BRPI1015495B1

BRPI1015495B1 - Composições farmacêuticas antimaláricas contendo derivados de diterpenos caurânicos

Info

Publication number: BRPI1015495B1
Application number: BRPI1015495-7A
Authority: BR
Inventors: Alaíde Braga De Oliveira; Fernando de Pilla Varotti; Ronan Batista
Original assignee: Universidade Federal De Minas Gerais
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2010-12-23
Publication date: 2023-02-14
Also published as: BRPI1015495A2; WO2012083408A1; WO2012083408A8

Abstract

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTIMALÁRICAS CONTENDO DERIVADOS DE DITERPENOS CAURÂNICOS. A presente invenção descreve composições farmacêuticas contendo derivados caurânicos produzidos a partir do ácido caurenóico e de outros diterpenos, bem como a sua atividade antimalária. Os mesmos podem ser utilizados isoladamento ou em combinação para o tratamento de malária

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção descreve composições farmacêuticas contendo derivados caurânicos produzidos a partir do ácido caurenóico e de outros diterpenos, bem como a sua atividade antimalárica. Os mesmos podem ser utilizados isoladamente ou em combinação para o tratamento de malária.

ESTADO DA TÉCNICA

Os cauranos constituem uma importante classe de diterpenos tetracíclicos, encontrados principalmente em espécies vegetais pertencentes às famílias Asteraceae (Wedelia spp, Mikania spp, Oyedaea spp, Baccharis spp, Solidago spp), Annonnaceae (Annonna spp, Xylopia spp), Euphorbiaceae (Beyeria spp, Croton spp, Ricinocarpus spp), Celastraceae (Tripterygium spp), Apiaceae (Alepidea spp), Velloziaceae (Vellozia spp), Lamiaceae (Rabdosia spp) e Rutaceae (Phebalium spp), dentre outras (HASAN, C.M.; HEALEY, T.M.; WATERMAN, P.G. Kolavane and kaurane diterpenes from the stem bark of Xylopia aethiopica. Phytochemistry, v. 21, n° 6, p. 1365-1368, 1982.BOHLMANN, F.; KRAMP, W.; JAKUPOVIC, J.; ROBINSON, H.; KING, R.M. Diterpenes from Baccharis species. Phytochemistry, v. 21, n° 2, p. 399- 403, 1982.KUBO, I.; GANJIAN, I.; KUBOTA, T. Chemotaxonomic significance of enf-kaurene diterpenes in Rabdosia umbrosus varieties. Phytochemistry, v. 21, p. 81-83, 1982.PINTO, A.C.; PINCHIN, R.; PRADO, S.K. Three enf-kaurene diterpenes from Vellozia caput-ardeae. Phytochemistry, v. 22, n° 9, p. 2017- 2019, 1983.LE QUESNE, P.W.; HONKAN, V.; ONAN, K.D.; MORROW, P.A.; TONKYN, D. Oxidized kaurene derivatives from leaves of Solidago missouriensis and S. rígida. Phytochemistry, v. 24, n° 8, p. 1785-1787, 1985.TAKAHASHI, J. A. Estudo fitoquimico de Xylopia frutescens Aubl. e transformações microbianas de cauranos, afidicolanos e estemodanos. Belo Horizonte, 1994. 363p. Tese (Doutorado em Química) - Departamento de Química, Instituto de Ciências Exatas, UFMG, 1994. 363p.GHISALBERTI, E.L. The biological activity of naturally occurring kaurane diterpenes. Fitoterapia, v. 68, n° 4, p.303-323, 1997.DUAN, H.; TAKAISHI, Y.; MOMOTA, H.; OHMOTO, Y.; TAKI, T.; JIA, Y.; LI, Y. Immunosuppressive diterpenoids from Tripterygium wilfordii. Journal of Natural Products, v. 62, n° 11, p. 1522-1525, 1999.MÜLLER, S.; TIRAPELLI, C.R.; OLIVEIRA, A.M.; MURILLO, R.; CASTRO, V.; MERFORT, I. Studies of enf-kaurane diterpenes from Oyedaea verbesinoides for their inhibitory activity on vascular smooth muscle contraction. Phytochemistry, v. 63, p. 391-396, 2003.NUNEZ, C.V.; AMÊNDOLA, M.C.; LAGO, J.H.G.; ROQUE, N.F. Diterpene acids from Mikania sp. nov (Asteraceae). Biochemical Systematics and Ecology, v. 32, p. 233-237, 2004).

Nas plantas, os diterpenos caurânicos são intermediários na biossíntese de diversos metabólitos secundários, como as giberelinas, que são hormônios de crescimento de plantas. Portanto, não é surpreendente o fato de grande parte destes diterpenos apresentar atividade reguladora do crescimento de plantas (GHISALBERTI, E.L. The biological activity of naturally occurring kaurane diterpenes. Fitoterapia, v. 68, n°4, p.303-323, 1997).

