BRPI1003912A2

BRPI1003912A2 - mÉtodo para produzir um meio nutritivo melhorado

Info

Publication number: BRPI1003912A2
Application number: BRPI1003912-0A
Authority: BR
Inventors: Jeffrey E Hartle; William C Carlson
Original assignee: Weyerhaeuser Nr Co
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2010-09-24
Publication date: 2013-01-29
Also published as: CA2713838A1; CA2713838C; UY32910A; SE535083C2; US20110076772A1; ZA201202203B; AU2010219386B2; SE1051015A1; US8871514B2; AU2010219386A1

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM MEIO NUTRITIVO MELHORADO Em um aspecto, é provido um método para produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende um material adsorvente para a cultura de embriões de planta.

Description

"MÉTODO PARA PRODUZIR UM MEIO NUTRITIVO MELHORADO"

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a métodos para a produção de meios nutritivos melhorados para o crescimento e/ou a germinação de embriões de planta.

FUNDAMENTOS

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E freqüentemente desejável plantar grandes quantidades de plantas geneticamente idênticas, que foram selecionadas como tendo propriedades vantajosas, mas, em muitos caos, não é exeqüível produzir tais plantas usando técnicas de procriação convencionais. A cultura in vitro de embriões de planta somáticos ou zigóticos pode ser usada para a produção de grandes números de embriões geneticamente idênticos, que possuem a capacidade de se desenvolverem como plantas normais. No entanto, os embriões resultantes carecem de estruturas protetoras e nutritivas, encontradas em sementes botânicas naturais, que protegem o embrião da planta no interior da semente contra o ambiente do solo severo e nutrem o embrião durante os estágios críticos da semeadura e da germinação. Foram efetuadas tentativas para prover tais estruturas protetoras e nutritivas através do uso de sementes manufaturadas, mas, até o momento, a germinação a partir de sementes manufaturas é menos bem sucedida do que a partir de sementes naturais. Permanecem ainda grandes diferenças entre as sementes manufaturadas e as sementes naturais correspondentes. Enquanto que o embrião depende do megagametófito quanto aos nutrientes úteis para a germinação, o embrião em uma semente manufaturada depende do meio nutritivo, que é provido na semente manufaturada.

Portanto, existe uma necessidade quanto à geração de um meio nutritivo melhorado, de um modo a que sejam melhoradas as taxas de conversão para as sementes manufaturadas contendo embriões somáticos, de um modo a prover um grande número de germinantes normais. A presente invenção aborda esta e outras necessidades.

SUMÁRIO

De acordo com um aspecto da invenção, é provido um método para produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende um material adsorvente para a cultura de células de planta. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende (a) determinar se existe um decréscimo na concentração de um ou mais componentes em um primeiro meio nutritivo, após a incubação com uma quantidade desejada de um material adsorvente; e (b) produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende os mesmos componentes que o primeiro meio nutritivo, em que o meio nutritivo melhorado compreende: (i) uma concentração aumentada de um ou mais componentes, que foi determinada do estágio (a), de um modo a que seja diminuída em concentração na presença do material absorvente; e (ii) o mesmo tipo de material absorvente, em uma faixa de concentração de dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com o estágio (a).

De acordo ainda com um outro aspecto da invenção, é provido um método para produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende um material adsorvente para a cultura de células de planta. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende: (a) incubar um primeiro meio nutritivo, que compreende uma concentração inicial predeterminada de componentes compreendendo uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, minerais e aminoácidos, com uma quantidade desejada de material adsorvente, a ser adicionada a um meio nutritivo melhorado; (b) determinar se houve um decréscimo na concentração de um ou mais dos componentes no primeiro meio nutritivo após a incubação de acordo com o estágio (a), quando comparada com a concentração do componente inicial predeterminada; e (c) produção de um meio nutritivo melhorado, que compreende os mesmos componentes que o primeiro meio nutritivo, em que o meio nutritivo melhorado compreende: (i) uma concentração aumentada de um ou mais componentes, que foi determinada no estágio (b), de um modo a que seja diminuída em concentração na presença do material absorvente; e (ii) o mesmo tipo de material absorvente em uma faixa de concentração dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com o estágio (a).

Os métodos de produção de um meio nutritivo melhorado são úteis para o crescimento e/ou a germinação de um embrião de planta, tal que um embrião de conífera.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Os aspectos precedentes e muitas das vantagens pertinentes desta invenção serão mais prontamente apreciados, pois os mesmos se tornam melhor entendidos por referência à descrição detalhada que se segue, quando tomada em conjunção com os desenhos anexos, nos quais:

A FIGURA 1 é uma vista planar em seção transversal de uma semente manufaturada exemplar, que compreende um embrião de planta de acordo com várias modalidades da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção provê sementes manufaturadas, que compreendem um meio nutritivo modificado, que resulta em uma freqüência de germinação melhorada em comparação com sementes manufaturadas, que compreendem um meio nutritivo convencional contendo carvão vegetal tratado com nutriente.

Como aqui usado, "um embrião somático de planta" refere-se a um embrião produzido através do cultivo de células de planta totipotentes, tais que o tecido meristemático, sob condições laboratoriais, nas quais as células que compreendem o tecido, são separadas, uma da outra, e são pressionadas para desenvolverem, dentro de minutos, embriões completos. De um modo alternativo, os embriões somáticos podem ser produzidos através de "poliembriogenia por clivagem" de embriões zigóticos. Os métodos para a produção de embriões somáticos de planta, adequados para o uso nos métodos da invenção, são convencionais na técnica e foram previamente descritos (vide, por exemplo, as Patentes U.S. N0 s 4. 957. 866; 5. 034. 326; 5.036.007; 5.041. 382; 5.236. 841; 5. 294. 549; 5.482. 857; 5. 563.061; e 5. 821. 126). Por exemplo, o tecido da planta pode ser cultivado em um meio de iniciação, que inclui hormônios, de um modo a iniciar a formação de células embriogênicas, tais que as massas de suspensão embriônicas, que são capazes de se desenvolverem como embriões somáticos. As células embriogênicas podem ser então adicionalmente cultivadas em um meio de manutenção, que promove o estabelecimento e a multiplicação de células embriogênicas. Subseqüentemente, as células embriogênicas multiplicadas podem ser cultivadas em um meio de desenvolvimento, que promove o desenvolvimento de embriões somáticos, que podem ser adicionalmente submetidos a tratamentos pós-desenvolvimento, tais que tratamentos a frio. Os embriões somáticos, usados nos métodos da invenção, completaram o estágio de desenvolvimento do processo de embriogênese somática. Eles podem ser também submetidos a um ou mais tratamentos pós-desenvolvimento.

De um modo típico, os embriões somáticos da planta, usados na invenção, possuem uma extremidade de broto e uma extremidade de raiz. Em algumas espécies de plantas, a extremidade de broto inclui um ou mais cotiledôneos (estruturas similares a folha) em algum estágio do desenvolvimento. Os embriões de planta, adequados para o uso nos métodos da invenção, podem ser embriões a partir de qualquer espécie de planta, tais que plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas ou gimnoespermas, tais que os embriões zigóticos ou somáticos de conífera (isto é, o pinheiro, tal que o pinheiro teda, pinheiro, ou conífera norte-americana). Para o uso em sementes manufaturadas de acordo com a presente invenção, o embrião da planta é suficientemente desenvolvido, de um modo a que apresente uma extremidade de broto e uma extremidade de radícula. Em certas espécies de plantas, a extremidade do broto inclui um ou mais cotiledôneos em algum estágio de desenvolvimento. Em outros tipos de plantas, o(s) cotiledôneo(s) está(ão) situados em outros locais, que não a extremidade de broto.

Como aqui usado, o termo "germinação" refere-se a um processo fisiológico, que resulta no alongamento de um embrião de planta ao longo de seu eixo, e estão completo quando o embrião foi alongado até o ponto de protrusão através do revestimento da semente ou a capa da semente manufaturada.

Como aqui usado, o termo "germinação completa" refere-se a uma semente manufaturada tendo uma protrusão de raiz através do revestimento da semente ou da capa de semente manufaturada.

Uma semente manufaturada para o uso na invenção compreende um embrião de planta, um revestimento de semente manufaturado, e um meio nutritivo. A FIGURA 1 é uma vista planar em seção transversal de uma semente manufaturada exemplar 20, que compreende um embrião de planta 42, disposto no interior da mesma. Tal como mostrado na FIGURA 1, o embrião 42 está disposto no interior de uma cavidade 34, está em contato funcional com o meio nutritivo 26 e está vedado no mesmo, de um modo adequado, através de uma vedação extrema viva 43. Será entendido que a FIGURA 1 provê uma modalidade representativa de uma semente manufaturada 20, que compreende um embrião de planta, um revestimento de semente manufaturado, que circunda o embrião somático da planta compreendendo um orifício, um meio nutritivo em contato funcional com o embrião da planta, e uma capa vedando o embrião somático da planta no interior da semente manufaturada; no entanto, o método não está limitado à modalidade particular da semente manufaturada mostrada na FIGURA 1. Na modalidade exemplar mostrada na figura 1, a semente manufaturada 20 compreende um revestimento de semente 24, um meio nutritivo 26, uma vedação extrema morta 28, e uma capa ciliar opcional 22 (restrição de broto). Na modalidade exemplar mostrada na FIGURA 1, a semente manufaturada 20 compreende um embrião de planta 42, um revestimento de semente 24, um meio nutritivo em contato funcional com o embrião da planta e uma capa ciliar opcional 22 (restrição do broto).

