BRPI1003857A2 - meio nutritivo, e, semente manufaturada - Google Patents

Abstract

MEIO NUTRITIVO, E, SEMENTE MAMIFATURADA Em um aspecto, é provido um meio nutritivo, que compreende de 10 gIL a 100 g/L de um material adsorvente, de 350 mg/ml a 450 mg/ml de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4, de 5 mg IL a 25 mg/L de FeSO4, de 600 mg/L a 1500 mg/L de MgSO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3,0 mgfL de Tiamina - HCi, de 0,30 mg!L a 0,80 mg/L de Piridoxina-HCl, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Acido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mgIL de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0,15 mgIL a 0, 30 mg/L de Acido Fólico. Em um outro aspecto, é provida uma semente manufaturada que compreende o meio nutritivo aperfeiçoado.

Description

"MEIO NUTRITIVO, Ε, SEMENTE MANUFATURADA" CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a meios nutritivos aperfeiçoados para o crescimento e/ou a germinação de embriões de planta e sementes manufaturadas que compreendem o meio nutritivo aperfeiçoado.

FUNDAMENTOS É freqüentemente desejável plantar grandes quantidades de plantas geneticamente idênticas, que foram selecionadas como tendo propriedades vantajosas, mas, em muitos casos, não é exeqüível produzir tais plantas usando técnicas de procriação convencionais. A cultura in vitro de embriões de planta somáticos ou zigóticos pode ser usada para a produção de grandes números de embriões geneticamente idênticos, que possuem a capacidade de se desenvolverem como plantas normais. No entanto, os embriões resultantes carecem de estruturas protetoras e nutritivas, encontradas em sementes botânicas naturais, que protegem o embrião da planta no interior da semente contra o ambiente do solo severo e nutrem o embrião durante os estágios críticos da semeadura e da germinação. Foram efetuadas tentativas para prover tais estruturas protetoras e nutritivas através do uso de sementes manufaturadas, mas, até o momento, a germinação a partir de sementes manufaturas é menos bem sucedida do que a partir de sementes naturais. Permanecem adicionalmente grandes diferenças entre as sementes manufaturadas e as sementes naturais correspondentes. Enquanto que o embrião depende do megagametófito quanto aos nutrientes úteis para a germinação, o embrião em uma semente manufaturada depende do meio nutritivo, que é provido na semente manufaturada.

Portanto, existe uma necessidade quanto à geração de um meio nutritivo aperfeiçoado, de um modo a que sejam aperfeiçoadas as taxas de conversão para as sementes manufaturadas contendo embriões somáticos, de um modo a prover um grande número de germinantes normais. A presente invenção aborda esta e outras necessidades.

SUMÁRIO

De acordo com um aspecto da invenção, é provido um método para a produção de um meio nutritivo aperfeiçoado, que compreende de 10 g/L a 100 g/L de um material adsorvente, de 350 mg/ml a 450 mg/ml de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1,5 mg/Ç a 3, 0 mg/L de Tiamina-Hcl, de 0,30 mg/L a 0,80 mg/L de Piridoxina-HCl, de 1, 5 mg/L a 3,0 mg/L de Ácido Nicotínico, e de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0, 75 mg/L a 2,0 mg/L de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0, 30 m/L de Ácido Fólico.

De acordo com um outro aspecto da invenção, são providas sementes manufaturadas, que compreendem (a) um revestimento de semente; e (b) um meio nutritivo aperfeiçoado, que compreende de 10 g/L a 100 g/L de um material adsorvente, de 350 mg/L a 450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de : a partir de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1, 5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina-HCl, de 0,30 mg/L a 0,890 mg/L de Piridoxina -HC1, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Ácido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Ácido Fólico.

O meio nutritivo aperfeiçoado e as sementes manufaturadas compreendendo um meio nutritivo aperfeiçoado são úteis para o crescimento e/ou a germinação de um embrião de planta, tal que um embrião de conífera.

DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Os aspectos precedentes e muitas das vantagens pertinentes desta invenção serão mais prontamente apreciados, pois os mesmos se tornam melhor entendidos por referência à descrição detalhada que se segue, quando tomada em conjunção com os desenhos anexos, nos quais:

A FIGURA 1 é uma vista planar em seção transversal de uma semente manufaturada exemplar, que compreende um embrião de planta de acordo com várias modalidades da invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção provê sementes manufaturadas, que compreendem um meio nutritivo modificado, que resulta em uma freqüência de germinação aperfeiçoada em comparação com sementes manufaturadas, que compreendem um meio nutritivo convencional contendo carvão vegetal tratado com nutriente.

Como aqui usado, " um embrião somático de planta" refere-se a um embrião produzido através do cultivo de células de planta totipotentes, tais que o tecido meristemático, sob condições laboratoriais, nas quais as células que compreendem o tecido, são separadas, uma da outra, e são pressionadas para desenvolverem, dentro de minutos, embriões completos. De um modo alternativo, os embriões somáticos podem ser produzidos através de "poliembriogenia por clivagem" de embriões zigóticos. Os métodos para a produção de embriões somáticos de planta, adequados para o uso nos métodos da invenção, são convencionais na arte e foram previamente descritos (vide, por exemplo, as Patentes U.S. N0 s 4. 957. 866; 5. 034. 326; 5.036.007; 5.041. 382; 5.236. 841; 5. 294. 549; 5.482. 857; 5. 563.061; e 5. 821.126). Por exemplo, o tecido da planta pode ser cultivado em um meio de iniciação, que inclui hormônios, de um modo a iniciar a formação de células embriogênicas, tais que as massas de suspensão embriônicas, que são capazes de se desenvolverem como embriões somáticos. As células embriogênicas podem ser então adicionalmente cultivadas em um meio de manutenção, que promove o estabelecimento e a multiplicação de células embriogênicas. Subseqüentemente, as células embriogênicas multiplicadas podem ser cultivadas em um meio de desenvolvimento, que promove o desenvolvimento de embriões somáticos, que podem ser adicionalmente submetidos a tratamentos pós-desenvolvimento, tais que tratamentos frios. Os embriões somáticos, usados nos métodos da invenção, completaram o estágio de desenvolvimento do processo de embriogênese somática. Eles podem ser também submetidos a um ou mais tratamentos pós-desenvolvimento.

De um modo típico, os embriões somáticos da planta, usados na invenção, possuem uma extremidade de broto e uma extremidade de raiz. Em algumas espécies de plantas, a extremidade de broto inclui um ou mais cotilédones (estruturas similares a folha) em algum estágio do desenvolvimento. Os embriões de planta, adequados para o uso nos métodos da invenção, podem ser embriões a partir de qualquer espécie de planta, tais que plantas dicotiledôneas ou monocotiledôneas ou gimnoespermas, tais que os embriões zigóticos ou somáticos de conífera (isto é, o pinheiro, tal que o pinheiro teda, pinheiro, ou conífera norte-americana). Para o uso em sementes manufaturadas de acordo com a presente invenção, o embrião da planta é suficientemente desenvolvido, de um modo a que apresente uma extremidade de broto e uma extremidade de radícula. Em certas espécies de plantas, a extremidade do broto inclui um ou mais cotilédones em algum estágio de desenvolvimento. Em outros tipos de plantas, o(s) cotilédone(s) está(ão) situados em outros locais, que não a extremidade de broto.

Como aqui usado, o termo "germinação" refere-se a um processo fisiológico, que resulta no alongamento de um embrião de planta ao longo de seu eixo, e estão completo quando o embrião foi alongado até o ponto de protrusão através do revestimento da semente ou a capa da semente manufaturada.

Como aqui usado, o termo "germinação completa" refere-se a uma semente manufaturada tendo uma protrusão de raiz através do revestimento da semente ou da capa de semente manufaturada. Uma semente manufaturada para o uso na invenção compreende um embrião de planta, um revestimento de semente manufaturado, e um meio nutritivo. A FIGURA 1 é uma vista planar em seção transversal de uma semente manufaturada exemplar 20, que compreende um embrião de planta 42, disposto no interior da mesma. Tal como mostrado na FIGURA 1, o embrião 42 está disposto no interior de uma cavidade 34, está em contato funcional com o meio nutritivo 26 e está vedado no mesmo, de um modo adequado, através de uma vedação extrema viva 43. Será entendido que a FIGURA 1 provê uma modalidade representativa de uma semente manufaturada 20, que compreende um embrião de planta, um revestimento de semente manufaturado, que circunda o embrião somático da planta compreendendo um orifício, um meio nutritivo em contato funcional com o embrião da planta, e uma capa vedando o embrião somático da planta no interior da semente manufaturada; no entanto, o método não está limitado à modalidade particular da semente manufaturada mostrada na FIGURA 1. Na modalidade exemplar mostrada na figura 1, a semente manufaturada 20 compreende um revestimento de semente 24, um meio nutritivo 26, uma vedação extrema morta 28, e uma capa ciliar opcional 22 (restrição de broto). Na modalidade exemplar mostrada na FIGURA 1, a semente manufaturada 20 compreende um embrião de planta 42, um revestimento de semente 24, um meio nutritivo em contato funcional com o embrião da planta e uma capa ciliar opcional 22 (restrição do broto).

Como aqui usado, um "revestimento de semente manufaturado" refere-se a uma estrutura análoga a um revestimento de semente natural, que protege o embrião da planta e outras estruturas da semente manufaturada contra o dano mecânico, dessecação, contra o ataque por micróbios, fungos, insetos, nematódeos, pássaros, e outros patógenos, herbívoros e pestes, dentre outras funções. O revestimento de semente 24 pode ser fabricado a partir de uma variedade de materiais, que incluem, mas não limitados a, materiais celulósicos, vidro, plástico, plástico moldável, resinas poliméricas curadas, parafina, ceras, vernizes, e combinações dos mesmos, tais que um papel impregnado com cera. Os materiais a partir dos quais o revestimento da semente é produzido são, de um modo geral, não- tóxicos e fornecem um grau de rigidez. O revestimento da semente pode ser biodegradável embora, de um modo típico, o revestimento da semente permaneça intato e resistente à penetração por patógenos de planta, ou até a emergência do embrião em germinação. O revestimento da semente pode ser formado a partir de uma seção de material tubular. O revestimento da semente pode ser uma palha ou um material fibroso seccionado, tal que o papel. As seções de palha podem ser previamente tratadas em um material de revestimento adequado, tal que a cera. De um modo alternativo, o revestimento da semente pode ser formado a partir de uma seção tubular de material plástico biodegradável. Um tal material é o ácido poliláctico ("PLA") e é vendido por MAT-UR de Los Angeles, Califórnia. Um outro material adequado é uma mistura de policaprolactona ("PCL"), tal que CAPA 6800 (Perstorp polyols Inc., Toledo, OK 43 612), com ou sem 1 % de plastificante Tegomer SI6440 (Degussa Goldschmidt Chemical Corp. 914, East Randolph Road, Hopewell, Virgínia 23 860). Tais tubos plásticos biodegradáveis podem ou não requerer um revestimento de cera, pois tais tubos já são resistentes a elementos ambientais. Os aditivos, tais que os antibióticos e os reguladores de crescimento de planta, podem ser adicionados ao revestimento da semente, por exemplo, através da incorporação no material, que forma uma ou mais das camadas do revestimento da semente ou através de revestimento ou tratando, de um outro modo, a(s) camada(s) com o aditivo através de meios convencionais.

A capa ciliar 22, também conhecida como restrição de broto, ou restrição de cotilédone, é manufaturada, de um modo adequado, a partir de um material poroso, que apresente uma dureza suficientemente forte para resistir à perfuração ou à fratura pelo embrião em germinação, tal que um material cerâmico ou de porcelana, e inclui uma porção de vedação extrema e uma porção de restrição de cotilédone 32. A porção de restrição de cotilédone 32 possui uma superfície interior para contatar e circundar pelo menos a extremidade de broto de um embrião de planta e resiste à penetração pela extremidade do embrião durante a germinação. A restrição de broto evita com que a extremidade de broto do embrião, tais que os cotilédones, se desenvolvam ao interior do, e sejam retidas no meio nutritivo (também referido como o meio gametófito). A porção de restrição de cotilédone 32 está formada, de um modo adequado, integralmente ou unitariamente com a porção de vedação 30. A capa ciliar 22 também inclui uma cavidade, que se estende longitudinalmente 34, estendendo-se através da porção de vedação final e parcialmente através de uma extremidade da porção de restrição do cotilédone 32. A extremidade aberta da cavidade 34 é conhecida como uma abertura de restrição de cotilédone 36. A cavidade 34 é dimensionada de um modo a receber um embrião de planta 42 na mesma. Tal como mostrado na FIGURA 1, a capa ciliar 22 compreende uma pluralidade de poros 27, em que os poros 27 permitem com que o meio nutritivo 26 acesse a parte interna da cavidade 34, que compreende o embrião 42, e, deste modo, permita com que o meio nutritivo 26 contate, de um modo funcional, o embrião 42, sob condições suficientes para gerar um embrião condicionado, tal como aqui descrito.

A restrição é porosa, de um modo a permitir o acesso do embrião à água, nutrientes, e oxigênio. A restrição do broto pode ser fabricada a partir de qualquer material adequado, incluindo, mas não limitado a, materiais vítreos, metálicos, elastoméricos, cerâmicos, argilosos, adesivos, cimento, amido, tipo argamassa, poliméricos sintéticos, poliméricos naturais, e materiais adesivos. As restrições de broto exemplares estão descritas na Patente U. S. N0 5. 687. 504 (por exemplo, Col. 3, linha 61, a Col. 4, linha 13; Col. 18, linha 7, a Col. 22, linha 2) incorporadas a este, a título referencial.

Como a seguir mostrado na FIGURA 1, em algumas modalidades da semente manufaturada 20, o material de enchimento 80 circunda, de um modo completo ou parcial, o embrião 42, e aumenta a área superficial do embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26, deste modo provendo vias múltiplas para que os nutrientes a partir do meio nutritivo 26 passem para o embrião 42. Embora seja preferido que o material de enchimento 80 centralize, de um modo substancial, o embrião 42 no interior da cavidade 34, o embrião 42 não precisa estar posicionado deste modo. O material de enchimento 80 precisa apenas posicionar o embrião 42 no interior da cavidade 34, de qualquer modo, para colocar o embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26. Além disso, em algumas modalidades da invenção, o material de enchimento 80 precisa apenas encher, seja de um modo completo ou gradual, um dos dois lados do espaço entre o

embrião 42 e as paredes da cavidade 34.

De um modo preferido, o material de enchimento 80 é um adsorvente, tal que carvão vegetal ativado, resinas Dowex, zeólitos, alumina, argila, terra diatomácea, sílica gel, e Kieselguhr. Durante a montagem da semente manufaturada 20, o material de enchimento 80 é depositado no interior da cavidade 34 da capa ciliar 22, de qualquer modo conhecido na arte, inclusive manualmente. O material de enchimento 80 é, de um modo preferido, mas não necessário, depositado no interior da cavidade 34, de um modo tal que ele centralize substancialmente o embrião 42 no interior da cavidade 34. A centralização do embrião 42 no interior da cavidade 34 aumenta a área superficial do embrião 42 em contato funcional com o meio nutritivo 26. Como aqui usado, o termo "contato funcional" tem a intenção de compreender em uma posição, em que o embrião 42 absorva os nutrientes a

partir do meio nutritivo 26.

Em algumas modalidades, o material de enchimento 80 é o carvão vegetal. De um modo preferido, o carvão vegetal está sob a forma de um pó e é ativado através de tratamento prévio com um ácido, tal que HCl, ou ácido fosfórico. O carvão vegetal ativado está comercialmente disponível. Por exemplo, o carbono ativado NORIT® CNSP ou DARCO® KB-G são produzidos através de ativação, usando um processo de ácido fosfórico e estão disponíveis a partir de Norit Américas Inc., Marshall, Texas, 75671.

Em algumas modalidades, o material de enchimento 80 é carvão vegetal tratado com nutriente. Como aqui usado, o termo carvão vegetal "tratado com nutriente" refere-se a um carvão vegetal que tenha estado em contato com um meio que contenha uma variedade de nutrientes, tais que uma fonte de carbono, vitaminas, minerais, e aminoácidos, de um modo tal que o carvão vegetal absorva e retenha os nutrientes a partir do meio. Um meio representativo, usado para preparar o carvão vegetal tratado com nutriente é o meio KE 64, tal como descrito no Exemplo 1. Um método exemplar para preparar o carvão vegetal tratado com nutriente para o uso como um material de enchimento para a inserção no interior da cavidade 34 é

provido no Exemplo 1.

De acordo com as sementes manufaturadas e com os métodos da invenção, o meio nutritivo 26 (de um outro modo referido como o "meio de gametófito") está em contato funcional com o embrião da planta, disposto no interior da semente manufaturada 20. Como aqui usado, um " meio nutritivo" refere-se a uma fonte de nutrientes, tais que vitaminas, minerais, carbono, e fontes de energia, e a outros compostos benéficos usados pelo embrião durante a germinação. Deste modo, o meio nutritivo é análogo ao gametófito de uma semente natural.

De acordo com um aspecto da invenção, é provido um método para a produção de um meio nutritivo aperfeiçoado, que compreende um material adsorvente para a cultura de células de planta. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende (a)incubar um primeiro meio nutritivo, que compreende uma concentração inicial predeterminada de componentes, que compreendem uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, minerais e aminoácidos, com uma quantidade desejada de um material adsorvente a ser adicionado a um meio nutritivo aperfeiçoado; (b) determinar se existe um decréscimo na concentração de um ou mais componentes em um primeiro meio nutritivo após a incubação de acordo com o estágio (a), quando comparada com a concentração inicial predeterminada do componente; e (c) produzir um meio nutritivo aperfeiçoado, que compreende os mesmos componentes que o primeiro meio nutritivo, em que o meio nutritivo aperfeiçoado compreende : (i) uma concentração aumentada de um ou mais componentes que foi determinada no estágio (b), de um modo a diminuir em concentração na presença do material absorvente ; e (ii) o mesmo tipo de material absorvente, em uma faixa de concentração de dentro de duas vezes aquela que foi usada de acordo com o estágio (a).

Os métodos da presente invenção são úteis para preparar um meio nutritivo, que compreende um material absorvente, tal que o carvão vegetal, para o uso no crescimento e/ou na germinação de embriões de planta. O meio nutritivo aperfeiçoado, gerado de acordo com a invenção, é útil para a manufatura e a germinação de sementes manufaturadas em uma variedade de contextos diferentes.

De acordo com este aspecto da invenção, um primeiro meio nutritivo, que compreende uma concentração inicial predeterminada de componentes, que compreendem uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, minerais e aminoácidos é incubado com um material adsorvente durante um período de tempo suficiente para que os vários componentes do meio sejam adsorvidos ao material adsorvente. Períodos de tempo adequados para a incubação do primeiro meio nutritivo com a composição adsorvente estão em uma faixa de pelo menos cerca de 10 minutos a vários dias ou uma semana, ou um período mais, longo, tal que de pelo menos 15 minutos, pelo menos 30 minutos, pelo menos 1 hora, pelo menos 2 horas, pelo menos 3 horas, pelo menos 4 horas, pelo menos 8 horas, até 24 horas, 48 horas, ou adicionalmente mais longo.

Os materiais adsorventes para o uso nos métodos de produção de um meio nutritivo modificado (ou aperfeiçoado) incluem, mas não estão limitados a, carvão vegetal polivinil polipirrolidona, e sílica géis. Em algumas modalidades, o material adsorvente no primeiro meio nutriente e modificado (aperfeiçoado) é de 1,0 g/L a 100 g/L de carvão vegetal. Em algumas modalidades, o carvão vegetal adicionado ao primeiro meio nutritivo e modificado (aperfeiçoado) é de 1,0 g/L a 100 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente (tal que, por exemplo, de 5 g/L, 20g/L a 100 g/L, de 50 g/L a 100 g/L, de 60 g/L a 100 g/L, ou de 50 g/L a 80 g/L, ou de cerca de 60 g/L). Como aqui usado, o termo carvão vegetal " tratado com não-nutriente", refere-se a carvão vegetal (por exemplo, carvão vegetal simples, ou carvão vegetal ativado) que não tenha estado em contato com meios que contenha uma variedade de nutrientes, tais que uma fonte de carbono, vitaminas, minerais, e aminoácidos, de um modo tal que o carvão vegetal absorva e retenha nutrientes a partir do meio.

De acordo com este aspecto da invenção, o primeiro meio nutritivo e modificado (aperfeiçoado) inclui o mesmo tipo de composição absorvente (por exemplo, carvão vegetal). A concentração de composição adsorvente no meio nutritivo aperfeiçoado está, de um modo típico, dentro de uma faixa de concentração, que é de duas vezes a cinco vezes aquela da concentração do adsorvente que foi incubado no primeiro meio nutritivo. Em algumas modalidades do método, a concentração da composição adsorvente no meio nutritivo aperfeiçoado pé a mesma que a concentração de adsorvente, que foi incubado no primeiro meio nutritivo.

Após o primeiro meio nutritivo ter sido incubado com a composição adsorvente de acordo com o estágio (a), é executada uma análise de um modo a determinar se existe um decréscimo na concentração de um ou mais dos componentes no primeiro meio nutritivo após a incubação, quando comparada com a concentração inicial do componente no primeiro meio nutritivo. Por exemplo, as TABELAS 3 e 4 mostram uma comparação dos componentes do meio, antes e após a incubação com carvão vegetal. Para um ou mais componentes do meio nutritivo, determinado como tendo decrescido no primeiro meio nutritivo após a incubação com o material adsorvente, é efetuado um ajuste de um modo a aumentar a concentração de um ou mais componentes no meio nutritivo aperfeiçoado. Em algumas modalidades do método, é efetuado um ajuste, de um modo tal que o aumento na concentração do componente no meio nutritivo aperfeiçoado corresponda a um decréscimo na concentração, observado no primeiro meio nutritivo, após a composição com a composição adsorvente. Em algumas modalidades do método, o ajuste é efetuado até a concentração do componente no meio nutritivo aperfeiçoado, que adicionalmente considere pelo menos um de (1) o efeito da concentração aumentada do componente particular sobre o pH total do meio; (2) a interação com outros componentes no meio (isto é, a precipitação); ou (3) um nível máximo de um componente particular com relação à viabilidade do embrião da planta a ser contatada com o meio nutritivo. Em algumas modalidades, o método de acordo com este

aspecto da invenção é executado na preparação para o escalonamento, de um modo tal que o primeiro meio nutritivo incubado com a composição adsorvente de acordo com o estágio (a) possua um volume, que é de cerca de 1/4 a 1/100 (tal que de 1/5, 1/10, 1/50, 1/75 a até 1/100) do volume total do meio nutritivo aperfeiçoado de acordo com o estágio (c).

Em algumas modalidades, o método compreende adicionalmente dispor o primeiro meio nutritivo do estágio (a) no interior de um primeiro conjunto de sementes manufaturadas e dispor o meio nutritivo aperfeiçoado do estágio (c) no interior de um segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocando um embrião de conífera em contato funcional com o meio nutritivo em cada uma das sementes manufaturadas a partir do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas, colocando as sementes manufaturadas no interior de um ambiente condutivo para o crescimento da planta e comparando as freqüências de germinação dos embriões a partir do primeiro e do segundo conjunto de sementes manufaturadas, de um modo a determinar se existe um efeito do meio nutritivo aperfeiçoado sobre a freqüência de germinação.

De acordo com este aspecto da invenção, o primeiro meio nutritivo e o meio nutritivo modificado (aperfeiçoado) incluem, de um modo típico, os mesmos componentes, em que o meio nutritivo modificado (aperfeiçoado) compreende uma concentração aumentada de pelo menos um ou mais dos componentes, quando comparado ao primeiro meio nutritivo. Em algumas modalidades do método, o primeiro meio nutritivo e modificado compreende pelo menos dois componentes, selecionados a partir do grupo, que consiste de NH4NO3, KH2PO4, Mio-inositol, Tiamina-HCl, Piridoxina-

r

HCl, Ácido Nicotínico, Ribloflavina, Pantotenato de Ca, Biotina e Acido Fólico, DL-serina, L-prolina, L-arginina-HCL e L-alanina.

O meio nutritivo também inclui, de um modo típico, CuCl2, CaCl2, MgSO4, citrato férrico, MnCl2, H3BO3, ZnSO4, e (NH4)2MoO4, tal como descrito com referência ao meio designado por "MS09", conforme descrito nos Exemplos 1, 3 e 4 neste. Em algumas modalidades, o meio nutritivo aperfeiçoado inclui FeSO4 em uma concentração de cerca de 5mg/L a 25 mg/L, tal que de cerca de 10 mg/L a cerca de 15 mg/L. Em algumas modalidades, o meio nutritivo aperfeiçoado inclui MgSO4 em uma concentração de cerca de 600mg/L a cerca de 1500 mg/L, tal que de cerca de 800 mg/L a cerca de 1200 mg/L.

O meio nutritivo pode compreender também aminoácidos. Os aminoácidos adequados podem incluir aminoácidos comumente encontrados incorporados em proteínas, assim como aminoácidos não comumente encontrados em proteínas incorporadas, tais que o succinato de arginina, citrulina, canavanina, ornitina, e D-estereoisômeros. Em uma modalidade, o meio nutritivo também inclui pelo menos um aminoácido selecionado a partir do grupo, que consiste de a partir de 85 mg/L a 100 mg/L de DL-serina; de 55 mg/L a 70 mg/L de L-prolina, de 300 mg/L a 600 mg/L de L-arginina-HCL, e

de 55 mg/L a 70 mg/L de L-alanina.

O meio nutritivo compreende adicionalmente, de um modo típico, uma ou mais fontes de carbono, vitaminas, e minerais. As fontes de carbono incluem, mas não estão limitadas a, monossacarídeos, dissacarídeos, e/ou amidos. O meio nutritivo modificado pode também incluir um ou mais compostos envolvidos no metabolismo de nitrogênio, tais que uréia ou poliaminas.

O meio nutritivo pode adicionalmente incluir substâncias que portam oxigênio, de um modo a aumentar tanto a absorção de oxigênio, como a retenção de oxigênio pelo meio nutritivo, deste modo permitindo com que o meio mantenha uma concentração de oxigênio, que é mais alta do que a que estaria presente de um outro modo no meio unicamente a partir da absorção de oxigênio a partir da atmosfera. Substâncias, que portam oxigênio exemplares, incluem perfluorocarbonetos, tais que FC-77, e tensoativos, tais que Pluronic F-68, disponível de BASF Corp. Parsippany, N. J. As substâncias que portam oxigênio exemplares estão descritas na Patente U. S. N0 5.564.224 (por exemplo, Col. 9, linha 44, a Col. 11, linha 67),

incorporadas a este a título referencial. O meio nutritivo pode também conter hormônios. Os

hormônios adequados incluem, mas não estão limitados a, ácido abscísico, citoquininas, auxinas, e giberelinas. O ácido abscísico é um hormônio de planta sequiterpenóide, que está implicado em uma variedade de processos fisiológicos da planta (vide, por exemplo, Milborrow, J. Exp. Botany 52: 1145-1164 (2001); Leung & Giraudat5 Ann. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol 49: 199-123 (1998)). As auxinas são hormônios o crescimento da planta, que promovem a divisão e o crescimento celular. As auxinas exemplares para o uso no meio de germinação incluem, mas não estão limitadas a, ácido 2,4- diclorofenoxiacético, ácido indol-3-acético, ácido indol-3-butírico, ácido naftaleno acético e ácido clorogênico. As citoquininas são hormônios do crescimento da planta, que afetam a organização de células que se dividem. As citoquininas exemplares, para o uso no meio de germinação, incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, 6-benzilaminopurina, 6- furfurilaminopurina, diidrozeatina, zeatina, quinetina e zeatina ribosídeo. As giberelinas constituem uma classe de hormônios de planta diterpenóides (vide, por exemplo, Krishnamoorthy, Gibberellins and Plant Growth, John Wiley & Sons (1975)). Exemplos representativos de giberelinas, úteis na prática da presente invenção, incluem o ácido giberélico, giberelina 3, giberelina 4 e giberelina 7. Um exemplo de uma mistura útil de giberelinas é uma mistura de giberelina 4 e de giberelina 7 (referida como a giberelina 4/7), tal que a giberelina 4/7, vendida por Abbott Laboratoires, Chicago, Illinois. Quando o ácido abscísico está presente no meio nutritivo modificado, ele é, de um modo típico, usado em uma concentração na faixa de a partir de cerca de 1 mg/L a cerca de 200 mg/L. Quando presente no meio nutritivo, a concentração de giberelina(s) está, de um modo típico, entre cerca de 0,1 mg/L e cerca de 500 mg/L. As auxinas podem ser usadas, por exemplo, em uma concentração de a partir de 0, 1 mg/L a 200 mg/L. As citoquininas podem ser usadas, por exemplo, em uma concentração de a partir de 0,1 mg/L a 100 mg/L.

O meio nutritivo pode também incluir agentes antimicrobianos. Os agentes antimicrobianos adequados estão disponíveis de Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, vendidos como o Produto # A 5955. Os agentes antimicrobianos podem ser usados, por exemplo, em uma concentração de 1 ml/L.

O métodos da invenção podem ser também executados com meio nutritivos, que incluem uma substância, que causa com que o meio seja um semi-sólido, ou que possua uma consistência congelada sob uma condição ambiental normal. Por exemplo, o meio nutritivo pode estar sob a forma de um gel hidratado. Um "gel" é uma substância, que é preparada como uma solução coloidal, e que irá, ou será causada a, formar um material semi-sólido. Uma tal conversão de uma solução de gel líquido em um material semi-sólido é aqui denominada "cura" ou "sedimentação" do gel. Um " gel hidratado" refere-se a um gel contendo água. Tais géis são preparados primeiramente pela dissolução em água (em que a água serve como o solvente, ou a "fase contínua), que, mediante a cura, é combinada com a fase contínua, de um modo a formar o material semi-sólido. Deste modo, a água é associada, de um modo homogêneo, com as moléculas solutas, sem que experimente qualquer separação substancial da fase contínua a partir da fase dispersa. No entanto, as moléculas de água podem ser livremente retiradas a partir de um gel hidratado durado, tal que através da evaporação ou da inibição, por um embrião em germinação. Quando curados, estes géis adquirem as características de sólidos resilientes, tais que uma massa de gelatina, em que a resiliência se torna progressivamente menor, e o gel se torna mais " sólido " ao toque, à medida que a quantidade relativa de água no gel é diminuída.

Em adição a ser solúvel em água, os solutos de gel adequados não são citotóxicos, nem substancialmente fitotóxicos. Como aqui usada, uma substância "substancialmente não-fitotóxica" é uma substância que não interfere, de um modo substancial, com o desenvolvimento da planta normal, tal que pela exterminação de um número substancial de células da planta, alterando, de um modo substancial, a diferenciação celular ou a maturação, causando mutações rompendo um número substancial de membranas celulares, ou rompendo, de um modo substancial, o metabolismo celular, ou rompendo, de um modo substancial, um outro processo.

Os solutos de gel candidatos incluem, mas não estão limitados, aos seguintes : alginato de sódio, ágar, agarose, amilose, pectina, dextrano, gelatina, amido, amilopectina, celuloses modificadas, tais que metil celulose e hidroxietil celulose, e poliacrilamida. Outros solutos de gel hidrofílicos podem ser também usados, desde que eles possuem propriedades de hidratação e de gelação similares e que careçam de toxicidade.

Os géis são, de um modo típico, preparados através da dissolução de um soluto de gel, de um modo usual, em uma forma em partículas finas, em água, de um modo a formar uma solução de gel. Dependendo do soluto de gel particular, o aquecimento é, de um modo usual, necessário, algumas vezes até a fervura, até que o soluto de gel seja dissolvido. O resfriamento subsequente irá causar com que muitas soluções de gel sejam " sedimentadas" ou curadas (sejam transformadas em gel), de um modo reversível. Os exemplos incluem gelatina, ágar e agarose. Os solutos de gel são denominados " reversíveis" porque o reaquecimento do gel curado irá formar novamente a solução do gel. Soluções de solutos de gel requerem um agente de "complexação", que serve para curar, de um modo químico, o gel, através da reticulação de moléculas de soluto de gel. Por exemplo, o alginato de sódio é curado através da adição de nitrato de cálcio (Ca(NO3)2) ou de sais de outros íons divalentes, tais que, mas não limitados a, cálcio, bário, chumbo, cobre, estrôncio, cádmio, zinco, níquel, cobalto, magnésio e ferro, à solução de gel. Muitos dos solutos de gel, que requerem agentes de complexação, se tornam curados de um modo irreversível, em cujo caso o reaquecimento não irá estabelecer novamente a solução do gel.

A concentração de soluto de gel, requerida para que seja preparado um gel satisfatório de acordo com a presente invenção, varia, dependendo do soluto de gel particular. Por exemplo, uma concentração útil de alginato de sódio está dentro de uma faixa de cerca de 0,5% p/v, a cerca de 2,5% p/v, de um modo preferido de cerca de 0,9% p/v a 1, 5% p/v. Uma concentração útil de ágar está dentro de uma faixa de cerca de 0,8% p/v a cerca de 2,5% p/v, de um modo preferido de cerca de 1, 8% p/v. De um modo geral, os géis curados através de complexação requerem menos soluto de gel para formar um gel satisfatório do que os géis "reversíveis".

Através da prática dos métodos deste aspecto da invenção, os presente inventores geraram um meio nutritivo modificado (aperfeiçoado) para o uso em sementes manufaturadas, tal como descrito no Exemplo 2.

Em algumas modalidades, é provido um meio nutritivo aperfeiçoado, em que o meio nutritivo compreende de 10 g/L a 100 g/L de um material adsorvente tratado com não-nutriente, e de 350 mg/L a 450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de: de 150 mg/ml a 300 mg/ml de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina -HC1, de 0,30 mg/L a 0,80 mg/L de piridoxina-HCl, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de ácido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0,15 mg/L a 0,30 mg/L de Ácido Fólico.

Em algumas modalidades, o meio nutritivo aperfeiçoado compreende adicionalmente pelo menos 1 componente selecionado a partir do grupo, que consiste de : de 85 mg/L a 100 mg/L de DL-serina; de 55 mg/L a 70 mg/L de L-prolina, de 300 mg/L a 600 mg/L de L-arginina-HCL, e de

55 mg/L a 70 mg/L de L-alanina.

Em algumas modalidades, o meio nutritivo aperfeiçoado compreende cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a 2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de 0,50 mg /L de Piridoxina-HCl, cerca de 2,0 mg/L de Ácido Nicotínico, cerca de 0, 26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0, 25 mg/L de ácido Fólico.

De acordo com um outro aspecto da invenção, tal como descrito nos Exemplos 3 e 4, os presentes inventores descobriram, durante a experimentação, que uma semente manufaturada, que compreende um meio nutritivo modificado (aperfeiçoado), que compreende de 10 g/L a 100 g/L de um material adsorvente tratado com não-nutriente, e de 350 mg/L a 450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1, 5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina-HCl, de 0,30 mg/L a 0, 80 mg/L de Piridoxina-HCl, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Ácido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0,15 mg/L a 0,30 mg/L de Ácido Fólico, provê um aperfeiçoamento na taxa de germinação e a normalidade dos germinantes, em comparação com uma semente manufaturada que compreende um meio nutritivo convencional (isto é, KE 64), incluindo 60 g/L de carvão vegetal tratado com nutriente.

Em algumas modalidades, o meio nutritivo modificado para o uso na semente manufaturada compreende de cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a cerca de 2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de 0,50 mg/L de Piridoxina-HCl, e cerca de 2,0 mg/L de ácido Nicotínico, cerca de 0,26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0,25 mg/L de Ácido Fólico.

Em algumas modalidades, a semente manufaturada compreende adicionalmente uma restrição de broto, em que a restrição de broto compreende uma cavidade dimensionada para receber o embrião de conífera. Em algumas modalidades, a semente manufaturada compreende adicionalmente um embrião de conífera disposto no interior da cavidade da restrição de broto.

Em algumas modalidades, a semente manufaturada

compreende adicionalmente um material adsorvente, tal que o carvão vegetal, na cavidade. Em algumas modalidades, o carvão vegetal na cavidade é tratado com nutriente.

Em uma modalidade exemplar, a semente manufaturada compreende um meio nutritivo, que compreende cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a cerca de 2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de 0,50 mg/L de Piridoxina-HCl, cerca de 2,0 mg/L de Ácido Nicotínico, cerca de 0,26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0, 25 mg/L de Ácido Fólico. O Meio MS09, tal como descrito nos Exemplos 1, 3 e 4 é um meio nutritivo modificado exemplar para o uso nas sementes manufaturadas e nos métodos

de germinação, tais como aqui descritos.

O meio nutritivo modificado (aperfeiçoado), gerado usando os

métodos da invenção, e as sementes manufaturadas que compreendem o meio nutritivo, podem ser usados para a germinação de um embrião de conífera. O método de acordo com este aspecto da invenção compreende (a) colocar um embrião de conífera em contato funcional com um meio nutritivo em uma semente manufaturada, o meio nutritivo compreendendo: de 10 g/L a 100 g/L de carvão vegetal, de 350 mg /L a 450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de: de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina-HCl, de 0,30 mg/L a 0,80 mg/L de Piridoxina-HCl, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de ácido Nicotínico, e de 0,15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de Pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0, 30 mg/L de Ácido Fólico; e (b) colocação da semente manufaturada em um ambiente condutivo para o crescimento da planta, de um modo a permitir com que o embrião possa crescer e germinar a partir da semente manufaturada.

Conforme descrito supra, os presentes inventores descobriram, através de experimentação, que uma semente manufaturada, que compreende um meio nutritivo modificado, melhora a freqüência de germinação de embriões de conífera em comparação com um meio nutritivo padrão (por exemplo, KE 64). O meio nutritivo modificado aqui descrito em conexão com as sementes manufaturadas é também útil nos métodos para a germinação de um embrião. Em algumas modalidades do método, o carvão vegetal no meio nutritivo modificado é tratado com um não-nutriente, anteriormente à adição ao meio. Em algumas modalidades, o meio nutritivo modificado compreende de 10 g/L a 100 g/L de carvão vegetal. Em algumas modalidades, o carvão vegetal adicionado ao meio nutritivo modificado é de g/L a 100 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente (tal que, por exemplo, de 20 g/L a 100 g/L, de 50 g/L a 100 g/L, de 60 g/L a 100 g/L, ou de 50 g/L a 80 g/L, ou de cerca de 60 g/L).

Em algumas modalidades do método, o meio nutritivo modificado para o uso na semente manufaturada compreende cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, de cerca de 2000 mg/L a cerca de 2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo que consiste de: cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina-HCl, cerca de 0,50 mg/L de Piridoxina-HCl, cerca de 2,0 mg/L de ácido Nicotínico, cerca de 0,26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0,25 mg/L de Ácido Fólico.

Os exemplos que se seguem ilustram meramente o melhor modo agora contemplado para a prática da invenção, mas não devem ser construídos de um modo a limitar a invenção.

EXEMPLO 1

Este exemplo provê um método de preparação representativo de um meio nutritivo adequado, carvão vegetal tratado com nutriente, e de sementes manufaturadas representativas, adequadas para o uso nos métodos da invenção.

Métodos;

1. Meio Nutritivo (KE 64-50): é produzido pela combinação do Meio Básico KE64 (Tabela 1) com os componentes da Tabela 2, tal como descrito. KE 64-50 é também preparado a partir de materiais pré-fabricados. A quantidade requerida de cada solução de material (que não é termicamente instável) é adicionada à água. Substâncias químicas não-material (tais que carvão vegetal e ágar) são pesadas e diretamente adicionadas ao meio. Após todas as substâncias químicas não termicamente instáveis e os compostos serem adicionados, o meio é conduzido a um volume apropriado e o pH é ajustado para 5,7. O meio é então esterilizado através de autoclavagem, durante 25 minutos.

TABELA 1 : Formulação de Meio Básico KE64

Componente do Meio Concentração Final (mg/l) NH4NO3 301,1 H3BO3 10,0 (NH4)2MoO4 0,06 CaCl2-2H20 299,2 KH2PO4 1800,0 MgS04-7H20 1000,0 MnCl2.4H20 6,0 ZnS04-7H20 0,8 CuCl2-2H20 0,5 Citrato Férrico 60 mg/L Pluronic F-68 10 g/l Agar 18 g/l Os componentes termicamente instáveis esterilizados em filtro (Tabela 2) são adicionados após o meio ter sido resfriado a 40°C.

TABELA 2: Componentes adicionados ao Meio Básico KE64

Componente do Meio

Mio-inositol Tiamina-HCl Piridoxina-HCl Ácido Nicotínico Riboflavina Pantotenato de Ca Biotina Ácido Fólico

L-asparagina

L-glutamina

L-Iisina-2HC1

DL-serina

L-prolina

L-arginina-Hcl

Uréia

Concentração Final mM

0,5549 0,0030 0,0012 0,0081 0,0021

0,0003 0,8077

1,8255 0,3646 0,7612 0,4631 1,5310 0,4552 13,3200

L-valina L-alanina L-Ieucina L-treonina L-fenilalanina L-histidina L-triptofano L-isoleucina L-metionina L-glicina

L-tirosina

L-cisteína

Sacarose

Acido Giberílico (GA4ff)

Agentes Antimicrobianos

0,5983 0,2203 0,2448 0,3226 0,1720 0,1308 0,2035 1,2930 0,7100 0,0003

0,2242

0,6098

Concentração Final (mg/l)

100,0 1,0 0,25 1,0 0,125 0,50 0,0010 0,1250

106,7 266,7 53,3 80 53,3 266,7 800

53,3 53,3 80 26,7 53,3 26,7 26,7 26,7 26,7 53,3

53,3

26,7

50 g/l

0,1

1,0 ml/l

2. Preparação de Carvão vegetai para a adição aos meios e/ou à cavidade de corrosão das sementes manufaturadas

A. Preparação de Carvão vegetal tratado com nutriente;

Um meio básico KE64 (Tabela 1) é preparado, como acima descrito, sem Pluronic F-68 e sem ágar. 23, 3 gramas de carvão vegetal de 100 mesh são adicionados a 1 litro de Meio Básico KE 64. Os componentes são autoclavados, e deixados resfriar a 40°C. Os componentes da Tabela 2, conforme descrito no Exemplo 1, são adicionados, de um modo estéril, ao meio básico KE64, e o meio é agitado, durante pelo menos 2 horas, de um modo a misturar os componentes. O meio é filtrado através de um papel de filtro Whatman # 1, em um funil de Buchner, de um modo a coletar o carvão vegetal. Um equilíbrio da umidade é usado de um modo a determinar o conteúdo de umidade da torta de carvão vegetal, e o peso seco do carvão vegetal é calculado. Se o carvão vegetal tratado com nutriente tiver que ser adicionado à cavidade da semente manufaturada, ele é primeiramente secado, de um modo a que ele se torne uma matéria escoável.

B. Preparação de Carvão vegetal tratado com não- nutriente : Carvão vegetal de 100 mesh, que foi ativado quimicamente usando um processo de ácido fosfórico (NORIT® CNSP) foi obtido a partir

de Norit Américas Inc., Marshall, Texas.

3. Preparação de sementes manufaturadas: Os métodos representativos, usados para a produção de sementes manufaturadas, são descritos nas Patentes U.S. Nos 6.119.395; 5.701.699; e 5.427. 593,

incorporadas a este a título referencial.

De um modo descrito genericamente, as sementes manufaturadas incluem um revestimento de semente (24), um meio nutritivo (26), um embrião de planta (42), e, de um modo opcional, uma restrição de cotilédone (22). Um semente manufaturada, que não inclui uma parte de embrião (42), é conhecida na arte como uma "semente vazia". A semente vazia é uma cápsula cilíndrica tendo uma extremidade fechada e uma

extremidade aberta.

O meio nutritivo (26), também referido como o "Meio de Gametófito" é análogo ao gametófito de uma semente natural, e está colocado no interior do revestimento da semente, de um modo a preencher substancialmente o interior do revestimento da semente. Um meio nutritivo exemplar (26) para o uso em sementes manufaturadas, inclui o KE64 acima descrito, ou um meio nutritivo modificado, como aqui descrito, que pode incluir de 0 g/L a 100 g/L de uma composição adsorvente, tal que o carvão vegetal. O carvão vegetal para o uso no meio nutritivo pode ser previamente tratado com nutrientes, conforme acima descrito, ou pode ser carvão vegetal

não-tratado com nutriente, simples.

Uma inserção porosa dura, que se estende longitudinalmente, conhecida como uma restrição de cotilédone (22), está localizada centralmente no interior de uma extremidade do revestimento da semente circundada pelo meio nutritivo e inclui uma cavidade localizada centralmente (34), também referida como a uma cavidade de corrosão" que se estende parcialmente através do comprimento da restrição de cotilédone. A cavidade (34) é dimensionada de um modo a receber um embrião de planta (42) na mesma. O embrião de planta bem conhecido inclui uma extremidade de radícula e uma extremidade de cotilédone. O embrião de planta é depositado no interior da cavidade de restrição de cotilédone (22), primeira extremidade de cotilédone. O embrião de planta é então vedado no interior da semente vazia através de uma vedação extrema (43). Uma mancha enfraquecida na vedação extrema (43) permite com que a extremidade de radícula do embrião

da planta penetre na vedação extrema.

Em um método exemplar para preparar uma semente

manufaturada para o uso na invenção, o revestimento da semente é preparado pelo seccionamento da tubulação de policaprolactona no comprimento apropriado. As restrições de broto cerâmicas são produzidas pela injeção de uma aba de porcelana no interior de um molde previamente formado, com um pino no centro, de um modo a criar a cavidade de aceitação de broto. A aba é deixada secar a uma consistência que permita a remoção da restrição previamente formada. A restrição é subseqüentemente aquecida a uma temperatura, que permita com que a porcelana forme uma estrutura porosa, mas fundida. A restrição pode ser lavada com um ácido, de um modo a remover as impurezas, se desejado. As tampas são produzidas a partir de Parafilm™ previamente estirado (Pechiney Plastic Packaging, Chicago,

Illinois 60 631).

As sementes manufaturadas são unidas através de

termoligação da restrição do broto cerâmico (22) ao revestimento da semente

(24). O revestimento da semente (24) é então enchido com meio nutritivo (26) e um embrião é inserido ao interior da cavidade (34), na restrição do cotilédone (22), a extremidade do cotilédone primeiramente. O material de enchimento de carvão vegetal seco (80) (seja tratado ou nutriente ou tratado com não-nutriente) pode estar localizado na restrição do cotilédone após o embrião ter sido inserido no interior da cavidade (34). Após o carvão vegetal ter sido adicionado, as sementes são então vedadas com uma vedação extrema secundária, através de sua deposição sobre a extremidade aberta da semente e fusão das tampas à superfície por meio de calor. As vedações extremas primárias são então imersas em uma mistura de cera azul, antes da união à vedação extrema secundária. Isto promove uma boa ligação entre as vedações extremas primária e secundária. As sementes são então impregnadas com

agentes antimicrobianos.

4. Preparação de embriões de planta:

Os embriões zigóticos são preparados a partir de sementes botânicas. As sementes são então esterilizadas superficialmente através de métodos similares àqueles previamente descritos (Cyr et al., Seed Sei. Res. 1: 91-97 (1991))· As sementes são rompidas e abertas e os embriões zigóticos são dissecados a partir do megagametófito com escalpos e fórceps em uma

cobertura de fluxo laminar. Os embriões somáticos são produzidos de acordo com os

métodos convencionais, previamente descritos (vide, por exemplo, as Patentes

U.S. Nos 4. 957. 866; 5.034.326; 5.036. 007; 5.041. 382; 5. 236. 841; 5. 294.

549; 5. 482.857; 5.563. 061; e 5. 821. 126). Por exemplo, o tecido da planta

pode ser cultivado em um meio de iniciação, que inclui hormônios, de um

modo a iniciar a formação de células embriogênicas, tais que as massas de

suspensão embriônicas, que são capazes de se desenvolverem sob a forma de

embriões somáticos. As células embriogênicas podem então ser

adicionalmente cultivadas em um meio de manutenção, que promove o

estabelecimento e a multiplicação de células embriogênicas. Subseqüentemente, as células embriogênicas multiplicadas podem ser cultivadas em um meio de desenvolvimento, que promove o desenvolvimento de embriões somáticos, que podem ser, de um modo adicional, submetidos a tratamentos pós-desenvolvimento, tais que tratamentos frios. Os embriões somáticos, usados nos métodos da invenção, completaram o estágio de desenvolvimento do processo de embriogênese somático. Eles podem ser também submetidos a um ou mais tratamentos de pós-desenvolvimento.

5. Germinação: uma quantidade adequada de areia estéril é preparada através do cozimento de 2 litros de areia em uma temperatura de 375°F, durante 24 horas. A areia é então adicionada a bandejas previamente esterilizadas e 285 ml de água são adicionados. São então formados sulcos e a caixa é vedada. A caixa contendo areia é então autoclavada durante 1 hora a

1210C e sob pressão atmosférica 1.

As sementes manufaturadas são semeadas na areia e deixadas

germinar. De um modo típico, as sementes manufaturadas são cultivadas sob

luz contínua, em temperatura ambiente (23°C), durante de quatro a cinco

semanas.

Vários parâmetros podem ser medidos, de um modo a determinar a freqüência de germinação das sementes manufaturadas e a

qualidade dos germinantes.

Em um período de tempo designado após a semeadura, os

comprimentos da radícula, hipocótilo, cotilédones, e epicótilo dos agentes de

germinação podem ser medidos.

O termo "radícula" refere-se à parte de um embrião de planta,

que se desenvolve no interior da raiz primária da planta resultante.

O termo "cotilédone" refere-se genericamente ao, primeiro, primeiro par, ou primeiro espira (dependendo do tipo de planta) de estruturas similares a folha no embrião da planta, que funcionam primariamente para produzir compostos alimentícios na sementes disponíveis para o desenvolvimento do embrião, mas que, em alguns casos, agem como estruturas fotossintéticas ou de armazenamento de alimento.

O termo "hipocótilo" refere-se à porção de em embrião de planta ou muda localizada abaixo dos cotilédones, mas acima da radícula. O termo "epicótilo" refere-se à porção de haste da muda, que

está acima dos cotilédones.

A taxa de germinação pode ser medida e a normalidade dos

germinantes pode ser também avaliada. Um "germinante normal " ou "normalidade" denota a presença de todas as partes da planta esperadas em um período de tempo de avaliação. No caso dos gimnoespermas, a normalidade é caracterizada pelo fato de que a radícula possua um comprimento maior do que 3 mm e de que não hajam má formações visivelmente discerníveis, comparadas ao aparecimento de embriões germinados a partir de semente natural. "Não normal " significa que o tecido sobre pelo menos um órgão está intumescido, e que a raiz e os cotilédones estão mortos. " não normal inteiramente extraído " significa que o germinante emergiu inteiramente a partir da cavidade, mas que não está normal. Inalterado " significa um embrião que não foi alterado a partir do dia um do experimento (isto é, não ocorreu germinação). EXEMPLO 2

Este Exemplo descreve a preparação de um meio nutritivo modificado para o uso em sementes manufaturadas contendo carvão vegetal

tratado com não-nutriente.

Métodos: O meio KE64, produzido como descrito no Exemplo

1, foi incubado na presença ou na ausência de carvão vegetal tratado com

nutriente ou tratado com não-nutriente, e a concentração dos componentes do

meio foram medidas após a incubação.

O carvão vegetal de 100 mesh tratado com nutriente foi

preparado como descrito no Exemplo 1. Condições Testadas:

1. Meio KE64 sem adição de carvão vegetal (amostra 012).

2. Meio KE64 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado

com não-nutriente de 100 mesh (amostra 013). 3. Meio KE64 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado

com nutriente de 100 mesh (amostra 014).

O carvão vegetal foi adicionado onde indicado, misturado, e

incubado durante 2 horas. A concentração dos componentes do meio foi analisada como mostrado abaixo na Tabela 2. TABELA 3: Comparação da Concentração Medida dos Componentes do Meio, antes e após a incubação, na presença de carvão vegetal. As medições

estão em mg/L, a não ser que indicado de um outro modo.

Componente do Meio Meio KE64 (sem carvão vegetal) Concentração Final Esperada (mg/L) "B" Meio KE64 (sem carvão vegetal) Concentração Medida (mg/L) (mg/L) "C" Meio KE64 acrescido de carvão vegetal (não-tratado) Concentração Medida (mg/L) "D" Meio KE"4 acrescido de carvão vegetal (tratado com nutriente) Concentração Medida (mg/L) "E" NHzlNO^ 301,1 322,3 296,8 381,3 ΗςΒΟ^ 10,0 11,4 9,7 11,4 (NHA)-JMOOA 0,06 0,08 0,02 0,02 CaCl7-IH9O 299,2 275,9 124,7 271,1 KH7PO4 1800,0 1573 2513 1907 MrS0A-7H70 1000,0 987,3 635,6 960,9 MnCl7.4H70 6,0 3,8 1,7 3,9 ZnS0A-7H70 0,8 0,15 0,09 0,10 CuCl7-2H7 O 0,5 0,27 <0,01 <0,01 Mio-inositol 100,0 ND ND ND Tiamina-HCl 1,0 ND ND ND Piridoxina-HCl 0,25 ND ND ND Ácido Nicotínico 1,0 ND ND ND Riboflavina 0,13 ND ND ND Pantotenato de Ca 0,50 ND ND ND Biotina 0,0010 ND ND ND Ácido Fólico 0,1250 ND ND ND L-asparagina/Serina 187 191 155 204 L-Glutamina/Histidina 293 231 166 206 L-Lisina-HCl 53,3 43 21 32 DL-Serina 80,0 ND ND ND L-prolina 53,3 94 87 100 L-Arginina-HCl 266,7 256 43 76 L-Valina 53,3 50 41 49 L-Alanina 53,3 45 40 49 L-Leucina 80,0 75 48 64 L-Treonina 26,7 44 I 37 42 Meio KE64 Meio KE"4 acrescido Meio KE64 (sem Meio KE64 (sem acrescido de de carvão vegetal carvão vegetal) carvão vegetal) carvão vegetal (tratado com Concentração Concentração (não-tratado) nutriente) Final Esperada Medida (mg/L) Concentração Concentração Medida (mg/L) (mg/L) Medida (mg/L) (mg/L) L-Fenilanina 53,3 51 5 10 L-Triptofano 26,7 19 ND ND L-Isoleucina 26,7 25 16 22 L-Metionina 26,7 18 ND ND L-Glicina 53,3 52 40 51 L-Tirosina 53,3 56 3 6 L-Cisteina 26,7 ND ND ND Sacarose 50,0 g/L 52,8 g/L 49,2 g/L 63,2 g/L Uréia 800 ND ND ND

TABELA 4: Análise dos Resultados da TABELA 3

Concentração absorvida em carvão vegetal mg/L (C-D) Ganho em concentração de nutriente de sobrenadante devido à adição de carvão vegetal tratado ao meio mg/L (E-C) Fator de Ajuste do Meio E/C Nova Concentração de Partida (HxB) Componente do Meio "F" "G" "H" "I" NHUNOt 25,5 59,0 1,2 361,3 Η,ΒΟτ 1,7 0,0 1,0 10,00 (NH4)7MoO4 0,1 -0,1 1,0 0,1 CaCb-2H?0 151,1 -4,8 1,0 299,2 KH7PO4 -940,3 333,9 1,1 2059,8 MgS04-7H?0 351,7 -26,4 1,0 1000,0 MnCl->.4H<>0 2,1 0,1 1,0 6,0 ZnS04-7H90 0,10 -0,1 1,0 0,8 CuCl9-2H70 ND ND 1,0 0,5 Mio-inositol ND ND ND 100,0 Tiamina-HCl ND ND ND 1,0 Piridoxina-HCl ND ND ND 0,3 Ácido Nicotínico ND ND ND 1,0 Riboflavina ND ND ND 0,1 Pantotenato de Ca ND ND ND 0,5 Biotina ND ND ND 0,0 Ácido Fólico ND ND ND 0,1 L-asparagina/Serina 36,0 13,0 1,1 L-Asparagina: 117,4 Serina: 88,0 L-Glutamina/Histidina 65,0 -25,0 1,0 L-Glutamina:266,7 L-Histidina: 26,7 L-Lisina-HCl 22,0 -25,0 1,0 53,3 L-prolina 7,0 6,0 1,1 58,6 L-Arginina-HCl 213,0 -180,0 2,0 533,4 L-Valina 9,0 -1,0 1,0 53,3 L-Alanina 5,0 4,0 1,1 58,6 L-Leucina 27,0 -11,0 1,0 80,0 L-Treonina 7,0 -2,0 1,0 26,7 L-Fenilanina 46,0 -41,0 1,0 53,3 L-Isoleucina 9,0 -3,0 1,0 26,7 L-Glicina 12,0 -1,0 1,0 53,3 L-Tirosina 53,0 -50,0 1,0 53,3 L-Cisteina ND ND ND 53,3 Sacarose 3,6 10,4 1,2 60,0 Uréia ND ND 1,0 800,0 TABELA 5: Meio Nutritivo Modificado MS08 e MS09

Componente do Meio Meio KE64 Concentração Final (mg/L) Concentração Final de MS08 (mg/L) Concentração Final de MS09 (mg/L) NH4NO3 301,1 301,1 371,7 H3BO3 10,0 10,0 10,0 (NH4)2MoO4 0,06 0,06 0,06 CaCl2-2H20 299,2 299,2 299,2 KH2PO4 1800,0 2088 2088 MgS04-7H20 1000,0 1000 1000 MnCl2.4H20 6,0 6,0 6,0 ZnS04-7H20 0,8 0,8 0,8 CuCl2-2H20 0,5 0,5 0,5 Citrato Férrico 60 mg/l 60 60 100 100 200 Tiamina-HCl 1,0 1,0 2,0 0,25 0,25 0,50 Ácido Nicotínico 1,0 1.0 2,0 0,125 0,13 0,26 Pantotenato de Ca 0,50 0,50 1,0 0,0010 0,01 0,02 0,1250 0,13 0,25 106,7 11,73 11,73 266,7 266,7 266,7 L-lisina-2HCl 53,3 53,3 53,3 80,0 88,0 88,0 53,3 58,63 58,63 266,7 533,3 533,3 800,0 800 800 53,3 53,3 53,3 53,3 58,63 58,63 80,0 80,0 80,0 26,7 26,7 26,7 L-fenilalanina 53,3 53,3 53,3 L-histidina 26,7 26,7 26,7 26,7 26,7 26,7 26,7 26,7 26,7 L-metionina 26,7 26,7 26,7 53,3 53,3 53,3 53,3 53,3 53,3 26,7 26,7 26,7 IORfl 9,Ogfl 9,0 g/l Carvão vegetal 60g/l (tratado com nutriente) 60,0g/l (tratado com não- nutriente) 60,Ogfl (tratado com não- nutriente) 18g-26g/l 18,0g/l 18,Ogfl t>H 5,7 5,7 k"____ Sacarose 50g/l 60,0g/l 60,0g/l

TABELA 6: Sumário dos componentes que diferem em meio modificado MS- 08 e MS-09 em comparação com KE64 Componente do Meio Meio KE64 Concentração Final (mg/L) Concentração Final de MS08 (mg/L) Concentração Final ae MS09 (mg/L) NH4NO3 301,1 301,1 371,7 KH2PO4 Mio-inositol Tiamina-HCl Piridoxina-HCl Ácido Nicotínico 1800,0 100 1,0 0,25 1,0 2088 100 1,0 0,25 1,0 2088 200 2,0 0,50 2,0 Componente do Meio Riboflavina Pantotenato de Ca Biotina Ácido Fólico Meio KE64 Concentração Final (mg/L) 0,125 0,50 0,0010 0,1250 Concentração Final de MS08 (mg/L) 0,13 0,50 0,01 0,13 11 73 Concentração Final de MS09 (mg/L) 0,26 1,0 0,02 0,25 11,73 L-asparagina DL-serina L-prolina L-arginina-HCl L-alanina Carvão vegetal Agar pH Sacarose 106,7 80,0 53,3 266,7 53,3 60g/l (tratado com nutriente) 18g-26g/l 50g/l 88,0 58,63 533,3 58,63 60,0g/l (tratado com não- nutriente) 18,0g/l 5,7 60,0g/l 88,0 58,63 533,3 58,63 60,0g/l (tratado com não- nutriente) 18,0g/l 5.7 60,0g/l

É notado que a concentração de alguns dos componentes, tais que L-Tirosina, L-Fenilalanina5 e Citrato Férrico, foi ajustada para que seja considerada para o pH e de modo a evitar problemas de precipitação.

EXEMPLO 3

Este Exemplo descreve uma comparação do efeito de várias formulações de meio nutritivo KE64, MS08, e MS09, usadas em sementes manufaturadas com relação à freqüência de germinação e qualidade em

pinheiro teda.

Métodos:

Sementes de pinheiro teda zigótico foram esterilizadas

superficialmente, os embriões foram removidos e inseridos na semente

manufaturada, tal como descrito no Exemplo 1.

As sementes manufaturadas foram preparadas como descrito

nos Exemplos 1 e 2, com o uso de restrições de cotilédone, com as variações no meio nutritivo e ou carvão vegetal tratado com nutriente ou carvão vegetal tratado com não-nutriente incluídos na cavidade, como abaixo indicado. O meio nutritivo KE64 foi produzido como descrito no Exemplo 1. O carvão vegetal tratado com nutriente foi preparado como descrito no Exemplo 1. Os meios MS08 e MS09 foram produzidos como descrito no Exemplo 2.

Uma vez conjugados os vazios de semente manufaturados, para os construtos indicados, carvão vegetal tratado com nutriente, seco, de 100 mesh, ou carvão vegetal tratado com não-nutriente foram então pipetados ao interior da cavidade de corrosão do construto usando uma pipeta de Pasteur estéril. Os embriões foram então inseridos na restrição do cotilédone.

O meio nutritivo foi preparado como descrito abaixo e foi colocado no interior do revestimento da semente, de um modo a encher substancialmente o interior do revestimento da semente. Em algumas condições de tratamento, o meio nutritivo continha carvão vegetal que foi tratado com nutriente, e em outras condições, o meio continha carvão vegetal

que foi tratado com não-nutriente.

Como descrito acima no Exemplo 2, MS08 e MS09 foram formulados de um modo a aumentar a concentração de certos componentes do meio, mostrados nas Tabelas 5 e 6, em comparação com KE64, de um modo a tentar melhorar ou pelo menos manter a mesma freqüência de germinação observada com KE64 na presença de carvão vegetal tratado com nutriente.

A temperatura de distribuição do meio era de 45°C. A extremidade viva da semente manufaturada (extremidade com a cavidade de

embrião) foi imersa em cera.

108 sementes foram testadas por tratamento (4 tratamentos),

resultando em um total de 432 sementes.

Condições de tratamento testadas:

1. Meio Completo KE64 (50 g/l de sacarose; 18 g/L de ágar), acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com nutriente no meio e carvão

vegetal tratado com nutriente na cavidade.

2. Meio Completo (60 g/L de sacarose; 18 g/L de ágar), além

de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio e carvão

vegetal tratado com nutriente na cavidade.

3. Meio Completo MS09 (60 g/L de sacarose; 18 g/L de ágar), além de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio e carvão vegetal tratado com nutriente na cavidade. 4. Meio Completo KE64 (50g/L de sacarose; 18 g/L de ágar), além de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio e carvão

vegetal tratado com nutriente na cavidade.

As sementes manufaturadas, conjugadas como acima descrito

para cada condição de tratamento, foram semeadas em caixas de areia estéril e

colocadas em um ambiente claro. As sementes foram graduadas para a

germinação em 25 dias após a semeadura.

Resultados:

Os resultados são apresentados abaixo nas Tabelas 7 e 8. TABELA 7: Comprimentos de Órgão e % de Laterais

Meio

Tratamento # 1 (KE64 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com nutriente no meio)

Tratamento # 2 (MS08 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio)

Tratamento # 3 (MS09 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio)

Tratamento # 4 (KE64 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio) ___

Laterais (%)

Comprimento do Radical (mm)

25,3%

20,4%

43,0%

27,0

27,0

Comprimento do Hipocótilo (mm)

22,7

23,3

28,9

4.3%

10,9

28,1

14,6

Comprimento do Cotilédone (mm)

19,5

21,2

Comprimento do Epicótilo (mm)

8,2

10,6

20,5

16,4

9,5

4,7

TABELA 8: Qualidade dos Germinantes

Meio Germinantes Normais (%) Seria normal se inteiramente extraído (%) Germinantes normais totais: (col 1+col 2) Germinantes anormais (%) Inalterado (%) Tratamento # 1 (KE 64 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com nutriente no meio) 30.3% 5.1% 35.4% 38.4% 26.3% Tratamento # 2 (MS08 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no 22.1% 2.1% 24.2% 32.6% 43.2% Tratamento # 3 (MS09 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no 44.7% 10.6% 55.3% 26.6% 18.1% Tratamento # 4 (KE64 acrescido de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio) 3.2% 2.1% 5.3% 43.6% 51.1% Discussão dos Detalhes:

Como mostrado acima na Tabela 8, as sementes manufaturadas com MS09 com 60 g/L de carvão vegetal tratado com não- nutriente no meio obtiveram um melhor desempenho do que KE64 com 60 g/L de carvão vegetal tratado com nutriente no meio, em que as sementes contendo KE64 resultaram em uma freqüência de germinação de 44,7% de germinantes normais, e uma freqüência total de normal mais normal, mas não extraíram inteiramente os germinantes de 55, 3% em comparação com as sementes contendo MS09 que geraram 30,3% de freqüência de germinação normal, e uma freqüência de germinação total de 35,4 % normal mais normal,

mas não extraíram inteiramente os germinantes.

O meio MS08 com 60 g/L de meio tratado com nutriente não

obteve um desempenho tão bom quanto KE64 ou MS09.

Como mostrado adicionalmente na Tabela 7, as sementes manufaturadas com o meio MS09 (com carvão vegetal tratado com não-nutriente no meio) produziram germinantes tendo tamanhos de órgão pelo menos tão grandes quanto, se não maiores, do que os germinantes produzidos a partir do meio KE64 padrão (com carvão vegetal tratado com nutriente no meio). Conclusão geral:

Parece que o MS09 é superior, tanto a KE64 como a MS08,

para o uso sem sementes manufaturadas com o pinheiro teda, com relação à freqüência e à qualidade dos germinantes resultantes. O uso deste meio modificado (MS09) fornece a vantagem de evitar o dispêndio de tempo e de custo envolvidos na preparação demorada do carvão vegetal tratado com

nutriente nas sementes manufaturadas.

É observado que um experimento adicional foi executado com

embriões do pinheiro teda, de um modo a comparar as sementes manufaturadas

contendo ou KE64 com 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente ou

MS09 com 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, com os resultados de germinação sendo avaliados em 49 dias após a semeadura, no entanto, este experimento não produzidos dados estatisticamente relevantes, provavelmente devido a problemas de contaminação. EXEMPLO 4

Este Exemplo descreve o efeito de vários meios nutritivos

usados em sementes manufaturadas com relação à freqüência de germinação e à qualidade de embriões de conífera norte-americana.

Métodos:

Embriões somáticos de abeto norte-americano de dois diferentes genótipos (genótipo # 1 e # 2 ) foram cultivados até o estágio de desenvolvimento, tal como descrito no Exemplo 1. Estes embriões foram então colocados sobre um meio de estratificação, durante 4 semanas, e avaliados quanto à esterilidade, antes da inserção no interior de sementes manufaturadas.

As sementes manufaturadas foram preparadas como descrito

no Exemplo 1, com o uso ou de restrições de cotilédone cerâmicas do Tipo A ou restrições de cotilédone cerâmicas do Tipo B, com variações no meio nutritivo e cada um de carvão vegetal tratado com não-nutriente ou tratado com nutriente incluído na cavidade, tal como abaixo indicado. O meio nutritivo KE64 foi produzido como descrito no Exemplo 1. O carvão vegetal tratado com nutriente foi preparado como descrito no Exemplo 1. O meio MS09 foi produzido como descrito no Exemplo 2.

Uma vez que os vazios de semente manufaturados tenham sido conjugados, para os construtos indicados, carvão vegetal tratado com não- nutriente ou carvão vegetal tratado com nutriente, seco, de 100 mesh, foi então pipetado ao interior da cavidade de corrosão do construto usado uma Pipeta de Pasteur. Os embriões foram então inseridos ao interior da restrição de cotilédone.

O meio nutritivo foi preparado como abaixo mostrado e foi colocado no interior do revestimento da semente, de um modo a encher substancialmente o interior do revestimento da semente. Em algumas condições de tratamento, o meio nutritivo continha carvão vegetal, que foi tratado com nutriente, e em outras condições, o meio continha carvão vegetal,

que não foi tratado com nutriente. Como descrito acima no Exemplo 2, MS09 foi formulado de

um modo a aumentar a concentração de certos componentes do meio, apresentados nas Tabelas 5 e 6, em comparação com KE64, de um modo a tentar aumentar, ou pelo menos manter, a mesma freqüência de germinação observada com KE64 na presença de carvão vegetal tratado com nutriente. A temperatura de distribuição do meio foi de 45°C. A

extremidade viva da semente manufaturada (extremidade com a cavidade do

embrião) foi imersa em cera.

