CA1235064A - Antigenes a base de composes estradienique et d'albumine humaine ou bovine, et methode d'obtention d'anticorps - Google Patents
Antigenes a base de composes estradienique et d'albumine humaine ou bovine, et methode d'obtention d'anticorpsInfo
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- CA1235064A CA1235064A CA000534309A CA534309A CA1235064A CA 1235064 A CA1235064 A CA 1235064A CA 000534309 A CA000534309 A CA 000534309A CA 534309 A CA534309 A CA 534309A CA 1235064 A CA1235064 A CA 1235064A
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Abstract
L'invention concerne des antigènes constitués par la conjugaison d'un produit de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti: <IMG> (III) dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA), et répondant aux formules (V) et (VI): (V) <IMG> dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroîde est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti, et: <IMG> (VI) dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroîde est sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti. L'invention concerne également une méthode pour la préparation d'anticorps, caractérisée en ce que l'on administre à un animal au moins un des antigènes ci-dessus définis.
Description
Ceci est une division de la demande de brevet canadien no. 456.495 déposée le 13 juin 1984.
La présente invention a pour objet, à titre de produits industriels nouveaux, des antigènes constitués par la conjugaison d'un produit de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
1~
H3C-I ~ ~OR
3 ~ "'~C- C CH
N ~ (III) HO-CO
dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un ~5 groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA), et répondant aux formules (V) et (VI):
H3C-N ~ R
~ C - C-CH3 ~ tv) S O
cH2 O __ _ _ _.
I n BSA
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti,et:
CH~ C--CH3 ~ (VI) ~ H2 : CO~
HSA
~ :
La présente invention a pour objet, à titre de produits industriels nouveaux, des antigènes constitués par la conjugaison d'un produit de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
1~
H3C-I ~ ~OR
3 ~ "'~C- C CH
N ~ (III) HO-CO
dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un ~5 groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA), et répondant aux formules (V) et (VI):
H3C-N ~ R
~ C - C-CH3 ~ tv) S O
cH2 O __ _ _ _.
I n BSA
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroide est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti,et:
CH~ C--CH3 ~ (VI) ~ H2 : CO~
HSA
~ :
2 -~: ~
.,.. ~ -, 23~6~
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stérolde est sous forme d'isomere syn, sous forme d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti.
Parmi les valeurs de R, on peut citer:
a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-pentyle, sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle, iso-hexyle, sec-hexyle, tert-hexyle;
b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle, butyryle, isobutyryle, valéryle, hexanoyle, benzoyle, caprylyle, méthoxy-carbonyle, éthoxy carbonyle.
De préférence R est l'hydrogène.
Ces antigènes sont nécessaire pour permettre la réalisation de dosages radioimmunologique de la 17~-hydroxy ~ (4-diméthylaminophényl) 17G~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one (Produit B) et de ses métabolites dans les fluides biologique, chez l'homme ou l'animal. Ces dosages sont effectués à l'aide des dérivés estradiéniques marqués à
l'iode, faisant l'objet de la demande principale, sous forme de melange d'isomères syn et anti ou sous forme d'isomères syn ou sous forme d'isomères anti, de formule générale (I):
H3C-N ~ /~R
~ ~ C - c-cH3 (I) O
~2 =O
NH R
:
~ 3 ~
::
5~6~
dans laquelle la ligne ondulée sur l'a~ote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti, formule dans laquelle R représen-te un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et Rl représente le reste d'un acide aminé Rl NH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce xeste étant accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 125 ou 131.
Un produit de formule (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
CH3 ~ R
(III) o H-O-CO
dans laquelle R a les significations précédentes et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, peut être obtenu en faisant réagir un produit de formule générale (II):
H3C-N_~
a~ ( II) .
: , ' .
,~ ~
,: ~
1~3S06~
dans laquelle R a les significations précitéeS avec un halogénure de carboxyméthoxylamine en présence d'une base.
Le produit obtenu est isolé sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou le produit obtenu est séparé, si désiré, en ses isomères, puis, le cas échéant, la fonction hydroxyle en 17 est éthérifié ou estérifié.
Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé
l'halogénure de carboxyméthoxylamine est l'hémihydrochlorure de carboxyméthoxylamine et on opère sous atmosphère inerte et en présence de soude.
Dans une mise en oeuvre très préférentielle du procédé, l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine.
