BRPI1005855B1

BRPI1005855B1 - processos de produção e purificação de proteina sml 4 recombinante em pichia pastoris

Info

Publication number: BRPI1005855B1
Application number: BRPI1005855A
Authority: BR
Inventors: Miriam Tendler; Celso Raul Romero Ramos; Andrew J. G. Simpson
Original assignee: Fundação Oswaldo Cruz
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2020-04-22
Also published as: MX350668B; US9193772B2; EP2617829B1; MX2013003005A; EP2617829A1; ZA201302741B; BRPI1005855A2; AU2011301714A8; US9475838B2; AU2011301714B2; AU2011301714A1; EP2617829A4; PE20140424A1; WO2012034197A8; US20160052963A1; US20130237475A1; NZ609370A; WO2012034197A1; MX339728B

Abstract

vacina recombinante para helmintos em pichia pastoris, e, processos de produção e purificação de proteína como vacina para helmintos. a presente invenção esta relacionada ao campo de produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em pichia pa.storis. mais especificamente, a invenção descreve a produção de proteína sm14 schistosoma mansoni em forma recombinante, onde foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína sm14 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de pichia pastoris para produzir uma vacina eficazmente. também foram aperfeiçoados os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de p. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

Description

(54) Tftulo: PROCESSOS DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA SML 4 RECOMBINANTE EM PICHIA PASTORIS (51) Int.CL: C12N 15/12; C12N 15/81; A61K 39/00.

(73) Titular(es): FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ.

(72) Inventor(es): MIRIAM TENDLER; CELSO RAUL ROMERO RAMOS; ANDREW J. G. SIMPSON.

(57) Resumo: VACINA RECOMBINANTE PARA HELMINTOS EM PICHIA PASTORIS, E, PROCESSOS DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNA COMO VACINA PARA HELMINTOS. A presente invenção esta relacionada ao campo de produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pa.storis. Mais especificamente, a invenção descreve a produção de proteína Sml4 Schistosoma mansoni em forma recombinante, onde foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sml4 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir uma vacina eficazmente. Também foram aperfeiçoados os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

PROCESSOS DE PRODUÇÃO E PURIFICAÇÃO DE PROTEINA SML4 RECOMBINANTE EM PICHIA PASTORIS

Campo de Aplicação

A presente invenção esta relacionada ao campo de produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pastoris. Mais especificamente, a invenção descreve a produção de proteína Sm14 do Schistosoma mansoni em forma recombinante, onde foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sm14 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir uma vacina eficazmente. Também foram aperfeiçoados os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

Fundamentos da Invenção

A proteína Sm14 que tem um peso molecular aproximado de 14,8 kDa e apresenta um significativo grau de identidade com as proteínas que pertencem à família de proteínas que se ligam a ácidos graxos, já foi amplamente estudada e descrita pelo depositante em seus pedidos de patente anteriores.

A estrutura tridimensional da proteína Sm14 foi prevista através de modelagem molecular por homologia computadorizada assim como por cristalografia e Ressonância Magnética Nuclear. A estrutura da proteína Sm14 permitiu a identificação dos epítopos protetores em potencial e, possibilitou o uso do rSm14 como antígeno de vacinação.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 8/35

A estrutura da proteína Sm14, assim como os modelos construídos para as proteínas homólogas de Fasciola hepática (sendo a FABP tipo 3 a que compartilha maior identidade seqüencial, 49%) mostram que estas moléculas adotam configurações tridimensionais semelhantes às moléculas de outros membros da família de proteínas que se ligam a lipídeos (“Fatty Acid Binding Proteins - FABP).

Assim, com base em todo o estado da arte de conhecimento dos inventores, será demonstrada aqui a capacidade que as formas recombinantes da proteína Sm14 tem de conferir uma alta proteção contra infecções causadas por helmintos supostamente patogênicos em relação a humanos e animais.