Como aqui usado, um "revestimento de semente manufaturado" refere-se a uma estrutura análoga a um revestimento de semente natural, que protege o embrião da planta e outras estruturas da semente manufaturada contra o dano mecânico, dessecação, contra o ataque por micróbios, fungos, insetos, nematódeos, pássaros, e outros patógenos, herbívoros e pestes, dentre outras funções. O revestimento de semente 24 pode ser fabricado a partir de uma variedade de materiais, que incluem, mas não limitados a, materiais celulósicos, vidro, plástico, plástico moldável, resinas poliméricas curadas, parafina, ceras, vernizes, e combinações dos mesmos, tais que um papel impregnado com cera. Os materiais a partir dos quais o revestimento da semente é produzido são, de um modo geral, não- tóxicos e fornecem um grau de rigidez. O revestimento da semente pode ser biodegradável embora, de um modo típico, o revestimento da semente permaneça intato e resistente à penetração por patógenos de planta, ou até a emergência do embrião em germinação. O revestimento da semente pode ser formado a partir de uma seção de material tubular. O revestimento da semente pode ser uma palha ou um material fibroso seccionado, tal que o papel. As seções de palha podem ser previamente tratadas em um material de revestimento adequado, tal que a cera. De um modo alternativo, o revestimento da semente pode ser formado a partir de uma seção tubular de material plástico biodegradável. Um tal material é o ácido poliláctico ("PLA") e é vendido por MAT-UR de Los Angeles, Califórnia. Um outro material adequado é uma mistura de policaprolactona ("PCL"), tal que CAPA 6800 (Perstorp polyols Inc., Toledo, OK 43 612), com ou sem 1 % de plastificante Tegomer SI6440 (Degussa Goldschmidt Chemical Corp. 914, East Randolph Road, Hopewell, Virgínia 23 860). Tais tubos plásticos biodegradáveis podem ou não requerer um revestimento de cera, pois tais tubos já são resistentes a elementos ambientais. Os aditivos, tais que os antibióticos e os reguladores de crescimento de planta, podem ser adicionados ao revestimento da semente, por exemplo, através da incorporação no material, que forma uma ou mais das camadas do revestimento da semente ou através de revestimento ou tratando, de um outro modo, a(s) camada(s) com o aditivo através de meios convencionais.

A capa ciliar 22, também conhecida como restrição de broto, ou restrição de cotiledôneo, é manufaturada, de um modo adequado, a partir de um material poroso, que apresente uma dureza suficientemente forte para resistir à perfuração ou à fratura pelo embrião em germinação, tal que um material cerâmico ou de porcelana, e inclui uma porção de vedação extrema e uma porção de restrição de cotiledôneo 32. A porção de restrição de cotiledôneo possui uma superfície interior para contatar e circundar pelo menos a extremidade de broto de um embrião de planta e resiste à penetração pela extremidade do embrião durante a germinação. A restrição de broto evita com que a extremidade de broto do embrião, tais que os cotiledôneos, se desenvolvam ao interior do, e sejam retidas no meio nutritivo (também referido como o meio gametófito). A porção de restrição de cotiledôneo 32 está formada, de um modo adequado, integralmente ou unitariamente com a porção de vedação 30. A capa ciliar 22 também inclui uma cavidade, que se estende longitudinalmente 34, estendendo-se através da porção de vedação final e parcialmente através de uma extremidade da porção de restrição do cotiledôneo 32. A extremidade aberta da cavidade 34 é conhecida como uma abertura de restrição de cotiledôneo 36. A cavidade 34 é dimensionada de um modo a receber um embrião de planta 42 na mesma. Tal como mostrado na FIGURA 1, a capa ciliar 22 compreende uma pluralidade de poros 27, em que os poros 27 permitem com que o meio nutritivo 26 acesse a parte interna da cavidade 34, que compreende o embrião 42, e, deste modo, permita com que o meio nutritivo 26 contate, de um modo funcional, o embrião 42, sob condições suficientes para gerar um embrião condicionado, tal como aqui descrito.

A restrição é porosa, de um modo a permitir o acesso do embrião à água, nutrientes, e oxigênio. A restrição do broto pode ser fabricada a partir de qualquer material adequado, incluindo, mas não limitado a, materiais vítreos, metálicos, elastoméricos, cerâmicos, argilosos, adesivos, cimento, amido, tipo argamassa, poliméricos sintéticos, poliméricos naturais, e materiais adesivos. As restrições de broto exemplares estão descritas na Patente U. S. N0 5. 687. 504 (por exemplo, Col. 3, linha 61, a Col. 4, linha 13; Col. 18, linha 7, a Col. 22, linha 2) incorporadas a este, a título referencial.

Como a seguir mostrado na FIGURA 1, em algumas modalidades da semente manufaturada 20, o material de enchimento 80 circunda, de um modo completo ou parcial, o embrião 42, e aumenta a área superficial do embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26, deste modo provendo vias múltiplas para que os nutrientes a partir do meio nutritivo 26 passem para o embrião 42. Embora seja preferido que o material de enchimento 80 centralize, de um modo substancial, o embrião 42 no interior da cavidade 34, o embrião 42 não precisa estar posicionado deste modo. O material de enchimento 80 precisa apenas posicionar o embrião 42 no interior da cavidade 34, de qualquer modo, para colocar o embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26. Além disso, em algumas modalidades da invenção, o material de enchimento 80 precisa apenas encher, seja de um modo completo ou gradual, um dos dois lados do espaço entre o embrião 42 e as paredes da cavidade 34.

De um modo preferido, o material de enchimento 80 é um adsorvente, tal que carvão vegetal ativado, resinas Dowex, zeólitos, alumina, argila, terra diatomácea, sílica gel, e Kieselguhr. Durante a montagem da semente manufaturada 20, o material de enchimento 80 é depositado no interior da cavidade 34 da capa ciliar 22, de qualquer modo conhecido na arte, inclusive manualmente. O material de enchimento 80 é, de um modo preferido, mas não necessário, depositado no interior da cavidade 34, de um modo tal que ele centralize substancialmente o embrião 42 no interior da cavidade 34. A centralização do embrião 42 no interior da cavidade 34 aumenta a área superficial do embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26. Como aqui usado, o termo "contato funcional" tem a intenção de compreender em uma posição, em que o embrião 42 absorva os nutrientes a partir do meio nutritivo 26.

Em algumas modalidades, o material de enchimento 80 é o carvão vegetal. De um modo preferido, o carvão vegetal está sob a forma de um pó e é ativado através de tratamento prévio com um ácido, tal que HCl, ou ácido fosfórico. O carvão vegetal ativado está comercialmente disponível. Por exemplo, o carbono ativado NORIT® CNSP ou DARCO® KB-G são produzidos através de ativação, usando um processo de ácido fosfórico e estão disponíveis a partir de Norit Américas Inc., Marshall, Texas, 75671.

Em algumas modalidades, o material de enchimento 80 é carvão vegetal tratado com nutriente. Como aqui usado, o termo carvão vegetal "tratado com nutriente" refere-se a um carvão vegetal que tenha estado em contato com um meio que contenha uma variedade de nutrientes, tais que uma fonte de carbono, vitaminas, minerais, e aminoácidos, de um modo tal que o carvão vegetal absorva e retenha os nutrientes a partir do meio. Um meio representativo, usado para preparar o carvão vegetal tratado com nutriente é o meio KE 64, tal como descrito no Exemplo 1. Um método exemplar para preparar o carvão vegetal tratado com nutriente para o uso como um material de enchimento para a inserção no interior da cavidade 34 é provido no Exemplo 1.

De acordo com as sementes manufaturadas e com os métodos da invenção, o meio nutritivo 26 (de um outro modo referido como o "meio de gametófito") está em contato funcional com o embrião da planta, disposto no interior da semente manufaturada 20. Como aqui usado, um "meio nutritivo" refere-se a uma fonte de nutrientes, tais que vitaminas, minerais, carbono, e fontes de energia, e a outros compostos benéficos usados pelo embrião durante a germinação. Deste modo, o meio nutritivo é análogo ao gametófito de uma semente natural.

De acordo com um aspecto da invenção, é provido um método para produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende um material adsorvente para a cultura de células de planta. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende (a) determinar se existe um decréscimo na concentração de um ou mais componentes em um primeiro meio nutritivo após a incubação com uma quantidade desejada de material adsorvente ; e (b) produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende os mesmos componentes que o primeiro meio nutritivo, em que o meio nutritivo melhorado compreende : (i) uma concentração aumentada de um ou mais componentes que foram determinados no estágio (a), de um modo a que diminuam em concentração na presença do material absorvente ; e (ii) o mesmo tipo de material absorvente, em uma faixa de concentração de dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com o estágio (a).

De acordo com um outro aspecto da invenção, é provido um método para produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende um material adsorvente para a cultura de células de planta. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende : (a) incubar um primeiro meio nutritivo, que compreende uma concentração inicial predeterminada dos componentes, compreendendo uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, minerais e aminoácidos com uma quantidade desejada de material adsorvente a ser adicionada a um meio nutritivo melhorado; (b) determinar se existe um decréscimo na concentração de um ou mais dos componentes no primeiro meio nutritivo após a incubação de acordo com o estágio (a), quando comparada à concentração inicial predeterminada do componente ; e (c) produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende os mesmos componentes que o primeiro meio nutritivo, em que o meio nutritivo melhorado compreende : (i) uma concentração aumentada de um ou mais componentes, que foram determinados no estágio (b), de um modo a que ocorra um decréscimo na concentração na presença do material absorvente; e (ii) o mesmo tipo de material absorvente, em uma faixa de concentração de dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com o estágio (a).

Os métodos da presente invenção são úteis para preparar um meio nutritivo melhorado, que compreende um material absorvente, tal que carvão vegetal, para o uso no crescimento e/ou germinação de embriões de planta. O meio nutritivo melhorado, gerado de acordo com a invenção, é útil para a manufatura e germinação de sementes manufaturadas em uma variedade de diferentes contextos. De acordo com os vários aspectos da invenção, um primeiro

meio nutritivo, que compreende uma concentração inicial predeterminada de componentes, que compreendem uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, minerais e aminoácidos é incubado com um material adsorvente durante um período de tempo suficiente para que os vários componentes do meio sejam adsorvidos ao material adsorvente. Períodos de tempo adequados para a incubação do primeiro meio nutritivo com a composição adsorvente estão em uma faixa de pelo menos cerca de 10 minutos a vários dias ou uma semana, ou um período mais, longo, tal que de pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas, até 24 horas, 48 horas, ou ainda mais longo.

Os materiais adsorventes para o uso nos métodos de produção de um meio nutritivo modificado (ou melhorado) incluem, mas não estão limitados a, carvão vegetal polivinil polipirrolidona, e sílica géis. Em algumas modalidades, o material adsorvente no primeiro meio nutriente e modificado (melhorado) é de 1,0 g/L a 100 g/L de carvão vegetal. Em algumas modalidades, o carvão vegetal adicionado ao primeiro meio nutritivo e modificado (melhorado) é de 1,0 g/L a 100 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente (tal que, por exemplo, de 5 g/L, 20g/L a 100 g/L, de 50 g/L a 100 g/L, de 60 g/L a 100 g/L, ou de 50 g/L a 80 g/L, ou de cerca de 60 g/L). Como aqui usado, o termo carvão vegetal "tratado com não-nutriente", por exemplo, carvão vegetal simples, ou carvão vegetal ativado) que não tenha estado em contato com meios que contenha uma variedade de nutrientes, tais que uma fonte de carbono, vitaminas, minerais, e aminoácidos, de um modo tal que o carvão vegetal absorva e retenha nutrientes a partir do meio.