L'éthérification ou l'estérification de la fonction hydroxyle en 17 du produit de formule générale (III), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peut etre effectuée selon des méthodes habituelles.
L'éthérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle.
L'estérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé
fonctionnel d'acide, comme un chlorure d'acide ou un anhydride.
Pour obtenir les isomères syn et anti des produits de formule générale (III) séparés, on peut procéder par exemple de la manière décrite ci-après:
- on soumet un produit de formule générale (III), sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, où R
a les significations précitées, à l'action d'un agent d'estérification pour estérifier la fonction carboxyle, sépare l'isomère~syn de l'isomère anti de l'ester résultant puis saponifie séparément ladite fonction ester de chacun des isomères syn et antij obtient l'isomère syn et l'isomère ... ,. - ~ - ::
' ..
' -' ~506~
anti des produits de formule générale (III), dans laquelle R
garde les significations précitées.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, l'application des produits de formule générale (III), est caractérisée par les points suivants:
- on fait réagir un produit de formule générale ~III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
CH3 ~ R
~ (III) H-0-~0 dans laquelle la ligne ondulée et R ont les significations précitées, en vue de l'activation de la fonction carbonyle, avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère interte, obtient l'anhydride mixte correspondant, de formule (IV):
~5 H3C- = - C-CH3 (IV) o CH~
CO
' /~
.
. - ' ' .
~3Sa)69L
dans laquelle R garde la signification précitée et R2 représente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugue avec l'albumine sérique hovine (BSA) ou humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché.
Dans un mode d'exécution préférée, l'application des produits de formule générale (III) est encore caractérisée par les poiPts suivants:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte, - on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
L'application selon l'invention permet d'obtenir au départ du 3-carboxyméthyloxime de 17~-OR-11~ -(4-dimethylaminophényl) 17~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one, sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous ~0 forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, les antigènes de formules générales (V) et (VI) dans lesquelles R a les significations précitées:
J~ ( v, , cH2 o ~
sSA
:
;.,, :
, :,, , ' .
~\
~506~
dans laquelle n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous ~orme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, et:
I
CH3 ~ -- C-CH3 (VI) ~H2 n dans laquelle n = 20 à 30 et la partie oxime de stéro;de est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti.
L'invention a également pour objet l'application des antigènes ci-dessus à la préparation des anticorps.
Pour étudier et doser par des méthodes radioimmunologiques la 17~-hydroxy-11~-(4-diméthyl-aminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9 -dièn-3-one non radioactive (produit B), on prépare comme déjà dit à partir de ce dernier,~ des antigènes avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA).
Les antigènes résultant de formules (V) et (VI), objets de l'invention peuvent servir au développement d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant. Ils permettent ainsi d'obtenir des serums contenant des anticorpsF
~ Ces anticorps servent ensuite de récepteurs de produits radioactifs et/ou de produits non-radioactifs, à
`
: :; :
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-~Z;~5(~6~
savoir de récepteurs de produits de Eormule générale (I) et notamment du 3-carboxymé-thyloxirne de 17~-hydroxy- 1 ~ -(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dien-3-one sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, couplé a 1'(~5I) histamine (produi-t A), ainsi que de la 17~-hydroxy 1 -(4-diméthylaminophényl) 17O~-(prop-l-ynyl) estra 4,9-dièn-3-one non radioactive (produit B) et de ses métabolites.
La présence de ces anticorps est mise en évidence au moyen d'un produit de formule générale (I) et no-tamment au moyen du 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, couplé à
1'( 5I) histamine radioactif ~produit A).
Le dosage du produit B ou de ses métabolites selon des methodes radioimmunologiques conventionnelles, telles que celle décrites par:
- S.A. BERGSON et R.S. YALOW, HORMONE 4, p. 557 (1964) et - G.E. ABRAHAM J. of CHEM. ENDOCRINAL METAB., 29, p. 866 (1969~
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE_l:
Antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-ll-~(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-diène-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine sérique bovine (BSA).
STADE A:
Anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~ -hydroxy~ -(4-diméthylamlnophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-_ g ~s~
4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti avec le formiate d'isobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 63 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11/~-(4-diméthylaminophényl)-l7~-(prop-l-ynyl)-estra-4~9-diène-3-one dans 1,2 ml de dioxane, ajoute 57,5 ,ul de tri-n-butylamine, puis abaisse la température vers 13 C, ajoute 16 ~l de chloroformiate d'isobutyle, maintient ce mélange réactionnel sous agitation à la température de 13 C environ pendant une demi-heure. On obtient une solution du produit cherché, que l'on utilise telle quelle pour le stade suivant de la synthèse.