Nos trabalhos que mostraram pela primeira vez a atividade protetora da proteína Sm14, a proteína recombinante correspondente era expressa com o vetor pGEMEX-Sm14, em forma de corpúsculos de inclusão. Após o isolamento e lavagem dos corpúsculos, a proteína era purificada através de eletroforese preparativa por eletroeluição da banda correspondente (Tendler et al., 1996) . Essa metodologia, entretanto, não era adequada para produção da proteína em escala maior. Posteriormente, a proteína Sm14 passou a ser produzida com uma fusão de seis histidinas consecutivas (6xHis) no extremo amino terminal no sistema de expressão de Escherichia coli, na forma de corpúsculos de inclusão. Após a obtenção e solubilização dos corpúsculos era necessário fazer o re-enovelamento (refolding), para obter uma proteína funcional e imunologicamente ativa (Ramos et al., 2001).

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 9/35

Assim, verifica-se que apesar de todo o conhecimento adquirido pelos inventores, ainda existem desvantagens a serem superadas para a obtenção de um material antigênico que possa ser obtido com alto rendimento, em escala industrial em condições de GMP, e que não perca a característica de estabilidade.

Sumário da Invenção

A presente invenção propõe uma plataforma produtora de vacina recombinante para helmintos em Pichia pastoris. Através da referida plataforma é possível alcançar uma vacina recombinante para helmintos (em P. pastoris), incluindo os processos de produção e purificação da proteína Sm14 desenvolvida no sistema de Pichia pastoris.

A invenção propõe ainda um gene sintético para a expressão da proteína Sm14. A transformação genética de Pichia pastoris com este gene sintético sob controle do promotor AOX1 permite produzir e purificar a proteína Sm14.

Assim, a invenção permite a obtenção da proteína Sm14 a partir de um gene sintético contendo códons otimizados para a alta expressão em Pichia pastoris, SEQ ID NO:3 (seqüência final do gene), assim como os procedimentos de purificação da proteína Sm14.

Breve Descrição das Figuras

A Figura 1 mostra a estratégia para a construção do plasmídeo pPIC9K-Sm14-MV.

A Figura 2 mostra a clonagem de Sm14-MV em pPIC9K.

Figura 3 mostra a análise por PCR de clones de P. pastoris.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 10/35

A Figura 4 mostra a indução da expressão da proteína Sm14 nos clones P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.

A Figura 5 mostra a indução da expressão da proteína Sm14 em P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV.

A Figura 6 mostra o resultado da purificação da proteína Sm14.

A Figura 7 mostra o resultado do cromatograma da gelfiltração da proteína Sm14-MV produzida em P. pastoris.

A Figura 8 mostra a análise por western blot da proteína purificada de P. pastoris.

A Figura 9 mostra o espectro de dicroísmo circular da proteína Sm14 purificada de P. pastoris.

Descrição Detalhada da Invenção

O objetivo principal da presente invenção, qual seja, produzir uma vacina recombinante para helmintos, é alcançável através da produção de proteínas em forma recombinante utilizando um gene sintético para a alta expressão da proteína em Pichia pastoris. De acordo com a invenção foi criado um gene sintético para alta expressão da proteína Sm14 e com ele foi obtida e manipulada geneticamente a cepa de Pichia pastoris para produzir a vacina de forma eficaz. A presente invenção contempla ainda os processos para produzir e purificar esta proteína a partir das células de P. pastoris, que podem ser escalonados para sua produção industrial.

O sistema de expressão na levedura metilotrófica Pichia pastoris apresenta importantes vantagens quando comparado aos sistemas baseados em E. coli, para a produção de proteínas recombinantes em escala industrial. Dentre

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 11/35 essas vantagens podemos citar, por exemplo, a estabilidade das cepas transformadas, alta expressão, cultura em alta densidade celular, facilidade para o escalonamento da cultura, não apresenta perigo para a saúde humana, e não produz endotoxinas (Fabe et al., 1995). Esta última vantagem, sendo um dos fatores que influenciaram na mudança do micro-organismo para expressão da proteína, pois, a necessidade de detecção ou quantificação das endotoxinas produzidas por bactérias Gram-negativas a cada lote, seria um fator limitante, visto que, produtos gerados em E.coli que serão posteriormente aplicados em humanos, deverão estar livres de endotoxinas bacterianas. Esta exigência adicional dificultaria os processos de produção com E. coli o que impacta negativamente no custo final de produção.

