CA2051695A1 - Glutathion-s-transferase sm26 du s. mansoni - Google Patents
Glutathion-s-transferase sm26 du s. mansoniInfo
- Publication number
- CA2051695A1 CA2051695A1 CA002051695A CA2051695A CA2051695A1 CA 2051695 A1 CA2051695 A1 CA 2051695A1 CA 002051695 A CA002051695 A CA 002051695A CA 2051695 A CA2051695 A CA 2051695A CA 2051695 A1 CA2051695 A1 CA 2051695A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- protein
- sequence
- residue
- amino acid
- ending
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Abandoned
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1085—Transferases (2.) transferring alkyl or aryl groups other than methyl groups (2.5)
- C12N9/1088—Glutathione transferase (2.5.1.18)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P33/00—Antiparasitic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
- C07K14/43536—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms
- C07K14/43559—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from worms from trematodes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
2051695 9112327 PCTABS00105 L'invention concerne une glutathion-S-transférase de Schistosoma mansoni, ayant un poids moléculaire de 26 Kd, appelée p26 ou Sm26 ainsi que les moyens de production de cette protéine sous une forme substantiellement purifiée.
Description
Wo 91/12327 ~ 6~35 pcr/FR9l/ooosl .
GLUTAT~IOh-S-TRA~SFERASE S~126 DE S.I~ SO~I
~0 La présente invention concerne une glutathion S-lransférase (GST) de SchislosomLI
mansonh ayam un poids moléculaire de 26 Kd, appelée p~6 ou Sm26 ainsi que l~s moyens de production de cene proléine sous une forme substamieliement purifiée.
Les schistosomes sonl des vers qui sont les agents d'une maladie parasitaire des '25 régions lropicales et sub-lropicales, appelée schislosomiase (ou bilharziose). Cene maladie affecle environ 200 à 400 millions d'etres humains. 11 existe un médicament efficace contre le parasite adulte, le praziquantel, mais son coût est trop élevé pour qu!on puisse envisager sori usage généralisé dans les pays en voie de développemem. Le seul espoir séricux de prévention de la maladie réside, a ce jour, dans la mise au poim d-un vaccin 30 efficace contre le parasile.
Il cst déj3 connu que S. mansoni possede au moins deux glulathion-S-transtërases;
l'une d'un poids moléculaire de 6 Kd, l'aulre, prédominame, d'un poids moleculaire de 28 Kd, appcl6e p28 ou Sm28. L'existence de ces deux prot6ines a élé mise en evidenc~
35 sur gcl SDS-polyacrylamide apres éleclrophorèse de l'échanlillon d'un élual oblenu par chromatographie d'affinilé d'un extrait dc S. mansoni sur une colonne de ~lulalhion-agsrose ~Tiu ct al, Parasite Immunol., (1988) 10: 693). Toutefois, cet article n'indique pas commcn~ obtcnir 3 partir de l'éluat, dcs prcparaiions conlenanl chacune des deux glutathion-S-transférases sous forme séparée.
; , ., , ..
WO 91/12327 P~/FR91/00091 . ~
De plus, il est aussi connu que Sm~8, lelle que obtenue par les ~echniques de l'AD.~, recombinant~ pou.~ail elre un candidaL de choix à lilr~ d agenl vaccinal conlre la schislosomiase.
Enfin, dRs travaux parallèles sur S. japonicum om mis ~ie m~me en ~videnc~ d~
amigènes similaires, i.e. Sp26 et Sp28, chez ce dernier organisme (Smilh el al, Mol.
Biochem. Parasilol. (1988) ": ~49) Le fragmenl d'ADN codanl pour Sm26 ayant maintenant été trouvé, il es~ donc possible de produire ceLte protéine par les techniques de l'AD~' recombinam. Ceci perme~
entre autre d'obtenir la Sm 6 en l'absence de Sm~8 el en quamil~ suffisame pour ~Ir~
purifiée.
Par conséquent, la préseme invemion propose:
(i) une protéine dom la séquence en acides aminés préseme au moins 90 ~O
avantageusemenl au moins 95 % d'homologie avec la séquence lelle que momrée dans l'identificateur de séquence, commenc,ant avec le résidu alanine en posilion 1 et finissant avec le résidu Iysine en position '17; ladile proléine e~anl sous'0 forme substantiellement pure; ainsi que (ii) une proléine donl la séquence en acides aminés esl lelle que momrée dans l'idenîificateur de séquence, commenc,am avec le résidu alanine en poshion l ~l finissant avec le résidu Iysine en position 217, ou un fragment de ladile proléine contenanl au moins 22 acides aminés; ladite protéine ou ledil fragmem élam sous une forme subslamiellemenl pure.
Ceci inclut notamment la Sm26 ainsi que des analogues de celle-ci. Toul comme laSm26, ces analogues pourraienl etre caractérisés par une activité glulalhion-S-transférase ou par la capacilé d'induire chez un mammifere une réponse immunologique qui protège ce mammifère conlre une infection par des schislosomes. A titre d'exemple, on cite l'analogue (45-80) commcnçant avec le résidu Iysine en posilion 45 et finissanl avec le résidu histidine en posilion 80.
Unc proléine selon l'invenlion, en particulier la pro~éine Sm26 donl la séquence en acidcs aminés esl ~elle que monlrée dans l~iden~ificaleur de séquence peu~ exister sous forme monomèrc ou multimere. Pour illuslrer ce dernier cas on cile, a li~re d'exemple, la formc dimérique qui peul êlre avanlageusemenl main~enue par des ponls disulphures imer chatnes.
WO 91/12327 ~ 6~ ~ Pcr/FR9l/ooogl Une activité glutathion-S-transferase peut etre mise en évidence par la méthode décrite par Hahig & Jakoby, Me~hods in Enzvmology, 77: 398. Environ 10 ul d'un~
solution à tester, de préférence préparée en milieu tampon proche de la neutralité. sont ajoutés à 8~0 ~I d'une solution tampon de phosphate de potassium 50ml~,1; pH 6,j 4ui contien~ en oulre 4,7 mM de glulalhion réduil el 360 ~M de l~hloro-~ dinilrobenzene.
En parallèle, on effectue un contrôle négatif. L'apparition du produit de la réaction esl sui- ie par spectrophotométrie à 340 nm jusqu'à transformation complèle du substra!.
L'activité glutaîhion-S-transférase est donnée en ~ Vmin/mg.
Sous un autre aspec~, I'invention concerne aussi:
i) un ~ragmenl d'ADN isolé qui code pour une protéine selon l'invemion. Un exemple particulier d un fragmenl d'AD!~ selon l'invemion esl momre dan.s l identificateur d~ séquence. Par tra ~mem d'ADI~ isole, on enlend un irat~menl d'ADN qui n'est plus associe aux régions qui contrôlem son expression dans l organisme dom il est issu, c est-à-dire dans le cas présenl S.mansoni.
ii) une casse~te d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon l'invemion ainsi que des éléments nécessaires à son expression (transcription et traduction) '0 dans une cellule hote. Ces éléments sont essentiellemem un promoleur detranscription appropri~ ainsi que les codons d iniliation e~ de fin de Iraduction.
Dans cerlains cas, il esl aussi avamageux d'ajouler un lerminateur d.
transcription.
~5 iii) une cellule qui est transformée par une cassette d'expression selon l'invention.
