BRPI1105822A2

BRPI1105822A2 - composição de peptídeo de oelanoyl e um método de tratamento do envelhecimento da pele

Info

Publication number: BRPI1105822A2
Application number: BRPI1105822A
Authority: BR
Inventors: Nagabhushanam Kalyanam; Majeed Muhammed; Sood Rattan; H Chandramouli Renukeshwar; Prakash Subbalakshmi; Anand Tathapudi Susmitha
Original assignee: Sami Labs Ltd
Priority date: 2010-12-28
Filing date: 2011-12-28
Publication date: 2018-11-21
Also published as: CA2975170A1; US10071043B2; EA035128B1; JP6176893B2; WO2012091743A1; US20160113853A1; AU2011265587B2; EP2510919A3; CA2975170C; EA035128B9; US8987212B2; JP2018505890A; US20110091398A1; JP2017206503A; EP2510919A2; JP2012140428A; US20150148297A1; MY188723A; AU2015381703A1; AU2015381703B2

Abstract

composição de peptídeo de oelanoyl e um método de tratamento do envelhecimento da pele. a presente invenção se refere a uma composição que contem o peptídeo da seq id no. 1 ligado ao ácido oleanólico e um método de tratamento do envelhecimento da pele. a composição reduz com eficiência os sinais de envelhecimento devidos à oxidação, insu?ciência de colágeno e atividade excessiva de proteases de serina, como a elastase e colagenase, que resultam no enrugamento da pele, linhas ?nas de expressão, espessura reduzida da pele, hiperpigmentação, círculos escuros sob os olhos e envelhecimento prematuro.

Description

(54) Título: COMPOSIÇÃO DE PEPTÍDEO DE OELANOYL E UM MÉTODO DE TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO DA PELE (51) Int. Cl.: A61K 8/64; C07K 7/06; A61Q 19/00; A61Q 19/08.

(52) CPC: A61K 8/64; C07K 7/06; A61Q 19/007; A61Q 19/08; A61Q 19/00; (...).

(30) Prioridade Unionista: 28/12/2010 US 12979667.

(71) Depositante(es): SAMI LABS LIMITED.

(72) lnventor(es): MUHAMMED MAJEED; KALYANAM NAGABHUSHANAM; RENUKESHWAR H CHANDRAMOULI; RATTAN SOOD; SUBBALAKSHMI PRAKASH; SUSMITHA ANAND TATHAPUDI.

(57) Resumo: COMPOSIÇÃO DE PEPTÍDEO DE OELANOYL E UM MÉTODO DE TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO DA PELE. A presente invenção se refere a uma composição que contem o peptídeo da SEQ ID No. 1 ligado ao ácido oleanólico e um método de tratamento do envelhecimento da pele. A composição reduz com eficiência os sinais de envelhecimento devidos à oxidação, insu?ciência de colágeno e atividade excessiva de proteases de serina, como a elastase e colagenase, que resultam no enrugamento da pele, linhas ?nas de expressão, espessura reduzida da pele, hiperpigmentação, círculos escuros sob os olhos e envelhecimento prematuro.

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COMPOSIÇÃO DE PEPTÍDEO DE OLEANOYL E UM MÉTODO DE TRATAMENTO DO ENVELHECIMENTO DA PELE

Esta petição é uma continuação em parte da petição Ser. N° 11/835165 efetuada em 07 de agosto de 2007, intitulada “Peptídeos modificados com triterpeqóides e pequenas moléculas orgânicas: Síntese e Uso em Cosmecêuticos” a qual é por meio desta incorporada por referência na íntegra para todos os fins.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a uma composição contendo um peptídeo da SEQ ID N° 1 vinculada ao ácido oleanólico e seu uso no tratamento do envelhecimento dérmico. O peptídeo da SEQ ID N° 1 vinculado ao ácido oleanólico está presente na composição de maneira individual ou combinado com ingredientes ou extratos vegetais selecionados a partir de um grupo consistindo em endosperma líquido de coco, extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, tetraidrocurcuminóides ou seus derivados e extrato de alcaçuz. A composição reduz eficazmente o envelhecimento devido à oxidação, insuficiência de colágeno e atividade excessiva de proteases da serina como elastase e colagenase que resultam no enrugamento da pele, linhas de expressão finas, espessura dérmica reduzida, hiperpigmentação, olheiras e envelhecimento prematuro.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A aparência e condição da pele podem ser degradadas através dos efeitos de fatores ambientais, ocorrendo naturalmente (luz solar, abrasão pelo vento, umidade, etc.) ou por ação humana (aquecimento, ar condicionado, poluentes, etc.), processos patológicos tais como doenças dermatológicas ou o processo de envelhecimento normal. As várias agressões às quais a pele é exposta podem atuar individualmente ou sinergicamente. Para amenizar ou prevenir a deterioração da

2/46 qualidade dérmica que pode ocorrer com o passar do tempo, os consumidores têm cada vez mais buscado composições cosméticas novas ou aperfeiçoadas e métodos cosméticos para o cuidado da pele. Tais produtos ou métodos previnem, retardam ou revertem os sinais visíveis do processo de envelhecimento, como o aparecimento i

de rugas, linhas, perda de tônus da pele, afinamento da pele, hiperpigmentação ou mosqueamento e manchas de envelhecimento. Tais produtos ou métodos melhoram a aparência e a condição da pele sensível, seca ou escamosa e/ou suavizam a pele que sofreu irritação devido à exposição a produtos químicos, vento ou luz solar, entre outros irritantes em potencial.

Com a população em processo de envelhecimento, tem havido um aumento no estudo do envelhecimento no que diz respeito ao corpo humano e, mais particularmente, à pele humana. Por exemplo, o tratamento do envelhecimento da pele demonstrado pela presença de linhas finas, rugas e coisas semelhantes tem recebido bastante atenção. Os sinais dérmicos de envelhecimento, como linhas finas, rugas, flacidez e hiperpigmentação, têm sido combatidos através de várias táticas, incluindo cirurgia, tratamento a laser e cosméticos. Os tratamentos cosméticos incluem o uso de vários cremes e loções para alterar os efeitos do envelhecimento dérmico. Grande parte da literatura do estado da técnica anterior enfoca o uso de um único componente primário para prevenir um dos vários efeitos prejudiciais do envelhecimento. Por exemplo, uma tática tem sido utilizar um ou mais hidroxiácidos ou ácido retinóico para estimular um novo crescimento das células dérmicas sem outros componentes. Esta abordagem é falha porque não reconhece que o envelhecimento é provocado pela interação prejudicial de múltiplos agentes sobre a pele, oriundos de múltiplas fontes, causando dano à pele através de múltiplos trajetos nocivos simultâneos.

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Os consumidores cada vez mais estão buscando produtos “antienvelhecimento que tratem o surgimento de rugas, vincos e sulcos na pele. O advento de injeções cosméticas dolorosas e caras para o tratamento de linhas de expressão do rosto aumentou o interesse em encontrar alternativas tópicas que sejam eficazes e não invasivas.

Linhas de expressão são um tipo distinto de ruga que ocorre na pele do rosto no início da idade adulta. Elas estão anatomicamente relacionadas com os músculos da expressão facial nas áreas periorbital, glabelar, da testa e perioral. A atividade destes músculos durante as ações de sorrir, semicerrar os olhos, franzir os lábios e franzir as sobrancelhas causa maior pressão sobre a pele sobrejacente do que em outras áreas do rosto. Por este motivo, as linhas de expressão respondem menos aos tratamentos tópicos que enfocam os elementos não contráteis da anatomia cutânea, como a epiderme. A fim de ser mais eficaz, o tratamento das linhas de expressão deve também acarretar a inibição dos músculos de expressão facial e os elementos das fibras musculares associados à derme. Várias substâncias que relaxam as fibras musculares estriadas são descritas no estado da técnica anterior na área cosmética. O problema é que os relaxantes musculares do estado da técnica agem de forma lenta, não são suficientemente potentes ou os efeitos inibitórios não são cumulativos. Além dos mais, nenhum destes relaxantes musculares reduz as ações dos músculos faciais. Um extrato vegetal recém descoberto que inibe rapidamente a deformação da derme possibilita que substâncias que a reparam e rejuvenescem sejam mais eficazes.

Uma linha de expressão é formada guando um músculo de expressão facial contrai-se ou encurta-se sob a pele e então se relaxa e retorna ao seu comprimento de repouso. A pele também pode contrair-se e voltar à posição anterior, mas não tão

4/46 bem quanto o músculo. Portanto, a pele tende a curvar-se e dobrar-se para dentro à medida que o músculo contrai-se. A capacidade da pele de resistir à contração e extensão do músculo subjacente está relacionada com a qualidade e a saúde da camada superior da derme. Com o aumento da idade, a espessura, elasticidade, i teor de colágeno e capacidade reparadora da derme diminuem. A pele não consegue mais recuperar-se depois desta ação e a matriz fibrosa intercelular da derme enfraquece e rompe-se. Neste ponto, a pele já desenvolveu uma ruga permanente. A ruga continuará a aprofundar-se, visto que esta área da pele está sujeita à tensão infindável das expressões faciais.

Anatomia das Linhas de Expressão

A pele associada com as linhas de expressão é diferente histologicamente daquela encontrada no resto do rosto. Os septos interlobulares do tecido conjuntivo subdérmico contêm fibras de tecido muscular estriado (panniculus carnosus). Estas fibras originam-se dos grupos musculares faciais subjacentes. Elas estão integradas dentro da rede colágena da camada inferior da derme (reticular). Uma subpopulação de fibroblastos dérmicos na camada superior da derme (papilar), conhecidos como “miofibroblastos”, tem características contráteis inerentes semelhantes ao tecido muscular estriado. As contrações dentro destes fibroblastos dérmicos são mediadas pelo mesmo neurotransmissor, isto é, a acetilcolina, como os elementos fibrosos do músculo estriado.

As fibras musculares dentro da pele facial têm uma influência direta sobre a suavidade de sua superfície e a modulação do influxo neuromotor para estas fibras musculares provoca uma redução das ruga^S. Por exemplo, pacientes que sofrem de paralisia de Bell no nervo facial têm uma pele mais suave no lado paralisado da face do que no lado não paralisado. Além disso, injeções cosméticas com Botox™ não só

5/46 imobilizam a testa e os músculos superiores das sobrancelhas, mas também suavizam a pele externa a estes músculos. O Botox.™ interfere na absorção de acetilcolina dentro da junção sináptica do neurônio motor aferente das fibras musculares, prevenindo por este meio a contração do tecido muscular associado com rugas e vincos. O tratamento com Botox.™ tem uma demanda elevada e, consequentemente, o objetivo dos cientistas cosméticos é desenvolver um equivalente tópico (veja A. Blitzer et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg., 119, páginas 1018 a 1022 (1993)) (veja J. D. Carruthers et al., J. Dermatol. Surg. Oncol., 18, páginas 17 a 21 (1992)).