A invenção será agora descrita através de sua melhor forma de realização.

1. OBTENÇÃO DA CEPA RECOMBINANTE DE PICHIA PASTORIS

1.1 Gene sintético para a expressão da proteína Sm14 em P. pastoris:

Num primeiro passo foi desenhado e sintetizado um gene contendo códons otimizados para se obter máxima expressão da proteína Sm14 em P. pastoris. No presente caso foi utilizada a proteína Sm14-MV, entretanto pode ser utilizada qualquer forma da proteína Sm14.

Na literatura existe evidência sobre o uso diferencial de códons entre proteínas expressas em pouca quantidade e em alta quantidade, num mesmo organismo (Roymondal and Sahoo, 2009) . Porém, as tabelas de uso de códons disponíveis em bases de dados (por exemplo:

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 12/35 (www.kazusa.or.jp/codon) contém dados de todas as proteínas do organismo, sem levar em consideração o nível de expressão gênica. Por este motivo, para o desenho do gene, inicialmente foi elaborada uma tabela de uso de códons tendo como base de dados de seqüências que codificam as proteínas recombinantes expressas acima de 1 grama por

Litro de cultura em P. pastoris (ver tabela 1), assim como a seqüência da proteína AOX1 (que representa 30% da proteína total da P. pastoris, após a indução com metanol).

Tabela 1: Lista de proteínas recombinantes com alta expressão em P. pastoris.

Proteína expressa	(mg/L)	Referencia
Hydroxynitrile lyase	22000	Hasslacher, M. et al. (1997) Protein Expr. Purif. 11: 61-71
Mouse gelatin	14800	Werten, M.W. et al. (1999) Yeast 15: 1087-1096
Tetanus toxin fragment C	12000	Clare, J.J. et al. (1991) Bio/Technology 9: 455-460
Human tumor necrosis factor	10000	Sreekrishna, K. et al. (1989) Biochemistry 28: 4117-4125
α-amylase	2500	Paifer, E. et al. (1994) Yeast 10: 1415-1419
T2A peroxidase	2470	Thomas, L. et al. (1998) Can. J. Microbiol. 44: 364-372
Catalase L	2300	Calera, J.A. et al. (1997) Infect. Immun. 65: 4718-4724
Hirudin	1500	Rosenfeld, S.A. et al. (1996) Protein Expr. Purif. 8: 476-482.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 13/35

Para o desenho do gene foi escolhida a seqüência da proteína Sm14-MV, que tem um resíduo de valina na posição 62 - no lugar da cisteína, que a torna mais estável (Ramos et al., 2009), aqui representada como SEQ ID NO:1.

SEQ ID NO: 1

MSSFLGKWKL SESHNFDAVM SKLGVSWATR QIGNTVTPTV TFTMDGDKMT MLTESTFKNL SVTFKFGEEF DEKTSDGRNV KSVVEKNSES KLTQTQVDPK NTTVIVREVD GDTMKTTVTV GDVTAIRNYK RLS

Após uma primeira seleção dos códons segundo a tabela criada com os dados das proteínas da Tabela 1, foi realizada uma depuração de seqüências que resultaram em sítios de terminação de transcrição (ATTTA) doadores e receptores crípticos de splicing (MAGGTRAGT e YYYNTAGC, respectivamente) e seqüências repetitivas (sítios de corte para as enzimas de restrição BamHI e EcoRI). A SEQ ID NO:2 mostra a seqüência desenhada para expressar a proteína Sm14-MV em Pichia pastoris.

