BRPI1002320A2

BRPI1002320A2 - dispositivo de ensaio de ação capilar e sua fabricação

Info

Publication number: BRPI1002320A2
Application number: BRPI1002320-8A
Authority: BR
Inventors: Jonas Melin; Christina Joensson
Original assignee: Amic Ab
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-06-30
Publication date: 2012-02-22
Also published as: US20110000791A1; RU2010127056A; CN101957368B; CA2708637A1; CN101957368A; EP2281632B1; CA2708637C; RU2554754C2; EP2281632A1

Abstract

DISPOSITIVO DE ENSAIO DE AçãO CAPILAR E SUA FABRICAçãO. A presente invenção refere-se a um método para a fabricação de um dispositivo de ensaio de ação capilar compreendendo as etapas de a) fornecimento de um substrato capilar, b) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato, c) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em uma solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura covalentemente ligadas à matriz e d) depósito da solução em uma área distinta na pelo menos uma zona de reação. Um dispositivo de ensaio de ação capilar é obtenível através do método. Vantagens da invenção incluem que é possível modificar o substrato com uma química de superfície e ainda depositar moléculas de captura em uma matriz ótima sobre áreas desejadas. Menos material de matriz é consumido e, assim, vários materiais de matriz diferentes podem ser usados sobre um chip (figura 2).

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DISPOSITIVO DE ENSAIO DE AÇÃO CAPILAR E SUA FABRICAÇÃO".

Campo Técnico

A presente invenção refere-se a um método aprimorado para hidrofilização de superfície e imobilização de anticorpo sobre uma superfície copolimérica de ciclo-olefina, em particular em um dispositivo de ensaio de ação capilar. Antecedentes

O desempenho de reações bioquímicas envolvendo uma fase sólida é dependente das propriedades químicas e físicas da superfície da fase sólida. Para imunoensaios realizados em formatos fluídicos de ação capilar, a superfície tem de suportar o fluxo de líquido e proporcionar uma base química para imobilização de anticorpo de captura. Além disso, para obter um bom desempenho de ensaio, uma alta capacidade de ligação do analito é desejada.

Dispositivos microfluídicos de ação capilar são descritos, por exemplo, nos documentos US 2005/042766, US 2006/0285996, US 2007/0266777,US 2008/0176272, US 2009/0208920, US 2009/0311805, US 2010/0009465 e US 2010/0041154, todos para a Amic AB. Em dispositivos microfluídicos de ação capilar, freqüentemente é desejável modificar as pro- priedades das superfícies as quais se destinam a estar em contato com um fluido. Em muitos casos, é desejável modificar a hidrofilicidade da superfície, de modo que uma solução aquosa possa fluir mais facilmente através do sistema capilar. Em particular, é importante ser capaz de controlar as forças entre a superfície do dispositivo microfluídico e o fluido quando o fluxo é de ação capilar.

A superfície do dispositivo microfluídico pode ser modificada de várias formas. Uma forma de modificação da superfície na técnica anterior é gerar uma monocamada mais ou menos densa de uma pequena molécula orgânica. Esta camada fornece as propriedades físicas necessárias para os fluidos e atua como uma base para subsequentes fixações de entidades maiores, tais como constituintes de matriz e biomoléculas. A preparação de tais superfícies pode ser realizado em fase gasosa ou em fase líquida. A ge- ração de matrizes de ampliação de superfície na técnica anterior envolve moléculas com alto peso molecular, tais como dextrana ou outros materiais poliméricos. Tais materiais, portanto, são freqüentemente presos às superfí- cies por meio de química em fase líquida, por exemplo, revestimento por imersão. Ligantes de afinidade, tais como anticorpos ou ácidos nucleicos são, em alguns casos, subseqüentemente depositados sobre a superfície coberta da matriz.

O documento WO 90/01167 descreve um sistema de suporte poroso para imobilização de componentes de imunoensaio.

O documento RU 2 102 134 descreve um imunoabsorvente com um veículo o qual pode ser aerosil que pode ser modificado com uma solu- ção de dextrana e o qual é subseqüentemente oxidado. O imunoabsorvente tem capacidade específica aprimorada.