De acordo com este aspecto da invenção, o primeiro meio nutritivo e modificado (melhorado) inclui o mesmo tipo de composição absorvente (por exemplo, carvão vegetal). A concentração de composição adsorvente no meio nutritivo melhorado está, de um modo típico, dentro de uma faixa de concentração, que é de duas vezes a cinco vezes aquela da concentração do adsorvente que foi incubado no primeiro meio nutritivo. Em algumas modalidades do método, a concentração da composição adsorvente no meio nutritivo melhorado pé a mesma que a concentração de adsorvente, que foi incubado no primeiro meio nutritivo.

Após o primeiro meio nutritivo ter sido incubado com a composição adsorvente de acordo com o estágio (a), é executada uma análise de um modo a determinar se existe um decréscimo na concentração de um ou mais dos componentes no primeiro meio nutritivo após a incubação, quando comparada com a concentração inicial do componente no primeiro meio nutritivo. Por exemplo, as TABELAS 3 e 4 mostram uma comparação dos componentes do meio, antes e após a incubação com carvão vegetal. Para um ou mais componentes do meio nutritivo, determinado como tendo decrescido no primeiro meio nutritivo após a incubação com o material adsorvente, é efetuado um ajuste de um modo a aumentar a concentração de um ou mais componentes no meio nutritivo melhorado. Em algumas modalidades do método, é efetuado um ajuste, de um modo tal que o aumento na concentração do componente no meio nutritivo melhorado corresponda a um decréscimo na concentração, observado no primeiro meio nutritivo, após a composição com a composição adsorvente. Em algumas modalidades do método, o ajuste é efetuado até a concentração do componente no meio nutritivo melhorado, que ainda considere pelo menos um de (1) o efeito da concentração aumentada do componente particular sobre o pH total do meio; (2) a interação com outros componentes no meio (isto é, a precipitação); ou (3) um nível máximo de um componente particular com relação à viabilidade do embrião da planta a ser contatada com o meio nutritivo.

Em algumas modalidades, o método de acordo com este aspecto da invenção é executado na preparação para o escalonamento, de um modo tal que o primeiro meio nutritivo incubado com a composição adsorvente de acordo com o estágio (a) possua um volume, que é de cerca de 1/4 a 1/100 (tal que de 1/5, 1/10, 1/50, 1/75 a até 1/100) do volume total do meio nutritivo melhorado de acordo com o estágio (c).

Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente dispor o primeiro meio nutritivo do estágio (a) no interior de um primeiro conjunto de sementes manufaturadas e dispor o meio nutritivo melhorado do estágio (c) no interior de um segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocando um embrião de conífera em contato funcional com o meio nutritivo em cada uma das sementes manufaturadas a partir do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocando as sementes manufaturadas no interior de um ambiente condutivo para o crescimento da planta e comparando as freqüências de germinação dos embriões a partir do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas, de um modo a determinar se existe um efeito do meio nutritivo melhorado sobre a freqüência de germinação.

De acordo com este aspecto da invenção, o primeiro meio nutritivo e o meio nutritivo modificado (melhorado) incluem, de um modo típico, os mesmos componentes, em que o meio nutritivo modificado (melhorado) compreende uma concentração aumentada de pelo menos um ou mais dos componentes, quando comparado ao primeiro meio nutritivo. Em algumas modalidades do método, o primeiro meio nutritivo e modificado compreende pelo menos dois componentes, selecionados a partir do grupo, que consiste de NH4NO3, KH2PO4, Mio-inositol, Tiamina-HCl, Piridoxina-

r r

HCl, Acido Nicotínico, Ribloflavina, Pantotenato de Ca, Biotina e Ácido Fólico, DL-serina, L-prolina, L-arginina-HCL e L-alanina.

O meio nutritivo também inclui, de um modo típico, CuCl2, CaCl2, MgSO4, citrato férrico, MnCl2, H3BO3, ZnSO4, e (NH4)2MoO4, tal como descrito com referência ao meio designado por "MS09", conforme descrito nos Exemplos 1, 3 e 4 neste. Em algumas modalidades, o meio nutritivo melhorado inclui FeSO4 em uma concentração de cerca de 5mg/L a mg/L, tal que de cerca de 10 mg/L a cerca de 15 mg/L. Em algumas modalidades, o meio nutritivo melhorado inclui MgSO4 em uma concentração de cerca de 600mg/L a cerca de 1500 mg/L, tal que de cerca de 800 mg/L a cerca de 1200 mg/L.

O meio nutritivo pode compreender também aminoácidos. Os aminoácidos adequados podem incluir aminoácidos comumente encontrados incorporados em proteínas, assim como aminoácidos não comumente encontrados em proteínas incorporadas, tais que o succinato de arginina, citrulina, canavanina, ornitina, e D-estereoisômeros. Em uma modalidade, o meio nutritivo também inclui pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo, que consiste de a partir de 85 mg/L a 100 mg/L de DL-serina; de 55 mg/L a 70 mg/L de L-prolina, de 300 mg/L a 600 mg/L de L-arginina-HCL, e de 55 mg/L a 70 mg/L de L-alanina. O meio nutritivo compreende ainda, de um modo típico, uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, e minerais. As fontes de carbono incluem, mas não estão limitadas a, monossacarídeos, dissacarídeos, e/ou amidos. O meio nutritivo modificado pode também incluir um ou mais compostos envolvidos no metabolismo de nitrogênio, tais que uréia ou poliaminas.

O meio nutritivo pode ainda incluir substâncias que portam oxigênio, de um modo a aumentar tanto a absorção de oxigênio, como a retenção de oxigênio pelo meio nutritivo, deste modo permitindo com que o meio mantenha uma concentração de oxigênio, que é mais alta do que a que estaria presente de um outro modo no meio unicamente a partir da absorção de oxigênio a partir da atmosfera. Substâncias, que portam oxigênio exemplares, incluem perfluorocarbonos, tais que FC-77, e tensoativos, tais que Pluronic F-68, disponível de BASF Corp. Parsippany, N. J. As substâncias que portam oxigênio exemplares estão descritas na Patente U. S. N0 5.564.224 (por exemplo, Col. 9, linha 44, a Col. 11, linha 67), incorporadas a este a título referencial.

O meio nutritivo pode também conter hormônios. Os hormônios adequados incluem, mas não estão limitados a, ácido abscísico, citoquininas, auxinas, e giberelinas. O ácido abscísico é um hormônio de planta sequiterpenóide, que está implicado em uma variedade de processos fisiológicos da planta (vide, por exemplo, Milborrow, J. Exp. Botany 52: 1145-1164 (2001); Leung & Giraudat, Ann. Rev. Plant. Physiol Plant Mol Biol. 49: 199-123 (1998)). As auxinas são hormônios o crescimento da planta, que promovem a divisão e o crescimento celular. As auxinas exemplares para o uso no meio de germinação incluem, mas não estão limitadas a, ácido 2,4- diclorofenoxiacético, ácido indol-3-acético, ácido indol-3-butírico, ácido naftaleno acético e ácido clorogênico. As citoquininas são hormônios do crescimento da planta, que afetam a organização de células que se dividem. As citoquininas exemplares, para o uso no meio de germinação, incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, 6-benzilaminopurina, 6- furfurilaminopurina, diidrozeatina, zeatina, quinetina e zeatina ribosídeo. As giberelinas constituem uma classe de hormônios de planta diterpenóides (vide, por exemplo, Krishnamoorthy, Gibberellins and Plant Growth, John Wiley & Sons (1975)). Exemplos representativos de giberelinas, úteis na prática da presente invenção, incluem o ácido giberélico, giberelina 3, giberelina 4 e giberelina 7. Um exemplo de uma mistura útil de giberelinas é uma mistura de giberelina 4 e de giberelina 7 (referida como a giberelina 4/7), tal que a giberelina 4/7, vendida por Abbott Laboratoires, Chicago, Illinois. Quando o ácido abscísico está presente no meio nutritivo modificado, ele é, de um modo típico, usado em uma concentração na faixa de a partir de cerca de 1 mg/L a cerca de 200 mg/L. Quando presente no meio nutritivo, a concentração de giberelina(s) está, de um modo típico, entre cerca de 0,1 mg/L e cerca de 500 mg/L. As auxinas podem ser usadas, por exemplo, em uma concentração de a partir de 0, 1 mg/L a 200 mg/L. As citoquininas podem ser usadas, por exemplo, em uma concentração de a partir de 0,1 mg/L a 100 mg/L.

O meio nutritivo pode também incluir agentes antimicrobianos. Os agentes antimicrobianos adequados estão disponíveis de Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, vendidos como o Produto # A 5955. Os agentes antimicrobianos podem ser usados, por exemplo, em uma concentração de 1 ml/L.

O métodos da invenção podem ser também executados com meio nutritivos, que incluem uma substância, que causa com que o meio seja um semi-sólido, ou que possua uma consistência congelada sob uma condição ambiental normal. Por exemplo, o meio nutritivo pode estar sob a forma de um gel hidratado. Um "gel" é uma substância, que é preparada como uma solução coloidal, e que irá, ou será causada a, formar um material semi-sólido. Uma tal conversão de uma solução de gel líquido em um material semi-sólido é aqui denominada "cura" ou "sedimentação" do gel. Um "gel hidratado" refere-se a um gel contendo água. Tais géis são preparados primeiramente pela dissolução em água (em que a água serve como o solvente, ou a "fase contínua), que, mediante a cura, é combinada com a fase contínua, de um modo a formar o material semi-sólido. Deste modo, a água é associada, de um modo homogêneo, com as moléculas solutas, sem que experimente qualquer separação substancial da fase contínua a partir da fase dispersa. No entanto, as moléculas de água podem ser livremente retiradas a partir de um gel hidratado durado, tal que através da evaporação ou da inibição, por um embrião em germinação. Quando curados, estes géis adquirem as características de sólidos resilientes, tais que uma massa de gelatina, em que a resiliência se torna progressivamente menor, e o gel se torna mais "sólido "ao toque, à medida que a quantidade relativa de água no gel é diminuída.

Em adição a ser solúvel em água, os solutos de gel adequados não são citotóxicos, nem substancialmente fitotóxicos. Como aqui usada, uma substância "substancialmente não-fitotóxica" é uma substância que não interfere, de um modo substancial, com o desenvolvimento da planta normal, tal que pela exterminação de um número substancial de células da planta, alterando, de um modo substancial, a diferenciação celular ou a maturação, causando mutações rompendo um número substancial de membranas celulares, ou rompendo, de um modo substancial, o metabolismo celular, ou rompendo, de um modo substancial, um outro processo.