SEQ ID NO:2

ATGTCTTCTT TCTTGGGTAA GTGGAAGTTG TCTGAATCTC ACAACTTCGA 51 CGCTGTTATG TCTAAGTTGG GTGTTTCTTG GGCTACCAGA CAAATTGGTA

101	ACACCGTTAC	TCCAACCGTT	ACCTTCACCA	TGGACGGTGA	CAAGATGACT
151	ATGTTGACCG	AGTCTACCTT	CAAGAACTTG	TCTGTTACTT	TCAAGTTCGG
201	TGAAGAGTTC	GACGAAAAGA	CTTCTGACGG	TAGAAACGTT	AAGTCTGTTG
251	TTGAAAAGAA	CTCTGAATCT	AAGTTGACTC	AAACTCAAGT	TGACCCAAAG
301	AACACTACCG	TTATCGTTAG	AGAAGTTGAC	GGTGACACTA	TGAAGACTAC
351	TGTTACCGTT	GGTGACGTTA	CCGCTATCAG	AAACTACAAG	AGATTGTCTT
401	AA

Na extremidade 5' da seqüência desenhada foi adicionada a seqüência Kozak do gene da proteína AOX1 de P.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 14/35 pastoris (AAACG). Finalmente foram adicionados os sítios de restrição para BamHI (GGATCC) e EcoRI (GAATTC) nas extremidades 5' e 3' do gene desenhado, respectivamente.

A SEQ ID NO:3 mostra a seqüência final do gene sintético para a produção da proteína Sm14.

SEQ ID NO:3

GGATCCAAAC GATGTCTTCT TTCTTGGGTA AGTGGAAGTT GTCTGAATCT

CACAACTTCG ACGCTGTTAT GTCTAAGTTG GGTGTTTCTT GGGCTACCAG

101	ACAAATTGGT	AACACCGTTA	CTCCAACCGT	TACCTTCACC	ATGGACGGTG
151	ACAAGATGAC	TATGTTGACC	GAGTCTACCT	TCAAGAACTT	GTCTGTTACT
201	TTCAAGTTCG	GTGAAGAGTT	CGACGAAAAG	ACTTCTGACG	GTAGAAACGT
251	TAAGTCTGTT	GTTGAAAAGA	ACTCTGAATC	TAAGTTGACT	CAAACTCAAG
301	TTGACCCAAA	GAACACTACC	GTTATCGTTA	GAGAAGTTGA	CGGTGACACT
351	ATGAAGACTA	CTGTTACCGT	TGGTGACGTT	ACCGCTATCA	GAAACTACAA
401	GAGATTGTCT	TAAGAATTC

Após a síntese da seqüência desenhada (SEQ ID NO:3) foi realizada a clonagem e posterior seqüenciamento do gene sintético no vetor pCR2.1 para confirmação da fidelidade da seqüência sintetizada com a seqüência desenhada.

1.2 Construção do plasmídeo para a expressão da proteína Sm14 em Pichia pastoris:

O gene sintetizado foi clonado no vetor pPIC9K, onde a proteína Sm14 é expressa sem fusão nenhuma, possibilitando sua produção intracelular.

O vetor pPIC9K (Invitrogen) foi escolhido para a construção do plasmídeo de expressão da Sm14 em P. pastoris pelos seguintes motivos:

(1) Possibilidade de ser utilizado para expressar proteínas intracelulares substituindo o gene do fator-alfa

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 15/35 pelo gene de interesse, a través do sítio de restrição

BamHI	do	vetor, situado	antes	da	seqüência Kozak e	do
início	de	tradução. Para	isso,	foi	necessário recriar	a
seqüência	Kozak antes do	ATG da	ORF	a ser expressa, como

realizado no desenho do gene sintético da Sm14.

(2) Possui a vantagem de poder selecionar clones com múltiplas cópias integradas no genoma, pela seleção de resistência contra o antibiótico G418. Essa possibilidade não existia no pPIC9, usada anteriormente.

A estratégia da construção do plasmídeo pPIC9K-Sm14 esta descrita na Figura 1.