Para atender à demanda dos consumidores, muitas composições cosméticas e métodos cosméticos têm sido desenvolvidos para o cuidado e tratamento da pele. Contudo, muitos, se não a maioria, dos produtos ou métodos de tratamento descritos até o momento conduzem a resultados inadequados ou são prejudicados por efeitos colaterais indesejáveis. Estes podem incluir a irritação da pele ou das membranas mucosas adjacentes, a produção de oleosidade ou sebosidade excessiva na pele ou sua descoloração.

Reparo dérmico: A habilidade regenerativa da derme tem uma influência fundamental em sua habilidade de resistir à contração muscular crônica e ao relaxamento dos músculos de expressão. Como consequência do envelhecimento ou da pele danificada pelo sol, há uma redução das células fibroblásticas e vasos sanguíneos necessários para rejuvenescer a camada inferior da derme. Os fibroblastos na “camada basal” da derme superior reproduzem-se em novas células mais lentamente, perdem sua capacidacjfe de fabricar colágeno e são menos capazes de se organizar e preservar a rede de fibras colágenas. Visto que a matriz dérmica é a fonte do colágeno e das principais moléculas que retêm água, isto é, os

6/46 glicoaminoglicanos e o ácido hialurônico, preservá-la é essencial para a saúde da epiderme. Sem a reposição contínua das proteínas precursoras, ocorre a desorganização e dissolução da rede de fibras colágenas e da matriz extracelular. O resultado deste processo é um achatamento da junção dermoepidérmi^a e um / enfraquecimento da resistência mecânica da camada superior da derme. Assim, a pele envelhecida tem uma suscetibilidade muito maior de tornar permanentes as deformações temporárias que ocorrem durante a expressão facial (veja Oikarinen, The Aging of Skin: Chronoaging Versus Photoaging, Photodermatol. Photoimmunol. Formation, Photomed., vol. 7, pp. 3-4, 1990, e Thalmann et al. A Computational Skin Model: Fold and Wrínkle FormatiorippA-5).

Há vários ensinamentos na área (patente americana número 6,794,362), (patente americana número 6,777,389) que discutem moléculas ou composições específicas para reforçar a elasticidade da pele ou fortalecer a derme. Elas são formuladas a partir de peptídeos ou compostos semelhantes a peptídeos que imitam a composição molecular da elastina ou reforçam-na. Mitts e colegas (Patente americana número 6,809,075) postulou que uma composição de peptídeo/retinóide poderia ser integrada ao componente de elastina da derme, aumentando por meio disto a capacidade da pele de recuperar-se da deformação. Mais frequentemente, o estado da técnica ensina que formulações de peptídeos naturais ou sintéticos podem reforçar a rede de fibras colágenas ou o substrato extracelular da matriz dérmica, daí a integridade inovadora (Lowe, N. et al., *Pharmacology of Retinols In Skin, Vol. 3 (1989), pp. 240-248). Contudo, a instabilidade e irritação provocadas pelos retinóides são problemáticas. Um^f abordagem defendida por Dioguardi (patente americana número 5,198,465) é aumentar o teor de colágeno na pele em geral através da aplicação tópica de moléculas precursoras de colágeno sintetizadas

7/46 e coenzimas da via metabólica do colágeno. A premissa é que a substituição direta via difusão e adsorção das moléculas precursoras fortifica a pele deficiente. Uma noção similar ensinada por Kludas (patente americana número 5,055,298) é que uma composição substancialmente natural pode ter um efeito repapador e remodelador na junção dermoepidérmica. Igualmente, o estado da técnica recente (patente americana número 6,906,036, patente americana número 6,884,425) ensina que os inibidores das metaloproteinases matriciais são capazes de prevenir a ruptura da derme, curando-a e facilitando o retorno a uma pele saudável e normal. Nenhuma das patentes supramencionadas indica a capacidade de estimular a atividade fibroblástica e a síntese de precursores do colágeno, nem professam a restauração da espessura dérmica e da rede de fibras colágenas.

Em uma patente recente, Varani e colegas (patente Americana número 6,919,072) identificam uma composição de um retinóide e um inibidor da metaloproteinase matricial que inibe a ruptura do colágeno, promove o teor de colágeno aumentando a síntese de procolágeno e aumenta a proliferação de queratinócitos e fibroblastos. A invenção restaura a espessura da junção dermoepidérmica na pele cronologicamente envelhecida e restaura os níveis normais do teor de colágeno dentro da camada superior da derme. É aí que reside sua propriedade de dar força à pele para resistir ao estresse ambiental e físico. Como no caso dos outros retinóides, o retinóide de Lowe requer uma aplicação prolongada e o reparo da derme é muito mais lento do que com a incorporação preferida deste pedido de patente.

A importância dos peptídeos '

O enfoco do estado da técnica inicial foi na revelação de substâncias as quais se acreditava que repunham fisicamente as moléculas que constroem colágeno

8/46 novo ou que adicionam substâncias que irritam ou rompem a camada basal para obter sua regeneração e reconstituição sadia. O estado da técnica mais recente ensina os benefícios dos tratamentos tópicos com peptídeos na estimulação da camada superior da derme para se renovar por meio de um novo crescimento celular. Isso é respaldado pelo conhecimento de que o corpo tem peptídeos que ocorrem naturalmente e que são essenciais na estimulação do processo de recuperação após uma lesão na pele. Robinson ensina (patente americana número 6,492,326) várias formulações contendo combinações de palmitoil pentapeptídeo-3, derivados de pentapeptídeos e misturas dos mesmos. Lintner (patente americana número 6,620,419) divulga fórmulas de peptídeos da sequência geral palmitoil-lisiltreonil-treonil-lisil-serina (grupo palmitoil ligado à SEQ ID No. 1). Eles agem sinergicamente para curar rugas e outras formas de envelhecimento da pele de maneira bem mais eficaz do que as formulações anteriores. A diferença principal no ensinamento de Lintner em relação ao de Robinson é a adição de uma cadeia de ácidos graxos à extremidade terminal de um pentapeptídeo que torna este peptídeo lipofílico modificado bastante eficiente na penetração da epiderme e, assim, mais eficaz ao alcançar as camadas formadoras da derme. O resultado final é o aumento da espessura da pele através da restauração da capacidade reparadora da camada dérmica superior. Consequentemente, a pele tem maior capacidade de resistir à deformação imposta a ela pela contração ativa e relaxamento dos músculos de expressão e pelas microcontrações dentro da própria pele.

Estudos mais abrangentes têm constatado que fatores ambientais, como estresse, exposição ao sol e impurezas ncjfe alimentos, água e ar, também afetam adversamente os componentes das camadas epidérmicas e dérmicas da pela que, por sua vez, afetam e alteram a aparência da pele, levando a uma aparência de

9/46 envelhecimento precoce. Por exemplo, fatores como radicais livres, espécies reativas de nitrogênio (“RNS”), espécies reativas de oxigênio (“ROS”) e outras espécies oxidantes (“OOS”) podem ter um impacto adverso sobre o corpo humano, inclusive a pele. Fatores particulares dentro dos grupos observados acima que

I mostram ter um impacto e afetar adversamente a aparência da pele incluem o óxido nítrico, radicais superóxidos, peróxido de hidrogênio e radicais livres de hidróxido. Estes fatores têm sido implicados de maneira variada em uma série de problemas de pele, incluindo danos por exposição à luz solar, envelhecimento geral da pele, dermatite de contato, enrugamento, peroxidação lipídica, degradação enzimática, redução e ruptura do colágeno e/ou elastina, degradação e reprodução inibida do DNA, inflamação e danos gerais ao tecido da pele.

A atividade antioxidante é uma atividade que reduz a produção da espécie reativa de oxigênio no corpo e ao mesmo tempo previne a oxidação que causa danos irrecuperáveis às células. O oxigênio triplete ou em estado fundamental pode ser ativado como resultado da exposição a fatores ambientais ou bioquímicos, tais como enzimas, metabolismo de redução, compostos químicos, poluentes e reações fotoquímicas, e transformado na espécie reativa de oxigênio (ROS), a qual possui uma alta reatividade como radicais superóxidos, radicais hidróxi e peróxido de hidrogênio. Sendo assim, ele resulta em uma ruptura irreversível dos constituintes celulares. As ações de tal espécie reativa de oxigênio podem ser reduzidas por enzimas antioxidantes tais como a superóxido dismutase (SOD), a catalase e a peroxidase e substâncias antioxidantes como a vitamina C, vitamina E e glutationa, as quais formam o sistema de defesa do Organismo. Contudo, quando ocorre um distúrbio de tal mecanismo de defesa do organismo ou uma exposição excessiva à espécie reativa de oxigênio, a espécie reativa de oxigênio pode romper

10/46 irreversivelmente lipídeos, proteínas e o DNA. Várias doenças, inclusive envelhecimento, câncer, esclerose múltipla, artrite e mal de Parkinson são o resultado.

Foram desenvolvidos até o momento antioxidantes sintéticos comovo BHA (hidroxianisol butilado), BHT (hidroxitolueno butilado) e NDGA (ácido nordiidroguaiarético). Como exemplos de antioxidantes naturais, há as enzimas antioxidantes como a superóxido dismutase, peroxidase, catalase e glutationa peroxidase e substâncias antioxidantes não-enzimáticas como tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), carotenóide e glutationa.

Contudo, os antioxidantes sintéticos podem provocar reações alérgicas e oncogênese devido à sua forte toxidade no organismo e são facilmente desfeitos pelo calor devido à suscetibilidade à temperatura. Por outro lado, os antioxidantes naturais são mais seguros do que os antioxidantes sintéticos no organismo, mas têm o problema de um efeito mais fraco. Portanto, é necessário o desenvolvimento de um novo antioxidante natural que não apresente problemas., seja de uso seguro e que também possua uma excelente atividade antioxidante. Os antioxidantes de aplicação tópica têm o mérito, em todos os tipos de pele, de manter a pele saudável e de ajudar a prevenir o dano do sol e melhorar a função celular.