Várias atividades biológicas têm sido descritas para os diterpenos caurânicos, como antiagregadora plaquetária, antiespasmódica, anti-HIV, antimicrobiana, antinociceptiva, antitumoral, estimulante da deposição de ovos de insetos, hipoglicêmica, imunossupressora, inibidora do apetite de insetos, tripanosomicida, inibidora da contração do músculo liso vascular. (YANG, Y.L.; CHANG, F.R.; WU, C.C.; WANG, W.Y.; WU, Y.C. New enf-kaurane diterpenoids with anti-platelet aggregation activity from Annona squamosa. Journal of Natural Products, v. 65, p. 1462-1467, 2002.ZAMILPA, A.; TORTORIELLO, J.; NAVARRO, V.; DELGADO, G.; ALVAREZ, L. Antispasmodic and antimicrobial diterpenic acids from Viguiera hypargyrea roots. Planta Medica, v. 68, p. 277-281, 2002.WU, Y.C.; HUNG, Y.C.; CHANG, F.R.; COSENTINO, M.; WANG, H.K.; LEE, K.H. Identification of βnM6D,17- dihydroxykauran-19-oic acid as an anti-HIV principle and isolation of the new diterpenoids annasquamosins A and B from Annona squamosa. Journal of Natural Products, v. 59, p. 635-637, 1996.ZGODA-POLS, J.R.; FREYER, A.J.; KILLMER, L.B.; PORTER, J.R. Antimicrobial diterpenes from the stem bark of Mitrephora celebica. Fitoterapia, v. 73, p. 434-438, 2002.ITO, A.; CHAI, H.B.; SHIN, Y.G.; GARCÍA, R.; MEJÍA, M.; GAO, Q.; FAIRCHILD, C.R.; LANE, K.E.; MENENDEZ, A.T.; FARNSWORTH, N.R.; CORDELL, G.A.; PEZZUTO, J.M.; KINGHORN, D. Cytotoxic constituents of the roots of Exostema acuminatum. Tetrahedron, v. 56, p. 6401-6405, 2000.MORRIS, B.D.; FOSTER, S.P.; GRUGEL, S.R.; CHARLET, L.D. Isolation of the diterpenoids, enf-kauran-16ü- ol and ent-atisan-16D-ol, from sunflowers, as oviposition stimulants for the banded sunflower moth, Cochylis hospes. Journal of Chemical Ecology, v. 31, n° 1, p. 89-102, 2005.BRESCIANI, L.F.V.; YUNES, R.A.; BURGER, C.; OLIVEIRA, L.E.; BÓF, K.L.; CECHINEL-FILHO, V. Seasonal variation of kaurenoic acid, a hypoglycemic diterpene present in Wedelia paludosa (Acmela brasiliensis) (Asteraceae). Zeitschrift für Naturforschung, v. 59C, p. 229-232, 2004.DUAN, H.; TAKAISHI, Y.; MOMOTA, H.; OHMOTO, Y.; TAKI, T.; TORI, M.; TAKAOKA, S.; JIA, Y.; LI, Y. Immunosuppressive terpenoids from extracts of Tripterygium wilfordii. Tetrahedron, v. 57, p. 8413-8424, 2001.BRUNO, M.; ROSSELLI, S.; PIBIRI, S.; PIOZZI, F.; BONDI, M.L.; SIMMONDS, M.S.J. Semisynthetic derivatives of enf-kauranes and their antifeedant activity. Phytochemistry, v. 58, p. 463-474, 2001.BATISTA, R„ CHIARI, E„ DE OLIVEIRA, A.B. Trypanosomicidal kaurane diterpenes from Wedelia paludosa D.C. Planta Medica, v. 65, p. 283-284, 1999).

Diante da grande diversidade de atividades biológicas apresentadas por estes diterpenos, torna-se interessante a modificação estrutural do esqueleto caurânico visando a obtenção de novas substâncias potencialmente bioativas. Estas transformações estruturais podem ser realizadas por via química, e por via microbiológica, utilizando-se, neste último caso, culturas de microrganismos.( CASTELLARO, S.J.; DOLAN, S.C.; MAcMILLAN, J.; WILLIS, C. Deuterium labelling of ent-kaur-16-en-19-oic acid at carbon-6 and -7. Phytochemistry, v. 29, n. 6, p.1823-1831, 1990. BRUNO, M.; ROSSELLI, S.; PIBIRI, S.; PIOZZI, F.; BONDI, M.L.; SIMMONDS, M.S.J. Semisynthetic derivatives of enf-kauranes and their antifeedant activity. Phytochemistry, v. 58, p. 463-474, 2001. BRITTON, R.A.; PIERS, E.; PATRICK, B.O. Total synthesis of (±)-13-methoxy-15-oxozoapatlin, a rearranged kaurane diterpenoid. Journal of Organic Chemistry, v. 69, n° 9, p. 3068-3075, 2004. OLIVEIRA, A.B.;HANSON, J.R.; TAKAHASHI, J.A. The biotransformation of enM5-oxokaur-16- en-19-oic acid and its methyl ester by Cephalosporium aphidicola. Phytochemistry, v. 40, n° 2, p. 439-442, 1995).

A quimioterapia da malária teve início no século XVII. Os jesuítas que vieram para a América do Sul observaram que os índios do Perú utilizavam plantas do gênero Cinchona spp (família Rubiaceae), conhecidas popularmente por quinas, para o tratamento de doenças febris. Estudos fitoquímicos de Cinchona spp, realizados na Europa, levaram ao isolamento na França, por Pelletier e Caventou, no início do século XIX, da quinina, que apresentou atividade antimalárica. A quinina constituiu um modelo para a síntese dos antimaláricos como mefloquina e cloroquina.

A cloroquina foi utilizada por um longo período no tratamento da malária, mais recentemente novos fármacos, como a artemisinina e a atovacona, foram introduzidos na qumioterapia antimalárica.

A artemisinina é uma substância ativa da Artemisia annua L., de uso milenar na China, tendo sido isolada em 1972. Derivados semi-sintéticos como artemeter, arteeter e artesunato também se encontram em uso clínico (ROSENTHAL, P.J. e GOLDSMITH, R.S. Antiprozoários. Farmacologia Básica & clínica. Editor: Katzung, B.G.C. Guanabara- Koogan, 8a ed, capitulo: 53, p. 769-783, 2003.)

A atovacona é uma naftoquinona sintética, um análogo do lapachol, que é freqüente em espécies de Tabebuia, gênero ao qual pertencem os ipês, árvores que ocorrem na América do Sul (MIRAGLIA, M.C.M. Estudo químico de Tabebuia serratifolia (Vahl.) Nichols (Bignoniaceae) e síntese de piranonaftoquinonas, furanonaftoquinonas e antraquinonas. Tese (Doutorado em Química) - Universidade Federal de Minas Gerais, 1991).

Apesar do desenvolvimento tecnológico e científico, a malária permanece como um dos maiores problemas de saúde a serem combatidos. As estratégias modernas para o controle da doença prevêem ações conjuntas, como o combate do inseto vetor, diagnóstico rápido e preciso, garantia de terapêutica adequada, redução dos casos de resistência, além do desenvolvimento de novos agentes terapêuticos (PIMENTEL, Lúcio Figueira;JACOME JUNIOR, Agenor Tavares; MOSQUEIRA, Vanessa Carla Furtado and SANTOS-MAGALHAES, Nereide Stela. Nanotecnologia farmacêutica aplicada ao tratamento da malária. Rev. Bras. Cienc. Farm, [online]. 2007, vol.43, n.4, pp. 503-514). Entre os agentes terapêuticos eficazes com ação contra os parasitas da malária estão as famílias das quinolinas (quinina, cloroquina, primaquina, mefloquina, amodiaquina, halofantrina), diclorobenzilidina (lumefantrina), biguanidas (proguanil, clorproguanil), diaminopiridinas (pirimetamina), sulfonas (dapsona), hidroxinaftoquinonas (atovacona) e lactonas sesquiterpênicas (derivados da artemisinina, artesunato e artemeter) segundo Loiseau e Le Bras LOISEAU, P.M.; LE BRAS, J. New drugs against parasitic diseases. Rev. Prat., Paris, v.57, p. 175-182, 2007. Porém, estes agentes terapêuticos apresentam muitos inconvenientes relacionados ao seu uso, pois eles compreendem complexos regimes de administração e muitos efeitos colaterais, o que contribui para interrupção do tratamento e o possível desenvolvimento de resistência pelo parasita (WINSTANLEY, P.O. Modern chemotherapeutic options for malaria. Lancet, Amsterdam, v.1 p. 242-250, 2001).