Com o plasmídeo pCR21-Sm14-MV, foi transformada a cepa DH5a de E. coli, para sua propagação. Posteriormente o pDNA foi purificado com o Qiaprep Spin Miniprep Kit (QIAGEN). Este plasmídeo, assim como o vetor pPIC9K foi digerido com as enzimas de restrição BamHI e EcoRI (ambas da New England Biolabs) simultaneamente. Após a digestão, os fragmentos de DNA foram separados por eletroforese em gel de agarose contendo brometo de etídio. Os fragmentos correspondentes ao vetor pPIC9K e ao inserto Sm14-MV sintético foram excisados do gel de agarose e purificados com o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN).

Os fragmentos purificados foram ligados usando a T4 DNA ligase (New England Biolabs) . A cepa DH5a de E. coli, foi transformada com a reação de ligação e os clones foram selecionados em meio LB ágar contendo ampicilina. O pDNA de alguns clones resistentes a ampicilina foi purificado e analisado por restrição com as enzimas BamHI e EcoRI, mostrado na Figura 2. Na Figura 2 é mostrado o resultado da

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 16/35 clonagem de Sm14-MV em pPIC9K, onde a seleção de clones foi conforme a seguir:

M.- 1Kb DNA ladder + phiX174/HaeIII

1. - pPIC9K/BamHI + EcoRI

2. - pCR21-Sm14-MV/BamHI + EcoRI a 11.- Clones pPIC9K-Sm14-MV/ BamHI + EcoRI.

Na Figura 2 as setas marcam a posição de inserto e vetor da clonagem.

Os clones que apresentaram a banda correspondente ao inserto foram selecionados e sequenciados com o primer AOX5' para confirmar o sucesso da clonagem e a fidelidade da seqüência. Desta forma, a seqüência sintética para a expressão da proteína Sm14 ficou sob controle do forte promotor da álcool oxidase 1 (AOX1), que é induzido pelo metanol (Cregg et al., 1993).

1.3 Transformação da P. pastoris com o plasmídeo pPIC9KSm14-MV e seleção de clones recombinante com múltiplas cópias

Para a produção da proteína a cepa GS115 (his4) de P. pastoris foi transformada com o plasmídeo pPIC9K-Sm14. O plasmídeo pPIC9K-Sm14-MV foi purificado com o kit Maxiprep(Qiagen). O DNA plasmideal foi digerido separadamente com as enzimas BglII e SacI (New England Biolabs), usando 20 pg de DNA para cada reação. As reações de digestão foram separadas por eletroforese em gel de agarose e bandas com os fragmentos de DNA contendo a gene sintético da Sm14-MV foram cortados do gel e o DNA purificado.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 17/35

Células competentes para eletroporação da cepa GS115 foram preparadas e transformadas separadamente com o DNA purificado das reações de restrição para BglII e SacI (10 pg de pDNA por cada transformação). A digestão com a enzima BglII dirige a recombinação do cassete de expressão no gene da AOX1, no genoma da P. pastoris, enquanto que a digestão com SacI pode se integrar em outras regiões.

Após a transformação, as células foram semeadas no meio RD (meio sem histidina, que contém: 1 M sorbitol; 2% dextrose; 1,34% YNB; 4x10^-5% biotina; e 0,005% de cada aminoácido: L-glutamato, L-methionina, L-lisina, L-leucina, e L-isoleucina para a seleção das cepas transformadas pelo marcador de auxotrofia his4. Os clones que conseguiram crescer no meio sem histidina, foram submetidos à seleção com o antibiótico G418, nas concentrações 0,5; 1; 2 e 4 mg/ml no meio de cultura YPD (1% Extrato de Levedura, 2% Peptona; 2% dextrose) a 30°C em placas de microcultura. Apenas os clones transformados com o plasmídeo pPIC9K-Sm14MV digerido com a enzima SacI conseguiram crescer com o G418 na concentração 4 mg/ml, que caracteriza a inserção de multiplas cópias do cassete de expressão no genoma de P. pastoris.

Para confirmar se os clones selecionados apresentavam o cassete de expressão do gene sintético, o DNA genômico de 17 clones foi purificado e usado em reações de PCR com os primers AOX5' e AOX3'. O plasmídeo pPIC9K-Sm14-MV foi usado como controle positivo. A Figura 3 mostra a análise por PCR de clones de P. pastoris GS115 transformados com pPIC9KSm14-MV e selecionados com 4mg/ml de G418.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 18/35

M. - phiX174/HaeIII a 17. - Clones GS115/pPIC9K-Sm14-MV

18. - Controle positivo: plasmídeo pPIC9K-Sm14-MV.

