BR102015031861B1 - Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso - Google Patents
Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso Download PDFInfo
- Publication number
- BR102015031861B1 BR102015031861B1 BR102015031861-8A BR102015031861A BR102015031861B1 BR 102015031861 B1 BR102015031861 B1 BR 102015031861B1 BR 102015031861 A BR102015031861 A BR 102015031861A BR 102015031861 B1 BR102015031861 B1 BR 102015031861B1
- Authority
- BR
- Brazil
- Prior art keywords
- cutaneous leishmaniasis
- human cutaneous
- leishmaniasis
- diagnosing human
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 63
- 206010011668 Cutaneous leishmaniasis Diseases 0.000 title claims abstract description 62
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 40
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 title claims abstract description 38
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title abstract description 57
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims abstract description 30
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 22
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 21
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 21
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 21
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 15
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 12
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 8
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 6
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 claims description 3
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 claims description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 3
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 claims description 3
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 claims description 3
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims description 3
- 108010093894 Xanthine oxidase Proteins 0.000 claims description 3
- 102100033220 Xanthine oxidase Human genes 0.000 claims description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 3
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 claims description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims description 3
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 3
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 claims description 3
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 claims description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 230000002514 anti-leishmanial effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 claims description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 claims description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 28
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 28
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 20
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 20
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 20
- 201000000626 mucocutaneous leishmaniasis Diseases 0.000 description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 17
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 17
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 16
- 206010047505 Visceral leishmaniasis Diseases 0.000 description 16
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 15
- 241000222722 Leishmania <genus> Species 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 10
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 10
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 10
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000222740 Leishmania braziliensis Species 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 7
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 6
- 208000032791 BCR-ABL1 positive chronic myelogenous leukemia Diseases 0.000 description 5
- 208000010833 Chronic myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 206010001935 American trypanosomiasis Diseases 0.000 description 4
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 4
- 208000024699 Chagas disease Diseases 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000223109 Trypanosoma cruzi Species 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 4
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 241000222724 Leishmania amazonensis Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-[tert-butyl(dimethyl)silyl]oxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O[Si](C)(C)C(C)(C)C)C1 QAPSNMNOIOSXSQ-YNEHKIRRSA-N 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 2
- 108091006027 G proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 2
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 2
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000497386 Silveira Species 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N Triethanolamine Chemical compound OCCN(CCO)CCO GSEJCLTVZPLZKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001522283 Viannia Species 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 2
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 2
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 1
- 208000031504 Asymptomatic Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 201000000077 Cysticercosis Diseases 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002738 Giemsa staining Methods 0.000 description 1
- 206010018691 Granuloma Diseases 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 241000222712 Kinetoplastida Species 0.000 description 1
- 241000222697 Leishmania infantum Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 208000031705 Neglected disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031662 Noncommunicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241001345477 Nyssomyia flaviscutellata Species 0.000 description 1
- 206010033767 Paracoccidioides infections Diseases 0.000 description 1
- 201000000301 Paracoccidioidomycosis Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255129 Phlebotominae Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 206010041736 Sporotrichosis Diseases 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 description 1
- 241000222714 Trypanosomatidae Species 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000000498 diffuse cutaneous leishmaniasis Diseases 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000011841 epidemiological investigation Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000006054 immunological memory Effects 0.000 description 1
- 230000002134 immunopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000126 in silico method Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009854 mucosal lesion Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000003108 parasitologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000011240 pooled analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 244000000040 protozoan parasite Species 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 201000004409 schistosomiasis Diseases 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000013517 stratification Methods 0.000 description 1
- 210000001768 subcellular fraction Anatomy 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 208000004441 taeniasis Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 1
- 230000009278 visceral effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/002—Protozoa antigens
- A61K39/008—Leishmania antigens
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
PEPTÍDEOS SINTÉTICOS, MÉTODO E KIT PARA DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE CUTÂNEA HUMANA, E USO. A presente tecnologia trata de 6 (seis) peptídeos sintéticos altamente específicos e reativos com amostras de pacientes com leishmaniose cutânea humana, além de um método e um kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea sintomática e assintomática, que utilizam como antígenos os 6 peptídeos sintéticos, isolados ou associados, ou os clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.
Description
[001] A presente tecnologia trata de 6 (seis) peptídeos sintéticos altamente específicos e reativos com amostras de pacientes com leishmaniose cutânea humana, além de um método e um kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea sintomática e assintomática, que utilizam como antígenos os 6 peptídeos sintéticos, isolados ou associados, ou os clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.
[002] As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por parasitos protozoários do gênero Leishmania, pertencentes à família Trypanosomatidae e ordem Kinetoplastida. A doença é encontrada em 98 países no mundo e estima-se que 12 milhões de pessoas estejam clinicamente afetadas, com uma incidência anual 700.000 a 1.200.000 casos de leishmaniose tegumentar (LT) (DESJEUX, P. The increase in risk factors for leishmaniasis worldwide. Trans R Soc Trop Med Hyg, v. 95, n. 3, p. 239-43, May-Jun 2001a. ISSN 0035-9203. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microbiol Infect Dis, v. 27, n. 5, p. 305-18, 2004. ALVAR, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One, v. 7, n. 5, p. e35671, 2012). Cerca de urn terço dos casos de LT ocorrem nas Américas, Mediterrâneo e Ásia Ocidental. Os países com maior número de casos da doença são: Afeganistão, Argélia, Colômbia, Brasil, Irã, Síria, Etiópia, Sudão do Norte, Costa Rica e Peru; que em conjunto representam entre 70 e 75% da incidência global de LT (ALVAR, J. et al. Leishmaniasis worldwide and global estimates of its incidence. PLoS One, v. 7, n. 5, p. e35671,2012).
[003] Atualmente, 20 espécies de Leishmania são encontradas nas Américas, das quais 14 estão associadas à L.T. No Brasil, seis espécies foram identificadas como agentes etiológicos da doença, das quais cinco pertencem ao subgênero Viannia: Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (V.) guyanensis, Leishmania (V.) lainsoni, Leishmania (V.) shawi e Leishmania (V.) lindenbergi (LAINSON, R.; SHAW, J. J. Evolution, classification and geographical distribution. Academic Press: London, p. 1-120, 1987; SILVEIRA, F. T. et al. An outbreak of cutaneous leishmaniasis among soldiers in Belem, Para State, Brazil, caused by Leishmania (Viannia) lindenbergi n. sp. A new leishmanial parasite of man in the Amazon region. Parasite, v. 9, n. 1, p. 43-50, 2002). A sexta espécie pertence ao subgênero Leishmania, Leishmania (Leishmania) amazonensis (SHAW, J. J.; LAINSON, R. Leishmaniasis in Brazil. VI. Observations on the seasonal variations of Lutzomyia flaviscutellata in different types of forest and its relationship to enzootic rodent leishmaniasis (Leishmania mexicana amazonensis). Trans R Soc Trop Med Hyg. v. 66, n. 5, p. 709-17, 1972). As espécies L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis são as mais patogênicas ao homem (SILVEIRA, F. T.; LAINSON, R.; CORBETT, C. E. Clinical and immunopathological spectrum of American cutaneous leishmaniasis with special reference to the disease in Amazonian Brazil: a review. Mem Inst Oswaldo Cruz, v. 99, n. 3, p. 239-51,2004).