Celle casselte d'expression peut etre soit intégrée dans le génome de la cellule, soit portée par un vecteur d'expression approprié à replication autonomc e.g., un plasmide.
iv) un procédé de préparation d'une protéine selon l'invention qui comprend l'acte de cul~iver une cellule selon l'inven~ion e~ de récolter ladite proléine à panir de la culture.
LGS technologies perme~an~ le clonage et I'expression d'un gene étrangcr dans des cellules holes procaryo~es ou eucaryoles sont connues de l'homme du mélier. Elles seron illustrées dans les exemples ci-après, é~anl entendu que d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes peuvent être utilisés.
WO 91/12327 i~ ; PCr/FR91/00091 - 4 .
Enfin l'invention concerne de même:
i) une composition pharmaceutique de~stinée à la prévemion ou au traitemem de laschistosomiase qui comprend à tilre d'agent thérapeutique au moins une proléine dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence commen~ant avec le résidu aianine en position 1 et finissant avec le résidu Ivsine en posi~ion '1-.
ii) une composition pharmaceutique deslinée à prévenir ou traiter la schistosomiase qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence.
commencant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu Iysine en position '17 ou un fragment de ladite protéine contenam au moins " acides aminés.
1~ .
iii) une mélhode pour prévenir ou traiter la schistosomiase qui comprend l ac~e d'administrer une quantité thérapeutiquement effective d'une protéine selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
iv) I'usage d'une protéine selon l'invention à titre d'agenl thérapeutique destiné
prévenir ou uaiter la schistosomiase.
IJne protéine selon l'invemion ou un fragmem de celle-ci possède une activi~é
thérapeutique par exemple une activité vaccinale et par conséquent esl utile en tant que ~5 produi~ pharmaceulique. Celte ac~ivi~é peut être mise en évidence dans un tes~ iden~ique ou similaire à celui décrit dans l'Exemple 3.
Une composition pharmaceu~ique selon l'invention peut être fabriquée de manière convenlionnelle. En paniculier on associe une protéine selon l'invenlion ou un fragmem de ladite protéine avec un diluan~ ou un supporl acceptable d'un poim de vue phar~naceutique. On indique de plus que pour usage dans une composi~ion selon l'invention la protéine peu~ clre avan~ageusemen~ sous forme monomérique ou dimérique ce~e derniere forme é~an~ paniculièremen~ inléressanLe Une composition selon l'invenlion peut en outre conlenir d'aulres composés ~els que d'au~res glu~a~hion-S-transférases de schis~osomes e.g. Sp26 Sp28 Sm28 de préférence sous forme dimérique ou un des analogues de celles-ci. Enfin une composi~ion selon l'invention peut con~enir un adjuvanl de vaccination ~el que l'alun. De maniere al~erna~ive ce~ adjuvan~ peu~ êlre ajoulé à une composi~ion selon l'inven~ion jus~e avan~ usage.
WO 9Itl2327 %~5~6~ Pcr/FRgl/ooog1 Une composition selon I invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins en particulier par voie sous-cutanée par exemple sous forme de solution ou de suspension injectable. L'administration peul avoir lieu en dose unique ou répélée une ou plusieurs fois après un certain délai 5 d'intervalle. Le dosage approprié varie en tonction de divers paramètres par e:Yemple de l'individu traité eL du mode d'adminis~ralion.
Sous un dernier aspec~ de l'invention. une protéine selon l'invenlion ou un fragmenl de celle-ci peul être notamment utile à titre d'agent présentant une ac~ivilé glu~a~hion 10 transférase. De ce fait elle peut etre employée par exemple dans des procédés de bioconversion.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques e avantages de la présente invention en prenant les figures suivantes en référenc~.
La Figure 1 représente le vecteur pTG959.
La Figure 2 repré-senle un gel de polyacrvlamide-SDS révélé par ccloration au bleu de Coomassie après électrophorèse. Les colonnes a b et c correspondent respectivement ~0 aux fractions non purifiées solubles et insolubles des extraits T&E901/pTG4170 après induc~ion Sh à 42C et à la préparalion purifiée sur colonne de gluta~hion-agarose.
La Figure 3 permet de comparer les séquences d'acides aminés des proleines Sm~6 el Sj26. Dans celles-ci des espaces sont schémaliquemenl introduits de manière a obtenir '5 un alignemenl optimal WO 91/12327 PCI/FR9l/00091
GLUTAT~IOh-S-TRA~SFERASE S~126 DE S.I~ SO~I
~0 La présente invention concerne une glutathion S-lransférase (GST) de SchislosomLI
mansonh ayam un poids moléculaire de 26 Kd, appelée p~6 ou Sm26 ainsi que l~s moyens de production de cene proléine sous une forme substamieliement purifiée.
Les schistosomes sonl des vers qui sont les agents d'une maladie parasitaire des '25 régions lropicales et sub-lropicales, appelée schislosomiase (ou bilharziose). Cene maladie affecle environ 200 à 400 millions d'etres humains. 11 existe un médicament efficace contre le parasite adulte, le praziquantel, mais son coût est trop élevé pour qu!on puisse envisager sori usage généralisé dans les pays en voie de développemem. Le seul espoir séricux de prévention de la maladie réside, a ce jour, dans la mise au poim d-un vaccin 30 efficace contre le parasile.
Il cst déj3 connu que S. mansoni possede au moins deux glulathion-S-transtërases;
l'une d'un poids moléculaire de 6 Kd, l'aulre, prédominame, d'un poids moleculaire de 28 Kd, appcl6e p28 ou Sm28. L'existence de ces deux prot6ines a élé mise en evidenc~
35 sur gcl SDS-polyacrylamide apres éleclrophorèse de l'échanlillon d'un élual oblenu par chromatographie d'affinilé d'un extrait dc S. mansoni sur une colonne de ~lulalhion-agsrose ~Tiu ct al, Parasite Immunol., (1988) 10: 693). Toutefois, cet article n'indique pas commcn~ obtcnir 3 partir de l'éluat, dcs prcparaiions conlenanl chacune des deux glutathion-S-transférases sous forme séparée.
; , ., , ..
WO 91/12327 P~/FR91/00091 . ~
De plus, il est aussi connu que Sm~8, lelle que obtenue par les ~echniques de l'AD.~, recombinant~ pou.~ail elre un candidaL de choix à lilr~ d agenl vaccinal conlre la schislosomiase.
Enfin, dRs travaux parallèles sur S. japonicum om mis ~ie m~me en ~videnc~ d~
amigènes similaires, i.e. Sp26 et Sp28, chez ce dernier organisme (Smilh el al, Mol.
Biochem. Parasilol. (1988) ": ~49) Le fragmenl d'ADN codanl pour Sm26 ayant maintenant été trouvé, il es~ donc possible de produire ceLte protéine par les techniques de l'AD~' recombinam. Ceci perme~
entre autre d'obtenir la Sm 6 en l'absence de Sm~8 el en quamil~ suffisame pour ~Ir~
purifiée.