Como demonstrado na Figura 3, todos os clones selecionado com 4 mg/ml de G418 apresentaram a seqüência Sm14-MV sintético.

Para testar a expressão da proteína Sm14, os clones foram crescidos em meio BMG (Buffered Minimal Glycerol medium, contendo: 1,34% YNB; 0,04% biotina, 0,1 M fosfato de potássio pH 6,0; e 1% glicerol) por 48 horas e depois transferidos ao meio BMM (Buffered Minimal Methanol medium, contendo os mesmos componentes que o meio BMG, porém o glicerol foi substituído por 0,5% de metanol e adicionado EDTA para concentração final de 1mM), para a indução da expressão da proteína recombinante. Após 72 horas, adicionando 0,5% de metanol cada 24 horas, as proteínas totais de cada clone foram analisadas por SDS-PAGE (Figura 4). A Figura 4 mostra o resultado da indução da expressão da proteína Sm14 nos clones P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14MV.

M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

1. - Controle positivo proteína Sm14 sem fusão purificada de E. coli a 18. - Proteína total dos clones l - 17 GS115/pPIC9KSm14-MV apos a indução com metanol.

1.4 Indução da expressão da Sm14 recombinante em P. pastoris GS115/ pPIC9K-Sm14-MV

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 19/35

A Figura 5 mostra a indução da expressão da proteína Sm14 em P. pastoris GS115/pPIC9K-Sm14-MV, onde:

M.- Low Molecular Weight Marker (Marcador de baixo peso molecular)

1.- Amostra não induzida, no meio BMG a 7.- Indução da expressão por 0, 24, 48, 72 e 91 horas, respectivamente, no meio BMM

8.- Controle positivo proteína Sm14 sem fusão purificada de E. coli

Em todos os clones selecionados foi possível observar uma banda majoritária que coincide com o tamanho da proteína Sm14 sem fusão, purificada de E. coli.

Para confirmar se a proteína foi induzida pelo metanol, o clone n^o 1 foi crescido no meio BMG por 48 horas (Figura 5, canaleta 1) a 250 rpm, a 30^oC e e posteriormente foi transferido para o meio BMM (0,5% de metanol). Foram coletadas amostras de diferentes intervalos de tempo (Figura 5, canaletas 2 a 7). Cada 24 horas o metanol foi adicionado na cultura, para a concentração final de 0,5%.

Como é possível observar na Figura 5, no meio BMG não se obteve a expressão da proteína induzida com o metanol (Figura 5, canaleta 1), assim como no tempo zero com o meio indutor BMM (Figura 5, canaleta 2). A indução foi visível após 24 horas de cultura no meio BMM e foi estável durante o crescimento celular, até as 91 horas que foi o prazo de duração do experimento.

Desta forma, foi comprovada a indução especifica da proteína recombinante correspondente a Sm14 em P. pastoris.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 20/35

No experimento, usando apenas meio BMM e metanol a 0,5%, foi possível atingir um rendimento de 26 gramas de massa celular úmida por litro de cultura, mantendo um bom nível de expressão da proteína Sm14, que compõe a proteína majoritária das células após a indução com metanol. Através do uso de um fermentador e meios mais apropriados para a produção de proteínas recombinantes em P. pastoris, é possível atingir tanto uma maior massa celular, assim como ter uma maior expressão da Sm14.

2. PURIFICAÇÃO DA PROTEÍNA SM14 RECOMBINANTE EXPRESSA NA

CEPA P.	pastoris GS115/	pPIC9K-Sm14-MV
O	protocolo de	purificação	da	proteína	Sm14
recombinante a partir	do citoplasma	de	P. pastoris	foi
baseado	na metodologia desenvolvida	no	Laboratório	de

Esquistossomose Experimental do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) para a purificação da Sm14 sem fusão no sistema de E. coli.