Os antioxidantes têm demonstrado, de forma conclusiva, exercer um efeito positivo sobre a redução da irritação e inflamação dérmicas e isso é um passo crucial na criação ou manutenção de uma pele saudável e vibrante, por conseqüência, reduzindo potencialmente as rugas. (International Journal of Experimental Pathology, 2000:257-263; ₍Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology, 2000: 143-149)

Centenas de moléculas com uma estrutura de polifenol (poliidroxifenol) (isto

11/46 é, vários grupos hidroxila em anéis aromáticos) têm sido identificadas em plantas comestíveis. Estas moléculas são metabólitos secundários de plantas e são geralmente envolvidos na defesa contra a radiação ultravioleta ou agressão por patógenos. Os polifenóis são constituintes bastante frequentes das frutas, vegetais, cereais, legumes secos, chocolate e bebidas como chá, café ou vinho.

Estes compostos podem ser classificados em grupos diferentes em função do número de anéis de fenol que contêm e dos elementos estruturais que ligam estes anéis uns aos outros. As classes de polifenóis incluem os ácidos fenólicos, flavonóides, estilbenos e lignanas. Existem duas classes de ácidos fenólicos: derivados do ácido benzóico e derivados do ácido cinâmico.

Realmente não é prático medir cada um dos antioxidantes in vivo. Atualmente, supõe-se de forma geral que o fator principal que influencia o estresse oxidativo é o estado antioxidante global do sistema, o qual previne doenças por meio da eliminação de radicais livres e ROS. Portanto, é essencial ter um método capaz de medir coletivamente o estado antioxidante extracelular. Existem métodos de mensuração do estado antioxidante baseados na inibição dos radicais livres gerados que atingem as moléculas indicadoras alvo, através de antioxidantes. A característica comum dos ensaios de inibição é a geração de um radical livre para reagir com uma molécula alvo, gerando por meio disso um desfecho que pode ser observado e quantificado. A adição de antioxidantes inibe o desenvolvimento deste desfecho. Um bom exemplo disto é a atividade de limpeza de radicais livres de DPPH (1, 1-difenil-2-hidrazil).

A elastina, encontrada nas mais altas concentrações nas fibras elásticas dos tecidos conjuntivos, é responsável pela textura e tônus da pele. ELASTASE, uma enzima de serina protease, tem um papel na dissociação de tecidos que contêm

12/46 redes de fibras intercelulares extensas. A produção excessiva de elastase resultará no enrugamento da pele/envelhecimento precoce.

A proteína vital, o colágeno, mantém o tônus e a estrutura da pele. A COLAGENASE é uma enzima de serina protease que limpa a ferida de qualquer tecido morto deixando o leito da lesão pronto para a recuperação. Sabe-se que a colagenase, intensamente produzida durante a inflamação, desempenha um papel no enrugamento da pele por meio da digestão da proteína vital colágeno, a qual mantém o tônus e a estrutura da pele.

Outro mecanismo de antienvelhecimento é o reforço do colágeno na pele. Princípios ativos que conseguem reabastecer fisicamente as moléculas que constroem novo colágeno ou que adicionam substâncias que irritam ou rompem a camada basal para obter sua regeneração e reconstituição sadia são excelentes para as composições antienvelhecimento. A literatura mais recente ensina os benefícios dos tratamentos tópicos com peptídeo estimulando a camada superior da derme a se renovar por meio de um novo crescimento celular. Isso é respaldado pelo conhecimento de que o organismo possui peptídeos de ocorrência natural que são vitais no estímulo do processo de recuperação após uma lesão na pele. Robinson ensina (patente americana número 6,492,326) várias formulações contendo palmitoil pentapeptídeo-3, derivados de pentapeptídeos e misturas dos mesmos. Lintner (patente americana número 6,620,419) divulga fórmulas com peptídeos da sequência geral palmitoil-lisil-treonil-lisil-serina (grupo palmitoil ligado à SEQ ID N° 1) que aumentam a síntese de colágeno e de glicosaminoglicanos. Eles atuam sinergicamente para recuperar rugas e outras formas de envelhecimento da pele de forma bem mais eficaz do que as formulações anteriores.

A presente invenção divulga uma composição contendo um peptídeo da SEQ

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ID N° 1 ligado ao ácido oleanólico e seu uso eficaz no tratamento do envelhecimento da pele.

RESUMO DA INVENÇÃO

A presente invenção proporciona uma composição contendo um peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico e um método de tratamento do envelhecimento da pele. A composição atua eficazmente por meio de múltiplos mecanismos na prevenção, retardo e/ou reversão do envelhecimento da pele causado pela perda de elasticidade, deformação do colágeno, inflamação, danos dérmicos induzidos por radicais livres, etc.

O peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico está presente na composição individualmente ou em combinação com ingredientes ou extratos vegetais. A composição contendo peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico e ingredientes ou extratos vegetais mostra um efeito sinérgico no tratamento de sinais específicos do envelhecimento da pele. Os ingredientes ou extratos vegetais são selecionados a partir de um grupo, incluindo endosperma líquido de coco, extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, tetraidrocurcuminóides ou seus derivados, extrato de alcaçuz e combinações dos mesmos. Os estilbenos são selecionados a partir de um grupo contendo oxiresveratrol, pterostilbeno, resveratrol, 3-hidroxipterostilbeno e combinações dos mesmos.

A concentração do peptídeo de Oleanoyl utilizado na invenção varia de cerca de 0,0001 até cerca de 10%.

A concentração dos ingredientes' ou extratos vegetais utilizados na composição varia de cerca de 0,0001 até cerca de 10%.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS ANEXAS

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Figura 1: Estrutura do peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico.

Figura 2: Fornece a percentagem de inibição da colagenase em uma concentração variável do peptídeo de Oleanoyl.

Figura 3: Fornece a percentagem de inibição da elastase ern uma concentração variável do peptídeo de Oleanoyl.

Figura 4: Representa a inibição do TNF α em concentrações variáveis do peptídeo de Oleanoyl.

Figura 5: Efeito do peptídeo de Oleanoyl em doses graduadas sobre a expressão de interleucina-1beta extracelular (IL-1 β) a partir de neutrófilos humanos; valor P: *<0.01; **<0.001

Figura 6: Efeito do peptídeo de Oleanoyl em doses graduadas sobre a expressão de interleucina-6 (IL-6) a partir de neutrófilos humanos; valor P: *<0.01; **<0.001

Figura 7: Efeito do peptídeo de Oleanoyl em doses graduadas sobre a expressão de Prostaglandina E2 extracelular (PGE₂) a partir de neutrófilos humanos; valor P: *<0.01; **<0.001

Figura 8: Efeito do peptídeo de Oleanoyl em doses graduadas sobre a expressão de Óxido Nítrico extracelular (NO) a partir de neutrófilos humanos; valor P: *<0.01; **<0.001

Figura 9 (a) & 9 (b): Representa uma fotografia do candidato feita antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl, respectivamente. A Figura 9 (b) mostra o efeito do peptídeo de Oleanoyl na suavização das rugas.

Figura 10 (a) & 10 (b): Representa i^ria fotografia do candidato feita antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl, respectivamente. A Figura 10 (b) mostra o efeito do peptídeo de Oleanoyl na melhora da espessura da pele.

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Figure 11 (a) & 11 (b): Representa uma fotografia do candidato feita antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl, respectivamente. A Figura 11 (b) mostra o efeito do peptídeo de Oleanoyl na redução da hiperpigmentação.

Figure 12 (a) & 12 (b): Representa uma fotografia do candidato feita<antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl, respectivamente. A Figura 12 (b) mostra o efeito do peptídeo de Oleanoyl na redução das olheiras.

Figure 13: Efeito da composição contendo peptídeo de Oleanoyl e endosperma de líquido de coco no condicionamento e rejuvenescimento da pele; (a) Células controle sem a amostra (b) 35% de ampliação em comparação com as células não tratadas a 5pg/ml pelo endosperma de líquido de coco (c) 15% de ampliação em comparação com as células não tratadas a 5pg/ml pelo peptídeo de Oleanoyl (d) 85% de ampliação em comparação com as células não tratadas a 5pg/ml pela composição contendo peptídeo de Oleanoyl e endosperma de líquido de coco.

Figure 14: Efeito da composição contendo peptídeo de Oleanoyl e extrato de amla na proteção da pele contra UVB; (a) Células controle expostas a UV sem a amostra (b) 53% de proteção UV em comparação com as células não tratadas a 40pg/ml pelo extrato de amla (c) 13% de proteção UV em comparação com as células não tratadas a 40pg/ml pelo peptídeo de Oleanoyl (d) 80% de proteção UV em comparação com as células não tratadas a 40pg/ml pela composição contendo peptídeo de Oleanoyl e extrato de amla.

Figure 15: Efeito da composição contendo peptídeo de Oleanoyl e estilbenos/extrato de alcaçuz/THC na inibição de melanina; (a) Células controle sem a amostra (b) Tratamento com peptídeo de Oleanoyl não mostrando uma redução significativa da melanina (c) Composição contendo peptídeo de Oleanoyl e

16/46 pterostilbeno -o IC₅₀ é 0.34pg/ml (d) Composição contendo peptídeo de Oleanoyl e

3-hidroxipterostilbeno (3HPT) - o IC₅o é 0.42pg/ml (e) Composição contendo peptídeo de Oleanoyl e extrato de alcaçuz -o IC₅o é 1.3pg/ml (f) Composição contendo peptídeo de Oleanoyl e oxiresveratrol -o IC₅o é 4.3pg/ml (g) Corr^posição / contendo peptídeo de Oleanoyl e THC - o IC₅o é 1.2pg/ml (h) composição contendo peptídeo de Oleanoyl e Resveratrol - o IC₅o é 1.6pg/ml

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção diz respeito a um método de tratamento do envelhecimento da pele, o referido método compreendendo a etapa de tratamento 10 da pele com uma composição contendo um peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico representado pela estrutura I.

Estrutura I

Em outra incorporação da presente invenção, a composição opcionalmente inclui ingredientes ou extratos vegetais selecionados a partir de um grupo compreendendo endosperma líquido de coco, extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, tetraidrocurcuminóides ou seus derivados, extrato de alcaçuz e combinações dos mesmos. f

Em ainda outra incorporação da presente invenção, os estilbenos são selecionados dentre um grupo compreendendo oxiresveratrol, pterostilbeno,

17/46 resveratrol, 3-hidroxipterostilbeno e combinações dos mesmos.

Em ainda outra incorporação da presente invenção, a composição é aplicada topicamente e encontra-se na forma selecionada dentre um grupo compreendendo um creme, uma loção, um gel, uma emulsão, um patch e um líquido.