A resistência às drogas antimaláricas é definida como a habilidade do parasitária de sobreviver e / ou multiplicar, apesar da administração e absorção de uma droga antimalárica na dose normalmente recomendada. A resistência à uma droga pode levar ao fracasso do tratamento, porém não é o único fator. O insucesso do tratamento também pode ser o resultado de dosagem incorreta, problemas de aderência ao tratamento (adesão),baixa qualidade dos produtos,ou erros de diagnóstico do paciente.(WHO. World Malaria Report 2008. World Health Organization: Geneva, Switzerland, 2008. Available online http://whqlibdoc.who.int/publications/2008/9789241563697 eng.pdf(Acessado em05 de dezembro de 2010).

Dessa forma, o tratamento adequado e oportuno da malária constitui hoje o principal alicerce para o controle da doença.

Os seguintes pedidos de patentes abaixo descritos se relacionam a presente invenção:

Os pedidos de patente CN1900046 e CN1431187 descrevem a atividade antitumoral de diterpenos caurânicos, o primeiro pedido se refere a diterpenos extraídos de semiaquilegia, enquanto o segundo relata um diterpeno tipo caurano anticancerígeno extraído do tronco da graviola para tramento de 5 cancer de esofago e fígado.

Já o pedido de patente CN1711999 relata uma infusão lipídica bioativa preparada através de diterpenos cauranicos e excipientes ricos em ácidos graxos e derivados, possuindo alta estabilidade e baixa irritação.

O pedido de patente US2008274987 descreve um novo diterpeno io caurânico, denominado pluricarside, que foi isolado de Pulicaría undulate apresentando forte atividade promotora de alfa-glicosidase com diversas aplicações clínicas.

Porém, nenhum dos documentos supracitados descreve o uso dos derivados propostos nesse pedido como agentes antimaláricos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Esquema de síntese do ent-caur-16-en-19-oato de metila

Figura 2: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ) (A), de RMN13C desacoplado, de DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ)(B), e no infravermelho (v, cm-1) (C) para ent-caur-16-en-19-oato de metila.

Figura 3: Esquema de síntese da mistura dos ésteres enf-caur-16-en-19-oato de metila (4), ent-caur-15-en-19-oato de metila (5).

Figura 4: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ) (A), de RMN13C desacoplado, de DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ) (B) para 0 éster 5.

Figura 5: Esquema de síntese dos epóxidos enf-caur-16β:17-epoxi-19-oato de metila (7), ent-caur-9β:11β,16β:17-diepoxi-19-oato de metila(8) e ent-caur- 9β:11β,16α:17-diepoxi-19-oato de metila(9).

Figura 6: Espectro de massas (m/z, FAB+) (A) para 0 epóxido 7, espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ)(B), de RMN13C desacoplado,DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ) (C)para 0 epóxido 7.

Figura 7: Cristalografia de raio-X do epóxido 7

Figura 8: Espectros de massas (m/z, FAB+) para diepóxido 8 (A) e para 0 diepóxido 9 (B)

Figura 9: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ) para o diepóxido 8 (A) e para 0 diepóxido 9 (B)

Figura 10: Espectros de de RMN13C desacoplado,DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ) para o diepóxido 8 (A) e 9 (B).

Figura 11: Cristalografia de Raios-X do diepóxido 8

Figura 12: Cristalografia de Raios-X do diepóxido 9

Figura 13: Esquema de síntese dos álcoois enf-15β-hidroxi-16α-cauran-19- oato de metila (10), 12, enM 7-hidroxi-16a-caur-9:11-en-19-oato de metila (11a) ent-17-hidroxi-16β-caur-9:11-en-19-oato de metila (11b)

Figura 14: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ) (A), de RMN13C desacoplado, DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ) (B) para o álcool 10.

Figura 15: Espectros de massas (m/z, FAB+) para o álcool 10.

Figura 16: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ), de RMN13C desacoplado, DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3) δ) para os álcoois 11 a/b.

Figura 17: Esquema de síntese do álcool ent-15β-hidroxi-caur-16-en-19-oato de metila (12)

Figura 18: Espectros de massas (m/z, FAB+) para o álcool 12.

Figura 19: Espectros no Infravermelho (v, cm’1) para o álcool 12.

Figura 20: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ) (A), de RMN13C desacoplado,DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ) (B) para o álcool 12.

Figura 21: Esquema de síntese das diterpenil-naftoquinonas 15 a/b

Figura 22: Espectros de massas (m/z, FAB+) para as diterpenil- naftoquinonas15 a/b.

Figura 23: Espectros de RMN1H (400 MHz, CDCI3, δ)(A), RMN13C desacoplado(B),DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ) para as diterpenil- naftoquinonas 15 a/b.

Figura 24: Esquema de síntese do derivado peridro-pirimidínico 17.

Figura 25: Espectros de RMN1H (200 MHz, CDCI3, δ)(A), de RMN13C desacoplado,DEPT 90 e 135 (50 MHz, CDCI3, δ)(B) para o derivado peridro- pirimidínico 17.

Figura 26: Mobilização de cálcio por D17 em eritrócitos infectados com trofozoitos de Plasmodium falciparum (cepa W2) marcados com Fluoro-4 AM. (A) DIC. (B) Fluorescência basal. (C) Fluorescência após a adição de 17 (1 μg/ml). (D) Ação de D17 (aumento de 1,40±0,1, n=5). (E) Ação da tapsigargina (TAP) (aumento de 1,3±0,1, n=7) e D17. (F) Ação de D17 (aumento de 1,3±0,1, n=6) e TAP. (G) Ação do artesunato (ART) (aumento de 1,3±0,2, n=7) e D17. (H) Ação de D17 (aumento de 1,2±0,2, n=5) e ART (aumento de 0,6±0,2, n=5. Barra: 8 μm.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA TECNOLOGIA

A presente invenção descreve composições farmacêuticas contendo derivados caurânicos produzidos a partir do ácido caurenóico e de outros diterpenos, bem como a sua atividade antiplasmódica. Os derivados apresentam a seguinte fórmula estrutural:

Onde R é selecionado do grupo: alquila Ci-8, fenila ou arila C3.33; R1 é selecionado do grupo: H, OH, =0, SH,=S, NH2, NH-R; R2 é selecionado do X grupo:

R3 é igual a R1 ou selecionado do grupo: carboidratos, quinonas, diaminoalquilas; X é selecionado do grupo: O, S, N; onde entre C9 e C11 pode haver uma ligação simples, dupla ou um grupo epóxido; onde entre C15 e C16 pode haver uma ligação simples ou dupla; e ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.

