CA1242698A - Intermediaires utiles pour la preparation de derives estradieniques et d'antigenes, et methode de preparation desdits antigenes - Google Patents
Intermediaires utiles pour la preparation de derives estradieniques et d'antigenes, et methode de preparation desdits antigenesInfo
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Abstract
L'invention concerne des produits de formules générales (III) et (IV), sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti: <IMG> <IMG> (III) (IV) dans lesquelles la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et R2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle. Ces produits sont utiles à titre d'intermédiaires pour soit la préparation d'antigènes lorsque conjugués avec l'albumine sérique humaine ou bovine, soit la préparation de dérivés estradiéniques radioactifs marqués à l'iode, qui eux sont utiles pour réaliser l'étude et le dosage radioimmunologique de stéroïdes dans des fluides biologiques.
Description
Ceci est une division de la demande de brevet canadien n 456.495 déposée le 13 juin 1984.
La présente invention a pour objet à titre de produits industriels nouveaux, les produits de formules générales (III) et (IV), sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'iso-mère anti:
33C-1 ~ R 33C-N ~ ~ 'C- C-CH
C~H2 (III) ~H2 _ (IV) HO- O O
dans lesquelles la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut etre en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et R2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle.
Parmi les valeurs de R, on peut citer:
: a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-pentyle, : 30 sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle, iso-hexyle, sec-hexyle, tert--hexyle;
b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle, butyryle, :~ isobutyryle, valéryle, hexanoyle, benzoyle, caprylyle, ~ méthoxy-carbonyle, éthoxy carbonyle.
.~
Parmi ces produits, on citera les produits suivants:
- le 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-dimé-thylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, - l'anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy~ -(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)estra-4,9-dièn-3-one avec le formiate d'isobutyle sous forme de 10 mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti:
H3C-N~ OH
15cl ~ ,c--c-cH3 CH( CH 3 ) 2 20ll H2 ~H2 O=C C=O
\o/
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des produits répondant à la formule générale (III) ou (IV) ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale (II):
::: H3C-N~, C ~ ~ C~CH (II) dans laquelle R a les significations précitées avec un halogénure de carboxyméthoxyl.amine en présence d'une base et ob-tient un produit de formule (III):
H~C-N
C~3 ~ R
~ C- C CH
O (III) ~H2 dans laquelle R a les significations précitées et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, puis isole le produit obtenu, ou bien l'on fixe sur la fonction acide de ce ; produit, un groupement activateur de la fonction carbonyle et obtient le produit de formule générale (IV):
25 : H C-N_~
3 , ~ R
: , ~ C _ C-CH3 N~ J (IV) :30~: 1 ~: O
~;:: O' R
.
~ - 3 -~: ', : ,, :
~ .
~ D~ ~
dans laquelle R a les significations précitées, R2 repré-sente un groupement activateur de la fonction carbonyle e-t la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, puis isole le produit obtenu, le sépare, si désire,en ses isomères, puis le cas échéant, éthérifie ou estérifie la fonction hydroxyle en 17.
Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé
de l'invention:
- l'halogénure de carboxyméthoxylamine est l'hémihydro-chlorure de carboxyméthoxylamine et on opère sous atmosphère inerte et en présence de soude;
- on fixe sur la fonction acide un groupement activa-teur de la fonction carbonyle en faisant agir un halogéno-formiate d'alcoyle en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte.
Dans une mise en oeuvre très préférentielle du procédé de l'invention, l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine.
Llactivation de la fonction carbonyle du produit de formule générale ~III) peut aussi etre réalisée en faisant agir sur celui-ci le N-hydroxy succinimide ou le dicyclohexylcarbodiimide, générateur de groupements activa-teurs de ladite fonction carbonyle.
L'éthérification ou l'estérification de la fonc-tion hydroxyle en 17 du produit de formule générale ~III) ou (IV), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peut être effectuée selon des méthodes habituelles.
L'éthérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle.
L'estérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé
fonctionnel d'acide, comme un chlorure d'acide ou un anhydride.