/

A presente invenção diz respeito a uma composição contendo um peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico representado pela estrutura I e adicionalmente um ou mais adjuntos selecionados a partir de um grupo compreendendo filtro solar, agente de clareador da pele, agente bronzeador da pele, antioxidante, perfume, opacificante, conservante, colorante, emulsificante, agente formulados dermatologicamente aceitável.

espessante e composto iônico (buffer)

veículo

incorporação da presente invenção, a

Em outra composição opcionalmente inclui ingredientes ou extratos vegetais selecionados dentre um grupo compreendendo endosperma líquido de coco, t

i derivados, tetraidrocurcuminóides ou seus extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, extrato de alcaçuz e combinações dos mesmos.

Em outra incorporação da presente invenção, os estilbenos são selecionados

18/46 dentre um grupo compreendendo oxiresveratrol, pterostilbeno, resveratrol, 3hidroxipterostilbeno e combinações dos mesmos.

Em outra incorporação da presente invenção, a composição é formulada para aplicação tópica e encontra-se na forma selecionada dentre urry grupo 5 compreendendo creme, loção, gel, emulsão, patch e líquido.

A presente invenção diz respeito ao peptídeo da SEQ ID N° 1 ligado ao ácido oleanólico como representando na estrutura I. O ácido oleanólico é acoplado ao terminal lisina do peptídeo da SEQ ID N° 1.

Em outra incorporação da presente invenção, o peptídeo da SEQ ID N° 1 ligado ao ácido oleanólico é sintetizado pelo acoplamento da SEQ ID N° 1 com o ácido oleanólico através de uma reação de desidratação.

Definições

O termo “aplicação tópica”, conforme aqui utilizado, significa aplicar ou espalhar as composições da presente invenpão sobre a superfície da pele.

I

O termo “dermatologicamente aceitável”, conforme utilizado aqui, significa que as composições ou componentes das mesmas assim descritos são adequados

19/46 para uso em contato com a pele humana sem toxicidade indevida, incompatibilidade, instabilidade, resposta alérgica, etc.

O termo “quantidade segura e eficaz”, conforme aqui utilizado, significa uma quantidade de um composto ou composição suficiente para induzir um t^enefício positivo, preferivelmente uma aparência positiva da pele ou sentir um benefício, incluindo independentemente os benefícios aqui divulgados, mas baixa o suficiente para evitar efeitos colaterais sérios, isto é, proporcionar uma relação risco-benefício razoável, no âmbito do juízo sólido do artesão hábil.

O termo “compatibilidade da pele” conforme aqui utilizado significa a habilidade da pele de tolerar a aplicação a longo prazo de composições tópicas com reações dérmicas adversas mínimas tais como ardência, queimadura, vermelhidão, coceira e foliculite.

O termo “co-administrado” refere-se à administração da composição com um segundo produto medicinal, apresentando tipicamente um mecanismo diverso de ação, utilizando um regime de dosagem que promova o resultado desejado. Isso pode referir-se à dosagem simultânea, dosagem em momentos diferentes durante um único dia ou mesmo dosagem em dias diferentes. As composições podem ser administradas separadamente ou podem ser combinadas em uma única formulação.

A presente invenção oferece uma composição contendo um peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico e um método de tratamento do envelhecimento da pele. O peptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao ácido oleanólico (composto) é doravante referido como “peptídeos de Oleanoyl” durante toda a descrição.

O ácido oleanólico no composto po£e ser substituído por seus derivados e utilizado na invenção. A parte de ácido oleanólico do composto pode também ser modificada contendo substituintes nos grupos 2-acilóxi escolhidos dentre os grupos

20/46 alcanoilóxi, alquenoilóxi, arilcarboxiloilóxi, heteroarilcarboxiloilóxi, etc.

O peptídeo de Oleanoyl utilizado na invenção age eficazmente por meio de múltiplos mecanismos na prevenção, retardo e/ou reversão do envelhecimento da pele provocado pela perda de elasticidade da mesma, deformação do colágeno, inflamação, danos dérmicos induzidos por radicais livres, etc.

A composição contém peptídeo de Oleanoyl individualmente ou em combinação com ingredientes ou extratos vegetais. A composição contendo o peptídeo de Oleanoyl e ingredientes ou extratos vegetais divulgados na invenção mostra um efeito sinérgico no tratamento de sinais específicos de envelhecimento da pele. Os ingredientes ou extratos vegetais são selecionados dentre um grupo compreendendo endosperma líquido de coco, extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, tetraidrocurcuminóides ou seus derivados, extrato de alcaçuz e combinações dos mesmos. Os estilbenos são selecionados dentre um grupo compreendendo oxiresveratrol, pterostilbeno, resveratrol, 3-hidroxipterostilbeno e combinações dos mesmos.

A concentração do peptídeo de Oleanoyl utilizado na invenção varia desde cerca de 0,0001 até cerca de 10%.

A concentração de ingredientes ou extratos vegetais utilizados na composição varia desde cerca de 0,0001 até cerca de 10%.

Em uma incorporação, a composição compreendendo peptídeo de Oleanoyl e endosperma líquido de coco proporciona um rejuvenescimento celular ampliado.

Em outra incorporação, a composição compreendendo peptídeo de Oleanoyl e extrato de amla proporciona uma proteçãçf ampliada contra os danos induzidos por UV.

Em ainda outra incorporação, a composição compreendendo peptídeo de

21/46 também

Oleanoyl e estilbenos ou seus derivados/extrato de alcaçuz/tetraidrocurcuminóides ou seus derivados proporciona um clareamento ampliado da pele.

Os ingredientes naturais doravante são referidos como “ingredientes ativos”. A composição de cuidado da pele antienvelhecimento da presente invenção compreende um veículo dermatologicamente aceitável. Esta substância age como um diluente, dispersante ou carreador para os ingredientes ativos. O veículo pode compreender materiais comumente empregados em produtos de cuidado da pele, incluindo, mas não limitado à água, uma solução aquosa tamponada, emolientes líquidos ou sólidos, óleos de silicone, emulsificadores, solventes, umectantes, agentes espessantes, pós, propulsantes e assemelhados.

Os componentes em pó da composição de cuidado da pele antienvelhecimento podem ser dissolvidos no veículo adequado para aumentar ou reduzir a força e, consequentemente, a potência do produto. Tais variações na força e potência podem ser altamente desejáveis na manutenção da eficácia da composição de cuidado da pele antienvelhecimento ao se tratar uma população altamente heterogênea constituída de indivíduos com grandes variações no tipo e condição da pele.

Além dos ingredientes ativos, a composição da presente invenção pode conter de forma ideal vários adjuntos cosméticos ou de fabricação. Por exemplo, filtros solares, e agentes clareadores da pele também podem ser incluídos. O veículo também pode incluir outros adjuntos como antioxidantes, perfumes, opacificadores, conservantes, colorantes e compostos iônicos, conforme necessário ou desejável para ampliar a eficácia, armazenamento, utilidade ou comerciabilidade da composição de cuidado da pele antienvelhecimento. Nas incorporações preferidas, a adição de perfumes ou outros agentes de mascaramento à composição

22/46 de cuidado da pele é desejável e/ou necessária para reduzir ou bloquear os odores associados à presença dos ingredientes ativos.

Para preparar a composição de cuidado da pele antienvelhecimento da presente invenção, várias técnicas podem ser empregadas. Por exemplo, os ingredientes ativos podem geralmente ser incorporados ao veículo dermatologicamente aceitável na maneira usual de preparo de produtos de cuidado da pele. Assim, os ingredientes ativos podem primeiro ser dissolvidos ou dispersados em uma porção de água ou outro solvente ou líquido para serem incorporados ao veículo dermatologicamente aceitável. As composições preferidas para uso nesta abordagem de fabricação são as emulsões de óleo em água, água em óleo ou água em óleo em água.

Contudo, em uma incorporação preferida, os ingredientes ativos, com ou sem os adjuntos acima descritos, são mantidos em um estado separado do carreador dermatologicamente aceitável, por exemplo, como pó seco. A composição de cuidado da pele antienvelhecimento resultante é então aplicada à pele da face, mãos, pernas, pescoço ou outras áreas onde seja.desejável por meio de aplicação manual para garantir uma cobertura completa e homogênea das áreas tratadas.

A composição de cuidado da pele antienvelhecimento da presente invenção pode encontrar-se na forma de produtos de cuidado da pele convencionais nãoenxaguáveis, incluindo, mas não se limitando a soluções aquosas, cremes, géis, loções, sprays, pomadas, pastas, mousses, cosméticos, etc. A composição de cuidado da pele antienvelhecimento também pode ser na forma de produtos enxaguáveis, incluindo, mas não se limitando a um gel para banho ou ducha, possivelmente contendo um sistema de distribuição para os ingredientes ativos promoverem sua adsorção ou aderência à pele durante o enxágüe. Mais

23/46 preferivelmente, o produto é um produto não-enxaguável; um produto a ser aplicado à pele sem uma etapa de enxágüe deliberada logo após a sua aplicação na pele.

A composição de cuidado da pele antienvelhecimento da presente invenção pode ser embalada de qualquer maneira adequada, incluindo, mas não se limitando a um jarro, frasco, tubo, stick, aplicador roll-on, dispositivo de spray aerossol, etc. na maneira convencional.

A presente invenção também proporciona um método para proporcionar um benefício de cuidado à pele como o retardo ou prevenção do enrugamento; retardo ou prevenção da flacidez; retardo ou prevenção da pele danificada pela luz solar; dando uma aparência jovem à pele; ampliando a deposição de colágeno na pele; retardando ou prevenindo a pele danificada pelo sol; dando uma aparência jovem à pele; ampliando a deposição de colágeno na pele; ampliando a reparação tecidual e o crescimento celular e melhorando a textura, suavidade ou firmeza da pele.

Nas incorporações preferidas, o método da presente invenção pode ser efetuado uma ou mais vezes diariamente na pele que requeira tratamento. Neste método, um pequeno volume da composição de cuidado da pele antienvelhecimento, por exemplo, de 0.1 a 5 ml, é aplicado na pele a partir de um recipiente adequado ou aplicador e espalhado e/ou esfregado na pele utilizando as mãos ou os dedos ou um dispositivo adequado. Uma etapa de enxágue pode opcionalmente ser efetuada a seguir dependendo se a composição for formulada como um produto não-enxaguável ou enxaguável. O aprimoramento da aparência da pele irá tornar-se visível dentro de um ou mais dias de uso, dependendo da condição da pele e da concentração, quantidade e'frequência com que a composição de cuidado da pele antienvelhecimento é utilizada.