Par conséquent, la préseme invemion propose:
(i) une protéine dom la séquence en acides aminés préseme au moins 90 ~O
avantageusemenl au moins 95 % d'homologie avec la séquence lelle que momrée dans l'identificateur de séquence, commenc,ant avec le résidu alanine en posilion 1 et finissant avec le résidu Iysine en position '17; ladile proléine e~anl sous'0 forme substantiellement pure; ainsi que (ii) une proléine donl la séquence en acides aminés esl lelle que momrée dans l'idenîificateur de séquence, commenc,am avec le résidu alanine en poshion l ~l finissant avec le résidu Iysine en position 217, ou un fragment de ladile proléine contenanl au moins 22 acides aminés; ladite protéine ou ledil fragmem élam sous une forme subslamiellemenl pure.
Ceci inclut notamment la Sm26 ainsi que des analogues de celle-ci. Toul comme laSm26, ces analogues pourraienl etre caractérisés par une activité glulalhion-S-transférase ou par la capacilé d'induire chez un mammifere une réponse immunologique qui protège ce mammifère conlre une infection par des schislosomes. A titre d'exemple, on cite l'analogue (45-80) commcnçant avec le résidu Iysine en posilion 45 et finissanl avec le résidu histidine en posilion 80.
Unc proléine selon l'invenlion, en particulier la pro~éine Sm26 donl la séquence en acidcs aminés esl ~elle que monlrée dans l~iden~ificaleur de séquence peu~ exister sous forme monomèrc ou multimere. Pour illuslrer ce dernier cas on cile, a li~re d'exemple, la formc dimérique qui peul êlre avanlageusemenl main~enue par des ponls disulphures imer chatnes.
WO 91/12327 ~ 6~ ~ Pcr/FR9l/ooogl Une activité glutathion-S-transferase peut etre mise en évidence par la méthode décrite par Hahig & Jakoby, Me~hods in Enzvmology, 77: 398. Environ 10 ul d'un~
solution à tester, de préférence préparée en milieu tampon proche de la neutralité. sont ajoutés à 8~0 ~I d'une solution tampon de phosphate de potassium 50ml~,1; pH 6,j 4ui contien~ en oulre 4,7 mM de glulalhion réduil el 360 ~M de l~hloro-~ dinilrobenzene.
En parallèle, on effectue un contrôle négatif. L'apparition du produit de la réaction esl sui- ie par spectrophotométrie à 340 nm jusqu'à transformation complèle du substra!.
L'activité glutaîhion-S-transférase est donnée en ~ Vmin/mg.
Sous un autre aspec~, I'invention concerne aussi:
i) un ~ragmenl d'ADN isolé qui code pour une protéine selon l'invemion. Un exemple particulier d un fragmenl d'AD!~ selon l'invemion esl momre dan.s l identificateur d~ séquence. Par tra ~mem d'ADI~ isole, on enlend un irat~menl d'ADN qui n'est plus associe aux régions qui contrôlem son expression dans l organisme dom il est issu, c est-à-dire dans le cas présenl S.mansoni.
ii) une casse~te d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon l'invemion ainsi que des éléments nécessaires à son expression (transcription et traduction) '0 dans une cellule hote. Ces éléments sont essentiellemem un promoleur detranscription appropri~ ainsi que les codons d iniliation e~ de fin de Iraduction.
Dans cerlains cas, il esl aussi avamageux d'ajouler un lerminateur d.
transcription.
~5 iii) une cellule qui est transformée par une cassette d'expression selon l'invention.
Celle casselte d'expression peut etre soit intégrée dans le génome de la cellule, soit portée par un vecteur d'expression approprié à replication autonomc e.g., un plasmide.
iv) un procédé de préparation d'une protéine selon l'invention qui comprend l'acte de cul~iver une cellule selon l'inven~ion e~ de récolter ladite proléine à panir de la culture.
LGS technologies perme~an~ le clonage et I'expression d'un gene étrangcr dans des cellules holes procaryo~es ou eucaryoles sont connues de l'homme du mélier. Elles seron illustrées dans les exemples ci-après, é~anl entendu que d'autres vecteurs et d'autres cellules hôtes peuvent être utilisés.
WO 91/12327 i~ ; PCr/FR91/00091 - 4 .
Enfin l'invention concerne de même:
i) une composition pharmaceutique de~stinée à la prévemion ou au traitemem de laschistosomiase qui comprend à tilre d'agent thérapeutique au moins une proléine dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence commen~ant avec le résidu aianine en position 1 et finissant avec le résidu Ivsine en posi~ion '1-.
ii) une composition pharmaceutique deslinée à prévenir ou traiter la schistosomiase qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence.
commencant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu Iysine en position '17 ou un fragment de ladite protéine contenam au moins " acides aminés.
1~ .
iii) une mélhode pour prévenir ou traiter la schistosomiase qui comprend l ac~e d'administrer une quantité thérapeutiquement effective d'une protéine selon l'invention à un patient ayant besoin d'un tel traitement.
iv) I'usage d'une protéine selon l'invention à titre d'agenl thérapeutique destiné
prévenir ou uaiter la schistosomiase.
IJne protéine selon l'invemion ou un fragmem de celle-ci possède une activi~é
thérapeutique par exemple une activité vaccinale et par conséquent esl utile en tant que ~5 produi~ pharmaceulique. Celte ac~ivi~é peut être mise en évidence dans un tes~ iden~ique ou similaire à celui décrit dans l'Exemple 3.
Une composition pharmaceu~ique selon l'invention peut être fabriquée de manière convenlionnelle. En paniculier on associe une protéine selon l'invenlion ou un fragmem de ladite protéine avec un diluan~ ou un supporl acceptable d'un poim de vue phar~naceutique. On indique de plus que pour usage dans une composi~ion selon l'invention la protéine peu~ clre avan~ageusemen~ sous forme monomérique ou dimérique ce~e derniere forme é~an~ paniculièremen~ inléressanLe Une composition selon l'invenlion peut en outre conlenir d'aulres composés ~els que d'au~res glu~a~hion-S-transférases de schis~osomes e.g. Sp26 Sp28 Sm28 de préférence sous forme dimérique ou un des analogues de celles-ci. Enfin une composi~ion selon l'invention peut con~enir un adjuvanl de vaccination ~el que l'alun. De maniere al~erna~ive ce~ adjuvan~ peu~ êlre ajoulé à une composi~ion selon l'inven~ion jus~e avan~ usage.
WO 9Itl2327 %~5~6~ Pcr/FRgl/ooog1 Une composition selon I invention peut être administrée par n'importe quelle voie conventionnelle en usage dans le domaine des vaccins en particulier par voie sous-cutanée par exemple sous forme de solution ou de suspension injectable. L'administration peul avoir lieu en dose unique ou répélée une ou plusieurs fois après un certain délai 5 d'intervalle. Le dosage approprié varie en tonction de divers paramètres par e:Yemple de l'individu traité eL du mode d'adminis~ralion.
Sous un dernier aspec~ de l'invention. une protéine selon l'invenlion ou un fragmenl de celle-ci peul être notamment utile à titre d'agent présentant une ac~ivilé glu~a~hion 10 transférase. De ce fait elle peut etre employée par exemple dans des procédés de bioconversion.
Les exemples ci-après sont destinés à mettre en évidence d'autres caractéristiques e avantages de la présente invention en prenant les figures suivantes en référenc~.
La Figure 1 représente le vecteur pTG959.
