CA1038786A

CA1038786A - Anticoccidal substance and preparation thereof by cultivating a streptomyces

Info

Publication number: CA1038786A
Application number: CA221,219A
Authority: CA
Inventors: Jean Florent; Denise Mancy; Jean Lunel
Original assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Current assignee: Rhone Poulenc Industries SA
Priority date: 1974-03-05
Filing date: 1975-03-04
Publication date: 1978-09-19
Also published as: AU7879375A; IE40730L; HU170058B; NL7502215A; OA04905A; JPS50129796A; IE40730B1; IT1046878B; LU71965A1; NL179925B; DE2509653A1; NL179925C; IL46748A0; HK70480A; GB1495858A; CH602919A5; DE2509653C2; NZ176820A; CY1102A; DK86375A

Abstract

La présente invention a pour objet une nouvelle substance antibactérienne et anticoccidienne désignée par le numéro 31.559 RP ses sels métalliques et ses sels avec les basses azotées, et sa préparation par culture de Streptomyces hygroscopicus DS 24.367(NRRL 5787). Les compositions à base de cette nouvelle substance sont particulièrement utiles de fait de leurs activités anticoccidiennes, antibactérienne et antimalarique pour l'alimentation d'animaux.The present invention relates to a new antibacterial and anticoccidial substance designated by the number 31.559 RP, its metal salts and its salts with low nitrogen, and its preparation by culture of Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 (NRRL 5787). The compositions based on this new substance are particularly useful because of their anticoccidial, antibacterial and antimalarial activities for animal feed.

Description

La présente invention concerne une nouvelle substance antibiotique designee ci~apres par le numero 31.559 RP, de la formule generale:

OCH 3 CH 3 OCH 3 ~ pCH 3 ,CH3 H3 ~C9_ ~ 3 ~CH3 ~ H

H C~ H~H ~ O /\~ O H H ~

ainsi que ses sels métalliques, ses sels avec les bases azotées, son procédé de préparation et les compositions q~li les contiennent.
Le 31. 559 RP présente un intérêt tout particulier par suite de l'activité anticoccidienne qu'il manifeste à côté de son activité antibactérienne et de son activité antimalarique.
Il est également particulièrement intéressant comme facteur de croissance des ruminants et comme agent de lutte contre la dysenterie des porcins.
Le 31.559 RP peut être obtenu ~ partir des milieux de culture appropriés d'un nouveau microorganisme identifié plus complètement ci-apr8s, appartenant au genre Streptomyces et d~signé par l'appellation Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 (NRRL 5787).
Le 31.559 RP contient du carbone, de l'hydrog8ne et de l'oxyg8ne. La composition élémentaire de son sel de sodium est voisine de:
C % -,63,2 H % _8,8 0 % =24,3 Na %_ 2,9.
Son équivalent neutre (détermin~ par dosage du sel de sodium en milieu acétique par l'acide perchlorique) est de 836.
D~apres son analyse élémentaire et ses spectres de RMN du proton et du carbone 3C, le sel de sodium du 31.559 RP
r~pond a la formule brute probable C44H73_75O13 ~4Na.

D~autre part les spectres RMN du proton et du carbone C permettent de mettre en évidence la présence de quatre groupements méthoxy ~ans sa molécule.
Le sel de sodium du 31.559 RP est en outre caracté-risé par les propriétés physico-chimiques suivantes:
- aspect: poudre microcristalline blanche ~

- solubilité ~notation selon la Pharmacopée ~rançaise IX édi-tion, 2~ partie p. 13 (1972)~
- pratiquement insoluble dans l'eau - peu soluble dans les solvants hydrocarbonés tels que llhexane - soluble dans les alcools tels que le méthanol, les céto-nes telles que ltacétone, dans le diméthylformamide et llacétate d~éthyle - facilement soluble dans les solvants chlorés tels que le chlorure de méthylène et le chloroforme - E_int de fusion (déterminé au banc Kofler): 220C (décom-position) - pouvoir rotatoire: (c = 1,050% - méthanol) [~20 = + 51,2 Co~436 = ~ 101 ~ 1~5 r.a~36s = + 167 1 2 ~ ~E~tre ultra-vlolet: (détermlnation ~ partir d~une ~olution a 0~950 mg/ml dans l~éthanol) pas d~absorption caractéristique ~usqu~à 210 nm.
- ~ectre infra-rou~e: (déterminat~on à partir de comprimés en ~
mélange avec KBr). Ce spectre est représenté par la figure 1 dans laquelle on a porté en abscisses, d~une part les longueurs dlon-de~ exprim~es en microns (échelle supérieure) et d~autre part le~ nombres d~ondes en cm 1 (échelle in~érieure) et en ordonnée~ -les densités optique~0 Dans le tableau I, on indique les principales bandes d~a~orption infxa-rouge pour ce produit exprimée~ en nombre d~ondes (cm 1)o TABLEA~ I
3430 ~ 1372 ép. 1090 ~p. 775 ~p.
3180 F 1362 ~p. 1072 ~ 765 ép.
2970 t~ 1350 ép. 1065 ép. 748 m Z935 ~ 1335 ép. 1040 F 705 m 2925 ép. 1298 ép. 1018 ~ 655 ép.
2880 ~ 1292 m 1000 épO 635 m 2825 m 1260 ép. 985 F 610 f 2600 ép. 1238 F 968 t~ 590 tf 2060 tf 1220 ép0 940 ~ 570 ép.
1945 tf 1200 ~ 928 m 565 f 1850 tf 1190 ép. 912 F 550 f 1 1760 ti 1185 ép. 890 m 535 i 1 1730 tf 1170 F 870 F 500 tf 1630 ép. 1152 f 852 m 482 tf 1590 ~ 1~40 ép. 828 m 420 m 1450 ~ 1115 ~ 815 ép. 378 f 1398 F 1108 ép. 792 ép. 350 m 1380 F 1092 tF 788 m tF z trè~ forte ~ = forte m = moyenne f = faible ti _ tr~s faible ~p. ~ ~paulement ~ e sel de sodium du 31.559 RP peut être encore ca-ract~rlsé par chromatographie ascendante sur couche mi~ce de gel de silice en utilisant deux systèmes de mélange de solvants:
- 1) ac~tate d~éthyle, cyclohexane, eau, butanol (50-50-25-5 en volume~): dans ce système, le sel de sodium du 31.559 RP
a ~n Ri de 0,5O The present invention relates to a new substance antibiotic designated below by the number 31.559 RP, from the general formula:

OCH 3 CH 3 OCH 3 ~ pCH 3 , CH3 H3 ~ C9_ ~ 3 ~ CH3 ~ H

HC ~ H ~ H ~ O / OHH ~

as well as its metal salts, its salts with nitrogenous bases, its preparation process and the compositions q ~ li contain them.
31. 559 RP is of particular interest by following the anticoccidial activity which he manifests next to its antibacterial activity and its antimalarial activity.
It is also particularly interesting as a factor growth of ruminants and as a control agent pig dysentery.
31.559 RP can be obtained from appropriate culture of a new microorganism identified more completely below, belonging to the genus Streptomyces and d ~ signed by the name Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 (NRRL 5787).
31.559 RP contains carbon, hydrogen and oxygen. The basic composition of its sodium salt is close to:
C% -, 63.2 H% _8.8 0% = 24.3 Na% _ 2.9.
Its neutral equivalent (determined by dosing salt sodium in acetic medium by perchloric acid) is 836.
According to his elementary analysis and his spectra of Proton and 3C carbon NMR, the sodium salt of 31.559 RP
answers the probable raw formula C44H73_75O13 ~ 4Na.

On the other hand the NMR spectra of the proton and the carbon C allow to highlight the presence of four methoxy groups ~ in its molecule.
The sodium salt of 31.559 RP is also characterized laughed at by the following physicochemical properties:
- appearance: white microcrystalline powder ~

- solubility ~ rating according to the Pharmacopoeia ~ French IX edi-tion, 2 ~ part p. 13 (1972) ~
- practically insoluble in water - poorly soluble in hydrocarbon solvents such as llhexane - soluble in alcohols such as methanol, keto-nes such as acetone, in dimethylformamide and ethyl acetate - easily soluble in chlorinated solvents such as methylene chloride and chloroform - E_int of fusion (determined on the Kofler bench): 220C (decom-position) - rotary power: (c = 1.050% - methanol) [~ 20 = + 51.2 Co ~ 436 = ~ 101 ~ 1 ~ 5 ra ~ 36s = + 167 1 2 ~ ~ E ~ tre ultra-vlolet: (determination ~ from ~ an ~ olution at 0 ~ 950 mg / ml in ethanol) no characteristic absorption ~ usqu ~ at 210 nm.
- ~ infrared ectre ~ e: (determat ~ on from tablets in ~
mixture with KBr). This spectrum is represented by FIG. 1 in which we have plotted on the abscissa, on the one hand the lengths dlon-of ~ expressed in microns (upper scale) and on the other hand the ~ wave numbers in cm 1 (in ~ upper scale) and on the ordinate ~ -optical densities ~ 0 The main bands are shown in Table I
d ~ a ~ infxa-red orption for this product expressed ~ in number waves (cm 1) o TABLEA ~ I
3430 ~ 1372 th. 1090 ~ p. 775 ~ p.
3180 F 1362 ~ p. 1072 ~ 765 th.
2970 t ~ 1350 th. 1065 th. 748 m Z935 ~ 1335 th. 1040 F 705 m 2925 th. 1298 th. 1018 ~ 655 th.
2880 ~ 1292 m 1000 epO 635 m 2,825 m 1,260 th. 985 F 610 f 2600 th. 1238 F 968 t ~ 590 tf 2060 tf 1220 ep0 940 ~ 570 ep.
1945 tf 1200 ~ 928 m 565 f 1850 tf 1190 th. 912 F 550 f 1 1760 ti 1185 th. 890 m 535 i 1 1730 tf 1170 F 870 F 500 tf 1630 th. 1152 f 852 m 482 tf 1590 ~ 1 ~ 40 th. 828 m 420 m 1450 ~ 1115 ~ 815 th. 378 f 1398 F 1108 th. 792 th. 350 m 1380 F 1092 tF 788 m tF z very ~ strong ~ = strong m = medium f = low ti _ very weak ~ p. ~ ~ payment ~ e sodium salt of 31.559 RP can still be ract ~ rlsé by ascending chromatography on mid layer ~ gel silica using two solvent mixing systems:
- 1) ethyl acetate, cyclohexane, water, butanol (50-50-25-5 in volume ~): in this system, the sodium salt of 31.559 RP
a ~ n Ri of 0.5O

- 2) chlorure de méthylane, méthanol (94-6 en volumes): dans ce 30système le ~el de sodium du 31.559 RP a un Rf de 0,7.
- activité bactériostatique in vitro:
:

,~ ' '''.