As composições inventivas, métodos e usos descritos aqui resultam na

24/46 prevenção, redução ou retardo da formação de rugas e prevenção, redução ou retardo da perda de tônus da pele. As composições, métodos e usos aqui descritos também melhoram manchas, a textura, a suavidade ou a firmeza da pele e criam uma pele suave e maleável com elasticidade aprimorada. Uma melhora ^eral da í ’ aparência, textura e condição, em particular com relação ao brilho, claridade e aparência jovem em geral da pele, é obtida. A presente invenção fornece, portanto, uma ampla gama de resultados que são descritos coletivamente como benefícios antienvelhecimento proporcionados pelo peptídeo de Oleanoyl.

As composições inventivas, métodos e usos aqui descritos são também úteis para a aplicação tópica e para a regulação da condição da pele, incluindo descontinuidades visíveis e/ou tácteis na pele (especialmente na superfície da pele, tais descontinuidades são geralmente indesejáveis). Estas descontinuidades podem ser induzidas ou provocadas por fatores internos e/ou externos e incluem os sinais de envelhecimento da pele aqui descritos.

Os “sinais de envelhecimento da pele” incluem, mas não são limitados a todas as manifestações externas visíveis e tatilmente perceptíveis bem como quaisquer outros macro ou microefeitos devido ao envelhecimento da pele. Tais sinais podem ser induzidos ou provocados por fatores intrínsecos ou extrínsecos, por exemplo, envelhecimento cronológico e/ou dano ambiental. Estes sinais podem resultar de processos que incluem, mas não se limitam ao desenvolvimento de descontinuidades texturais como rugas, incluindo tanto rugas finas superficiais quanto rugas profundas e grossas, linhas, depressões e protuberâncias na pele, poros grandes (por exemplo, associados ccjfn estruturas anexiais como os dutos das glândulas sudoríparas, glândulas sebáceas ou folículos pilosos), escamosidade e/ou outras formas de irregularidade ou aspereza da pele, perda de elasticidade da pele

25/46 (perda e/ou desativação da elastina funcional da pele), flacidez (incluindo inchaço na área dos olhos e papadas), perda de firmeza da pele, perda de rigidez da pele, perda da capacidade da pele de se recuperar da deformação, vermelhidão ou descoloração (incluindo olheiras), manchas, palidez, regiões hiperpigment^das da pele como manchas de envelhecimento e sardas, queratoses, diferenciação anômala, hiperqueratinização, elastose, ruptura do colágeno e outras alterações histológicas no stratum corneum, derme, epiderme, sistema vascular da pele (por exemplo, telangiectasia ou microvarizes) e tecidos subjacentes, especialmente aqueles próximos da pele.

Deve-se entender que a presente invenção não está limitada à prevenção, redução ou retardo dos “sinais de envelhecimento da pele’ acima mencionados que surgem em vista de mecanismos associados com o envelhecimento da pele, mas visa a incluir a prevenção, redução ou retardo dos referidos sinais independentemente do mecanismo de origem.

EXEMPLOS

As características acima e outras vantagens da presente invenção serão compreendidas de forma mais clara a partir da descrição detalhada a seguir junto com os exemplos.

Extrato de Olea europaea: é um pó de cor creme com o componente ativo triterpenóide ácido oleanólico, com mais de 90% de pureza. A fonte são as folhas de Olea europaea (oliveira).

Pentapeptídeo, Lisil-Treonil-Treonil-Lisil-Serina (SEQ ID N° 1): É um peptídeo da sequência geral Lisil-Treonil-Treonil-Lisi^Serina que é produto da degradação do colágeno (K. Katayama, J. A. Borunda, R. Raghow, A. H. Kang, J. M. Sayer, J. Biol. Chem, 268, 9941 (1993).

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Exemplo 1

O pentapeptídeo da SEQ ID N° 1 ligada ao triterpenóide ácido oleanólico (o ácido oleanólico está ligado ao terminal lisina do peptídeo da SEQ ID N° 1), reduz sinergicamente ou retarda os sintomas do envelhecimento ao manter um ^guilíbrio sadio entre a síntese de colágeno e a decomposição de colágeno na matriz dérmica da pele.

Assim, o peptídeo de Oleanoyl é dotado de todos os modos de ação antienvelhecimento como a atividade inibitória da serina protease, a atividade antiinflamatória, atividade antioxidante, atividade de promoção do colágeno, etc.

As composições cosméticas tópicas da presente invenção contendo peptídeo de Oleanoyl individualmente ou em combinação com ingredientes ou extratos vegetais é preparado em forma líquida ou semi-sólida através da mistura com os ingredientes básicos, adjuvantes e aditivos comumente utilizados no campo da cosmética. Os cosméticos em forma líquida ou semi-sólida incluem, mas não se limitam às loções, cremes e géis para a pele.

As composições para a aplicação tópica também podem ser utilizadas em loções corporais e formulações cosméticas para máscara facial e peeling.

Embora as incorporações preferidas da presente invenção tenham sido divulgadas para fins ilustrativos, aqueles habilitados na área apreciarão que várias modificações, adições e substituições são possíveis, sem desviar do escopo e do espírito da invenção como divulgado nas reivindicações anexas.

Exemplo 1: Síntese química do peptídeo de Oleanoyl

Acetiloleanovl Lys (Z)-Thr (Bzl)-Thr (BzD-Lvar (Z)-Ser (Bzl)-OBzl

Ácido acetiloleanólico (5 GMs, 10 mmóis) é dissolvido em 50 ml de clorofórmio e resfriado até 0°C. 20 ml de cloreto de tionila destilado são adicionados

27/46 em gotas à mistura de reação. A mistura foi agitada em baixa temperatura por 30 min e então sob temperatura ambiente por 2 h. Os solventes são então removidos completamente a vácuo e o resíduo é seco. TFA.Lys (Z)-Thr (Bzl)-Thr (Bzl)-Lys (Z)Ser (Bzl)-OBzl (9.3 GMs, 7.14 mmóis) é retirado com 100 ml de clorofórmio e

I resfriado até 0°C. Sob agitação, 5 ml de trietilamina são adicionados e o pH desta solução é ajustado até 8-9. A solução de pentapeptídeo é resfriada até 10°C e, sob agitação, a solução de cloreto de acetiloleanoyl preparada acima (em 25 ml de clorofórmio) é lentamente adicionada. A mistura é agitada em baixa temperatura por 15 min e em temperatura ambiente até a reação ser concluída. A mistura de reação é então lavada com solução de KHSO₄ a 10% (3 vezes), água, solução saturada de NaHCO₃ (3 vezes), água e solução de NaCl saturada. Ela é finalmente seca sobre Na₂SO₄ anídrico e concentrado sob vácuo. O resíduo é precipitado utilizando acetato de etila/éter de petróleo (7:3). Então o precipitado é filtrado e seco a vácuo. Rendimento de 13.4 g (80%). O espectro de massas indicou o pico m/e desejado em 1673 e a RMN de alta resolução estava em conformidade com a estrutura desejada. Acetiloleanoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH

Acetiloleanoyl-Lys (Z)-Thr (Bzl)-Thr (Bzl)-Lys (Z)-Ser (Bzl)-OBzl (10 GMs, 6 mmóis) é misturado com 100 ml de ácido acético a 5% em metanol e transferido para um hidrogenador. 2 g de Pd-C a 10% são adicionados à mistura de reação. A hidrogenação é realizada a uma temperatura de 60°C utilizando pressão de hidrogênio de 5 kg. Após a conclusão da reação, o catalisador foi filtrado e a mistura de reação foi concentrada a vácuo. O resíduo foi precipitado adicionando-se Acetonitrila. O sólido foi filtrado e seco. Rertdimento de 5.6 g (90%). O espectro de massas mostrou o pico do íon molecular em 1045. Oleanoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-QH(Peptídeo de Oleanovl)

28/46

O acetiloleanoyl-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser-OH obtido acima (5 GMs, 4.8 mmóis) foi absorvido em 25 ml de metanol e agitado. A esta mistura, 25 ml de uma solução de 2M de LiOH foram adicionados e agitados por 2 horas. O metanol foi retirado da mistura de reação. A solução aquosa lavada com acetato de etila e acidificada com i solução de 1N de NCI até um pH de 7-8. A solução aquosa foi então evaporada até secar. Metanol foi adicionado ao resíduo e os sais insolúveis foram filtrados. A solução foi concentrada e precipitada utilizando éter de dietila seco. O sólido (peptídeo de Oleanoyl) foi então filtrado e seco. Rendimento de 4.1 g (85%). O espectro ES-MS mostrou o pico do íon molecular em m/e 1001 (M-H).

A ligação do ácido oleanólico ao pentapeptídeo da SEQ ID N° 1 (Lisil-TreonilTreonil-Lisil-Serina) (Figura 1) realça significativamente o potencial antienvelhecimento do pentapeptídeo com modos múltiplos de ação. Assim, o peptídeo de oleanoyl da invenção serve como uma molécula melhor e inovadora para o tratamento dos problemas de pele.

Exemplo 2: Potencial antienvelhecimento do peptídeo de Oleanoyl

Estudo in vitro:

Potencial inibitório da colagenase:

O potencial inibitório da colagenase do peptídeo de Oleanoyl foi determinado utilizando o kit de ensaio da colagenase com sondas moleculares EnzChek®, que propicia a alta sensibilidade exigida para o teste de inibidores em um formato de alto rendimento. O kit EnzChek contém DQgelatin, gelatina conjugada com fluoresceína. Este substrato é digerido eficientemente pela maioria das gelatinases e colagenases a fim de produzir peptídeos altamente fluorescentes. O aumento da fluorescência é proporcional à atividade proteolítica e pode ser monitorado com um leitor de fluorescência de microplacas. A redução da fluorescência é diretamente proporcional

29/46 à atividade inibitória colagenase da amostra. A colagenase utilizada para o ensaio é purificada a partir do Clostridium histolyticum. Utilizando 100 pg/mL de DQ Gelatin e um período de incubação de 30 minutos, o ensaio pode detectar a atividade desta enzima até uma concentração final de 2 χ 10’³ U/mL (7 ng de proteína/mL·), onde uma unidade é definida como a quantidade de enzima necessária para liberar 1 pmol de equivalentes da L-leucina a partir do colágeno em 5 horas a 37°C, pH 7.5.

Concentrações variáveis do peptídeo de Oleanoyl em um veículo adequado (PBS ou DMSO a 2% que não afeta a intensidade de fluorescência) foram préincubadas por 10 minutos com 12.5 pg/ml do substrato, gelatina DQ (da pele suína), conjugado de fluoresceína e então 0.2U/ml de Colagenase Tipo IV da enzima de Clostridium histolyticum foram adicionados. A intensidade da fluorescência foi medida após 30 minutos (Em: 485nm e Ex: 520nm.) no leitor de microplacas. A atividade inibitória dose-dependente do peptídeo de Oleanoyl é calculada e os resultados são expressos como valores IC₅o utilizando software Graphpad Prism.

A percentagem de inibição da colagenase é calculada como a seguir, % de inibição = [(C-T) / C] X 100

Onde C = absorvência devido à atividade da colagenase na ausência do inibidor

T = absorvência devido à atividade de colagenase na presença do inibidor

O valor IC₅₀ é a concentração exigida para 50% de inibição da atividade da colagenase e, por isso, um valor IC₅o mais baixo indica um melhor potencial inibitório da colagenase. A partir da tabela 1, fica evidente que o peptídeo de Oleanoyl mostra uma atividade inibitória da colagenase significativa quando comparado com o ácido oleanólico, o peptídeo da SEQ ID N° 1 e Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser (grupo palmitoil ligado à SEQ ID N° 1) individualmente.

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A Figura 2 fornece a % de inibição da colagenase em várias concentrações do peptídeo de Oleanoyl.

Potencial inibitório da elastase:

O potencial de inibição da elastase do peptídeo de Oleanoyl foi determinado

I ' utilizando um Kit de Ensaio da Elastase com Sondas Moleculares EnzChek® que proporciona a alta sensibilidade necessária para testar inibidores em um formato de alto rendimento. O kit EnzChek contém DQelastin, conjugado de fluoresceína, elastina solúvel do ligamento do pescoço bovino. Este substrato é eficientemente digerido pela elastase a fim de produzir peptídeos altamente fluorescentes. O aumento da fluorescência é proporcional à atividade proteolítica e pode ser monitorado com o leitor de fluorescência de microplacas. A redução da fluorescência é diretamente proporcional à atividade de inibição da elastase pela amostra. A elastase utilizada para o ensaio é purificada a partir do pâncreas suíno.

Concentrações variáveis do peptídeo de Oleanoyl em um veículo adequado (PBS ou DMSO a 2% que não afeta a intensidade de fluorescência) foram préincubadas por 10 minutos com o substrato, 25pg/ml de DQ Elastin (proveniente do ligamento do pescoço bovino), conjugado de fluoresceína e 0.1U/ml da enzima elastase do pâncreas suíno foram adicionados. A intensidade da fluorescência foi medida após 30 minutos (Em: 485nm e Ex: 520nm) no leitor de microplacas. A atividade inibitória dose-dependente das amostras é calculada e os resultados são expressos como valores IC₅o utilizando o software Graphpad Prism.

A percentagem de inibição da elastase é calculada da seguinte forma, % de inibição = [(C-T) / C] X 100 '

Onde C = absorvância devido à atividade de elastase na ausência do inibidor

T = absorvância devido à atividade de elastase na presença do inibidor

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O valor IC₅o é a concentração exigida para 50% de inibição da atividade da elastase e, por isso, um valor IC₅o mais baixo indica um melhor potencial inibitório da elastase. O valor IC₅o do peptídeo de Oleanoyl (tabela 1) indica claramente que ele mostra um melhor potencial inibitório da elastase do que Pal-Lys-Thr-Thr^Lys-Ser

I ' (grupo palmitoil ligado à SEQ ID N° 1). O ácido oleanólico e o peptídeo da SEQ ID N° 1 não mostraram inibição da elastase individualmente.

A figura 3 fornece a % de inibição da elastase na concentração variável do peptídeo de Oleanoyl.

Ampliação do colágeno:

A ampliação do colágeno facilita o reparo do dano à pele devido a várias condições estressantes.

A ampliação do colágeno foi determinada utilizando corante Sirius Red, o qual se liga com maior especificidade ao colágeno tipo I e colágeno tipo III da matriz extracelular. O corante ligado ao colágeno é dissolvido e a densidade óptica (OD) é medida de maneira espectrofotométrica Utilizando um. leitor de placas de microtitulação Fluostar Optima em 544 nm. A OD do corante ligado ao colágeno é diretamente proporcional ao teor de colágeno nas células.

Células de osteossarcoma do osso humano foram utilizadas para estudos de ampliação do colágeno. As células foram semeadas com uma densidade de semeadura de 10000 células por poço em uma placa de 24 poços. As monocamadas confluentes das células foram inicialmente tratadas com concentrações variáveis não citotóxicas do peptídeo de Oleanoyl e do veículo (controle) no meio de cultura. Para cada concentração, 4 réplicas foram mantidas e a análise foi realizada duas vezes para que o valor ‘ri fosse 8. Após o tratamento da amostra, as células foram incubadas em uma incubadora de CO₂ por 48 h. As

32/46 células foram então desenvolvidas por meio da técnica de coloração com Sirius Red para analisar a ampliação do colágeno. As células foram lavadas extensamente com PBS. As células foram fixadas utilizando líquido de Bouin contendo 1,3% de ácido pícrico, 35% de formaldeído e ácido acético glacial em uma razão de 15/5:1 por meio de incubação com 1 ml de líquido de Bouin por poço durante 1 h sob temperatura ambiente. O fixador foi então removido por sucção com uma micropipeta e as células foram lavadas sob água de torneira por 15 minutos. Após a secagem a ar da placa de cultura, as células foram coradas com 0,1% de corante Sirius Red em 1,3% de ácido pícrico. Adicionou-se 1 ml por poço do corante Sirius Red e as células foram incubadas por 1 h sob agitação leve de 70 RPM no agitador Orbitek. O corante foi então removido por sucção e as células foram lavadas extensamente com 0.01 N de HCI para remover o corante não fixado. O corante ligado ao colágeno foi então dissolvido em 0.2 ml de 0.1 N de NaOH por poço por 30 minutos sob leve agitação de 70 RPM em um agitador Orbitek sob temperatura ambiente. O corante foi então transferido para a microplaca de 96 poços e a OD foi lida a 544 nm no leitor de microplacas Fluostar Optima.

A percentagem de ampliação do colágeno em relação às células não tratadas considerando a OD de células não tratadas como ótima sob condições normais é calculada da seguinte forma, % de ampliação do crescimento celular = [(100/C) X T] - 100

Onde C = absorvância devido ao colágeno nas células não tratadas

T = absorvância devido ao colágeno nas células tratadas

Observou-se que o peptídeo de Ole^hoyl mostrou uma ampliação de 17% do colágeno a 1.25 ppm, Pal-Lys-Thr-Thr-Lys-Ser (grupo palmitoil ligado à SEQ ID N°1) mostrou 11% de ampliação do colágeno a 1.25 ppm, o peptídeo da SEQ ID N°1

33/46 mostrou 5% de ampliação do colágeno a 1.25 ppm, enquanto que o ácido oleanólico não mostrou qualquer ampliação. É claro que o peptídeo de Oleanoyl mostra uma melhor ampliação do colágeno em comparação com os outros.

Potencial antioxidante:

-------------------------------------------------- 7 ' i

Ensaio de sequestro com DPPH (radical 1, 1 -difenil-2-picril-hidrazila):

O ensaio com DPPH é frequentemente utilizado para avaliar a habilidade dos antioxidantes de sequestrar radicais livres que são conhecidos como um fator importante nos danos biológicos provocados pelo estresse oxidativo. Sabe-se que este ensaio fornece informações confiáveis a respeito da habilidade antioxidante dos compostos testados. O ensaio é baseado na mudança de cor do radical livre estável DPPH do roxo para o amarelo à medida que o radical é inibido pelo antioxidante.

Os tubos de mistura do ensaio contendo 1.5 ml de 0.1 mM de solução metanólica com DPPH e concentrações variáveis da amostra em um volume total de 3 ml foram incubados a 37°C por 30 minutos em banho-maria sob agitação. A redução da absorvância que é diretamente proporcional ao. sequestro do radical é medida de forma espectrofotométrica a 517 nm. A .atividade de sequestro do radical livre dose-dependente das amostras é calculada e os resultados são expressos como valores SC₅o utilizando o software Graphpad Prism.

A percentagem de sequestro é calculada da forma seguinte, % de sequestro = [(C-T) / C] X 100

Onde C = absorvância na ausência do inibidor

T = absorvância na presença do inibidor

O valor SC₅o é a concentração necessária para 50% de sequestro dos radicais livres e, por isso, um valor SC₅o mais baixo indica um melhor potencial antioxidante. Fica aparente a partir da tabela 1 que o peptídeo de Oleanoyl mostra

34/46 atividade de seqüestro do DPPH.

Potencial antiinflamatório:

Potencial de inibição do TNF-a:

Para o estudo da inibição do TNF-α, é utilizado sangue humano t^tal. No ensaio de sangue total, os monócitos parecem ser a fonte principal de TNF-α na estimulação com lipopolissacarídeo (LPS). Os monócitos e macrófagos são a principal fonte de TNF-α além de outros tipos de células como os eosinófilos, mastócitos, linfócitos periféricos e granulócitos. A ativação das células inflamatórias é influenciada pelos níveis intracelulares de c-AMP que são regulados pela isoenzima fosfodiesterase. O LPS é o estímulo mais potente da produção de TNF-a no sangue humano. Após a estimulação, o ensaio emprega a técnica quantitativa de imunoensaio enzimático do tipo sanduíche. Um anticorpo monoclonal específico para o TNF-α foi pré-revestido em uma microplaca. O TNF-α presente na amostra é ligado pelo anticorpo imobilizado. Após remover por lavagem quaisquer substâncias não ligadas, um anticorpo policlonal ligado a uma enzima específico para o TNF-α é adicionado. Após a lavagem para remover qualquer reagente enzimático para anticorpo não ligado, uma solução de substrato é adicionada aos poços e a cor desenvolve-se proporcionalmente à quantidade de TNF- α ligado na etapa inicial. O desenvolvimento da cor é interrompido e a intensidade cromática é diretamente proporcional ao teor de TNF-a.

Sangue heparinizado proveniente de doadores sadios foi diluído 1:3 em meio de cultura RPMI 1640 contendo 10% de FBS. As amostras de sangue diluído foram pré-incubadas com concentrações variáveis de peptídeo de Oleanoyl no veículo adequado (PBS ou 0,1% de DMSO) por 1 hora a 37°C em uma incubadora com 5% de CO₂. DMSO a 0,1% foi utilizado como veículo para as amostras insolúveis na

35/46 água. Após a pré-incubação, as células de sangue total foram estimuladas por 1 ng/mL de LPS para a liberação de TNF-α a partir de macrófagos por meio de incubação por 5 horas a 37°C em uma incubadora com 5% de CO₂. As amostras foram então centrifugadas em 3000 g por 3 minutos a 4°C e o sobrenadante foi /

ensaiado quanto ao teor de TNF-α através da utilização do kit Elisa para TNF-a. 200 pL do sobrenadante de todos os tubos foram transferidas para uma placa de microtitulação nos respectivos poços (microplaca para anticorpo monoclonal de camundongo pré-revestida) seguido pela adição de 50 pL dos diluentes de ensaio em todos os poços. Após a incubação por 2h em temperatura ambiente, os poços foram lavados minuciosamente com o tampão de lavagem fornecido e então 200 pL do conjugado foram adicionados a cada poço. A placa foi incubada por 2h em temperatura ambiente. Após nova lavagem, 200 pL da solução de substrato foram adicionados a cada poço e incubados por 20 minutos em temperatura ambiente. Foram adicionados 50 pl_ da Solução Stop em cada poço, a qual irá causar a mudança de cor nos poços de azul para amarelo. A densidade óptica foi lida a 450 nm, o que é diretamente proporcional ao teor de TNF-α, e a percentagem de inibição do teor de TNF-α durante o tratamento com a amostra foi calculada em relação à das células não tratadas. A atividade inibitória dose-dependente das amostras foi calculada e os resultados foram expressos como valores IC₅o utilizando o software Graphpad Prism.

A percentagem de inibição da elastase é calculada como a seguir, % de inibição = [(C-T) / C] X 100

Onde C = absorvência devido ao TNF-α na ausência do inibidor

T = absorvância devido ao TNF-α na presença do inibidor

O valor IC50 é a concentração necessária para 50% de inibição do TNF-α e,

36/46 por isso, o valor IC₅o mais baixo indica um melhor potencial de inibição do TNF-a.

O procedimento acima também é seguido para determinar a inibição de LTB4 pelo peptídeo de Oleanoyl. A partir dos resultados tabulados na tabela 1, fica claro que o peptídeo de Oleanoyl é um melhor inibidor do TNF-α e LTB4. <

i ’

A figura 4 representa a inibição do TNF-α em concentrações variáveis do peptídeo de Oleanoyl.

Tabela 1: Estudo in vitro do potencial antienvelhecimento do peptídeo de Oleanoyl

Composto	Inibição de elastase (IC50 pg/ml)	Inibição de colagena se (IC50 pg/ml)	Inibição de TNF α (IC50 pg/ml)	Inibição de LTB4	Atividade pelo método anti- oxidante DPPH
Peptídeo Oleanoyl	143	119	21	26% de inibição a 0.625 pg/ml	29% de inibição a 300 pg/ml
Ácido oleanóico	Nil	129	17% de inibição a 100 pg/ml	Nil	Nil
Peptídeo da SEQ ID No. 1	Nil	24% de inibição a 500 pg/ml	Nil	Nil	Nil
Pal- Lys-ThrThr-Lys- Ser (Grupo palmitoil anexado para SEQ ID No. 1)	16% de inibição a 500 pg/ml	38% de inibição a 500 pg/ml	Nil	Nil	Nil
0 pept	'deo de 0	eanoyl também móstrou inibição da expressão de IL-Ιβ. A

inibição máxima revelada foi de 31,78% de inibição da expressão de IL-Ιβ em concentrações de 1 pg/ml (Tabela 2, Figura 5).

37/46

Observações experimentais foram efetuadas no neutrófilo humano que foi desafiado com LPS. As medidas do sobrenadante na cultura celular revelaram uma redução significativa na expressão de IL-6 de 28,03% a 4 pg/ml (Tabela 3, Figura 6). Rolipram a um nível de dose de 100 pg/ml foi utilizado como droga padrão para /

observar a autenticidade e reprodutibilidade do delineamento experimental.

O peptídeo de Oleanoyl foi também testado quanto à expressão de NO e PGE₂. Foi revelada uma inibição máxima de 31,85% e 50,00% da expressão de NO e PGE2 a uma concentração de 2 pg/ml (Tabela 4, Figura 7; Tabela 5, Figura 8).

A habilidade do peptídeo de oleanoyl de inibir marcadores inflamatórios como

TNF a, IL- 1β, IL-6, LTB4, NO e PGE₂ é indicativo de seu papel no tratamento do envelhecimento da pele devido à inflamação.

Tabela 2: Efeito do peptídeo de Oleanoyl (OP) em doses graduadas sobre a expressão de Interleucina -1 beta (IL-1 β) extracelular a partir de neutrófilos humanos

Número da amostra	Amostras	Concentração da amostra teste (pg/ml)	Concentração da IL1β produzida (pg/ml) Média ± desvio padrão	% de atividade da expressão de IL-1 contra o controle LPS
	Controle LPS		139.58±2.98
1	OP	0.125	130.79±3.07	6.29;
2	OP	0.25	119.44±2.23	14.42;
3	OP	0.5	109.72±3.21	21.39;
4	OP	1	96.61 ±3.63** t	30.78;
5	OP	2	102.08±2.61*	26.86;
6	OP	4	100.45 ±3.78*	28.03 ;

38/46

Rolipram (Padrão)

100

67.52±2.07**

51.62f

Número de observações-3; Controle LPS: Controle de lipopolissacarídeo;

;: inibição da expressão de IL-1 β; Valor P: *<0.01; **<0.001

Tabela 3: Efeito do peptídeo de Oleanoyl (OP) em doses graduadas ^obre a expressão de interleucina extracelular (IL-6) a partir de neutrófilos humanos

Número da amostra	Amostras	Concentração da amostra teste (pg/ml)	Concentração da IL-6 produzida (pg/ml) Média ± desvio padrão	% da atividade da expressão de IL-6 contra o controle LPS
	Controle LPS		142.24 ± 1.87
1	OP	0.125	130.38±2.11	8.33;
2	OP	0.25	123.92±2.09	12.87;
3	OP	0.5	117.23±2.84	17.58;
4	OP	1	106.81±3.79*	24.90;
5	OP	2	104.75 ±5.31**	26.35;
6	OP	4	101.11 ±2.87**	28.91 ;
	Rolipram (Padrão)	100	72.65 ± 2.07**	48.92 ;

Número de observações-3; Controle LPS: Controle.de lipopolissacarídeo; ;: inibição da expressão de IL-6; valor P: *<0.01; **<0.001

Tabela 4: Efeito do peptídeo de Oleanoyl (OP) em doses graduadas sobre a expressão de Prostaglandina extracelular E2 (PGE₂) a partir de neutrófilos humanos

Número da amostra	Amostras	Concentração da amostra teste (pg/ml)	Concentração da PGE₂ produzida (pg/ml) Média ± desvio padrão	% da atividade da expressão de PGE₂contra o controle LPS
	Controle LPS		768.98± 11.21
1	OP	0.125	573.82±6.08	25.37;

39/46

2	OP	0.25	501.64±7.56	34.761
3	OP	0.5	468.31±6.41*	39.091
4	OP	1	419.53±5.07**	45.441 f J > JÍ
5	OP	2	384.44±8.02**	50.001
6	OP	4	395.81 ±4.68**	48.52 1
	Rolipram (Padrão)	100	265.71±10.09**	65.44 1

Número de observações-3; Controle LPS: Controle de lipopolissacarídeo; 1: inibição da expressão de NO; valor P: *<0.01; **<0.001

Tabela 5: Efeito do peptídeo de Oleanoyl (OP) em doses graduadas sobre a expressão de Óxido Nítrico (NO) extracelular a partir de neutrófilos humanos

Número da amostra	Amostras	Concentração da amostra teste (pg/ml)	Concentração do NO produzido (pmol /ml) Média ± desvio padrão	% da atividade da expressão de NO contra o controle LPS
	LPS controle		44.33 ± 1.01.
1	OP	0.125	42.77±1.42	3.511
2	OP	0.25	41.21±1.05	7.031
3	OP	0.5	39.25±1.08	11.451
4	OP	1	34.12±2.00*	23.031
5	OP	2	30.21±1.18**	31.851
6	OP	4	31.18 ± 1.20**	29.66 1
	Rolipram (Padrão)	100	24.83 ±2.07**	43.98 1

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Número de observações-3; Controle LPS: Controle de lipopolissacarídeo; f inibição da expressão de NO; valor P: *<0.01; **<0.001

Exemplo 3: Estudo do efeito do peptídeo de Oleanovl em humanos

Para estudar o efeito potencial do peptídeo de Oleanoyl na pele humana, os candidatos foram selecionados internamente com idade variando de 30 a 60 anos com sinais de envelhecimento entre moderados e severos. Uma composição tópica incluindo o peptídeo de Oleanoyl (0,01%) foi preparada na forma de um creme para aplicação na pele.

O creme contendo o peptídeo de Oleanoyl foi aplicado sobre as áreas afetadas da pele facial dos candidatos duas vezes por dia por um período contínuo de três semanas. Foram tiradas fotos dos candidatos antes e depois das três semanas de aplicação do creme.

A Figura 9 (a) e 9 (b) representa uma fotografia do candidato tirada antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl. É evidente que as rugas foram suavizadas após a aplicação do peptídeo de Oleanoyl.

A Figura 10 (a) e 10 (b) representa uma fotografia do candidato tirada antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl. É evidente que existe uma melhora na espessura da pele após a aplicação do peptídeo de Oleanoyl.

A Figura 11 (a) e 11 (b) representa uma fotografia do candidato tirada antes e depois da aplicação do peptídeo de Oleanoyl. É evidente que existe uma redução na hiperpigmentação após a aplicação do peptídeo de oleanoyl.

A Figura 12 (a) e 12 (b) representa uma fotografia do candidato tirada antes e depois da aplicação do peptídeo de Olearpyl. É evidente que existe uma redução das olheiras após a aplicação do peptídeo de oleanoyl.

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Todas estas evidências são claramente indicativas do potencial antienvelhecimento multifuncional do peptídeo de Oleanoyl.

Exemplo 4: Preparação das composições contendo peptídeo de Oleanovl ou extratos vegetais 'i

Em uma incorporação da presente invenção, vários ingredientes e extratos vegetais são utilizados em combinação com o peptídeo de Oleanoyl. Componentes específicos são selecionados a partir do grupo compreendendo endosperma líquido de coco, extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, extrato de alcaçuz e tetraidrocurcuminóides ou seus derivados. Estes componentes são utilizados 10 individualmente com o peptídeo de Oleanoyl ou em combinações. O pó seco dos componentes e do peptídeo de Oleanoyl é misturado em proporções determinadas, dissolvido em água ou qualquer outro solvente para chegar à composição. Cada componente utilizado na invenção com peptídeo de Oleanoyl mostra uma atividade significativa para o tratamento de sinais específicos de envelhecimento da pele.