La Figure 2 repré-senle un gel de polyacrvlamide-SDS révélé par ccloration au bleu de Coomassie après électrophorèse. Les colonnes a b et c correspondent respectivement ~0 aux fractions non purifiées solubles et insolubles des extraits T&E901/pTG4170 après induc~ion Sh à 42C et à la préparalion purifiée sur colonne de gluta~hion-agarose.
La Figure 3 permet de comparer les séquences d'acides aminés des proleines Sm~6 el Sj26. Dans celles-ci des espaces sont schémaliquemenl introduits de manière a obtenir '5 un alignemenl optimal WO 91/12327 PCI/FR9l/00091
2~S~5 -EXEMPLE 1: clona~e d'un ADN comulémentaire codant pour Sm26 IA. Préparalion d'antisérum anti-Sm 6 Une souche du parasite S.mansoni est maintenue dans BiomDhalaria Plabra~a (escargot aquatique) puis dans des hamsters dorés. La forme adulte du parasite est récol~ée à panir du sang prélevé dans la veine po~e de hamsters infec~és depuis 40 jours. Après lavage en milieu d'Ea~le minimum (MEM). Ies vers sont repris dans un tampon de formule: 10 mM de phosphate de potassium a pH 7 0; l,lS~o KCI; 0 5 mM de PMSF
(Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride) et 1 mM d'EDTA (Ethylene Diamine TetraAce(ic acid disodium sall). Celle préparation soumise aux ultrasons est homogénéisee puis centrifugée pendant 20 min à 10000 tours par minute à 4C en utilisant un rotor Sorval!
HB-4. Le surnageant esl récupéré puis appliqué sur une colonne de g~utha~ion-a~arose (Sigma Chemical Co Sl. Louis. Mo) équilibrée avec le ~ampon décrit ci~essus. Aprè~
lavage intensif avec ce meme ~ampon la fraction f~xée esl éluée avec un ~ampon d-elu~ion (aO mM de Tris-HCl pH 91 7 mM de glu~hation réduit et 01 mM de di~hio~réi~ol). La frac~ion éluée est ensui~e neutralisée à l aide du tampon phospha~e de po~assium 0.5 M
pH 7 puis dialysée contre du phosphate de potassium 10mM pH 7 et enfin concemreeavec de l'aquacide II (Calbiochem-Behring Corp CA).
Les glulhation S-transférases totales de S. mansoni ainsi purifiées sont fractionnées sur gel préparatif de polyacrylamide (13%) suivant la technique décrite par Laemmli el al Nature (1970) 227: 680. Apres coloration au bleu de Coomassie la bande migrant à
26 kDa est récupérée. La Sm26 est elecLro-éluée suivan~ le protocole décrit par Balloul e~ al. Mol. Biochem. Parasi~ol. (1985) 17: 105. Elle esl dialysée conlre de l eau puis concentrée à l'aide d'aqùacide II.
Des lapins recoivent par injeclion intradermale multi-sile (40 points) 100 ~g de Sm26 sous un volume lotal de 1 ml purifiée en présence d'adjuvanl complet de Freund. Deux scmaines plus tard 20 ~g de Sm26 sonl injectés en présence d'adjuvam incomplet de Frcund cn administration sous-claviculaire.
IB. Préparation de la banque d'ADN comPlémenlaire L'ARN to~al dcs schistosomes adultes esl extrait par la méthode décrite par Chirgwin el al. Biochemistry (1979) 18: 5294 et modifiee par Gausz el al. Mol. Biochem.
Parasilol. (1983) 7: 293. L'ARN poly A~ est oblenu par chromalographie d'affinilé sur colonne dc ccllulose oligo (dT)12-18 (Collaborative F~esearch Lcxington MA). Unebanque d'ADN complémenlaire exprimée dans le vccleur lambda gt 11 est conslruile e~
utilisanl la trousse Amersham de la fa~on suivante. A parlir des ARN poly A- purifiés , ' . :
,... . . , ,. ~
.
~' , Wo 91/l2327 2~6,~ pcr/FR9l/ooo9l .
on synlhétise des ADN complémen~aires (cADN) suivanl la méthode de Gubler et Hoffman, Gene (1983) '5: 263. Après proleclion des sites EcoRl inlernes des cADN, des adaptaleurs EcoR1 sont accroches aux fragmen~s de cADI\I. Ceux-ci sonl alors digérés par EcoR1 et les adaplateurs en excès sonl éliminés par chromalographie sur colonne. Ces S fragmenls de cADN sont insérés dans le site EcoRI du phage lambda gl 11 (Young el Davis, 19~3). Les inserts EcoRI sonl ainsi fusionnes avec la séquence codant pour la ~-galactosidase et sont donc placés sous le contrôle du promoteur lactose. Les phages recombinants sont empaquetés in vi~ro.
10 lC Sélection d'un ADNc codant pour Sm26 1,5 . 106 phages indépendants de la banque d'ADN complémenlaire sonl leslés p~r -la mélhode décrile par Huynh et al.. DNA cloning, a Prac~ical Approach, (19~5) Glov~r D.M., ed., 1: 49. modifiée de la fac,on suivante: un échanlillon de cene banque en lambda gl11 esl inoculé sur la souche E. coli Y1090 à une dilulion représenlanl 5000 phages par boile de 85 mm de diamètre e~ incubée à ~'C. Les plages sont lransférées pendanl S h à 37C sur des fillres de nilrocellulose (Schleicher el Schuell) préalablement imprégnés d'isopropyl-~-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 10 mM; l'IPTG permet d'induire l'expression de la proléine de fusion qui esl sous conlrôle du promoleur lac. L~s ~illres 20 sonl incubés en présence de l'an~isérum de lapin anti-p26 (préalablemenl adsorbé sur un exlrai~ d'an~igènes de E.coli). Les anlicorps fixés sonl reconnus par un second anlicorps anti IgG de lapin marqué a la bioline; une streplavidine-peroxidase se fixe alors à la bio~ine, et ce complexe es~ révélé par une réaclion de la peroxydase sur un réaclif coloré
nommé "HRP color developmenl reagenl", commercialisé par Bio Rad.
~5 Cetle dé~eclion par anlicorps perme~ d'idenlifier les phages recombinanls donl l'insert de cADN dirige la synthèse d'une proléine ou une fraction de proléine porlanl des épilopes reconnus par les anlicorps specifiques an~i-Sm26.
Qua~re clones phagiques capable d'exprimer une proléine réagissanl avec l~antisérum anli-Sm26 sonl récolLés séparémenn Leur ADNs sont purifiés el digérés par EcoRI. Puis les fragments issus de la digeslion sonl séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Un des inserls d'ADNc, de taille suffisanle pour coder pour une Sm26 complèle, est électro ~lue par la méthode de Geneclean (Bio 101 Inc. La Jolla, CA) puis sous-cloné dans le sile EcoRI dc la région d'insenion mulliple du vecteur M13TG130 (Kieny et al, Gene (1983) 26: 91). 1~ séquence nucléolidique de ccl ADNc est établie par la mélhode de Sanger el al, PNAS (1977) 74: 5463. L'éludc de la séquence permel d'établir que cel ADNc paniculier code bien pour une protéine de 26 Kd. Cet ADNc n'ayant pas la base A du codon d'ini~iation ATG, celle-ci doi~ donc elre rajou~ée. De plus, on désire remplacer le sile EcoRI par un site Bglll. Ces deux opérations sont réalisées conjointement par 2~ .J
mutagénèse dirigée en utilisanl I'oligonucléolide OTG2467 de séquence:
S '-GCTCrCCCGGAGATCrATGGCACCrAAGTr-3 ' .
On obtient ainsi le veCleur M13TG4116. La séquence du cADN est présemée dans l'identificateur de sequence.
EXEMPLE ~ Produc~ion et purification de Sm~6 Le vecleur M13TG4116 es~ digéré par EcoR1 et BglII, et les ~agmen~s d'AD~' som séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Le fragment de 0,75 Kb componant le cADN
de la Sm26 est élué par la méthode de Geneciean. En parallèle, le vecteùr pTG959 decri~
dans EPA ~9'~ 404 et représemé schématiquement à la Figure 1 es~ diyéré par EcoR1 e~
BgllI. Ces coupures entrainenl la pene d'un fragment contenant la partie 5' du gène lacZ.
Le ~agment de 0,75 Kb est ligué dans le vecteur pTG959 tel que précédemmem préparé pour donner le vecleur pTG4170. Dans cet~e dernière construction. Ie fragmem d'ADN codant pour la Sm26 esl donc placé en aval et sous le contrôle du promoteur pL
~0 du phage lambda qui est induc~ible à 4~C.
E.coli TGE901 (F-sup-his ilv bio (lambda-cl 857 del~a-Bam delta-H1)) ~ransl`ormée par le plasmide pTG4170 est cultivée dans 11 de milieu LB - ampicilline. La cultur~ és~
poursuivie, dans un premier temps à 30C jusqu'a une DO600 de 0,2 et dans un deuxième lemps à 42C pendant 5 heures.
En fin de cullure~ les cellules sonl récollées par centrifugation puis Iysées à la fois par sonicalion el par trailemenl enzymatique dans un tampon d'équilibration de formule:
10mM phosphate de polassium, pH7; 1,15 % ph KCI; 0,5 mM Phenyl Methyl Sulphonyi Fluoride; 1 mM EDTA, conlenanl en oulre 100 ~gJml de Iysosyme et 0,1 % de tritonX100 (Sigma).
Le Iysat esl ensuite centrifugé a 10 000 tr/min à 4C pendant '0 min. Le surnageanl est récupéré puis déposé en flux conlinu (30 mllh) sur une colonne de glutathion-agarose (Sigma Chemicals Co., Sl Louis, Mo) préalablemenl équilibrée avec le lampon d'équilibration décril ci-dessus. Aprcs lavagc inlensif avec ce même tampon, la ~raction fixec esl éluce avec 10 ml de lampon d'élulion de formule: 50 mM Tris-HCI, pH9,1;
7 mM glulalhion sous forme réduite; 0,1 mM di~hiolhreilol. La lolalité de l'éluat est récupérée, neutralisée ~ I'aide de phospha~e de potassium 0,5 M pH 7, puis dialysée lou~e la nui~ à 4C con~re un tampon de dialyse de formule: 10 mM phosphale de polassium WO 91/12327 .~5~6~35 PCI/FR91/00091 . g pH 7; 1 mM EDTA. Le dialysal esl finalement concentré sous un volume d'environ 2 ml avec de l'aquacide n (Calbiochem - Behring Corp. CA).
La pureté de la préparation ainsi obtenue est vérifiée après électrophorèse d'un5 échantillon en gel de polyacrylamide. Tel que montré à la Figure 2, I'apparilion d'une seule bande d'environ 26 Kd indique que la Sm~6 est obtenue sous forme substantiellement pure.
D'autre parl, l'activité glutathion-S-transférase de la préparation ainsi purifiée es~
contrôlée comme suil: 10 Ill de la préparation sonl ajoutés à 820 ~l d'une solmion tampon de phosphate de potassium 50 mM; pH 6,S; qui contient en outre 4,7 mM de glutathion reduit et 360 IlM de l-chloro-2.4-dinitroben~ène. En parallèle, on e~ectue un contrôle négatif. L'appari~ion du produil de la réaction (coloration jaune) esl suivie à 340 nm jusqu'à transformation comple~e du substrat. L-activhé mesurée est de l'ordre de ~0 1 j à 50 ~M/min/mg.
Le mode de préparation de la Sm26 précédemment décrit perrnet d'ob~enir environ 1 à 2 mg de protéine purifiée à partir d'un litre de culture.
~O
EXEMPLE 3: Mise en évidence de l'effet immuno-protecleur de Sm 6 3A. Expérience n 1 ~5 Des rals Fisher mâles de 8 semaines (Iffa-Credo) sont répartis en 5 groupes de 4 à
7 rats chacun. Les rals recoivent par voie sous-cuLanée 25 ,ug de Sm26 ~el que oblenue à l'exemple 2 (groupe 1), 25 ~g de Sm28 purifiée à partir de vers adulles (groupe 2) ou 25 llg de serumalbumine bovine (groupe 3). Chaque antigene est injecté sous un volume de 1 ml en présence de 1,25 mg d'adjuvant hydroxyde d'aluminium (alun gel Serva). En parallèle, les rats du groupe 4 recoivent seulemenl 1,25 mg d'adjuvant hydroxyded'aluminium sous le même volume. Enfin, les rats du groupe 5 ne recoivenl rien. Pour chacun des groupes 1 à 4, le ~raitemen~ correspondant est renouvelé 15 jours après la premiere injection.
30 jours après la deuxieme injeclion, les rats de chacun des groupes sonl aneslhésiés, puis infestés par passage Iranscu~ané de 1 000 cercaires. 21 jours apres l'infeslalion, les foies sonl ligaturés el perfusés avec du liquide physiologique conlenanl 1 % d'héparine el 0,1 % dc Tween. Ceci permel de récupérer les vers qui sonl ensuile complés sous la loupe binoculaire. Les résullats sonl présenlés dans le tableau ci-dessous.
PCI /FR9l/ooog S.. :-n~ 3rrupe _ ~ 3 4 _ 2 20' 138 lg9 284 18'
(Phenyl Methyl Sulphonyl Fluoride) et 1 mM d'EDTA (Ethylene Diamine TetraAce(ic acid disodium sall). Celle préparation soumise aux ultrasons est homogénéisee puis centrifugée pendant 20 min à 10000 tours par minute à 4C en utilisant un rotor Sorval!
HB-4. Le surnageant esl récupéré puis appliqué sur une colonne de g~utha~ion-a~arose (Sigma Chemical Co Sl. Louis. Mo) équilibrée avec le ~ampon décrit ci~essus. Aprè~
lavage intensif avec ce meme ~ampon la fraction f~xée esl éluée avec un ~ampon d-elu~ion (aO mM de Tris-HCl pH 91 7 mM de glu~hation réduit et 01 mM de di~hio~réi~ol). La frac~ion éluée est ensui~e neutralisée à l aide du tampon phospha~e de po~assium 0.5 M
pH 7 puis dialysée contre du phosphate de potassium 10mM pH 7 et enfin concemreeavec de l'aquacide II (Calbiochem-Behring Corp CA).
Les glulhation S-transférases totales de S. mansoni ainsi purifiées sont fractionnées sur gel préparatif de polyacrylamide (13%) suivant la technique décrite par Laemmli el al Nature (1970) 227: 680. Apres coloration au bleu de Coomassie la bande migrant à
26 kDa est récupérée. La Sm26 est elecLro-éluée suivan~ le protocole décrit par Balloul e~ al. Mol. Biochem. Parasi~ol. (1985) 17: 105. Elle esl dialysée conlre de l eau puis concentrée à l'aide d'aqùacide II.
Des lapins recoivent par injeclion intradermale multi-sile (40 points) 100 ~g de Sm26 sous un volume lotal de 1 ml purifiée en présence d'adjuvanl complet de Freund. Deux scmaines plus tard 20 ~g de Sm26 sonl injectés en présence d'adjuvam incomplet de Frcund cn administration sous-claviculaire.
IB. Préparation de la banque d'ADN comPlémenlaire L'ARN to~al dcs schistosomes adultes esl extrait par la méthode décrite par Chirgwin el al. Biochemistry (1979) 18: 5294 et modifiee par Gausz el al. Mol. Biochem.
Parasilol. (1983) 7: 293. L'ARN poly A~ est oblenu par chromalographie d'affinilé sur colonne dc ccllulose oligo (dT)12-18 (Collaborative F~esearch Lcxington MA). Unebanque d'ADN complémenlaire exprimée dans le vccleur lambda gt 11 est conslruile e~
utilisanl la trousse Amersham de la fa~on suivante. A parlir des ARN poly A- purifiés , ' . :
,... . . , ,. ~
.
~' , Wo 91/l2327 2~6,~ pcr/FR9l/ooo9l .
on synlhétise des ADN complémen~aires (cADN) suivanl la méthode de Gubler et Hoffman, Gene (1983) '5: 263. Après proleclion des sites EcoRl inlernes des cADN, des adaptaleurs EcoR1 sont accroches aux fragmen~s de cADI\I. Ceux-ci sonl alors digérés par EcoR1 et les adaplateurs en excès sonl éliminés par chromalographie sur colonne. Ces S fragmenls de cADN sont insérés dans le site EcoRI du phage lambda gl 11 (Young el Davis, 19~3). Les inserts EcoRI sonl ainsi fusionnes avec la séquence codant pour la ~-galactosidase et sont donc placés sous le contrôle du promoteur lactose. Les phages recombinants sont empaquetés in vi~ro.
10 lC Sélection d'un ADNc codant pour Sm26 1,5 . 106 phages indépendants de la banque d'ADN complémenlaire sonl leslés p~r -la mélhode décrile par Huynh et al.. DNA cloning, a Prac~ical Approach, (19~5) Glov~r D.M., ed., 1: 49. modifiée de la fac,on suivante: un échanlillon de cene banque en lambda gl11 esl inoculé sur la souche E. coli Y1090 à une dilulion représenlanl 5000 phages par boile de 85 mm de diamètre e~ incubée à ~'C. Les plages sont lransférées pendanl S h à 37C sur des fillres de nilrocellulose (Schleicher el Schuell) préalablement imprégnés d'isopropyl-~-D-thiogalactopyranoside (IPTG) à 10 mM; l'IPTG permet d'induire l'expression de la proléine de fusion qui esl sous conlrôle du promoleur lac. L~s ~illres 20 sonl incubés en présence de l'an~isérum de lapin anti-p26 (préalablemenl adsorbé sur un exlrai~ d'an~igènes de E.coli). Les anlicorps fixés sonl reconnus par un second anlicorps anti IgG de lapin marqué a la bioline; une streplavidine-peroxidase se fixe alors à la bio~ine, et ce complexe es~ révélé par une réaclion de la peroxydase sur un réaclif coloré
nommé "HRP color developmenl reagenl", commercialisé par Bio Rad.
~5 Cetle dé~eclion par anlicorps perme~ d'idenlifier les phages recombinanls donl l'insert de cADN dirige la synthèse d'une proléine ou une fraction de proléine porlanl des épilopes reconnus par les anlicorps specifiques an~i-Sm26.
Qua~re clones phagiques capable d'exprimer une proléine réagissanl avec l~antisérum anli-Sm26 sonl récolLés séparémenn Leur ADNs sont purifiés el digérés par EcoRI. Puis les fragments issus de la digeslion sonl séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Un des inserls d'ADNc, de taille suffisanle pour coder pour une Sm26 complèle, est électro ~lue par la méthode de Geneclean (Bio 101 Inc. La Jolla, CA) puis sous-cloné dans le sile EcoRI dc la région d'insenion mulliple du vecteur M13TG130 (Kieny et al, Gene (1983) 26: 91). 1~ séquence nucléolidique de ccl ADNc est établie par la mélhode de Sanger el al, PNAS (1977) 74: 5463. L'éludc de la séquence permel d'établir que cel ADNc paniculier code bien pour une protéine de 26 Kd. Cet ADNc n'ayant pas la base A du codon d'ini~iation ATG, celle-ci doi~ donc elre rajou~ée. De plus, on désire remplacer le sile EcoRI par un site Bglll. Ces deux opérations sont réalisées conjointement par 2~ .J
mutagénèse dirigée en utilisanl I'oligonucléolide OTG2467 de séquence:
S '-GCTCrCCCGGAGATCrATGGCACCrAAGTr-3 ' .
On obtient ainsi le veCleur M13TG4116. La séquence du cADN est présemée dans l'identificateur de sequence.
EXEMPLE ~ Produc~ion et purification de Sm~6 Le vecleur M13TG4116 es~ digéré par EcoR1 et BglII, et les ~agmen~s d'AD~' som séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Le fragment de 0,75 Kb componant le cADN
de la Sm26 est élué par la méthode de Geneciean. En parallèle, le vecteùr pTG959 decri~
dans EPA ~9'~ 404 et représemé schématiquement à la Figure 1 es~ diyéré par EcoR1 e~
BgllI. Ces coupures entrainenl la pene d'un fragment contenant la partie 5' du gène lacZ.
Le ~agment de 0,75 Kb est ligué dans le vecteur pTG959 tel que précédemmem préparé pour donner le vecleur pTG4170. Dans cet~e dernière construction. Ie fragmem d'ADN codant pour la Sm26 esl donc placé en aval et sous le contrôle du promoteur pL
~0 du phage lambda qui est induc~ible à 4~C.
E.coli TGE901 (F-sup-his ilv bio (lambda-cl 857 del~a-Bam delta-H1)) ~ransl`ormée par le plasmide pTG4170 est cultivée dans 11 de milieu LB - ampicilline. La cultur~ és~
poursuivie, dans un premier temps à 30C jusqu'a une DO600 de 0,2 et dans un deuxième lemps à 42C pendant 5 heures.
En fin de cullure~ les cellules sonl récollées par centrifugation puis Iysées à la fois par sonicalion el par trailemenl enzymatique dans un tampon d'équilibration de formule:
10mM phosphate de polassium, pH7; 1,15 % ph KCI; 0,5 mM Phenyl Methyl Sulphonyi Fluoride; 1 mM EDTA, conlenanl en oulre 100 ~gJml de Iysosyme et 0,1 % de tritonX100 (Sigma).