Jõnsson et al. em European Cells and Materials, Vol. 14, supl. 3, 2007 (página 64) descrevem uma superfície plástica silanizada funcionaliza- da com uma matriz de dextrana oxidada. Anticorpos de captura são coloca- dos sobre a superfície funcionalizada. É descrito que uma matriz de alta ca- pacidade para imobilização de anticorpo é proporcionada. O anticorpo de captura e a matriz (dextrana) não são acoplados um ao outro antes que eles sejam colocados sobre a superfície.

Jõnsson et al em Lab on a Chip, Vol. 8, 2008, páginas 1191-1197 divulgam um método para o tratamento da superfície de chips de teste. A su- perfície é sinalizada através de imersão em uma solução de APTES (3- aminopropil trietoxi-silano). Dextrana oxidada é subseqüentemente acoplada a grupos amino da superfície. Subseqüentemente, a superfície com dextrana oxi- dada acoplada à mesma é submetida a uma etapa de oxidação para gerar al- deídos reativos para uma reação com aminas em anticorpos de captura. Anti- corpos são acoplados à dextrana oxidada após sua imobilização à superfície.

O documento WO 03/020978 descreve um método para a fabri- cação de um biochip de hidrogel onde uma matriz de um derivado de polieti- leno glicol similar à estrela tendo um grupo epóxi em sua extremidade termi- nal e um agente de reticulação polimérico hidrofílico são reagidos com uma sonda ou molécula de captura para formar um conjugado. O conjugado é subseqüentemente depositado sobre o biochip.

O documento US 2006/141484 descreve substratos compreen- dendo superfícies entalhadas com íons reativos e agentes de ligação especí- ficos imobilizados sobre as mesmas. Também divulgados são métodos de fabricação de superfícies entalhadas com íons reativos.

Jõnsson C. et aí. em European Cells and Materials vol. 14 2007, supl. 3, página 64 descrevem chips os quais são cobertos com APTES, re- vestidos com dextrana, oxidados e onde anticorpos são colocados sobre a superfície.

O documento WO 2005/054860 descreve um método de detec- ção de um marcador biológico em uma amostra.

Com relação aos ensaios de ação capilar na técnica anterior on- de modificações de superfície são necessárias, também é desejável fixar moléculas de captura que tomam parte em um ensaio diagnóstico. Quando a molécula de captura tem de ser presa à superfície de um dispositivo fluídico de ação capilar, limitações podem ser impostas com relação à modificação das propriedades de superfície, incluindo a hidrofilicidade. Em alguns casos, modificações das propriedades de superfície em um dispositivo fluídico de ação capilar são necessárias de forma que as forças capilares sejam satisfa- tórias. Na técnica anterior, há margem para aprimoramento em dispositivos fluídicos de ação capilar onde a fixação de moléculas de captura e modifica- ção de hidrofilicidade de superfície são desejadas.

Sumário

É um objetivo da presente invenção eliminar pelo menos uma das desvantagens da técnica anterior e proporcionar um método aprimorado e um dispositivo de ação capilar aprimorado. Em particular, é um objetivo da invenção fornecer uma possibilidade de fixar moléculas de captura a um dis- positivo de ensaio de ação capilar onde a possibilidade de modificar a super- fície é aprimorada.

Em um primeiro aspecto, é proporcionado um método para a fabricação de um dispositivo de ensaio de ação capilar, o método compre- endendo as etapas de:

a) fornecimento de um substrato, o referido substrato compreen- dendo pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de retenção, pelo menos um sumidouro e pelo menos um trajeto de fluxo que conecta pelo menos uma zona de adição de amostra, a pelo menos uma zona de retenção e a pelo menos um sumidouro, em que o pelo menos um trajeto de fluxo é aberto e compreende projeções substancialmente verticais à superfície do dito substrato e tendo uma altura (H), diâmetro (D) e espa- çamento recíproco (t1, t2), de modo que fluxo capilar lateral de uma amostra líquida seja obtido,

b) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato,

c) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em uma solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura cova- lentemente ligadas à matriz,e

d) depósito da solução em uma área distinta na pelo menos uma zona de retenção.

