par rapport à des cobayes immuni-1 15 sés avec des bactéries mortes (fig. 1).
I 3) Ee~_~e_ ~L~I L~LY~L19D_ ¦ a) filtration sur tamis moléculaire i Une colonne préparative Si300, 3 ~m, 50x750 mm (Serva) a été équilibree avec un tampon salin (Na2H-PO~, 50 mM ajusté à pH 7,5 avec KH2PO4) contenant du butanol (4%). Le débit de la colonne était de 1,25 ml/
: min, la pression maximale de 4~ bars n'a pas été attein-' te.
¦ Le produit lyophilisé à l'étape précédente a été dissous dans une solution tampon~butanol à une con-centration de 50 mg/ml. Il a été ultra-centrifugé à
, 40 000 g pendant 2 heures pour éliminer les résidus : insolubles. Après une filtration sur des filtres de 0,22 ~m, des parties aliquotes (10 ml) contenant 500 mg de substance ont été conservees à -20C. Elles ont eté à
nouveau filtrées à travers un filtre de 0,22 ~m après décongélation juste avant l'injection sur la colonne. Le ~rofil de densilé optique à 220 nm a eté enregistre ~fig 2). Les six '-2C~' ons ~rincipaies recol~ees en r_ncl on du ?ror~' de densit2 o~lique ont éte `~vees de ;~~con WO93/19093 j i ~ PCr/FR93/00268 ,. i .
intensive à 4C avec de l'eau désionisée contenant du butanol (4%), concentrees sur une membrane PMlo et ¦ lyophilisees. Apres lyophilisation les fractions ont é~t~é
pesées et conservées à -20~C. La fractlon 4, contenant la majorité des molécules capables de provoquer une réaction d'hypersensibilité de type retardé chez un co~aye immunisé avec des bact~ries vivantes a été
sélectionne et chargé sur la colonne suivante (fig. 2).
L'activité HSR de la fraction 4 a ét~ évaluée à environ 75 000 UT par mg chez des cobayes immunisés avec des bactériec vivantes pour 14 000 UT par mg chez des cobayes immunisés avec des bactéries mortes.
b) Colonne de chromatographie d'échange d'ions Une colonne préparative DEAE-TSK 5PW, 21,5x150 mm (LKB) a été équilibrée avec un tampon salin de faible concentration ionique (Na2HPO~NaH2PO4 lO mM, pH
7,5, et NaCl 10 mM) contenant du butanol (4%). Le debit co~trôlé était de 6 ml par min. avec une pression ! maximale de 30 bars. Un gradient linéaira de NaCl de i 20 1 M au maximum dans le meme tampon a été appliqué après ¦ l'injection de 100 mg de la fraction 4 précédente obtenue à partir de la colonne Si300, dissous dans 4 ml du tampon salin de départ. Cinq fractions majoritaires ont été
récupér~ees en fon~tion de la densité optique (220 nm).
Elles ont été lavées de façon intensive à 4C avec de l'eau désionisée/butanol 4~, concentrées sur une membrane PMlo et lyophilisees. Seule la fraction l contenant les anti~ènes capables de révéler une reaction de HSR chez le cobaye immunisé avec des bacteries vivantes a été
chargee sur la colonne suivante.
L'activite HSR de la fraction l a ete evaluee a 180 000 UIT par mg chez des cobayes immunisés avec BCG
vivants contre 5 000 UIT par mg chez des bacteries immu-nisées avec des BCG morts --lg 3j 3~ c) col~nne de cAr~malogr~phle de pnases inverses ~ `h ~ 14 ¦ Une colonne RP300 C8 lO ~m de 4,6x250 mm ¦ (Aquapore Brownlee Lab.) a été équilibrée avec un tampon I acetate d'ammonium (NH4COOCH3 20 mM, pH 6,5) avec un j d~bit contrôle de 2 ml par minute et une pression maxi-ii 5 male de llS bars. 7,5 mg de la fraction pr~c~dente l obtenue à partir de la colonne DEAE a ét~ inject~e dans 1 ml de tampon acétate d'ammonium. Un gradient d'éluti~n contenant de 0 à 90% d'acét~nitrile pour les concentra-tions les plus élevées a ~t~ établi selon le profil repr~sente, à la figure 4. Le profil de densit~ optique à ~20 nm a permis d'isoler 6 fractions maje1~res qui ont été concentrées sous vide à 40C pour éliminer l'acétoni-trile, et lyophilisées.
La fraction 3 correspondant à 20~22% d'acéto-nitrile a présenté une activité HSR très élevée sur des cobayes immunisés avec du BCG vivant (environ 550 000 UIT/mg) et une activité très faible sur des cobayes immunisés avec du BCG mort (inférieure à 3 000 UIT/mg) (fig. 4).