Le Iysat esl ensuite centrifugé a 10 000 tr/min à 4C pendant '0 min. Le surnageanl est récupéré puis déposé en flux conlinu (30 mllh) sur une colonne de glutathion-agarose (Sigma Chemicals Co., Sl Louis, Mo) préalablemenl équilibrée avec le lampon d'équilibration décril ci-dessus. Aprcs lavagc inlensif avec ce même tampon, la ~raction fixec esl éluce avec 10 ml de lampon d'élulion de formule: 50 mM Tris-HCI, pH9,1;
7 mM glulalhion sous forme réduite; 0,1 mM di~hiolhreilol. La lolalité de l'éluat est récupérée, neutralisée ~ I'aide de phospha~e de potassium 0,5 M pH 7, puis dialysée lou~e la nui~ à 4C con~re un tampon de dialyse de formule: 10 mM phosphale de polassium WO 91/12327 .~5~6~35 PCI/FR91/00091 . g pH 7; 1 mM EDTA. Le dialysal esl finalement concentré sous un volume d'environ 2 ml avec de l'aquacide n (Calbiochem - Behring Corp. CA).
La pureté de la préparation ainsi obtenue est vérifiée après électrophorèse d'un5 échantillon en gel de polyacrylamide. Tel que montré à la Figure 2, I'apparilion d'une seule bande d'environ 26 Kd indique que la Sm~6 est obtenue sous forme substantiellement pure.
D'autre parl, l'activité glutathion-S-transférase de la préparation ainsi purifiée es~
contrôlée comme suil: 10 Ill de la préparation sonl ajoutés à 820 ~l d'une solmion tampon de phosphate de potassium 50 mM; pH 6,S; qui contient en outre 4,7 mM de glutathion reduit et 360 IlM de l-chloro-2.4-dinitroben~ène. En parallèle, on e~ectue un contrôle négatif. L'appari~ion du produil de la réaction (coloration jaune) esl suivie à 340 nm jusqu'à transformation comple~e du substrat. L-activhé mesurée est de l'ordre de ~0 1 j à 50 ~M/min/mg.
Le mode de préparation de la Sm26 précédemment décrit perrnet d'ob~enir environ 1 à 2 mg de protéine purifiée à partir d'un litre de culture.
~O
EXEMPLE 3: Mise en évidence de l'effet immuno-protecleur de Sm 6 3A. Expérience n 1 ~5 Des rals Fisher mâles de 8 semaines (Iffa-Credo) sont répartis en 5 groupes de 4 à
7 rats chacun. Les rals recoivent par voie sous-cuLanée 25 ,ug de Sm26 ~el que oblenue à l'exemple 2 (groupe 1), 25 ~g de Sm28 purifiée à partir de vers adulles (groupe 2) ou 25 llg de serumalbumine bovine (groupe 3). Chaque antigene est injecté sous un volume de 1 ml en présence de 1,25 mg d'adjuvant hydroxyde d'aluminium (alun gel Serva). En parallèle, les rats du groupe 4 recoivent seulemenl 1,25 mg d'adjuvant hydroxyded'aluminium sous le même volume. Enfin, les rats du groupe 5 ne recoivenl rien. Pour chacun des groupes 1 à 4, le ~raitemen~ correspondant est renouvelé 15 jours après la premiere injection.
30 jours après la deuxieme injeclion, les rats de chacun des groupes sonl aneslhésiés, puis infestés par passage Iranscu~ané de 1 000 cercaires. 21 jours apres l'infeslalion, les foies sonl ligaturés el perfusés avec du liquide physiologique conlenanl 1 % d'héparine el 0,1 % dc Tween. Ceci permel de récupérer les vers qui sonl ensuile complés sous la loupe binoculaire. Les résullats sonl présenlés dans le tableau ci-dessous.
PCI /FR9l/ooog S.. :-n~ 3rrupe _ ~ 3 4 _ 2 20' 138 lg9 284 18'
3 197 86 ~5 254 218
4 190 155 288 ~13 247 lg7 59 ~'5 263 6 194 ~7~
7 218 71 _ __ ~r~ ~00.57 1~8 43 ~44 740 ~33 86 Le groupe n 2 (controle lémoin positif) et le groupe n 1 présentem respec~ivemen~
une réduction de charge parasitaire de 45 % et de 16 % par rapporl au groupe n 4 (contrôle témoin adjuvant). Le résultat du groupe n 1 bien que inférieur à celui du groupe n 2 est tout à fait significatif en raison de la faiblesse de l écart-~ype (p = 0 03).
3B. Exoérience n 2 Une nouvelle expérience dont les conditions d expérimentation sont en tous poinLs similaires à celles décrites sous 3A est conduite de manière indépendante. Le groupe des rats immunisés avec la Sm26 présentent une réduction de la charge parasilaire de '5 ~O.
WO 91/12327 ~:~5~ 5 PCI/FR91/00091 , . . .
rDENTlFICATEUR DE SEQUENCE
Objel: La séquence d'acides amines de la gluLalhion-S-transférase de 26 Kd de S.mansoni. appelée Sm26 ainsi que la séquence nucleolidique du ~agmenl d'ADN
complémentaire codanl pour la proléine citée ci~essus.
Ala Pro Lys Phe Gly Tyr Trp Ly~ Val Ly3 Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Hi~ Leu Glu Glu Thr Tyr Glu Glu Arg Ala Tyr Asp Arg Asn Glu Ile Asp Ala Trp Ser Asn Asp Lys Phe Lys Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly A~p Phe Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala A~p Lys ~iH Asn Met Leu Gly Ala Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Met Gly Val L-u Arg Ile Ala Tyr AJn Lys Glu Tyr Glu Thr Leu Lys Val Asp
7 218 71 _ __ ~r~ ~00.57 1~8 43 ~44 740 ~33 86 Le groupe n 2 (controle lémoin positif) et le groupe n 1 présentem respec~ivemen~
une réduction de charge parasitaire de 45 % et de 16 % par rapporl au groupe n 4 (contrôle témoin adjuvant). Le résultat du groupe n 1 bien que inférieur à celui du groupe n 2 est tout à fait significatif en raison de la faiblesse de l écart-~ype (p = 0 03).
3B. Exoérience n 2 Une nouvelle expérience dont les conditions d expérimentation sont en tous poinLs similaires à celles décrites sous 3A est conduite de manière indépendante. Le groupe des rats immunisés avec la Sm26 présentent une réduction de la charge parasilaire de '5 ~O.
WO 91/12327 ~:~5~ 5 PCI/FR91/00091 , . . .
rDENTlFICATEUR DE SEQUENCE
Objel: La séquence d'acides amines de la gluLalhion-S-transférase de 26 Kd de S.mansoni. appelée Sm26 ainsi que la séquence nucleolidique du ~agmenl d'ADN
complémentaire codanl pour la proléine citée ci~essus.
Ala Pro Lys Phe Gly Tyr Trp Ly~ Val Ly3 Gly Leu Val Gln Pro Thr Arg Leu Leu Leu Glu Hi~ Leu Glu Glu Thr Tyr Glu Glu Arg Ala Tyr Asp Arg Asn Glu Ile Asp Ala Trp Ser Asn Asp Lys Phe Lys Leu Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly A~p Phe Lys Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala A~p Lys ~iH Asn Met Leu Gly Ala Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Met Gly Val L-u Arg Ile Ala Tyr AJn Lys Glu Tyr Glu Thr Leu Lys Val Asp
5~ P5 r Phe Leu Asn Lys Leu Pro Gly Arg Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Ser Asn Lys Thr Tyr Leu Asn Gly Asn Cys Val Thr Hi3 Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp Val Val Leu Tyr Met Asp Ser Gln Cy8 Leu Asn Glu Phe Pro Ly~ Leu Val Ser Phe Lys Lys Cys Ile Glu Asp Leu Pro Gln Ile Lys Asn Tyr Leu Asn Ser Ser Arg Tyr Ile Lys Trp Pro Leu Gln Gly Trp Asp Ala Thr Phe Gly Gly Gly Asp Thr Pro Pro LyY
Claims (10)
1. Une protéine dom la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217;
la dite protéine étant sous forme substaniellement pure.
la dite protéine étant sous forme substaniellement pure.