As composições farmacêuticas da presente invenção, em formas sólidas, semi-sólidas ou líquidas, caracterizam-se pelo uso das substâncias supracitadas combinados com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, definidos como veículos, comumente usados para formular composições farmacêuticas para administração humana ou animal e selecionados de modo a não afetar a atividade biológica/farmacológica do fármaco ou mistura de fármacos. Exemplos de excipientes incluem água, solução salina, soluções tamponadas com fosfato, solução de Ringer, solução de dextrose, solução de Hank, soluções salinas biocompativeis contendo ou não polietilenoglicol. Veículos não aquosos, como óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etila, ou triglicerídeo também podem ser utilizados. Podem ser preparadas composições com um excipiente ou mistura desses.

Carreadores para solubilização podem incluir hidroxipropil beta ciclodextrina ou agentes como Ploxamer, Providona K17, Providona K12, Tween 80, etanol, cremofor-etanol, polietilenoglicol 400, propilenoglicol e Trappsol. A invenção não se limita a agentes de solubilização em água, e agentes solubilizantes de base oleosa também são incluídos tais como lipiodol, óleos fixos, óleo de sésamo, oleato de etila, ou triglicerídeos também podem ser utilizados. Também são contemplados sistemas lipídicos de nano- estruturados, apresentando propriedades de liberação controlada, como liposomas, nanopartículas lipídicas sólidas (NLS) e sistemas lipídicos auto- emulsionáveis (SMEDDS) cujas principais vantagens são elevadas biocompatibilidade e biodisponibilidade.

Os excipientes também podem conter quantidades menores de aditivos como substâncias que aumentam a isotonicidade e estabilidade química de substâncias ou tampões. Exemplos de tampões incluem tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris, enquanto exemplos de conservantes incluem timerosal, m- ou o-cresol, formalina e álcool benzílico. As composições padrões podem ser líquidas, sólidas ou semi-sólidas. Desta forma, numa formulação sólida, o excipiente pode incluir dextrose, conservantes, para qual água ou solução salina estéril podem ser acrescentadas antes da administração. Além de aglutinantes, desintegrantes, diluentes, lubrificantes, tensoativos. Essas composições podem ser administradas via intramuscular, intravenosa, subcutânea, cutânea, oral, inalatória ou como dispositivos que possam ser implantados ou injetados, sendo preferencialmente administrados por via oral ou cutânea.

A presente invenção pode ser mais bem entendida através dos seguintes exemplos, não limitantes de tecnologia:

EXEMPLO 1: SÍNTESE DO EWT-CAUR-16-EN-19-OATO DE METILA (4)

A síntese do ent-caur-16-en-19-oato de metila (Figura 1) foi realizada por dois métodos distintos abaixo descritos:

- Método 1-A

A um balão de fundo redondo (500 mL) contendo o ácido caurenóico (1) (1287 mg; 4,26 mmol) dissolvido em acetona anidra (170 mL), na presença de carbonato de potássio (9,85 g), adicionou-se sulfato de dimetila (6,0 mL; 63,27 mmol), e deixou-se o sistema sob agitação magnética, em temperatura não superior a 60 °C, por 20 horas. Em seguida, a mistura reacional foi filtrada a vácuo, utilizando-se diclorometano (aprox. 50 mL) para a lavagem do carbonato de potássio. A solução orgânica foi concentrada em evaporador rotatório (50 °C), e o resíduo obtido, de aspecto oleoso e amarelado, foi submetido a uma cromatografia em coluna de sílica-gel (34 x 150 mm). A eluição foi iniciada com n-hexano, aumentando-se gradativamente o teor de diclorometano até o máximo de 30% durante toda a eluição. Recolheram-se 7 frações de 1.000 mL cada. As frações 3-6, por apresentarem semelhança em CCD (n-hexano - diclorometano 1:1), foram reunidas, obtendo-se o éster ent- caur-16-en-19-oato de metila (4) (1006 mg; 3,18 mmol, P.F. 90-92°C) em 75% de rendimento.

- Método 1-B

A um balão de fundo chato (250 mL) contendo ácido caurenóico (1) (503 mg; 1,67 mmol), adicionou-se uma solução etérea saturada com diazometano (100 mL). A solução amarelada foi deixada ao abrigo da luz, e a reação foi acompanhada por CCD de sílica-gel (n-hexano - diclorometano 1:1). Sempre que ocorria uma eventual descoloração do sistema, este era concentrado em evaporador rotatório (40°C) e um novo volume (100 mL) de solução etérea de diazometano era adicionado ao resíduo. A reação foi interrompida após 4 horas, quando a coloração amarelada da mistura se manteve inalterada, coincidindo com o desaparecimento completo da mancha referente ao ácido 1. A mistura reacional foi, então, concentrada em evaporador rotatório (40°C), fornecendo 527 mg (1,67 mmol) do éster e/?f-caur-16-en-19-oato de metila (4), em 100% de rendimento.

Os espectros de RMN1H e RMN13C do éster 4 (Figura 2) apresentaram, essencialmente, os mesmos sinais obtidos para o ácido caurenóico (1), diferindo-se apenas na presença de um simpleto (3H) em δ 3,64 (RMN1H) e de um sinal extra em δ 51,2 (RMN13C), ambos atribuídos ao grupo metila da função éster.

EXEMPLO 2: SÍNTESE DA MISTURA DOS ÉSTERES HNT-CAUR-16-EN-19- OATO DE METILA (4), ENT-CAUR-15-EN-19-OATO DE METILA (5) e ENT- CAUR-9:11,16- DIEN-19-OATO DE METILA (6)

O esquema de síntese dos ésteres 4, 5 e 6 pode ser visualizado na Figura 3.A mistura dos ésteres 4+5+6 foi obtida pela esterificação da mistura dos ácidos caurenóico (1), /so-caurenóico (2) e grandiflorênico (3) ,A mistura de ésteres caurânicos 4+5+6 que, por sua vez, foi submetida a CCGS contendo 20% de nitrato de prata incorporado na sílica-gel, eluindo-se com hexano - éter etílico (97:3) e isolando-se apenas o éster 5 (123 mg).