10387~36 ~ e 31.559 RP montre une activité bactériostatique qui s~exerce en particulier sur certaines bactéries prenant la coloration de Gram.
~'activité bactériostatique du sel de sodium du .31.559 RP vis-à-vis dlun certain nombre de germes a été déter-minée par une des méthodes de dilution couramment employées à
cet ef~et. Pour chaque germe on a déterminé la plus petite concentration de substance active qui, dans des conditions dé-finies, emp~che tout développement visible dans un bouillon .
nutriti~ appropri~. ~es résultats des diverses déterminations sont rassemblés dans le tableau I~ ci-apras où les concentra-tions bactériostatiques minimales sont exprimées en microgram-mes de substances par cm3 de milieu d~essai:
TA~LEAU II

Concentrations . Organismes bactériens essayés minimales bactériostatiques . (en u ~cm3) .
Staphylococcus aureus, souche209 P-A~CC 653~ 0,8 Staphylococcu3 aursu3, souche Smith 2,5 Sar¢ina lutea - ATCC 9341 1,9 Streptoooccus faecali~ - ATCC 8043 0,5 Streptococcus pyogenes hemolyticus, souche. 0,8 Dig 7 (In~titut Pasteur) Diplococcus pneumoniae~ souche Til 0,2 (Institut Pasteur) Neis~eria ¢atarrhalis (A152,InstitutP~st~ur) 50 ~acillus subtilis - ATCC 6633 0,8 9aclllus cereus ATCC 6630 0,5 Myoobacterium species - ATCC 607 25 Esoheriohia coli - ATCC 9637 >150 .. Shigella dysenteriae, Shi~a ~ >150 (In~titut Pasteur) Salmonella paratyphi A (souche Lacasse~>150 Institut Pasteur~
Salmonella schottmuelleri (paratyphi B),~150 (souche Fougenc, Institut Pasteur) Proteus vulgaris >150 Pseudomonas aeruginosa >150 _ ~.~

~oxicite: 1038786 Cheæ le poussin, la dose l~tale 50% (D~50) du sel de sodium du 3?1~559 RP est de 150 mg/kg p.o. en adm;nistration unique.
Activité anticoccidienne: -~ 'activit~ anticoccidienne du sel de sodium du 31.559 RP a ét~ déterminée chez le poussin infesté notamment par ~imeria tenella et Eimeria acervulina.
~ 'acti~ité anticoccidienne du sel de sodium du 31.559 RP in¢orporé à la nourriture se manifeste ~ des concen-trations non toxiques compr~ses entre 0,005 et 0,04% en poids de produit contenu dans l'aliment.
Aciti~ité antimalariaue , ~ e sel de sodium du 31.559 RP manifeste ~galement une activité antimalarique vis-à-vis des infestations expéri-mentales a pla~modium du poussin et de la souris.
~ 'organisme produoteur de l'anti¢o¢¢idien 31.559 ~P
est une souohe de streptomyce~ gul a ~té lsolée à partir d'un ~chantillon de terre prélevë en Inde, et à laquelle a été attri-bU~ le numéro DS 24-367. Un é¢hantillon en a été déposé au Nor-the?rn Regional Resear¢h Laboratory de l'U.S. Department of Agri¢ulture à PeDr~a, Ill. (Etats-Unis)~ où il a été enregistré
~OU8 la référen¢e ~RR~ 5787.
~'isolement de oette sou¢he a été effectué en sui-vant la méthode générale qui ¢onsiste à mettre une petite quan-tlté de terre en suspension dans de lleau distillée stérile~ a dlluer la suspension à diiférentes concentrations~ et ~ é~aler un petit ~olume de chaque dilution sur la surface de boites de Pétri aontenant un milieu nutriti~ géloæé. Apr~s une~ncubation ~; ~30 de quelques jours à 25C, qui permet aux microorganismes de se développer, les colonies que l'on veut isoler pour en pour-~. . -suivre l'~tude sont pr~lev~es et repiquées sur des g~loses nu-' '. ,,:
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~ 0 3 87 8 6 tritives inclin~es afin d'en obtenir des cultures plus abondantes.
La ~ouche de streptomyces DS 2~.367 se rattache à
l'espace Streptomyces h.y~ro~copicus dont les caractéristiques es~entielles ont été définies par H.D. ~R~Sl~ER et E J. ~ACK~S
(Applied r~crobiology, 4, 243-250, 1956) et par S.A. WAKSMAN
(The Actinomycete~, II, ~he Williams and Wilkins Company, Bal-timore, 1961, p. 230-231), c'est pour~uoi elle a été désignée par l'appellatio~ Stre~__~vces hy~roscopious~ souche DS 24.367.
S. hy~roscopi-cu-s DS 24.367 présente en effet les trois caractère~ suivants, qui correspondent aux trois carac-téristiques p~r lesquelles H.D. TRESNEn et E,J. ~CKUS ainsi que S.A. WAKSMAN d~finissent l'espèce S. h~y~rôsco~icu~:
a) se~ ~porophores se terminent d'une manière générale en spi-rales ~errées ayant un enroulement de quelques tours; ces ~po-rophore~ spiralés sont habituellement groupé~ le long d'un fi-lament en formant des grappes plu8 OU moins allongées, b) son my¢~lium aérien ~porulé, lorsqu'il est arriv~ à un bon ~tade de développement~ montre une ooloration gris fonoé cor-respondant à oelle mo.ntrée par l'espa¢e S. hygroscopicus, c) ~ur certains milieux de culture permettant un bon développe-ment du myc~lium aérien, apparition par vieillissement dans les surface~ sporulées de zones noire~, brillantes, d'aspect humide, oaractéristiques de l'espè¢e S,_h2~ æsco~icus.
Dan~ le cas de S. hygro~copicus DS ~4.367, la formation de mycélium aérien .ne se produit souve.nt ~ue d'une manière peu abondante, ~aisant même défaut sur un ¢ertain nombre 1~)38786 de milieux de culture. ~orsqu'un mycélium aérien sporulé gris appar~ t, la formation par vie~llissement de zones noires, lors-qulelle a lieu, ne s'e*fectue généralement que dtune manière assez discr~te, et elle est limitée ~ de petits points ou de petites zones répartis par endroits sur le mycelium aérien plut8t que sur sa surface toute enti~re. Elle est cependant mani~este et elle peut ~tre observ~e en particulier sur gélose à l'extrait de levure de Pridham, sur gélose à la ~arine d'a-voine et à l'extrait de tomates de Pridham, et sur gélose ~lucose-asparagine.
~a souche S.h~grosco~icus cit~e comme référence par S.A. WAKSMAN dans "The Actinomycetes" montre, sur les quelques milieux de culture où son aspect morphologique est décrit, quel-ques petites différences avec la souche DS 24.367, dont les plus appréciables consistent en ce qu'elle forme un mycélium aérien sur gélo~e nitratée au saccharose et ~ur gélose nutri-tlve~ alors que sur ces deux milieux 1~ souche DS 24.367 n'en forme pas, De plus~ sur un milieu contenant du sacoharose comme source de car~one, S. hy~rosco~icus ne réduit pas les nitrate8 alors que dans les m~mes conditions la souche DS 24.367 réduit fortement les nitrates en nitrites. Toutefois~
ces quelques di~férences ~on~ trop peu importantes pour dis-tlnguer la souChe DS 240~67 de l'espèc~ S. hygroscopicus dont elle présente par ~illeurs le~ principales ¢aractéristique~
~ervant à la dérinir.
S.h~roscoPicus DS 24.367 ~orme des chaines de spo-res qui, en g~neral~ se terminent en spirales ~errées d'un nom-bre de tours limité, raxement supérieur a 3 ou 4, bien que, oc-casionnellement, on puisse observer des spirales ~ormant un nom-bre de tours plus important, ou aussi ~uelques chaines de spores simplement recourbés dans leur partie terminale sans former un tour complet, ou encore des spirales ~lus ou moins l~ches et , )38786 d~rouléesO ~'appareil sporifère présente une structure en grappe, les sporophores spiralés, susceptibles de présenter eux-m~mes quelques ramifications, étant insérés le long d'un ~ilament prin- -cipal qui peut atteindre une assez grande longueur. ~es spores sont ovales à cylindriques, mesurant 0,8 à 1,0 ~ / 0,6 à 0,8 ~.
Des examens microscopiques ont montré une organisation identique de l'appareil sporif~re sur gélose de Bennett et sur gélose avoi-ne-tomate de Pridham. Par son mode de sporulation, S. hygrosco-~icu8 D~ 24~367 se place dans la section SPira de la classifica-tion de Pridham.
S0 hy~roscopicus DS 24.367 se développe bien ~ 25C, un peu moins bien à 37C~ et ne se développe pas ~ 50C. Dans ~e8 cultures effectuées à 25C, il pré8ente les caractères bio-chimiques suivants:

-productlon de ~élanine : négative -productio~ de H2S s négative -ty~osinase s négative -llquéfaction do la gélatine : po~itive -utilisation de la cellulose : positive -production de nitrites ~ partir des nitrates: forteme~t positive -hydrolyse de l'amidon : positive ~culture sur lait : peptonigation3ans coagulation; peu de variationdu pH
en 1 mois i ~es caracteres culturaux de streptomYces hygroscopi-CU8 DS 240367 sont rassemblés dans le tableau ci-dessous. Ce sont ceux de culture arrivées à un bon stade de développement, o'est-à-dire d'environ 2 à 3 semaines ~ 25C sauf indication3 contraires. Ces caractères ont été observés sur des géloses nu-tritive5 et des bouillons habituellement utilisés pour déterminer le3 caractères morphologiques des souches de streptomyces, les ., ,.. . . ... .. .
- . . .. . - ~ . . . . , ... ,.. . ~, .. .. . .. . .. . .

1~38~86 cultures sur milieux gélosés étant e~fb~tuées sur des géloses inclinées. Un certain nombre des milieux de culture employés ont ét~ préparés d~apr~s les formules indiquées dans "~he Acti-nomycetes~' (S.A. WAKSMAN, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., U.S~ ., 1950); dans ce cas, ils sont indiqués par la lettre W suivie du num~ro qui leur a été attribué dans "The Actinomycetes". ~es ré~érences ou constitutions des autres milieux de culture sont les suivantefi:
- Ré~. A - Bennett's Agar" - S.A WAKSMAN - The Actinomycetes, vol. 2~ pO 331- n 30 - The Williams and Wilk~ns Com-pany, Baltimore, 1961 - Ré~O B - "Hickey and Tresner's Agar" - T.G. PRIDHAM et coll., Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950 - ~éi. C - Formule W-23, additionnée de 2% de gélose - Ré~. D - "Yeast Extract Agar" - T.G. PRIDHAM et coll., Anti-bioti¢s Annual "956-1957, p. 950 - R~i. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - T.G. PRIDN~ et ooll.
Antlblotics Annual, 1956-1957, p. 950 `
- Réf. ~ - "Melanin ~ormation medium" - S.A. ~AKSMAN - The Actl-nomgcetes, vol.2, p.333 - n 42 - ~he Williams and Wilkins Company, ~altimore, 1961 - Réi. G - ~.E. GRUNDY et coll., Antibiotics and Chem. 2, 401, - Rbi. H - "Inorganic Salts Starch Agarn _ T.G.PRIDHAM et collO, Antibiotics Annual, 1956-1957, p.951 - R~r. I - correspond à la ~ormule W-1, où 30 g de saccharose sont remplacés par 15 ~ de gluco~e - R~r. J - correspond à la ~ormule W-1, o~ 30 g de saccharose sont remplacé 8 par 15 g de glycérine - Réf. X - correspond à la iormule W-18, où 30 g de saccharose sont remplacés par 15 g de glucose .
_g_ ::

~'s ~, Ré~ correspond à la formule ~-18, o~ le saccharose est suppri-mé et remplacé par de petites bandes de papier ~iltre im-mergées partiellement dans le liquide Réf. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria"-Society oi American ~acteriologist~, Geneva, N.Y.

Réf. N - "Plain Gelatin" -préparé suivant le~ indications du "Manual of Methods for Pure Culture Study of Ba~teria"-Society of American Bacteriologists, Geneva, N.Y., Réf. P - ~ait écrémé en poudre commercial reconstitué selon les indications du ~abricant Réi. Q - Milieu indiqué pour la recherche de la production de H2S par : H.D. TRESNER et ~0 DANGA-Journal o~ Bacterio-logy, ~ 239-244~ 1958.

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- bacteriostatic activity in vitro:
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10387 ~ 36 ~ e 31.559 RP shows bacteriostatic activity which is exerted in particular on certain bacteria taking the Gram stain.
~ 'bacteriostatic activity of the sodium salt of .31.559 RP against a certain number of germs has been detected undermined by one of the dilution methods commonly used in this ef ~ and. For each germ we have determined the smallest concentration of active substance which, under conditions finished, prevents any visible development in a broth.
nutritious. ~ es results of various determinations are collated in table I ~ below where the concentra-minimum bacteriostatic values are expressed in micrograms of substances per cm3 of test medium:
TA ~ LEAU II

Concentrations . Bacterial organisms tested minimum bacteriostatic . (in u ~ cm3) .
Staphylococcus aureus, strain 209 PA ~ CC 653 ~ 0.8 Staphylococcu3 aursu3, strain Smith 2.5 Sar ¢ ina lutea - ATCC 9341 1.9 Streptoooccus faecali ~ - ATCC 8043 0.5 Streptococcus pyogenes hemolyticus, strain. 0.8 Dig 7 (In ~ titut Pasteur) Diplococcus pneumoniae ~ Til strain 0.2 (Pastor Institute) Neis ~ eria ¢ atarrhalis (A152, InstitutP ~ st ~ ur) 50 ~ acillus subtilis - ATCC 6633 0.8 9aclllus cereus ATCC 6630 0.5 Myoobacterium species - ATCC 607 25 Esoheriohia coli - ATCC 9637> 150 .. Shigella dysenteriae, Shi ~ a ~> 150 (In ~ titut Pasteur) Salmonella paratyphi A (strain Lacasse ~> 150 Institut Pasteur ~
Salmonella schottmuelleri (paratyphi B), ~ 150 (Fougenc strain, Pasteur Institute) Proteus vulgaris> 150 Pseudomonas aeruginosa> 150 _ ~. ~

~ oxicitis: 1038786 Cheæ le chick, the daily dose 50% (D ~ 50) of salt sodium of 3? 1 ~ 559 RP is 150 mg / kg po in administration;
unique.
Anticoccidial activity: -~ 'anticoccidial activity of the sodium salt of 31.559 RP was ~ determined in the infested chick in particular by ~ imeria tenella and Eimeria acervulina.
~ 'anticoccidial activity of the sodium salt of 31,559 RP in ¢ involved in food manifests ~ concen-non-toxic trations comprised between 0.005 and 0.04% by weight of product contained in the food.
Anti-malaria acity , ~ e sodium salt of manifest 31.559 RP ~ also antimalarial activity vis-à-vis experimental infestations mental to pla ~ modium of chick and mouse.
~ 'producing organism of the anti-o ideto 31.559 ~ P
is a streptomyce souohe ~ gul a ~ té lsolée from a ~ soil sample taken from India, to which has been assigned BU ~ DS number 24-367. A sample was deposited at Nor-the? rn Regional Resear ¢ h Laboratory of the US Department of Agri ¢ ulture at PeDr ~ a, Ill. (United States) ~ where it was registered ~ OU8 the reference ~ RR ~ 5787.
~ The isolation of this strain was carried out in the general method which consists of putting a small amount tlté of soil suspended in sterile distilled water ~ a dilute the suspension at different concentrations ~ and ~ é ~ aler a small ~ olume of each dilution on the surface of cans Petri dish containing a nutrient medium. After an incubation ~; ~ 30 of a few days at 25C, which allows microorganisms to develop, the colonies that we want to isolate in order to ~. . -follow the study are taken and transplanted onto agar plates '' ,,:
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~ 0 3 87 8 6 inclined tritives in order to obtain more abundant crops.
The ~ streptomyces DS 2 hatch ~ 367 is related to Streptomyces hy ~ ro ~ copicus space whose characteristics these are defined by HD ~ R ~ Sl ~ ER and E J. ~ ACK ~ S
(Applied r ~ crobiology, 4, 243-250, 1956) and by SA WAKSMAN
(The Actinomycete ~, II, ~ he Williams and Wilkins Company, Bal-timore, 1961, p. 230-231), it is for ~ uoi she was designated by the name ~ Stre ~ __ ~ vces hy ~ roscopious ~ strain DS 24.367.
S. hy ~ roscopi-cu-s DS 24.367 indeed presents the three following characters ~, which correspond to the three characters teristics for which HD TRESNEn and E, J. ~ CKUS as well that SA WAKSMAN define the species S. h ~ y ~ rôsco ~ icu ~:
a) se ~ ~ porophores generally end in spi-rales ~ errées having a winding of a few turns; these ~ po-rophore ~ spiral are usually grouped ~ along a fi-lament by forming more or less elongated clusters, b) its porous my ¢ ~ air lium ~, when it has arrived ~ at a good ~ development stage ~ shows a dark gray color corresponding to that minted by the space S. hygroscopicus, c) ~ certain culture media allowing good development-ment of aerial mycium, appearance by aging in surface ~ black spore-forming ~, shiny, wet-looking, characteristics of the species S, _h2 ~ æsco ~ icus.
Dan ~ the case of S. hygro ~ copicus DS ~ 4.367, training of aerial mycelium. does not occur often.
abundant, ~ having the same defect on a certain number 1 ~) 38786 culture media. ~ as a gray spore-forming aerial mycelium appar ~ t, formation by life ~ llissement black areas, when-as it takes place, is usually only done in one way fairly discreet, and it is limited to small dots or small areas distributed in places on the aerial mycelium rather than on its entire surface. She is however mani ~ este and it can ~ be observed ~ e especially on agar with Pridham yeast extract, on ~ arine agar vein and Pridham tomato extract, and on agar ~ lucose-asparagine.
~ a strain Sh ~ grosco ~ icus cit ~ e as reference by SA WAKSMAN in "The Actinomycetes" shows, on the few culture media where its morphological aspect is described, what only small differences with strain DS 24.367, including more appreciable is that it forms a mycelium aerial on gelo ~ e nitrate with sucrose and ~ ur agar nutri-tlve ~ while on these two media 1 ~ strain DS 24.367 not form, more ~ on a medium containing sacoharose as a source of car ~ one, S. hy ~ rosco ~ icus does not reduce nitrate8 while under the same conditions the strain DS 24.367 strongly reduces nitrates to nitrites. However ~
these few di ~ ferences ~ on ~ too small to dis-tlngue strain DS 240 ~ 67 of the species ~ S. hygroscopicus of which it presents by ~ illeurs the ~ main ¢ characteristic ~
~ serving to derive it.
Sh ~ roscoPicus DS 24.367 ~ elm spo chains res which, in general ~ general ~ end in spirals ~ errées of a name-limited number of turns, raxement greater than 3 or 4, although, oc-occasionally, we can observe spirals ~ orming a name-more important rounds, or also ~ a few spore chains simply bent in their terminal part without forming a full turn, or read or less loose spirals and , ) 38786 d ~ rouléesO ~ 'sporiferous device has a cluster structure, the spiraled sporophores, capable of presenting themselves ~ my some ramifications, being inserted along a ~ main ilament - -cipal which can reach quite a long length. ~ spores are oval to cylindrical, measuring 0.8 to 1.0 ~ / 0.6 to 0.8 ~.
Microscopic examinations have shown identical organization of the sporif ~ re apparatus on Bennett agar and on avoi agar-ne Pridham tomato. By its mode of sporulation, S. hygrosco-~ icu8 D ~ 24 ~ 367 is located in the SPira section of the classification-tion of Pridham.
S0 hy ~ roscopicus DS 24.367 develops well at 25C, a little worse at 37C ~ and does not develop ~ 50C. In ~ e8 cultures carried out at 25C, it presents the bio-following chemicals:

-productlon of ~ elanine: negative -productio ~ of negative H2S s -ty ~ osinase s negative -llquéfaction do gelatine: po ~ itive -use of cellulose: positive -production of nitrites ~ from nitrates: forteme ~ t positive - starch hydrolysis: positive ~ culture on milk: peptonigation3 years coagulation; little pH variation in 1 month i ~ es cultural characteristics of streptomYces hygroscopi-CU8 DS 240367 are gathered in the table below. This are those of culture arrived at a good stage of development, i.e. about 2 to 3 weeks ~ 25C unless stated3 contrary. These characters were observed on nu-tritive5 and broths usually used to determine le3 morphological characters of streptomyces strains, ., , ... . ... ...
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1 ~ 38 ~ 86 cultures on agar media being e ~ fb ~ killed on agars inclined. A number of the culture media used have been prepared according to the formulas indicated in "~ he Acti-nomycetes ~ '(SA WAKSMAN, p. 193-197, Chronica Botanica Company, Waltham, Mass., US ~., 1950); in this case, they are indicated by the letter W followed by the number assigned to them in "The Actinomycetes". ~ re ~ erences or constitutions of others culture media are as follows:
- D ~. A - Bennett's Agar "- SA WAKSMAN - The Actinomycetes, flight. 2 ~ PO 331- n 30 - The Williams and Wilk ~ ns Com-pany, baltimore, 1961 - Ré ~ OB - "Hickey and Tresner's Agar" - TG PRIDHAM et al., Antibiotics Annual, 1956-1957, p. 950 - ~ éi. C - Formula W-23, added with 2% agar - D ~. D - "Yeast Extract Agar" - TG PRIDHAM et al., Anti-bioti ¢ s Annual "956-1957, p. 950 - R ~ i. E - "Tomato Paste Oatmeal Agar" - TG PRIDN ~ and ooll.
Antlblotics Annual, 1956-1957, p. 950 `
- Ref. ~ - "Melanin ~ ormation medium" - SA ~ AKSMAN - The Actl-nomgcetes, vol.2, p.333 - n 42 - ~ he Williams and Wilkins Company, ~ altimore, 1961 - Réi. G - ~ .E. GRUNDY et al., Antibiotics and Chem. 2, 401, - Rbi. H - "Inorganic Salts Starch Agarn _ TGPRIDHAM et al, Antibiotics Annual, 1956-1957, p.951 - R ~ r. I - corresponds to ~ W-1 ormule, where 30 g of sucrose are replaced by 15 ~ gluco ~ e - R ~ r. J - corresponds to ~ W-1 ormule, o ~ 30 g of sucrose are replaced 8 by 15 g of glycerin - Ref. X - corresponds to the iormule W-18, where 30 g of sucrose are replaced by 15 g of glucose .
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~ 's ~, Ré ~ corresponds to the formula ~ -18, o ~ sucrose is suppri-mé and replaced by small strips of paper ~ iltre im-partially immersed in the liquid Ref. M - "Manual of Methods for Pure Culture Study of Bacteria" -Society oi American ~ acteriologist ~, Geneva, NY

Ref. N - "Plain Gelatin" -prepared according to ~ indications of "Manual of Methods for Pure Culture Study of Ba ~ teria" -Society of American Bacteriologists, Geneva, NY, Ref. P - ~ has skimmed into commercial powder reconstituted according to indications of the ~ manufacturer Réi. Q - Medium indicated for research into the production of H2S by: HD TRESNER and ~ 0 DANGA-Journal o ~ Bacterio-logy, ~ 239-244 ~ 1958.

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a capacité de Streptomyces h~oscopicus DS 24.367 à utiliser diverses sources de carbone et d'azote pour assurer ~on d~veloppement a ét~ déterminée sui~ant le principe de la méthode de Pridham et G~ttlieb (J. o~ ~act. 56, 107-114, 1948) ; le degré
de développement a ét~ observé, après un temps convenable d'incu-bation à 25C, sur le milieu de base indiqué par les auteurs en remplaçant soit le glucose par les diverses sou~ce9 de carbone xespectivement essayées, soit S04(NH4)2 par le~ dlverses sources d'a~ote respectiveme~t es~ayées. ~es résultats sont i.ndigués dans le tableau ci-dessous: :

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D-Xylose po~itive, 3 positive :~

I-Arabinose positive N2Na positive ~-Rhamnose positive S04(NH4)2 positive D-Glucose positive P04H(~H4)2 positive DbGalactose posltive, Urée po3itive mais lente D-~ructo~e positive I_Asparagine posltive D-Manno~e posltive, Glucosa~ine positive mais lente ~-Sorbose n~gative Glycocolle positive ~actose positive .Sarcosine positive Maltose négative D~-Alanine posltlve ~aocharose positive D~_Valine positive Acite ~réhalo8e poslti~e IL-aspartigue positive Cellobiose positi~e ~-glutamique positlve Raf~inose positive I Areinine po~itive .
Dextrlne positive ~-Iyslne positive . Inuline positi~e DI-Sérine positive : :
Amidon positive DI-Thréonlne positiYe ~ :
Glycogène po~ltive D~-N~thionlne négative j .
lycérol positi~e Taurine négativ~ ~
: Erythritol négative D~-Phény~b~n~ mais lente ...

Adnnltol po~ltive ~-Tyrosine po~itive . .
Dulcitol négative DL-Proline ositive ~3 ~ D-Y~nnltol positive I_Hydro2ypr~ine ositive ;~ ~ D-SorbitoL n~gative ~-Histidine ositive ..
~nositol négative I-Tryptophane ositive, ~ : . mais lente -;~. Salicine négative . Bétaine négative . . .
-16(bis)- .

1~)38786 ~ e procédé de préparation de 31~559 RP consiste essen-tiellement à cultiver Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 ou ses mutants producteurs sur un milieu et dans des conditions appropriés et à séparer le produit formé au cours de la culture.
~ a culture de Streptomyces hydroscopicus DS 24.367 peut ~tre effectuée par toute méthode de culture aérobie en sur-face ou en pro~ondeur mais cette dernière est à préférer pour des raisons de commodité. On utilise à cette ~in les dif~érents types d'appareils qui sont d'un usage courant dans l'industrie des fermentations.
On peut en particulier adopter la marche suivante pour la conduite des opérations:
Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 - stock culture sur gélose culture en flole agitée culture inoculum en iermenteur .,' 1 culture de production en fermenteur ~e milieu de iermentation doit contenir essentiellement une sour-ce de carbone et une æource d'azote assimilables, des éléments 'f minéraux, en parti~ier des chlorures, et éventuellement des raoteurs de croissance, tou~ ces éléments pouvant etre apportés 80U9 ~orme de produits bien dé~inis ou par des mélanges comple-xes, tels quton en rencontre dans des produits biologiques d'origines diverses.
Comme ~ources de carbone assimilable, on peut utiliser de~ hydrates de carbone tels que le glucose, les deztrines, l'amidon ou d'autres substances hydrocarbonées comme des sucres a}oools (glycérol) ou comme certains acides organiques : acides lactique, citrique. Certaines huiles animales ou végétales .

1~ 3 87 ~ 6 comme l'huile de lard ou l'huile de soja peuvent remplacer avan-tageusement ces di~férentes sources hydrocarbonées, ou leur 8tre ad~ointes.
~ es sources convenables dlazote assimilable sont extra-ment vari~es. Elleæ peuvent atre des substances chimiques très simples comme le~ Rels minéraux ou organiques dlammonium, llurée, certains acide~ ~minés. Elles peuvent aussi être apportées par des sub~tances complexes contenant principalement l'azote sous ~orme protidique; caséine~ lactalbumine, gluten et leurs hydroly-sats, ~arine de soja~ dlarachide, de poisson, extraits de vian-de, de levure~ distillers' solubles, corn-~teep.
Parmi le~ él~ments minéraux a~outés, certains peuvent avoir un ef~et tampon ou neutralisant comme les phosphates alca-lins ou alcalino-terreux ou les carbonates de calcium ou de ma-~nésium.D'autresapportent l'équilibreionique nécessaireau développe-ment de Streptom~ce~ ~y~ro~copicus DS 24 367 et à l'élaboration du 31.559 RP comme les chlorures et sulfate3 de~ métaux alcalin~
et alcalino-terreux. En~in certains a~i~sent plus ~p~cial~ment oomme activateurs des réactions métaboligues de Streptomyces ~Y~roscopicus DS 24.367, ¢e sont les sels de zinc, de cobalt, de ~er, de cuivre, de manganase.
~es ~acteurs de croissance sont de~ produits de nature ~itaminique tels gue la ribo n avine, l'acide ~olique~ l'acide pantothénigue, ~e pH du milieu de ~ermentation de départ de la culture doit être compr~s entre 5,8 et 7,8 et de pré~érence entre 6,2 et 7~4. ~a température optimale pour la ~ermentation est comprise entre 25 et 30C, mais une production satis~aisante est obtenue pour des températurès comprises entre 23 et 33C. ~!aération de la fermentation peut varier entre des valeuræ assez larges.
On a cependant trouYé que des aérations de 0,3 ~ 3 litres d'air par litre de bouillon et par minute conviennent particulièrement ~ 387~6 bien. ~e rendement maximal en 31.559 RP est obtenu apr~s 2 à 8 jours de culture~ ce temps dépendant essentiellement du milieu util~s~.
Dlaprès ce qui précade, on conçoit que les conditions gén~rales de la culture de Streptomyces ~ygroscopicus DS 24.367 pour la produetion du 31 559 RP peuvent varier dans une lar~e mesure et être adaptées ~ chaque nécessité particulière.
~ e 31.559 ~P peut 8tre isolé des mo~ts de ferme~tation de la manière ~uivante:
~e mo~t e~t ~iltré ~ un pH acide~ généralement compris entre 3 et 6 et de préférence voisin de 5. ~activité retenue dans le ~teau de filtration en est extraite à llaide d!un sol-v~nt approprié, alcool inférieur, par exemple le m~thanol ou un ~olvant chloré tel que le chlorure de méth~lène.
Aprbs un traitement alcalin approprie le 31.559 RP peut ~txe isolé SOU5 ~orme de sel de sodium à partir de~ solutions mentionnées ci-dessus par cri~tallisatlon~ après concentration sou8 pressio~ réduite éventuellement suivie d!une dilution par un non-solvant on un mauvais solvant et d'un séjour en chambre ~roide.
~e 31 559 RP ou son sel de sodium peut être purifi~
par le~ méthodes classiques en usa~e, telle que la cristallisa~
tion, la chromato~raphie sur diver~ a~ents adsorbants ou la dis-tribution à contre-courant.
~exemple suivant, donné à titre non l~mitatii, montre comment llinvention peut être mi~e en pratique.
Exem~le-~) - Fermentation On char~e dans un fe~menteur de 170 litre~:
30 - peptone 1200 g - extrait de levure ... 600 g .

.

- 1~3~3786 - -glucose monohydraté 0.. 1200 g -g~lose ~O~ 240 g -eau de ville compl~ment pour .................. 110 litres ~ e pH est ajusté à 7~30 par addition de 70 cm3 de coude 10 No On ~térilise le milieu par barbotage de ~apeur ~
122~ pendant 40 mlnutes. Après refroidi~sement, du fait de la condensation de la vapeur au cours de la stérilisation, le volu-me du bouillon est de 120 l~tres et le pH est de 6,85. On ense-me~ce alor3 avec 290 cm~ d'une culture en erlenmeyer agité du Streptomyce~ hygroscopicus DS 240367. ~a culture est developpée 27-C penda~t 25 heures en agitant et en aérant avec de l'air ~térile; elle e~t alors convenable pour l'ensemencement de la culture productrioe.
~ a culture produ¢trice est e~fectu~e dans un ~er-me~teur de 800 litre B chargé a~ec les substances suivantes:
- dlstiller~' solubles .0O 2 kg - haricot~ en grains ... 10 kg - glycérlne ... 6 kg - ohlorure de sodium ... 2 kg - solutlon de chlorure de cobalt hexa-~y.draté, à 20 g/l ... 0,4 litre - eau de ville qOs.p.......................... .365 lltres ~e pH du milieu est a~usté a 7,50 par addition de 200 cm3 de soude 10 N, puis on st~rilise le bouillon par barbotage de ~apeur à 122C pendant 40 minutes. Après refroi-di~sement, du ialt de la condensation de la vapeur au cours de 1~ et~rilisation~ le volume du ~ouillon est de ~90 litres; il est complété à 400 litres par addition de 10 litres de ~olu- . .
t~o~ aqueuse stérile contena~t: :
~ gluco~e mo~ohydrat~ ,.0 4 kg :
~e pH du milieu e~t égal à 6,65; on ensemence avec 40 litres de la culture inoculum en fermenteur de 170 li-., , 1()38786 ~xes décrite ci-desæu~O La cultur~ est developpée A 27C durant ~13 heure~ en agitant avec une turbine tournant ~ 205 tourg/minute et en aérant avec un volume d'air ~térile de 20 m3/hO En fin d'o-p~ration, le pH de la culture est de 7,65 et le volume de 380 li-tres.
B) - Extraction _________ 400 litres de mo~t obtenu comme indiqu~ précédemment sont amenés ~ pH 5 par addition de 2,8 litres d'une solution d'a-cide cblorhydrique 6 ~ puis agité~ pendant une demi-heureO Après addition de 20 k8 d'ad~u~art de filtration~ le mo~t est filtré
sur ~iltre-preaee et le gateau d~ filtration est lavé sur le filtre par 100 litre~ d'eau dont le pH est a~usté ~ 5 par une ~olutio~
d'aclde chlorhydrique 6 N. Le iiltrat et le lavage sont élimin~s.
~e gâteau de filtration est délité dans 300 litre~
de m~thanol~ le mélange obtenu a~usté à pH 7 par addition de 200 cm3 de ~oude 6 N et agité pendant une demi-heure.
~e mélange est filtré sur filtre-pre~se et le g~teau de iiltration la~ sur le filtre par 80 litres de méthanol. ~e ~lltrat et le la~age sont r~unis et concentrés sous pression r~-dulte (5 à 10 mm de mercure) de façon à obtenir 30 litres de con-oentrat aqueux. Ce concentrat est a~usté ~ pH 3 par addition de 290 om3 d'acide chlorbydrique 6 N~ puis agit~ pendant 10 minutes en présence de 30 litres de chlorure de méthylène. ~es deux phases ~ont s~parées. On extrait encore deu% fois selon ce procédé la phase aqueuse par 30 litres de ohlorure de méthyl~ne ~ chaque rois.
~es trois e~traits chlorométhyléniques sont r~unia et agités avec 9 litres d'eau~ e~ acidifiant ~u~qu'à obtention de pH 3 dans la pha~e aqueuse (20 cm3 d'acide chlorhydrique 6 N)o Ia pha~e org~nique est séparée et lavée par 18 litre~ d'eau, en ajou-tant de la soude jusqu'~ obtentio~ de ~H 9,5 dans la phase aqueuse ( 20 cm3 de soude 6 N).
Ia pha~e chlorom~thyl~niqu~ est concentrée 80us pre~-.. ,....... , . ,. , " ., , .. -,. ., ,.. , - , . .. . .

:1~3~786 sion r~duite ( 5 à 10 mm de mercure) ju~qu'au volume~d~ 1 litre.
C) - Purification ___________ ~ e concentr~ chlorom~thyl~nique obtenu pr~c~dem-ment est vers~ lentement dans 10 litres d'hex~ne ~ la tempéra-ture amblante.
~ a solution est filtrée, on sépare ainsi 6~ g d'un insoluble ~nacti~.
~ e ~iltrat est concentré 80U8 pression réduite ( 5 ~ 10 mm de mercure) ~u~qu'à un volume de 0,5 litre environ.
Cette solution est agitée pendant 2 heures à la température de oa pu18 on laisse reposQr 24 heures à +4C.
~es cristaux obtenus sont isolés par centrlfuga-tion de la solutlon puis la~és par 250 cm3 d'hexane ~ +4C et s~ohés sous pression r~duiteO
On i601e ainsi 103 g du sel de sodium du 31.559 RP.
D) - Recri~tallisation _________________ .
57 B du ~el de sodium du 31~559 RP préc~demment obtenu sont mis en solution dans 1~2 litre d'ac~tone et agit~s , pendant 15 minutes. On a~oute 2~5 g de noir décolorant lavé ~
l'aoide chlorhydrique, pUi8 agite à nou~eau pendant une demi-heure et enfin s~pare le noir décolorant par filtration.
~e filtrat agité lentement ast add~tionné de 750 om3 d'eau di~till~e. ~e sel de sodium du 31.559 RP cr~tallise lentement à la température de 0C~
~es cristaux so~t 1#ol~8 par ~iltration? lav~s par 150 cm3 du m~lange acétone/eau (50-50 en volumes) et ~ch~s ~OUB pres~ion r~duite à 35C.
On obtient 35 g du sel de ~odium du 310559 RP-Par concentration de~ eaux-mères ~ la moitié de leur volume init~al, puis re~roidi~sement ~ 4C~ on obtient nou~esu 13,2 g de se,l de sodium du 310559 RPo ~n autre ob~et de la prése~te inventio~ est cons-: , . . . ., ., .. .. , , : ; .,~ . . ., :

~ 38786 titué par les compositions anticoccidiennes qui contiennent le 31.559 RP ou se~ sels métalliques ou ~els avec les bases azotée~
et, plu~ particuli~rement, par le~ aliments mixtes pour animaux ou le~ m~langes concentr~ pour l'ali~entation animale renfer-mant le 31.559 RP ou ses ~els métalliques ou ~els avec leR base~
azotée~, éventuellement en présence d~un autre agent anticocci-dien. Ce~ compositions sont particuli~rement utiles pour lutter contre la coc¢idiose des volatile~ et plus spéci~lement de la volallle, ~a do~e néces~aire pour produire un e~fet convena-ble peut naturellement varier dan8 dla~sez large# limites sui-~ant la valeur des aliments eux-memes, D~une façon g6nérale, $1 ~uiilt que les rations ali-menta~re# misesà laaisposition des animau~ cont~e~nent de 0,005 0,04 % en poids de 31.559 RP ou de ses sels métalliques ou ~els ~oc les bases azotées.
~e 3~0559 RP ou ses sels métalliques ou sels avec le~ bases azoté~s peut être réparti en disper~ion uni~orme dans le~ aliment~ ¢omposés complets aux doses ci-dessus, I1 peut atre répartl da~s les aliments ¢omplémen-talres ~ une dose de 09025 à 1%, le plu8 souvent ave¢ d~autres addltifs tels que ~itamines et sels min~rauxO Ces aliment~ com-plémentalres peuvent etre soit mélangés à la ration~ soit con-so~més tels guels~ et représentent habituellement 5 à 20% de la ration.
~es "prémixes"~utilisés pour la préparstion de~ ra-tions ¢omplbtes ou des aliments complé~entaires contiennent ha-bituellement de 0~05 ~ 20% de 31.559 RP ou de ses sels métalli-queo ou sels avec les bases azotées dilu~ dan~ u~e charge alimen-taire. Il~ con~tituent un intermédiaire commode facilitant la ré- ;
partition uniiorme du produit actii dans les aliments. ~es pré-mixes eux-même3 eont généralement obtenu~ ~ partir de concentré 9 qui ~ontien~lent de 99,9 ~ 20% de 31,559 RP ou de ~e~ sels m~-talliques ou sels avec le~ bases azotée~ additionn~ de dénatu-rant~ comestibles telæ que colorants alimentaires, aromatisants, agents dispersant~ ou évitant l'agglomération et charges alimen-ta~res.
~es concentr~s et prémixes sont généralement pul_ -véxulents. Les aliments complémentaires et le~ aliments composés complet~ peuvent être soit pulvérulent~, soit sous ~orme de Bra-nulé~ pr~parés ~elon les technique~ habituelles.
~exemple ~uivant, donnée à titre non limitatif, illu~txe une campo~ition selon l~invention.
_ emple A:
On prépare un ali03nt ayant la composition suivante:
- farine de~s is~ue~ de céréales 0-- 13~41%
- farine d~orge ... 13,41~
- ~rine de mais ..- 13~41%
- farine de blé ... 31,32%
- ~axine de poi~on 0O. 8~9~%
- ~arlne de so~a ... 8,92%
- farine de ~ourrage déshydraté- ... 4~56%
- extrait~ de levure ... 2,33%
- lait ~ec en poudre ... 2,68%
- ~hlorure de sodium Ø 0.09%
- chlorure de calcium ... 0~89%
- élément~ minéraux ... 0~06%
- complexe vitamlniques vitamine A ... 4000 UI/kg vitamine D3 0.. 1000 ~I/kg chlorure de choline O.. 11,5 mg/kg ribo~lavine 0.. 2,24 mg/kg , 1~38786 A cet aliment9 on ajoute et r~partit uniformément 0,02% de sel de sodium du 31.559 RP.
Un autre objet de la pr~sente invention est consti-tué par les compositions utilisables comme facteur de croissance chez les ruminant~ (bovins, ovin~ caprin~) et comme agent de lut-te contre la dysenterie des porcs.
Ce~ compositions æont constituées par les aliments mixtes pour les ruminants et les porcs et par les méla~ges concentr~ pour l'alimentation animale renfermant l'antibiotique 31.559 RP ou ses sels.
~ a dose nécessaire pour produire un e~fet convenable peut naturellement ~arier dans de larges limites sui~ant les es-pè¢es animales et suivant la valeur nutriti~e des aliments eux-m~mesO
Il est particulièrement avantageux de mettre 8 la disposition des snimaux une quantité Journslière d'antibiotique 31.559 ~P compri~e entre 50 et 250 mg psr t~te d'snimal.
De préférence l'antibiotique 31.559 RP e~t réparti dans des aliments complémentaires qui en contiennent de 0,01 a 0~1%,1e plus sou~ent avec d'autres additifs tel~ que vitami~es et sele minérauxO Ces aliments complémentairee peuvent etre soit mélan-gés ~ laration soit consomméstels quel~ et ils représentent habi-tuellement environ 1 à 10% de la ration Journalière; le 310559 RP
oorrespond à 0,0001-0,01% en poids de la ration journalière, ~ es"prémixes", utilisés pour la pr~paration des ra-tions compl~tes ou des aliments complémentaire~ contiennent géné-ralement de 0~1 à 5% d'antibiotique 31.559 RP dilué dans une char-gè alimentaire~ Ils constituent un intermédiaire commode facili-tant la r~partition u~iforme de l'antibioti~ue 31.559 RP dans 30 ~ le~ aliments ~es "prémlxes" eux-mames sont généralement ob-_25-.. . ... . . . . . . .

~38786 tenus ~ partir de concentr~ qui contiennent 99,9 ~ 5% d'anti-biotique 31~559 RP additionné de d~naturants comestibles tels que colorant~ alimentaire~, aromatisants, agents dispersants ou itant l'agglom~ration et charges alimentaires.
~es concentré~ et "prémixes" ~ont généralement pulvérulent~, ~e~ aliments complémentaires peuvent être soit pulvérulents soit 50US foxme de granulé~ préparés ~elon les tech-niques habituelle~ Dans ces compositio~s, l'antibiotique 31,559 RP ou ses sels peut 8tre sous forme de fine~ particules libres ou recouvertes d'un enrobage.
~exemple suiva~t, donné ~ titre non limitatif, montre l'utili~ation de ~antibiotique 31.559 RP comme facteur de croissance:
Exemple BL
Douze ~eunes boeuf~ de race Holstein sont placés aans des oellules individuelles dont la ~urface moyenne est de 48 m puis so~t pesés.
~es aliment~ à étudier sont dlstribués à partlr du Jour 0, Jour de la mise en place de l'sssai.
~es boeufs sont en~uite pes~s au bout de 28 ~ours pUi8 de 56 Jours et le poids des aliments consommés pendant oette période est déterminé.
~e~ moyennes des gains de poids et de taux de con-verslon alimenbalre so~t déterminés pour cha~ue allment étUdié
aans le~ i~tsrvalles 0-28 Jours et 28-56 Jours.
~e~ anlmaux reçoivent leur nourriture deux fois par Jour. ~a ration Journalière est d~terminée de telle ~orte '' .,~.
,;.
~ p - 26 -, .

.. `` ., ' ' - . . ' .... ~ . ' , . : , ' . '. !- ' . . ' ' .

1~3~7~6 que les boeufs absorbent le maximum de nourritl~re sans en laisser.
Dans l~essai~ les jeunes boeufs sont répartis en 3 groupes. Chaque animal re~oit un aliment de ~ase qui est constitue de mais, de foin et d'un supplement proteique.
Chaque animal du groupe I reçoit l'aliment de base.
Chaque animal du groupe II rec,oit l'aliment de base dans lequel le supplement proteique contient 100 mg d'antibiotique 31.559 RP.
Chaque animal du groupe III reçoit l'aliment de base dans lequel le supplement proteique contient 200 mg d'antibiotique 31.559 RP.
La ration journalière moyenne par animal a la composi-tion suivante:

_ _ ~ _ Groupe IGroupe II_Groupe III
mais 8,86 kg8,96 kg 8,91 kg foin 1,46 kg1,45 kg 1,47 kg supplément proteique~ 0,49 kg 0,5 kg 0,Sl kg antiblotique 31.55g RP I100 mg 200 mg ~Le supplément protéique utilisé est le "PRO BLEND 50" marque de commerce de la Société Landmarck, Inc., qui se compose en parti-culier de:
~quivalent protéique total7/50% , lipides 71%
fibres végétales ~9 vitamine A -765.000 unites/k~
Les résultats obtenus sont rassembles dans les tableaux suivants:

1~)38786 ;
I - Poids mo~en en kg (par animal) , ,. .
au ~our 0 à 28 ~our~ ~ 56 jour~ ~:~
. __ ~ -' ~ . ' Groupe I 285,1 325,2 374,5 :~
.- . .... _ ... .
Groupe II 284,9 325,2 381,1 . .
Groupe III 286,6 333 387 II - Variatlon du ~oids mo~en et taux de conversion . _ , 0-2l Jourl A .__ _ 28-5i jour3 0-56 Jour~ _ Groupe Groupe ~roupe Gr~e Gr~4~ Gro~ Groupe Groupe Gro~e . I II ~I I II III I II III
__ . . .
G~ln de poid~
mo~en en kg par anlmal 40,1 40,3 46~4 49,3 55,9 54 89,4 96,2 100,4 ..
Gain de poids moyen en kg par ~our par :- :-. anlmal 1~43 1~44. 1~65 ~76 1,99 1~93 1~59 ~72 1,79 _ ...... . , ' ' Consommation . ;
mo~enne en kg par Jour . . ~ .
3o par animal 9~83 9~76 9,84 11,78 12,5 ~1,94 10,81 lO,9 I0,89 :~ _ . __ __ ~aux de .
conver~ion 6~86 6,77 5,94 6,70 6,04 6,19 6,77 6,34 6,08 .:.

.
_28-.

. .

1~3~7~36 Ainsi pendant le~ 28 premiers jours, les animaux rece~ant 100 mg par tate et par ~our de 310559 RP ont un gain de poids de 3% ~up~rieur et un taux de con~ersion de 1,3~ ini~-rieur à ceux des animaux témoin~ et ces pourcentage~ sont respec tivement de 15~3% et 13,4% pour les ~nimaux recevant 200 mg par t~te et par ~our de 31O559 RPo Pendant la seconde p~riode (28-56 ~ouræ), les zni-mau~ recevant 100 .m8/~our de 31.559 RP dépaæ~ent ceux recevant la dose la plu~ ~orte. ~es gains de poids 80nt alors de 13,4%
supérieur~ et les taux de conversion de 9,8% iniérieurs ~ ceux des t~moins ~ la dose de 100 mg/~our et ce~ pourcentages sont respectivement de 9~6% et 7~6% pour la doæe de 200 mg/Jour.
Sur la période totale de l'essai (56 jouræ), les gains moyen~ ~ournaliers sont améliorés de 7,8% et 12,2% et les tBUX de converaion de 6~4~ et 10~2% par rapport aux témolns, aux do~e~ re~pectl~es de 100 et 200 m ~ ~our de 31.559 RP.

, .
.

-29~ 3 o ~ O ,, : ~ v ~, ~ ~ a ~, v ~
o U ~ ~ U
0 1 ~ 0 ta X ~. ~ a) oo .c ~
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`~ ~ ~ 0 ~ Z p ~ Z: Z; Z
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_ ~ rl V t ~ E s ~ o ~ ~ v ~ c ~ o ~ n ~ o ~ .....
V op ~ ~ 0 ~ O ~ 3 ~ 3 c ~ - V c ~ o '.,: ....

. . .

has capacity of Streptomyces h ~ oscopicus DS 24.367 to use various sources of carbon and nitrogen to ensure ~ on development was determined based on the principle of the method de Pridham and G ~ ttlieb (J. o ~ ~ act. 56, 107-114, 1948); degree development was observed after a suitable time of incu-bation at 25C, on the basic medium indicated by the authors by replacing either the glucose by the various sou ~ ce9 carbon xespectively tried, ie S04 (NH4) 2 by the ~ dlverses sources a ~ ote respective ~ t es ~ ayées. ~ the results are i.ndigued in the table below:

, . '' : "., ~ ''.
1 ~ ,, , ................................................. .................
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! ~. ...
'' ~ ~, '.
'1 ('' `- '~', _ 16 - ~

`10 3 87 8 6 . _ _ Carbon sources Nitrogen sources tried ~ Use tried ~ Use . ,. ~ ~:
D-Xylose po ~ itive, 3 positive: ~

I-Arabinosis positive N2Na positive ~ -Rhamnose positive S04 (NH4) 2 positive D-Glucose positive P04H (~ H4) 2 positive DbGalactose posltive, urea po3itive but slow D- ~ ructo ~ e positive I_Asparagine posltive D-Manno ~ e posltive, Glucosa ~ ine positive but slow ~ -No sorbose positive Glycocolle positive ~ positive actosis. Positive sarcosine Maltose negative D ~ -Alanine posltlve ~ positive aocharosis D ~ _Valin positive Acite ~ rehalo8e poslti ~ e IL-aspartigue positive Cellobiose positi ~ e ~ -glutamic positlve Raf ~ inose positive I Areinine po ~ itive.
Dextrlne positive ~ -Iyslne positive . Inulin positi ~ e DI-Serine positive::
Positive starch DI-Thréonlne positiYe ~:
Glycogen po ~ ltive D ~ -N ~ negative thionlne j.
lyceol positi ~ e Taurine negativ ~ ~
: Erythritol negative D ~ -Pheny ~ b ~ n ~ but slow ...

Adnnltol po ~ ltive ~ -Tyrosine po ~ itive. .
Dulcitol negative DL-Proline ositive ~ 3 ~ DY ~ positive nnltol I_Hydro2ypr ~ ine ositive ; ~ ~ D-SorbitoL n ~ gative ~ -Histidine ositive ..
~ negative I-Tryptophan nositol, ~:. but slow -; ~. Salicin negative. Negative betaine . . .
-16 (bis) -.

1 ~) 38786 ~ e preparation process of 31 ~ 559 RP consists essen-to grow Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 or its producing mutants on a medium and under conditions separate the product formed during the culture.
~ a culture of Streptomyces hydroscopicus DS 24.367 can be done by any aerobic culture method face or in pro ~ inverter but the latter is preferred for for convenience. We use this ~ in the dif ~ erent types of devices that are in common use in industry fermentations.
We can in particular adopt the following step for the conduct of operations:
Streptomyces hygroscopicus DS 24.367 - stock agar culture shake flask culture inoculum culture in fermenter ., '1 production culture in fermenter ~ The fermentation medium must contain essentially a sour-ce of carbon and an assimilable nitrogen resource, elements' f minerals, in part ~ ier chlorides, and possibly growth promoters, tou ~ these elements can be provided 80U9 ~ elm of well defined products ~ inis or by complete mixtures-xed, as encountered in organic products of various origins.
Like ~ ources of assimilable carbon, we can use carbohydrates such as glucose, deztrins, starch or other hydrocarbon substances such as sugars a} oools (glycerol) or like certain organic acids: acids lactic, citric. Certain animal or vegetable oils .

1 ~ 3 87 ~ 6 like bacon oil or soybean oil can replace before-tagging these di ~ ferent hydrocarbon sources, or their 8tre ad ~ anointed.
~ es suitable sources of assimilable nitrogen are extra-varied. It can be very chemical substances simple like ~ Rels mineral or organic ammonium, lure, some acid ~ ~ mined. They can also be provided by complex substances containing mainly nitrogen under ~ protein elm; casein ~ lactalbumin, gluten and their hydrolyzes-sats, ~ soy arine ~ peanut, fish, vian extracts of, yeast ~ soluble distillers, corn- ~ teep.
Some of the ~ mineral elements ~ out ~, some may have a buffering or neutralizing ef ~ like phosphates alca-linins or alkaline earth or calcium carbonates or ma-~ néium. Others bring the necessary ionic balance to the development ment de Streptom ~ ce ~ ~ y ~ ro ~ copicus DS 24 367 and in development of 31.559 RP like chlorides and sulfate3 of ~ alkali metals ~
and alkaline earth. In ~ in some a ~ i ~ feel more ~ p ~ cial ~ ment as activators of the metabolic reactions of Streptomyces ~ Y ~ roscopicus DS 24.367, ¢ e are the zinc, cobalt, ~ er, copper, manganase.
~ es ~ growth players are from ~ nature products ~ itaminic such as ribo n avine, acid ~ olic ~ acid pantothenic, ~ e pH of the starting ~ ermentation medium of the culture must be understood between 5.8 and 7.8 and preferably between 6.2 and 7 ~ 4. ~ at optimal temperature for ~ ermentation is included between 25 and 30C, but a satisfactory production is obtained for temperatures between 23 and 33C. ~! ventilation fermentation can vary between fairly large values.
However, we found that vents of 0.3 ~ 3 liters of air per liter of broth and per minute are particularly suitable ~ 387 ~ 6 good. ~ e maximum yield in 31.559 RP is obtained after ~ s 2 to 8 days of culture ~ this time depends mainly on the environment useful ~ s ~.
From what precedes, we understand that the conditions general culture of Streptomyces ~ ygroscopicus DS 24.367 for the production of 31 559 RP can vary in a lar ~ e measure and be adapted ~ each particular need.
~ e 31.559 ~ P can be isolated from the mo ~ ts of farm ~ tation in the following way:
~ e mo ~ te ~ t ~ illiterate ~ an acid pH ~ generally understood between 3 and 6 and preferably close to 5. ~ activity selected in the ~ filtration head is extracted therefrom using a soil v ~ nt suitable, lower alcohol, for example m ~ thanol or a ~ chlorinated solvent such as methyl chloride ~ lene.
After an appropriate alkaline treatment the 31.559 RP can ~ isolated text SOU5 ~ sodium salt elm from ~ solutions mentioned above by cry ~ tallisatlon ~ after concentration sou8 pressio ~ reduced possibly followed by dilution by a non-solvent has a bad solvent and a room stay ~ stiff.
~ e 31 559 RP or its sodium salt can be purified ~
by the ~ classic methods in usa ~ e, such as crystallized ~
tion, chromato ~ raphie on diver ~ a ~ ents adsorbents or the dis-tribution against the current.
~ following example, given as a non-mitatii, shows how the invention can be mi ~ e in practice.
Example ~
~) - Fermentation Char ~ e in a fe ~ liar of 170 liter ~:
30 - peptone 1200 g - yeast extract ... 600 g .

.

- 1 ~ 3 ~ 3786 - -glucose monohydrate 0 .. 1200 g -g ~ lose ~ O ~ 240 g - city water completely for .................. 110 liters ~ e pH is adjusted to 7 ~ 30 by adding 70 cm3 of elbow 10 No On ~ sterilizes the medium by bubbling ~ fear ~
122 ~ for 40 mlnutes. After cooling ~ sement, due to the condensation of steam during sterilization, the volume broth is 120 liters and the pH is 6.85. We teach me ~ this alor3 with 290 cm ~ of a stirred Erlenmeyer culture from Streptomyce ~ hygroscopicus DS 240367. ~ a culture is developed 27-C for ~ 25 hours shaking and aerating with air ~ terile; it is then suitable for seeding the productrioe culture.
~ a producing culture is carried out in a ~ er-800 liter B meter loaded with the following substances:
- dlstiller ~ 'soluble .0O 2 kg - beans ~ in grains ... 10 kg - glycerine ... 6 kg - sodium ohloride ... 2 kg - cobalt chloride hexut solutlon ~ y.draté, at 20 g / l ... 0.4 liter - city water qOs.p .......................... .365 lltres ~ e pH of the medium is ~ usté at 7.50 by addition of 200 cm3 of 10 N sodium hydroxide, then the broth is sterilized by bubbling ~ apeur at 122C for 40 minutes. After cooling di ~ sely, ialt of condensation of steam during 1 ~ and ~ rilisation ~ the volume of ~ ouillon is ~ 90 liters; he is made up to 400 liters by adding 10 liters of ~ olu-. .
t ~ o ~ sterile aqueous containing ~ t::
~ gluco ~ e mo ~ ohydrat ~, .0 4 kg:
~ e pH of the medium e ~ t equal to 6.65; we seed with 40 liters of inoculum culture in a 170 liter fermenter .,, 1 () 38786 ~ xes described above ~ O The culture ~ is developed at 27C during ~ 13 hours ~ stirring with a rotating turbine ~ 205 tourg / minute and ventilating with a volume of air ~ terile of 20 m3 / hO At the end of p ~ ration, the pH of the culture is 7.65 and the volume of 380 li-very.
B) - Extraction _________ 400 liters of mo ~ t obtained as indicated ~ previously are brought to ~ pH 5 by adding 2.8 liters of a solution of-hydrochloric acid 6 ~ then stirred ~ for half an hourO After addition of 20 k8 of ad ~ u ~ filtration art ~ the mo ~ t is filtered on ~ iltre-preaee and the filter cake is washed on the filter per 100 liter ~ of water whose pH is ~ usté ~ 5 by ~ olutio ~
6N hydrochloric acid. The iiltrate and the washing are eliminated.
~ e filter cake is disintegrated in 300 liter ~
of m ~ thanol ~ the mixture obtained has ~ usté at pH 7 by addition of 200 cm3 of ~ or 6 N and stirred for half an hour.
~ e mixture is filtered on pre-filter ~ se and the cake iiltration ~ on the filter with 80 liters of methanol. ~ e ~ lltrat and la ~ age are r ~ united and concentrated under pressure r ~ -dulte (5 to 10 mm of mercury) so as to obtain 30 liters of con-watery oat. This concentrate is a ~ usté ~ pH 3 by addition of 290 om3 hydrochloric acid 6 N ~ then acts ~ for 10 minutes in the presence of 30 liters of methylene chloride. ~ es two phases ~ have s ~ ready. We still extract two times according to this process the aqueous phase with 30 liters of methyl ohloride ~ do ~ each kings.
~ es three e ~ chloromethylenic traits are r ~ unia and stirred with 9 liters of water ~ e ~ acidifier ~ u ~ that obtaining pH 3 in the aqueous phase (20 cm 3 of hydrochloric acid 6 N) o Ia pha ~ e org ~ nique is separated and washed with 18 liter ~ of water, in addition both soda up to ~ obtentio ~ from ~ H 9.5 in the aqueous phase (20 cm3 of 6 N soda).
Ia pha ~ e chlorom ~ thyl ~ niqu ~ is concentrated 80us pre ~ -.., .......,. ,. , ".,, .. - ,..,, .., -,. ...

: 1 ~ 3 ~ 786 sion reduced ~ (5 to 10 mm of mercury) ju ~ volume ~ d ~ 1 liter.
C) - Purification ___________ ~ e concentr ~ chlorom ~ thyl ~ nique obtained pr ~ c ~ dem-ment is towards ~ slowly in 10 liters of hex ~ ne ~ tempera-amure ture.
~ a solution is filtered, thus separating 6 ~ g of insoluble ~ nacti ~.
~ e ~ iltrat is concentrated 80U8 reduced pressure (5 ~ 10 mm of mercury) ~ u ~ only at a volume of about 0.5 liters.
This solution is stirred for 2 hours at the temperature of o pu18 is left to rest for 24 hours at + 4C.
~ es crystals obtained are isolated by centrlfuga-tion of the solutlon then the ~ és with 250 cm3 of hexane ~ + 4C and s ~ ohes under pressure r ~ duiteO
In this way, 103 g of the sodium salt of 31,559 RP are thus 601.
D) - Recrystallization _________________.
57 B of ~ el of sodium of 31 ~ 559 RP previously obtained are dissolved in 1 ~ 2 liter of ac ~ tone and acts ~ s , for 15 minutes. We have ~ oute 2 ~ 5 g of bleached black washed ~
hydrochloric acid, pUi8 stirred again with water for half a hour and finally the bleaching black is filtered off.
~ Slowly stirred filtrate ast add ~ 750 om3 of di ~ till ~ e. ~ e sodium salt of 31.559 RP cr ~ tallise slowly at a temperature of 0C ~
~ es crystals so ~ t 1 # ol ~ 8 by ~ iltration? lav ~ s per 150 cm3 of the mixture of acetone / water (50-50 by volume) and ~ ch ~ s ~ OUB pres ~ ion r ~ reduced to 35C.
35 g of the odium salt of 310559 RP are obtained.
By concentration of ~ mother liquors ~ half of their volume init ~ al, then re ~ roidi ~ ment ~ 4C ~ we get us ~ esu 13.2 g of se, l of sodium from 310559 RPo ~ n other ob ~ and of the prese ~ te inventio ~ is cons-:,. . . .,., .. ..,,:; ., ~. . .,:

~ 38,786 incorporated by the anticoccidial compositions which contain the 31.559 RP or se ~ metal salts or ~ els with nitrogenous bases ~
and, more particularly, by the mixed animal feed or the ~ m ~ concentrated diapers ~ for animal feed ~ contain mant the 31.559 RP or its ~ metallic els or ~ els with the base R ~
nitrogen ~, possibly in the presence of ~ another anticocci agent dien. These ~ compositions are particularly useful for combating against the cocididosis of the volatile ~ and more specifically of the volallle, ~ a do ~ e neces ~ area to produce a suitable e ~ effect ble can naturally vary dan8 dla ~ sez large # limits ~ ant the value of the food itself, Generally, $ 1 ~ than the rations menta ~ re # made available to animals ~ cont ~ e ~ nent 0.005 0.04% by weight of 31.559 RP or its metallic salts or ~ els ~ oc nitrogen bases.
~ e 3 ~ 0559 RP or its metal salts or salts with the ~ nitrogen bases ~ s can be divided into disper ~ uni ion ~ elm in the ~ food ~ ¢ complete omposed at the above doses, I1 can be distributed in ~ s food complete talres ~ a dose of 09025 at 1%, most often with others additives such as ~ itamines and mineral salts ~ rauxO These foods ~
can be either mixed with the ration ~ or con-so ~ such guels ~ and usually represent 5 to 20% of the ration.
~ es "premixes" ~ used for the preparation of ~ ra-¢ omplbtes or complementary foods ~ contain ha-usually 0 ~ 05 ~ 20% of 31,559 RP or its metallic salts queo or salts with dilute nitrogen bases ~ dan ~ u ~ e feed charge to hush up. It ~ con ~ constitute a convenient intermediate facilitating the re-;
primary partition of the actii product in food. ~ are pre-mixes themselves3 have generally obtained ~ ~ from concentrate 9 which ~ ontien ~ slow from 99.9 ~ 20% of 31.559 RP or ~ e ~ salts m ~ -metallics or salts with ~ nitrogenous bases ~ addition ~ of denatu-rant ~ edible such as food colors, flavorings, dispersing agents ~ or avoiding agglomeration and feed charges your ~ res.
~ es concentr ~ s and premixes are generally pul_ -vehicles. Complementary foods and compound foods complete ~ can be either powdery ~ or in ~ Bra elm null ~ pr ~ ready ~ according to the usual technique ~.
~ example ~ next, given without limitation, illu ~ txe a campo ~ ition according to the invention.
_ example A:
An ali03nt having the following composition is prepared:
- flour of ~ s is ~ ue ~ of cereals 0-- 13 ~ 41%
- barley flour ... 13.41 ~
- ~ corn rine .. - 13 ~ 41%
- wheat flour ... 31.32%
- ~ axi de poi ~ on 0O. 8 ~ 9 ~%
- ~ arlne de so ~ a ... 8.92%
- flour of dehydrated fodder ... 4 ~ 56%
- yeast extract ... 2.33%
- milk ~ ec powder ... 2.68%
- ~ sodium chloride Ø 0.09%
- calcium chloride ... 0 ~ 89%
- element ~ minerals ... 0 ~ 06%
- vitamin complexes vitamin A ... 4000 IU / kg vitamin D3 0 .. 1000 ~ I / kg choline chloride O .. 11.5 mg / kg ribo ~ lavine 0 .. 2.24 mg / kg , 1 ~ 38786 To this aliment9 we add and leave uniformly 0.02% sodium salt of 31.559 RP.
Another object of the present invention is to killed by the compositions usable as growth factor in ruminants ~ (cattle, sheep ~ goats ~) and as a control agent against swine dysentery.
This ~ compositions æont consist of food mixed for ruminants and pigs and by mixes concentrate for animal feed containing the antibiotic 31.559 RP or its salts.
~ at the dose necessary to produce a suitable effect can naturally ~ arier within wide limits following the animal fathers and according to the nutritional value of the food themselves m ~ mesO
It is particularly advantageous to put 8 the Daily supply of antibiotics 31.559 ~ P comprised between 50 and 250 mg psr head of animal.
Preferably the antibiotic 31.559 RP e ~ t distributed in complementary foods containing 0.01 a 0 ~ 1%, 1st most often with other additives such as vitami and mineral saltO These complementary foods can either be mixed gés ~ laration be consumed as is ~ and they represent habiti-approximately 1 to 10% of the Daily ration; 310559 RP
o corresponds to 0.0001-0.01% by weight of the daily ration, ~ es "premixes", used for the preparation of ra-complete or complementary foods contain general 0 ~ 1 to 5% of antibiotic 31.559 RP diluted in a char-gè food ~ They are a convenient and easy intermediary both the u ~ ifiform repartition of the antibiotic 31.559 RP in 30 ~ the ~ food ~ es "premlxes" themselves are generally ob-_25-... ... . . . . . .