[004] Na apresentação clínica da LT, a doença pode se manifestar sobre três formas clínicas principais: leishmaniose cutânea (LC), forma mais comum e incidente da doença; leishmaniose muco-cutânea ou mucosa (LMC) e a leishmaniose cutâneo-difusa (LCD) (WHO. Leishmaniasis. Fact sheet, v. 375, Jan 2014). A LC é caracterizada pela presença de uma lesão cutânea primária que se desenvolve no local da picada do flebotomíneo, sendo única ou podendo originar várias outras lesões. A doença tende a evoluir à cura espontânea. Porém, há casos em que a lesão pode permanecer ativa por vários anos e coexistir com lesões mucosas que podem surgir posteriormente (GONTIJO, B.; DE CARVALHO MDE, L. [American cutaneous leishmaniasis]. Rev Soc Bras Med Trop, v. 36, n. 1, p. 71-80, 2003). A doença pode se apresentar sob as seguintes formas clínicas: (1) cutâneo-localizada, responsável por cerca de 85% dos casos, com tendência à cicatrização espontânea e com boa resposta à terapêutica; e (2) cutâneo- disseminada, caracterizada pelo aparecimento de lesões papulares múltiplas que acometem diversas partes do corpo.
[005] A espécie L. braziliensis é o principal agente etiológico da LC na América do Sul (MARSDEN, P. D. Mucosal leishmaniasis ("espundia" Escomel, 1911). Trans R Soc Trop Med Hyg, v. 80, n. 6, p. 859-76, 1986. ISSN 0035-9203 (Print). Mucosal leishmaniasis due to Leishmania (Viannia) braziliensis in Tres Bracos, Bahia-Brazil. Rev Soc Bras Med Trop, v. 27, n. 2, p. 93-101, 1994). O diagnóstico definitivo das leishmanioses baseia-se na avaliação clínica das manifestações da doença em conjunto com inquéritos epidemiológicos e com a detecção dos estágios intracelulares do parasito, por meio de exame de esfregaços ou biópsias de lesões da pele e cultura de espécimes, além de outros exames laboratoriais.
[006] O diagnóstico precoce é fundamental para evitar danos permanentes e graves sequelas funcionais. Porém, para o diagnóstico clínico, a sintomatologia da LT é semelhante à de outras doenças infecciosas, tais como tuberculose, paracoccidioidomicose e hanseníase. Doenças não-infecciosas, como granuloma e neoplasias, podem também causar lesões que se assemelham às úlceras causadas pelo parasita Leishmania (JUNQUEIRA-PEDRAS, M. et al. Antibody subclass profile against Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis in the diagnosis and follow-up of mucosal leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 47, n. 3, p. 477-85, 2003).
[007] A detecção do agente causador de toda doença infecciosa é um passo determinante para o manejo clínico e/ou monitoramento epidemiológico da doença. As leishmanioses representam um desafio para o diagnóstico clínico e laboratorial e um motivo de preocupação de saúde pública mundial, pois o número de casos de falha terapêutica ao tratamento convencional tem aumentado nos últimos anos (ALVAR, J.; CROFT, S.; OLLIARO, P. Chemotherapy in the treatment and control of leishmaniasis. Adv Parasitol, v. 61, p. 223-74, 2006).
[008] Os métodos de diagnóstico direto, que demonstram a presença do parasito no indivíduo doente, são considerados ideais para o diagnóstico das leishmanioses. Entretanto, a prática apresenta limitações, que podem ser compensadas por métodos indiretos baseados na resposta imunológica dos hospedeiros infectados (KAR, K. Serodiagnosis of leishmaniasis. Crit Rev Microbiol, v. 21, n. 2, p. 123-52, 1995). A observação das formas evolutivas de diferentes espécies do parasito é essencial para demonstrar a origem da doença e é considerada o padrão-ouro para seu diagnóstico. Amostras obtidas de biópsias das lesões de LT são normalmente empregadas para a confecção de lâminas de esfregaço e/ou para impressão em lâminas. A técnica de coloração utilizada para a identificação das formas amastigotas dos parasites é a coloração por Giemsa. Entretanto, na LT, a sensibilidade na observação dos esfregaços depende da forma clínica da doença, da idade e do sexo do paciente, do tempo de existência da lesão, da espécie do parasito, além da distribuição do mesmo na lesão, que pode não ser homogênea (BOGGILD, A. K. et al. Clinical and demographic stratification of test performance: a pooled analysis of five laboratory diagnostic methods for American cutaneous leishmaniasis. Am J Trop Med Hyg, v. 83, n. 2, p. 345-50, 2010). Dessa forma, os métodos parasitológicos, apesar de apresentarem especificidade elevada, possuem limitações em sua sensibilidade, pela distribuição não homogênea dos parasitos na lesão, além da coleta das amostras ser considerada invasiva. Além disso, esses métodos consomem um grande tempo para a confecção das lâminas, fato que também dificulta sua utilização na prática médica rotineira (WEIGLE, K. A. et al. Diagnosis of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis in Colombia: a comparison of seven methods. Am J Trop Med Hyg, v. 36, n. 3, p. 489-96, 1987).
[009] Em relação ao diagnóstico imunológico da LT, o teste de Intradermoreação de Montenegro (IDRM) se baseia na resposta celular devido à memória imunológica de células T que são ativadas quando um indivíduo foi ou se encontra infectado por Leishmania spp. O IDRM foi o primeiro método de diagnóstico que necessitava de um produto preparado em laboratório para comprovar o diagnóstico clínico da LT. Seu uso é amplo em várias áreas endêmicas do mundo. Entretanto, não existe uma padronização na preparação do antígeno usado, com a utilização de diferentes espécies e inóculos de Leishmania spp., além de diferentes concentrações de conservantes, como o fenol e o timerosol (WEIGLE, K. A. et al. Leishmania skin test standardization and evaluation of safety, dose, storage, longevity of reaction and sensitization. Am J Trop Med Hyg, v. 44, n. 3, p. 260-71, 1991). Além disso, essa técnica apresenta limitações, como a complexidade e fraca estabilidade de seus componentes, além de poder ser interpretada como positiva em indivíduos assintomáticos ou naqueles não infectados, mas que residem em áreas endêmicas e de elevada transmissão da LT. Indivíduos alérgicos aos componentes do kit ou aqueles com doenças que causam reação cruzada, como doença de Chagas, esporotricose, hanseníase, tuberculose, entre outras, podem também ter seus resultados falseados positiva ou negativamente. Também, o teste pode ser interpretado como negativo nos indivíduos fraco-reativos, naqueles precocemente tratados e em pacientes com LCD (BERN, C. et al. Loss of leishmanin skin test antigen sensitivity and potency in a longitudinal study of visceral leishmaniasis in Bangladesh. Am J Trop Med Hyg, v. 75, n. 4, p. 744-8, 2006).