O éster enf-caur-15-en-19-oato de metila, em seu espectro de RMN1H (Figura 4A), apresenta simpletos em δ 5,06 (1H) e em δ 1,69 (3H), além daqueles referentes aos grupos metila em C-18 (δ 1,16; 3H) e C-20 (δ 0,84; 3H), sugerindo um caurano com a ligação dupla endocíclica situada entre C-15 e C-16. Seu espectro de RMN13C (Figura 4B) apresenta sinais em δ 142,3 (C) e δ 135,1 (CH), o que confirma a localização da ligação dupla entre C-15 e C- 16 na estrutura deste éster (5).

EXEMPLO 3: SÍNTESE DOS EPÓXIDOS ENT-CAUR-16β:17-EPOXI-19- OATO DE METILA (7), ENT-CAUR-9β:11β,16β:17-DIEPOXI-19-OATO DE METILA (8) E E/VT-CAUR-9β:11β,16α:17-DIEPOXI-19-OATO DE METILA (9)

O esquema de síntese dos epóxidos 7, 8 e 9 pode ser visualizado na Figura 5. A, um balão de fundo redondo (100 mL) contendo a mistura (506 mg; 1,60 mmol) dos ésteres 4 (0,84 mmol) + 5 (0,24 mmol) + 6 (0,52 mmol), dissolvida em diclorometano (30 mL), na presença de bicarbonato de sódio (1 g), adicionou-se o ácido n?-cloroperbenzóico a 55% (567 mg; 1,83 mmol), e a mistura foi mantida à temperatura ambiente, sob agitação magnética e monitoramento por CCD de sílica-gel (n-hexano - acetato de etila 8:2). Após 30 minutos de reação, constatou-se o desaparecimento do material de partida (4+5+6) e a presença de três manchas principais, todas de menor Rf. A mistura reacional foi quantitativamente transferida para um funil de decantação (250 ml_) com o auxílio de diclorometano (aprox. 50 ml_), e a fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de tiossulfato de sódio (2 x 100 ml_) e com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (2 x 100 ml_), sendo posteriormente seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada em evaporador rotatório (40 °C), fornecendo um produto bruto (540 mg) de aspecto oleoso, amarelado e bastante viscoso. Este (540 mg), por sua vez, foi submetido a uma cromatografia em coluna (16 x 340 mm) de sílica-gel “flash”, utilizando-se a mistura n-hexano - acetato de etila (95:5) como único eluente, e recolhendo-se 48 frações de 20 ml_ cada, que foram comparadas por CCD em cromatoplacas de sílica-gel (n-hexano - acetato de etila 8:2). As frações 19-24 foram reunidas, originando o epóxido 7 (217 mg; 0,66 mmol; P.F.129-131°C) em 78% de rendimento a partir do éster 4. As frações 36-39 foram reunidas, obtendo-se o diepóxido 8 (31 mg; 0,09 mmol; P.F.168-170°C) em 17% de rendimento a partir do éster 6. A reunião das frações 31-34 levou à obtenção do diepóxido 9 (14 mg; 0,04 mmol; P.F. 96-99 °C), em 8% de rendimento a partir do éster 6.

A fórmula molecular de 7 (C21H32O3), obtida a partir de seu espectro de massas de alta resolução (Figura 6), juntamente com os dupletos em δ 2,80 (1H, J = 4,8 Hz) e δ 2,88 (1H, J = 4,8 Hz), em seu espectro de RMN1H(Figura 6B) e com os sinais em δ 66,3 (C) e δ 50,4 (CH2), em seu espectro de RMN13C(Figura 6C) confirma a epoxidação da ligação dupla do éster de partida (4). A blindagem observada no deslocamento químico de C-14 (δ 38,5), em relação ao C-14 do éster de partida 4 (δ 39,7), sugere que a função epóxido assuma a configuração enf-16β. A estrutura proposta para 7 foi confirmada por cristalografia de Raios-X (Figura 7).

A observação de que os espectros de massa de alta resolução obtidos para 8 (Figura 8A) e 9 (Figura 8B) propõem uma mesma fórmula molecular (C21H32O4) para estes diepóxidos, associada ao fato de que há grande semelhança entre seus espectros de RMN1H (Figura 9A e 9B), poucas diferenças entre os deslocamentos químicos de seus carbonos (Figuras 10A e 10B) e uma considerável diferença nos valores de seus pontos-de-fusão (8, 168-170 °C; 9, 96-99 °C), indica tratarem-se de isômeros. A variação dos deslocamentos químicos de C-7, C-9, C-12 e C-14 entre estes diepóxidos sugere que a estereoquímica do grupo epóxido em C-16/C-17 seja a única diferença estrutural entre estes dois compostos. A observação da desblindagem de C-14 e blindagem de C-12, no espectro de RMN13C de 9, aponta uma provável estereoquímica ent-16β do grupo epóxido em C-16/C-17 para este diterpeno, justificando o efeito y -gauche observado entre o oxigênio em C-16/C-17 e o carbono C-12 de 9. A análise dos cristais de 8 e 9 por cristalografia de Raios-X (Figuras 11 e 12)confirmou inequivocamente as estruturas propostas.

EXEMPLO 4: SÍNTESE DOS ÁLCOOIS ENT-15β-HIDROXI-16α-CAURAN-19- OATO DE METILA (10), 12, ENT-17-HIDROXI-16a-CAUR-9:11-EN-19-OATO DE METILA (11a) £NT-17-HIDROXI-16β-CAUR-9:11-EN-19-OATO DE METILA (11b)

A síntese dos álcoois ent-15β-hidroxi-16α-cauran-19-oato de metila (10), 12, ent-17-hidroxi-16a-caur-9:11-en-19-oato de metila (11a) ent-17-hidroxi- 16β-caur-9:11-en-19-oato de metila (11b) (Figura 13) foi realizada por dois métodos distintos abaixo descritos:

Condição A

A um balão de fundo redondo (100 mL) contendo a mistura (504 mg; 1,60 mmol) dos ésteres 4 (0,84 mmol) + 5 (0,24 mmol) + 6 (0,52 mmol), dissolvida em THF anidro (20 mL), adicionaram-se boridreto de sódio (610 mg; 16,12 mmol) e complexo trifluoreto de boro-éter etílico (gota-a-gota; 2,0 mL; 15,92 mmol), mantendo-se, em seguida, a mistura reacional sob agitação magnética e atmosfera inerte (Ar), à temperatura ambiente, por 1 hora.