Lise: A purificação da proteína recombinante se inicia com a lise das células de P. pastoris. Para isso, as células são ressuspendidas 30mM Tris-HCl 30mM pH 9,5 e lisadas no French press. O lisado é clarificado por centrifugação (Figura 6, canaleta 2).

Captura: O lisado clarificado é carregado na resina QSepharose XL (GE Healthcare) equilibrada com o tampão A (30 mM Tris-HCl pH 9,5). Toda a proteína Sm14 do lisado é absorvida pela resina, pois não se tem a proteína Sm14 no material não absorvida na resina (Figura 6, canaleta 3). Depois de carregar a proteína, a coluna é lavada com tampão A. A proteína é eluída com tampão B (30 mM Tris-HCl pH

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 21/35

8,0), no sistema AKTA-fplc (GE Healthcare) (Figura 6, canaletas 4 -6) .

Polimento: A proteína eluída da resina Q-sepharose XL apresenta poucas proteínas contaminantes. Para separar estas proteínas da proteína Sm14, foi usada a gelfiltração. Para isso, as frações da cromatografia de troca iônica contendo a proteína Sm14 foram reunídas e concentradas na membrana Centriprep YM-10 (Millipore) e o material foi aplicado na coluna Sephacryl S100 HR 26/60 (GE Healthcare) usando PBS pH 7,4 como fase móvel. A pico cromatográfico (Figura 6, canaleta 8) apresentou um volume de retenção idêntico à proteína sem fusão produzida em E. coli (figura 7).

A Figura 6 mostra o resultado da purificação da proteína Sm14, onde

M.- Low Molecular Weight marker (Marcador de baixo peso molecular)

1. - Controle positivo proteína Sm14 sem fusão purificada de E. coli

2. - Lisado clarificado, 2.- Proteínas não absorvidas na resina Q-sepharose XL

- 6.- Frações eluidas de resina Q-sepharose XL

7. - Pool das frações da cromatográfica de troca iônica

8. - Pico da gel-filtração na coluna sephacryl S-100 HR 26/60

A Figura 7 mostra o resultado do cromatograma da gelfiltração da proteína Sm14-MV produzida em Pichia pastoris.

- ANÁLISE DA PROTEÍNA Sm14 RECOMBINANTE PRODUZIDA EM

Pichia pastoris

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 22/35

A proteína recombinante foi purificada de Pichia pastoris, usando as mesmas características físico-químicas que a proteína Sm14-MV sem fusão expressa em E. coli. A proteína purificada desta forma de P. pastoris corresponde em tamanho com a proteína induzida especificamente pelo metanol. Sendo que no cassete de expressão temos o gene sintético da proteína Sm14-MV sob controle do promotor AOX1, deduzimos que a proteína expressa e purificada de P. pastoris é a proteína Sm14-MV.

Para comprovar esta afirmação, a proteína purificada de P. pastoris foi analisada por western blot, usando soro anti-Sm14 de coelho (Figura 8) . A Figura 8 representa a análise por western blot da proteína purificada de P. pastoris.

e 2.- Proteína Sm14-MV purificada de P. pastoris

3.- Controle positivo proteína Sm14 sem fusão purificada de E. coli.

Neste experimento foi possível observar que os anticorpos anti-Sm14 reconheceram especificamente a proteína purificada de P. pastoris (o soro dos coelhos não reconhece proteínas endógenas de P pastoris, dados não mostrados), confirmando de esta forma sua identidade.

Por fim foi necessário identificar se a proteína purificada de P. pastoris possui estrutura correspondente ao enovelamento beta, característico das proteínas da família das Fatty Acid Binding Protein, à qual a Sm14 pertence. Para isso, as amostras de proteínas foram analisadas por dicroísmo circular, usando o espectrofotopolarímetro J-815 (JASCO) (Figura 9). A Figura

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 23/35 mostra o espectro de dicroísmo circular da proteína Sm14 purificada de P. pastoris.

Como se observa na Figura 9, o espectro corresponde a uma proteína com estrutura beta. Este espectro foi semelhante a os espectros de dicroísmo circular de lotes da proteína Sm14 purificados anteriormente de E. coli no laboratório de Esquistossomose Experimental.

Assim, a partir do relato acima podemos concluir que a presente invenção permite:

desenhar e sintetizar um gene sintético para a alta expressão da proteína Sm14-MV em Pichia pastoris;

construir um plasmídeo de expressão pPIC9K-Sm14-MV que contém a seqüência do gene sintético sob controle do promotor AOX1;

obter uma cepa de P. pastoris produtora da proteína Sm14; e, purificar a proteína Sm14 em duas etapas cromatográficas, factíveis de escalonamento para sua produção industrial.

Portanto, a presente invenção aqui descrita mostra que a proteína Sm14 confere proteção contra a infecção por Schistosoma mansoni em camundongos, nas plataformas E. coli e P. pastoris.

REFERENCIAS (1) Cregg, J.M., Vedvick, T.S. and Raschke, W.C.. Recent advances in the expression of foreign genes in Pichia pastoris. BioTechnology v. 11, p. 905-910, 1993.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 24/35 (2) Faber, K.N., Harder, W., and Veenhuis, M. Review:

Methylotropic Yeasts as Factories for the Production of Foreign Proteins. Yeast. v. 11, p. 1331-1344, 1995.

(3) Ramos, C.R., Spisni, A., Oyama, S.Jr., Sforça, M.L., Ramos, H.R, Vilar, M.M., Alves, A.C., Figueredo, R.C., Tendler, M., Zanchin, N.I., Pertinhez, T.A., Ho, P.L. Stability improvement of the fatty acid binding protein Sm14 from S. mansoni by Cys replacement: structural and functional characterization of a vaccine candidate. Biochim

Biophys Acta. v. 1794, p. 655 - 662, 2009.

(4) Ramos, C.R., Vilar, M.M., Nascimento, A.L., Ho, P.L., Thaumaturgo, N., Edelenyi, R., Almeida, M., Dias, W.O., Diogo, C.M., Tendler, M. r-Sm14 - pRSETA efficacy in experimental animals. Mem Inst Oswaldo Cruz.v. 96, p.131 135, 2001.

(5) Roymondal, U.D. and Sahoo, S.S. Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application to Escherichia coli genome. DNA Res. v. 16, p.

- 30, 2009.

(6) Tendler, M., Brito, C.A., Vilar, M.M., Serra-Freire,

N., Diogo, C.M., Almeida, M.S., Delbem, A.C., Da Silva,

J.F., Savino, W., Garratt, R.C., Katz, N., Simpson, A.S. A

Schistosoma mansoni fatty acid-binding protein, Sm14, is the potential basis of a dual-purpose anti-helminth vaccine. Proc Natl Acad Sci U S A. v. 93, p. 269 - 273,

1996.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 25/35

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Processo de produção de proteína Sml4 recombinante em Pichia pastoris, caracterizado pelo fato de que consiste de:

(a) sintetizar o gene definido pela SEQ ID NO :3; (b) clonagem do gene sintetizado na etapa (a) no vetor pPIC9K, pelo sítio de BamHI e reconstituindo a sequência Kozak do gene AOXl antes do códon de início da proteína Sm14, para expressão de proteína Sml4 em forma intracelular; e (c) transformação da P. pastoris com o plasmídeo pPIC9K-Sm14-MV e seleção de clones recombinantes com

múltiplas cópias.
2. Processo de purificação de proteína recombinante expressa em Pichia pastoris obtida em um processo de produção como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de consistir nas seguintes etapas:

(a) efetuar a lise das células de P. pastoris;

(b) clarificar o lisado obtido na etapa (a);

(c) carregar o lisado clarificado em resina de troca aniônica e depois de carregar a proteína, a proteína é eluída por troca de pH na coluna; e (d) separar as proteínas contaminantes da recombinante por gel-filtração.

Petição 870190068257, de 18/07/2019, pág. 26/35