Os solutos de gel candidatos incluem, mas não estão limitados, aos seguintes : alginato de sódio, ágar, agarose, amilose, pectina, dextrano, gelatina, amido, amilopectina, celuloses modificadas, tais que metil celulose e hidroxietil celulose, e poliacrilamida. Outros solutos de gel hidrofílicos podem ser também usados, desde que eles possuem propriedades de hidratação e de gelação similares e que careçam de toxicidade. Os géis são, de um modo típico, preparados através da dissolução de um soluto de gel, de um modo usual, em uma forma em partículas finas, em água, de um modo a formar uma solução de gel. Dependendo do soluto de gel particular, o aquecimento é, de um modo usual, necessário, algumas vezes até a fervura, até que o soluto de gel seja dissolvido. O resfriamento subsequente irá causar com que muitas soluções de gel sejam "sedimentadas" ou curadas (sejam transformadas em gel), de um modo reversível. Os exemplos incluem gelatina, ágar e agarose. Os solutos de gel são denominados "reversíveis" porque o reaquecimento do gel curado irá formar novamente a solução do gel. Soluções de solutos de gel requerem um agente de "complexação", que serve para curar, de um modo químico, o gel, através da reticulação de moléculas de soluto de gel. Por exemplo, o alginato de sódio é curado através da adição de nitrato de cálcio (Ca(NO3)2) ou de sais de outros íons divalentes, tais que, mas não limitados a, cálcio, bário, chumbo, cobre, estrôncio, cádmio, zinco, níquel, cobalto, magnésio e ferro, à solução de gel. Muitos dos solutos de gel, que requerem agentes de complexação, se tornam curados de um modo irreversível, em cujo caso o reaquecimento não irá estabelecer novamente a solução do gel.

A concentração de soluto de gel, requerida para que seja preparado um gel satisfatório de acordo com a presente invenção, varia, dependendo do soluto de gel particular. Por exemplo, uma concentração útil de alginato de sódio está dentro de uma faixa de cerca de 0,5% p/v, a cerca de 2,5% p/v, de um modo preferido de cerca de 0,9% p/v a 1, 5% p/v. Uma concentração útil de ágar está dentro de uma faixa de cerca de 0,8% p/v a cerca de 2,5% p/v, de um modo preferido de cerca de 1, 8% p/v. De um modo geral, os géis curados através de complexação requerem menos soluto de gel para formar um gel satisfatório do que os géis "reversíveis".

Através da prática dos métodos deste aspecto da invenção, os presente inventores geraram um meio nutritivo modificado (melhorado) para o uso em sementes manufaturadas, tal como descrito no Exemplo 2. Tal como descrito nos Exemplos 3 e 4, verificou-se ainda, através de experimentação, que uma semente manufaturada, compreendendo um meio nutritivo modificado, compreendendo de 10 g/L a 100 g/L de um material adsorvente tratado com não-nutriente, e de 350 mg/L a 450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de: de 150 mg/ml a 300 mg/ml de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina -HC1, de 0, 30 mg/L a 0,80 mg/L de piridoxina-HCl, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de ácido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0, 30 mg/L de ácido Fólico, provê um aperfeiçoamento na taxa de germinação e na normalidade de germinantes em comparação com uma semente manufaturada, que compreende um meio nutritivo convencional (isto é, KE 64), que inclui 60 g/L de carvão vegetal tratado com nutriente.

Em algumas modalidades, o meio nutritivo modificado para o uso na semente manufaturada compreende de cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a cerca de 2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio - inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de 0,50 mg/L de Piridoxina-HCl, e cerca de 2,0 mg/L de ácido Nicotínico, cerca de 0,26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0,25 mg/L de Ácido Fólico. Em algumas modalidades, a semente manufaturada

compreende adicionalmente uma restrição de broto, em que a restrição de broto compreende uma cavidade dimensionada para receber o embrião de conífera. Em algumas modalidades, a semente manufaturada compreende adicionalmente um embrião de conífera disposto no interior da cavidade da restrição de broto.

Em algumas modalidades, a semente manufaturada compreende adicionalmente um material adsorvente, tal que o carvão vegetal, na cavidade. Em algumas modalidades, o carvão vegetal na cavidade é tratado com nutriente.

Em uma modalidade exemplar, a semente manufaturada compreende um meio nutritivo, que compreende cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a cerca de 2100 mg/L de KH2PQ4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de

r

0,50 mg/L de Piridoxina-HCl, cerca de 2,0 mg/L de Acido Nicotínico, cerca de 0,26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca

r

de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0, 25 mg/L de Acido Fólico. O Meio MS09, tal como descrito nos Exemplos 1, 3 e 4 é um meio nutritivo modificado exemplar para o uso nas sementes manufaturadas e nos métodos de germinação, tais como aqui descritos.

O meio nutritivo modificado (melhorado), gerado usando os métodos da invenção, e as sementes manufaturadas que compreendem o meio nutritivo, podem ser usados para a germinação de um embrião de conífera. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende (a) colocar um embrião de conífera em contato funcional com um meio nutritivo em uma semente manufaturada, o meio nutritivo compreendendo: de 10 g/L a 100 g/L de carvão vegetal, de 350 mg/L a 450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de: de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina-HCl, de 0,30 mg/L a 0,80 mg/L de Piridoxina-HCl, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de ácido Nicotínico, e de 0,15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de Pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0, 30 mg/L de Ácido Fólico; e (b) colocação da semente manufaturada em um ambiente condutivo para o crescimento da planta, de um modo a permitir com que o embrião possa crescer e germinar a partir da semente manufaturada.

Conforme descrito supra, verificou-se, através de experimentação, que uma semente manufaturada, que compreende um meio nutritivo modificado, melhora a freqüência de germinação de embriões de conífera em comparação com um meio nutritivo padrão (por exemplo, KE 64). O meio nutritivo modificado aqui descrito em conexão com as sementes manufaturadas é também útil nos métodos para a germinação de um embrião. Em algumas modalidades do método, o carvão vegetal no meio nutritivo modificado é tratado com um não-nutriente, anteriormente à adição ao meio. Em algumas modalidades, o meio nutritivo modificado compreende de 10 g/L a 100 g/L de carvão vegetal. Em algumas modalidades, o carvão vegetal adicionado ao meio nutritivo modificado é de g/L a 100 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente (tal que, por exemplo, de 20 g/L a 100 g/L, de 50 g/L a 100 g/L, de 60 g/L a 100 g/L, ou de 50 g/L a 80 g/L, ou de cerca de 60 g/L).

Em algumas modalidades do método, o meio nutritivo modificado para o uso na semente manufaturada compreende cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a cerca de 2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de 0,50 mg/L de Piridoxina-HCl, cerca de 2,0 mg/L de ácido Nicotínico, cerca de 0, 26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0, 25 mg/L de Ácido Fólico.

Os exemplos que se seguem ilustram meramente o melhor modo agora contemplado para a prática da invenção, mas não devem ser construídos de um modo a limitar a invenção.

EXEMPLO 1

Este exemplo provê um método de preparação representativo de um meio nutritivo adequado, carvão vegetal tratado com nutriente, e de sementes manufaturadas representativas, adequadas para o uso nos métodos da invenção.

Métodos:

1. Meio Nutritivo (KE 64-50): é produzido pela combinação do Meio Básico KE64 (Tabela 1) com os componentes da Tabela 2, tal como descrito. KE 64-50 é também preparado a partir de materiais pré-fabricados. A quantidade requerida de cada solução de material (que não é termicamente instável) é adicionada à água. Substâncias químicas não-material (tais que carvão vegetal e ágar) são pesadas e diretamente adicionadas ao meio. Após todas as substâncias químicas não termicamente instáveis e os compostos serem adicionados, o meio é conduzido a um volume apropriado e o pH é ajustado para 5,7. O meio é então esterilizado através de autoclavagem, durante 25 minutos.

TABELA 1 : Formulação de Meio Básico KE64

Componente do Meio Concentração Final (mg/l) NH4NO3 301,1 H3BO3 10,0 (NH4)2MoO4 0,06 CaCl2-2H20 299,2 KH2PO4 1800,0 MgS04-7H20 1000,0 MnCl2.4H20 6,0 ZnS04-7H20 0,8 CuC12-2H20 0,5 Citrato Férrico 60 mg/L Pluronic F-68 10 g/l Ágar 18 g/l Os componentes termicamente instaveis esterilizados em filtro (Tabela 2) sao adicionados apos ο meio ter sido resfriado a 40°C.

TABELA 2: Componentes adicionados ao Meio Basico KE64

Concentra9ao Final Concentra^ao Final Componente do Meio nM (mg/l) Mio-inositol 0,5549 100,0 Tiamina-HCl 0,0030 1,0 Piridoxina-HCl 0,0012 0,25 AcidoNicotinico 0,0081 1,0 Riboflavina 0,0021 0,125 PantotenatodeCa 0,50 Biotina 0,0003 0,0010 AcidoFolico 0,8077 0,1250 L-asparagina 1,8255 106,7 L-glutamina 0,3646 266,7 L-Iisina^HCl 0,7612 53,3 DL-serina 0,4631 80 L-prolina 1,5310 53,3 L-arginina-HCI 0,4552 266,7 Ureia 13,3200 800 L-valina 0,5983 53,3 L-alanina 0,2203 53,3 L-Ieucina 0,2448 80 L-treonina 0,3226 26,7 L-fenilalanina 0,1720 53,3 L-histidina 0,1308 26,7 L-triptofano 0,2035 26,7 L-isoleucina 1,2930 26,7 L-metionina 0,7100 26,7 L-glicina 0,0003 53,3 L-tirosina 0,2242 53,3 L-cisteina 0,6098 26,7 Sacarose 50 g/1 Acido Giberilico (GA4") 0,1 Agentes Antimicrobianos 1,0 ml/1

2. Preparacao de Carvao vegetal para a adigao aos meios

e/ou a cavidade de corrosao das sementes manufaturadas

A. Preparacao de Carvao vegetal tratado com nutriente:

Um meio basico KE64 (Tabela 1) e preparado, como acima descrito, sem Pluronic F-68 e sem agar. 23’ 3 gramas de carvao vegetal de 100 mesh sao adicionados a 1 litro de Meio Basico KE 64. Os componentes sao autoclavados, e deixados resfriar a 40°C. Os componentes da Tabela 2, conforme descrito no Exemplo 1，sao adicionados, de um modo esteril, ao meio basico KE64, e ο meio e agitado, durante pelo menos 2 horas, de um modo a misturar os componentes. O meio e filtrado atraves de um papel de

filtro Whatman # 1, em um funil de Buchner, de um modo a coletar ο carvao vegetal. Um equilibrio da umidade e usado de um modo a determinar ο conteiido de umidade da torta de carvao vegetal, e ο peso seco do carvao vegetal e calculado. Se ο carvao vegetal tratado com nutriente tiver que ser adicionado a cavidade da semente manufaturada, ele e primeiramente secado, de um modo a que ele se tome uma materia escoavel.