Pour obtenir les isomères syn et anti des produits de formule générale (III) séparés, objet de l'invention, on peut procéder par exemple de la manière décrite ci-après:
on soumet un produit de formule générale (III), sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, où R
a les significations précitées, à l'action d'un agent d'estérification pour estérifier la fonction carboxyle, sépare l'isomère syn de l'isomère anti de l'ester résultant puis saponifie séparément ladite fonction ester de chacun des isomères syn et anti., puis obtient l'isomère syn et l'isomère anti des produits de formule générale (III), dans laquelle R garde les significations précitées.
Les produits de formule générale (III) sont des produits de depart utiles pour la préparation d'antigènes, nécessaires également aux dosages radioimmunologiques de la 17~-hydroxy 11~ -(4-diméthylaminophényl) 17O~-(prop-l-ynyl) estra 4,9-diène 3-one et de ses métabolites dans les fluides biologiques, chez l'homme ou l'ami.nal.
Leur application en tant que telle fait également l'objet de la présente invention et es-t caractérisé en ce que l'on conjugue un de ces produits avec l'albumine sérique bovine (~SA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA) et obtient llantigène cherché.
` Dans des conditions préferentielles de mise en oeuvre, l'application des produits de formule générale (III), est caractérisée par les points suivants:
- on fait réagir un produit de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous Eorme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
:: .
CH3~)R
C_C - CH3 (III) O
H-O - CO
dans laquelle la ligne ondulée et R on-t les significations précitées, en vue de l'activation de la fonction carbonyle, avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, e~ milieu anhydre et sous atmosphère inerte, obtient l'anhydride mixte!!correspondant, de formule ~IV):
~: H3 C-N _~, CU~--C-CH3 (IV) O
CH
La présente invention a pour objet à titre de produits industriels nouveaux, les produits de formules générales (III) et (IV), sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'iso-mère anti:
33C-1 ~ R 33C-N ~ ~ 'C- C-CH
C~H2 (III) ~H2 _ (IV) HO- O O
dans lesquelles la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut etre en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et R2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle.
Parmi les valeurs de R, on peut citer:
: a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-pentyle, : 30 sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle, iso-hexyle, sec-hexyle, tert--hexyle;
b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle, butyryle, :~ isobutyryle, valéryle, hexanoyle, benzoyle, caprylyle, ~ méthoxy-carbonyle, éthoxy carbonyle.
.~
Parmi ces produits, on citera les produits suivants:
- le 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-dimé-thylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, - l'anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy~ -(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)estra-4,9-dièn-3-one avec le formiate d'isobutyle sous forme de 10 mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti:
H3C-N~ OH
15cl ~ ,c--c-cH3 CH( CH 3 ) 2 20ll H2 ~H2 O=C C=O
\o/
L'invention a également pour objet un procédé de préparation des produits répondant à la formule générale (III) ou (IV) ci-dessus.
Ce procédé est caractérisé en ce que l'on fait réagir un produit de formule générale (II):
::: H3C-N~, C ~ ~ C~CH (II) dans laquelle R a les significations précitées avec un halogénure de carboxyméthoxyl.amine en présence d'une base et ob-tient un produit de formule (III):
H~C-N
C~3 ~ R
~ C- C CH
O (III) ~H2 dans laquelle R a les significations précitées et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, puis isole le produit obtenu, ou bien l'on fixe sur la fonction acide de ce ; produit, un groupement activateur de la fonction carbonyle et obtient le produit de formule générale (IV):
25 : H C-N_~
3 , ~ R
: , ~ C _ C-CH3 N~ J (IV) :30~: 1 ~: O
~;:: O' R
.
~ - 3 -~: ', : ,, :
~ .
~ D~ ~
dans laquelle R a les significations précitées, R2 repré-sente un groupement activateur de la fonction carbonyle e-t la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, puis isole le produit obtenu, le sépare, si désire,en ses isomères, puis le cas échéant, éthérifie ou estérifie la fonction hydroxyle en 17.
Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé
de l'invention:
- l'halogénure de carboxyméthoxylamine est l'hémihydro-chlorure de carboxyméthoxylamine et on opère sous atmosphère inerte et en présence de soude;
- on fixe sur la fonction acide un groupement activa-teur de la fonction carbonyle en faisant agir un halogéno-formiate d'alcoyle en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte.
Dans une mise en oeuvre très préférentielle du procédé de l'invention, l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine.
Llactivation de la fonction carbonyle du produit de formule générale ~III) peut aussi etre réalisée en faisant agir sur celui-ci le N-hydroxy succinimide ou le dicyclohexylcarbodiimide, générateur de groupements activa-teurs de ladite fonction carbonyle.
L'éthérification ou l'estérification de la fonc-tion hydroxyle en 17 du produit de formule générale ~III) ou (IV), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peut être effectuée selon des méthodes habituelles.
L'éthérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle.
L'estérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé
fonctionnel d'acide, comme un chlorure d'acide ou un anhydride.
Pour obtenir les isomères syn et anti des produits de formule générale (III) séparés, objet de l'invention, on peut procéder par exemple de la manière décrite ci-après:
on soumet un produit de formule générale (III), sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, où R
a les significations précitées, à l'action d'un agent d'estérification pour estérifier la fonction carboxyle, sépare l'isomère syn de l'isomère anti de l'ester résultant puis saponifie séparément ladite fonction ester de chacun des isomères syn et anti., puis obtient l'isomère syn et l'isomère anti des produits de formule générale (III), dans laquelle R garde les significations précitées.
Les produits de formule générale (III) sont des produits de depart utiles pour la préparation d'antigènes, nécessaires également aux dosages radioimmunologiques de la 17~-hydroxy 11~ -(4-diméthylaminophényl) 17O~-(prop-l-ynyl) estra 4,9-diène 3-one et de ses métabolites dans les fluides biologiques, chez l'homme ou l'ami.nal.
Leur application en tant que telle fait également l'objet de la présente invention et es-t caractérisé en ce que l'on conjugue un de ces produits avec l'albumine sérique bovine (~SA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA) et obtient llantigène cherché.
` Dans des conditions préferentielles de mise en oeuvre, l'application des produits de formule générale (III), est caractérisée par les points suivants:
- on fait réagir un produit de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous Eorme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
:: .
CH3~)R
C_C - CH3 (III) O
H-O - CO
dans laquelle la ligne ondulée et R on-t les significations précitées, en vue de l'activation de la fonction carbonyle, avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, e~ milieu anhydre et sous atmosphère inerte, obtient l'anhydride mixte!!correspondant, de formule ~IV):
~: H3 C-N _~, CU~--C-CH3 (IV) O
CH
2 5 ` O
R
: 2 ::~ :
dans laquelle R garde la signification précitée et R2 ; 30 : représente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un : : radical alcoyle ayant au:plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugue avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSAj et obtient l'antigène cherché:.
~:~
~ ' ' ~:
Dans un mode d'exécution préférée, l'application des produits de formule générale (III) est encore caractérisée par les points suivants:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte, - on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
Tout particulièrement, la 3-carboxyméthyloxime de ~ OR 11 B- (4-diméthylaminophényl) 17d-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one, sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous Eorme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, permet la préparation d'antigènes de formule générale (V) et (VI):
. . .
CH3~)R
fy~ C_ C-CH3 (v) o ICcH2 n BSA
dans laquelle R a les significations précitées, n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, et H 3 C - N ~ I
CH3 ~)R
~ C----C-CH~
CH (VI) YO
n HSA
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroide est sous forme de mélange d'isomère syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti.
Pour étudier et doser par des méthodes radioimmu-nologiques conventionnelles la 17~-hydroxy-llB-(4-diméthyl-aminophenyl-17~ -(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one non radioactive, on prépare comme déjà dit à partir de ce dernier, des antigènes avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA).
Les antigènes~résultant de formules (V) et (VI) peuvent servir au développement d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant. Ils perme~;ttent alnsi d'obtenir des sérums contenant des anticorps.