[010] O diagnóstico laboratorial baseando-se na presença de anticorpos específicos por parte do hospedeiro infectado constitui-se em uma alternativa, com a sensibilidade variando em torno de 62% a 100% dos casos, dependendo da preparação antigênica utilizada. Uma das desvantagens de testes de sorodiagnóstico tem sido baseada na baixa especificidade dos mesmos, causada pelos baixos títulos de anticorpos específicos e pela reatividade cruzada com antígenos presentes em agentes infecciosos causando outras doenças relacionadas (GUIMARAES, M. C.; CELESTE, B. J.; FRANCO, E. L. Evaluation of dot enzyme-linked immunosorbent assay for mucocutaneous leishmaniasis and comparison with microplate enzyme immunoassay. J Clin Microbiol, v. 24, n. 3, p. 364-7, 1986. VALLI, L. C. et al. Humoral immune responses among mucosal and cutaneous leishmaniasis patients caused by Leishmania braziliensis. J Parasitol, v. 85, n. 6, p. 1076-83, 1999).
[011] A resposta humoral na LT é de intensidade baixa a moderada, quando comparada com a resposta imune observada em pacientes com leishmaniose visceral (LV). O teste de imunofluorescência indireta (IFAT), apesar de algumas limitações, possui uma sensibilidade superior a 80%. Os títulos da IFAT são influenciados pela espécie do parasito, pelo tipo de lesão e pelo tempo de ocorrência da mesma. O uso do IFAT para o diagnóstico apresenta melhor desempenho em relação ao de IDRM, pois as infecções antigas têm menor influência em seu desempenho, apresentando melhores valores preditivos positivos e negativos (PASSOS, V. M. et al. American cutaneous leishmaniasis: use of a skin test as a predictor of relapse after treatment. Bull World HeaLT Organ, v. 78, n. 8, p. 968-74, 2000. BRITO, M. E. et al. Dynamics of the antibody response in patients with therapeutic or spontaneous cure of American cutaneous leishmaniasis. Trans R SocTrop Med Hyg, v. 95, n. 2, p. 203-6, 2001).
[012] A técnica de ELISA vem substituindo o IFAT por apresentar melhores valores de sensibilidade e especificidade (GOTO, H.; LINDOSO, J. A. Current diagnosis and treatment of cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Expert Rev Anti Infect Ther, v. 8, n. 4, p. 419-33, 2010). Essa técnica é considerada uma ferramenta importante para o diagnóstico da LT e monitoramento da exposição dos indivíduos em áreas endêmicas da doença. Geralmente, esses testes utilizam antígenos obtidos de frações brutas e/ou moléculas semi-purificadas do parasito, bem como proteínas recombinantes e/ou peptídeos sintéticos derivados dos mesmos. Essa técnica permite o melhoramento da especificidade, com o objetivo de diferenciar os pacientes com LT daqueles com doença de Chagas, malária e outras doenças que apresentam reatividade cruzada (JUNQUEIRA-PEDRAS, M. et al. Antibody subclass profile against Leishmania braziliensis and Leishmania amazonensis in the diagnosis and follow-up of mucosal leishmaniasis. Diagn Microbiol Infect Dis, v. 47, n. 3, p. 477-85, 2003).
[013] Outras razões para que a técnica de ELISA tenha um enorme potencial como método de diagnóstico é a possibilidade de inovações tecnológicas que melhorem sua efetividade. O uso de frações sub-celulares, de novos substratos para detecção e o emprego de proteínas recombinantes tem permitido melhorias na técnica, com vistas ao aumento de sua sensibilidade e especificidade. Atualmente, a proteína recombinante mais importante no diagnóstico da LV é a rk39, que tem sido empregada para o diagnóstico de pacientes e para estudos epidemiológicos com humanos e cães (SUNDAR, S. et al. Comparative evaluation of parasitology and serological tests in the diagnosis of visceral leishmaniasis in India: a phase III diagnostic accuracy study. Trop Med Int HeaLT, v. 12, n. 2, p. 284-9, 2007). No entanto, sua validação para detecção dos casos de infecção por L. infantum tem variado de acordo com a cepa e o cultivo dos parasites, a produção da proteína recombinante e a variabilidade clínica e sorológica dos pacientes, além da variabilidade genética observada entre cepas diferentes da mesma espécie, principalmente quando se avalia cepas isoladas de localizações distantes (Zijlstra EE, Nur Y, Desjeux P, Khalil EA, El-Hassan AM, Groen J. Diagnosing visceral leishmaniasis with the recombinant K39 strip test: experience from the Sudan. Trop Med Int Health. 2001 ;6(2):108-13). Tais problemas têm também sido observados quando a proteína recombinante é usada para diagnóstico da LT (Adams ER, Versteeg I, Leeflang MM. Systematic Review into diagnostics for post-kala-azar dermal leishmaniasis (PKDL). J Trop Med. 2013; 2013: 150746).
[014] Dessa forma, urn teste sorológico ideal para o diagnóstico da LC deve ser baseado no uso de antigenos que sejam reconhecidos por amostras de soros de todos os pacientes infectados, independente da sintomatologia clínica e dos níveis de anticorpos antileishmaniais existentes. Ao mesmo tempo, esses antígenos não podem ser reconhecidos por indivíduos não infectados pelo parasita Leishmania.
[015] A heterogeneidade da resposta humoral observada em pacientes com LC indica que, para um sorodiagnóstico efetivo da doença, uma combinação de antígenos em uma mesma técnica de ELISA poderia ser desejável; quando comparada à utilização de antígenos isolados dos parasitas. Uma combinação de diferentes antígenos com valor diagnóstico também poderia detectar infecções assintomáticas sendo, dessa forma, altamente desejável para o sorodiagnóstico da doença.
[016] O monitoramento da eficácia do tratamento e a prevenção de recidivas à doença são considerados fundamentais para o controle da doença. Apesar dos avanços científicos, a LC constitui um problema de Saúde Pública. Até o presente momento, o diagnóstico da doença é realizado pela associação de parâmetros clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. Particularmente, em relação aos métodos imunológicos de diagnóstico, a falta de um padrão-ouro para a detecção da doença é uma importante limitação para o controle efetivo da mesma. Além disso, resultados falso-negativos podem retardar o início do tratamento, contribuindo, assim, para a manutenção dos reservatórios e, como consequência, mantendo os parasitas no ambiente doméstico.
[017] A tecnologia de phage display é baseada na expressão de peptídeos, proteínas ou fragmentos de anticorpos associados a proteínas presentes na superfície externa de bacteriófagos recombinantes. A sequência de nucleotídeos codificadora dos peptídeos inseridos é geneticamente fundida a uma sequência codificadora de algumas proteínas do bacteriófago, originando um produto híbrido, que é então exposto na superfície externa das partículas virais (Smith G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science, v. 228, p. 1315-1317, 1985). Bibliotecas de bacteriófagos expressando peptídeos exógenos têm sido usadas na identificação de diversos receptores celulares, facilitando a identificação de pequenas moléculas que se ligam com alta afinidade e mimetizam a interação com seus ligantes naturais, bem como na identificação de peptídeos que interagem com anticorpos, sem a necessidade do conhecimento prévio da região antigênica reconhecida pelo anticorpo.