B. Preparagao de Carvao vegetal tratado com nao- nutriente : Carvao vegetal de 100 mesh, que foi ativado quimicamente usando um processo de acido fosforico (NORIT® CNSP) foi obtido a partir de Norit Americas Inc., Marshall, Texas. 3. Preparagao de sementes manufaturadas: Os metodos

representatives, usados para a produgao de sementes manufaturadas, sao descritos nas Patentes U.S. Nos 6.119.395; 5.701.699; e 5.427. 593, incorporadas a este a titulo referencial.

De um modo descrito genericamente， as sementes manufaturadas incluem um revestimento de semente (24), um meio nutritivo (26), um embriao de planta (42)，e, de um modo opcional, uma restrigSo de cotiledoneo (22). Um semente manufaturada, que nao inclui uma parte de embriao (42), e conhecida na tecnica como uma "semente vazia". A semente vazia e uma capsula cilindrica tendo uma extremidade fechada e uma extremidade aberta.

O meio nutritivo (26), tambem referido como ο "Meio de Gametofito" e analogo ao gametofito de uma semente natural, e esta colocado no interior do revestimento da semente, de um modo a preencher substancialmente ο interior do revestimento da semente. Um meio nutritivo exemplar (26) para ο uso em sementes manufaturadas, inclui ο KE64 acima descrito, ou um meio nutritivo modificado, como aqui descrito, que pode incluir de O g/L a 100 g/L de uma composi9ao adsorvente, tal que ο carvao vegetal. O carvao vegetal para ο uso no meio nutritivo pode ser previamente

tratado com nutrientes, conforme acima descrito, ou pode ser carvao vegetal nao-tratado com nutriente, simples. Uma inserfao porosa dura, que se estende longitudinalmente, conhecida como uma restri5ao de cotiledoneo (22), esta localizada centralmente no interior de uma extremidade do revestimento da semente circundada pelo meio nutritivo e inclui uma cavidade localizada centralmente (34)，tambem referida como a uma cavidade de corrosao" que se estende parcialmente atraves do comprimento da restri9ao de cotiledoneo. A cavidade (34) e dimensionada de um modo a receber um embriao de planta (42) na mesma. O embriao de planta bem conhecido inclui uma extremidade de radicula e uma extremidade de cotiledoneo. O embriao de planta e depositado no interior da cavidade de restrigSo de cotiledoneo (22), primeira extremidade de cotiledoneo. O embriao de planta e entao vedado no interior da semente vazia atraves de uma veda^ao extrema (43). Uma mancha enfraquecida na veda9ao extrema (43) permite com que a extremidade de radicula do embriao da planta penetre na veda9ao extrema.

Em um metodo exemplar para preparar uma semente manufaturada para ο uso na inven辟o，ο revestimento da semente e preparado pelo seccionamento da tubulafao de policaprolactona no comprimento apropriado. As restri?5es de broto ceramicas sao produzidas pela injegSo de uma aba de porcelana no interior de um molde previamente formado, com um pino no centro, de um modo a criar a cavidade de aceita9ao de broto. A aba e deixada secar a uma consistencia que permita a remogao da restrifao previamente formada. A restri9ao e subsequentemente aquecida a uma temperatura, que permita com que a porcelana forme uma estrutura porosa, mas fundida. A restrigao pode ser lavada com um acido, de um modo a remover as impurezas, se desejado. As tampas sao produzidas a partir de Parafilm™ previamente estirado (Pechiney Plastic Packaging, Chicago, Illinois 60 631).

As sementes manufaturadas sao unidas atraves de termoliga9ao da restrigSo do broto ceramico (22) ao revestimento da semente (24). O revestimento da semente (24) e entao enchido com meio nutritivo (26) e um embriao e inserido ao interior da cavidade (34), na restrifao do cotiledoneo (22), a extremidade do cotiledoneo primeiramente. O material de enchimento de carvao vegetal seco (80) (seja tratado ou nutriente ou tratado com nao-nutriente) pode estar localizado na restrigSo do cotiledoneo apos ο embriao ter sido inserido no interior da cavidade (34). Apos ο carvao vegetal ter sido adicionado, as sementes sao entao vedadas com uma veda9ao extrema secundaria, atraves de sua deposigao sobre a extremidade aberta da semente e fusao das tampas a superficie por meio de calor. As veda9oes extremas primarias sao entao imersas em uma mistura de cera azul, antes da uniao a veda9ao extrema secundaria. Isto promove uma boa Iiga^So entre as vedagdes extremas primaria e secundaria. As sementes sao entao impregnadas com agentes antimicrobianos.

4. Preparacao de embrides de planta:

Os embriSes zigoticos sao preparados a partir de sementes botanicas. As sementes sao entao esterilizadas superficialmente atraves de metodos similares aqueles previamente descritos (Cyr et al.，Seed Sci. Res. 1: 91-97 (1991)). As sementes sao rompidas e abertas e os embrioes zigoticos sao dissecados a partir do megagametofito com escalpos e forceps em uma coifa de fluxo laminar.

Os embrides somaticos sao produzidos de acordo com os metodos convencionais, previamente descritos (vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 4. 957. 866; 5.034.326; 5.036. 007; 5.041. 382; 5. 236. 841; 5. 294. 549; 5. 482.857; 5.563. 061; e 5. 821. 126). Por exemplo, ο tecido da planta pode ser cultivado em um meio de iniciapao，que inclui hormonios, de um modo a iniciar a formafao de celulas embriogenicas, tais que as massas de suspensao embrionicas, que sao capazes de se desenvolverem sob a forma de

embrioes somaticos. As celulas embriogenicas podem entao ser adicionalmente cultivadas em um meio de manutenfao, que promove ο estabelecimento e a multiplicafao de celulas embriogenicas. Subsequentemente, as celulas embriogenicas multiplicadas podem ser cultivadas em um meio de desenvolvimento, que promove ο desenvolvimento de embrioes somaticos, que podem ser, de um modo adicional, submetidos a tratamentos pos-desenvolvimento, tais que tratamentos a frio. Os embrioes somaticos, usados nos metodos da ίηνβηςδο, completaram ο estagio de desenvolvimento do processo de embriogenese somatico. Eles podem ser tambem submetidos a um ou mais tratamentos de pos-desenvolvimento.

5. Germinacao: uma quantidade adequada de areia esteril e preparada atraves do cozimento de 2 litros de areia em uma temperatura de 375。F, durante 24 horas. A areia e entao adicionada a bandejas previamente esterilizadas e 285 ml de agua sao adicionados. Sao entao formados sulcos e a caixa e vedada. A caixa contend。areia e entao autoclavada durante 1 hora a 121°C e sob pressao atmosferica 1.

As sementes manufaturadas sao semeadas na areia e deixadas germinar. De um modo tipico, as sementes manufaturadas sao cultivadas sob Iuz continua, em temperatura ambiente (23。C), durante de quatro a cinco semanas.

Varios parametros podem ser medidos, de um modo a determinar a frequencia de germina9ao das sementes manufaturadas e a qualidade dos agentes de germinagSo.

Em um period。de tempo designado apos a semeadura, os comprimentos do radiculo, hipocotilo, cotiledoneos, e epicotilo dos agentes de germinagao podem ser medidos.

O termo "radiculo" refere-se a parte de um embriao de planta, que se desenvolve no interior da raiz primaria da planta resultante.

O termo "cotiledoneo" refere-se genericamente ao, primeiro, primeiro par, ou primeiro espira (dependendo do tipo de planta) de estruturas similares a folha no embriao da planta, que funcionam primariamente para produzir compostos alimenticios na sementes disponiveis para ο desenvolvimento do embriao, mas que, em alguns casos, agem como estruturas fotossinteticas ou de armazenamento de alimento.

O termo "hipocotilo" refere-se a por9ao de em embriao de

planta ou muda localizada abaixo dos cotiledoneos, mas acima do radiculo.

O termo "epicotilo" refere-se a por^ao de haste da muda, que esta acima dos cotiledoneos.

A taxa de germinagao pode ser medida e a normalidade dos germinantes pode ser tambem avaliada. Um "agente de germinasao normal "ou "normalidade" denota a presenga de todas as partes da planta esperadas em um periodo de tempo de avaliagao. No caso dos gimnoespermas, a normalidade e caracterizada pelo fato de que ο radiculo possua um comprimento maior do que 3 mm e de que nao hajam ma formafoes visivelmente discerniveis, comparadas ao aparecimento de embrioes germinados a partir de semente natural. "Nao normal "significa que ο tecido sobre pelo menos um orgao esta intumescido, e que a raiz e os cotiledoneos estao mortos. "nao normal inteiramente extraido "significa que ο agente de germinagao emergiu inteiramente a partir da cavidade, mas que nao esta normal. "Inalterado "significa um embriao que nao foi alterado a partir do dia um do experimento (isto e, nao ocorreu germina9ao).

EXEMPLO 2

Este Exemplo descreve a prepara9ao de um meio nutritivo modificado para ο uso em sementes manufaturadas contendo carvao vegetal tratado com nao-nutriente.

Metodos: O meio KE64, produzido como descrito no Exemplo 1, foi incubado na presenya ou na ausencia de carvao vegetal tratado com

nutriente ou tratado com nao-nutriente, e a concentragao dos componentes do meio foram medidas apos a incubafao. O carvao vegetal de 100 mesh tratado com nutriente foi preparado como descrito no Exemplo 1.

Condigdes Testadas:

1. Meio KE64 sem adigSo de carvao vegetal (amostra 012).

2. Meio KE64 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente de 100 mesh.

3. Meio KE64 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nutriente de 100 mesh (amostra 014).

O carvao vegetal foi adicionado onde indicado, misturado, e incubado durante 2 horas. A concentra9ao dos componentes do meio foi analisada como mostrado abaixo na Tabela 2.