; Ces produits de formules (III) ou (IV) permettent en outre la préparation de dérivés estradiéniques marqués à
iode, faisant l'objet de la demande principale, sous forme de ~mélange d'isomères syn et anti ou sous forme d'isomères syn ou sous forme d'isomères anti, de formule générale (I):
:: :
. ~ . -.
;~ ~ ', .
~ ~ .
~ ~?d~8 H3C-N_~
CH3 ~ R
~ C - C-CH~ (I) cH2 l =O
NH-R
dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou : 15anti, formule dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et Rl représente le reste d'un :~ ~acide aminé RlNH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce 20reste étant accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 1.25 ou ; i31. Cette préparation s'effectue notamment par réaction du produit de formule (IV) avec un acide aminé de formule RlNH2 :possédant un groupe accepteur marqué à lliode 12S ou 131 ou avec un dérivé d'un tel acide.
: 25: Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXE~PLE 1:: 3-carboxyméthylo~ime de 1 ~-hydroxy-1 ~-(4-dimé-thy:laminophényl)17~ -(prop-1-ynyl)-estr_-4,9-dièn-3-one ~
A une solution de lg de 17Jg-hydroxy-1 ~-(4-dimé-thylaminophenyl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one dans :35 ml d'éthanol, on ajoute 665 mg d'hemihydrochlorure de g :~`:: .
~ : .
.:~ .
' '- ' `: .' .
: ` ~ ''', , ' carboxyméthoxylamine, soumet le mélange reactionnel à
l'agitation pendant une heure environ à température ambiante, additionne de 1,6 ml de soude N, puis concentre sous vide, reprend le résidu par le chloroforme, essore, évapore le filtrat à sec, le chromatographie sur silice (éluants chloroforme/méthanol 7:3), isole le produit cherché
que l'on empâte par l'éther isopropylique, essore et sèche sous vide pour obtenir 1,13 g du dit produit cherché sous forme de mélange d'isomères syn et anti. La chromatographie sur couche mince de silice, en éluant au mélange chloroforme/méthanol (8:2) donne Rf=0,45.
Préparation dianhydride mixte de 3-carboxyméthyl-oxime de 17~-hydroxy 11~ (4-diméthylaminophényl) 170~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dien-3-one sous forme de mélange d'isomè-res syn et anti, avec le formiate dlisobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 3,5 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy 11~-(4-diméthylaminophényl) 17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one préparé au stade précédent dans 50 ~ul de dioxane, ajoute 10 ~1 de mélange tri-n-butylamine/tétrahydrofuranne (1-5) puis 10 ul de mélange chloroformiate d'isobutyle/tétrahydrofuranne (1:10), maintient ce mélange réactionnel sous agitation pen-dant une demi-heure à 4C environ, puis additionne de 3,4 ml de tétrahydrofuranne et obtient une solution du produit cherché.
EXEMPLE 2: antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de __ _ _ 17~-hydroxy~ (4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine séri~ue bovine (BSA).
-STADE A: Anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti avec le formiate d'isobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 63 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one, préparé à de l'exemple 1 dans 1,2 ml de dioxane, ajoute 57,5 ~l de tri-n-butylamine, puis abaisse la température vers 13C, ajoute 16 ~l de chloroformiate d'isobutyle, maintient ce mélange réactionnel SOU9 agi-tation à la température de 13C environ pendant une demi~heure. On obtient une solu-tion du produit cherché, que l'on utilise telle quelle pour le stade suivant de la synthèse.
STAD~ B: Dissolution de l'albumine sérique bovine.
On introduit à 4C sous agitation et sous atmosphère inerte 175 mg d'albumine sérigue bovine dans 0,5 ml d'eau, maintient sous agitation pendant 20 mn environ, ra~oute successivement après la dissolution 3 ml de dioxane et 170 ~l de NaOH N.
STADE C: Conjugaison.
On verse lentement dans la solution d'albumine sérique bovine obtenue au stade B, la solution d'anhydride mixte obtenue au stade A, amène le pH à 8,9 à l'aide d'acide chlorhydrique N et agite le mélange réactionnel pendant 5 heures à 10C environ. On sépare ensuite la phase organique du précipité formé, la dilue par 30 ml d'eau distillée, amène le pH à 4,1 par l'addition d'acide chlorhydrique N, sépare le précipité formé, le reprend par 25 ml d'une ~ solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1%. La solution résultante est laissée au repos, puis soumise à l'ultrafil-tration. On épuise ensuite la solution des molécules de poids moleculaire 10-15000 par 510 ml d'eau distillée puis ~;~ ajuste le volume final à 17 ml. On lyophilise cette solu-~ ~ .
.
~: .
~2~ 3 tion pendant 30 heures environ et obtient 169 mg d'antigène cherché.
Analyse Spectre_UV
- dans eau : max 265 nm E'1=53 max 290 nm E'l=62 - dans HCl N/10 : max 290 nm E'1=61 Dichrofsme circulaire - dans eau : max 222 nm ~ E'1=-0,305 max 260 nm ~ E'1=-,070 max 289 nm aE ' l=- ~ 050 - dans HC1 N/10 : max 222 nm a E'1=-0,250 max 290 nm ~ E'1:-tO,027 Ce produit contient 20 à 22 groupes de stéroïde liés par mole de protéine.
EXEMPLE 3: _ntigene à partir de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl~-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine sérique humai_e (HSA).
:
En procédant comme décrit dans le stade C de : l'exemple 2, mais en partant de la solution d'anhydride mixte du stade A et d'une solution d'albumine sérique humaine préparée selon la méthode décrite au stade B, on ~ obtient 180 mg d'antigène cherché.
: 30 Ce produit con-tient 34 à 36 groupes de stéroïde liés par mole de protbine.
~ 12 -:
.
Analyse Spectre UV
_ - dans eau : max 265 nm E'1=79 5max 291 nm E'l=g4 - dans HCl N~10 : max 290 nm E'1=93 Dichroîsme circulaire - dans eau : infl. 218 nm ~ E'1=-0,308 max 259 nm ~ E'1=-0,115 max 288 nm ~ E'1=+0,085 - dans HCl N/10 : max 223 nm ~ E'1=-0,300 max 283 nm ~ E'1=+0,037.
R
: 2 ::~ :
dans laquelle R garde la signification précitée et R2 ; 30 : représente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un : : radical alcoyle ayant au:plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugue avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSAj et obtient l'antigène cherché:.
~:~
~ ' ' ~:
Dans un mode d'exécution préférée, l'application des produits de formule générale (III) est encore caractérisée par les points suivants:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte, - on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
Tout particulièrement, la 3-carboxyméthyloxime de ~ OR 11 B- (4-diméthylaminophényl) 17d-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one, sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous Eorme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, permet la préparation d'antigènes de formule générale (V) et (VI):
. . .
CH3~)R
fy~ C_ C-CH3 (v) o ICcH2 n BSA
dans laquelle R a les significations précitées, n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, et H 3 C - N ~ I
CH3 ~)R
~ C----C-CH~
CH (VI) YO
n HSA
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroide est sous forme de mélange d'isomère syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti.
Pour étudier et doser par des méthodes radioimmu-nologiques conventionnelles la 17~-hydroxy-llB-(4-diméthyl-aminophenyl-17~ -(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one non radioactive, on prépare comme déjà dit à partir de ce dernier, des antigènes avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA).
Les antigènes~résultant de formules (V) et (VI) peuvent servir au développement d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant. Ils perme~;ttent alnsi d'obtenir des sérums contenant des anticorps.
; Ces produits de formules (III) ou (IV) permettent en outre la préparation de dérivés estradiéniques marqués à
iode, faisant l'objet de la demande principale, sous forme de ~mélange d'isomères syn et anti ou sous forme d'isomères syn ou sous forme d'isomères anti, de formule générale (I):
:: :
. ~ . -.
;~ ~ ', .
~ ~ .