~ 38,786 required ~ from concentrate ~ which contain 99.9 ~ 5% anti biotic 31 ~ 559 RP with edible edants such as as food coloring, flavoring agents, dispersing agents or the agglomeration and food costs.
~ are concentrated ~ and "premixes" ~ usually have powdery ~, ~ e ~ complementary foods can be either powders or 50US pellet foxme ~ prepared ~ according to tech-usual nics ~ In these compositio ~ s, the antibiotic 31,559 RP or its salts can be 8tre in the form of fine ~ particles free or covered with a coating.
~ example followed ~ t, given ~ non-limiting title, shows the use of antibiotic 31.559 RP as a factor growth:
BL example Twelve ~ Holstein beef donkeys ~ are placed with individual cells with an average surface area of 48 m then so ~ t weighed.
~ the food ~ to be studied is distributed from partlr from Day 0, Day of setting up the test.
~ the oxen are in ~ uite pes ~ s after 28 ~ bear pUi8 of 56 Days and the weight of food consumed during this period is determined.
~ e ~ average weight gain and comfort rate verslon alimenbalre so ~ t determined for cha ~ ue allment étUdié
in the ~ i ~ tsrvalles 0-28 Days and 28-56 Days.
~ e ~ animals receive food twice per day. ~ a Daily ration is finished ~ such '' ., ~.
,;.
~ p - 26 -,.

.. ``., '' -. . '.... ~. ',. :, '. '. ! - '. . '' 1 ~ 3 ~ 7 ~ 6 that the oxen absorb the maximum nourritl ~ re without leaving any.
In the test ~ the young oxen are divided into 3 groups. Each animal receives ~ ase food which is constituted corn, hay and a protein supplement.
Each animal in group I receives the basic food.
Each group II animal receives the staple food wherein the protein supplement contains 100 mg of antibiotic 31.559 RP.
Each animal in group III receives the basic food wherein the protein supplement contains 200 mg of antibiotic 31.559 RP.
The average daily ration per animal has the composition next tion:

_ _ ~ _ Groupe IGroupe II_Groupe III
but 8.86 kg 8.96 kg 8.91 kg hay 1.46 kg 1.45 kg 1.47 kg protein supplement ~ 0.49 kg 0.5 kg 0, Sl kg antiblotic 31.55g RP I100 mg 200 mg ~ The protein supplement used is the "PRO BLEND 50" brand of trade of the Company Landmarck, Inc., which consists in part culier of:
~ total protein equivalent7 / 50%, fat 71%
vegetable fibers ~ 9 vitamin A -765,000 units / k ~
The results obtained are gathered in the following tables:

1 ~) 38786;
I - Weight mo ~ in kg (per animal) , ,. .
to ~ our 0 to 28 ~ our ~ ~ 56 day ~ ~: ~
. __ ~ - '~. '' Group I 285.1 325.2 374.5: ~
.-. .... _ ....
Group II 284.9 325.2 381.1 . .
Group III 286.6 333 387 II - Variatlon of ~ oids mo ~ en and conversion rate . _, 0-2l Jourl A .__ _ 28-5i day3 0-56 Day ~ _ Group Group ~ group Gr ~ e Gr ~ 4 ~ Gro ~ Group Group Gro ~ e . I II ~ II II III I II III
__. . .
G ~ ln of weight ~
mo ~ in kg per year 40.1 40.3 46 ~ 4 49.3 55.9 54 89.4 96.2 100.4 ..
Weight gain average in kg by ~ our by: -: -. anlmal 1 ~ 43 1 ~ 44. 1 ~ 65 ~ 76 1.99 1 ~ 93 1 ~ 59 ~ 72 1.79 _ ....... , '' Consumption. ;
mo ~ enne in kg per day. . ~.
3o per animal 9 ~ 83 9 ~ 76 9.84 11.78 12.5 ~ 1.94 10.81 lO, 9 I0.89: ~ _. __ __ ~ aux de.
conver ~ ion 6 ~ 86 6.77 5.94 6.70 6.04 6.19 6.77 6.34 6.08 .:.

.
_28-.

. .

1 ~ 3 ~ 7 ~ 36 So during the first ~ 28 days, the animals receiving 100 mg per tate and per our of 310559 RP have a gain weight of 3% ~ up ~ laughing and a conversion rate of 1.3 ~ ini ~ -laugh at those of control animals ~ and these percentage ~ are respec 15 ~ 3% and 13.4% for animals receiving 200 mg per day all and by our 31O559 RPo During the second period (28-56 ~ ouræ), the zni-mau ~ receiving 100 .m8 / ~ our of 31,559 RP outpacing those receiving the higher dose ~ ~ orte. ~ weight gains 80nt then 13.4%
higher ~ and conversion rates of 9.8% lower ~ those t ~ minus ~ the dose of 100 mg / ~ our and this ~ percentages are 9 ~ 6% and 7 ~ 6% respectively for the 200 mg / day dose.
Over the total trial period (56 days), the average earnings ~ ~ daily workers improved by 7.8% and 12.2% and tBUX of conversion of 6 ~ 4 ~ and 10 ~ 2% compared to Témolns, do ~ e ~ re ~ pectl ~ es of 100 and 200 m ~ ~ our of 31.559 RP.

,.
.

-29 ~

Claims

The embodiments of the invention about which an exclusive right of property or privilege is claimed are defined as follows;

1. Process for the preparation of a new substance antibacterial and anticoccidial designated by number 31.559 RP, of general formula:

as well as its metal salts and its salts with bases nitrogen, the sodium salt of which is characterized in that:
- it is a white microcrystalline powder, practically insoluble in water, sparingly soluble in solvents hydrocarbons such as hexane, soluble in alcohols such than methanol, ketones such as acetone, in the dimethylformamide and ethyl acetate, easily soluble in chlorinated solvents such as methylene chloride and chloroform, - its centesimal composition is close to:
C% = 63.2 H% = 8.8 0% = 24.8 Na% = 2.9 - its melting point is 220 ° C (with decomposition sition) - its rotary power: (c-1.050% - methanol) - it has no characteristic absorption in the ultraviolet - its infrared spectrum has bands of ab-sorption to:
3430, 3180, 2970, 2935, 2925, 2880, 2825, 2600, 2060, 1945, 1850, 1760, 1730, 1630, 1590, 1450, 1398, 1380, 1372, 1362, 1350, 1335, 1298, 1292, 1260, 1238, 1220, 1200, 1190, 1185, 1170, 1152, 1140, 1115, 1108, 1092, 1090, 1072, 1065, 1040, 1018, 1000, 985, 968, 940, 928, 912, 890, 870, 852, 828, 815, 792, 788, 775 765, 748, 705, 655, 635, 610, 590, 570, 565, 550, 535, 500, 482, 420, 378, 350 cm-1 - in ascending thin layer chromatography silica gel with ethyl acetate mixture as solvent cyclohexane - water - butanol (50-50-25-5 by volume) there is an Rf 0.5 and with the methylene chloride mixture as solvent -methanol (94/6 by volume) an Rf of 0.7 - its anticoccidial activity is manifested in the chick: at minimum concentrations between 0.005 and 0.04% by weight in the food, characterized in that that are grown aerobically streptomyces hygroscopicus OS 24.367 (NRRL5787), on its producing metants, on a medium classic suitable and under usual conditions for this kind of culture then separates the 31.559RP formed during the culture optionally in the form of a salt, and purifies it.

2. New antibacterial and anticocidal substance cidienne designated by the number 31.559 RP, of general formula:

as well as its metal salts and its salts with nitrogenous bases, whose sodium salt is characterized in that:
- it is a white microcrystalline powder, practically insoluble in water, sparingly soluble in solvents hydrocarbons such as hexane, soluble in alcohols such than methanol, ketones such as acetone, in dimer-thylformamide and ethyl acetate, easily soluble in chlorinated solvents such as methylene chloride and chloroform, - its centesimal composition is close to:
C% = 63.2 H% = 8.8 0% = 24.8 Na% = 2.9 - its melting point is 220 ° C (with decomposition sition) - its rotary power: (c 1.050% -methanol) - it has no characteristic absorption in the ultraviolet - its infrared spectrum shows bands absorption at:
3430, 3180, 2970, 2935, 2925, 2880, 2825, 2600, 2060, 1945, 1850, 1760, 1730, 1630, 1590, 1450, 1398, 1380, 1372, 1362, 1350, 1335, 1298, 1292, 1260, 1238, 1220, 1200, 1190, 1185, 1170, 1152, 1140, 1115, 1108, 1092, 1090, 1072, 1065, 1040, 1018, 1000, 985, 968, 940, 928, 912, 890, 870, 852, 828, 815, 792, 788, 775, 765, 748, 705, 655, 635, 610, 590, 570, 565, 550, 535, 500, 482, 420, 378, 350cm-1 - in ascending thin layer chromatography silica gel with acetate mixture as solvent ethyl - cyclohexane - water - butanol (50-50-25-5 by volume) there is an Rf of 0.5 and with the chloride mixture as solvent of methylene - methanol (94/6 by volume) an Rf of 0.7 - its anticoccidial activity is manifested in the chick at minimum concentrations between 0.005 and 0.04% by weight in the food each time it is obtained by a process as defined in claim 1, or its obvious chemical equivalents.