Em um segundo aspecto, é proporcionado um dispositivo de en- saio de ação capilar compreendendo um substrato, proporcionado sobre o dito substrato pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de retenção, pelo menos um sumidouro e pelo menos um trajeto de fluxo que conecta pelo menos uma zona de adição de amostra, a pelo me- nos uma zona de retenção e pelo menos um sumidouro, em que pelo menos um trajeto de fluxo é aberto e compreende projeções substancialmente verti- cais à superfície do dito substrato e tendo uma altura (H), diâmetro (D) e es- paçamento recíproco (t1, t2), de modo que fluxo capilar lateral seja obtido, em que o dispositivo de ensaio de ação capilar é fabricado através de um método compreendendo as etapas de:

a) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato,

b) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em uma solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura cova- Ientemente ligadas à matriz, e c) depósito da solução em uma área distinta na pelo menos uma zona de retenção.

Outros aspectos e modalidades são definidos nas reivindicações em anexo, as quais são especificamente incorporadas aqui por referência.

Vantagens incluem que é possível proporcionar uma modifica- ção de superfície em um dispositivo de ensaio de ação capilar e, ao mesmo tempo, imobilizar uma molécula de captura em áreas distintas e bem defini- das sobre um substrato. É fornecida mais liberdade para selecionar um tra- tamento de superfície adequado de forma a modificar a hidrofilicidade da superfície em um dispositivo de ensaio de ação capilar. É possível modificar o substrato com uma química de superfície e ainda depositar moléculas de captura em uma matriz ótima sobre áreas desejadas.

Vantagens ainda incluem que nenhuma etapa de revestimento por imersão em fase líquida é necessária de forma a fixar a molécula de cap- tura, o que aprimora a reprodutibilidade.

Ainda, a matriz é aplicada apenas onde a molécula de captura é depositada. Menos material de matriz, portanto, é consumido comparado com revestimento do substrato todo. Uma vez que o material de matriz ape- nas é depositado localmente, diferentes formulações de matriz podem ser usadas para diferentes Iigantes de afinidade. Em ensaios multiplex, essa abordagem oferece a possibilidade de otimizar a formulação de matriz e as condições de reação para diferentes moléculas de captura configurando, por exemplo, a capacidade de ligação, densidade ou espessura da matriz. Além disso, volumes muito pequenos de material de matriz são requeridos, signifi- cando que matrizes de custo relativamente alto, tais como dendrôme- ros/dendrímeros multifuncionais ou produtos de círculos de rotação ("rolling circle"), poderiam ser potencialmente usadas.

Definições

Antes que a invenção seja divulgada e descrita em detalhes, deve ser entendido que a presente invenção não está limitada a compostos, configurações, etapas de método, substratos e materiais particulares divul- gados aqui, uma vez que tais compostos, configurações, etapas de método, substratos e materiais podem variar um pouco. Também deve ser entendido que a terminologia empregada aqui é usada para fins de descrição de moda- lidades particulares apenas e não se destina a ser limitativa, uma vez que o escopo da presente invenção está limitado apenas pelas reivindicações em anexo e equivalentes das mesmas.

Deve ser notado que, conforme usado na presente especificação e nas reivindicações em anexo, as formas no singular "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto venha a requerer claramente de outro modo.

Se nada for definido, quaisquer termos e a terminologia científica usada aqui destinam-se a ter os significados comumente entendidos por aqueles versados na técnica a qual a presente invenção pertence.

O termo "cerca de", conforme usado com relação a um valor numérico por toda a descrição e as reivindicações, denota um intervalo de precisão familiar e aceito por aqueles versados na técnica. O dito intervalo é de± 10%.

"Analito" é usado por toda a descrição e nas reivindicações para denotar uma substância ou constituinte químico ou biológico do qual uma ou mais propriedades são determinadas em um procedimento analítico. Um analito ou um componente em si pode, com freqüência, não ser medido, mas uma propriedade mensurável do analito pode. Por exemplo, é possível medir a concentração de um analito.

"Dispositivo de ensaio" é usado por toda a descrição e nas reivindi- cações para denotar um dispositivo o qual é utilizado para analisar uma amos- tra. Um dispositivo diagnóstico é um exemplo de um dispositivo de ensaio.

"Fluxo capilar", conforme usado por toda a descrição e nas rei- vindicações, denota um fluxo induzido principalmente por força capilar.

"Molécula de captura" é usada por toda a descrição e nas reivin- dicações para denotar uma molécula com a capacidade de se ligar à outra entidade química ou biológica de interesse. O termo "molécula de captura" inclui moléculas com a capacidade de se ligar especificamente às moléculas específicas. "Envoltório", conforme usado por toda a descrição e nas reivindi- cações, denota um elemento que envolve uma parte ou todo o dispositivo.