TABELA 3: ComparagSo da Concentra9ao Medida dos Componentes do Meio, antes e apos a incuba^So, na presenfa de carvao vegetal. As medi?5es

estao em mg/L, a nao ser que indicado de um outro modo.

Componente do Meio Meio KE64 (sem carvao vegetal) Concentrafao Final Esperada (mg/L) Meio KE64 (sem carvao vegetal) Concentra9ao Medida (mg/L) Meio KE64 acrescido de carvao vegetal (nao-tratado) Concentrafao Medida (mg/L) Meio KE"4 acrescido de carvao vegetal (tratado com nutriente) Concentrapao Medida (mg/L) "B" "C" "D" Έ" NH4NO3 301,1 322,3 296,8 381,3 H3BO3 10,0 11,4 9,7 11,4 (NH4)2MoO4 0,06 0,08 0,02 0,02 CaClr2H20 299,2 275,9 124,7 271,1 KH2PO4 1800,0 1573 2513 1907 MgS04-7H20 1000,0 987,3 635,6 960,9 MnCl2.4H20 6,0 3,8 1,7 3,9 ZnS04-7H20 0,8 0,15 0,09 0,10 CuC12-2H20 0,5 0,27 <0,01 <0,01 Mio-inositol 100,0 ND ND ND Tiamina-HCl 1,0 ND ND ND Piridoxina-HCl 0,25 ND ND ND Acido Nicotinico 1,0 ND ND ND Riboflavina 0,13 ND ND ND Pantotenato de Ca 0,50 ND ND ND Biotina 0,0010 ND ND ND Acido Folico 0,1250 ND ND ND L-asparagina/Serina 187 191 155 204 L-Glutamina/Histidina 293 231 166 206 L-Lisina-HCl 53,3 43 21 32 DL-Serina 80,0 ND ND ND Componente do Meio Meio KE64 (sem carvao vegetal) Concentrafao Final Esperada (mg/L) "B" Meio KE64 (sem carvao vegetal) Concentrafao Medida (mg/L) "C" Meio KE64 acrescido de carvao vegetal (nao-tratado) Concentrapao Medida (mg/L) "D" Meio KE"4 acrescido de carvao vegetal (tratado com nutriente) Concentrafao Medida (mg/L) Έ" L-prolina 53,3 94 87 100 L-Arginina-HCI 266,7 256 43 76 L-Valina 53,3 50 41 49 L-Alanina 53,3 45 40 49 L-Leucina 80,0 75 48 64 L-Treonina 26,7 44 37 42 L-Fenilanina 53,3 51 5 10 L-Triptofano 26,7 19 ND ND L-Isoleucina 26,7 25 16 22 L-Metionina 26,7 18 ND ND L-Glicina 53,3 52 40 51 L-Tirosina 53,3 56 3 6 L-Cisteina 26,7 ND ND ND Sacarose 50,0 g/L 52，8g/L 49,2 63,2 g/L Ureia 800 ND ND ND TABELA 4: Analise dos Resultados da TABELA 3 Componente do Meio Concentra?ao absorvida em carvao vegetal mg/L (C-D) "P" Ganho em concentxa^ao de nutriente de sobrenadante devido a adifao de carvao vegetal tratado ao meio mg/L (E-C) "G" Fator de Ajuste do Meio E/C Ή" Nova Concentrafao de Partida (HxB) IlJlt NH4NO3 25,5 59,0 1,2 361,3 H3BO3 1,7 0,0 1,0 10,00 (NH4)2MoO4 0,1 -0,1 1,0 0,1 CaCl2-2H20 151,1 -4,8 1,0 299,2 KH2PO4 -940,3 333,9 U 2059,8 MgS04-7H20 351,7 -26,4 1,0 1000,0 MnCl2.4H20 2,1 0,1 1,0 6,0 ZnS04-7H20 0,10 -0,1 1,0 0,8 CuC12-2H20 ND ND 1,0 0,5 Mio-inositol ND ND ND 100,0 Tiamina-HCl ND ND ND 1,0 Piridoxina-HCl ND ND ND 0,3 Acido Nicotinic。 ND ND ND 1,0 Riboflavina ND ND ND 0,1 Pantotenato de Ca ND ND ND 0,5 Biotina ND ND ND 0,0 Acido Folico ND ND ND 0,1 L-asparagina/Serina 36,0 13,0 U L-Asparagina: 117,4 Serina: 88,0 L-Glutamina/Histidina 65,0 -25,0 1,0 L-Glutamina:266,7 L-Histidina: 26,7 L-Lisina-HCl 22,0 -25,0 1,0 53,3 L-prolina 7,0 6,0 1,1 58,6 L-Arginina-HCl 213,0 -180,0 2,0 533,4 L-Valina 9,0 -1,0 1,0 53,3 L-Alanina 5,0 4,0 1,1 58,6 L-Leucina 27,0 -11,0 I 1,0 80,0 3

Concentrafao absorvida em carvao vegetal mg/L (C-D) Ganho em concentrafao de nutriente de sobrenadante devido a adigao de carvao vegetal tratado ao meio mg/L (E-C) Fator de Ajuste do Meio E/C Nova Concentra^ao de Partida (HxB) L-Treonina 7,0 -2,0 1,0 26,7 L-FeniIanina 46,0 -41,0 1,0 53,3 L-Isoleucina 9,0 -3,0 1,0 26,7 L-Glicina 12,0 -1,0 1,0 53,3 L-Tirosina 53,0 -50,0 1,0 53,3 L-Cisteina ND ND ND 53,3 Sacarose 3,6 10,4 1，2 60,0 Ureia ND ND 1,0 800,0

TABELA 5: Meio Nutritivo Modificado MS08 e MS09

Componente do Meio Meio KE64 Concentragao Final (mg/L) Concentra^ao Final MS08 (mg/L) Concentragao Final MS09 (mg/L) NH4NOi5 301,1 301,1 371,7 ΗλΒΟλ 10,0 10,0 10,0 (NH4)2MoO4 0,06 0,06 0,06 CaClr2H?0 299,2 299,2 299,2 KH2PO4 1800,0 2088 2088 MgS04-7H20 1000,0 1000 1000 MnCl2.4H20 6,0 6,0 6,0 ZnS04-7H70 0,8 0,8 0,8 CuC12-2H20 0,5 0,5 0,5 Citrato Ferrico 60mg/l 60 60 Mio-inositol 100 100 200 Tiamina-HCl 1,0 1,0 2,0 Piridoxina-HCl 0,25 0,25 0,50 Acido Nicotinico 1,0 1,0 2,0 Riboflavina 0,125 0,13 0,26 Pantotenato de Ca 0,50 0,50 1,0 Biotina 0,0010 0,01 0,02 Acido Folico 0,1250 0,13 0,25 L-asparagina 106,7 11,73 11,73 L-glutamina 266,7 266,7 266,7 L-lisina-2HCl 53,3 53,3 53,3 Dl-serina 80,0 88,0 88,0 L-prolina 53,3 58,63 58,63 L-arginina-HCl 266,7 533,3 533,3 Ureia 800,0 800 800 L-valina 53,3 53,3 53,3 L-alanina 53,3 58,63 58,63 L-Ieucina 80,0 80,0 80,0 L-treonina 26,7 26,7 26,7 Componente do Meio Meio KE64 Concentragao Final (mg/L) Concentrafao Final MS08 (mg/L) Concentragao Final MS09 (mg/L) L-fenilalanina 53,3 53,3 53,3 L-histidina 26,7 26,7 26,7 L-triptofano 26,7 26,7 26,7 L-isoleucina 26,7 26,7 26,7 L-metionina 26,7 26,7 26,7 L-glicina 53,3 53,3 53,3 L-tirosina 53,3 53,3 53,3 L-cisteina 26,7 26,7 26,7 Pluronic F-68 10g/l 9,0g/l 9,0 g/1 Carvao vegetal 60g/l (tratado com nutriente) 60,0g/l (tratado com nao- nutriente) 60,0g/l (tratado com nao- nutriente) Agar 18g-26g/l 18,0g/l 18,0g/l pH 5,7 5,7 Sacarose 50g/l 60,0g/l 60，0g/l TABELA 6: Sumario dos componentes que diferem em meio modificado MS-08 e MS-09 em comparagSo com KE64 Componente do Meio Meio KE64 Concentra9ao Final (mg/L) Concentrafao Final MS08 (mg/L) Concentragao Final MS09 (mg/L) NH4NOs 301,1 301,1 371,7 KH9PO4 1800,0 2088 2088 Mio-inositol 100 100 200 Tiamina-HCl 1,0 1,0 2,0 Piridoxina-HCl 0,25 0,25 0,50 Acido Nicotinic。 1,0 1,0 2,0 Riboflavina 0,125 0,13 0,26 Pantotenato de Ca 0,50 0,50 1,0 Biotina 0,0010 0,01 0,02 Acido Folico 0,1250 0,13 0,25 L-asparagina 106,7 11,73 11,73 DL-serina 80,0 88,0 88,0 L-proIina 53,3 58,63 58,63 L-arginina-HCl 266,7 533,3 533,3 L-alanina 53,3 58,63 58,63 Carvao vegetal 60g/l (tratado com nutriente) 60，0g/l (tratado com nao- nutriente) 60,0g/l (tratado com nao- nutriente) Agar 18g -26g/l 18,0g/l IB.Og/l pH 5,7 5,7 Sacarose 50g/l 60,0g/l 60,0g/l E notado que a concentragSo de alguns dos componentes, tais que L-Tirosina, L-Fenilalanina, e Citrato Ferrico, foi ajustada para que seja considerada para ο pH e de modo a evitar problemas de precipita9ao.

EXEMPLO 3

Este Exemplo descreve uma compara9ao do efeito de varias formula9oes de meio nutritivo KE64, MS08, e MS09, usadas em sementes manufaturadas com rela9ao a frequencia de germina9ao e qualidade em pinheiro teda.

Metodos:

Sementes de pinheiro teda zigotico foram esterilizadas superficialmente, os embriSes foram removidos e inseridos na semente manufaturada, tal como descrito no Exemplo 1.

As sementes manufaturadas foram preparadas como descrito nos Exemplos 1 e 2, com ο uso de restrifoes de cotiledoneo, com as varia9oes no meio nutritivo e ou carvao vegetal tratado com nutriente ou carvao vegetal tratado com nao-nutriente incluidos na cavidade, como abaixo indicado. O meio nutritivo KE64 foi produzido como descrito no Exemplo 1. O carvao vegetal tratado com nutriente foi preparado como descrito no Exemplo 1. Os meios MS08 e MS09 foram produzidos como descrito no Exemplo 2.