2. Une protéine dont la séquence en acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217 ou un fragment de ladite protéine contenant au moins 22 acides aminés; la dite protéine étant sous forme substantiellement pure.
3. Un fragment d'ADN codant pour une protéine selon la revendication 1 ou pour un.
protéine ou un fragment de celle-ci selon la revendication 2.
protéine ou un fragment de celle-ci selon la revendication 2.
4. Une cassette d'expression qui comprend un fragment d'ADN selon la revendication 3 et les éléments nécessaires à l'expression dudit fragment d'ADN dans une cellule hôte.
5. Une cellule transformée par une cassette d'expression selon la revendication 4.
6. Une cellule selon la revendication 5 qui est de l'espèce E.coli.
7. Un procédé de préparation d'une protéine selon la revendication 1 ou 2 qui comprend l'acte de cultiver une cellule selon la revendication 5 ou 6 et de récolter ladite protéine à partir de la culture.
8. Application d'une protéine selon la revendication 1 ou 2 à titre d'agent présentant une activité glutathion-transférase.
9. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de la schistosomiase qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'homologie avec la séquence telle que montrée dans l'identificateur de séquence commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217.
10. Une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou au traitement de la schistosomiase qui comprend à titre d'agent thérapeutique au moins une protéine dont la séquence d'acides aminés est telle que montrée dans l'identificateur de séquence, commençant avec le résidu alanine en position 1 et finissant avec le résidu lysine en position 217 ou un fragment de ladite protéine contenant au moins 22 acides aminés.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR90/01403 | 1990-02-07 | ||
| FR9001403A FR2657883A1 (fr) | 1990-02-07 | 1990-02-07 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA2051695A1 true CA2051695A1 (fr) | 1991-08-08 |
Family
ID=9393459
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA002051695A Abandoned CA2051695A1 (fr) | 1990-02-07 | 1991-02-06 | Glutathion-s-transferase sm26 du s. mansoni |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0466912A1 (fr) |
| JP (1) | JPH04505402A (fr) |
| KR (1) | KR920701445A (fr) |
| AU (1) | AU645786B2 (fr) |
| CA (1) | CA2051695A1 (fr) |
| FR (1) | FR2657883A1 (fr) |
| WO (1) | WO1991012327A1 (fr) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0772679A1 (fr) * | 1994-06-22 | 1997-05-14 | IMPERIAL COLLEGE OF SCIENCE, TECHNOLOGY & MEDICINE | Proteine de schistosoma et ses utilisations |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU613583B2 (en) * | 1986-08-22 | 1991-08-08 | Transgene S.A. | Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity |
| NZ224663A (en) * | 1987-05-28 | 1990-11-27 | Amrad Corp Ltd | Fusion proteins containing glutathione-s-transferase and expression of foreign polypeptides using glutathione-s-transferase encoding vectors |
| WO1990008819A1 (fr) * | 1989-01-31 | 1990-08-09 | Daratech Pty. Ltd. | Vaccin servant au traitement preventif de l'infection par la douve du foie chez les ruminants |
-
1990
- 1990-02-07 FR FR9001403A patent/FR2657883A1/fr active Pending
-
1991
- 1991-02-06 JP JP3505493A patent/JPH04505402A/ja active Pending
- 1991-02-06 KR KR1019910701272A patent/KR920701445A/ko not_active Application Discontinuation
- 1991-02-06 EP EP91904781A patent/EP0466912A1/fr not_active Withdrawn
- 1991-02-06 CA CA002051695A patent/CA2051695A1/fr not_active Abandoned
- 1991-02-06 WO PCT/FR1991/000091 patent/WO1991012327A1/fr not_active Application Discontinuation
- 1991-02-06 AU AU73333/91A patent/AU645786B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR920701445A (ko) | 1992-08-11 |
| JPH04505402A (ja) | 1992-09-24 |
| EP0466912A1 (fr) | 1992-01-22 |
| FR2657883A1 (fr) | 1991-08-09 |
| AU645786B2 (en) | 1994-01-27 |
| WO1991012327A1 (fr) | 1991-08-22 |
| AU7333391A (en) | 1991-09-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4900673A (en) | Mutant human angiogenin (angiogenesis factor with superior angiogenin activity) genes therefor and methods of expression | |
| Jones et al. | Expression and structural analysis of 14-3-3 proteins | |
| DK172463B1 (da) | Anvendelse af oncostatin-A eller derivater deraf til in vitro diagnostisk detektion af tumorceller | |
| EP0293357B1 (fr) | Expression de la proapolipoprotéine A-I humaine | |
| KR100629185B1 (ko) | 인간 리조포스파티드산 수용체 물질 및 그 용도 | |
| JP2000509967A (ja) | カルシウムチャンネルモジュレーターとして活性のあるアセチルコリンエステラーゼの可溶形態からのペプチド | |
| JPH025869A (ja) | Ｄｎａ配列、組換えｄｎａ分子及びリポコルチン類３、４、５並びに６の製造方法 | |
| AU589598B2 (en) | Brain derivable polypeptide factors and antibodies | |
| JPH11500312A (ja) | ＮＦ−κＢの活性化制御蛋白、ＩκＢ−β | |
| CA2113202A1 (fr) | Inhibiteurs neuraux de la proteinase neutre activee par le calcium | |
| CA2051695A1 (fr) | Glutathion-s-transferase sm26 du s. mansoni | |
| US20050069557A1 (en) | Vertebrate globin | |
| WO1994029448A1 (fr) | Adn et proteine codee par celui-ci | |
| uan Fan et al. | Antibodies to cytoplasmic dynein heavy chain map the surface and inhibit motility | |
| US6794500B2 (en) | RNA-binding protein | |
| US4963485A (en) | Brain derivable polypeptide factors and antibodies thereto | |
| US5011777A (en) | Vectors encoding brain derivable polypeptide factors | |
| US20020173475A1 (en) | Methods to inhibit viral replication | |
| JP2001507226A (ja) | 有糸分裂を調節するためのタンパク質および組成物 | |
| JP4232423B2 (ja) | 新規ユビキチン特異プロテアーゼ | |
| US5661003A (en) | Water channel | |
| KR100233962B1 (ko) | 포스포리파제 c-베타4를 인지하는 단클론성 항체와 이를 분비하는 융합 세포주 | |
| JPH03173899A (ja) | 生体由来のタンパク質 | |
| FR2848566A1 (fr) | Peptides epitopiques de l'enzyme thyroperoxydase, les compositions les contenant et leurs applications | |
| CN1375007A (zh) | 编码一种新的苏氨酰转移核糖核酸合成酶的基因及其应用和制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FZDE | Dead |