"Polímero de ciclo-olefina" é usado por toda a descrição e nas reivindicações para denotar copolímeros de olefina cíclica baseados em dife- rentes tipos de monômeros de olefina cíclica. Copolímeros baseados em monômeros de olefina cíclica e etano são abrangidos dentro do termo.

"Dendrímero" é usado aqui para denotar moléculas repetidamen- te ramificadas. Dendrímeros são monodispersos.

"Estrutura dendrítica" é usada aqui para denotar uma estrutura ramificada. Exemplos de estruturas dendríticas incluem, mas não estão limi- tados a, dendrômeros, dendrímeros, polímeros hiper-ramificados e dendro- nizados.

"Grupo detectável", conforme usado por toda a descrição e nas reivindicações,denota qualquer configuração de moléculas ou átomos que pode ser detectada quando presente sobre um substrato.

"Trajeto de fluxo", conforme usado por toda a descrição e nas reivindicações, denota uma área sobre o dispositivo onde fluxo de líquido pode ocorrer entre diferentes zonas.

"Conexão de fluido", conforme usado por toda a descrição e nas reivindicações, denota uma conexão na qual um fluido pode ser transportado.

"Hidrofilicidade", conforme usado por toda a descrição e nas rei- vindicações com relação a uma superfície, está relacionado à tendência de uma solução aquosa de umedecer a superfície. Umedecimento é a capaci- dade de um líquido de manter contato com uma superfície sólida, resultante de interações intermoleculares quando os dois são mantidos juntos. O grau de umedecimento é determinado por um equilíbrio de força entre forças ade- sivas e coesivas. Umedecimento e as forças de superfície que controlam o umedecimento são também responsáveis por outros efeitos relacionados, incluindo efeitos capilares.

"Hiper-ramificado", conforme usado por toda a descrição e nas reivindicações com relação às moléculas poliméricas, denota uma estrutura altamente ramificada. "Tampa", conforme usado por toda a descrição e nas reivindica- ções, denota um elemento que cobre uma parte ou todo o dispositivo.

"Matriz" é usada por toda a descrição e nas reivindicações para denotar um material ao qual moléculas de captura são acopladas.

"Aberto", conforme usado por toda a descrição e nas reivindica- ções, o termo quando usado com relação ao fluxo capilar, significa que o sistema é aberto, isto é, o sistema não é cercado. Exemplos de um sistema aberto incluem um sistema sem uma tampa em contato capilar com o líquido de amostra. Em um sistema aberto, uma tampa não estará em contato capi- lar com o líquido de amostra, isto é, uma tampa não tomará parte na criação da força capilar.

"Espaçamento recíproco", conforme usado por toda a descrição e nas reivindicações, denota a distância entre projeções adjacentes.

"Zona de retenção" é usada por toda a descrição e nas reivindica- ções para denotar uma área sobre um dispositivo de ensaio de ação capilar onde moléculas em uma amostra podem se ligar às moléculas de captura.

"Amostra", conforme usado por toda a descrição e nas reivindi- cações, denota uma mistura ou uma solução a ser analisada.

"Zona de adição de amostra", conforme usado por toda a descri- ção e nas reivindicações, denota uma zona onde uma amostra é adicionada.

"Silanizar" é usado por toda a descrição e nas reivindicações para denotar a fixação de moléculas de silano sobre uma superfície.

"Sumidouro", conforme usado por toda a descrição e nas reivin- dicações,denota uma área com a capacidade de recebimento de amostra líquida.

"Substância", conforme usado por toda a descrição e nas reivin- dicações, denota qualquer entidade química ou biológica pura ou qualquer mistura ou solução compreendendo pelo menos uma entidade química ou biológica.

Breve Descrição dos Desenhos

A invenção é descrita em maiores detalhes com referência aos desenhos, nos quais: A figura 1 mostra uma figura esquemática de um dispositivo de ensaio. A é uma zona de adição de amostra, B é uma zona de retenção e C é um sumidouro, com a capacidade de receber amostra líquida,

A figura 2 mostra um quadro esquemático de depósito em fase gasosa, seguido por colocação de anticorpo covalentemente acoplado à ma- triz de dextrana. No painel superior é mostrada uma modificação da hidrofili- cidade da superfície do substrato. No meio é mostrado o depósito de com- plexo de dextrana-anticorpo. No painel inferior, o complexo depositado com- preendendo dextrana acoplada a anticorpos é mostrado. A matriz está pre- sente apenas onde o anticorpo é depositado.

A figura 3 mostra respostas comparativas à dose para um ensaio de CRP com dextrana revestida por imersão e dextrana colocada, respecti- vamente.

Descrição Detalhada

É proporcionado um método para a fabricação de um dispositivo de ensaio de ação capilar, o método compreendendo as etapas de:

a) fornecimento de um substrato, o dito substrato compreenden- do pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de retenção, pelo menos um sumidouro e pelo menos um trajeto de fluxo que conecta pelo menos uma zona de adição de amostra, a pelo menos uma zona de retenção e a pelo menos um sumidouro, em que o pelo menos um trajeto de fluxo é aberto e compreende projeções substancialmente verticais à superfície do dito substrato e tendo uma altura (H), diâmetro (D) e espa- çamento recíproco (t1, t2), de modo que fluxo capilar lateral de uma amostra líquida seja obtido,

b) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato,

c) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em uma solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura cova- lentemente ligadas à matriz e

d) depósito da solução em uma área distinta pelo menos em uma zona de retenção.

Em uma modalidade, a superfície do dispositivo de ensaio de ação capilar é oxidada antes do dito depósito. Em uma modalidade, a etapa de oxidação compreende tratamento a plasma. Em uma modalidade, a su- perfície do substrato é primeiro ativada através de uma reação a plasma em fase gasosa e uma pequena molécula ligante orgânica é subseqüentemente presa à superfície via depósito em fase gasosa. Depósito em fase gasosa é vantajoso, uma vez que isso torna a produção menos complicada e aprimora a reprodutibilidade e homogeneidade do revestimento. A extremidade livre da molécula ligante apresenta um grupo (por exemplo, amina) reativo a ou com afinidade pela matriz. O complexo ligante-matriz pode, assim, ser colo- cado diretamente sobre a superfície ativada.

Em uma modalidade, pelo menos uma parte da superfície do dispositivo de ensaio de ação capilar é silanizada. Em uma modalidade, a etapa de silanização compreende silanização em fase gasosa.

Na etapa (b) a hidrofilicidade da superfície do substrato é modifi- cada, o que significa que a hidrofilicidade é aumentada ou que a hidrofilici- dade é diminuída. Em uma modalidade, a hidrofilicidade é aumentada atra- vés da adição de grupos polares sobre a superfície. Em uma modalidade, a hidrofilicidade é aumentada através da adição de grupos carregados sobre a superfície.

Em uma modalidade, toda a superfície do substrato é modificada com relação à hidrofilicidade da superfície. Em uma modalidade alternativa, um lado do substrato é modificado com relação à hidrofilicidade da superfície.

Em uma modalidade, o dispositivo de ensaio de ação capilar compreende pelo menos uma superfície polimérica de ciclo-olefina.

Em uma modalidade, a matriz compreende um polissacarídeo.

Em uma modalidade, a matriz compreende agarose. Em uma modalidade, a matriz compreende dextrana. Em uma modalidade, a matriz compreende dextrana oxidada. Em uma modalidade, a matriz compreende um gel de po- liacrilamida. Em uma modalidade, a matriz compreende um polímero hiper- ramificado. Em uma modalidade, a matriz compreende um dendrômero. Em uma modalidade, a matriz compreende um dendrímero. Em uma modalida- de, a matriz compreende uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, a molécula de captura compreende pelo menos uma entidade selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um aptâmero, uma sonda de ácido nucleico, uma sonda de DNA1 uma sonda de RNA, uma sonda de PNA1 um fragmento de anticorpo, um fragmento Fab e um fragmento scFv. Em uma modalidade, a molécula de captura é um anti- corpo. Em uma modalidade, a molécula de captura compreende uma combi- nação dos mesmos.

