WO1993019093A1 - Sequence peptidique apte a induire une reaction d'hypersensibilite de type retarde en presence de bacteries vivantes du complexe mycobacterium tuberculosis et ses applications - Google Patents
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- the "tuberculin” activity of this protein is thus equivalent to approximately 415,000 International Tuberculin Units (ITU) per mg in guinea pigs immunized with live bacilli, and to 3,000 ITU per mg in guinea pigs immunized with bacilli dead.
- ITU International Tuberculin Unit
- - fig. 2 represents the molecular filtration results of the substance present in the culture medium after 14 days of BCG growth and the HSR activity of the major fractions tested on guinea pigs immunized with living bacteria (white squares) and dead bacteria (squares black);
- - fig. 3 represents the results of purification on the DEAE column of the molecules present in fraction 4 obtained after gel filtration and the HSR activity of the major fractions tested on guinea pigs immunized with living bacteria (white squares) and dead bacteria (black squares );
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Abstract
La présente invention concerne une séquence peptidique apte à initier des réactions d'hypersensibilité retardée d'intensité différente en présence de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas plus de 0,5 % en poids d'acides aminés tyrosine, phénylalanine, méthionine, histidine, arginine et cystéine, ainsi que les applications diagnostiques et thérapeutiques d'un peptide ou d'une protéine comprenant ladite séquence.
Description
Séquence peptidique apte à induire une réaction d'hy¬ persensibilité de type retardé en présence de bactéries vivantes du complexe Myoobacterium tuberculosis et ses applications.
La présente invention concerne une nouvelle protéine antigénique apte à provoquer des réactions d'hypersensibilités retardées d'intensité différente en présence de bactéries du complexe Mycobacterium tubercu- losis vivantes ou mortes, ses applications diagnostiques et thérapeutiques notamment comme vaccin.
Ce complexe Mycoiacteriiππ tuberculosis comprend quatre espèces : MycoJacteriiππ tuberculosis, Mycobacterivm boviε, Mycobacterium africanum. Mycobacte- rium microti (le Minor et Veron; bactériologie Médicale 1990. 2ème éd. p. 966) .
La réaction d'hypersensibilité de type retardé (HSR) à la tuberculine, est utilisée de façon courante comme moyen de diagnostic de la tuberculose. Cette épreuve à la tuberculine est particulièrement utilisée comme moyen de diagnostic aux Etats-Unis ou aux Pays-Bas, pays où il n'existe pas ou plus de vaccination par le BCG. Une récente mise au point (1990) de l'Ameri¬ can Thoracic Society préconise en particulier 1*utilisa- tion de ce test diagnostique et en précise les limites pour la campagne nationale d'éradication totale de la tuberculose qui se met en place aux Etats-Unis. Pour la France la pratique médicale est un peu différente du fait de 1'utilisation large du BCG et de la fréquence encore relativement élevée de la tuberculose. La réaction à la tuberculine est utilisée pour suivre la sensibilisation secondaire à la vaccination et aussi pour apporter des arguments en faveur de l'existence d'une infection tuberculeuse. Cette indication diagnostique est basée sur 1 'augmentation nette de 1'intensité de la réaction chez un sujet donné ou sur l'intensité très élevée de la réaction. Mais cette notion quantitative est difficile à apprécier avec exactitude lorsque les réactions
tuberculiniques sont pratiquées et/ou lues par des personnes différentes.
En fait, la réaction cutanée d'hypersensibi¬ lité de type retardé à la tuberculine ne permet pas actuellement de différencier de façon certaine les sujets malades présentant une tuberculose en évolution des sujets sensibilisés antérieurement. En effet des sujets porteurs de bacilles vivants nombreux (malades tubercu¬ leux ou sujets récemment vaccinés) peuvent présenter la même réactivité cutanée à la tuberculine que des sujets ayant été sensibilisés antérieurement par une primo¬ infection guérie spontanément ou ayant souffert d'une tuberculose actuellement guérie.