Transcorrido este tempo, a mistura foi resfriada a 0 °C com o auxílio de banho de gelo e, sob agitação, adicionaram-se, na seqüência, etanol (10 ml_), solução aquosa de hidróxido de sódio a 20% p/v (10 ml_; 50,00 mmol) e solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 30% v/v (5 ml_; 44,12 mmol). Em seguida, a mistura foi aquecida a 50 °C e deixada sob agitação magnética por 1 hora. O sistema foi quantitativamente transferido para um funil de decantação (250 ml_) e lavado com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (2 x 100 ml_). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, e concentrada em evaporador rotatório (50 °C), obtendo-se 556 mg de um produto bruto, de aspecto oleoso e amarelado. Observou-se, por CCD (n-hexano - acetato de etila 8:2), o desaparecimento da mancha referente aos ésteres de partida (4+5+6) e a presença de três manchas principais, de menor valor de Rf. O produto bruto (556 mg) foi submetido a uma cromatografia em coluna “flash” de sílica-gel (17 x 380 mm), utilizando-se a mistura n-hexano - acetato de etila (9:1) como único eluente, recolhendo-se 41 frações de 20 mL cada, cujos perfis cromatográficos foram comparados por CCD de sílica-gel (n-hexano - acetato de etila 8:2). As frações 21-25 foram reunidas, fornecendo o álcool 10 (64 mg; 0,19 mmol; P.F.139-141°C) em 72% de rendimento, a partir do éster 5. A reunião das frações 27-29 forneceu a mistura dos epímeros 11 a/b (26 mg; 0,08 mmol) em 15% de rendimento, a partir do éster 6.

Condição B

A um balão de fundo redondo (100 mL) contendo a mistura (660 mg; 2,09 mmol) dos ésteres 4 (1,10 mmol) + 5 (0,31 mmol) + 6 (0,68 mmol), dissolvida em THF anidro (25 mL), adicionaram-se boridreto de sódio (802 mg; 21,20 mmol) e o complexo trifluoreto de boro-éter etílico (gota-a-gota; 5,0 mL; 39,80 mmol), mantendo-se, em seguida, a mistura reacional sob agitação magnética e atmosfera inerte (Ar), à temperatura ambiente, por 2 horas. Transcorrido este tempo, a mistura foi resfriada a 0 °C com o auxílio de banho de gelo e, sob agitação, adicionaram-se, sequencialmente, etanol (10 mL), solução aquosa de hidróxido de sódio a 20% p/v (10 mL; 50,00 mmol) e solução aquosa de peróxido de hidrogênio a 30% v/v (7 mL; 61,76 mmol). Em seguida, a mistura foi aquecida a 50 °C e deixada sob agitação magnética por 2 horas. O sistema foi quantitativamente transferido para um funil de decantação (250 mL) e lavado com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (2 x 100 mL). A fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, e concentrada em evaporador rotatório (50 °C), obtendo-se 894 mg de um produto bruto, de aspecto oleoso e amarelado. Observou-se, por CCD (n- hexano - acetato de etila 8:2), o desaparecimento da mancha referente aos ésteres de partida (4+5+6) e a presença de três manchas principais, duas com valores de Rf entre 0.3 e 0.4, e a terceira com valor de Rf < 0,1. O produto bruto (894 mg) foi submetido a uma cromatografia em coluna “flash” de sílica- gel (16 x 380 mm), utilizando-se a mistura n-hexano - acetato de etila (9:1) como único eluente, e recolhendo-se 47 frações de 20 mL cada, cujos perfis cromatográficos foram comparados por CCD de sílica-gel (n-hexano - acetato de etila 8:2). As frações 19-21 foram reunidas, fornecendo o álcool 10 (81 mg; 0,24 mmol) em 77% de rendimento, a partir do éster 5.

O espectro de RMN1H de 10 (Figura 14A) apresenta, além dos simpletos em δ 0,84 (3H, H-20), δ 1,18 (3H, H-18) e δ 3,65 (3H, H-21), um dupleto a δ 1,12 (3H, J = 7,3 Hz) e a ausência de sinais de hidrogénios olefínicos, sugerindo um novo grupo metila (C-17) ligado a um carbono metínico (C-16). A fórmula molecular de 10 (C21H34O3), indicada pelo espectro de massas de alta resolução (Figura 15), sugere tratar-se de um álcool correspondente ao caureno 4 ou 5. O espectro de RMN13C de 10 (Figura 14B) mostra um sinal de carbono metínico oxigenado (CH) em δ 88,3, confirmando a hidroboração- oxidação de 5, e apontando uma possível hidroxilação enf-β de C-15, devido ao efeito y-gauche observado através da blindagem de C-7 e C-14, em comparação com o deslocamento químico destes mesmos carbonos no éster 4.

A mistura dos álcoois 11 a/b apresenta, por RMN13C (Figurai6), sinais referentes ao grupo hidroximetila (-CH2OH) em C-17 (δ 65,8 e 67,5) e sinais de carbonos olefínicos da ligação dupla endocíclica entre C-9/C-11 (δ 158,1 e 156,4 / δ 114,9 e 114,7). A comparação dos deslocamentos químicos de seus carbonos C-16 e C-17 com aqueles relatados na literatura permitiram a atribuição da estereoquímica ent-16α para 11a e ent-16β para 11b. (ETSE, J.T.; GRAY, A.I.; WATERMAN, P.G. Chemistry in the Annonaceae, XXIV. Kaurane and kaur-16-ene diterpenes from the stem bark of Annona reticulata. Journal of Natural Products, v. 50, n° 5, p. 979-983, Sept-Oct 1987).