É ainda proporcionado um dispositivo de ensaio de ação capilar compreendendo um substrato, proporcionado sobre o dito substrato pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de retenção, pelo menos um sumidouro e pelo menos um trajeto de fluxo que conecta a pelo menos uma zona de adição de amostra, a pelo menos uma zona de retenção e o pelo menos um sumidouro, em que o pelo menos um trajeto de fluxo é aberto e compreende projeções substancialmente verticais à superfí- cie do dito substrato e tendo uma altura (H)1 diâmetro (D) e espaçamento recíproco (t1, t2), de modo que fluxo capilar lateral seja obtido, em que o dispositivo de ensaio de ação capilar é fabricado através de um método compreendendo as etapas de:

a) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato,

b) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em uma solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura cova- lentemente ligadas à matriz, e

c) depósito da solução em uma área distinta na pelo menos uma zona de retenção.

Em uma modalidade, o dispositivo de ensaio de ação capilar compreende pelo menos duas matrizes diferentes e pelo menos duas molé- culas de captura diferentes, em que cada matriz é covalentemente ligada a um tipo específico de molécula de captura.

É descrita uma forma de geração de uma matriz de alta capaci- dade tridimensional local apenas onde moléculas de captura são deposita- das. Isso é obtido conjugando o Iigante a uma matriz de ampliação de super- fície em fase homogênea antes de depósito. A hidrofilicidade do substrato é modificada e exemplos de modificações de superfície incluem, mas não es- tão modificados a, adsorção de moléculas orgânicas e reação de grupos químicos sobre a superfície do substrato. Na figura 2, o painel superior mos- tra uma modalidade onde a hidrofilicidade do substrato é modificada. A figu- ra 2, painel mediano, representa como moléculas de captura são acopladas a uma matriz antes depositada sobre a superfície. A figura 2, painel inferior, mostra como o complexo compreendendo uma matriz acoplada às molécu- las de captura foi depositado sobre a superfície.

Um material polimérico o qual é amorfo e mostra as proprieda- des de alta temperatura de transição do vidro, Tg, clareza óptica, baixa re- tração, baixa absorção de umidade e baixa bi-refringência é adequado para uso como um substrato. Polímeros de ciclo-olefina têm unidades de olefina cíclica volumosas aleatória ou alternadamente presas à parte principal poli- mérica e o polímero, assim, torna-se amorfo e mostra as propriedades de- sejadas. Em uma modalidade, o dispositivo de ensaio de ação capilar com- preende pelo menos uma superfície polimérica de ciclo-olefina. Em uma mo- dalidade, o dispositivo de ensaio de ação capilar compreende pelo menos uma superfície polimérica de ciclo-olefina. Em uma modalidade, o dispositivo de ensaio de ação capilar é feito de um polímero de ciclo-olefina. Em uma modalidade, o dispositivo de ensaio de ação capilar é moldado por injeção em um polímero de ciclo-olefina. Em uma modalidade, o polímero de ciclo- olefina é fabricado através de polimerização por metátese abertura de anel de vários monômeros cíclicos, seguido por hidrogenação.

Em uma modalidade, o dispositivo de análise compreende pelo menos duas matrizes diferentes e pelo menos duas moléculas de captura diferentes, em que cada matriz é covalentemente ligada a um tipo específico de molécula de captura. Dessa forma, é possível realizar uma análise multi- plex com diferentes moléculas de captura, onde cada tipo de molécula de captura tem sua própria matriz individualmente adaptada. Cada par de molé- cuia de captura e matriz é misturado e subseqüentemente colocado em uma área predeterminada distinta sobre o dispositivo de ensaio.

Outras características da invenção e suas vantagens associadas serão evidentes para aqueles versados na técnica de leitura da descrição e exemplos.

Deve ser entendido que a presente invenção não está limitada às modalidades particulares mostradas aqui. Os exemplos a seguir são for- necidos para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o escopo, uma vez que o escopo da presente invenção está limitado apenas pelas reivindica- ções em anexo e equivalentes das mesmas.

Exemplos

Chips de substrato plástico feitos de Zeonor® (Zeon Corporation, Japão) foram oxidados em plasma de oxigênio. A oxidação ocorreu durante 6 min em uma câmara de plasma (400 Plasma System) em uma pressão de ope- ração de 0,26 mbar(p.14), 1000 W e com um fluxo de oxigênio a 100 ml/min.

Duas abordagens diferentes para silanização foram empregadas. Sinalização em fase gasosa foi realizada em uma câmara Solitec BPM-2000 com um tamanho de lote de três chips. Em cada depósito, 250 μΙ de APTES (FIuka) foram aplicados sobre um vidro de relógio colocado sobre a placa quente (80°C) na câmara. Depósito foi realizado durante 15 minutos em uma pressão de operação de 25 mmHg. Como um resultado da capacidade de produção limitada da câmara de depósito em fase gasosa, um método de de- pósito em fase líquida foi também usado. Nesse protocolo, os chips foram i- mersos em uma solução de APTES a 3% em volume em etanol a 95% (Ke- metyl, Suécia) durante duas horas. Os chips foram rigorosamente lavados em etanol e MilliQ-H2O. Para ambas as abordagens, a camada de silano foi cura- da durante a noite em temperatura ambiente em ar para permitir reticulação do silano, resultando em uma superfície funcionalizada com amina estável.

Dextrana oxidada (Dextran T40 (40 kDa), Pharmacosmos, Di- namarca) foi preparada através de oxidação em NaIO4 a 30 mM (Sigma Al- drich) e diluída para 2%. O anticorpo de captura (aCRP, clone número M701289, Fitzgerald, MA) foi acoplado à dextrana oxidada em solução a- quosa. A solução continha 500 ug/ml de anticorpo, dextrana oxidada a 2%, trealose a 1% (Sigma Aldrich) e tampão de NaPO4 a 50 mM (pH de 7,5, Sigma Aldrich). A solução foi incubada durante uma hora antes de depósito em pelo menos uma zona de retenção sobre a superfície do chip. A solução foi colocada em uma tubulação através do canal fluídico sobre o chip. A mis- tura foi colocada sob condições úmidas (umidade relativa de 75%) com um Nano-plotter NP 2.1 (Ge-Sim, Alemanha) através do canal fluídico, resultan- do em uma banda de -0,5 χ 2 mm. No total, o volume depositado foi de 16 μl. Em experimentos de controle, todo o chip foi primeiro imerso em solução de dextrana oxidada a 2% durante 2h e totalmente enxaguado em MiIIiQ- H2O. Anticorpo de captura foi depositado usando o mesmo protocolo, substi- tuindo a dextrana por MiIIiQ-H2O.

Um ensaio de CRP competitivo foi realizado para caracterizar o desempenho do método. Amostras para o ensaio de CRP foram preparadas mediante diluição de CRP em etapas de cinco (250, 50, 10, 2, 0,4 e 0 mg/l) em soro sem CRP (Scipack, Reino Unido). CRP foi adquirido da Scipac, Reino Unido. CRP foi fIuorescentemente rotulado de acordo com as instru- ções do fabricante usando o kit Alexa Fluor® 647 Protein Labeling (Invitro- gen). CRP rotulado foi adicionado à amostra resultante em uma concentra- ção final de 1 mg/l. 37 μΙ de amostra foram adicionados à zona de amostra do chip e a ação capilar do arranjo microcapilar distribuiu a amostra através da pelo menos uma zona de retenção para a zona de ação capilar. O volume adicionado é ligeiramente maior do que o volume total sustentável no chip. Nenhuma outra adição de líquido foi necessária antes de leitura do sinal. Um tempo de ensaio típico era cerca de 10 minutos. As intensidades de sinal foram registradas em um scanner de fiuorescência de iluminação em linha protótipo. Um novo chip foi usado para cada ensaio e todos os ensaios fo- ram realizados em triplicata, a menos que de outro modo estabelecido. Os resultados de um experimento de ensaio comparando dextrana colocada e dextrana revestida por imersão são mostrados na figura 3.