La fraction 3 a été retitrée de façon plus 1 précise en utilisant 8 cobayes par groupe d'immunisation.
La substance purifiee était lO0 fois plus j active sur des cobayes immunises avec des bacteries !- vivantes par rapport à des cobayes immunisés avec des bactéries mortes. L'activité était respectivement de 415 000 UIT/mg et 3 000 UIT/mg apres une mesure précise du titre (fig. 5).
II - Caracteristiques de la p~otéine LIP-DHT
l) Com~osition de la la Drotéine LIP-,DHT
La composition globale en glucides et en acides aminés presents dans la fraction purifiee indique qu'environ 20~ de la masse totale est composee de diffe-rents oses ma~eures ~mannose, ~alactose, arabinose ~-xYiose i.
, - Cette protéine est sensible a~x enzymes proteolytiques telles que pronase et subtilopeptidase, . ce qui signifie que son activité biologique disparait après incubation en présen~e de ces enzymes dans des , 5 conditions habituelles de tampon et de concentration.
L'analyse de la séquence NH2-terminale de la protéine a révélée la séquence peptidique suivante :
Thr-Pro-Pro-X1-Glu-X2-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-X3-Val-X~-Leu-dans laquelle X~, X2, X3 et X4 représentent des acides aminés modifiés.
2) ~
Le poids moléculaire a été étudié sur SDS-PAGE à 10 ~ d'acrylamide; le gel d'environ 10 cm pour 'la partie résolutive, a été récolte et coupé en fragments de 0,5 ~m de longueur. Chaque fragment de gel a été élué
dans 1 ml d'eau en présence de Tween 80 à 0,0005 %, puis 1'activite HSR a été tastée sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes. Le front et le maximum d'activité ont eté trouvé dans une zone de 45 kDa (figure -,. 6).
Cette détermination du poids moléculaire est effectuée avec une approximation d'environ 10 %, approxi-mation imputable aux variations des résultats en fonctiondes kits d'étalonnage utilisés. (Pharmacia par exemple).
3) Détermination du Doint l~oélectri~ue Le point isoélectrique a été déterminé sur un ! gel de polyacrylamide incluant des ampholytes (Servalyt 2-11). Le gel après isofocalisation d'un aliquote de la '. . fraction LIP-DTH dans un champ electrique selon les conditions classiaues a ete decoupé en ~1 fragments ae , 0,~ cm. Chaque f-aamen~ de gei a e-e elue dans 1 m~ d'eau en presence de T.veen ~C ~ 0,~00~ ~ _e pH a ~-o mesurê.
_~ ?uis ' ac-i~Ji~o .:a~ _é o?r- -ee s - àes ~a-v-e--16immunises avec des bacilles vivants~ L'activité principa-~ le, environ 4 000 UIT par ml est trouvée pour un pH de ! 4~0,2, la faible activité dans la zon~ de pH 8 correspon-¦ dant a l'emplacement du dépôt des molecules à analyser, d'ou la petite activité résiduelle visible sur la figure 7.
, Après une période d'environ 48 à 96 heures, s~lon l'espèce, (environ 48 à 72 heures chez 1'homme), , 5 on regarde l'apparition d'une réaction locale se tradui-sant par un éryth~me et/ou une induration. L'apparition d'une telle réaction permet d'~tablir le diagnostic d'une sensibilisation en mettant en oeuvre une réaction immunologique ayant pour origine des lymphocytes T
senslbillsés par des antigènes de bactéries du complexe Mycobacterium tube~culos~s~
L'inj~ction de la proteine LIP-DTH, de pr~fé-rence en intradermique dans les memes conditions qu'une injection de tuberculine permet, pour les faibles con-centrations de cette protéine, de msttre en evidence une réaction de type tuberculine seulement chez les sujets porteurs de bacilles vivants, c'est à dire les sujets inf ectés récemment, les malades présentant une tubercu-lose ou les sujets récemment vaccin~s, et non chez les su~ets t~moins, cependant sensibilisés vis-à~vis de la tubercul~ne classique.
; La présente invention a égalemen~ pour ob~et une composition immunogène comprenant un peptide ou une proteine selon 1'invention, destinee à permettre une st~mulation du système immunitaire afin d'obtenlr une reponse de type 8 ou T chez un sujet humain ou animal (mammifère) en vue de le protéger contre une infection ultérieure par les bacteries du complexe Mycobacterium tuberculosis.