Uma vez conjugados os vazios de semente manufaturados, para os construtos indicados, carvao vegetal tratado com nutriente, seco, de 100 mesh, ou carvao vegetal tratado com nao-nutriente foram entao pipetados ao interior da cavidade de corrosao do construto usando uma pipeta de Pasteur esteril. Os embriSes foram entao inseridos na restri9ao do cotiledoneo.

O meio nutritivo foi preparado como descrito abaixo e foi colocado no interior do revestimento da semente, de um modo a encher substancialmente ο interior do revestimento da semente. Em algumas condi9oes de tratamento, ο meio nutritivo continha carvao vegetal que foi tratado com nutriente, e em outras condi9oes, ο meio continha carvao vegetal que foi tratado com nao-nutriente. Como descrito acima no Exemplo 2, MS08 e MS09 foram formulados de um modo a aumentar a concentra9ao de certos componentes do meio, mostrados nas Tabelas 5 e 6, em compara9ao com KE64, de um modo a tentar melhorar ou pelo menos manter a mesma frequencia de germina9ao observada com KE64 na presenya de carvao vegetal tratado com nutriente.

A temperatura de distribui9ao do meio era de 45°C. A extremidade viva da semente manufaturada (extremidade com a cavidade de embriao) foi imersa em cera.

108 sementes foram testadas por tratamento (4 tratamentos), resultando em um total de 432 sementes.

Condicoes de tratamento testadas:

1. Meio Completo KE64 (50 g/1 de sacarose; 18 g/L de agar), acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nutriente no meio e carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade.

2. Meio Completo (60 g/L de sacarose; 18 g/L de agar), alem de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio e carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade.

3. Meio Completo MS09 (60 g/L de sacarose; 18 g/L de agar), alem de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio e carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade.

4. Meio Completo KE64 (50g/L de sacarose; 18 g/L de agar), alem de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio e carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade.

As sementes manufaturadas, conjugadas como acima descrito para cada condigSo de tratamento, foram semeadas em caixas de areia esteril e colocadas em um ambiente claro. As sementes foram graduadas para a

germina9ao em 25 dias apos a semeadura. Resultados: Os resultados sao apresentados abaixo nas Tabelas 7 e 8.

__________r

TABELA 7: Comprimentos de Orgao e % de Laterals

Meio Laterais (%) Comprimento do Radical (mm) Comprimento do Hipocotilo (mm) Comprimento do Cotiledoneo (mm) Comprimento do EpicotiIo (mm) Tratamento # 1 (KE64 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nutriente no meio) 25,3% 27,0 22,7 19,5 8,2 Tratamento # 2 (MS08 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nSo-nutriente no meio) 20,4% 27,0 23,3 21,2 10,6 Tratamento # 3 (MS09 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio) 43,0% 28,9 28’ 1 20,5 9,5 Tratamento # 4 (KE64 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio) 4,3% 10,9 14,6 16,4 4J

TABELA 8: Qualidade dos Germinantes

Meio Germinantes Normais (%) Seria normal se inteiramente extraido (%) Germinantes normais totais (col 1+col 2) Germinante anormal (%) InaIterado (%) Tratamento # 1 (KE 64 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nutriente no meio) 30.3% 5.1% 35.4% 38.4% 26.3% Tratamento # 2 (MS08 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio) 22.1% 2.1% 24.2% 32.6% 43.2% Tratamento # 3 (MS09 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio) 44.7% 10.6% 55.3% 26.6% 18.1% Tratamento # 4 (KE64 acrescido de 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente no meio) 3.2% 2.1% 5.3% 43.6% 51.1%

Discussao dos Detalhes:

Como mostrado acima na Tabela 8, as sementes manufaturadas com MS 09 com 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao- nutriente no meio obtiveram um melhor desempenho do que KE64 com 60 g/L de carvao vegetal tratado com nutriente no meio, em que as sementes contendo KE64 resultaram em uma frequencia de germina9ao de 44,7% de agentes de germinafao normais, e uma frequencia total de normal mais normal, mas nao extrairam inteiramente os germinantes de 55, 3% em comparaySo com as sementes contendo MS09 que geraram 30,3% de frequencia de germina9ao normal, e uma frequencia de germina9ao total de 35,4 % normal mais normal, mas nao extrairam inteiramente os germinantes.

O meio MS08 com 60 g/L de meio tratado com nutriente nao obteve um desempenho tao bom quanto KE64 ou MS09.

Como mostrado adicionalmente na Tabela 7, as sementes manufaturadas com ο meio MS09 (com carvao vegetal tratado com nao- nutriente no meio) produziram germinantes tendo tamanhos de orgao pelo menos tao grandes quanto, se nao maiores, do que os germinantes produzidos a partir do meio KE64 padrao (com carvao vegetal tratado com nutriente no meio).

Conclusao geral:

Parece que ο MS09 e superior tanto a KE64 como a MS08 para ο uso sem sementes manufaturadas com ο pinheiro teda, com relafao a frequencia e a qualidade dos germinantes resultantes. O uso deste meio modificado (MS09) fornece a vantagem de evitar ο dispendio de tempo e de custo envolvidos na preparagSo demorada do carvao vegetal tratado com nutriente nas sementes manufaturadas.

r

E observado que um experimento adicional foi executado com embri5es do pinheiro teda, de um modo a comparar as sementes manufaturadas contendo ou ΚΈ64 com 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao-nutriente ou MS09 com 60 g/L de carvao vegetal tratado com nao- nutriente, com os resultados de germinagSo sendo avaliados em 49 dias apos a semeadura, no entanto, este experimento nao produzidos dados estatisticamente relevantes, provavelmente devido a problemas de

contamina9ao. EXEMPLO 4 Este Exemplo descreve ο efeito de varios meios nutritivos usados em sementes manufaturadas com relagSo a frequencia de germina9ao e a qualidade de embrioes de conifera norte-americana.

Metodos:

Embrioes somaticos de abeto norte-americano de dois diferentes genotipos (genotipo # 1 e # 2) foram cultivados ate ο estagio de desenvolvimento, tal como descrito no Exemplo 1. Estes embriSes foram entao colocados sobre um meio de estratificagSo, durante 4 semanas, e avaliados quanto a esterilidade, antes da inser9ao no interior de sementes manufaturadas.

As sementes manufaturadas foram preparadas como descrito no Exemplo 1, com ο uso ou de restri9oes de cotiledoneo ceramicas do Tipo A ou restrifoes de cotiledoneo ceramicas do Tipo B, com variagSes no meio nutritivo e cada um de carvao vegetal tratado com nao-nutriente ou tratado com nutriente incluido na cavidade, tal como abaixo indicado. O meio nutritivo KE64 foi produzido como descrito no Exemplo 1. O carvao vegetal tratado com nutriente foi preparado como descrito no Exemplo 1. O meio MS09 foi produzido como descrito no Exemplo 2.

Uma vez que os vazios de semente manufaturados tenham sido conjugados, para os construtos indicados, carvao vegetal tratado com nao- nutriente ou carvao vegetal tratado com nutriente, seco, de 100 mesh, foi entao pipetado ao interior da cavidade de corrosao do construto usado uma Pipeta de Pasteur. Os embrioes foram entao inseridos ao interior da restri9ao de cotiledoneo.

O meio nutritivo foi preparado como abaixo mostrado e foi colocado no interior do revestimento da semente, de um modo a encher substancialmente ο interior do revestimento da semente. Em algumas condigoes de tratamento, ο meio nutritivo continha carvao vegetal, que foi tratado com nutriente, e em outras condifoes, ο meio continha carvao vegetal, que nao foi tratado com nutriente.

Como descrito acima no Exemplo 2, MS09 foi formulado de um modo a aumentar a concentra9ao de certos componentes do meio, apresentados nas Tabelas 5 e 6, em compara9ao com KE64, de um modo a tentar aumentar, ou pelo menos manter, a mesma frequencia de germina9ao observada com KE64 na presenp de carvao vegetal tratado com nutriente.

A temperatura de distribui9ao do meio foi de 45°C. A extremidade viva da semente manufaturada (extremidade com a cavidade do embriao) foi imersa em cera.

Cada tratamento neste estudo consistiu de 7 replicas com um tratamento de 10 sementes/replica, para um total de 280 sementes.

As condi9oes de tratamento foram tais que descritas abaixo na Tabela 9. As sementes manufaturadas contend。os embrioes foram semeadas em 7 caixas de areia estereis com 10 sementes/tratamento/caixa. As sementes foram avaliadas com relagSo a frequencia de germina9ao e aos comprimentos de orgao em 61 dias apos a semeadura.

TABELA 9: CondigSes de Tratamento para a PreparapSo de Sementes Manufaturadas Usando os genotipos # 1 e # 2 de Embrioes Somaticos de abeto norte-americano

Tratamento Genotipos testados Meio nutritive Carvao vegetal em meio nutritivo Carvao vegetal na cavidade Restri^ao de cotiledoneo 1 #1 #2 KE64 tratado com nutriente (60 g/L) carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade Tipo B/ 2 MS09 carvao vegetal tratado com nao -nutriente (60 g/L) carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade Tipo B/ 3 #2 KE64 carvao vegetal tratado com nutriente (60 g/L) carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade Tipo B/ 4 #2 MS09 carvao vegetal tratado com nao-nutriente (60 g/L) carvao vegetal tratado com nutriente na cavidade Tipo B/ #1 KE64 carvao vegetal tratado com nutriente (60 g/L) sem carvao vegetal na cavidade Tipo AJ 6 #2 KE64 carvao vegetal tratado com nutriente (60 g/L) sem carvao vegetal na cavidade Tipo AJ TABELA 10: Comprimentos de Orgao para Todos os Tratamentos (mm) Tratamento Comprimento do Radical (mm) α = 0,0014 Comprimento do hipocotilo (mm) α = 0,0001 CompHmento do cotiledoneo (mm) α = 0,0001 Comprimento do EpicotUo (mm) α = 0,6717 #l(geno 細2 : KE64 : carvao vegetal tratado no meio e na cavidade) 9，51mmB 10’46c 5’34B 0,00 #2 (geno # 1: MS09: carvao vegetal nao-tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 12,89mmAB 13,OOmmc 7,24mmAB 7,75mm #3 (geno # m 2: KE64 : carvao vegetal tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 6,93mmB ll,26mmBC 5,15mmB 5,40mm #4 (geno #2: MS09: carvao vegetal nao-tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 7’81mmB 10,47mmBC 5,15mmB 2,60mm #5 (geno #1: KE64: carvao vegetal tratado no meio, sem carvao vegetal na cavidade) lSJlmm^ 14,76mmA 9;57mmA 3,51mm #6 (geno # 2: KE64: carvao vegetal tratado no meio, sem carvao vegetal na cavidade) 23，04mmA 17,45mmA 9,03mmA 3,52mm