Claims

1. Método para a fabricação de um dispositivo de ensaio de ação capilar, o método compreendendo as etapas de: a) fornecimento de um substrato, o dito substrato compreenden- do pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de retenção, pelo menos um sumidouro e pelo menos um trajeto de fluxo que conecta a pelo menos uma zona de adição de amostra, a pelo menos uma zona de retenção e pelo menos um sumidouro, em que pelo menos um traje- to de fluxo é aberto e compreende projeções substancialmente verticais à superfície do dito substrato e tendo uma altura (H), diâmetro (D) e espaça- mento recíproco (t1, t2), de modo que fluxo capilar lateral de uma amostra líquida seja obtido, b) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato, c) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em uma solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura cova- lentemente ligadas à matriz e d) depósito da solução em uma área distinta em pelo menos uma zona de retenção.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, em que a superfície do dispositivo de ensaio de ação capilar é oxidada antes do dito depósito.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e -2, em que a etapa de oxidação compreende tratamento a plasma.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, em que pelo menos uma parte da superfície do dispositivo de ensaio por ação capilar é silanizada.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, em que a etapa de silanização compreende silanização em fase gasosa.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -5, em que o dispositivo de ensaio de ação capilar compreende pelo menos uma superfície polimérica de ciclo-olefina.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que a matriz compreende um polissacarídeo.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -7, em que a matriz compreende agarose.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -8, em que a matriz compreende dextrana.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -9, em que a matriz compreende dextrana oxidada.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -10, em que a matriz compreende um gel de poliacrilamida.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -11 em que a matriz compreende um polímero hiper-ramificado.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -12, em que a matriz compreende um dendrômero.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -13, em que a matriz compreende um dendrímero.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -14, em que a molécula de captura compreende pelo menos uma entidade selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um aptâmero, uma son- da de ácido nucleico, uma sonda de DNA, uma sonda de RNA, uma sonda de PNA, um fragmento de anticorpo, um fragmento Fab e um fragmento scFv.

16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -15, em que a molécula de captura é um anticorpo.

17. Dispositivo de ensaio de ação capilar compreendendo um substrato, proporcionado sobre o dito substrato pelo menos uma zona de adição de amostra, pelo menos uma zona de retenção, pelo menos um su- midouro e pelo menos um trajeto de fluxo que conecta pelo menos uma zona de adição de amostra, a pelo menos uma zona de retenção e pelo menos um sumidouro, em que pelo menos um trajeto de fluxo é aberto e compreen- de projeções que projetam-se de modo substancialmente vertical à superfí- cie do dito substrato e tendo uma altura (H), diâmetro (D) e espaçamento recíproco (t1, t2), de modo que fluxo capilar lateral da dita amostra seja obti- do, caracterizado pelo fato de que o dispositivo de ensaio de ação capilar é fabricado através de um método compreendendo as etapas de: a) modificação da hidrofilicidade da superfície do substrato, b) mistura de uma matriz e uma molécula de captura em solução para obter uma solução compreendendo moléculas de captura covalente- mente ligadas à matriz, e c) depósito da solução em uma área distinta na pelo menos uma zona de retenção.

18. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com a rei- vindicação 17, em que a superfície do dispositivo de ensaio de ação capilar é oxidada antes da etapa (c).

19. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 18 em que a etapa de oxidação compre- ende tratamento a plasma.

20. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 19, em que pelo menos uma parte da su- perfície do dispositivo de ensaio de ação capilar é silanizada.

21. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com a rei- vindicação 20,em que a etapa de silanização compreende silanização em fase gasosa.

22. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 21, em que o dispositivo de ensaio de a - ção capilar compreende pelo menos uma superfície polimérica de ciclo- olefina.

23. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 22, em que a matriz compreende um po- lissacarídeo.

24. Dispositivo de ensaio de ação capilar,de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 23 em que a matriz compreende agarose.

25. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 24, em que a matriz compreende dextrana.

26. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 25, em que a matriz compreende dextrana oxidada.

27. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 26, em que a matriz compreende um gel de poliacrilamida.

28. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 27, em que a matriz compreende um po- límero hiper-ramificado.

29. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 28, em que a matriz compreende um den- drômero.

30. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 29, em que a matriz compreende um den- drímero.

31. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 30, em que a molécula de captura com- preende pelo menos uma entidade selecionada do grupo consistindo em um anticorpo, um aptâmero, uma sonda de ácido nucleico, uma sonda de DNA, uma sonda de RNA, uma sonda de PNA, um fragmento de anticorpo, um fragmento Fab e um fragmento scFv.

32. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 31, em que a molécula de captura é um anticorpo.

33. Dispositivo de ensaio de ação capilar, de acordo com qual- quer uma das reivindicações 17 a 32, compreendendo pelo menos duas ma- trizes diferentes e pelo menos duas moléculas de captura diferentes, em que cada matriz é covalentemente ligada a um tipo específico de molécula de captura.