Avantageusement, la composition immunogène selon l'invention comprend comme principe actif de 1 ng à 1 mg de proteine LIP-DTH.
La voie d'administration comprend toutes celies classiquement u~ilisees pour les vaccins, ?ar _- exemple les voies orale, intraveineuse, intraàermique, intramusculaire, sous-cutanée, aércsol ou sublinguale.
Cette composition peut ou non comprendre un adjuYant doué de propri~tés immunostimulantes, tel que les sels minéraux, par exemple 1'hydroxyde d'aluminium, des composés hydrophobes ou des surfactants, par exemple l'adjuvant inc~mplet de Freund chez l~animal, le squalène ou des liposomes, des polynucléotides synthetiques, des j microorganismes ou composants de microorganismes, par exemple le murabutide, des molécules artificielles lQ synthéti~ues, ou encore des cytokines, par exemple les ¦ interférons a, ~, y ou des interleukines naturelles ou ! obtenues par expression d'hotes recombinants.
La composition i~munog~ne selon l'invention peut également etre utilisée comme composition de désen-lS sibilisation.
Certains auteurs considèrent en effet que la maladie provoquée par les bactéries du complexe Mycobac-terium tuberculosis peut être, en part$e, due à la reponse immunitaire massive, à lymphocytes T, en réponse à la st~mulation par les antigènes de ces bactéries.
Il peut donc etre intéressant dans certains cas de desensibiliser un sujet humain ou animal en lui I - administrant à intervalles répétés, par exemple de 8 à
¦ 15 jours une composition telle que d~crite ci-dessus.
Des essais réalisés avec la protéine LIP-DTH
; ont montre une intensité très forte de la réaction d'hypersensibilité de type retardé, y compris avec de petites quantités de bactéries vivantes injectées (de l'ordre de 2x103) lorsque l'épreuve était effectuée plus de 20 jours après 1'immunisation. D'autre part, la réponse immunitaire induite par la protéine LIP-DTH est une reponse thymodépendante 'pure", la reponse en anti-corps vis a vis de cette protéine étant très faible ou nulle lors de " immunisa~ion par des bactéries vivantes ~_ ! OU mor~es l ~_omme lors de l immunisa~ion avec la pro~éine WO93/l9093 PCT/FR93~00268 . ~ i J ~ 1 &' purifiée.
Ces résultats amènent à proposer la prot~ine I LIP-DTH comme moléculeuse "porteuse" d'épitopes vis-à-vis ¦ desquels est privil~ ée une réponse des lymphocytes T.
i 5 L'invention a donc également pour objet une composition immunogène comportant une protéine selon I l'invention sur laquelle est ajouté ou fixé un épitope ¦ contre leguel une réponse de type T est souhaitée.
Cet épitope peut etre d'origine bact~rienne I 10 (par exemple de mycobacteries), parasitaire, (par exemple I . de Leishmania, Trypanosoma ou Toxoplasma) ou viral (virus du Sida (VIH), virus d'Epstein-Barr ou virus de l'hépa-; tite B (HBV).
Parmi les épitopes préférés, on peut citer les antigènes gag et/ou l'antigène nef du VIH ou tout ou . partie de l'enveloppe gp 120 du VIH 1 ou gp 140 du VIH
2, la toxine diphtérique ou des frayments de celle-ci, la toxine t~tanique, l'antigène HBS du virus HBV ou encore l'antigène VP1 du virus de la polyomyélite.
L'épitope peut ~tre coupl~ ~ la protéine porteuse au moyen d'agents de pontage bifonctionnels tels que le glutaraldeh~de, la benzoquinone ou le N-bromo succinimide, bien connus pour leurs propriétes de couplage des protéines entre elles ou tel que l'hydrazide : 25 permettant le couplage de résidus glycosylés avec des ¦ protéines.
3, L'invention a également pour objet l'utilisa-' tion d'une composition immunogène selo~ l'invention à des }
fins de diagnostic chez l'homme ou l'animal d'une réponse à lymphocytes T~
; L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition immunogène selon l'invention chez l'homme ou l'animai pour la stimulation des lymphocytes T, soit générale, soit spécifique et di-icee contre ur.
épitope Dar~-culi2~ dans ie c~s 3U la ~ro-eine seion ~32~1~
l'invention est couplée à un épitope tel que défini précédemment.
L'invention a en outre pour objet un proc~dé
in vltro de mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux chez un hôte humain ou animal, caracté-risé en ce qu'il comporte les ~tapes suivantes :
- mise en culture sur un milieu artificiel de cellules mononucle~es de l'hOte contenant des concentrations variables du pept1de ou de la protéine, tel que d~fini prec~demment, et - mise en évidence de l'activation des cellules mononu-cl~ées de l'hôte.
A cet effet, des cellules mononucléées provenant de sujets sensibilisés ou non sont mises en culture dans un milieu tel ~ue le RPMI 1640 ou MEM
contenant 2 a 20 % de sérum homologue ou hétérologue à
une concentration variant de 10 ~ 106 cellules/ml, milieu ¦ contenant des concentrations variables du peptide ou de ¦ la prot~ine tel que d~fini précédemment (1 ng à lO ~g/ml ¦ 20 par exemple). Seules les cellules provenant de sujets I sensibilises seront activées pour des concentrations choisies du peptide ou de la protéine. Cette activation pourra etre observée par l~examen direct des cellules au microscope (transformation lymphoblastique), incorpora-tion élev~e de précurseurs radioactifs (thymidine, uridine ou autre), par la présence dans le milieu de culture de différentes cytokines (IL2, INFy, etc~..) ou par l'apparition sur la surface des cellules de récep-teurs à ces cytokines.
Avantageusement, la mise en évidence de l'activation des cellules est realisée par la detection d'interféron ~ libéré par les cellules sensibilisées, au moyen d'un immuno-essai enzymatique utilisant un an~i-corps monoclona'.
3~ L'invention a egaiement Dour objet un xit de WO93/19093 ~ ~ i 8 PCT/FR93/00268 ~ diagnostic pour la mise en evidence d'une réponse T
i contre un agent infectieux chez 1'homme ou 1'animal, caracterisé en ce qu'il comprend :
- un milieu de cul~ure pour cellules mononucléées, conte-nant des concentrations variables du peptide ou de la protéine selon l'invention, et - des moyens de mise en evidence de l'activation des cellules mononucl~ées d'un hote.
On d~crira plus en d~tail ci-après la puri-ficat~on de la proteine LIP-DTH ainsi que ses caracte-r~stiques en se r~férant aux figures annex~,es sur les-quelles :
- la fig. l represente les résultats des réactlons HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (symboles blancs) ou des bactéries mortes (symboles noirs) et testés avec un PPD (Puri~ied - Protein Derivative) standard (ronds) ou le filtrat de culture (carrés);
I - la fig. 2 représen~e les résultats de filtration moléculaire de la substance présente dans le milieu de culture apr~s 14 jours de croissance du BCG et l'activité HSR des fractions majeures test~es sur des cobayes immunisés avec des bacteries vivantes (carrés blancs) et des bactéries mortes (carres noirs);
: 2S - la fig. 3 repré~ente les résultats de pur~fication sur la colonne DEAE des molécules présentes dans la fraction 4 obtenue après filtration sur gel et l'activité HSR des fractions majeures testées sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (carrés blancs) et des bacteries mortes (carres noirs);
- - la fig. 4 représente les resultats de purification sur colonne en phase inverse des molecules présentes dans la fraction 1 de la séparation sur DEAE
et ''activité HSR des frac~ions majeures testées sur des ~5 cobayes immunisés avec des bacteries vivantes ~carrés WO93/19093 ~,~ PCT/FK93/00268 blancs) et des bactéries mor~es (carrés noirs);
- la fig. 5 représente les résultats de l'activité HSR des fractions majeures tes~es sur des co~ayes immunisés avec des bactéries vivan~es (carrés blancs) et des bactéries mortes (carrés noirs) et testés avec un PPD (Purified Protein Derivative) standard (ronds) ou la fractton 3 de l'~tape de chromatographie en phase inverse ~carrés);
- la fig. 6 représente les r~sultats de détermination du poids mol~culaire de la ~lol~cule apte à r~véler une réactivité HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes.
- la fig. 7 représente les résultats de détermination du point isoélectrique de la molécule apte - à révéler une réactivi~é HSR chez des cobayes immunisés - avec des bactéries vivantes.
i I - Purification de la prot~ine hIP-D'rH
La purification de la protéine LIP-DTH a été
contrôléP par la mesure des réactions d'hypersensibilité
de type retardé (HSR).
Un groupe de 20 cobayes femelles (lignée hétérozygo~e albinos Hartley, pesant de 250 à 300 g) a ete immunisé avec des BCG vivants ou des BCG tués par chauffage.
Les BCG vivants (2xlO' unites viables dans 0,1 ml de solution saline) on ete injectés par voie intradermique en 2 sites dans les flancs de l'animal.
2 mg de BCG tues par chauffage (120C, 30 mn) on~ éte mélanges aans 0,5 ml d'un melange ~1,'1! de tampon saiin et d ' aa; uvan incompie~ ~e ~reund lDIFC0) et injectés pa~
'5 ~ole ~ rzm~sc_ i 2` re . ' cS ^oba~es sensibilises des deux W093/t9093 ~iS~zi~ PCT/FR93/00268 :
groupes ont éte utilisés pour tester la réactivité HSR
entre 2 et 10 mois apres l'immunisation. Généralement les cobayes sensibilises ont ~té testés 5 ou 6 fois pendant cette période avec un in~ervalle d'au moins un mois entre deux essais.
Les réactions HS~ ont été effectuées sur les flancs des cobayes sensibilisés et épilés 24 h avant l'injection. Quatre injections intradermiques ont été
réalisées dans chaque flanc dans le but d'administrer à
chaque animal différentes dilutions de la su~stance à
tester et différentes dilutions ~'un PPD témoin, af in d'obtenir une mesure du niveau de sensibilisation de chaque animal.
Des dilutions contenant 1, 0,50, 0,25 et 0,125 ~g de PPD pour 0,1 ml ont éte préparees dans une solution saline contenant du ~ween 80 (0,0005%) comme d~crit par Laudi et coll. (Develop. biol. ~tandard.
29:393-411). Des quantites déterminées de la substance à tester ont été préparées de la même manière dans 4 dilutions succes-sives dans la meme solution saline.
La substance à tester a été administrée dans 0,1 ml et à differentes dilutions à 2 à 4 animaux qui recevaient en même temps différentes dilutions du - sta~dard de PPD titré à 40 000 unités de tuberculine (UIT) par mg.
La réaction a été lue après 28 heures. Les diametres longitudinal et transversal de l'érythème ont été reportés en mm. La valeur de la moyenne pour une dilution donnée a été portee sur un diagramme et une courbe a pu etre tracée en utilisant une analyse de régression standard. ~ne comparaison des valeurs obser-vées pour le PPD standard a permis de transformer 1es résultats en unites ~e ~u~er~uiine conven~ionnelles (UIT).
3_ ~ ! ( `.`.'_ ur~ du._3~~-''~' ~1'' ,,, Les cultures de BCG (souche 1173P2) ont été
realisees dans les ballons contenant 130 ml de milieu synthétique de Sauton selon la méthode d~crite par Gheorghiu et coll. (Bull. Inst. Pasteur 81:281-288). Le milieu de culture a été récolté après 14 jours à 37C, filtré sur une gaze et a travers un filtre de 0~2~ ~m.
Le milieu a ét~é lavé soigneusement à 4C avec de l'eau désionisée contenant du butanol (4%) sur une membrane Amicon PMlo et concentré environ 10 fois, Le milieu concentré contenant des mol~cules d'un poids mol~culaire sup~rieur à 10 kDa a ét~ lyophilisé et conservé à -20C.
! Le produit lyophilisé possède une activit~
HSR dix fois supérieure chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes par rapport à des cobayes immuni-1 15 sés avec des bactéries mortes (fig. 1).
I 3) Ee~_~e_ ~L~I L~LY~L19D_ ¦ a) filtration sur tamis moléculaire i Une colonne préparative Si300, 3 ~m, 50x750 mm (Serva) a été équilibree avec un tampon salin (Na2H-PO~, 50 mM ajusté à pH 7,5 avec KH2PO4) contenant du butanol (4%). Le débit de la colonne était de 1,25 ml/
: min, la pression maximale de 4~ bars n'a pas été attein-' te.
¦ Le produit lyophilisé à l'étape précédente a été dissous dans une solution tampon~butanol à une con-centration de 50 mg/ml. Il a été ultra-centrifugé à
, 40 000 g pendant 2 heures pour éliminer les résidus : insolubles. Après une filtration sur des filtres de 0,22 ~m, des parties aliquotes (10 ml) contenant 500 mg de substance ont été conservees à -20C. Elles ont eté à
nouveau filtrées à travers un filtre de 0,22 ~m après décongélation juste avant l'injection sur la colonne. Le ~rofil de densilé optique à 220 nm a eté enregistre ~fig 2). Les six '-2C~' ons ~rincipaies recol~ees en r_ncl on du ?ror~' de densit2 o~lique ont éte `~vees de ;~~con WO93/19093 j i ~ PCr/FR93/00268 ,. i .
intensive à 4C avec de l'eau désionisée contenant du butanol (4%), concentrees sur une membrane PMlo et ¦ lyophilisees. Apres lyophilisation les fractions ont é~t~é
pesées et conservées à -20~C. La fractlon 4, contenant la majorité des molécules capables de provoquer une réaction d'hypersensibilité de type retardé chez un co~aye immunisé avec des bact~ries vivantes a été
sélectionne et chargé sur la colonne suivante (fig. 2).
L'activité HSR de la fraction 4 a ét~ évaluée à environ 75 000 UT par mg chez des cobayes immunisés avec des bactériec vivantes pour 14 000 UT par mg chez des cobayes immunisés avec des bactéries mortes.
b) Colonne de chromatographie d'échange d'ions Une colonne préparative DEAE-TSK 5PW, 21,5x150 mm (LKB) a été équilibrée avec un tampon salin de faible concentration ionique (Na2HPO~NaH2PO4 lO mM, pH
7,5, et NaCl 10 mM) contenant du butanol (4%). Le debit co~trôlé était de 6 ml par min. avec une pression ! maximale de 30 bars. Un gradient linéaira de NaCl de i 20 1 M au maximum dans le meme tampon a été appliqué après ¦ l'injection de 100 mg de la fraction 4 précédente obtenue à partir de la colonne Si300, dissous dans 4 ml du tampon salin de départ. Cinq fractions majoritaires ont été
récupér~ees en fon~tion de la densité optique (220 nm).
Elles ont été lavées de façon intensive à 4C avec de l'eau désionisée/butanol 4~, concentrées sur une membrane PMlo et lyophilisees. Seule la fraction l contenant les anti~ènes capables de révéler une reaction de HSR chez le cobaye immunisé avec des bacteries vivantes a été
chargee sur la colonne suivante.
L'activite HSR de la fraction l a ete evaluee a 180 000 UIT par mg chez des cobayes immunisés avec BCG
vivants contre 5 000 UIT par mg chez des bacteries immu-nisées avec des BCG morts --lg 3j 3~ c) col~nne de cAr~malogr~phle de pnases inverses ~ `h ~ 14 ¦ Une colonne RP300 C8 lO ~m de 4,6x250 mm ¦ (Aquapore Brownlee Lab.) a été équilibrée avec un tampon I acetate d'ammonium (NH4COOCH3 20 mM, pH 6,5) avec un j d~bit contrôle de 2 ml par minute et une pression maxi-ii 5 male de llS bars. 7,5 mg de la fraction pr~c~dente l obtenue à partir de la colonne DEAE a ét~ inject~e dans 1 ml de tampon acétate d'ammonium. Un gradient d'éluti~n contenant de 0 à 90% d'acét~nitrile pour les concentra-tions les plus élevées a ~t~ établi selon le profil repr~sente, à la figure 4. Le profil de densit~ optique à ~20 nm a permis d'isoler 6 fractions maje1~res qui ont été concentrées sous vide à 40C pour éliminer l'acétoni-trile, et lyophilisées.
La fraction 3 correspondant à 20~22% d'acéto-nitrile a présenté une activité HSR très élevée sur des cobayes immunisés avec du BCG vivant (environ 550 000 UIT/mg) et une activité très faible sur des cobayes immunisés avec du BCG mort (inférieure à 3 000 UIT/mg) (fig. 4).
La fraction 3 a été retitrée de façon plus 1 précise en utilisant 8 cobayes par groupe d'immunisation.
La substance purifiee était lO0 fois plus j active sur des cobayes immunises avec des bacteries !- vivantes par rapport à des cobayes immunisés avec des bactéries mortes. L'activité était respectivement de 415 000 UIT/mg et 3 000 UIT/mg apres une mesure précise du titre (fig. 5).
II - Caracteristiques de la p~otéine LIP-DHT
l) Com~osition de la la Drotéine LIP-,DHT
La composition globale en glucides et en acides aminés presents dans la fraction purifiee indique qu'environ 20~ de la masse totale est composee de diffe-rents oses ma~eures ~mannose, ~alactose, arabinose ~-xYiose i.
, - Cette protéine est sensible a~x enzymes proteolytiques telles que pronase et subtilopeptidase, . ce qui signifie que son activité biologique disparait après incubation en présen~e de ces enzymes dans des , 5 conditions habituelles de tampon et de concentration.
L'analyse de la séquence NH2-terminale de la protéine a révélée la séquence peptidique suivante :
Thr-Pro-Pro-X1-Glu-X2-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-X3-Val-X~-Leu-dans laquelle X~, X2, X3 et X4 représentent des acides aminés modifiés.
2) ~
Le poids moléculaire a été étudié sur SDS-PAGE à 10 ~ d'acrylamide; le gel d'environ 10 cm pour 'la partie résolutive, a été récolte et coupé en fragments de 0,5 ~m de longueur. Chaque fragment de gel a été élué
dans 1 ml d'eau en présence de Tween 80 à 0,0005 %, puis 1'activite HSR a été tastée sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes. Le front et le maximum d'activité ont eté trouvé dans une zone de 45 kDa (figure -,. 6).