[018] A seleção de moléculas de alta afinidade em relação a um determinado receptor-alvo, aderido a uma superfície sólida, é realizada por etapas consecutivas de seleção denominadas de “ciclos de bio-panning". O número de ciclos de bio- pannings realizados em phage display determina o grau de enriquecimento dos fagos que se ligam a um receptor-alvo. Uma população de clones de fagos com elevada afinidade em relação a um dado receptor pode ser obtida com a realização de 3 a 5 ciclos de bio-pannings (Crameri R, Suter M. Display of biologically active proteins on the surface of filamentous phages: a cDNA cloning system for selection of functional gene products linked to the genetic information responsible for their production. Gene 1993; 137:69-75, 1993). Metodologicamente, os ciclos de bio-panning podem ser adaptados de acordo com o grupo de pesquisa que domina tal tecnologia. Por exemplo, no caso da presente invenção, anticorpos da classe IgG provenientes de soros dos pacientes a serem investigados foram fundidas à superfície de microesferas magnéticas (denominadas de "beads") e tal híbrido foi submetido então a processos de captação (seleção) negativa ou positiva em relação aos clones de fagos presentes na biblioteca recombinante utilizada.
[019] A tecnologia de phage display vem sendo utilizada em diversos trabalhos para a pesquisa de novos antígenos que, sob a forma de clones de bacteriófagos expressando os peptídeos de interesse, ou dos próprios peptídeos individuais produzidos sinteticamente; possam ser testados no diagnóstico laboratorial de várias doenças, como nas infecções virais, no câncer e em doenças auto-imunes; bem como na produção de vacinas recombinantes. A identificação dos peptídeos reativos na superfície dos fagos permite sua utilização ou a construção sintética posterior dos mesmos, seguida pelo seu emprego nos testes laboratoriais, objetivando o diagnóstico laboratorial e/ou o desenvolvimento de vacinas contra as diversas doenças (Manoutcharian K, Terrazas LI, Gevorkian G, Acero G, Petrossian P, Rodrigues M, et al. Phage-displayed T-cell epitope grafted into immunoglobulin heavy-chain complementarity-determining regions: an effective vaccine design tested in murine cysticercosis. Infect Immun 1999; 67:4764-4770. Manoutcharian K, Diaz-Orea A, Gevorkian G, Fragoso G, Acero G, González E, et al. Recombinant bacteriophage-based multiepitope vaccine against Taenia solium pig cysticercosis. Vet Immunol Immunopathol 2004; 99:11-24. Noya, O.; Patarroyo, M.E.; Guzman, F.; Alarcon De Noya, B.; Immunodiagnosis of parasitic diseases with synthetic peptides. Curr. Prot. Peptide Sci., v. 4, p. 299-308, 2003. Sartorius R, Pisu P, D'Apice L, Pizzella L, Romano C, Cortese G, Giorgini A, Santoni A, Velotti F, De Berardinis P. The use of filamentous bacteriophage fd to deliver MAGE-A10 or MAGE-A3 HLA-A2-restricted peptides and to induce strong antitumor CTL responses. J Immunol. 2008 Mar 15;180(6):3719-28).
[020] O documento de patente BR102013027542, intitulado “Composição vacinai contra leishmaniose visceral canina, peptídeos sintéticos e uso”, descreve uma composição vacinai para prevenção e ou tratamento da leishmaniose visceral canina, utilizando, como antígenos, peptídeos expressos na superfície externa de bacteriófagos não nocivos ao hospedeiro mamífero, ou sintetizados, sendo utilizados isolados ou associados. A tecnologia descreve também o uso desses peptídeos na preparação de composições vacinais contra leishmaniose visceral. Esses peptídeos foram selecionados pela técnica phage display e induzem resposta imune específica do tipo Th1, destacada pela maior produção de IFN- gama. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender peptídeos diferentes dos seis peptídeos aqui descritos. Além disso, na presente invenção, tais antígenos foram identificados utilizando soros de pacientes humanos, o que amplia o leque de possibilidades de se utilizar os mesmos tanto no homem quanto em outros mamíferos.
[021] O documento de patente BR102013033627, intitulado “Peptídeos sintéticos, método e kit para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral canina e das leishmanioses tegumentar e visceral humana", descreve peptídeos, um método e Kit para imunodiagnóstico das leishmanioses, em seres humanos e/ou cães, e uso de peptídeos derivados de epitopos de célula B na identificação de indivíduos e animais infectados por leishmaniose visceral e tegumentar em método diagnóstico e kit diagnóstico. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender peptídeos diferentes dos seis peptídeos aqui descritos. Conforme descrito acima, na presente invenção, os 6 antígenos foram identificados utilizando soros de pacientes humanos, o que amplia o leque de possibilidades de se utilizar os mesmos tanto no homem quanto em outros mamíferos. Na patente citada, ainda que a mesma reivindique proteção intelectual para uso humano, a triagem experimental foi realizada utilizando soros de cães.
[022] O documento de patente PI0804859-2, intitulado “Peptídeos sintéticos para a obtenção de polímero proteico para imunização contra leishmaniose, produtos e seus usos” refere-se a dois peptídeos sintéticos antigênicos (epitopos/mimotopos), selecionados e sintetizados pelas técnicas de phage display e spot synthesis, e ao processo de obtenção de polímero proteico obtido através da conjugação destes peptídeos, o uso desse polímero proteico, a composição vacinai com ele produzida, método de vacinação, método de diagnóstico da doença e kit diagnóstico. Essa tecnologia se difere da presente invenção por compreender peptídeos diferentes dos seis peptídeos aqui descritos. Também, como descrito, na presente invenção, os antígenos foram identificados utilizando soros de pacientes humanos. Na invenção supracitada, foram utilizados soros de cães na seleção dos peptídeos de interesse.
[023] A presente tecnologia trata de 6 (seis) peptídeos sintéticos altamente específicos e reativos com amostras de pacientes com leishmaniose cutânea humana, além de um método e um kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea sintomática e assintomática, que utilizam como antígenos os 6 peptídeos sintéticos, isolados ou associados; ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.
[024] No estado da técnica não foi encontrada nenhuma tecnologia para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana que compreenda o uso dos seis peptídeos selecionados pela técnica subtrativa de phage display descritos na presente invenção. Os 6 peptídeos apresentam 100% de sensibilidade e especificidade para detectar pacientes com leishmaniose cutânea por meio de ensaios sorológicos.
[025] A presente tecnologia trata de 6 (seis) peptídeos sintéticos altamente específicos e reativos com amostras de pacientes com leishmaniose cutânea humana, além de um método e um kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea sintomática e assintomática, que utilizam como antígenos os 6 peptídeos sintéticos, isolados ou associados; ou clones de bacteriófagos expressando tais peptídeos, isolados ou associados.
[026] Mais especificamente, a presente invenção trata dos peptídeos identificados pelas seguintes sequências de aminoácidos KQEDKPI (Seq ID N° 1), YLLCISP (Seq ID N° 2), HLFLSSF (Seq ID N° 3), SVMIPQK (Seq ID N° 4), SFINSHG (Seq ID N° 5), PGIGSIY (Seq ID N° 6); de bacteriófagos capazes de expressar tais peptídeos; e do uso de tais peptídeos e/ou bacteriófagos no diagnóstico da leishmaniose cutânea humana e em um kit para diagnóstico da doença.