~ ~?d~8 H3C-N_~
CH3 ~ R
~ C - C-CH~ (I) cH2 l =O
NH-R
dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou : 15anti, formule dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et Rl représente le reste d'un :~ ~acide aminé RlNH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce 20reste étant accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 1.25 ou ; i31. Cette préparation s'effectue notamment par réaction du produit de formule (IV) avec un acide aminé de formule RlNH2 :possédant un groupe accepteur marqué à lliode 12S ou 131 ou avec un dérivé d'un tel acide.
: 25: Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXE~PLE 1:: 3-carboxyméthylo~ime de 1 ~-hydroxy-1 ~-(4-dimé-thy:laminophényl)17~ -(prop-1-ynyl)-estr_-4,9-dièn-3-one ~
A une solution de lg de 17Jg-hydroxy-1 ~-(4-dimé-thylaminophenyl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one dans :35 ml d'éthanol, on ajoute 665 mg d'hemihydrochlorure de g :~`:: .
~ : .
.:~ .
' '- ' `: .' .
: ` ~ ''', , ' carboxyméthoxylamine, soumet le mélange reactionnel à
l'agitation pendant une heure environ à température ambiante, additionne de 1,6 ml de soude N, puis concentre sous vide, reprend le résidu par le chloroforme, essore, évapore le filtrat à sec, le chromatographie sur silice (éluants chloroforme/méthanol 7:3), isole le produit cherché
que l'on empâte par l'éther isopropylique, essore et sèche sous vide pour obtenir 1,13 g du dit produit cherché sous forme de mélange d'isomères syn et anti. La chromatographie sur couche mince de silice, en éluant au mélange chloroforme/méthanol (8:2) donne Rf=0,45.
Préparation dianhydride mixte de 3-carboxyméthyl-oxime de 17~-hydroxy 11~ (4-diméthylaminophényl) 170~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dien-3-one sous forme de mélange d'isomè-res syn et anti, avec le formiate dlisobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 3,5 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy 11~-(4-diméthylaminophényl) 17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one préparé au stade précédent dans 50 ~ul de dioxane, ajoute 10 ~1 de mélange tri-n-butylamine/tétrahydrofuranne (1-5) puis 10 ul de mélange chloroformiate d'isobutyle/tétrahydrofuranne (1:10), maintient ce mélange réactionnel sous agitation pen-dant une demi-heure à 4C environ, puis additionne de 3,4 ml de tétrahydrofuranne et obtient une solution du produit cherché.
EXEMPLE 2: antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de __ _ _ 17~-hydroxy~ (4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine séri~ue bovine (BSA).
-STADE A: Anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti avec le formiate d'isobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 63 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one, préparé à de l'exemple 1 dans 1,2 ml de dioxane, ajoute 57,5 ~l de tri-n-butylamine, puis abaisse la température vers 13C, ajoute 16 ~l de chloroformiate d'isobutyle, maintient ce mélange réactionnel SOU9 agi-tation à la température de 13C environ pendant une demi~heure. On obtient une solu-tion du produit cherché, que l'on utilise telle quelle pour le stade suivant de la synthèse.
STAD~ B: Dissolution de l'albumine sérique bovine.
On introduit à 4C sous agitation et sous atmosphère inerte 175 mg d'albumine sérigue bovine dans 0,5 ml d'eau, maintient sous agitation pendant 20 mn environ, ra~oute successivement après la dissolution 3 ml de dioxane et 170 ~l de NaOH N.
STADE C: Conjugaison.
On verse lentement dans la solution d'albumine sérique bovine obtenue au stade B, la solution d'anhydride mixte obtenue au stade A, amène le pH à 8,9 à l'aide d'acide chlorhydrique N et agite le mélange réactionnel pendant 5 heures à 10C environ. On sépare ensuite la phase organique du précipité formé, la dilue par 30 ml d'eau distillée, amène le pH à 4,1 par l'addition d'acide chlorhydrique N, sépare le précipité formé, le reprend par 25 ml d'une ~ solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1%. La solution résultante est laissée au repos, puis soumise à l'ultrafil-tration. On épuise ensuite la solution des molécules de poids moleculaire 10-15000 par 510 ml d'eau distillée puis ~;~ ajuste le volume final à 17 ml. On lyophilise cette solu-~ ~ .