TABELA 11: Frequencia de Germina9ao no Abeto Norte-Americano

Tratamento Germina^ao Total ¢1 = 0,00131 Germina^ao ParciaI α = 0,0087 Germina^ao Total (col. 1 + 2) Raiz em ar2 α = 0,4614 Sem germina^ao α = 0,0011 #1 (geno # l/# 2:KE64: carvao vegetal tratado no meio e na cavidade) 0.0%B ua0zoab 11.1% 11.1% 75.9%A #2 (geno # 1: MS09: carvao vegetal nao-tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 1.9%^ 25.9%^ 27.8% 7.4% 64.8%^ #3 (geno # l/#2: KE64: carvao vegetal tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 0.0%B 5.6%B 5.6% 16.7% 77.8%A #4 (geno # 2: MS09: carvao vegetal nao-tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 0.0%B 18.5%^ 18.5% 14.8% 66.7%^ #5 (geno #1: KE64: carvao vegetal tratado no meio, sem carvao vegetal na cavidade) 11.1%A 22.2%^ 33.3% 18.5% 48.1%b #6 (geno #2: KE64: carvao vegetal tratado no meio, sem carvao vegetal na cavidade) 9.3%仙 29.6%a 38.9% 9.3% 48.1%B 1Significa seguido pela mesma letra nao significativamente diferente. 2raiz em ar e um resultado negativo e indica que a raiz perdeu ο seu geotropismo TABELA 12: Graduates de Normalidade para todos os Tratamentos Tratamento Normal 0 = 0,00011 Seria normal se total mente extraido α = 0,1665 Germina^ao Total (Colunas 1 + 2) InaIterado (sem germina^ao) α = 0,0273 Nao normal α =0,1174 m (geno # im: KE64 : carvao vegetal tratado no meio e na cavidade) 0.0%c 13.0% 13.0% 38.9% 37.0% #2 (geno # 1: MS09: carvao vegetal nao- tratado no meio, carvao vegetal tratado na 9.3%bc 25.9% 35.2% 27.8% 35.2% Tratamento Normal a = 0,00011 Seria normal se totalmente extraido α = 0,1665 Germina^ao Total (Colu nas 1 + 2) Inalterado (sem germina^ao) a = 0,0273 Nao normal a =0,1174 cavidade) #3 (geno Mί#2: KE64: carvao vegetal tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 1.9%c 9.3% 11.2% 33.3% 55.6% #4 (geno # 2: MS09: carvao vegetal nao- tratado no meio, carvao vegetal tratado na cavidade) 1.9%c 18.5% 20.4% 31.5% 42.6% #5 (geno #1: KE64: carvao vegetal tratado no meio, sem carvao vegetal na cavidade) 16.7%a 22.2% 38.9% 46.3% 14.8% #6 (geno # 2: KE64: carvao vegetal tratado no meio,sem carvao vegetal na cavidade) 25.9%a 22.2% 48.1% 33.3% 16.7%

'significa seguido pela mesma letra nao significativamente diferente.

Discussao dos Resultados:

Como mostrado acima nas Tabelas 10-12, ocorre um aumento na frequencia de germina9ao e no tamanho do orgao dos germinados a partir de sementes manufaturadas, contendo ο meio nutritivo modificado MS09 com um meio tratado com nao-nutriente, quando comparadas a sementes manufaturadas contendo um meio KE64 tratado com meio tratado com nutriente. O carregamento do nutriente do carvao vegetal e um processo complexo e demorado. Alem disso, ο uso do meio MS09 modificado com um meio tratado com nao-nutriente prove um avanfo importante na preparagao de sementes manufaturadas e de metodos de germina9ao de embrioes de planta.

Embora a modalidade preferida da invenfao tenha sido ilustrada e descrita, sera apreciado que varias altera9oes podem ser introduzidas nesta, sem que haja afastamento do espirito e do escopo da invenfao.

Claims

1. Metodo para produzir um meio nutritivo melhorado, compreendendo um material adsorvente para a cultura de celulas de planta, caracterizado pelo fato de compreender: (a) determinar se ocorre um decrescimo na concentra^So de um ou mais componentes em um primeiro meio nutritivo, apos a incubafao com uma quantidade desejada de material adsorvente. (b) produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende os mesmos componentes que ο primeiro meio nutritivo, em que ο meio nutritivo melhorado compreende: (i) uma concentra9ao aumentada de um ou mais componentes, que foi determinada no estagio (a), de um modo a diminuir em concentra9ao, na presenpa do material absorvente; e (ii) ο mesmo tipo de material absorvente, em uma faixa de concentra9ao dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com ο estagio (a).

2. Metodo de acordo com a reivindicagao 1, caracterizado pelo fato de que ο material adsorvente e selecionado a partir do grupo, que consiste de carvao vegetal, polivinil pirrolidona e silica gel.

3. Metodo de acordo com a reivindica9ao 1, caracterizado pelo fato de que ο material adsorvente e carvao vegetal.

4. Metodo de acordo com a reivindica9ao 3, caracterizado pelo fato de que a concentra9ao de carvao vegetal a ser adicionada ao meio nutritivo melhorado e de cerca de 1 g/L a cerca de 1OO g/L.

5. Metodo de acordo com a reivindicafao 3, caracterizado pelo fato de que ο carvao vegetal e tratado com nao-nutriente antes da adi9ao ao meio nutritivo.

6. Metodo de acordo com a reivindicafao 3, caracterizado pelo fato de que ο meio nutritivo destina-se ao crescimento de celulas de conifera.

7. Metodo de acordo com a reivindicafao 1, caracterizado pelo fato de que ο meio nutritivo melhorado compreende pelo menos 2 componentes selecionados a partir do grupo, que consiste de NH4NO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, Mio-inositol, Tiamina -HCL, Piridoxina-HCL, Acido Nicotinico，Riboflavina, Pantotenato de Ca, Biotina e Acido Folico, DL-Serina, L-prolina, L-arginina-HCL e L-alanina.

8. Metodo de acordo com a reivindicagSo 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente dispor ο primeiro meio nutritivo do estagio (a) no interior de um primeiro conjunto de sementes manufaturadas e dispor ο meio nutritivo melhorado do estagio (b) no interior de um segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocando um embriao de conifera em contato funcional com ο meio nutritivo em cada uma das sementes manufaturadas a partir do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocando as sementes manufaturadas no interior de um ambiente condutor para ο crescimento da planta e comparando as frequencias de germina9ao dos embrioes do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas.

9. Metodo para produzir um meio nutritivo melhorado, compreendendo um material adsorvente para a cultura de celulas de planta, caracterizado pelo fato de compreender: (a) incubar um primeiro meio nutritivo, compreendendo uma concentra9ao inicial predeterminada de componentes compreendendo uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, minerals e aminoacidos com uma quantidade desejada de material adsorvente a ser adicionada a um meio nutritivo melhorado; (b) determinar se existe um decrescimo na concentra^So de um ou mais dos componentes no primeiro meio nutritivo, apos a incubagao de acordo com ο estagio a), quando comparada a concentra9ao inicial predeterminada do componente; e (c) produzir um meio nutritivo melhorado, que compreende os mesmos componentes que ο primeiro meio nutritivo, em que ο meio nutritivo melhorado compreende: (i) uma concentra9ao aumentada de um ou mais componentes, que foi determinada no estagio (b), de um modo a diminuir em concentra9ao na presenga do material adsorvente; e (ii) ο mesmo tipo de material absorvente em uma faixa de concentra9ao dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com ο estagio (a).

10. Metodo de acordo com a reivindica^So 9, caracterizado pelo fato de que ο primeiro meio nutritivo e incubado com ο material absorvente durante um periodo de tempo de pelo menos 10 minutos a ate uma semana.

11. Metodo de acordo com a reivindicagSo 9, caracterizado pelo fato de que ο material adsorvente e selecionado a partir do grupo que consiste de carvao vegetal, polivinil pirrolidona e silica gel.

12. Metodo de acordo com a reivindicagSo 9, caracterizado pelo fato de que ο material adsorvente e ο carvao vegetal.

13. Metodo de acordo com a reivindica9ao 12, caracterizado pelo fato de que a concentra9ao de carvao vegetal a ser adicionada ao meio nutritivo e de cerca de 1 g/L a cerca de 1OO g/L.

14. Metodo de acordo com a reivindica9ao 12, caracterizado pelo fato de que ο carvao vegetal e tratado com um nao-nutriente, antes da adifao ao meio nutritivo.

15. Metodo de acordo com a reivindica9ao 9’ caracterizado pelo fato de que ο meio nutritivo destina-se ao crescimento de celulas coniferas.

16. Metodo de acordo com a reivindica9ao 9, caracterizado pelo fato de que ο meio nutritivo compreende pelo menos 2 componentes selecionados a partir do grupo, que consiste de NH4NO3, KH2PO4, MgSO4, FeSO4, Mio-inositol, Tiamina-HCL, Piridoxina-HCL, Acido Nicotinic。, Riboflavina, Pantotenato de Ca, Biotina e Acido Folico, DL-Serina, L-prolina, L-arginina-HCL, e L-alanina.

17. Metodo de acordo com a reivindicayao 9, caracterizado pelo fato de que ο volume de meio nutritivo incubado no estagio (a) e de 1/4 a 1/1000 do volume do meio nutritivo melhorado do estagio (c).

18. Metodo de acordo com a reivindica9ao 9，caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente dispor ο meio nutritivo melhorado do estagio (c) no interior de uma ou mais sementes manufaturadas.

19. Metodo de acordo com a reivindicagSo 18’ caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente colocar um embriao de conifera em contato funcional com ο meio nutritivo na semente manufaturada.

20. Metodo de acordo com a reivindicapSo 9，caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente dispor ο primeiro meio nutritivo do estagio (a) no interior de um primeiro conjunto de sementes manufaturadas e dispor ο meio nutritivo melhorado do estagio (c) ao interior de um segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocar um embriao de conifera em contato funcional com ο meio nutritivo em cada uma das sementes manufaturadas do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocar as sementes manufaturadas em um ambiente condutivo para ο crescimento da planta e comparar as frequencias de germina9ao dos embriSes do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas.