BRPI1006638B1 - Peptídeos marcadores das fases clínicas da neurocisticercose - Google Patents

Abstract

peptídeos marcadores das fases clínicas da neurocisticercose. a presente invenção refere-se á utilização de novos peptídeos miméticos e motivos protéicos que tenham interações com anticorpos ou imunoglobulinas g específicas á neurocisticercose no diagnóstico imunológico desta doença, em especial a fase inativa. para tanto, foram selecionados peptídeos expressos em fagos ligantes á imunoglobulina igy do soro de galinhas white leghorn imunizadas com extrato salino total de metacestódeos de taenia solium. os peptídeos que se ligaram especificamente a lgy dos animais imunizados foram selecionados e utilizados para detecção de lgg em soro de pacientes humanos com neurocisticercose através do teste imunológico elisa (enzyme-iinked immuno assay). dentre esses pacientes, parte apresentava a forma ativa da doença, com cisticercos viáveis e parte a forma inativa, com cisticercos calcificados. o nosso teste com os peptídeos expressos em fago resultou em um diagnóstico de fases da neurocisticercose bem preciso, obtido de forma prática pelo teste elisa. devido à capacidade de ligação em proteínas sorológicas específicas á doença, esses peptídeos podem ser potencialmente ser utilizados em kits de imunodiagnóstico para diferenciação das fases da neurocisticercose.

Description

A presente invenção refere-se à seleção, caracterização e utilização de peptídeos recombinantes e motivos protéicos que se ligam a Imunoglobulinas Y (IgY) presentes no soro de animais da raça White Leghornimunizados com antígeno salino total de metacestódeos de Taenia solium.Os peptídeos foram especificamente imunorreativos com o soro de pacientes com neurocisticercose (NC) e podem ser potencialmente usados no imunodiagnóstico diferencial ou em composições vacinais para o controle da doença.

A espécie T. soliumé um parasito zoonótico, com o suíno como hospedeiro intermediário (Hl) primário, albergando o estágio de metacestódeo ou larvário, e o ser humano é o único hospedeiro definitivo (HD) natural, por desenvolver a forma adulta. Os seres humanos podem comportar-se como Hl acidental, desenvolvendo a forma metacestódea, causando a cisticercose humana (PAWLOWSKI Z, ALLAN J, SARTI E. Control of Taenia solium taeniasis/cysticercosis: from research towards implementation. International Journal for Parasitology, 35:1221-1232, 2005). A forma larvária pode atingir vários tecidos, como tecido subcutâneo, músculo esquelético, coração, pulmão, osso, cordão espinhal e eventualmente a cavidade oral (SOBNACH S et al. First case report of pharyngeal cysticercosis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 103:206-208, 2009), porém o sistema nervoso central (SNC) revela-se como a localização mais importante por sua freqüência e gravidade, sendo relatado que 90% dos casos de cisticercose são da forma cerebral, ou neurocisticercose (NC) (TAKAYANAGUI OM, LEITE JP. Neurocisticercose. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 34:283-290, 2001).

A NC constitui a forma mais grave da cisticercose, sendo a principal causa de epilepsia nos países em desenvolvimento (GARCIA HH, DEL BRUTTO OH. Neurocysticercosis: updated concepts about an old disease.

Lancet Neurology, 4:653-661, 2005). A NC é uma doença parasitária economicamente importante, pois há gastos em saúde devido a hospitalização do paciente e perdas de dias de trabalho, além dos custos com médico, exames, medicamentos. O gasto estimado com o tratamento das complicações da doença no Brasil é de aproximadamente US$85 milhões. Além das perdas econômicas, há o estigma social causado pela epilepsia que também deve ser levado em conta na vida do paciente (PAL DK, CARPIO A, SANDER JWAS. Neurocysticercosis and epilepsy in developing countries. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 68:137-143, 2000).

Os mecanismos de transmissão da cisticercose homem-suíno, homemhomem têm como fator primordial as precárias condições sócio-econômicas, como falta de higiene e de saneamento básico, e comportamentos culturais do ser humano, como ingestão de carne suína mal cozida, uma vez que este é o único hospedeiro definitivo da teníase, não existindo reservatórios silvestres (GARCIA HH. et al. Seroincidence of porcine T. solium infection in the Peruvian highlands. Preventive Veterinary Medicine, 57:227-236, 2003). Outro fator importante para manutenção da cisticercose numa dada região geográfica é o sistema primitivo de criação de suínos, que permite o contato destes animais com fezes humanas mantendo o ciclo de vida de T. solium(SCIUTTO E. et al. Taenia solium disease in humans and pigs: an ancient parasitosis disease rooted in developing countries and emerging as major health problem of global dimensions. Microbes and Infection, 2:1875-1890, 2000).

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o complexo teníase- cisticercose acomete 50.000.000 de indivíduos em todo mundo, e estima-se que, anualmente, 50 milhões de pessoas são infectadas pela cisticercose, provocando aproximadamente 50.000 óbitos/ano mundialmente. (PAL DK, CARPIO A, SANDER JW. Neurocysticercosis and epilepsy in developing countries. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, 68:137-143, 2000).

Na América Latina, calcula-se que a taxa de prevalência de NC é de 100 casos/100.000 habitantes, atingindo cerca de 350.000 pessoas (PINTO PSA. et al. Cysticercosis occurrence and sanitary risks in groups of inspected and noninspected swine in Brazil. Parasitologia Latinoamericana, 57:129-133, 2002). A enfermidade foi encontrada em 17 países latino-americanos, com maiores taxas de morbidade no Brasil, Chile, Peru, El Salvador, Guatemala e México, tendo maior freqüência em áreas rurais (PFUETZENREITER MP, ÁVILA- PIRES FD. Epidemiologia da teníase/cisticercose por Taenia soliume Taenia saginata. Ciência Rural, 30:541-548, 2000).

Além disso, a NC é classificada como uma doença infecciosa emergente em alguns países desenvolvidos devido ao processo imigratório de habitantes de áreas endêmicas, como Estados Unidos da América (EUA) (CARPIO A. Neurocysticercosis: an update. The Lancet Infectious Diseases, 2:751-762, 2002) e Espanha (GIMÉNEZ-ROLDÁN S, DÍAZ F, ESQUIVEL A. Neurocisticercosis e inmigración. Neurologia, 18:385-388, 2003).

No Brasil, a NC é encontrada com elevada freqüência nos Estados de São Paulo, Minas Gerais, Paraná e Goiás, sendo mais comum entre os adultos na terceira e quarta década de idade, ou seja, trabalhadores ativos (ANDRADE-FILHO AS, FIGUERÔA LF, ANDRADE-SOUZA VM. Clinicai tomographic correlations of 220 patients with neurocysticercosis, Bahia, Brazil. The Brazilian Journal of Infectious Diseases, 11:114-117, 2007). No entanto, a prevalência populacional não é totalmente conhecida pela ausência de notificação da doença (TAKAYANAGUI OM, LEITE JP. Neurocisticercose. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical, 34:283-290, 2001).

Em 2003, foi apontado que a soroprevalência da NC no Brasil, desconsiderando as comunidades indígenas, variou 29,4 - 64%, com uma soroprevalência média de 7,04%. Dividindo-se em regiões, a soroprevalência foi maior na região centro-oeste com média de 23,14% (5,2 - 41,02%), seguida pela região norte-nordeste com 4,06% (1,9 - 6,22%) e a região sul-sudeste com 1,8% (0,68% - 3,2%). Em relação aos estudos clínicos e de necropsia, a incidência de NC variou de 0,03 a 13,4% e de 0,12 a 9%, respectivamente (AGAPEJEV S. Aspectos clínico-epidemiológicos da neurocisticercose no Brasil. Arquivos de Neuro-psiquiatria, 61:822-828, 2003).

A incidência da NC tem sido considerada baixa no nordeste brasileiro, sendo freqüente nos Estados do Sul, Sudeste e Centro-Oeste do país, esse fato pode ser justificado pela falta de diagnóstico, visto que sob o ponto de vista clínico as manifestações não são características (PFUETZENREITER MP, ÁVILA-PIRES FD. Epidemiologia da teníase/cisticercose por Taenia solium e Taenia saginata. Ciência Rural, 30:541-548, 2000).

Na região Centro-Oeste, um estudo soro-epidemiológico, demonstrou a endemicidade da cisticercose humana na cidade de Catalão - Goiás (11,3%) (OLIVEIRA, H. B. et al. Anti-Taen/a solium metacestode IgG antibodies in serum samples from inhabitants of a Central-Western region of Brazil. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 48: 49-52, 2006).

A endemicidade da cisticercose e a problemática do complexo teniase- cisticercose foram demonstradas na região do Triângulo Mineiro, constatando a soroprevalência da cisticercose em Araguari (13,5%), Tupaciguara (5,0%), Monte Alegre de Minas (4,8%) e Uberlândia (4,7%) (SILVEIRA-LACERDA E et al. Anti-Taen/a solium metacestodes antibodies in serum from blood donors from four cities of Triângulo Mineiro area, Minas Gerais, Brazil, 1995. Revista do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, 44:229-231, 2002).

Em Uberlândia, também foi investigada a prevalência de cisticercose humana através de necropsias, revelando uma prevalência de 39 casos (1,4%) de cisticercose. Destes, 82,1% dos casos eram do Estado de Minas Gerais, 15,4% de Goiás e um caso (2,5%) não foi possível identificação. Dos 39 casos 35 (89,7%) apresentaram comprometimento do SNC (COSTA-CRUZ JM et al. Occurrence of cysticercosis in autopsies performed in Uberlândia, Minas Gerais, Brazil. Arquivos de Neuropsiquiatria, 53:227-232,1995).