STADE B:
Dissolution de l~albumine sérique bovine.
On introduit à 4 C sous agitation e~ sous atmosphère inerte 175 mg d'albumine sérique bovine dans 0,5 ml d'eau, maintient sous agitation pendant 20 mn environ, rajoute successivement après la dissolution 3 ml de dioxane et 170 ,ul de NaOH N.
STADE C:
Conjugaison.
On verse lentement dans la solution d'albumine serique bovine obtenue au stade B, la solution d'anhydride mixte obtenue au stade A, amène le pH à 8,9 à l'aide d'acide chlorhydrique N et agite le mélange réactionnel pendant 5 heures à 10 C environ. On sépare ensuite la phase organique du précipité formé, la dilue par 30 ml d'eau distillée, amène le pH à 4,1 par l'addition d'acide chlorhydrique N, sépare le précipité formé, le reprend par 25 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1~.
La solution résultante est laissée au repos, puis soumise à
l'ultrafiltration. On épuise ensu~te la solution des .
.
3S~
molécules de poids moléculaire <10-15000 par 510 ml d'eau distillée puis ajuste le volume final à 17 ml. On lyophilise cette solution pendant 30 heures environ et obtient 169 mg d'antigène cherché.
Analyse Spectre UV
- dans eau: max 265 nm E'1= 53 max 290 nm E'1= 62 - dans HCl N/10: max 290 nm E'l= 61 Dichroisme circulaire - dans eau: max 222 nm ~E'1= -0,305 max 260 nm ~ E'1= -0,070 max 289 nm ~ E'1= -0,050 - dans HC1 /10: max 222 nm ~E'1= -0,250 max 290 nm ~ E'1:~0,027 Ce produit contient 20 à 22 groupes de stéroide liés par mole de protéine.
Préparation de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~(prop-1-ynyl)-estra -4,9-diène-3-one.
A une solution de 1 g de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn -3 -one dans 35 ml d'éthanol, on ajoute 665 mg d'hemihydrochlo-rure de carboxyméthoxylamine, soumet le mélange réactionnel à l'agitation pendant une heure environ à température ambiante, additionne de 1,6 ml de soude N, puis concentre sous vide, reprend le résidu par le chloroforme, essore, évapore le filtrat à sec, le chromatographie sur silice (eluants chloroforme/methanol 7:3), isole le produit cherché
que l'on empâte par l'ether isopropylique, essore et sèche sous vide~ pour obtenir 1,13 g dudit produit cherché sous forme de ;mélange~d'isomères syn et anti. La chromatographie sur couche mince de si~lice, en éluant au mélange chloroforme/méthanol ( a ~2) donne Rf=0,45.
~3SV~i9L
EXEMPLE 2:
Antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de 1 ~-hydroxy-ll ~(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-l~ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine sérique humaine (HSA).
En procédant comme décrit dans le stade C de l`exemple 1, mais en partant de la solution d'anhydride mixte du stade A et d'une solution d'albumine sérique humaine preparée selon la méthode décrite au stade B, on obtient 180 mg d'antigène cherché.
Ce produit contient 34 à 36 groupes de stéroîde lies par mole de protéine.
Analyse Spectre UV
15- dans eau: max 2~5 nm E'1= 79 max 291 nm E'1= 94 - dans HCl jlO: max 290 nm E'l= 93 Dichro~sme circulaire - dans eau: infl. 218 nm aE'l= -0,308 max 259 nm ~E'l= -0,115 max 288 nm ~E'l= +0,085 - dans HCl /10: max 223 nm aE' = -0,300 max 283 nm ~E'1= +0,037 ~,. .
,~
.,.. ~ -, 23~6~
dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stérolde est sous forme d'isomere syn, sous forme d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti.
Parmi les valeurs de R, on peut citer:
a) les radicaux méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, iso-pentyle, sec-pentyle, tert-pentyle, néo-pentyle, hexyle, iso-hexyle, sec-hexyle, tert-hexyle;
b) les radicaux formyle, acétyle, propionyle, butyryle, isobutyryle, valéryle, hexanoyle, benzoyle, caprylyle, méthoxy-carbonyle, éthoxy carbonyle.
De préférence R est l'hydrogène.
Ces antigènes sont nécessaire pour permettre la réalisation de dosages radioimmunologique de la 17~-hydroxy ~ (4-diméthylaminophényl) 17G~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one (Produit B) et de ses métabolites dans les fluides biologique, chez l'homme ou l'animal. Ces dosages sont effectués à l'aide des dérivés estradiéniques marqués à
l'iode, faisant l'objet de la demande principale, sous forme de melange d'isomères syn et anti ou sous forme d'isomères syn ou sous forme d'isomères anti, de formule générale (I):
H3C-N ~ /~R
~ ~ C - c-cH3 (I) O
~2 =O
NH R
:
~ 3 ~
::
5~6~
dans laquelle la ligne ondulée sur l'a~ote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti, formule dans laquelle R représen-te un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone et Rl représente le reste d'un acide aminé Rl NH2 ou le reste d'un dérivé de ce dernier, ce xeste étant accepteur d'iode et étant marqué à l'iode 125 ou 131.
Un produit de formule (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
CH3 ~ R
(III) o H-O-CO
dans laquelle R a les significations précédentes et la ligne ondulée sur l'azote indique que ce produit est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, peut être obtenu en faisant réagir un produit de formule générale (II):
H3C-N_~
a~ ( II) .
: , ' .
,~ ~
,: ~
1~3S06~
dans laquelle R a les significations précitéeS avec un halogénure de carboxyméthoxylamine en présence d'une base.
Le produit obtenu est isolé sous forme de mélange d'isomères syn et anti, ou le produit obtenu est séparé, si désiré, en ses isomères, puis, le cas échéant, la fonction hydroxyle en 17 est éthérifié ou estérifié.
Dans une mise en oeuvre préférentielle du procédé
l'halogénure de carboxyméthoxylamine est l'hémihydrochlorure de carboxyméthoxylamine et on opère sous atmosphère inerte et en présence de soude.
Dans une mise en oeuvre très préférentielle du procédé, l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine.
L'éthérification ou l'estérification de la fonction hydroxyle en 17 du produit de formule générale (III), dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, peut etre effectuée selon des méthodes habituelles.
L'éthérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'éthérification tel qu'un halogénure d'alcoyle ou d'aryle, ou un sulfate de dialcoyle.
L'estérification peut être effectuée par exemple au moyen d'un agent d'estérification tel qu'un dérivé
fonctionnel d'acide, comme un chlorure d'acide ou un anhydride.
Pour obtenir les isomères syn et anti des produits de formule générale (III) séparés, on peut procéder par exemple de la manière décrite ci-après:
- on soumet un produit de formule générale (III), sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, où R
a les significations précitées, à l'action d'un agent d'estérification pour estérifier la fonction carboxyle, sépare l'isomère~syn de l'isomère anti de l'ester résultant puis saponifie séparément ladite fonction ester de chacun des isomères syn et antij obtient l'isomère syn et l'isomère ... ,. - ~ - ::
' ..
' -' ~506~
anti des produits de formule générale (III), dans laquelle R
garde les significations précitées.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre, l'application des produits de formule générale (III), est caractérisée par les points suivants:
- on fait réagir un produit de formule générale ~III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
CH3 ~ R
~ (III) H-0-~0 dans laquelle la ligne ondulée et R ont les significations précitées, en vue de l'activation de la fonction carbonyle, avec un halogénoformiate d'alcoyle, en présence d'une base tertiaire, en milieu anhydre et sous atmosphère interte, obtient l'anhydride mixte correspondant, de formule (IV):
~5 H3C- = - C-CH3 (IV) o CH~
CO
' /~
.
. - ' ' .
~3Sa)69L
dans laquelle R garde la signification précitée et R2 représente un radical de formule -CO-O-alc, alc étant un radical alcoyle ayant au plus 6 atomes de carbone, que l'on conjugue avec l'albumine sérique hovine (BSA) ou humaine (HSA) et obtient l'antigène cherché.
Dans un mode d'exécution préférée, l'application des produits de formule générale (III) est encore caractérisée par les poiPts suivants:
- l'halogénoformiate d'alcoyle est le chloroformiate d'isobutyle et on opère en présence de tri-n-butylamine et sous atmosphère inerte, - on fait réagir l'anhydride mixte de formule générale (IV) avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou humaine (HSA) en ayant préalablement dissout cette dernière dans un mélange eau-dioxane sous atmosphère inerte.
L'application selon l'invention permet d'obtenir au départ du 3-carboxyméthyloxime de 17~-OR-11~ -(4-dimethylaminophényl) 17~-(prop-1-ynyl) estra-4,9-dièn-3-one, sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous ~0 forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, les antigènes de formules générales (V) et (VI) dans lesquelles R a les significations précitées:
J~ ( v, , cH2 o ~
sSA
:
;.,, :
, :,, , ' .
~\
~506~
dans laquelle n = 20 à 30 et la partie oxime de stéroide est sous ~orme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti, et:
I
CH3 ~ -- C-CH3 (VI) ~H2 n dans laquelle n = 20 à 30 et la partie oxime de stéro;de est sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti.
L'invention a également pour objet l'application des antigènes ci-dessus à la préparation des anticorps.
Pour étudier et doser par des méthodes radioimmunologiques la 17~-hydroxy-11~-(4-diméthyl-aminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9 -dièn-3-one non radioactive (produit B), on prépare comme déjà dit à partir de ce dernier,~ des antigènes avec l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec l'albumine sérique humaine (HSA).
Les antigènes résultant de formules (V) et (VI), objets de l'invention peuvent servir au développement d'anticorps lorsqu'ils sont injectés chez l'animal en présence d'un adjuvant. Ils permettent ainsi d'obtenir des serums contenant des anticorpsF
~ Ces anticorps servent ensuite de récepteurs de produits radioactifs et/ou de produits non-radioactifs, à
`
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-~Z;~5(~6~
savoir de récepteurs de produits de Eormule générale (I) et notamment du 3-carboxymé-thyloxirne de 17~-hydroxy- 1 ~ -(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dien-3-one sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, couplé a 1'(~5I) histamine (produi-t A), ainsi que de la 17~-hydroxy 1 -(4-diméthylaminophényl) 17O~-(prop-l-ynyl) estra 4,9-dièn-3-one non radioactive (produit B) et de ses métabolites.
La présence de ces anticorps est mise en évidence au moyen d'un produit de formule générale (I) et no-tamment au moyen du 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomère syn et d'isomère anti, sous forme d'isomère syn et sous forme d'isomère anti, couplé à
1'( 5I) histamine radioactif ~produit A).
Le dosage du produit B ou de ses métabolites selon des methodes radioimmunologiques conventionnelles, telles que celle décrites par:
- S.A. BERGSON et R.S. YALOW, HORMONE 4, p. 557 (1964) et - G.E. ABRAHAM J. of CHEM. ENDOCRINAL METAB., 29, p. 866 (1969~
Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
EXEMPLE_l:
Antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-ll-~(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-diène-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine sérique bovine (BSA).
STADE A:
Anhydride mixte de 3-carboxyméthyloxime de 17~ -hydroxy~ -(4-diméthylamlnophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-_ g ~s~
4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti avec le formiate d'isobutyle.
On dissout sous agitation et sous atmosphère inerte 63 mg de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11/~-(4-diméthylaminophényl)-l7~-(prop-l-ynyl)-estra-4~9-diène-3-one dans 1,2 ml de dioxane, ajoute 57,5 ,ul de tri-n-butylamine, puis abaisse la température vers 13 C, ajoute 16 ~l de chloroformiate d'isobutyle, maintient ce mélange réactionnel sous agitation à la température de 13 C environ pendant une demi-heure. On obtient une solution du produit cherché, que l'on utilise telle quelle pour le stade suivant de la synthèse.
STADE B:
Dissolution de l~albumine sérique bovine.
On introduit à 4 C sous agitation e~ sous atmosphère inerte 175 mg d'albumine sérique bovine dans 0,5 ml d'eau, maintient sous agitation pendant 20 mn environ, rajoute successivement après la dissolution 3 ml de dioxane et 170 ,ul de NaOH N.
STADE C:
Conjugaison.
On verse lentement dans la solution d'albumine serique bovine obtenue au stade B, la solution d'anhydride mixte obtenue au stade A, amène le pH à 8,9 à l'aide d'acide chlorhydrique N et agite le mélange réactionnel pendant 5 heures à 10 C environ. On sépare ensuite la phase organique du précipité formé, la dilue par 30 ml d'eau distillée, amène le pH à 4,1 par l'addition d'acide chlorhydrique N, sépare le précipité formé, le reprend par 25 ml d'une solution aqueuse de bicarbonate de sodium à 1~.
La solution résultante est laissée au repos, puis soumise à
l'ultrafiltration. On épuise ensu~te la solution des .
.
3S~
molécules de poids moléculaire <10-15000 par 510 ml d'eau distillée puis ajuste le volume final à 17 ml. On lyophilise cette solution pendant 30 heures environ et obtient 169 mg d'antigène cherché.
Analyse Spectre UV
- dans eau: max 265 nm E'1= 53 max 290 nm E'1= 62 - dans HCl N/10: max 290 nm E'l= 61 Dichroisme circulaire - dans eau: max 222 nm ~E'1= -0,305 max 260 nm ~ E'1= -0,070 max 289 nm ~ E'1= -0,050 - dans HC1 /10: max 222 nm ~E'1= -0,250 max 290 nm ~ E'1:~0,027 Ce produit contient 20 à 22 groupes de stéroide liés par mole de protéine.
Préparation de 3-carboxyméthyloxime de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~(prop-1-ynyl)-estra -4,9-diène-3-one.
A une solution de 1 g de 17~-hydroxy-11~-(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-1-ynyl)-estra-4,9-dièn -3 -one dans 35 ml d'éthanol, on ajoute 665 mg d'hemihydrochlo-rure de carboxyméthoxylamine, soumet le mélange réactionnel à l'agitation pendant une heure environ à température ambiante, additionne de 1,6 ml de soude N, puis concentre sous vide, reprend le résidu par le chloroforme, essore, évapore le filtrat à sec, le chromatographie sur silice (eluants chloroforme/methanol 7:3), isole le produit cherché
que l'on empâte par l'ether isopropylique, essore et sèche sous vide~ pour obtenir 1,13 g dudit produit cherché sous forme de ;mélange~d'isomères syn et anti. La chromatographie sur couche mince de si~lice, en éluant au mélange chloroforme/méthanol ( a ~2) donne Rf=0,45.
~3SV~i9L
EXEMPLE 2:
Antigène à partir de 3-carboxyméthyloxime de 1 ~-hydroxy-ll ~(4-diméthylaminophényl)-17~-(prop-l~ynyl)-estra-4,9-dièn-3-one sous forme de mélange d'isomères syn et anti et d'albumine sérique humaine (HSA).
En procédant comme décrit dans le stade C de l`exemple 1, mais en partant de la solution d'anhydride mixte du stade A et d'une solution d'albumine sérique humaine preparée selon la méthode décrite au stade B, on obtient 180 mg d'antigène cherché.
Ce produit contient 34 à 36 groupes de stéroîde lies par mole de protéine.
Analyse Spectre UV
15- dans eau: max 2~5 nm E'1= 79 max 291 nm E'1= 94 - dans HCl jlO: max 290 nm E'l= 93 Dichro~sme circulaire - dans eau: infl. 218 nm aE'l= -0,308 max 259 nm ~E'l= -0,115 max 288 nm ~E'l= +0,085 - dans HCl /10: max 223 nm aE' = -0,300 max 283 nm ~E'1= +0,037 ~,. .
,~
Claims (2)
1. Antigènes constitués par la conjugaison d'un produit de formule générale (III) sous forme de mélange d'isomères syn et anti, sous forme d'isomère syn ou sous forme d'isomère anti:
(III) dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA), et répondant aux formules (V) et (VI):
(V) dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroîde est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti et:
(VI) dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroîde est sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti.
(III) dans laquelle la ligne ondulée sur l'azote oximinique signifie que la fonction oxime peut être en position syn ou anti et dans laquelle R représente un atome d'hydrogène, un groupement alcoyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ou un groupement acyle d'un acide carboxylique ayant de 1 à 12 atomes de carbone, avec de l'albumine sérique bovine (BSA) ou avec de l'albumine sérique humaine (HSA), et répondant aux formules (V) et (VI):
(V) dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroîde est sous forme d'isomère syn, d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti et:
(VI) dans laquelle R a les significations précédentes, n = 20 à
30 et la partie oxime de stéroîde est sous forme d'isomère syn, sous forme d'isomère anti ou sous forme de mélange d'isomères syn et anti.
2. Méthode pour la préparation d'anticorps, caractérisée en ce que l'on administre à un animal au moins un des antigènes tels que définis dans la revendication 1.
Priority Applications (1)
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