[027] O método proposto para o diagnóstico de leishmaniose cutânea humana caracteriza-se por compreender as seguintes etapas: a. exposição de uma amostra a pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N° 1 a 6, ou a pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando cada um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N° 1 a 6, estando tais peptídeos ou bacteriófagos ligados a um suporte sólido ou a um carreador; b. adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c. detecção dos anticorpos específicos para leishmaniose cutânea humana na amostra citada na etapa (a), utilizando-se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).
[001] Na etapa “a”, as amostras utilizadas são selecionadas do grupo consistindo de sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.
[028] Na etapa “b”, o anticorpo secundário pode ser IgG, IgM, IgA, IgE ou respectivas subclasses; a proteína pode ser a Proteína A e/ou a Proteína G; e a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou à proteína é selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Já o marcador é selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes. Por fim, na etapa “c”, o reagente para detectar a enzima ou o marcador é selecionado do grupo compreendendo qualquer substrato cromógeno que seja reconhecido por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados.
[029] O kit para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana caracteriza-se por compreender: a. suporte sólido ou carreador contendo pelo menos um dos peptídeos sintéticos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N° 1 a 6 ou pelo menos um dos clones de bacteriófagos expressando pelo menos um dos peptídeos definidos pelas sequências de aminoácidos SEQ ID N°1 a 6; b. anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c. reagente para detectar a enzima ou marcador.
[030] O suporte sólido do item “a” pode ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou poliestireno. Preferencialmente, deve consistir em placas de microtitulação de 96 poços, tubos, esferas ou papéis de nitrocelulose e/ou nylon.
[031] No item “b” o anticorpo secundário pode ser IgG, IgM, IgA, IgE e/ou suas respectivas subclasses e a proteína pode ser a proteína A e/ou proteína G.
[032] Para os itens “b” e “c”, a enzima que está conjugada ao anticorpo secundário ou proteína pode ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase. Já o marcador pode ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e/ou quimioluminescentes.
[033] O reagente para detectar a enzima ou o marcador do item “c" pode ser selecionado do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas supracitadas, ou algum dos marcadores supracitados.
[034] A presente invenção pode ser mais bem compreendida através dos exemplos que se seguem, não limitantes.
[035] Amostras de soros - As seguintes amostras de soro foram utilizadas para a realização dos ciclos de bio-pannings na técnica de phage display e nos ensaios de ELISA para seleção de bacteriófagos expressando peptídeos específicos para o sorodiagnóstico da leishmaniose cutânea: (1) soros de indivíduos sadios e residentes em área não-endêmica de LT, n=20; (2) soros de pacientes com doença de Chagas, DC, (n=20); (3) soros de pacientes com leishmaniose cutânea, LC, n=20; e soros de pacientes com leishmaniose muco-cutânea, LMC, n=20. Pools de soros foram preparados usando quantidades iguais de cada amostra coletada e utilizados nos ciclos de bio-pannings.
[036] Purificação de anticorpos IgGs por acoplamento em microesferas de proteína-G - A purificação das imunoglobulinas da classe IgG a partir dos pools de soros listados acima foi realizada por meio de seu acoplamento em microesferas magnéticas (beads magnéticos) conjugadas à proteína G (Dynabeads, Invitrogen). Para tal, 2x109 partículas de microesferas foram lavadas por 3 vezes em tampão MES 0.1 M pH 5.0 e foram adicionados às mesmas: (a) 200 μL do pool de soros de pacientes com LMC, para um volume final de 400 μL; (b) 200 μL do pool de soros de pacientes com LC, para um volume final de 400 μL; (c) 200 μL do pool de soros de pacientes com DC, para um volume final de 400μL e (d) 200 μL do pool de soros de pacientes sadios (controles negativos), para um volume final de 400 μL. A proporção de anticorpos para a quantidade das microesferas em todos os casos foi de 1:1.
[037] Em seguida, foi realizada uma incubação por 40 min sob agitação constante e à temperatura ambiente. As microesferas adsorvidas com os anticorpos foram lavadas por 3 vezes em tampão MES 0.1 M pH 5.0, com a finalidade de retirar os anticorpos IgGs não-aderidos. Para a finalização da ligação covalente entre as microesferas e os anticorpos, o sistema “beads-anticorpo” foi lavado 2 vezes com 1 ml_ de tampão trietanolamina 0.2M pH 8.2 e ressuspendido em 1 ml_ de tampão de ligação covalente (20 mM de dimetilpimelinidato/HCI em tampão trietanolamina) por 30 min, sob agitação constante à temperatura ambiente. A neutralização da reação foi feita pela incubação do sistema com 1 ml_ de tampão Tris 50 mM pH 7.5, por 15 min à temperatura ambiente.
[038] Em seguida, as microesferas incorporadas foram lavadas por 3 vezes em tampão TBS-T 0.1% de Tween 20 e bloqueadas com solução de bloqueio (5% de BSA em TBS-T 0.05% de Tween 20) por 1 h e a 37°C, sendo então ressuspendidas em 200 μL de tampão TBS. Para certificação do acoplamento, 5 μL dos beads cobertos pelas IgGs foram incubados por 1 h e a 37°C com o anticorpo anti-lgG de humano (diluição de 1:5.000). Após a incubação, os beads foram lavados por 3 vezes com TBS-Tween 0.1% e a reação foi revelada pela adição do substrato tetrametilbenzidina. A reação foi então interrompida pela adição de ácido sulfúrico 2 N e a leitura da absorbância foi efetuada a 450 nm, em leitor de microplacas (Titertek Multiskan Plus, Flow Laboratories, USA).
[039] Ciclos de bio-pannings - Para a realização das seleções negativa e positiva dos ciclos de bio-pannings, 1x1011 partículas virais de uma biblioteca recombinante contendo peptídeos fusionados em fagos filamentosos (biblioteca comercial Ph.D.-C7C obtida da empresa New England, BioLabs®, USA) foram utilizadas. As mesmas foram diluídas em 190 μL de TBS-Tween 0,1% para a seleção dos ligantes nas microesferas incorporadas pelos anticorpos IgG.
[040] Para a seleção negativa, a biblioteca de bacteriófagos recombinantes foi incubada por 30 minutos à temperatura ambiente com 100 μl_ das microesferas acopladas com as IgGs de indivíduos sadios. Em seguida, as microesferas foram precipitadas por atração magnética ao suporte Dynal Biotech (no. 12020), sendo o sobrenadante, contendo os clones que não se aderiram às IgGs, transferido para novo tubo contendo 100 μL das microesferas acopladas com as IgGs do grupo de pacientes com DC. Em seguida, as microesferas foram precipitadas por atração magnética ao suporte Dynal Biotech (no. 12020), sendo o sobrenadante, contendo apenas os clones de fagos que não se aderiram a tais anticorpos, recuperado.