Les inventeurs ont isolé et purifié une protéine nouvelle, dénommée LIP-DTH à partir du milieu de culture de BCG qui se révèle apte à provoquer une hypersensibilité de type retardé chez des cobayes ne présentant pas de consanguinité immunisés avec des bacilles (BCG) vivants, sans à l'inverse provoquer de réaction importante chez des cobayes immunisés avec des bacilles (BCG) morts.
Cette différence de réactivité a également été observée chez des souris de deux lignées différentes (C57BI/6 et C3H/He). De même, les cobayes et les souris ayant reçu des bacilles virulents de la tuberculose (souche H37Rv) montrent une réactivité vis-à-vis de cette protéine identique à la réaction observée chez les animaux ayant reçu le BCG vivant. L'étude de la composition en acides aminés de
LIP-DTH a révélé une protéine ayant une composition très inhabituelle en acides aminés, de nombreux aminoacides tels que la tyrosine, la phenylalanine, la methionine, 1' istidine. I'arginine et la cysteine étant absents ou présents en quantités non détectables.
La présente invention a ainsi pour objet une séquence peptidique apte à initier des réactions d'hyper¬ sensibilité retardée d'intensité différente en présence de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes du complexe Myco.bacteri.inn tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle ne contient pas plus de 0,5 % en poids des acides aminés tyrosine, phenylalanine, methionine, histidine, arginine et cysteine.
L'invention a également pour objet un peptide ou une protéine apte à induire une réponse immunitaire chez l'hôte humain ou animal auquel elle est administrée, ayant une séquence peptidique telle que définie ci-dessus et caractérisée en ce que sa composition globale en acides aminés, exprimée en pourcentage par rapport au poids moléculaire total est sensiblement la suivante :
Asp/Asn : 1,2
Thr : 12,2
Ser : 2,5
Glu/Gin : 11,5 Gly : 7,7
Ala : 8,9
Val : 9,8
Ile : 2,8
Leu : 1,8 Lys : 1,6
Pro : 40,0 La protéine selon 1'invention peut être obtenue à partir de surnageant de cultures de BCG par les étapes de purification consistant en : (a) une filtration sur tamis moléculaire, et,
(b) une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE et (c) une chromatographie de phases inverses.
La protéine selon 1'invention induit une hypersensibilité de type retardé très intense en présence de bacilles vivants et beaucoup moins intense en présence
de bacilles morts.
L'activité "tuberculine" de cette protéine est ainsi équivalente à environ 415 000 Unités Interna¬ tionales de Tuberculine (UIT) par mg chez les cobayes immunisés avec des bacilles vivants, et à 3 000 UIT par mg chez les cobayes immunisés avec des bacilles morts.
La présente invention a donc également pour objet une composition de diagnostic caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon l'invention. Cette composition est utilisée pour détecter la présence de bactéries virulentes notamment pour le diagnostic in vitro ou in vivo de la tuberculose, chez l'homme ou chez l'animal (mammifère).
Pour le diagnostic in vivo de la tubercu- lose, la composition comprend par exemple de 1 ng à 1 μg de protéine/ml. Avantageusement, la composition de diagnostic comprend également une solution saline contenant un agent tensio-actif destiné à éviter l'adhé¬ rence de la protéine antigénique au récipient de condi- tionnement ou à la seringue utilisée pour l'injection. Un excipient particulièrement préféré pour la composition selon l'invention comprend :
- 75 g/1 de glycocolle
- 20 g/1 de NaCl - 2,375 ml/1 de Brij 35 à 10 %
- 30 ml/1 de Na2HP04 1M pH7,l
- équilibre : eau distillée apyrogène, l'excipient étant autoclave pendant 20 min à 120 °C.
La composition est administrée de préférence par voie intradermique à raison de 0,1 ml de solution dosée à 2 UIT (unités internationales de tuberculine) en utilisant une seringue à tuberculine munie d'une aiguille de 4/10e sur la face antérieure de l'avant-bras selon la méthode utilisée pour le test à la tuberculine. D'autres voies d'administration telles que
l'application d'une bague, une scarification ou l'appli¬ cation per cutanée sont également envisageables.
Après une période d'environ 48 à 96 heures, selon l'espèce, (environ 48 à 72 heures chez l'homme), on regarde l'apparition d'une réaction locale se tradui¬ sant par un érythème et/ou une induration. L'apparition d'une telle réaction permet d'établir le diagnostic d'une sensibilisation en mettant en oeuvre une réaction immunologique ayant pour origine des lymphocytes T sensibilisés par des antigènes de bactéries du complexe Mycobacteriυm tuberculosis.
L'injection de la protéine LIP-DTH, de préfé¬ rence en intradermique dans les mêmes conditions qu'une injection de tuberculine permet, pour les faibles con- centrations de cette protéine, de mettre en évidence une réaction de type tuberculine seulement chez les sujets porteurs de bacilles vivants, c'est à dire les sujets infectés récemment, les malades présentant une tubercu¬ lose ou les sujets récemment vaccinés, et non chez les sujets témoins, cependant sensibilisés vis-à-vis de la tuberculine classique.
La présente invention a également pour objet une composition immunogène comprenant un peptide ou une protéine selon l'invention, destinée à permettre une stimulation du système immunitaire afin d'obtenir une réponse de type B ou T chez un sujet humain ou animal (mammifère) en vue de le protéger contre une infection ultérieure par les bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis. Avantageusement, la composition immunogène selon l'invention comprend comme principe actif de 1 ng à 1 mg de protéine LIP-DTH.
La voie d'administration comprend toutes celles classiquement utilisées pour les vaccins, par exemple les voies orale, intraveineuse, intradermique.
intramusculaire, sous-cutanée, aérosol ou sublinguale.
Cette composition peut ou non comprendre un adjuvant doué de propriétés immunostimulantes, tel que les sels minéraux, par exemple l'hydroxyde d'aluminium, des composés hydrophobes ou des surfactants, par exemple l'adjuvant incomplet de Freund chez l'animal, le squalène ou des liposomes, des polynucléotidés synthétiques, des microorganismes ou composants de microorganismes, par exemple le murabutide, des molécules artificielles synthétiques, ou encore des cytokines, par exemple les interférons α, β, γ ou des interleukines naturelles ou obtenues par expression d'hôtes recombinants.
La composition immunogène selon l'invention peut également être utilisée comme composition de désen- sibilisation.
Certains auteurs considèrent en effet que la maladie provoquée par les bactéries du complexe Mycobac- terium tuberculosis peut être, en partie, due à la réponse immunitaire massive, à lymphocytes T, en réponse à la stimulation par les antigènes de ces bactéries.
Il peut donc être intéressant dans certains cas de désensibiliser un sujet humain ou animal en lui administrant à intervalles répétés, par exemple de 8 à 15 jours une composition telle que décrite ci-dessus. Des essais réalisés avec la protéine LIP-DTH ont montré une intensité très forte de la réaction d'hypersensibilité de type retardé, y compris avec de petites quantités de bactéries vivantes injectées (de l'ordre de 2xl03) lorsque l'épreuve était effectuée plus de 20 jours après l'immunisation. D'autre part, la réponse immunitaire induite par la protéine LIP-DTH est une réponse thymodépendante "pure", la réponse en anti¬ corps vis à vis de cette protéine étant très faible ou nulle lors de 1'immunisation par des bactéries vivantes {ou mortes) comme lors de 1'immunisation avec la protéine
purifiée.
Ces résultats amènent à proposer la protéine LIP-DTH comme moleculeuse "porteuse" d'epitopes vis-à-vis desquels est privilégiée une réponse des lymphocytes T. L'invention a donc également pour objet une composition immunogène comportant une protéine selon l'invention sur laquelle est ajouté ou fixé un épitope contre lequel une réponse de type T est souhaitée.
Cet épi ope peut être d'origine bactérienne (par exemple de mycobactéries), parasitaire, (par exemple de Leishmania, Trypanosoma ou Toxoplasma) ou viral (virus du Sida (VIH), virus d'Epstein-Barr ou virus de l'hépa¬ tite B (HBV).
Parmi les épitopes préférés, on peut citer les antigènes gag et/ou l'antigène nef du VIH ou tout ou partie de 1'enveloppe gp 120 du VIH 1 ou gp 140 du VIH 2, la toxine diphtérique ou des fragments de celle-ci, la toxine tétanique, l'antigène HBS du virus HBV ou encore 1'antigène VP1 du virus de la pσlyomyélite. L'épitope peut être couplé à la protéine porteuse au moyen d'agents de pontage bifonctionnels tels que le glutaraldéhyde, la benzoquinone ou le N-bromo succinimide, bien connus pour leurs propriétés de couplage des protéines entre elles ou tel que l'hydrazide permettant le couplage de résidus glycosylés avec des protéines.
L'invention a également pour objet l'utilisa¬ tion d'une composition immunogène selon 1'invention à des fins de diagnostic chez 1'homme ou 1'animal d'une réponse à lymphocytes T.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition immunogène selon 1'invention chez l'homme ou l'animal pour la stimulation des lymphocytes T, soit générale, soit spécifique et dirigée contre un épitope particulier dans le cas où la protéine selon
l'invention est couplée à un épitope tel que défini précédemment.
L'invention a en outre pour objet un procédé in vitro de mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux chez un hôte humain ou animal, caracté¬ risé en ce qu'il comporte les étapes suivantes :
- mise en culture sur un milieu artificiel de cellules mononucléées de l'hôte contenant des concentrations variables du peptide ou de la protéine, tel que défini précédemment, et
- mise en évidence de l'activation des cellules mononu¬ cléées de l'hôte.
A cet effet, des cellules mononucléées provenant de sujets sensibilisés ou non sont mises en culture dans un milieu tel que le RPMI 1640 ou MEM contenant 2 à 20 % de sérum homologue ou hétérologue à une concentration variant de 10 à 106 cellules/ml, milieu contenant des concentrations variables du peptide ou de la protéine tel que défini précédemment (1 ng à 10 μg/ml par exemple). Seules les cellules provenant de sujets sensibilisés seront activées pour des concentrations choisies du peptide ou de la protéine. Cette activation pourra être observée par l'examen direct des cellules au microscope (transformation lymphoblastique), incorpora- tion élevée de précurseurs radioactifs (thymidine, uridine ou autre), par la présence dans le milieu de culture de différentes cytokines (IL2, INFγ, etc..) ou par l'apparition sur la surface des cellules de récep¬ teurs à ces cytokines. Avantageusement, la mise en évidence de
1'activation des cellules est réalisée par la détection d'interféron y libéré par les cellules sensibilisées, au moyen d'un immuno-essai enzymatique utilisant un anri- corps onoclonal. L'invention a également pour objet un kit de
diagnostic pour la mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux chez 1'homme ou 1'animal, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un milieu de culture pour cellules mononucléées, conte- nant des concentrations variables du peptide ou de la protéine selon l'invention, et
- des moyens de mise en évidence de 1'activation des cellules mononucléées d'un hôte.
On décrira plus en détail ci-après la puri- fication de la protéine LIP-DTH ainsi que ses caracté¬ ristiques en se référant aux figures annexées sur les¬ quelles :
- la fig. 1 représente les résultats des réactions HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (symboles blancs) ou des bactéries mortes (symboles noirs) et testés avec un PPD (Purified Protein Derivative) standard (ronds) ou le filtrat de culture (carrés);
- la fig. 2 représente les résultats de filtration moléculaire de la substance présente dans le milieu de culture après 14 jours de croissance du BCG et l'activité HSR des fractions majeures testées sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (carrés blancs) et des bactéries mortes (carrés noirs); - la fig. 3 représente les résultats de purification sur la colonne DEAE des molécules présentes dans la fraction 4 obtenue après filtration sur gel et l'activité HSR des fractions majeures testées sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (carrés blancs) et des bactéries mortes (carrés noirs);
- la fig. 4 représente les résultats de purification sur colonne en phase inverse des molécules présentes dans la fraction 1 de la séparation sur DEAE et l'activité HSR des fractions majeures testées sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (carrés
blancs) et des bactéries mortes (carrés noirs);
- la fig. 5 représente les résultats de l'activité HSR des fractions majeures testées sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes (carrés blancs) et des bactéries mortes (carrés noirs) et testés avec un PPD (Purified Protein Derivative) standard (ronds) ou la fraction 3 de l'étape de chromatographie en phase inverse (carrés);
- la fig. 6 représente les résultats de détermination du poids moléculaire de la molécule apte à révéler une réactivite HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes.
- la fig. 7 représente les résultats de détermination du point isoélectrique de la molécule apte à révéler une réactivité HSR chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes.
I - Purification de la protéine LIP-DTH i) Test de contrôle de la purification La purification de la protéine LIP-DTH a été contrôlée par la mesure des réactions d'hypersensibilité de type retardé (HSR). Un groupe de 20 cobayes femelles (lignée hétérozygote albinos Hartley, pesant de 250 à 300 g) a été immunisé avec des BCG vivants ou des BCG tués par chauffage.
Les BCG vivants (2xl07 unités viables dans 0,1 ml de solution saline) on été injectés par voie intradermique en 2 sites dans les flancs de l'animal. 2 mg de BCG tués par chauffage (120°C, 30 mn) ont été mélangés dans 0,5 ml d'un mélange (1/1) de tampon salin et d'adjuvant incomplet αe Freund (DIFCO) et injectés par voie intramusculaire. Les cobaves sensibilisés des deux
groupes ont été utilisés pour tester la réactivité HSR entre 2 et 10 mois après l'immunisation. Généralement les cobayes sensibilisés ont été testés 5 ou 6 fois pendant cette période avec un intervalle d'au moins un mois entre deux essais.
Les réactions HSR ont été effectuées sur les flancs des cobayes sensibilisés et épilés 24 h avant l'injection. Quatre injections intradermiques ont été réalisées dans chaque flanc dans le but d'administrer à chaque animal différentes dilutions de la substance à tester et différentes dilutions d'un PPD témoin, afin d'obtenir une mesure du niveau de sensibilisation de chaque animal.
Des dilutions contenant 1, 0,50, 0,25 et 0,125 μg de PPD pour 0,1 ml ont été préparées dans une solution saline contenant du Tween 80 (0,0005%) comme décrit par Laudi et coll. (Develop. biol. Standard. 29:393-411). Des quantités déterminées de la substance à tester ont été préparées de la même manière dans 4 dilutions succes-sives dans la même solution saline.
La substance à tester a été administrée dans 0,1 ml et à différentes dilutions à 2 à 4 animaux qui recevaient en même temps différentes dilutions du standard de PPD titré à 40 000 unités de tuberculine (UIT) par mg.
La réaction a été lue après 28 heures. Les diamètres longitudinal et transversal de 1 'érythème ont été reportés en mm. La valeur de la moyenne pour une dilution donnée a été portée sur un diagramme et une courbe a pu être tracée en utilisant une analyse de régression standard. Une comparaison des valeurs obser¬ vées pour le PPD standard a permis de transformer les résultats en unités de tuberculine conventionnelles (UIT) . 2 ) Culture ciu_BCG.
Les cultures de BCG (souche 1173P2) ont été réalisées dans les ballons contenant 130 ml de milieu synthétique de Sauton selon la méthode décrite par
Gheorghiu et coll. (Bull. Inst. Pasteur 81:281-288). Le milieu de culture a été récolté après 14 jours à 37βC, filtré sur une gaze et à travers un filtre de 0,22 μm.
Le milieu a été lavé soigneusement à 4°C avec de l'eau désionisée contenant du butanol (4%) sur une membrane
Amicon PM10 et concentré environ 10 fois. Le milieu concentré contenant des molécules d'un poids moléculaire supérieur à 10 kDa a été lyophilisé et conservé à -20βC.
Le produit lyophilisé possède une activité
HSR dix fois supérieure chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes par rapport à des cobayes immuni- ses avec des bactéries mortes (fig. 1).
3) Etapes de purification, a) filtration sur tamis moléculaire
Une colonne préparative Si300, 3 μm, 50x750 mm (Serva) a été équilibrée avec un tampon salin (Na2H- P04, 50 mM ajusté à pH 7,5 avec KH2P04) contenant du butanol (4%). Le débit de la colonne était de 1,25 ml/ min, la pression maximale de 45 bars n'a pas été attein¬ te.
Le produit lyophilisé à 1'étape précédente a été dissous dans une solution tampon/butanol à une con¬ centration de 50 mg/ml. Il a été ultra-centrifugé à 40 000 g pendant 2 heures pour éliminer les résidus insolubles. Après une filtration sur des fil res de 0,22 μm, des parties aliquotes (10 ml) contenant 500 mg de substance ont été conservées à -20°C. Elles ont été à nouveau filtrées à travers un filtre de 0,22 μm après décongélation juste avant l'injection sur la colonne. Le profil de densité optique à 220 nm a été enregistré (fig. 2 ) . Les six fractions principales récoltées en fonction du profil de densité optique ont été lavées de façon
intensive à 4°C avec de l'eau désionisée contenant du butanol (4%), concentrées sur une membrane PM10 et lyophilisées. Après lyophilisation les fractions ont été pesées et conservées à -20"C. La fraction 4, contenant la majorité des molécules capables de provoquer une réaction d'hypersensibilité de type retardé chez un cobaye immunisé avec des bactéries vivantes a été sélectionné et chargé sur la colonne suivante (fig. 2). L'activité HSR de la fraction 4 a été évaluée à environ 75 000 UT par mg chez des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes pour 14 000 UT par mg chez des cobayes immunisés avec des bactéries mortes, b) Colonne de chromatographie d'échange d'ions
Une colonne préparative DEAE-TSK 5PW, 21,5x150 mm (LKB) a été équilibrée avec un tampon salin de faible concentration ionique (Na2HP04/NaH2P0410 mM, pH 7,5, et NaCl 10 mM) contenant du butanol (4%). Le débit contrôlé était de 6 ml par min. avec une pression maximale de 30 bars. Un gradient linéaire de NaCl de 1 M au maximum dans le même tampon a été appliqué après l'injection de 100 mg de la fraction 4 précédente obtenue à partir de la colonne Si300, dissous dans 4 ml du tampon salin de départ. Cinq fractions majoritaires ont été récupérées en fonction de la densité optique (220 nm). Elles ont été lavées de façon intensive à 4°C avec de l'eau désionisée/butanol 4%, concentrées sur une membrane PM10 et lyophilisées. Seule la fraction 1 contenant les antigènes capables de révéler une réaction de HSR chez le cobaye immunisé avec des bactéries vivantes a été chargée sur la colonne suivante.
L'activité HSR de la fraction 1 a été évaluée à 180000 UIT par mg chez des cobayes immunisés avec BCG vivants contre 5000 UIT par mg chez des bactéries immu¬ nisées avec des BCG morts (fig. 3). c ) colonne de chromatographie de phases inverses
Une colonne RP300 C8 10 μm de 4,6x250 mm (Aquapore Brownlee Lab. ) a été équilibrée avec un tampon acétate d'ammonium (NH4COOCH3 20 mM, pH 6,5) avec un débit contrôlé de 2 ml par minute et une pression maxi- maie de 115 bars. 7,5 mg de la fraction précédente 1 obtenue à partir de la colonne DEAE a été injectée dans
I ml de tampon acétate d'ammonium. Un gradient d'élution contenant de 0 à 90% d'acétonitrile pour les concentra¬ tions les plus élevées a été établi selon le profil représenté à la figure 4. Le profil de densité optique à 220 nm a permis d'isoler 6 fractions majeures qui ont été concentrées sous vide à 40°C pour éliminer l'acétoni¬ trile, et lyophilisées.
La fraction 3 correspondant à 20-22% d'acéto- nitrile a présenté une activité HSR très élevée sur des cobayes immunisés avec du BCG vivant (environ 550 000 UIT/mg) et une activité très faible sur des cobayes immunisés avec du BCG mort (inférieure à 3 000 UIT/mg) (fig. 4). La fraction 3 a été retitrée de façon plus précise en utilisant 8 cobayes par groupe d'immunisation.
La substance purifiée était 100 fois plus active sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes par rapport à des cobayes immunisés avec des bactéries mortes. L'activité était respectivement de
415 000 UIT/mg et 3 000 UIT/mg après une mesure précise du titre (fig. 5).
II - Caractéristiques de la protéine L P-DHT 1) Composition de la la protéine LIP-DHT
La composition globale en glucides et en acides aminés présents dans la fraction purifiée indique qu'environ 20% de la masse totale est composée de diffé¬ rents oses majeures îmannose. galactose, arabinose et xylose i-
Cette protéine est sensible aux enzymes protéolytiques telles que pronase et subtilopeptidase, ce qui signifie que son activité biologique disparaît après incubation en présence de ces enzymes dans des conditions habituelles de tampon et de concentration.
L'analyse de la séquence NH2-terminale de la protéine a révélée la séquence peptidique suivante :
Thr-Pro-Pro-X1-Glu-X2-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-X3-Val-X4-Leu-
dans laquelle Xl r X2, X3 et X4 représentent des acides aminés modifiés.
2) Détermination du poids moléculaire
Le poids moléculaire a été étudié sur SDS- PAGE à 10 % d'acrylamide; le gel d'environ 10 cm pour la partie résolutive, a été récolté et coupé en fragments de 0,5 cm de longueur. Chaque fragment de gel a été élue dans 1 ml d'eau en présence de T een 80 à 0,0005 %, puis 1'activité HSR a été testée sur des cobayes immunisés avec des bactéries vivantes. Le front et le maximum d'activité ont été trouvé dans une zone de 45 kDa (figure 6).
Cette détermination du poids moléculaire est effectuée avec une approximation d'environ 10 %, approxi- mation imputable aux variations des résultats en fonction des kits d'étalonnage utilisés. (Pharmacia par exemple).
3) Détermination du point isoélectrique
Le point isoélectrique a été déterminé sur un gel de polyacrylamide incluant des ampholytes (Servalyt 2-11). Le gel après isofocalisation d'un aliquote de la fraction LIP-DTH dans un champ électrique selon les conditions classiques a été découpé en 21 fragments de 0,5 cm. Chaque fragment de gel a été élue dans 1 ml d'eau en présence de Tween 80 à 0,0005 : le pH a été mesuré, ouis l'activité HSR ?. été éprouvée sur des cobaves
immunisés avec des bacilles vivants. L'activité principa¬ le, environ 4 000 UIT par ml est trouvée pour un pH de 4+0,2, la faible activité dans la zone de pH 8 correspon¬ dant à l'emplacement du dépôt des molécules à analyser, d'où la petite activité résiduelle visible sur la figure 7.
4) Toxicité
Des tests de toxicité ont été réalisés chez le cobaye selon des recommandations de Codex pour une tuberculine purifiée.
- Toxicité aiguë: après injection de l'équi¬ valent de.50000 UIT de protéine LIP-DTH, aucune toxicité n'a été observée.
- Sensibilisation: une épreuve de non- sensibilisation consistant à injecter 4 fois en 1 mois une dose correspondant à 500 UIT de protéine purifiée a montré une absence de toxicité dans des conditions semichroniques et l'absence de sensibilisation.
Par ailleurs des souris ont reçu des doses comprises entre 1 UIT et 2 000 UIT sans présenter de troubles cliniques. De même des singes saïmiri (12) ont reçu des doses de 200 UIT en intradermique sans présenter de signes locaux ou généraux.
Claims
1. Séquence peptidique apte à initier des réactions d'hypersensibilité retardée d'intensité différente en présence de bactéries vivantes par rapport à des bactéries mortes du complexe Mycobacteriuzn tubercu¬ losis, caractérisée en ce qu'elle ne comprend pas plus de 0,5 % en poids d'acides aminés tyrosine, phenylalani¬ ne, methionine, histidine, arginine et cysteine.
2. Peptide ou protéine antigénique apte à induire une réponse immunitaire chez 1'hôte auquel elle est administrée, ayant une séquence peptidique selon la revendication 1, caractérisée en ce que sa composition globale en acides aminés, exprimée en pourcentage par rapport au poids moléculaire total est sensiblement la suivante :
Asp/Asn : 1,2 Thr : 12,2 Ser : 2,5 Glu/Gin : 11,5 Gly : 7,7 Ala : 8,9 Val : 9,8 Ile : 2,8 Leu : 1,8 Lys : 1,6 Pro : 40,0
3. Peptide ou protéine selon 1'une des revendications 1 ou 2, caractérisée en ce qu'il (elle) présente tout ou partie de la séquence NH2-terminale suivante :
Thr-Pro-Pro-X.-Glu-X-.-Pro-Pro-Pro-Pro-Gln-X-.-Val-XΛ-Leu-
10 14
X. et X. représentant des acides aminés modifiés 4. Protéine selon l'une quelconque des reven¬ dications prédédentes, caractérisée en ce qu'elle est obtenue à partir de surnageant de culture de BCG par les étapes de purification consistant en : (a) une filtration sur tamis moléculaire,
(b) une chromatographie d'échange d'ions sur DEAE, et
(c) une chromatographie de phases inverses.
5. Protéine selon la revendication 4, carac¬ térisée en ce que l'étape (a) est une filtration sur une colonne Si 300, 3 μm équilibrée avec un tampon Na2H- P04/KH2P04r pH 7,5, l'élution étant effectuée avec le même tampon avec un débit de 1,25 ml/min. sous une pression inférieure à 45 bars.
6. Protéine selon la revendication 4 ou 5, caractérisée en ce que l'étape (b) est une chromatogrpa- hie d'échange d'ions sur une colonne DEAE-TSK 5PW équili¬ brée avec un tampon Na2HP04/NaH2P04 10 mM, pH 7,5, NaCl 10 mM, l'élution étant effectuée avec un gradient linéaire de NaCl de 0 à 1M dans le même tampon avec un débit de 6 ml/min. sous une pression inférieure à 30 bars.
7. Protéine selon l'une des revendications 4 à 6, caractérisée en ce que l'étape (c) est une chromato¬ graphie d'échange d'ions en phase inverse sur une colonne RP 300 C8 10 μm équilibrée avec un tampon NH4COOH3, pH 6,5, l'élution étant effectuée avec un gradient de 0 à 90% d'acétonitrile dans le même tampon avec un débit de 2 ml/min. et une pression inférieure à 115 bars.
8. Protéine selon 1'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire apparent d'environ 45 kDa en gel de polyacrylamide en présence de SDS.
9. Protéine selon 1'une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que son point isoélectrique est de 4 ±0,2.
10. Composition de diagnostic, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon 1'une quelcon¬ que des revendications précédentes.
11. Composition selon la revendication 10, pour le diagnostic in vivo d'une infection par des bactéries du complexe Mycobacterium tuberculosis, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un excipient contenant un agent surfactif.
12. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon l'une des revendi- cations 1 à 9.
13. Composition immunogène, caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine selon l'une des revendi¬ cations 1 à 9, en tant que protéine support sur laquelle est additionné ou fixé un épitope vis-à-vis duquel est recherché une réponse des lymphocytes T.
14. Utilisation de la composition selon la revendication 13 à des fins de diagnostic.
15. Utilisation de la composition selon la revendication 12 ou la revendication 13, pour la fabrica- tion d'une composition thérapeutique destinée à la stimulation des lymphocytes T.
16. Procédé de mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux chez un hôte, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : - mise en culture sur un milieu artificiel de cellules mononucléées de 1'hôte contenant des concentrations variables du peptide ou de la protéine tel que défini dans les revendications 1 à 9, et - mise en évidence de 1'activation des cellules mononu- cléées de l'hôte.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la mise en évidence de 1'activation des cellules est réalisée par une méthode choisie parmi l'observation directe des cellules au microscope. l'incorporation de précurseurs radioactifs, la détection dans le milieu de culture de cytokines et l'apparition de récepteurs des cytokines à la surface des cellules.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la mise en évidence de 1'activation des cellules est réalisée par la détection d'interféron γ libéré par les cellules sensibilisées au moyen d'un immuno-essai enzymatique utilisant un anticorps monoclo- nal.
19. Kit de diagnostic pour la mise en évidence d'une réponse T contre un agent infectieux, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un milieu de culture de cellules mononucléées contenant des concentrations variables du peptide ou de la protéine tel que défini dans les revendications 1 à 9, et - des moyens de mise en évidence de l'activation des cellules mononucléées de l'hôte.
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