EXEMPLO 5: SÍNTESE DO ÁLCOOL ENT-15β-HIDROXI-CAUR-16-EN-19- OATO DE METILA (12)

O esquema de síntese do álcool ent-15β-hidroxi-caur-16-en-19-oato pode ser visualizado na Figura 17. Primeiramente, foi preparada uma solução- mãe de hidroperóxido de f-butila em diclorometano, adicionando-se uma solução 6 M deste hidroperóxido em decano (3,6 mL) em diclorometano anidro (10 mL).Em seguida, a um balão de fundo redondo bitubulado (25 mL) contendo o éster 4 (101 mg; 0,32 mmol) dissolvido em diclorometano anidro (5 mL), adicionaram-se o dióxido de selênio (30 mg; 0,27 mmol) e a solução-mãe de hidroperóxido de f-butila em diclorometano (5 mL; 7,94 mmol), e a mistura reacional manteve-se sob agitação magnética e atmosfera inerte (Ar), à temperatura ambiente, por 45 minutos, quando constatou-se, por CCD de sílica-gel (n-hexano - acetato de etila 8:2), o desaparecimento da mancha correspondente ao éster de partida (4) e a presença de uma mancha principal, com menor valor de Rf. A solução foi concentrada em evaporador rotatório (40 °C), obtendo-se um óleo amarelado que, por sua vez, foi previamente purificado em uma coluna de sílica-gel (18 x 50 mm), utilizando-se o n-hexano (aprox. 100 mL) como solvente de arraste para a retirada do decano no produto bruto e, logo após, o acetato de etila (aprox. 100 mL) para a eluição do produto bruto semi-purificado. A solução orgânica foi concentrada em evaporador rotatório (50 °C) e submetida a uma cromatografia em coluna “flash” de sílica- gel (11 x 330 mm), utilizando-se n-hexano - acetato de etila (95:5) como único eluente. Recolheram-se 12 frações de 10 mL cada, cujos perfis cromatográficos foram comparados por CCD de sílica-gel (n-hexano - acetato de etila 8:2). A reunião das frações 10-11 forneceu o álcool 12 (74 mg; 0,22 mmol) em 70% de rendimento.

A fórmula molecular de 12 (C21H32O3), obtida a partir do espectro de massas de alta resolução (Figura 18), indica a adição de apenas um átomo de oxigênio na estrutura do éster de partida 4 (C21H32O2). O derivado 12 apresenta, respectivamente, em seus espectros de I.V. (Figura 19) e RMN13C (Figura 20B), uma banda larga em 3419 cm'1 e um sinal em δ 82,7 (CH-OH), confirmando a presença de uma função álcool em sua estrutura. No espectro de RMN1H (Figura 20A), o multipleto em δ 2,74 (1H, H-13), juntamente com a desblindagem observada para os carbonos insaturados da ligação dupla exocíclica (δ 160,3 e 108,3), no espectro de RMN13C, permite situar a hidroxila em C-15. A comparação dos dados espectrométricos de 12 com aqueles encontrados na literatura indicam a configuração enf-15β para este álcool. (HUTCHISON, M.; LEWER, P.; MacMILLAN, J. Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectra of eighteen derivatives of enf-kaur-16-en-19-oic acid. Journal of the Chemical Society Perkin Transactions I, p. 2363-2366, 1984. NASCIMENTO, A.M.; OLIVEIRA, D.C.R. Kaurane diterpenes and other chemical constituents from Mikania stipulacea (M. Vahl) Willd. Journal of the Brazilian Chemical Society, v. 12, n°4, p. 552-555, 2001).

EXEMPLO 6: SÍNTESE DAS DITERPENIL-NAFTOQUINONAS 15 a/b

O esquema de síntese diterpenil-naftoquinonas 15 a/b pode ser visualizado na Figura 21. A um balão de fundo redondo (25 mL) contendo a mistura das aminonaftoquinonas 14 a/b (57 mg; 0,18 mmol), dissolvida em diclorometano anidro (2 mL), na presença de sulfato de magnésio anidro (110 mg; 0,91 mmol), adicionou-se uma solução do aldeído 13 (52 mg; 0,16 mmol) em diclorometano anidro (3 mL), e a mistura foi monitorada por CCD de alumina (acetato de etila - hidróxido de amónio 99:1), mantendo-se sob agitação magnética e atmosfera inerte (Ar), à temperatura ambiente, por 50 horas. Transcorrido este tempo, adicionou-se cianoboridreto de sódio (88 mg; 1,40 mmol) dissolvido em metanol (2 mL), e o meio reacional foi mantido sob agitação magnética, à temperatura ambiente, por 2 horas. Em seguida, a mistura foi diluída com acetato de etila (30 mL), transferida quantitativamente para um funil de decantação (100 mL), lavada insistentemente com solução saturada de bicarbonato de sódio (5 x 40 mL), seca com sulfato de sódio anidro e concentrada em evaporador rotatório (40 °C). O resíduo obtido (109 mg) foi submetido a uma cromatografia em coluna de sílica-gel “flash” (11 x 330 mm), utilizando-se a mistura acetato de etila - hidróxido de amónio (95:5) como único eluente. Recolheram-se 21 frações de 15 mL cada, cujos perfis cromatográficos foram comparados por CCD de sílica-gel (eluentes: n-hexano - acetato de etila 1:1 / metanol com 1% de bicarbonato de sódio, em suspensão). As frações 17-20 foram reunidas, fornecendo as diterpenil- naftoquinonas 15 a/b (37 mg; 0,06 mmol), em 38% de rendimento.

O espectro de massas de alta resolução (Figura 22) indica a fórmula molecular C4oH56N204 para 15 a/b, e seus espectros de RMN1H e RMN13C (Figura 23 A e B) apresentam sinais característicos das porções diterpênica e amino-naftoquinônica. O sinal em δ 56,4 (CH2) foi atribuído a C-17, e os sinais em δ 178,1 (C=0) e δ 51,1 (CH3) foram atribuídos aos carbonos do grupo éster metílico. Dois outros sinais de carbonilas (δ 183,3 e 181,8) confirmam a presença da unidade quinônica em 15 a/b.

EXEMPLO 7: SÍNTESE DE DERIVADO PERIDRO-PIRIMIDÍNICO 17

O esquema de síntese do derivado peridro-pirimidínico 17 pode ser visualizado na Figura 24. A um balão de fundo redondo bitubulado (25 mL) contendo 1,3-diaminopropano (375 μL; 4,50 mmol) dissolvido em diclorometano anidro (2 mL), na presença de sulfato de magnésio (50 mg; 0,42 mmol), sob agitação magnética e atmosfera inerte (Ar), adicionou-se, gota-a-gota, uma solução do aldeído 16 (50 mg; 0,15 mmol) em diclorometano anidro (3 mL). A mistura foi mantida sob agitação magnética, à temperatura ambiente, por 6 horas. Em seguida, a solução foi concentrada exaustivamente à secura por Speed-Vac® (40 °C, 10 horas), obtendo-se o derivado peridropirimidínico 17 (45 mg; 0,12 mmol), de aspecto gelatinoso, amarelado, em 77% de rendimento.