Os metacestódeos geralmente são rapidamente destruídos pelo sistema imunológico do hospedeiro humano, exceto para aqueles localizados em locais imunologicamente privilegiados, como olhos e SNC (ALARCÓN F. Neurocisticercosis: etiopatogenia, manifestaciones clínicas, diagnóstico y tratamiento. Revista de Neurologia, 43:S93-S100, 2006). Entretanto, uma vez estabelecido, o metacestódeo escapa de respostas do sistema imunológico utilizando vários mecanismos, incluindo inibição do complemento, liberação de citocinas, e mimetismo através de imunoglobulinas do hospedeiro. Deste modo, são observadas somente mínimas alterações inflamatórias no tecido circundante (WANG IC. et al.. Suppression of host Th 1-type granulomatous inflammation by Taenia solium metacestodes is related to down-regulation of osteopontin gene expression. International Journal for Parasitology, 38:239- 248, 2008). Neste estágio os metacestódeos são considerados viáveis, sendo denominado de estágio vesicular. Quando o sistema imune do hospedeiro e a resposta inflamatória ultrapassam os mecanismos de evasão do parasito o cisticerco inicia um processo degenerativo, resultando na morte do parasito (GARCIA HH, DEL BRUTTO OH. Neurocysticercosis: updated concepts about an old disease. Lancet Neurology, 4:653-661, 2005). Os estágios pelos quais os cisticercos atravessam até a sua destruição compreendem: estágio vesicular, coloidal, granular e calcificado (SOTELO J, GUERRERO V, RUBIO F. Neurocysticercosis: a new classification based on active and inactive forms. A study of 753 cases. Archives of Internal Medicine, 145:442-445, 1985). A resposta inflamatória ao redor de um ou mais metacestódeos em processo de degeneração (estágios coloidal e granular) pode principiar uma doença sintomática, através da proliferação de linfócitos e posterior diferenciação em células efetoras tipo Th1 e Th2, com subsequente produção de várias citocinas, ou de células plasmáticas, com conseqüente produção de anticorpos específicos (SCIUTTO E. et al. The immune response in Taenia solium cysticercosis: protection and injury, Parasite Immunology, 29:621-636, 2007).

Dessa forma, as manifestações clínicas da NC são dependentes do número, tamanho, localização e estágio de desenvolvimento do metacestódeo, assim como da resposta imunológica do hospedeiro contra o parasito. Portanto, não há manifestações patognomônicas ou típicas da síndrome de NC (TAKAYANAGUI OM, ODASHIMA NS. Clinical aspects of neurocysticercosis. Parasitology International, 55:S111-S115, 2006).

A severidade dos sintomas desta doença é geralmente associada à resposta inflamatória crônica, sugerida pela persistência do antígeno, que também pode ser influenciada por glicoconjugados expressos pelos metacestódeos de T. solium (ALVAREZ JI, RIVERA J, TEALE JM. Differential release and phagocytosis of tegument glycoconjugates in neurocysticercosis: implications for immune evasion strategies. Pios Neglected Tropical Diseases, 2:1-12, 2008).

O conhecimento dos mecanismos imunológicos envolvidos na relação parasita-hospedeiro tem auxiliado na compreensão da patogenia desta parasitose humana. Por conseqüência, esse conhecimento tem colaborado no desenvolvimento de testes imunológicos para o diagnóstico laboratorial desta doença (FLEURY A. et al. Clinical heterogeneity of human neurocysticercosis results from complex interactions among parasite, host and environmental factors. Transactions of Royal Society of Tropical Medicine and Hygine, 104: 243-250, 2010; VAZ AJ. Diagnóstico imunológico das parasitoses. In: DE CARLI GA. (Ed). Parasitologia Clínica: seleção de métodos e técnicas de laboratório das parasitoses humanas. São Paulo: Atheneu, 2001, p.505-539).

Para estabelecer o diagnóstico final da NC é necessário interpretar corretamente os sinais e sintomas clínicos, os resultados dos estudos de neuroimagem e das provas imunodiagnósticas, sempre considerando a epidemiologia relacionada ao paciente (HAWK MW. et al. Neurocysticercosis: a review. Surgical Neurology, 63:123-132, 2005). A confirmação patológica por biópsia ou autópsia é o único padrão ouro no diagnóstico da NC, porém este tem limitações óbvias. O diagnóstico definitivo pode ser estabelecido quando o escólex é visualizado como um nódulo excêntrico nos métodos diagnóstico por imagem, tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (RM) (ALARCÓN F. Neurocisticercosis: etiopatogenia, manifestaciones clínicas, diagnóstico y tratamiento. Revista de Neurologia, 43:S93-S100, 2006). Entretanto, essas técnicas de imagem agregam alto custo e disponibilidade restrita, assim possuem limitado uso nos países em desenvolvimento e com altas taxas de infecção (GARCIA HH, DEL BRUTTO OH. Neurocysticercosis: updated concepts about an old disease. Lancet Neurology, 4:653-661,2005).

Um conjunto de critérios é utilizado para avaliar objetivamente os dados clínicos, radiológicos, imunológicos e epidemiológicos, estabelecendo, assim, o grau de certeza de diagnóstico da NC em definitiva e provável. Nessa classificação, o diagnóstico definitivo é dado quando é feita a demonstração do escólex do cisticerco, ou quando há lesões sugestivas e teste imunológico positivos, ou ainda a somatória desses à manifestações clínicas sugestivas de NC e dados epidemiológicos. O diagnóstico provável ocorre quando não é possível a realização e união de dados de neuroimagem, testes imunológicos e dados epidemiológicos (DEL BRUTTO OH. et al. Proposal of diagnostic criteria for human cysticercosis and neurocysticercosis. Journal of the Neurological Sciences, 142:1-6, 1996).

O diagnóstico clínico da cisticercose é difícil de ser realizado em pacientes assintomáticos, estando associado nos sintomáticos, à alterações fisiológicas provocadas pela localização das formas metacestódeas. No caso da NC nem sempre é fácil, devido ao polimorfismo das manifestações neurológicas, comuns a outras doenças do SNC (YANCEY LS, DIAZ- MARCHAN PJ, WHITE AC. Cysticercosis: recent advances in diagnosis and management of neurocysticercosis. Current Infectious Disease Reports, 7:7-39, 2005).

O imunodiagnóstico da cisticercose humana constitui o diagnóstico indireto da infecção pela detecção de anticorpos contra antígenos da forma metacestódea de T. solium,em amostras biológicas como soro, líquido cefalorraquidiano (LCR), saliva ou sangue em papel de filtro, alcançando quase sempre papel central no diagnóstico da neurocisticercose (COSTA JM. Teste imunoenzimático (ELISA) no diagnóstico da neurocisticercose. Estudo de diferentes extratos antigênicos na detecção de anticorpos IgG em amostras de soro e líquido cefalorraqueano. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 44:15-31, 1986; DECKERS N, DORNY P. Immunodiagnosis of Taenia solium taeniosis/cysticercosis. Trends in Parasitology, 26: 137-144, 2010). Apesar de os métodos de imunodiagnóstico ainda serem utilizados como complementos dos estudos de imagem na NC, o desenvolvimento de testes imunológicos resulta em ferramentas confiáveis para o diagnóstico da NC.

Diferentes técnicas foram descritas para detectar anticorpos em infecções humanas com T. solium,como fixação de complemento, hemaglutinação, radioimunoensaio, ensaio enzimático imunoadsorvente ou enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), dipstick-EUSΔ,aglutinação em látex, e técnicas de imunoeletrotransferência enzimática ou Enzyme-Linked Immunoelectrotransferblot- EITB (immunoblot)(DORNY P et al. Immunodiagnostic tools for human and porcine cysticercosis. Acta Tropica, 87:79-86, 2003). Entre os testes mais utilizados estão ELISA e immunoblot (MACEDO HW et al. Avaliação de testes imunológicos para o diagnóstico da neurocisticercose. Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, 38:93- 103, 2002). O teste ELISA é preferido pelo fato de maior viabilidade, simplicidade e baixo custo quando comparado ao immunoblot (DORNY P et al. Immunodiagnostic tools for human and porcine cysticercosis. Acta Tropica, 87:79-86, 2003). O método de ELISA pode ser realizado para detecção de anticorpos contra metacestódeo de T. soliumou antígenos desse parasito em amostras de soro, saliva, liquor e urina (ALARCÓN F. Neurocisticercosis: etiopatogenia, manifestaciones clínicas, diagnósticos y tratamiento. Revista de Neurologia, 43:S93-S100, 2006).

Antígenos mais comuns usados nesses testes são fluido cístico ou homogeneizados de metacestódeo de T. solium(DORNY ET al., 2003) ou preparações de parasitos relacionados como Taenia crassiceps (PARDINI AX et al. Use of Taenia crassicepsantigen preparations for detection of antibodies in cerebrospinal fluid samples from patients with neurocysticercosis (Taenia solium). Clinical and diagnostic laboratory immunology, 9:190-193, 2002) ou Taenia saginata (OLIVEIRA HB et al. Application of Taenia saginata metacestodes as alternative antigen for the serological diagnosis of human neurocysticercosis. Parasitology Research, 101:1007-1113, 2007). Esses antígenos não purificados possuem sensibilidade moderadas e baixa especificidade (FLEURY A et al. Neurocysticercosis: validity of ELISA after storage of whole blood and cerebrospinal fluid on paper. Tropical Medicine and International Health, 6:688-693, 2001), e assim, limitações na sua reprod utibilidade, sensibilidade e especificidade, e reações cruzadas ocorrem frequentemente com outras parasitoses, especialmente equinococose (DORNY P et al. Immunodiagnostic tools for human and porcine cysticercosis. Acta Tropica, 87:79-86, 2003).

A maioria dos laboratórios de diagnóstico de NC utiliza antigenos glicoprotéicos (GPs) purificados para detecção de anticorpos (TSANG VC, BRAND JA, BOYER AE. An enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay and glycoprotein antigens for diagnosing human cysticercosis (Taenia solium). The Journal of infectious diseases, 59:50-59, 1989). O uso de GPs purificadas é limitado devido à tecnologia necessária para o ensaio, alto custo e complexidade do processo de purificação (SILVA MRM et al. Recombinant expression of Taenia solium TS14 antigen and its utilization for immunodiagnosis of neurocysticercosis. Acta Tropica, 100:192-198, 2006). Assim, a baixa reprodutibilidade combinada com a freqüente indisponibilidade de material do parasito tem estimulado o desenvolvimento de antigenos alternativos utilizando métodos de biologia molecular (FERRER E et al. Molecular cloning and characterisation of Ts8B1, Ts8B2 and Ts8B3, three new members of the Taenia solium metacestode 8 kDa diagnostic antigen family. Molecular & Biochemical Parasitology, 152:90-100, 2007).

Desse modo, novos conceitos no diagnóstico desta parasitose têm sido aperfeiçoados nos últimos anos; dentre os quais se destaca a identificação e sequenciamento de antigenos específicos e o desenvolvimento de novas técnicas laboratoriais de diagnóstico (GARCIA HH et. al. New concepts in the diagnosis and management of neurocysticercosis (Taenia solium). American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 72:3-9, 2005).

Um diagnóstico preciso é a primeira etapa para um tratamento médico adequado. Tendo em vista este objetivo, várias patentes abordam a utilização de antigenos homólogos (T. solium)tais como: US4855408, MXPA02004417A, US5354660A, MXPA02001231A, W090/08958, ou heterólogos (T. crassiceps) PI0504527 e US005874251A para o diagnóstico da cisticercose.

Os extratos antigênicos totais são amplamente utilizados em estudos soroepidemiológicos em áreas endêmicas, mas a identificação e purificação de glicoproteínas (GPS) é o alvo de diversos estudos sorológicos no diagnóstico da NC (BUENO EC et al. Application of synthetic 8-kD and recombinant GP50 antigens in the diagnosis of neurocysticercosis by enzyme-linked immunosorbent assay. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 72:278-283, 2005), uma vez que o uso de diferentes extratos antigênicos totais da forma metacestódea de T. solium(extrato salino total, líquido de vesícula e extrato alcalino total) resultam em diferenças significantes nos testes imunológicos (COSTA JM. Teste imunoenzimático (ELISA) no diagnóstico da neurocisticercose. Estudo de diferentes extratos antigênicos na detecção de anticorpos IgG em amostras de soro e líquido cefalorraqueano. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 44:15-31, 1986). Nesse sentido foi feito pedido de patente para um grupo de GPs obtidas por purificação em lectina para o diagnóstico da NC, US5354660A.

Várias técnicas de purificação já foram descritas, nas quais as taxas de sensibilidade e especificidade ficaram próximas a 100% (ASSANA E et al. Isolation of a 14 kDa antigen from Taenia solium cyst fluid by HPLC and its evaluation in enzyme linked immunosorbent assay for diagnosis of porcine cysticercosis. Research in Veterinary Science, 82:370-376, 2007; SATO MO. et al. Evaluation of purified Taenia solium glycoproteins and recombinant antigens in the serologic detection of human and swine cysticercosis. The Journal of Infectious Diseases, 194:1783-1790, 2006).

O uso de peptídeos tem demonstrado ótimos resultados nas diversas áreas de imunodiagnóstico, onde estão sendo considerados excelentes candidatos a antígenos pelos altos índices de sensibilidade e especificidade, além de demonstrarem pouquíssima reatividade cruzada. Com isso, peptídeos sintéticos tornaram-se uma área de pesquisa promissora tanto para uso em testes imunológicos quanto no desenvolvimento de vacinas (FERRER E et al. Molecular cloning and characterisation os Ts8B1, Ts8B2 and Ts8B3, three new members of the Taenia solium metacestode 8 kDa diagnostic antigen family. Molecular and Biochemical Parasitology, 152:90-100, 2007; SAKO Y. et al.

Recombinant antigens for serodiagnosis of cisticercosis and echinococcosis. Parasitolgy Internacional, 55:569-573, 2006). Nesse sentido, existem algumas patentes que relatam a utilização de polipeptídeos sintéticos, por exemplo PT1282822E, US2007/0122853A1, WO01/75448A2, US7094576, recombinantes como WO01/25424A1, US6589752B1, W02005/000886A2, como reagentes úteis no diagnóstico da NC. Além dos bons resultados em testes imunológicos estes peptídeos podem ainda ser integrantes de composições farmacêuticas ou vacinais.

Nos últimos anos vários pesquisadores têm testado novas técnicas para diagnosticar a NC: um teste de co-aglutinação (CO-A) foi utilizado para detecção de antígenos de metacestódeos de T. soliumna urina de pacientes com NC, encontrando sensibilidade e especificidade moderadas (PARIJA M et al. Detection of specific cysticercus antigen in the urine for diagnosis of neurocysticercosis. Acta Tropica, 92:253-260, 2004), uma proteína de 10 kDa recombinante de T. soliumexpressa em uma bactéria foi utilizada para diagnosticar esta doença por immunoblot (LEE EG et al. Feasibility of baculovirus-expressed recombinant 10-kDa antigen in the serodiagnosis of Taenia solium neurocysticercosis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 99:919-926, 2005), insertos de cDNA clonados e purificados foram utilizados para detecção de NC ativa através do teste ELISA com amostras de soro e LCR, obtendo alta sensibilidade e especificidade (FERRER E et al. Molecular cloning and characterisation os Ts8B1, Ts8B2 and Ts8B3, three new members of the Taenia solium metacestode 8 kDa diagnostic antigen family. Molecular and Biochemical Parasitology, 152:90-100, 2007), antígenos de T. saginataforam testados como alternativa para o diagnóstico da NC humana, obtendo resultados bastante satisfatórios (OLIVEIRA HB et al. Application of Taenia saginatametacestodes as alternative antigen for the serological diagnosis of human neurocysticercosis. Parasitology Research, 101:1007-1113, 2007), e frações obtidas pela purificação do extrato salino de T. soliumatravés do Triton X-114 foram avaliadas no imunodiagnóstico da neurocisticercose humana, encontrando resultados satisfatórios (MACHADO

GA et al.. Assessment of antigenic fractions of varying hydrophobicity from Taenia solium metacestodes for the diagnosis of human neurocysticercosis. Tropical Medicine and International Health, 12:1-8, 2007); outros autores têm testado antigenos variados para o diagnóstico de NC pelo teste Dot Blot (MANDAL J et al. Evaluation of lower molecular mass (20-24 kDa) Taenia solium cysticercus antigen fraction by ELISA and dot blot for the serodiagnosis of neurocysticercosis in children. Parasitology Research, 102:1097-1101, 2008).

Várias patentes descrevem diferentes técnicas para diagnóstico da NC com diversos antigenos totais ou fracionados, assim como proteínas purificadas, ou polipetídeos sintetizados. A patente US4801532 se refere a um teste para detecção de NC ativa tanto em soro quanto em amostras de LCR. Já as patentes US2006264614 e CA2526023 faze referem á proteína T24 purificada para detecção de cisticercose e NC, e a patente US7547762 refere- se a sequência de aminoácidos e molecular dessa proteína. A patente US5354660 trata da utilização das glicoproteínas (GP) GP50, GP42, GP24, GP21, GP18, GP14 e GP13 no diagnóstico de NC através da técnica de immunoblot. A patente CA1340196 trata da utilização de proteínas excretadas/secretadas de Cysticercus cellulosae no imunodiagnóstico da NC.

A utilização de marcadores moleculares tem sido amplamente estudada com o objetivo de definir padrões de diversidade genética e variação interespecífica para Taeniasp e aprimorar os marcadores de diagnóstico e peptídeos para vacinação (HOBERG EP. Taenia tapeworms: Their biology, evolution and socioeconomic significance. Microbes and Infection, 4:859-866, 2002).

Desde a sua descrição em 1985, a tecnologia de phage display (exposição de biomoléculas em fagos) tem apresentado utilização cada vez mais crescente em diversas áreas das ciências (SMITH GP. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, 228:1315-1317, 1985). O phage displayé um método de seleção no qual uma biblioteca de peptídeos ou proteínas é expressa no exterior da partícula de um bacteriófago, enquanto o material genético codificante para cada peptídeo encontra-se no genoma virai. Biblioteca de peptídeos sintéticos apresentados em fagos é uma ferramenta importante para identificar os sítios ligantes de moléculas biológicas de interesse e no desenvolvimento de novas vacinas (AZZAZY W, HIGHSMITH Jr WE. Phage display technology: clinical applications and recent innovations. Clinical Biochemistry, 35:425-445, 2002), sendo possível estabelecer a correlação entre cada seqüência de proteína variante e sua respectiva seqüência de DNA, permitindo rápida caracterização (ADDA CG et al. Random sequence libraries displayed on phage: identification of biologically important molecules. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening, 5:1-14, 2002). Nesse sentido, o sistema de phage displaytem sido usado para seleção e identificação de epítopos específicos à diversas patologias (GERSHONI JM et al. Epitope mapping: the first step in developing epitope-based vaccines. BioDrugs, 21:145-156, 2007; KUROSAWAA G et al. Comprehensive screening for antigens overexpressed on carcinomas via isolation of human mAbs that may be therapeutic. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 5:7287-7292, 2008). Uma grande possibilidade do phage displayé a conveniência de que tais bibliotecas podem ser selecionadas pelos ligantes alvos-específicos (BROWN KC. Peptidic tumor targeting agents: the road from phage display peptide selections to clinical applications. Current Pharmaceutical Design, 16:1040-1054, 2010; SERGEEVA A et al. Display technologies: application for the discovery of drug and gene delivery agents. Advanced Drug Delivery Reviews, 58:1622-1654, 2006). Essa ampla utilização se deve a algumas vantagens: habilidade de selecionar ligantes de alta afinidade, possibilidade de produzir proteínas solúveis, baixo custo, fácil manuseio e rapidez (BRATKOVIC T. Progress in phage display: evolution of the technique and its application. Cellular and Molecular Life Sciences, 67: 749- 767, 2010; SMITH GP, PETRENKO VA. Phage display. Chemical Reviews, 97:391-410,1997). Além disso, essa técnica pode beneficiar o aperfeiçoamento de métodos diagnósticos através da identificação de moléculas atualmente impossíveis de se obter por métodos tradicionais (SODERLIND E et al., Recombining germLinederived CDR sequences for creating diverse singleframework antibody libraries. Nature Biotechnology 18: 852-856, 2000).

Esta técnica, desenvolvida por George Smith em 1985, que expressou pela primeira vez a enzima de restrição EcoRI fundida à proteína (pVIII) do capsídeo do fago, utiliza em muitos casos o bacteriófago M13, um vírus bacteriófago filamentoso que infecta bactérias gram-negativas que por sua vez apresentam pilusF (Sidhu SS Engineering M13 for phage display. Biomolecular engineering 18: 57-63, 2001). A partícula do fago é formada por uma fita simples de DNA envolta por uma capa protéica constituída por cinco proteínas (plll, pVI, pVII, pVIII e pIX). Neste sistema, o gene codificador do peptídeo ou proteína de interesse é geralmente fusionado a um dos genes das proteínas da capa protéica do fago, assim, o peptídeo é expresso na extremidade N-terminal da plll ou pVIII (BRÍGIDO MM, MARANHÃO AQ. Bibliotecas Apresentadas em fagos. Biotecnologia Ciência e Desenvolvolvimento, 26:44-55, 2002).

O peptídeo ou proteína expresso na superfície do fago possibilita a seleção de seqüências baseada na afinidade de ligação para uma molécula alvo por um processo de seleção in vitrodenominado biopanning (PARMELY SF, SMITH GP. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73:305-318,1988).

Atualmente, têm sido isolados inúmeros peptídeos pela técnica de phage displaypara diversas patologias. Por exemplo, a patente US2005/0037972A1 relata o isolamento de agentes antimicrobianos ligantes a Haemophilus influenzaepor essa técnica molecular. Muitas são as patentes relacionados a descoberta de peptídeos ligantes a células cancerígenas como US2006/0058228A1 que informa sobre a descoberta de peptídeos ligantes específicos a células de tumor de cólon, a patente US2008/0193375A1 sobre peptídeos ligantes alvo ao câncer de pulmão com possível função terapêutica, e a US2009/0136418A1 identificou peptídeos ligantes a células de carcino hepatocelular também com função terapêutica. Outra patente, US2007/0281302A1, discorre sobre peptídeos que permitem a detecção de

Bacillus anthracis.Adicionalmente, as patentes US6306365-B1, US6296832- B1, US6068829-A referem-se à identificação de peptídeos ligantes a diversos órgãos do corpo humano. Esses peptídeos podem ser usados no diagnóstico e tratamento de diferentes patologias.

A patente US2008124277 relata a utilização de peptídeos obtidos por bibliotecas como agentes de entrega de fármacos para inibição de angiogênese e crescimento tumoral e indução de apoptose. As patentes US7083945, US2006068421, US2005202512, GB2408332 , US2003104604, EP1452599, US2006035223 utilizam a técnica de phage displaycom o intuito de expressar polipeptídeos recombinantes, além de propor metodologias que tornam a técnica mais eficiente.

A técnica de phage displaypermitiu o mapeamento de epítopos da região N-terminal de TPmy (paramiosina de T. solium),que são altamente imunogênicos nesta molécula. Utilizando diferentes métodos de seleção e eluição, identificaram peptídeos com homologia à proteína em questão, sugerindo a identificação de um epítopo linear e descontinuo, com prováveis propriedades imunodominantes, reveladas por análises computacionais de antigenicidade (GAZARIAN KG et al. Epitope mapping on N-terminal region of Taenia solium paramyosin. Immunology Letters, 42:191-195, 2000). Esta técnica tem sido utilizada no entendimento de doenças provocadas por vírus, bactérias, protozoários e parasitos e a interação entre seus antigenos e a resposta imune do hospedeiro, na busca de mapear epítopos ou desenvolvimento de vacinas.

Esta metodologia tem se mostrado útil não apenas para o mapeamento de interações proteína-proteína como na identificação de moléculas alvo importantes para o desenvolvimento de vacinas e drogas contra parasitos como Plasmodiumsp, causador de malária, e Brugia malayi, causador de filariose linfática (LANZILLOTTI R, COETZER TL. Phage display: a useful tool for malaria research? Trends in Parasitology, 24:18-23, 2008; GNANASEKAR M et al. novel small heat shock protein 12.6 (HSP12.6) from Brugia malayi functions as a human IL-10 receptor binding protein. Molecular & Biochemical

Parasitology, 159:98-103, 2008), assim desenvolvendo veículos de entrega de vacinas (BENHAR, I. Biotechnological applications of phage and cell display. Biotechnology Advances, 19:1-33, 2001). A patente US2003/0082524A1 é um exemplo de peptídeos miméticos utilizados como vacina, nesse caso contra produtos bacterianos.

Apesar de T. soliumcausar uma importante doença parasitária em humanos e suínos, incluindo um sério problema neurológico que é a NC, este patógeno não é extensivamente caracterizado no nível molecular, e o diagnóstico desta helmintose continua sendo um desafio na prática médica (ROBLES Y et al. Isolation of the Taenia crassiceps antigens from a phage display cDNA library and evaluation of their use for diagnosis of neurocysticercosis. Clinical Immunology, 116:265-270, 2005). Dessa forma, o uso da técnica phage displaypode auxiliar a caracterização molecular de T. solium e apresenta possível uso no aprimoramento do diagnóstico da NC. Através da técnica de phage displayforam identificados epitopos ligantes de anticorpos presentes no LCR de pacientes com NC (MANOUTCHARIAN K et al. Characterization of cerebrospinal fluid antibody specificities in neurocysticercosis using phage display peptide library. Clinical Immunology, 91:117-121, 1999). Estes autores relataram a seleção de peptídeos por phage displaycomo uma ferramenta para o desenvolvimento de um teste de imunodiagnóstico mais simples e sensível e no entendimento dos mecanismos moleculares da patogênese da NC.

A metodologia do phage displaytambém foi utilizada para análise da homologia de sequências de peptídeos selecionados de bibliotecas contra conteúdos do soro de pacientes com NC e de pacientes sem NC. Dois tipos diferentes de seqüências foram obtidas e distinguidas como “NC-relacionada” e “NC-não relacionada”. Este tipo de análise pode permitir a identificação de doença quando os testes imunológicos são negativos (GAZARIAN KG et al. Post-panning computer-aided analysis of phagotope collections selected with neurocysticercosis patients polyclonal antibodies: separation of diseaserelevant and irrelevant peptide sequences. Combinatorial Chemistry & High

Throughput Screening, 4:221-235, 2001).

A capacidade de fagos recombinantes na vacinação contra cisticercose suína também foi testada, demonstrando uma capacidade protetora desta vacina contra a doença (MANOUTCHARIAN, K et al. Recombinant bacteriophage-based multiepitope vaccine against Taenia solium pig cysticercosis. Veterinary Immunology and Immunopathology, 99:11-24, 2004).

Além disso, buscou-se a utilização de antígenos alternativos no método de phage display, como o isolamento de antígenos de T. crassiceps em biblioteca de cDNA e sua utilização na identificação de antígenos para o reconhecimento de anticorpos em amostras clínicas de pacientes com NC. A construção de bibliotecas pode ter inúmeras implicações na pesquisa da cisticercose, como identificação de antígenos candidatos à vacina, isolamento de antígenos do parasito circulantes no hospedeiro, ou em estudos da interação parasito-hospedeiro (ROBLES, Y. et al Isolation of the Taenia crassiceps antigens from a phage display cDNA library and evaluation of their use for use for diagnosis of Neurocysticercosis. Clinical Immunology, 116:265- 270, 2005).

Mais recentemente, peptídeos selecionados por phage displayforam utilizados por diferentes grupos de pesquisadores para o imunodiagnóstico da NC, mostrando que essa metodologia é uma real e eficiente alternativa para seleção de peptídeos antigênicos com aplicação imediata no diagnóstico sorológico dessa patologia (HELL RC. et al. Immunodiagnosis of human neurocysticercosis using a synthetic peptide selected by phage-display. Clinical Immunology, 131:129-138, 2009; da SILVA RIBEIRO V. et al. Selection of high affinity peptide ligands for detection of circulating antibodies in neurocysticercosis. Immunology Letters, 129:94-99, 2010).

Diante das limitações dos testes sorológicos, houve um aumento no interesse da técnica de phage display(bibliotecas de peptídeos randômicos expressos na superfície de fagos), desenvolvida nos últimos anos como fonte de identificação de variado número de epítopos e mimotopos, e do bioppaning para a seleção biológica dos fagos ligantes às moléculas alvos.

A aplicação de bibliotecas de peptídeos em fagos para a identificação de anticorpos específicos ao nível de aminoácidos traz informações importantes sobre mecanismos moleculares de doenças e ainda possibilita novas ferramentas úteis no diagnóstico. Uma vez que esta estratégia não requer informações detalhadas sobre o antígeno natural, é possível identificar agentes responsáveis por doenças com etiologia obscura utilizando apenas o soro do paciente e uma biblioteca de peptídeos.

Várias aplicações das bibliotecas de peptídeos randômicos expostos em fagos têm sido realizadas com sucesso, tais como mapeamento de epítopos, desenvolvimento de vacinas e identificação de peptídeos miméticos de ligantes não peptídicos e, preparação de anticorpos monoclonais pela utilização de bibliotecas de fagos geradas pela imunização in vitro de células mononucleares do sangue periférico (PBMC); estudo de interações proteína-proteína, além da utilização de fagos como veiculadores na entrega de drogas contra células cancerosas (HOF D, HOEKE MO, RAATS JMH. Multiple-antigen immunization of chickens facilitates the generation of recombinant antibodies to autoantigens. Clinical and Experimental Immunology, 151:367-377, 2007; BAIR CL et al. A phage display system designed to detect and study protein-protein interactions. Molecular Microbiology, 67:719-28, 2008; MATSUMOTO SE et al. A rapid and efficient strategy to generate antigen-specific human monoclonal antibody by in vitro immunization and the phage display method. Journal of Immunological Methods, Article in press, 2008; BAR H, YACOBY I, BENHAR I. Killing cancer cells by targeted drug-carrying phage nanomedicines. BMC Biotechnology, 8:37-50, 2008).

As vantagens da utilização da técnica de phage displaysão a habilidade de selecionar ligantes de alta afinidade, a possibilidade de produzir proteínas solúveis, o baixo custo, o fácil manuseio e a rapidez (SMITH GP, PETRENKO VA. Phage display. Chemical Reviews, 97:391-410,1997).

Devido à distância evolucionária entre galinha, homem e cisticerco, sabe que esses animais reagem contra um número maior de epítopos do que os anticorpos dos seres humanos, que estão relacionados evolucionariamente à

T. solium,o que provê uma amplificação do sinal (CARLANDER D, STÂLBERG J, LARSSON A. Chicken antibodies: a clinical chemistry perspective. Upsala Journal of Medical Sciences, 104:179-189, 1998). O anticorpo IgY é a imunoglobulina predominante no soro de pássaros, répteis e anfíbios (ZHANG WW. The use of gene-specific IgY antibodies for drug target discovery. Drug Discovery Today, 8:364-371, 2003). Esse anticorpo foi descrito como um homologo funcional e ancestral evolucionário da IgG e IgE mamíferas, porém estruturalmente diferente (WARR GW, MAGOR KE, HIGGINS DA. IgY: clues to the origins of modern antibodies. Immunology Today, 16:392-398, 1995). IgY é considerada um típico anticorpo de baixo peso molecular, tendo duas cadeias leve e duas cadeias pesadas (COVA L. DNA-designed avian IgY antibodies: novel tools for research, diagnostics and therapy. Journal of Clinical Virology, 34:S70-S74, 2005).

A IgY possui diferenças em relação a IgG, como não ativação do complemento (CARLANDER D et al. Peroral immunotherapy with yolk antibodies for the prevention and treatment of enteric infections. Immunology Research, 21:1-6, 2000), e resistência a valores extremos de pH 4-9 (LEE K et al. Acid stability of anti-Helicobacter pylori IgY in aqueous polyol solution. Journal of Biochemistry and Molecular Biology, 35:488-493, 2002), e, adicionalmente, não reage com os anticorpos mamíferos IgG e IgM, fato que pode ser usada em muitas maneiras para reduzir reações indesejadas em ensaios usando anticorpos anti-lgG (ZHANG WW. The use of gene-specific IgY antibodies for drug target discovery. Drug Discovery Today, 8:364-371, 2003). Essas diferenças trazem grandes vantagens a aplicação de IgY em uma variedade de métodos de pesquisa, diagnósticos, aplicação médica e biotecnologia (CARLANDER D et al. Peroral immunotherapy with yolk antibodies for the prevention and treatment of enteric infections. Immunology Research, 21:1-6, 2000; ERHARD MH et al. Adjuvant effects of various lipopeptides and interferon-gamma on the humoral immune response of chickens. Poultry Science, 79:1264-1270, 2000; ZHANG WW. The use of genespecific IgY antibodies for drug target discovery. Drug Discovery Today, 8:364- 371, 2003). IgY gerada por imunização de galinhas com proteínas são atualmente usadas em técnicas de laboratório como, por exemplo, immunoblot, imunoeletroforese, imunoprecipitação, teste ELISA e em seleções de petídeos por phage display(CARDOSO R et al. Peptide mimicking antigenic and immunogenic epitope of neuwiedase from Bothrops neuwiedi snake venom. Toxicon, 53:254-261, 2009; TINI M et al. Generation and application of chicken egg-yolk antibodies. Comparative biochemistry and physiology. Part A, Molecular & integrative physiology, 131:569-574, 2002).

Na busca de um diagnóstico rápido, eficiente e acurado da NC, a presente invenção propõe o uso de peptídeos ligantes específicos a IgY de galinhas imunizadas com antígeno salino total de metacestódeo de T. solium, determinando motivos protéicos funcionais, através da interação de bibliotecas de peptídeos apresentados na superfícies de fagos filamentosos. Em combinação com outras tecnologias como testes imunoenzimáticos, por exemplo, o ELISA, faz com que essa invenção seja prontamente aceita, pois a nova tecnologia apresenta alta sensibilidade e flexibilidade de utilização em relação a outras tecnologias vigentes para identificação de novos marcadores para diagnóstico, monitoramento, prognóstico e tratamento da NC. Dessa forma, a presente invenção propõe o uso de seqüências peptídicas, fusionadas ou não a carreadores, tais como fagos filamentosos, ou a qualquer outro tipo de carreador e sua utilização no diagnóstico sorológico da NC através da detecção de IgG de pacientes com NC. A sequência reversa dos peptídeos também pode ser utilizada com esse propósito.

A invenção será compreendida através da descrição detalhada mediante os exemplos para os resultados experimentais obtidos. Os procedimentos experimentais envolvidos estão detalhados na seqüência.

A metodologia empregada permitiu selecionar peptídeos miméticos de antígenos envolvidos na NC marcadores das fases clínicas da NC, pela ligação á componentes e/ou moléculas envolvidas direta ou indiretamente na resposta imune à NC. Para a seleção, caracterização e utilização de peptídeos e motivos protéicos que interajam com IgG presentes no soro de pacientes com

NC vários métodos foram aplicados e testados em diferentes amostras de soro de pacientes com NC, outras parasitoses e aparentemente saudáveis, comprovando a eficiência da sua utilização para diagnóstico de pacientes com NC.

Exemplo 1:

Este exemplo se refere à produção de imunoglobulinas Y (IgY) anti- metacestódeo de Taenia soliumatravés da imunização de galinhas da raça White Leghorn.Foram imunizados quatro animais da raça White-Leghorn de três semanas de idade (BARBAS CF et al. Phage display: a laboratory manual. Plain view, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Sumariamente, três aplicações intramusculares do extrato total de metacestódeos de T. solium (COSTA JM. Teste imunoenzimático (ELISA) no diagnóstico da neurocisticercose. Estudo de diferentes extratos antigênicos na detecção de anticorpos IgG em amostras de soro e líquido cefalorraqueano. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 44:15-31, 1986), emulsionado em adjuvante foram realizadas, sendo que na primeira imunização a quantidade de proteína foi de 200 pg em adjuvante completo de Freund, e as demais de 100 pg em adjuvante incompleto de Freund, com intervalos de 15 dias entre cada uma das imunizações. Foram imunizadas duas galinhas e duas foram mantidas como controle, imunizadas somente com adjuvante e PBS. O título de anticorpos específicos foi monitorado por testes ELISA até a obtenção do título ideal quando coletou-se o sangue total dos animais. A purificação de IgY foi realizada com o uso da coluna HiTrap IgY Purification HP, 5 mL (Amersham Biosciences, USA). Foi utilizado um sistema completo de cromatografia liquida modelo Akta Purifier (Amersham Bioscience). A dosagem protéica foi realizada pelo método de Lowry et al. (1951) (LOWRY OH et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193: 265-275, 1951). A visualização das amostras de IgY purificadas foi realizada por SDS PAGE 12%, como descrito por Laemmli (LAEMMLI UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227: 680-685,1970), através de coloração do gel de poliacrilamida pela prata. Após a obtenção do anticorpo purificado a especificidade das IgYs em relação ao metacestódeo de T. soliumfoi realizada através do ensaio de ELISA.

Exemplo 2:

Este exemplo se refere à seleção e a caracterização dos peptídeos recombinantes e motivos protéicos que se ligaram a IgY dos animais imunizados com extrato total de metacestódeos de T. solium.Diversos parâmetros podem ser utilizados para indicar o sucesso da seleção de cada peptídeo (RODI DJ et al. Quantitative assessment of peptide sequence diversity in M13 combinatorial peptide Phage Display Libraries. Journal of Molecular Biology, 322: 1039-1052, 2002), como pode ser visualizado na TABELA 1.

A TABELA 1 apresenta a identidade das seqüências de aminoácidos selecionadas, bem como as suas respectivas frequências observadas (FO); freqüências esperadas (FE), que correspondem à probabilidade da sequência randômica; amplificação dos peptídeos decorrentes do processo de seleção em relação à freqüência esperada dos peptídeos na biblioteca original; grau de informação de cada peptídeo (l(m)), que é dado por -In (probabilidade de sequência randômica); e o número provável de clones independentes dentro da biblioteca (À). Quanto maior o grau de informação, mais efetiva foi a seleção do peptídeo, consequentemente, mais raro ele é na biblioteca.

Foram obtidos 7 clones com seqüências distintas (Seq. ID N— 01 a 07), sendo que todos eles apresentaram alto grau de informação. Peptídeos que exibem alto grau de informação são menos prováveis de ocorrer ao acaso do que aqueles que possuem baixo nível de informação (RODI DJ et al. Quantitative assessment of peptide sequence diversity in M13 combinatorial peptide Phage Display Libraries. Journal of Molecular Biology 322: 1039-1052, 2002).

O elevado grau de informação de cada peptídeo selecionado, obtido pelas análises de bioinformática, valida os dados de bioppaning e comprovam a eficiência da técnica de Phage Display.

Observou-se, ainda, que houve um grande enriquecimento de todos os peptídeos selecionados em relação as suas freqüências esperadas na biblioteca de fagos, sugerindo que são específicos para neurocisticercose.

Com a possibilidade de ligação dos peptídeos com alguma molécula tumoral no sentido carboxi terminal para amino terminal nós também analisamos as seqüências no seu sentido reverso, identificadas como Seq. ID 08 ao Seq. ID 14. Por exemplo, a Seq. ID N- 01 tem a seqüência inversa Seq. ID Ns 08, a Seq. ID N2 02 possui a seqüência inversa Seq. ID N2 09, a assim sucessivamente, até a Seq. ID N2 07 que possui a seqüência inversa Seq. ID N2 14 como apresentado da TABELA 2.

Exemplo 3:

Este exemplo refere-se as seqüências protéicas dos peptídeos selecionados que apresentaram similaridade com algumas proteínas de 5 diversas espécies do gênero Taenia,dentre elas as mais importantes e freqüentes: T. soliume T. saginata, que estão presentes no banco de dados GenBank.

A TABELA 3 apresenta o alinhamento das seqüências protéicas dos peptídeos selecionados mostrando as homologias encontradas com as io principais proteínas relacionadas ás espécies de T. soliume T. saginata no banco de dados do GeneBank pelo BLAST, com os números de acesso que obtiveram similaridade com os clones selecionados.

O resultado dos alinhamentos demonstrou que os peptídeos selecionados apresentam similaridades com proteínas relacionadas à T. solium e T. saginata previamente depositadas no banco de dados. Em relação as sequências de interesse, o peptídeo Seq. ID Na 1 foi similar às proteínas Ts3 e 17H; o Seq. ID N2 2 à proteína putative mitotic checkpointe à NADH desidrogenase subunidade 2; Seq. ID N2 3 foi similar à c-jun; Seq. ID N2 4 correlacionou-se às proteínas da família TSO45 e Tso31, e à paramiosina; Seq. ID N2 5 à TGTP1; Seq. ID N2 6 à filamina e c-jun; Seq. ID N2 7 teve máxima similaridade com citocromo c oxidase subunidade I, proteína putative mitotic checkpoint,ATPase transportadora de Sódio/Potássio subunidade alfa e putative quinase de nucleosideo trifosfato. Essas proteínas apresentam diversas funções. A proteína 17H pode ter um importante papel no tráfico de membrana, sugerindo estar envolvida na interação com o organismo hospedeiro. As proteínas como adenosina trifosfato subunidades 6 e 8, citocromo b, citocromo c oxidade subunidade 1-3 (Cox1-3) e NADH desidrogenase subunidades 1-6 e 4L (ND1-6 e 4L) estão envolvidas na fosforilação oxidativa. O gene c-jun, juntamente com c-fos, está relacionado com a proliferação e diferenciação celular em T. solium.Os genes TSO45 de T. soliumcodificam possivelmente proteína antigênicas com potencial uso como vacina. A paramiosina, também conhecida com antígeno B, foi identificada com um antígeno candidato à vacina de helmintos, e é expressa especificamente no estágio de metacestódeo em T. solium,sendo uma proteína muscular com importante papel na sobrevivência do parasito, inibindo a fração 1 do complemento. TGTP1 é um dos transportadores de difusão facilitada de glucose em T. soliume abundante no tegumento do parasito adulto e do cisticerco.

Exemplo 4:

Este exemplo se refere aos testes ELISA para estudo da imunoreatividade dos clones de fagos recombinantes selecionados. Os peptídeos ligados ao fago foram testados para detecção de anticorpos de pacientes com NC, além disso, foram utilizados soros de pacientes com outras parasitoses e de indivíduos saudáveis, para verificação da sensibilidade e especificidade dos clones, respectivamente. Para tanto, foram obtidas 40 amostras de soro de pacientes com diagnóstico confirmado de NC, constituindo o Grupo 1, sendo dezoito indivíduos (45%) classificados com NC ativa, e vinte e dois (55%) com NC inativa. Para verificar a reatividade cruzada, foram utilizadas 40 amostras de soro de pacientes com outras parasitoses (Grupo 2). O Grupo 3 constitui-se de 30 amostras de soro de indivíduos saudáveis. Houve diferença na detecção de IgG nos subgrupos dos pacientes com NC, ativa e inativa, pois todos os clones apresentaram maior reatividade no subgrupo dos pacientes com NC inativa. Os valores de sensibilidade, especificidade e eficiência diagnóstica estão apresentados na Tabela 4, onde NC = pacientes com neurocisticercose (n = 40); At = subgrupo de pacientes com neurocisticercose ativa (n = 18); In = subgrupo de pacientes com neurocisticercose inativa (n = 22).

Os níveis de IgG sérica obtidos por ELISA frente aos clones Seq. ID N- 1 a Seq. ID N- 7, obtidos pelo processo de bioppaning, com amostras de soro na diluição 1:200 dos indivíduos dos grupos 1 (neurocisticercose n=40); 2 (pacientes infectados por outros parasitos n=40) e 3 (indivíduos saudáveis n=30) são mostrados nas FIGURAS 1-7, onde a linha horizontal indica o índice de Reatividade (IR) = 1, o símbolo % a positividade, e as barras com asterísticos as diferenças estatísticas entre a positividade dos grupos sendo * = p < 0.05, ** = p < 0.001, *** = p <0.0001.

Na FIGURA 1, para o clone Seq. ID Ns 1, 95,5% (21/22) das amostras 5 foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, e 16,7% (3/18) para NC ativa, 17,5% (7/40) no grupo 2 e 6,7 % (2/30) no grupo 3.

Na FIGURA 2, observa-se que para o clone Seq. ID N- 2, 100% (22/22) das amostras foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, 27,8% (5/18) para NC ativa, 17,5% (7/40) no grupo 2 e 10 % (3/30) no grupo 3. io A FIGURA 3 mostra a reatividade para o clone Seq. ID N2 3, para o qual 100% (22/22) das amostras foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, 33,3% (6/18) e para NC ativa, 15% (6/40) no grupo 2 e 6,7 % (2/30) no grupo 3.

Na FIGURA 4, quando se testou o clone Seq. ID N2 4 observou-se que 95,5% (21/22) das amostras foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, 15 27,8% (5/18) para NC ativa, 10% (4/40) no grupo 2 e 6,7 % (2/30) no grupo 3.

Na FIGURA 5, com o clone Seq. ID N2 5 , foi observada uma positividade de 100% (22/22) das amostras foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, 27,8% (5/18) para NC ativa, 12,5% (5/40) no grupo 2 e 10 % (3/30) no grupo 3.

A FIGURA 6 mostra a positividade para o clone Seq. ID N- 6, no grupo 1, 100% (22/22) das amostras foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, 22,2 % (4/18) para NC ativa, 10% (4/40) no grupo 2 e 10 % (3/30) no grupo 3.

Na FIGURA 7, a positividade para o clone Seq. ID N2 7, no grupo 1 foi 100% (22/22) das amostras foram positivas para o grupo 1 com NC inativa, 11,1% (2/18) para NC ativa, 5% (2/40) no grupo 2 e 6,7 % (2/30) no grupo 3.

Os resultados demonstraram que os peptídeos foram específicos para o alvo utilizado na seleção. A maioria dos clones apresentou reatividade, embora com perfis diferenciados entre os fagos. Pela metodologia foi possível confirmar a especificidade da seleção em função da maioria dos clones apresentarem positividade no grupo 1 (índice de reatividade-IR maior que 1), com potencial para detecção de NC inativa, podendo-se considerar esses peptídeos apresentados pelos respectivos fagos com marcadores de fase inativa da NC. Em consideração a todos os dados apresentados, os resultados sugerem que os fagotopos são ferramentas úteis no diagnóstico de diferenciação de fases da NC. A distinção entre NC ativa e inativa é importante, principalmente tratando-se da escolha de tratamento dos pacientes, porque é consenso que o tratamento da NC deve ser individualizado em relação à quantidade e localização das lesões, e ao estágio evolutivo do parasito, além disso, o teste também pode ser utilizado no acompanhamento do curso da infecção. A utilização desses fagotopos possibilita um avanço no sorodiagnóstico para diferenciação de fases da NC, sendo que essa diferenciação de fase ativa e inativa da NC é feita através de exames de neuroimagem, no entanto esses exames são caros e inacessíveis na maioria das áreas onde a NC é endêmica. A utilização dos fagotopos selecionados no ELISA para distinção das fases da NC é um teste diagnóstico economicamente viável em relação aos métodos de neuroimagem.

Em ensaios de competição, as proteínas presentes no extrato total de metacestódeos de T. soliumem diferentes concentrações, inibiram a ligação das IgG aos clones de adsorvidos em placas de poliestireno nos testes ELISA. Os dados demonstraram que quantidades crescentes de proteína do parasito adicionadas ao soro interferem com a ligação das IgG no momento do reconhecimento dos fagos na placa. O controle negativo utilizado foi vetor sem inserto, representado pelo fago selvagem M13KE e o controle positivo, foi demonstrado pela adição do pool de soros de pacientes com NC sem adição 5 do antígeno. Estes dados indicam que os peptídeos expressos nos fagos podem ser reconhecidos especificamente pelas IgG presentes no soro de pacientes com NC e estes peptídeos apresentam capacidade de mimetizar os epítopos presentes nas proteínas totais de metacestódeos de T. solium.Desta forma, foi possível demonstrar a inibição da reatividade por ensaios de io competição para os clones obtidos.

Vários autores testaram diferentes antígenos, purificados ou recombinantes, com diferentes índices de sensibilidade e especificidade. Os fagos testados neste trabalho obtiveram sensibilidade e especificidade semelhantes ou superiores àqueles demonstrados por outros autores.

A TABELA 5 mostra a reatividade das amostras de soro de pacientes do Grupo 2 utilizando os clones de fagos selecionados.

Nenhum dos clones reagiu com amostras de soro de pacientes infectados com E. granulosus,o que demonstra um grande avanço, uma vez que a reatividade cruzada com amostras de soro de pacientes infectados com este parasito são frequentemente relatadas.

O estudo dos indivíduos do Grupo 2 é importante na análise dos dados porque representa a realidade da população, especialmente em nosso país onde as doenças parasitárias são altamente prevalentes. A reatividade cruzada pode estar relacionada à infecções concomitantes ou a presença de anticorpos remanescentes de infecções prévias.

Para melhor compreensão dos exemplos utilizados, segue abaixo uma descrição detalhada dos procedimentos experimentais adotados.

Na obtenção de peptídeos ligantes a IgG presentes no soro de pacientes com NC foram utilizadas 110 amostras de soro divididas em 3 grupos. Foram obtidas 40 amostras de soro de pacientes com diagnóstico confirmado de NC por meio de história clínica, dados epidemiológicos do paciente, TC e positividade no ELISA para cisticercose (DEL BRUTTO et al. Proposal of diagnostic criteria for human cysticercosis and neurocysticercosis. Journal of the Neurological Sciences 142:1-6, 1996), constituindo o Grupo 1. Para tanto, todos os pacientes selecionados tiveram analisados os prontuários médicos, e somente aqueles com laudo técnico de exame de neuroimagem foram incluídos no trabalho, sendo este dado utilizado na classificação de cada paciente. Deste grupo, dezoito (45%) foram classificados com NC ativa e vinte e dois (55%) com NC inativa. Para verificar a reatividade cruzada em métodos sorológicos, foram obtidas 40 amostras de soro de pacientes com outras parasitoses (Grupo 2), entre elas: Ancilostomídeos (5), Ascarís lumbrícoides (5), hidatidose por Echinococcus granulosus(3), Enterobius vermicularís (5), Hymenolepis nana (4), Schistosoma mansoni (3), Strongyloides stercoralis(5), pacientes com teníase por Taeniasp. (5) e Tríchuris trichiura (5). Embora, esses pacientes fossem provenientes de área endêmica para cisticercose, eles não apresentavam história prévia de cisticercose. O Grupo 3 constitui-se de 30 amostras de soro de indivíduos saudáveis, que em três exames parasitológicos de fezes (BAERMANN S. Eine Einfache Methode zur Auffindung Von Ankylostomum (Nematoden) - Larven in Erdproden. Mededeel mit. h. Geneesk. Lab Weltevredem Feestbundel, Batavia, 41-47, 1917; HOFFMANN WA, PONS JA, JANER JL. The sedimentation concentration method in schistosomiasis mansoni, Puerto Rico. Journal of Public Health Tropical Medicine 9:283-291, 1934) foram negativos para parasitos intestinais, negaram história anterior de teníase-cisticercose e foram negativos em exames sorológicos para cisticercose.

Para obtenção de IgY anti-metacestódeo de T. soliumforam imunizados quatro animais da raça White-Leghorn de três semanas de idade (BARBAS C et al. Phage display: a laboratory manual. Plain view, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). Três aplicações intramusculares do extrato total de metacestódeos de T. solium (Costa, JM. Teste imunoenzimático (ELISA) no diagnóstico da neurocisticercose. Estudo de diferentes extratos antigênicos na detecção de anticorpos IgG em amostras de soro e líquido cefalorraqueano. Arquivos de Neuro-Psiquiatria 44:15-31, 1986) emulsionado em adjuvante foram realizadas, sendo que na primeira imunização a quantidade de proteína foi de 200 pg, e as demais de 100 pg, com intervalos de 15 dias entre cada uma das imunizações. Na primeira dose foi usado adjuvante completo de Freund (Sigma Chemical Co, USA) e nas doses subseqüentes o adjuvante incompleto de Freund (Sigma), sendo que em ambas correspondiam a 50% do volume total da solução. Além do adjuvante, também foi acrescido solução de tampão fosfato (PBS, NaCI 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4 12 mM, KH2PO4 1,2 mM, pH 7.4) para tamponar a solução. Foram imunizadas duas galinhas e duas foram mantidas como controle, imunizadas somente com adjuvante e PBS. No sétimo dia pós-imunização (dpi) foi feita coleta de sangue dos animais, e o título de anticorpos específicos foi monitorado por testes ELISA. Após 14 dpi foi realizada uma nova imunização até a obtenção do título ideal de anticorpos. Após 3 meses coletou-se o sangue total dos animais.

No ELISA foram utilizados os seguintes parâmetros. A placa de microtitulação de poliestireno foi sensibilizada com 1 pg/mL de extrato salino de

T. soliumdiluído em tampão carbonato-bicarbonato (0,06 M pH 9,6) e incubadas por 18 horas a 4o C. Em seguida, os poços foram bloqueados com PBS acrescido de 0,05% de Tween 20 (PBS-T) e adicionado ainda 5% de leite em pó desnatado (PBS-TM), durante 30 min a 37° C. Após três ciclos de 5 min de lavagem com PBS-T, as amostras de soro das galinhas pré e pós imunizações diluídas seriadamente (na razão de 2) de 1:500 até 1:200.000 em PBS-TM foram incubadas por 45 minutos a 37°C, sendo que as amostras dos animais pré imunização e dos animais controle constituíram os controles negativos. Após novas lavagens com PBS-T, adicionou-se o anticorpo secundário anti-lgY marcado com peroxidase na diluição de 1:5000 em PBS- TM (50 mL/poço) para a reação com soro. Repetiu-se o processo de lavagem, e foi feita a adição da solução cromógena de ortofenilenodiamina (OPD) com H2O2 para revelação. A reação foi interrompida com a adição da solução de H2SO4 2N. Os valores de absorbância foram determinados em filtro de 492 nm em leitor ELISA (Tp Reader, Thermoplate, China).

A purificação da IgY foi realizada com 0 uso da coluna HiTrap IgY Purification HP, 5 mL (Amersham Biosciences, USA). Foi utilizado um sistema completo de cromatografia liquida modelo Akta Purifier (Amersham Bioscience), de acordo com as instruções dos fabricantes. Em seguida foi realizada a dosagem protéica (LOWRY VH et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry, 193:265-275, 1951) e realizado novo ensaio de ELISA como descrito anteriormente para verificar a especificidade dos anticorpos obtidos.

Para a seleção dos peptídeos (expressos na proteína III do capsídeo de fagos filamentosos), reativos com os anticorpos acima descritos, utilizou-se uma biblioteca randômica de peptídeos de 12 aminoácidos (Ph.D. 12 mer, New England Biolabs, USA). Esta biblioteca consiste de aproximadamente 2,8 x 1011 clones independentes, os quais representam 1,9 x 109 possíveis combinações de resíduos de aminoácidos. Foi adsorvido no poço de uma placa de microtitulação de 96 poços (Maxisorp, NUNC, USA) 150 pL de IgY purificada (100 pg/mL em NaHCO3 0,1 M, pH 8,6) e incubada overnight a 4o C. A placa foi bloqueada com 150 pL de tampão de bloqueio (NaHCOs 0,1 M, pH 8,6, 5 mg/mL BSA) por 1h sob agitação a 4o C, e lavada seis vezes com solução tamponada de tris (TBS, Tris-HCI 50 mM pH 7,5, NaCI 150 mM) acrescido 0,1% Tween 20 (TBS-T1%). Foi realizada uma seleção negativa, na qual os fagos foram colocados inicialmente em poço contendo IgY purificada do soro obtido de uma galinha sem nenhum processo de imunização (pré imune), os fagos não ligantes foram passados para o poço adsorvido com IgY do soro do animal controle imunizado com PBS, durante 1h sob agitação a temperatura ambiente em cada poço. Posteriormente os fagos não ligantes durante a seleção negativa foram incubados no poço com IgY purificada dos soros dos animais imunizados com extrato salino total de metacestódeos de Taenia solium,e após 1h os fagos ligantes foram eluídos com 200 pg de extrato total de metacestódeos de T. solium.

Uma pequena amostra deste eluato (10 pL) foi titulada e o restante foi utilizado para reamplificação, realizada em 20 mL de cultura de Escherichia coli (ER2537) em fase inicial de crescimento (OD600=0,3), contendo tetraciclina, incubando-se a cultura por 4-5 horas em agitador com temperatura a 37° C, antes do procedimento de precipitação dos fagos e posterior titulação. A cultura foi transferida para um tubo Oakridge (Hitachi, 50 mL) e centrifugada (10 min, 10.000 rpm). As células residuais foram descartadas e o sobrenadante transferido para outro tubo e re-centrifugado. Foi pipetado 80% do sobrenadante para um tubo esterilizado onde foi adicionado 1/6 do volume de PEG/NaCI (20% peso/volume de Polietileno glicol-8000, NaCI 2,5M, água), e a mistura permaneceu em repouso por 12 horas a 4o C.

Em seguida foi realizado um novo passo de centrifugação por 15 minutos a 10.000 rpm à 4o C. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi centrifugado brevemente, para que o sobrenadante residual pudesse ser removido. O precipitado foi ressuspendido em 1 mL de TBS, transferido para um microtubo e centrifugado por 5 minutos, 10.000 rpm à 4o C para precipitar os resíduos celulares. O sobrenadante foi transferido para um novo microtubo para a adição de PEG/NaCI (1/6 do volume). A mistura foi incubada em gelo por 1 hora e então centrifugada (10 min, 14.000 rpm, 4o C). O sobrenadante foi descartado, e a centrifugação foi repetida para remoção de sobrenadante residual. O precipitado foi ressuspendido em 200 pL de TBS, obtendo-se então o eluato amplificado, pronto para a titulação. Os fagos reamplificados a partir do primeiro ciclo de seleção foram utilizados em um segundo ciclo e assim subsequentemente, por um total de três ciclos, sendo que no último ciclo a estringência do tampão de lavagem foi aumentada de 0,1% para 0,5% de Tween-20 em todas as lavagens e foram sensibilizados dois poços com soros dos animais pré-imunização e dos animais controles.

Para todas as titulações foram utilizados 1 pL dos fagos, diluídos em 9 pL de meio de cultura LB. As diluições (101 a 107) foram incubadas com 200 pL de E. coli (ER2738) em fase de crescimento inicial por 5 minutos e plaqueadas em meio LB contendo IPTG (0,5 mM) e X-gal (40 pg/mL), juntamente com 3 mL de Agarose Top (10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCI, 1 g de MgCI2. 6H2O/litro). O vetor de fago utilizado contém o gene lacZ, permitindo que clones reativos fossem selecionados pela coloração das colônias (azuis positivas ou brancas negativas). O resultado se expressa por P.F.U. (unidades formadoras de placa). Após a incubação em estufa por toda a noite à 37° C, as colônias azuis foram contadas para a obtenção dos títulos de saída para todos os ciclos de seleção (número de colônias azuis x fator de diluição).

Ao final do 3o ciclo de seleção de fagos, foi obtido o DNA dos bacteriófagos filamentosos de fita simples. Quarenta e oito clones, devidamente identificados foram utilizados para os processos de caracterização descritos abaixo.

Para tanto, cada colônia isolada obtida do 3o ciclo não amplificada foi dispensada separadamente em microtubos contendo 1,0 mL de meio de cultura com E. coli em fase de crescimento inicial e tetraciclina. Os microtubos foram incubados, overnight à 37° C sob agitação. Seguindo-se centrifugação a 10.000 rpm por 30 segundos a 4o C, para a retirada do sobrenadante da cultura. O sobrenadante foi transferido outro microtubo e recentrifugado. Passou-se o sobrenadante para outro tubo e então foi adicionado 1/6 do volume de PEG/NaCI, e incubando por 10 min à temperatura ambiente. Os tubos foram centrifugados por 10 min a 14.000 rpm a 4o C, o sobrenadante foi descartado, e o precipitado suspenso em 100 pl de tampão iodeto para dissolução do pellet e então adicionado 250pl de etanol 100% e deixado em repouso por 10 min a temperatura ambiente. Em seguida, foi realizada centrifugação por 10 min a 14.000 rpm a 4o C. O pellet foi lavado com etanol 70% (14.000 rpm/10 min/4° C). O sobrenadante foi descartado, os tubos foram deixados secar em papel filtro, e por fim ressuspendidos em 20 pl de H2O mili-Q. Para confirmar a extração do DNA foi feito gel de agarose 1,5%.

O seqüenciamento foi realizado utilizando o kit DYEnamicTM ET dye termination (GE Healthcare, USA) e seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences). Para a reação do seqüenciamento, foi utilizado o primer M13 (5'-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG -3', Invitrogen, USA) que amplifica a região do DNA do fago correspondente aos insertos dos aminoácidos codificantes dos peptídeos randômicos fusionados na proteína Plll. Foram utilizados em cada poço da placa para reação de seqüenciamento 500 ng de DNA molde (DNA de cada fago por poço), 5 pmol do primer e Premix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit, Amersham Biosciences). Para a realização da reação de 35 ciclos foi utilizado um termociclador de placas (MasterCycler, Eppendorf, Brasil) nas seguintes condições: desnaturação (a 95° C por 20 segundos); anelamento do primer (a 58° C por 15 segundos) e extensão (a 60° C por um minuto).

A análise das seqüências de DNA provenientes do seqüenciador automático foi processada em software do próprio equipamento (Sequence Analyser, Base Caller, Cimarron 3.12, Phred 15). Logo após esta pré-análise, as seqüências dos vetores foram selecionadas, e somente os insertos com resíduos perfeitos foram traduzidos.

Os dados das seqüências de DNA geradas pelo seqüenciamento foram analisados utilizando-se programas de bioinformática disponíveis on-line.

Para a tradução das seqüências de aminoácidos utilizou-se o programa

DNA2PRO12, específico para seqüências de bibliotecas da New England Biolabs (http://relic.bio.anl.gov/dna2pro12.aspx). Para o cálculo da freqüência de cada aminoácido presente nos peptídeos seqüenciados e a diversidade dos mesmos, foi utilizado o programa AAFREQ (http://relic.bio.anl. gov/aafreqs3.aspx).

Para calcular a diversidade e a derivação padrão dos aminoácidos em cada posição nos peptídeos utilizou-se o programa DIVAA (http://relic.bio.anl.gov/divaa.aspx). Foi utilizado o programa MOTIF2 (http://relic.bio.anl.gov/motif2.aspx) para a identificação de motivos de três aminoácidos dentro a população de peptídeos que foi selecionada contra IgGs de pacientes com NC.

Os motivos protéicos consenso gerados foram analisados quanto a homologias com proteínas de Taeniasp depositadas no GENEBANK pelo programa BLAST - Basic Local Alignment Search Tool (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Para encontrar um ponto máximo de similaridade entre toda a população de peptídeo selecionada e uma proteína de interesse envolvida com NC ou com parasito do gênero Taeniaem especial T soliume T. saginata ou uma proteína encontrada no BLAST por homologia, utilizou-se o programa MATCH disponível em http://relic.bio.anl.gov/match.aspx.

Para a realização dos testes ELISA os clones considerados mais relevantes, após análise por bioinformática, devido à presença repetida de domínios consenso na população de fagos, foram utilizados.

O procedimento seguiu em linhas gerais, os mesmos parâmetros mencionados para os ensaios anteriores, portanto os clones foram re- amplificados e precipitados com PEG-NaCI, tendo como controle negativo em cada placa o fago helper (M13).

Para realização do teste ELISA com os clones selecionados, primeiramente as placas foram sensibilizadas com 1x1010 fagos diluídos em tampão carbonato-bicarbonato, durante 18h a 4°C. Em seguida, as placas foram manualmente lavadas com auxílio de micropipeta automática por seis vezes com PBS-T 0,05%, e adicionado 300 pl de solução de bloqueio PBS-TM, durante 1h a 37°C. Após novas lavadas, foi colocado na placa 100 pl de soro, dos pacientes do grupo 1, 2 e 3, diluído 1:200 em PBS-TM e incubados durante 1h a 37°C. As placas foram novamente lavadas, e 100 pl do conjugado anti-lgG marcado com peroxidase diluído 1:2000 em PBS-TM foi adicionado durante 1h a 37°C. Após lavar as placas, a reação foi revelada pela adição de 100 |il de OPD adicionado H2O2, durante 10 min. A reação foi interrompida utilizando 25pl de H2SO4 2N. A leitura da densidade óptica (DO) de cada fago foi realizada em leitor de ELISA (Tp Reader, Thermoplate) no comprimento de onda de 492 nm.

Todos os clones foram testados em duplicata e para controle negativo foi testada a reação do soro contra 0 fago Helper. O cut-off foi calculado da seguinte forma: [(média das DOs do soro com fago Helper) + 3 x Desvio Padrão], em seguida foi determinado o índice de Reatividade (IR) de cada fago utilizando a seguinte equação: (média de DO de cada clone)/cut-off. Foram considerados positivos aqueles soros com RI maior do que 1.

Experimentos de inibição foram realizados da mesma forma que 0 teste ELISA, exceto pela adição de um passo de pré-incubação do soro com proteínas presentes no extrato total de metacestódeos de T. solium previamente á sua incubação na placa, logo após 0 bloqueio. Concentrações variadas de proteínas totais foram adicionadas na ordem de 0 a 200 pg.

A sensibilidade, especificidade e eficiência do diagnóstico (ED) foram determinados (MINED JR et al. Pesquisa na área biomédica: do planejamento à publicação. Uberlândia: EDUFU: Editora da Universidade Federal de Uberlândia, 2005. 273p.).

Diferenças entre a sensibilidade no diagnóstico da NC foram calculadas pelo teste Binomial (Biostat 5.0). A análise entre os grupos 1, 2 e 3 de cada clone foi feita com o teste T, ou seu teste não paramétrico correspondente Mann-Whitney (GraphPad Prism 4.0). Os valores de probabilidade (P) menores do que 0,05 foram considerados como significantes.

Todo 0 procedimento de colheita, manuseio do material biológico e dos reagentes, e a utilização dos equipamentos foram realizados de acordo com as normas de biossegurança (CHAVES-BORGES FA, MINEO JR. Medidas de biossegurança em laboratórios. Uberlândia: Universidade Federal de Uberlândia, 1997). Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa 5 de Seres Humanos (CEP) (234/2007) e pela Comissão de Ética em Pesquisa na Utilização de Animais (CEUA) (001/2008) da Universidade Federal de Uberlândia.

Claims (5)

1- PEPTÍDEOS MARCADORES DAS FASES CLÍNICAS DA NEUROCISTICERCOSE, caracterizadas por compreender as sequências Seq ID N- 1 a Seq IDN27.

2- PEPTÍDEOS RECOMBINANTES LIGANTES Á COMPONENTES E/OU MOLÉCULAS ENVOLVIDAS DIRETA OU INDIRETAMENTE NA RESPOSTA IMUNE À CISTICERCOSE, caracterizadas por compreender as sequências Seq ID N2 1 a Seq ID N2 7.

3- PEPTÍDEOS RECOMBINANTES MIMÉTICOS DE ANTÍGENOS io ENVOLVIDOS NA CISTICERCOSE, caracterizadas por compreender as sequências Seq ID N2 1 a Seq ID N2 7.

4- PEPTÍDEOS de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3, caracterizados como moléculas ligantes aos anticorpos circulantes detectados por ensaios imunoenzimáticos enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), ou de qualquer outra forma de detecção relacionada direta ou indiretamente em amostras de fluídos corporais, preferencialmente soro.

5- PEPTÍDEOS de acordo com a reivindicação 4 caracterizados por serem usados em processos de imunodiagnóstico para detectar in vitro, pelo teste ELISA, a presença de moléculas ligantes, como os anticorpos circulantes, que reajam contra componentes ou moléculas envolvidas direta ou indiretamente em doença tal como a cisticercose, preferencialmente neurocisticercose.

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