Cada tratamento neste estudo consistiu de 7 réplicas com um

tratamento de 10 sementes/réplica, para um total de 280 sementes. As condições de tratamento foram tais que descritas abaixo na

Tabela 9. As sementes manufaturadas contendo os embriões foram semeadas em 7 caixas de areia estéreis com 10 sementes/tratamento/caixa. As sementes foram avaliadas com relação à freqüência de germinação e aos comprimentos de órgão em 61 dias após a semeadura. TABELA 9: Condições de Tratamento para a Preparação de Sementes

Manufaturadas Usando os genótipos # 1 e # 2 de Embriões Somáticos de

abeto norte-americano. _

Tratamento Genótipos testados Meio nutritivo Carvão vegetal em meio nutritivo Carvão vegetal na cavidade Restrição de cotilédone 1 #1 #2 KE64 tratado com nutriente (60 S/L·) carvão vegetal tratado com nutriente na cavidade TipoB 2 #1 MS09 carvão vegetal tratado com não -nutriente (60 g/L) carvão vegetal tratado com nutriente na cavidade TipoB 3 #1 #2 KE64 carvão vegetal tratado com nutriente (60 g/L) carvão vegetal tratado com nutriente na cavidade TipoB 4 #2 MS09 carvão vegetal tratado com nâo-nutriente (60 g/L) carvão vegetal tratado com nutriente na cavidade TipoB #1 KE64 carvão vegetal tratado com nutriente (60 g/L) sem carvão vegetal na cavidade TipoA 6 #2 KE64 carvão vegetal tratado com nutriente (60 g/L) sem carvão vegetal na cavidade Tipo A TABELA 10: Comprimentos de Órgão para Todos os Tratamentos (mm)

Tratamento

#l(geno # /#2 : KE64 : carvão vegetal tratado no meio e na cavidade)_

#2 (geno # 1: MS09: carvão vegetal não-tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)__

#3 (geno # l/# 2: KE64 : carvão vegetal tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

#4 (geno #2: MS09: carvão vegetal não-tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)_

#5 (geno #1: KE64: carvão vegeta] tratado no meio, sem carvão vegetal na cavidade)

#6 (geno # 2: KE64: carvão vegetal tratado no meio, sem carvão vegetal na cavidade)

Comprimento do Radical (mm) q=0,0014

9,51mmB

12,89mmA®

6,93mmB

7,81mmB

15,71mnA®

23,04mmA

Comprimento do hipocótilo (mm) a=0,0001_

10,46c

13,OOmmc

ll,26mmBC

10,47mmBC

14,76mmA

17,45mmA

Comprimento do cotilédone (mm) a=0,0001_

5,34

iB

7,24mm-

,AB

Comprimento do Epicótilo (mm) a=0,6717

0,00

5,15mmB

5,15mmB

9,57mmA

9,03mmA

7,75mm

5,40mm

2,60mm

3,51mm

3,52mm

TABELA 11: Freqüência de Germinação no Abeto Norte-Americano

Tratamento

#1 (geno # 1 /# 2-.KE64: carvão vegetal tratado no meio e na cavidade)

#2 (geno # 1: MS09: carvão vegetal não-tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

#3 (geno # l/#2: KE64: carvão vegetal tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

Germinação

Total α= Ο,ΟΟΡ1

0,0%

.B

1,9%

•AB

0,0%t

#4 (geno # 2: MS09: carvão vegetal não-tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

#5 (geno #1: KE64: carvão vegetal tratado no meio, sem carvão vegetal na cavidade)

#6 (geno #2: KE64: carvão vegetal tratado no meio, sem carvão vegetal na cavidade)

0,0%t

Germinação Parcial ct=0,0087

11,1 0Zoab

QO/oAB

5,6%e

18,5%^

\\,\%f

9,3%·

.AB

22,2%^

Germinação Total (col 1 + 2)

11,1%

27,8%

5,6%

18,5%

Raiz em Ar2 <x=0,4614

11,1%

7,4%

16,7%

Sem germinação q=0,0011

75,9%A

64,8%·

.AB

77,8%A

14,8%

33,3%

29,6%a

38,9%

18,5%

66,7%

.AB

48,1%b

9,3%

48,1%

.B

lia L-aviuau^y_\___ι__ι--;-

1 significa seguido pela mesma letra não significativamente diferente. 2Taiz em ar é um resultado negativo e indica que a raiz perdeu o seu geotropismo

TABELA 12: Graduações de Normalidade para todos os Tratamentos Tratamento

#1 (geno # l/#2: KE64 : carvão vegetal tratado no meio e na cavidade)

Normal K=O5OOOl1

0,0%c

#2 (geno # 1: MS09: carvão vegetal nâo-tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

#3 (geno #l/#2: KE64: carvão vegetal tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

#4 (geno # 2: MS09: carvão vegetal não-tratado no meio, carvão vegetal tratado na cavidade)

9,3%

BC

Seria normal se totalmente extraído a=0,1665

13,0%

Germinação

Total (Colunas 1+2)

13,0%

25,9%

1,9%C

9,3%

#5 (geno #1: KE64: carvão vegetal tratado no meio, sem carvão vegetal na cavidade)

#6 (geno # 2: KE64: carvão vegetal tratado no meio,sem carvão vegetal na cavidade)

1,9%C

16,7%A

25,9%A

18,5%

35,2%

11,2%

Inalterado (sem germinação) a=0,0273

38,9%

27,8%

33,3%

20,4%

22,2%

22,2%

38,9%

48,1%

31,5%

46,3%

33,3%

Não normal a=0,1174

37,0%

35,2%

55,6%

42,6%

14,8%

16,7%

lia yqyiuuuv; ι_ ι-'

'significa seguido pela mesma letra não significativamente diferente.

Discussão dos Resultados:

Como mostrado acima nas Tabelas 10-12, ocorre um aumento na freqüência de germinação e no tamanho do órgão dos germinados a partir de sementes manufaturadas, contendo o meio nutritivo modificado MS09 com um meio tratado com não-nutriente, quando comparadas a sementes manufaturadas contendo um meio KE64 tratado com meio tratado com nutriente. O carregamento do nutriente do carvão vegetal é um processo complexo e demorado. Além disso, o uso do meio MS09 modificado com um meio tratado com não-nutriente provê um avanço importante na preparação de sementes manufaturadas e de métodos de germinação de embriões de planta.

Embora a modalidade preferida da invenção tenha sido ilustrada e descrita, será apreciado que várias alterações podem ser introduzidas nesta, sem que haja afastamento do espírito e do escopo da invenção.

Claims (15)

1. Meio nutritivo, caracterizado pelo fato de compreender de 10 g/L a lOOg/L de um material adsorvente, de 350 mg/L a ,450 mg/L de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de : de 5 mg/L a 25 mg/L de FeSO4, de 600 mg/L a 1500 mg/L de MgSO4, de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3, 0 mg/L de Tiamina-HCl, de 0, 30 mg/L a 0, 80 mg ÍL de Piridoxina - HCl, de 1, 5 mg/L a 3,0 mg/L de Ácido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0, 30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de Pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0, 30 mg/L de Ácido Fólico.

2. Meio nutritivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material adsorvente é selecionado a partir do grupo, que consiste de carvão vegetal, polivinil pirrolidona ou sílica gel.

3. Meio nutritivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o material adsorvente é carvão vegetal.

4. Meio nutritivo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a concentração de carvão vegetal a ser adicionada ao meio nutritivo aperfeiçoado é de cerca de 10 g/L a cerca de 60 g/L.

5. Meio nutritivo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o carvão vegetal é tratado com não-nutriente antes da adição ao meio nutritivo.

6. Meio nutritivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio nutritivo compreende adicionalmente pelo menos 1 componentes, selecionado a partir do grupo de : de 85 mg/L a 100 mg/L de DL-serina; de 55 mg/L a 70 mg/L de L-prolina, de 300 mg/L a 600 mg/L de L-arginina-HCL, e de 55 mg/L a 70 mg/L de L-alanina.

7. Meio nutritivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o meio nutritivo compreende cerca de 60 g/L de carvão vegetal tratado com não-nutriente, de cerca de 350 mg/L a cerca de 375 mg/L de NH4NO3, e de cerca de 2000 mg/L a2100 mg/L de KH2PO4, e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de : cerca de 200 mg/L de Mio-inositol, cerca de 2,0 mg/L de Tiamina -HC1, cerca de 0,50 mg/L de Piridoxina-HCL, cerca de 2,0 mg/L de Ácido Nicotínico, cerca de 0, 26 mg/L de Riboflavina, cerca de 1,0 mg/L de Pantotenato de Ca, cerca de 0,02 mg/L de Biotina e cerca de 0, 25 mg/L de Ácido Fólico.

8. Semente manufaturada, caracterizada pelo fato de compreender: (a) um revestimento de semente; e (b) um meio nutritivo, que compreende de 10 g/L a 100 g/L de um material adsorvente, de 350 mg/ml a 450 mg/ml de NH4NO3, de 2000 mg/L a 3000 mg/L de KH2PO4, de 5 mg /L a 25 mg/L de FeSO4, de 600 mg/L a 1500 mg/L de MgSO4; e pelo menos um componente selecionado a partir do grupo, que consiste de : de 150 mg/L a 300 mg/L de Mio-inositol, de 1,5 mg/L a 3,0 mg/L de Tiamina - HCl, de 0,30 mg/L a 0,80 mg/L de Piridoxina- HCl, de 1, 5 mg/L a 3,0 mg/L de Ácido Nicotínico, de 0, 15 mg/L a 0,30 mg/L de Riboflavina, de 0,75 mg/L a 2,0 mg/L de pantotenato de Ca, de 0,01 mg/L a 0,03 mg/L de Biotina e de 0, 15 mg/L a 0, 30 mg/L de Ácido Fólico.

9. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o material adsorvente é carvão vegetal, polivinil polipirrolidona ou sílica gel.

10. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o material adsorvente é o carvão vegetal.

11. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que a concentração de carvão vegetal no meio nutritivo é de cerca de 10 g/L a cerca de 60 g/L.

12. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o carvão vegetal é tratado com um não- nutriente, antes da adição ao meio nutritivo.

13. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o meio nutritivo compreende adicionalmente pelo menos 1 componente selecionado a partir do grupo, que consiste de: de 85 mg/L a 100 mg/L de DL-serina; de 55 mg/L a70 mg/L de L-prolina, de 300 mg/L a 600 mg/L de L-arginina-HCL, e de 55 mg/L a 70 mg/L de L- alanina.

14. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente uma restrição de broto, em que a restrição de broto compreende uma cavidade dimensionada para receber o embrião de conífera.

15. Semente manufaturada de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente um embrião de conífera disposto na cavidade da restrição de broto.