Composição contendo peptídeo de Oleanoyl é endosperma líquido de coco para um rejuvenescimento ampliado da pele

Ampliação da proliferação celular:

Fibroblastos de camundongo suíço 3T3 foram utilizados para estudos de proliferação celular. As células foram semeadas com uma densidade de semeadura 20 de 3000 células por poço em uma placa de 96 poços em meio DMEM. As monocamadas confluentes dos fibroblastos de camundongo suíço 3T3 foram tratadas com concentrações não tóxicas variáveis da amostra (composição contendo peptídeo de Oleanoyl e endosperma líquido'de coco) e veículo (controle) no meio de cultura sem FBS. Para cada concentração, 6 réplicas foram mantidas e a análise foi 25 realizada duas vezes de modo que o valor ‘n’ fosse 12. Após o tratamento com a

42/46 amostra, as células foram incubadas em incubador CO₂ por 72 horas. As células foram então reveladas pela técnica de coloração NRU para analisar a viabilidade celular. As células foram incubadas com uma solução a 0,003% de vermelho neutro preparado em meio DMEM pré-aquecido por 3 horas a 37°C em uma incubadora de

Ϊ

CO₂. O excesso de corante foi então removido com tampão fosfato-salino (PBS). O corante lisossômico foi extraído em 100μΙ de solução reveladora consistindo em 25 ml de água, 24.5 ml de etanol e 0.5 ml de ácido acético glacial em temperatura ambiente por 20 min. A densidade óptica (OD) foi lida a 492 nm utilizando um leitor de microplacas Fluostar Optima.

A percentagem de ampliação do crescimento celular com relação às células não tratadas considerando a OD das células não tratadas como ótima sob condições normais é calculada da seguinte forma, % de ampliação do crescimento celular = [(100/C)XT]-100

Onde C = absorvância devido ao crescimento celular nas células não tratadas

T = absorvância devido ao crescimento celular nas células tratadas com a amostra

Os resultados tabulados na tabela 6 e figura 13 mostram que a proliferação celular é significativamente ampliada em células tratadas com a composição contendo peptídeo de Oleanoyl e endosperma líquido de coco, indicando, assim, que a composição é útil para o rejuvenescimento da pele.

Tabela 6:

Produto	Aumento da proliferação celular
Endosperma líquido de coco	35 ± 5 % de aumento em comparação com as células não tratadas com concentração de 5pg/ml.
Peptídeo de oleanoyl	15 ± 2 % de aumerfto em comparação com as células não tratadas com concentração de 5pg/ml.
Composição de endosperma líquido de	85 + 8 % de aumento em comparação com as células não tratadas com concentração de 5pg/ml.

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coco e peptídeo de oleanoyl (1:1)
Composição contendo	peptídeo de Oleanovl e extrato de amla para uma eficácia

ampliada da proteção UVB

Células do tipo fibroblasto de camundongo suíço 3T3 foram utilizadas nos estudos de proteção UV. As células foram semeadas com uma densidade de semeadura de 3000 células por poço em uma placa de 96 poços. Monocamadas confluentes dos fibroblastos do camundongo suíço 3T3 foram inicialmente tratadas com concentrações variáveis da amostra (composição contendo peptídeo de Oleanoyl e extrato de amla) e do veículo (controle) no meio de cultura e expostas a uma irradiação UVB de 0.036 J cm² para determinar a concentração não tóxica mais 10 alta em que a amostra fornece proteção UV máxima. 0.036 J cm² foi padronizado como a dosagem de UV exigida para provocar aproximadamente 50% de morte celular nas culturas de células na ausência de proteção. Uma placa de controle também foi mantida sob condições similares sem exposição ao UV, podendo somente fornecer observações sobre o potencial citotóxico da amostra. Para cada 15 concentração, 6 réplicas foram mantidas e a análise foi realizada duas vezes de modo que o valor “n fosse 12. Após a exposição ao UV, o meio foi substituído por um meio fresco sem amostra e as células foram incubadas em uma incubadora de CO₂ por 48 horas. As células foram então reveladas pela técnica de coloração NRU para analisar a viabilidade celular. As células foram incubadas com solução de 20 vermelho neutro a 0,003% preparada em meio DMEM pré-aquecido por 3 horas a 37°C em uma incubadora de CO₂. O excesso de corante foi então removido com tampão fosfato-salino (PBS). O corante fisossômico foi extraído em 100 pl de solução reveladora consistindo em 25 ml de água, 24.5 ml de etanol e 0.5 ml de

44/46 ácido acético glacial em temperatura ambiente por 20 min. A densidade óptica (OD) foi lida a 492 nm utilizando um leitor de microplacas.

O percentual de redução da citotoxicidade induzida por UV, isto é, a percentagem de proteção UV, foi calculada em relação à citotoxicidade nas células i

expostas comparada com a das células não expostas na presença e ausência da amostra.

% de citotoxicidade induzida por UV nas células sem tratamento da amostra (U1) = [(C1-T1) / C1] X 100

C1 = Absorvância devido à viabilidade celular nas células não expostas.

T1 = Absorvância devido à viabilidade celular nas células expostas a UV.

% de citotoxicidade induzida por UV nas células tratadas com a amostra (U2) = [(C2T2)/C2]X 100

C2 = Absorvância devido à viabilidade celular nas células tratadas com a amostra e não expostas.

T2 = Absorvância devido à viabilidade celular em células tratadas com a amostra e expostas a UV.

% de proteção UV = [(U1-U2) / U1] X 100

U1 = % de citotoxicidade induzida por UV em células sem tratamento com a amostra.

U2 - % de citotoxicidade induzida em células tratadas com a amostra.

Os resultados na Tabela 7 e figura 14 mostram que a composição contendo peptídeo de Oleanoyl e extrato de amla proporciona uma proteção UV ampliada, indicando assim que a composição é útil rp proteção da pele contra os danos por UV.

Tabela 7

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Produto	% de proteção UVB
Extrato de amla	53 ± 4 % de proteção UVB em comparação com as células não tratadas com concentração de 40 pg/ml.
Peptídeo de oleanoyl	13 ± 2.2 % de proteção UVB em compararão com as células não tratadas com concentração de 40 pg/ml.
Composição de extrato de amla e peptídeo de oleanoyl (1:1)	80 ± 8 % de proteção UVB em comparação com as células não tratadas com concentração de 40 pg/ml.

Composição contendo peptídeo de Oleanoyl e estilbenos/extrato de alcaçuz/tetraidrocurcuminóides (THC) para inibição ampliada da melanina

Células de melanoma de camundongo B16F1 foram semeadas em uma placa de microtitulação de 6 poços a uma densidade de semeadura de 5000 células por poço em 2 ml de meio DMEM por poço. Após 24 horas de incubação em uma incubadora de CO₂, a produção de melanina é induzida por 0.1 nM de O-MSH através da substituição do meio por um meio contendo O-MSH. As células foram então tratadas com concentrações variáveis da amostra (composição contendo peptídeo de oleanoyl e estilbenos/extrato de alcaçuz/THC) por um período de 9 dias com renovação do meio contendo O-MSH e da amostra em intervalos regulares de dias. Os poços de controle foram mantidos sem tratamento da amostra e somente com o veículo utilizado para a preparação da amostra. Após o período de incubação, o meio foi removido e as células foram raspadas e lavadas em PBS. Posteriormente, 15 a melanina foi extraída através de 1N de NaOH em banho de água fervente por 5 minutos. A absorvância do extrato de mejanina foi lido a 405nm em um leitor de %

microplaca. O efeito inibitório da amostra é calculado com base na redução da formação de melanina. A atividade inibitória dose-dependente das amostras é calculada e os resultados são expressos como valores IC₅o utilizando o software

46/46

Graphpad Prism. A percentagem de inibição da melanina é calculada da seguinte forma, % de inibição = [(C-T) / C] X 100 onde C = absorvância devido à melanina na ausência do inibidor

Γ

T = absorvância devido à melanina na presença do inibidor

O valor IC₅o é a concentração exigida para uma inibição de 50% da formação de melanina e, por isso, o valor IC₅o mais baixo indica um melhor potencial inibitório da melanina. É evidente a partir da tabela 8 e da figura 15 que os valores IC₅o das composições contendo peptídeo de Oleanoyl e estilbenos/extrato de licor/THC são 10 significativamente mais baixos do que os do princípio ativo individual, proporcionando, consequentemente, uma atividade ampliada.

Tabela 8

IC50 (pg/ml)
Produto	Princípio ativo individual	Em combinação com o peptídeo de Oleanoyl (1:1)
Peptídeo de oleanoyl	Não significativo
Resveratrol	3.0 ± 0.2	1.6 ±0.4
Oxiresveratrol	8.0 ± 1.2	4.3 ± 1.4
Pterostilbeno	0.6 ±0.1	0.34 ±0.11
3Hidroxipterostilbeno (3HPT)	0.8 ±0.22	0.42 ±0.12
Extrato de alcaçuz	3.0 ±0.3	1.3 ±0.4
Tetraidrocurcuminóides (IHÇ)	3.0 ±0.2	1.2 ±0.32

A relação da sequência de peptídeos é incluída no Apêndice 1 anexo e também é enviada via EFS Web na forma de um arquivo nomeado como sequencelistcip.txt.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. “MÉTODO PARA TRATAR O ENVELHECIMENTO DA PELE”, caracterizado por consistir da etapa de tratamento da pele com uma composição contendo peptídeos da SEQ ID no. 1 ligados ao ácido oleanólico representado pela estrutura I.
2 . “MÉTODO PARA TRATAR O ENVELHECIMENTO DA PELE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição opcionalmente incluir ingredientes ou extratos de plantas selecionados dentre um grupo que compreende endosperma líquido de coco, extrato de amla, estilbenos ou seus derivados, e tetrahidrocurcuminoides ou seus derivados, extrato de alcaçuz e combinações dos mesmos.
3. “MÉTODO PARA TRATAR O ENVELHECIMENTO DA PELE”, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelos estilbenos serem selecionados dentre um grupo que compreende oxyresveratrol, pterostilbene, resveratrol, 3hidroxipterostilbeno e combinações dos mesmos.
4 . “MÉTODO PARA TRATAR O ENVELHECIMENTO DA PELE”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela composição ser aplicada topicamente e é na forma selecionada dentre um grupo que compreende creme, loção, gel, emulsão, patch e líquido.

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