Cette détermination du poids moléculaire est effectuée avec une approximation d'environ 10 %, approxi-mation imputable aux variations des résultats en fonctiondes kits d'étalonnage utilisés. (Pharmacia par exemple).
3) Détermination du Doint l~oélectri~ue Le point isoélectrique a été déterminé sur un ! gel de polyacrylamide incluant des ampholytes (Servalyt 2-11). Le gel après isofocalisation d'un aliquote de la '. . fraction LIP-DTH dans un champ electrique selon les conditions classiaues a ete decoupé en ~1 fragments ae , 0,~ cm. Chaque f-aamen~ de gei a e-e elue dans 1 m~ d'eau en presence de T.veen ~C ~ 0,~00~ ~ _e pH a ~-o mesurê.
_~ ?uis ' ac-i~Ji~o .:a~ _é o?r- -ee s - àes ~a-v-e--16immunises avec des bacilles vivants~ L'activité principa-~ le, environ 4 000 UIT par ml est trouvée pour un pH de ! 4~0,2, la faible activité dans la zon~ de pH 8 correspon-¦ dant a l'emplacement du dépôt des molecules à analyser, d'ou la petite activité résiduelle visible sur la figure 7.
4) Toxicité
Des tests de toxicité ont ~t~ réalis~s chez le cobaye selon des recommandations de Codex pour une tuberculine purifiée.
- ~9_L~15e 3L~s~: apres injection de 1'équi-valent de 50 000 UIT de protéine LIP-DTH, aucune toxicité
n~ a été observée.
- Sensikilisation: une épreuve de non-sensibilisation consiskant à injecter 4 fois en 1 mois une dose correspondant à 500 UIT de protéine purifiée a montré une absence de toxicité dans des conditions semichroniques et l'absence de sensibilisation.
Par ailleurs des souris ont reçu des doses comprises entre 1 UIT et 2 000 UIT sans presenter de troubles cliniques. De même des singes saïmiri (12) ont reçu des doses de 200 UIT en intradermique sans présenter de signes loc~ux ou géneraux.
Des tests de toxicité ont ~t~ réalis~s chez le cobaye selon des recommandations de Codex pour une tuberculine purifiée.
- ~9_L~15e 3L~s~: apres injection de 1'équi-valent de 50 000 UIT de protéine LIP-DTH, aucune toxicité
n~ a été observée.
- Sensikilisation: une épreuve de non-sensibilisation consiskant à injecter 4 fois en 1 mois une dose correspondant à 500 UIT de protéine purifiée a montré une absence de toxicité dans des conditions semichroniques et l'absence de sensibilisation.
Par ailleurs des souris ont reçu des doses comprises entre 1 UIT et 2 000 UIT sans presenter de troubles cliniques. De même des singes saïmiri (12) ont reçu des doses de 200 UIT en intradermique sans présenter de signes loc~ux ou géneraux.
Claims (16)
1. Séquence peptidique apte à initier des réactions d'hypersensibilité retardée d'intensité
différente en présence de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes du complexe Mycobacterium tubercu-losis, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas plus de 0,5 % en poids d'acides aminés tyrosine, phénylalani-ne, méthionine, histidine, arginine et cystéine.
différente en présence de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes du complexe Mycobacterium tubercu-losis, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas plus de 0,5 % en poids d'acides aminés tyrosine, phénylalani-ne, méthionine, histidine, arginine et cystéine.
2. Peptide ou protéine antigénique apte à
induire une réponse immunitaire chez l'hôte auquel elle est administrée, ayant une séquence peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa composition globale en acides aminés, exprimée en pourcentage par rapport au poids moléculaire total est sensiblement la suivante :
Asp/Asn : 1,2 Thr : 12,2 Ser : 2,5 Glu/Gln : 11,5 Gly : 7,7 Ala : 8,9 Val : 9,8 Ile : 2,8 Leu : 1,8 Lys : 1,6 Pro : 40,0
induire une réponse immunitaire chez l'hôte auquel elle est administrée, ayant une séquence peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa composition globale en acides aminés, exprimée en pourcentage par rapport au poids moléculaire total est sensiblement la suivante :
Asp/Asn : 1,2 Thr : 12,2 Ser : 2,5 Glu/Gln : 11,5 Gly : 7,7 Ala : 8,9 Val : 9,8 Ile : 2,8 Leu : 1,8 Lys : 1,6 Pro : 40,0
3. Peptide ou protéine selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il (elle) présente tout ou partie de la séquence NH2-terminale suivante :
Thr-Pro-Pro-X1-Glu-X2-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-X3-Val-X4-Leu-X1, X2, X3 et X4 représentant des acides aminés modifiés.
Thr-Pro-Pro-X1-Glu-X2-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-X3-Val-X4-Leu-X1, X2, X3 et X4 représentant des acides aminés modifiés.
4. Protéine selon l'une quelconque des reven-dications prédédentes, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de surnageant de culture de BCG par les étapes de purification consistant en :
(a) une filtration sur tamis moléculaire, (b) une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE, et (c) une chromatographie de phases inverses.
(a) une filtration sur tamis moléculaire, (b) une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE, et (c) une chromatographie de phases inverses.
5. Protéine selon la revendication 4, carac-térisée en ce que l'étape (a) est une filtration sur une colonne Si 300, 3 µm équilibrée avec un tampon Na2H-PO4/KH2PO4, pH 7,5, l'élution étant effectuée avec le même tampon avec un débit de 1,25 ml/min. sous une pression inférieure à 45 bars.
6. Protéine selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que l'étape (b) est une chromatogrpa-hie d'échange d'ions sur une colonne DEAE-TSK 5PW équili-brée avec un tampon Na2HPO4/NaH2PO4 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM, l'élution étant effectuée avec un gradient linéaire de NaCl de 0 à 1M dans le même tampon avec un débit de 6 ml/min. sous une pression inférieure à 30 bars.
7. Protéine selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que l'étape (c) est une chromato-graphie d'échange d'ions en phase inverse sur une colonne RP 300 C8 10 µm équilibrée avec un tampon NH4COOH3, pH
6,5, l'élution étant effectuée avec un gradient de 0 à
90% d'acétonitrile dans le même tampon avec un débit de 2 ml/min. et une pression inférieure à 115 bars.
6,5, l'élution étant effectuée avec un gradient de 0 à
90% d'acétonitrile dans le même tampon avec un débit de 2 ml/min. et une pression inférieure à 115 bars.
8. Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire apparent d'environ 45 kDa en gel de polyacrylamide en présence de SDS.
9. Protéine selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que son point isoélectrique est de 4 +?0,2.
10. Composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon l'une quelcon-que des revendications précédentes.
11. Composition selon la revendication 10, pour le diagnostic in vivo d'une infection par des bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un excipient contenant un agent surfactif.
12. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon l'une des revendi-cations 1 à 9.
13. Procédé de mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux chez un hôte, caractérisé
en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- mise en culture sur un milieu artificiel de cellules mononucléées de l'hôte contenant des concentra-tions variables du peptide ou de la protéine tel que défini dans les revendications 1 à 9, et - mise en évidence de l'activation des cellules mononucléées de l'hôte.
en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- mise en culture sur un milieu artificiel de cellules mononucléées de l'hôte contenant des concentra-tions variables du peptide ou de la protéine tel que défini dans les revendications 1 à 9, et - mise en évidence de l'activation des cellules mononucléées de l'hôte.
14. Procédé selon la revendication 13 caractérisé en ce que la mise en évidence de l'activation des cellules est réalisée par une méthode choisie parmi l'observation directe des cellules au microscope l'incorporation de précurseurs radioactifs, la détection dans le milieu de culture de cytokines et l'apparition de récepteurs des cytokines à la surface des cellules.
15. Procédé selon la revendication 14 caractérisé en ce que la mise en évidence de l'activation des cellules est réalisée par la détection d'interféron y libéré par les cellules sensibilisées au moyen d'un immuno-essai enzymatique utilisant un anticorps monoclo-nal.
16. Kit de diagnostic pour la mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux caractérisé en ce qu'il comprend :
- un milieu de culture de cellules mononu-cléées contenant des concentrations variables du peptide ou de la protéine tel que défini dans les revendications 1 à 9, et - des moyens de mise en évidence de l'activa-tions des cellules monocucléées de l'hôte.
- un milieu de culture de cellules mononu-cléées contenant des concentrations variables du peptide ou de la protéine tel que défini dans les revendications 1 à 9, et - des moyens de mise en évidence de l'activa-tions des cellules monocucléées de l'hôte.
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| WO1995014713A2 (fr) | 1993-11-23 | 1995-06-01 | The Regents Of The University Of California | Vaccins a base de produits extracellulaires abondants, leurs procedes de fabrication et leur utilisation |
| US5714593A (en) * | 1995-02-01 | 1998-02-03 | Institut Pasteur | DNA from mycobacterium tuberculosis which codes for a 45/47 kilodalton protein |
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