[041] Para a seleção positiva, o sobrenadante coletado e recuperado durante a seleção negativa foi transferido para um novo tubo contendo as microesferas acopladas com as IgGs de pacientes com LMC, e incubado por 30 minutos à temperatura ambiente. As microesferas contendo o sistema beads-anticorpos precipitado nos tubos dos bio-panning dos anticorpos de pacientes com LMC, contendo os fagos de interesse, foram lavadas por 10 vezes com TBS-Tween 20 0.1% e eluídas em 500 μL de tampão glicina 0.2 M pH 2.0, sendo tal solução neutralizada pela adição de 75 μL de Tris-base pH 9.0. Os clones de fagos foram recuperados para realizar a segunda etapa do processo de seleção positiva. Estes clones recuperados e eluídos foram passados para um novo tubo contendo as microesferas acopladas com as IgGs de pacientes com LC. As microesferas contendo o sistema beads-anticorpos precipitado nos tubos dos bio-panning dos anticorpos de pacientes com LC, contendo os fagos de interesse, foram lavadas por 10 vezes com TBS-Tween 20 0.1% e eluídas em 500 μL de tampão glicina 0.2 M pH 2.0, sendo tal solução neutralizada pela adição de 75 μL de Tris-base pH 9.0. O processo foi repetido mais duas vezes, totalizando 3 ciclos de bioseleção. Após tal procedimento, os clones foram titulados de forma individualizada.
[042] Titulações dos clones de fagos selecionados - Ao final do 3o ciclo de bioseleção positiva, os clones de fagos recuperados foram titulados. Para tal, os mesmos foram submetidos a diluições seriadas exponenciais (log10) em meio LB líquido com ampicilina, sendo as diluições de 10‘1 até 10'4 para os eluatos não amplificados e de 108 a 10 11 para os eluatos amplificados. A cada diluição, 200 μl_ da cultura de E. coli ER2738 na fase mid-log (OD6oonm~0,5) foram acrescentados. Após a infecção das bactérias pelos fagos, a cultura foi transferida para novos tubos contendo 3 ml_ de ágar Top (10 g de Bacto-Triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCI, 7 g de agarose, 1 g de MgCI2.6H2O, por 1 L de água deionizada) e espalhadas em placa de Petri contendo meio LB sólido acrescido de IPTG (0.5 mM)/Xgal (40 μg/mL) e ampicilina (100 mg/mL). Para cada titulação, uma placa de cultura foi confeccionada. As placas foram incubadas a 37°C por 16 h. Após, as colônias que se apresentavam azuis e individualizadas foram quantificadas manualmente. Para estimar os valores dos títulos, o número total de colônias contadas foi multiplicado pelo fator de diluição de cada placa.
[043] As colônias de E. coli ER2738 individualizadas contendo os bacteriófagos selecionados foram coletadas para a extração do DNA. Para a amplificação dos fagos, 1,2 mL da cultura de células E. coli ER2738 em fase early-log (OD6oonm~0,3) foram distribuídos em cada poço de uma placa deepwell. Com palitos de dente esterilizados, 96 colônias azuis foram retiradas da placa de Petri e transferidas para a placa de cultura. A cada poço, apenas uma colônia de fago foi adicionada, totalizando 96 colônias na placa. A mesma foi vedada e incubada por 5 h, sob agitação constante e a 37°C. Após a incubação, a placa foi centrifugada por 20 min a 2.250 x g, sendo o sobrenadante transferindo para outra placa. A essa 2a placa, foi adicionado PEG/NaCI (1/6 do volume total do sobrenadante), sendo a mesma incubada por 14 h e a 4°C. Após, a placa foi centrifugada por 1 h, o sobrenadante foi retirado e o precipitado foi ressuspendido em tampão iodeto (10 mM de Tris HCI pH 8.0, 1 mM de EDTA e 4 M de Nal). As placas foram agitadas vigorosamente e, em seguida, adicionou-se etanol absoluto. Após uma incubação de 10 min, as placas foram centrifugadas (2.250 x g a 4°C e por 10 min), sendo o sobrenadante descartado. O precipitado contendo o DNA foi lavado com 500 μL de etanol 70% e novamente centrifugado. Finalmente, o DNA foi diluído em 20 μL de água ultra-pura e sua qualidade foi avaliada após uma corrida eletroforética realizada em gel de agarose 0,8%, corado com uma solução de brometo de etídio.
[044] Sequenciamento dos clones de bacteriófagos selecionados - A reação de sequenciamento utilizando o DNA dos 96 clones selecionados foi realizada com 500 ng do DNA de cada fago, 5 pmol do Primer 96 gill (5'-OH CCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3’-Biolabs) e o pré-mix (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences). A reação de 35 ciclos ocorreu em um termociclador de placas, nas seguintes condições: desnaturação a 95°C por 20 seg, anelamento a 58°C por 15 seg e extensão a 60°C por 60 seg. Os amplicons gerados da reação de sequenciamento foram precipitados com 1 pL de acetato de amónio e 27,5 pL de etanol absoluto. A placa foi centrifugada por 45 min a 2.432 x g e o sobrenadante descartado. Adicionou-se 150 pL de etanol 70% ao precipitado e o material foi centrifugando novamente por 10 min a 2.432 x g, sendo o sobrenadante descartado. A placa permaneceu invertida sobre um papel toalha e nesta posição foi centrifugada a 486 x g, durante 1 min. Em seguida, a placa foi coberta com papel alumínio, permanecendo por 5 min, para a evaporação completa do etanol remanescente. O precipitado foi ressuspendido em tampão de diluição (DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Kit-Amersham Biosciences) e o sequenciamento foi realizado no sequenciador automático MegaBace 1000 (Amersham Biosciences). A dedução in silico das sequências de aminoácidos, para a identificação dos peptídeos exógenos, foi realizada pelo programa DNA2PRO12, que é designado para a dedução de sequências de insertos das bibliotecas da New England Biolabs fPh.D.-12TM ou Ph.D.-C7CTM), como de outras bibliotecas de interesse que contenham as sequências inicial e final do vetor. O programa automaticamente localiza a posição do inserto, traduz o mesmo e indica os possíveis erros na tradução (tais como códons inesperados ou erros na sequência próxima). As sequências que não puderam ser traduzidas pelo programa foram analisadas manualmente.
[045] Dos 96 clones coletados, 48 tiveram suas sequências recuperadas e seus DNAs foram extraídos e armazenados.
[046] Os 48 clones sequenciados foram individualizados e testados no sorodiagnóstico da LC em experimentos de ELISA, com o propósito de selecionar os bacteriófagos específicos para o sorodiagnóstico da doença.
[047] Para tal, placas de ELISA (Jet Biofil) foram sensibilizadas por 16 h a 37°C com 100 μL de uma solução contendo 1x109 fagos de cada clone, sendo diluídos em tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6. Após, as placas foram lavadas por 3 vezes com solução de lavagem (PBS 1x e Tween 20 0,05%) e bloqueadas com a solução de bloqueio (BSA 5% diluída em PBS 1x) por 1 h a 37°C. Após, as placas foram lavadas 5 vezes com solução de lavagem e amostras contendo um pool de soros de pacientes com LC (pool positivo) e um pool de soros de indivíduos sadios residentes em área não-endêmica (pool negativo) foram adicionadas na diluição de 1:100 em solução de bloqueio (BSA 5% diluída em PBS 1x). A reação ocorreu por 1 h a 37°C. Após, as placas foram lavadas 5 vezes com a solução de lavagem e o anticorpo anti-lgG humano conjugado à peroxidase (Sigma; diluído 1:5.000 em tampão de incubação) foi acrescentado. A reação foi desenvolvida pela adição de 100 μL de uma solução composta por orto-fenilenodiamino (0.33 mg/mL), 4 μL de H2O2 e 10 mL de tampão citrato/fosfato, pH 5.0. Após 30 min de incubação ao abrigo da luz, a reação foi interrompida pela adição de 25 μL de ácido sulfúrico 2 N. A leitura das absorbâncias foi realizada no comprimento de onda de 492 nm, em leitor de ELISA (Molecular Devices, Spectra Max Plus, Canada).
[048] As reações individuais dos 48 clones frente às amostras de soro dos pacientes com LC e dos indivíduos sadios são mostradas nas Tabelas 1 e 2, respectivamente. Na Tabela 3 é mostrada a razão entre os valores de absorbância obtidos com os pools de soros positivo e negativo, para cada clone avaliado.
[049] Tendo em vista a razão Obtida usando o extrato proteico solúvel (SLA) de L. braziliensis como antígeno sensibilizador das placas de ELISA ter sido de 1,8, adotou-se esse valor como preditivo para a seleção dos clones de bacteriófagos específicos para o diagnóstico de LC, de forma que os clones que apresentassem razão entre os valores obtidos usando o pool de soro positivo e os valores obtidos usando o pool de soro negativo igual ou superior a 1,8 seriam selecionados.
[050] Os resultados levaram à identificação de 6 clones de bacteriófagos específicos para o sorodiagnóstico da leishmaniose cutânea humana. As sequências desses 6 clones são mostradas na Tabela 4.
[051] Tabela 1: Resultados das absorbâncias encontradas para cada clone de fago testado em reação com um pool de soros constituídos por amostras de pacientes com LC (positivo). O resultado obtido usando um clone de fago selvagem, como controle, foi utilizado. Tal clone não expressa peptídeos exógenos de interesse, e serve como controle de fago. O valor considerado “real” foi obtido pela diferença encontrada entre o valor de absorbância encontrada para cada clone menos o valor obtido pela reação do fago selvagem com o pool de soros positivos. Como os testes de ELISA foram realizados no mesmo dia e ao mesmo tempo, o valor encontrado para o clone selvagem foi único.
[052] Tabela 2: Resultados das absorbâncias encontradas para cada clone de fago testado em reação com um pool de soros constituídos por amostras de indivíduos sadios (negativo). O resultado obtido usando um clone de fago selvagem, como controle, foi utilizado. Tal clone não expressa peptídeos exógenos de interesse, e serve como controle de fago. O valor considerado “real” foi obtido pela diferença encontrada entre o valor de absorbância encontrada para cada clone menos o valor obtido pela reação do fago selvagem com o pool de soros negativos. Como os testes de ELISA foram realizados no mesmo dia e ao mesmo tempo, o valor encontrado para o clone selvagem foi único.
[053] Tabela 3: Razão entre os valores reais de absorbância para cada clone de fago avaliado. A razão foi determinada pela divisão entre os valores de reação com os pools de soros positivos e negativos, para cada clone avaliado. O SLA L braziliensis foi usado como controle. Os clones que apresentaram razão maior ou igual à encontrada para o SLA (1,8), foram selecionados (*).
[054] Pode-se observar que, dos 48 clones avaliados, 6 foram reconhecidos, com maiores valores de absorbâncias, pelos soros de pacientes com LC em relação ao grupo controle. Os valores da razão das absorbâncias entre os resultados obtidos usando pools de soros positivos e negativos de tais clones foram maiores ou iguais ao encontrado para o uso do SLA L. braziliensis, esse, com índice de razão de 1,8. As sequências dos 6 peptídeos expressos por cada um dos 6 clones selecionados estão apresentadas na Tabela 4.
[055] Tabela 4: Sequência dos 6 peptídeos específicos para o sorodiagnóstico da LC humana.
[056] Os 6 clones de bacteriófagos (A3, A4, B1, C4, E3 e E4) foram testados usados no sorodiagnóstico por ELISA para a LC humana. Foram utilizadas amostras de soros de indivíduos não-infectados residentes em área nâo-endêmica da doença, n=40; soros de pacientes com doença de Chagas, DC, n=20; com esquistossomose, n=15; ou leishmaniose visceral, LV, n=50; além dos soros de pacientes com leishmaniose cutânea, LC. Os resultados obtidos estão representados na Tabela 5.
[057] Tabela 5: Resultados de análises sorológicas obtidas usando os clones de bacteriófagos selecionados para o sorodiagnóstico da leishmaniose cutânea humana. Abreviaturas: Se: sensibilidade. Sp: especificidade. J: índice Youden. VPP: valor preditivo positivo. VPN: valor preditivo negativo. FS: fago selvagem.
[058] Na análise dos resultados, observa-se que todos os 6 clones apresentaram 100% de sensibilidade e especificidade para detectar pacientes com LC por meio dos ensaios sorológicos e, dessa forma, apresentam-se como novos antígenos para compor um método e um kit para diagnóstico da LC humana.
Claims (11)
1. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, caracterizado por compreender as seguintes etapas: a) exposição de uma amostra ao peptídeo definido pela sequência de aminoácidos SEQ ID No 1, ou a pelo menos um clone de bacteriófagos expressando o peptídeo definido pela sequência de aminoácidos SEQ ID No 1, estando tal peptídeo ou bacteriófago ligado a um suporte sólido ou a um carreador; b) adição de um anticorpo secundário ou uma proteína, que estejam conjugados a uma enzima ou a um marcador e que se liguem aos anticorpos da amostra da etapa (a); c) detecção dos anticorpos específicos para leishmaniose cutânea humana na amostra citada na etapa (a), utilizando- se reagentes capazes de detectar a enzima ou o marcador citados na etapa (b).
2. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “a”, as amostras utilizadas serem selecionadas do grupo compreendendo sangue, soro, plasma e/ou outro fluído corporal.
3. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “b”, o anticorpo ser selecionado do grupo compreendendo IgG, IgM, IgA, IgE e/ou respectivas subclasses.
4. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “b”, a proteína ser a Proteína A e/ou Proteína G.
5. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “b”, a enzima ser selecionada do grupo compreendendo peroxidase, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, urease, xantina oxidase, glicose oxidase e penicilinase.
6. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “b”, o marcador ser selecionado do grupo compreendendo enzimas, radioisótopos, biotina, cromóforos, fluoróforos e quimioluminescentes.
7. Método para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, na etapa “c”, a detecção do anticorpo secundário ou proteína especificamente ligados aos anticorpos anti-leishmania ser feita utilizando reagentes selecionados do grupo compreendendo substratos cromógenos que sejam reconhecidos por alguma das enzimas da reivindicação 5 ou algum dos marcadores da reivindicação 6.
8. Kit para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, caracterizado por compreender: a) suporte sólido ou carreador contendo o peptídeo sintético definido pela sequência de aminoácidos SEQ ID No 1 ou pelo menos um clone de bacteriófago expressando o peptídeo definido pela sequência de aminoácidos SEQ ID No1; b) anticorpo secundário ou uma proteína, conjugados a uma enzima ou a um marcador; c) reagente para detectar a enzima ou marcador.
9. Kit para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo suporte sólido ser selecionado do grupo de materiais compreendendo nitrocelulose, nylon, látex, polipropileno e/ou polistireno.
10. Kit para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelos anticorpos secundários, proteínas, enzimas, marcadores e reagentes serem selecionados dos grupos definidos nas reivindicações 3 a 7.
11. Uso do peptídeo definido pela SEQ ID No1, caracterizado por ser no diagnóstico e/ou em kits para diagnóstico de leishmaniose cutânea humana.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102015031861-8A BR102015031861B1 (pt) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso |
| PCT/IB2016/057791 WO2017103909A1 (pt) | 2015-12-18 | 2016-12-19 | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| BR102015031861-8A BR102015031861B1 (pt) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| BR102015031861A2 BR102015031861A2 (pt) | 2017-09-19 |
| BR102015031861A8 BR102015031861A8 (pt) | 2021-11-03 |
| BR102015031861B1 true BR102015031861B1 (pt) | 2023-12-12 |
Family
ID=59055978
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| BR102015031861-8A BR102015031861B1 (pt) | 2015-12-18 | 2015-12-18 | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| BR (1) | BR102015031861B1 (pt) |
| WO (1) | WO2017103909A1 (pt) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR102013013069B1 (pt) * | 2013-05-27 | 2021-05-04 | Universidade Federal De Minas Gerais | método, kit para teste imunodiagnóstico de leishmaniose visceral canina e vacina |
| BR102013027542B1 (pt) * | 2013-10-25 | 2021-02-09 | Universidade Federal De Minas Gerais | composição vacinal contra leishmaniose visceral canina, peptídeos sintéticos e uso |
| BR102013033627B1 (pt) * | 2013-12-27 | 2021-02-09 | Universidade Federal De Minas Gerais | peptídeos sintéticos, método e kit para imunodiagnóstico da leishmaniose visceral canina e das leishmanioses tegumentar e visceral humana |
| BR102014004107B1 (pt) * | 2014-02-21 | 2021-07-06 | Universidade Federal De Minas Gerais - Ufmg | método e kit para diagnóstico das leishmanioses utilizando peptídeos sintéticos |
| BR102014013193A2 (pt) * | 2014-05-30 | 2019-02-26 | Univ Minas Gerais | método e kit para diagnóstico das leishmanioses utilizando peptídeos sintéticos derivados do gene codificador da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa) |
-
2015
- 2015-12-18 BR BR102015031861-8A patent/BR102015031861B1/pt active IP Right Grant
-
2016
- 2016-12-19 WO PCT/IB2016/057791 patent/WO2017103909A1/pt active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| BR102015031861A8 (pt) | 2021-11-03 |
| BR102015031861A2 (pt) | 2017-09-19 |
| WO2017103909A1 (pt) | 2017-06-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Salles et al. | Leishmania infantum mimotopes and a phage–ELISA assay as tools for a sensitive and specific serodiagnosis of human visceral leishmaniasis | |
| BRPI0710155A2 (pt) | compostos e métodos para diagnóstico e tratamento de leishmaniose | |
| ES2681227T3 (es) | Péptidos y métodos para la detección de la leishmaniasis | |
| BR102013013069B1 (pt) | método, kit para teste imunodiagnóstico de leishmaniose visceral canina e vacina | |
| WO2015112099A1 (en) | Production of immunoreactive proteins by using the methods of recombinant dna technology that usable for serological diagnosis of babesia ovis infection | |
| BR102015031861B1 (pt) | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose cutânea humana, e uso | |
| BR102014013193A2 (pt) | método e kit para diagnóstico das leishmanioses utilizando peptídeos sintéticos derivados do gene codificador da proteína quinase ativada por mitógeno 3 (putativa) | |
| BR102015032494B1 (pt) | Peptídeos sintéticos, método e kit diagnóstico da leishmaniose mucosa humana, e uso | |
| ES2674672T3 (es) | Péptidos de interferencia y procedimiento de detección de microorganismos | |
| WO2017109763A1 (pt) | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose mucosa humana, e uso | |
| US7740859B2 (en) | Polypeptides for the diagnosis and therapy of Leishamaniasis | |
| Siqueira | Identification of New Antigens for the Diagnosis of Visceral Leishmaniasis-Application in Immunochromatography | |
| Marin et al. | Chimeric synthetic peptides as antigens for detection of antibodies to Trypanosoma cruzi | |
| CN103517714A (zh) | 用于刚地弓形虫感染和弓形体病的诊断和治疗的方法和蛋白抗原组合物 | |
| BRPI0903089B1 (pt) | Peptídeos recombinantes e motivos proteicos miméticos a antígenos de leishmania e suas aplicações | |
| WO2017103910A1 (pt) | Peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da leishmaniose visceral humana, e uso | |
| Hernandez et al. | Erythrocyte membrane protein 3 (EMAP3) is exposed on the surface of the Plasmodium berghei infected red blood cell | |
| Silva-Moraes et al. | Serological proteomic screening and evaluation of a recombinant egg antigen for the diagnosis of low-intensity infections in endemic area in Brazil Antigen target in schistosomiasis diagnosis | |
| BR102020007615B1 (pt) | PEPTÍDEO SINTÉTICO PSLi379 E SEU USO PARA O DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE, MÉTODO PARA IMUNODIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA E KIT PARA TESTE IMUNODIAGNÓSTICO | |
| BR102018016723A2 (pt) | Fusão peptídica, proteína quimérica, seu processo de obtenção e suas aplicações relacionadas à esquistossomose | |
| Ma | Identification of Babesia microti Diagnostic Antigens Using Phage Display cDNA Library Screening | |
| BR102021026546A2 (pt) | Kit para diagnóstico ou prognóstico da leishmaniose tegumentar, método e usos | |
| BRPI1006638A2 (pt) | peptÍdeos marcadores das fases clÍnicas da neurocisticercose | |
| JP2024517646A (ja) | Ｂａｂｅｓｉａ組換えタンパク質を使用するＢａｂｅｓｉａの診断 | |
| BR102016026208B1 (pt) | peptídeos sintéticos, método e kit para diagnóstico da neosporose bovina e uso |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B03A | Publication of a patent application or of a certificate of addition of invention [chapter 3.1 patent gazette] | ||
| B11A | Dismissal acc. art.33 of ipl - examination not requested within 36 months of filing | ||
| B11N | Dismissal: publication cancelled [chapter 11.14 patent gazette] |
Free format text: ANULADA A PUBLICACAO CODIGO 11.1 NA RPI NO 2505 DE 08/01/2019 POR TER SIDO INDEVIDA. |
|
| B03H | Publication of an application: rectification [chapter 3.8 patent gazette] |
Free format text: REFERENTE A RPI 2437 DE 19/09/2017, QUANTO AO ITEM 54. |
|
| B06U | Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette] | ||
| B07A | Application suspended after technical examination (opinion) [chapter 7.1 patent gazette] | ||
| B09A | Decision: intention to grant [chapter 9.1 patent gazette] | ||
| B16A | Patent or certificate of addition of invention granted [chapter 16.1 patent gazette] |
Free format text: PRAZO DE VALIDADE: 20 (VINTE) ANOS CONTADOS A PARTIR DE 18/12/2015, OBSERVADAS AS CONDICOES LEGAIS |