.
~: .
~2~ 3 tion pendant 30 heures environ et obtient 169 mg d'antigène cherché.
Analyse Spectre_UV
- dans eau : max 265 nm E'1=53 max 290 nm E'l=62 - dans HCl N/10 : max 290 nm E'1=61 Dichrofsme circulaire - dans eau : max 222 nm ~ E'1=-0,305 max 260 nm ~ E'1=-,070 max 289 nm aE ' l=- ~ 050 - dans HC1 N/10 : max 222 nm a E'1=-0,250 max 290 nm ~ E'1:-tO,027 Ce produit contient 20 à 22 groupes de stéroïde liés par mole de protéine.
EXEMPLE 3: _ntigene à partir de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl~-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine sérique humai_e (HSA).
:
En procédant comme décrit dans le stade C de : l'exemple 2, mais en partant de la solution d'anhydride mixte du stade A et d'une solution d'albumine sérique humaine préparée selon la méthode décrite au stade B, on ~ obtient 180 mg d'antigène cherché.
: 30 Ce produit con-tient 34 à 36 groupes de stéroïde liés par mole de protbine.
~ 12 -:
.
Analyse Spectre UV
_ - dans eau : max 265 nm E'1=79 5max 291 nm E'l=g4 - dans HCl N~10 : max 290 nm E'1=93 Dichroîsme circulaire - dans eau : infl. 218 nm ~ E'1=-0,308 max 259 nm ~ E'1=-0,115 max 288 nm ~ E'1=+0,085 - dans HCl N/10 : max 223 nm ~ E'1=-0,300 max 283 nm ~ E'1=+0,037.
Claims (5)
1. Produits de formules générales (III) et (IV), sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
(III) (IV) dans lesquelles la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et R2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle.
(III) (IV) dans lesquelles la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et R2 représente un groupement activateur de la fonction carbonyle.
2. Produits selon la revendication 1, caractéri-sés en ce qu'ils sont choisis dans le groupe constitué par:
- le 3-carboxyméthyloxime de 17.beta.-hydroxy-11.beta.-(4-diméthylaminophényl)-17?- (prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; et - l'anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17.beta.-hydroxy-11.beta.-(4-diméthylaminophényl)-17?-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one avec le formiate d'isobutyle, sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'iso-mère syn et sous forme d'isomère anti:
- le 3-carboxyméthyloxime de 17.beta.-hydroxy-11.beta.-(4-diméthylaminophényl)-17?- (prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti; et - l'anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17.beta.-hydroxy-11.beta.-(4-diméthylaminophényl)-17?-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one avec le formiate d'isobutyle, sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'iso-mère syn et sous forme d'isomère anti:
3. Méthode pour la préparation d'antigènes, caractérisée en ce que l'on conjugue au moins un des produits de formule générale (III) définis dans la revendi-cation 1, avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché.
4. Méthode selon la revendication 3, caracté-risée en ce que l'on fait réagir un produit de formule géné-rale (III), sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
(III) dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, en vue de l'activation de la fonction carbonyle, avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base ter-tiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte, obtient l'anhydride mixte correspondant, de formule (IV):
(IV) dans laquelle R garde la signification précitée et R2 repré-sente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugue avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) et ob-tient l'antigène cherché.
(III) dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, en vue de l'activation de la fonction carbonyle, avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base ter-tiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère inerte, obtient l'anhydride mixte correspondant, de formule (IV):
(IV) dans laquelle R garde la signification précitée et R2 repré-sente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugue avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) et ob-tient l'antigène cherché.
5. Méthode selon la revendication 4, caractérisée en ce que:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloro-formiate d'isobutyle et l'on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte;
- on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloro-formiate d'isobutyle et l'on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte;
- on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
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