O espectro de RMN13C de 17 (C24H4o02N2) (Figura 25) não apresenta sinais de carbonos insaturados além daquele da carbonila, o que inviabiliza a proposição de uma função imina para a estrutura deste derivado caurânico. O sinal em δ 73,2, atribuído a um carbono metínico (CH), e em δ 3,46 (1H; 9,6 Hz), atribuído ao hidrogênio de um carbono metínico ligado a dois átomos de nitrogênio saturados , sugere um grupo peridro-pirimidínico em C-17.

EXEMPLO 8: Avaliação da atividade antiplasmódica Testes esquizonticidas in vitro com Plasmodium falciparum utilizando o método de incorporação de hipoxantina tritiada

Culturas sincronizadas com 1% de parasitemia no estágio de anel e 1% de hematócrito foram distribuídas em microplacas de 96 poços colocando-se 200μl por poço. Os compostos a serem testados foram adicionados a diferentes concentrações na placa contendo os parasitos. Os poços controles (sem a adição de drogas) continham hemácias normais não infectadas (controle negativo) ou hemácias infectadas (controle positivo) em meio de cultivo sem adição de drogas. Foram ainda utilizados em cada experimento poços contendo os antimaláricos padrão, cloroquina, artesunato e/ou mefloquina, testados em paralelo nas placas. Cada composto ou fármaco foi testado em triplicatas. Após 24 horas de incubação foram adicionados 25μl da solução de [3H]-hipoxantina (1Ci/mMol) retornando as placas para mais 18 horas de incubação (Desjardins, R.E.; Canfield, C.J.; Haynes, J.D.; Chulay, J.D. Antimicrob. Agents Chemother. 1979, 16, 710). Após este segundo período de incubação, as microplacas foram acondicionadas a -70°C por 10 horas para promover a lise das hemácias; as amostras então foram aspiradas, os filtros secos e acondicionados em embalagem plástica apropriada na qual foram adicionados 4ml de líquido de cintilação. A viabilidade do parasito na presença dos compostos foi demonstrada em curvas de inibição em função de regressão não linear, determinando-se a dose inibitória do crescimento de 50% dos parasitos (IC5o). O resultado do teste está apresentado na tabela 1. Tabela 1-Valores de IC50 para derivados do ácido caurenóico em testes in vitro contra 0 Plasmodium falciparum (cepa W2, cloroquina-resistente).

Marcação de eritrócitos infectados com sondas fluorescentes para cálcio (Fluo-4 AM) e prótons (BCECF-AM)

Placas de cultivo com P. falciparum cloroquina-resistentes (clone W2) sincronizadas com parasitemia variando de 10 a 15%, com predomínio dos eritrócitos infectados no estágio de trofozoíto maduro, foram ressuspendidas com 10 ml de tampão de marcação (116mM NaCI, 5.4mM KCl, 0.8mM MgSCU, 5.5mM D-Glucose, 50mM Mops, 2mM CaCh, pH 7.4) em tubos de 15ml. Os tubos foram centrifugados a 9000g por 5 minutos a temperatura ambiente (TA) para a remoção do plasma humano presente no meio. O número de células foi ajustado para 108 hemácias/ml e adicionados Fluo-4 AM (10μM) ou BCECF-AM (8μM) na presença dos inibidores de proteases leupeptina, pepstatina A, antipaina, quimostatina (10μM) e benzamidina (20μM). A amostra foi incubada durante 40 minutos a 37°C no dessecador, em ambiente protegido da luz. Após esse periodo, as hemácias foram centrifugadas três vezes novamente a 9000g por 5 minutos a TA para a remoção do excesso de marcador extracelular.

Monitoramento da dinâmica de cálcio e prótons em eritrócitos infectados com trofozoítos marcados

Eritrócitos infectados com trofozoítos marcados foram acondicionados em lamínulas de vidro tratadas com poly-l-lysine (Sigma), permanecendo 5 minutos a TA. A lamínula foi introduzida em uma câmara Attofluor Cell Chamber, acoplada ao microscópio confocal Zeiss LSM 510. As amostras foram expostas ao laser 488 nm (Argônio) e a fluorescência captada em um filtro Band-Pass 505-530 nm. Os compostos avaliados foram adicionados diretamente à câmara. No início e final de cada experimento foram feitas io observações com contraste de fase para determinar a integridade morfológica das células. As imagens de fluorescência-captadas em tempo real geraram representações gráficas de intensidade de fluorescência contra o tempo utilizando o software Zeiss LSM 510. Em cada experimento foram avaliadas de 8 a 10 hemácias infectadas.

Em eritrócitos infectados marcados com a sonda fluorescente para cálcio, fluo 4-AM, a amostra 17 foi capazes de mobilizar cálcio de compartimentos intracelulares na concentração de 1 μg/mL em tempo real. A figura 26 mostra a cinética para a amostra 17. Na presença da amostra 17, houve um aumento do cálcio citossólico (Figuras 26 C e 26 D), inibido pela ação de tapsigargina (TAP) a 10μM, inibidor da PfATPaseδ, uma Ca2+-ATPase expressa no retículo endoplasmático do P. falciparum. A adição de 17 também inibiu a ação da TAP sobre a mobilização de cálcio nos parasitos (Figura 26F), indicando que o sítio de ação da amostra 17 é a PfATPAseδ. Comparamos a ação da 17com artesunato (ART) e observamos resultados semelhantes com a TAP. A adição de ART a 1ng/mL inibe a ação da 17 (Figura 26G), porém a adição da 17 não inibe a ação de ART (Figura 26H).

A ação dos diterpenos caurânicos sobre a homeostasia iônica de cálcio no parasito reforça sua importância como uma promissora classe de moléculas com ação antimalárica.

Claims

1. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS ANTIMALÁRICAS caracterizadas por compreenderem ao menos um excipiente farmaceuticamente aceitável e derivados caurânicos com a seguinte fórmula estrutural:

onde R é selecionado do grupo: alquila C1-8, fenila ou arila C3-33 ; R1 é selecionado do grupo: H, OH, =O, SH,=S, NH2 ou NH-R; R2 é selecionado do grupo:

ou ; R3 é igual a R1 ou selecionado do grupo: quinonas ou diaminoalquilas; X é selecionado do grupo: O, S ou N; Entre C9 e C11 pode haver uma ligação simples, dupla ou um grupo epóxido; Entre C15 e C16 pode haver uma ligação simples ou dupla.

2. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelos derivados estarem presentes de forma isolada ou em associação nas composições.

3. COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por serem utilizadas na preparação de medicamentos antimaláricos.