BRPI0924485A2

BRPI0924485A2 - Métodos e sistemas para produzir pelo menos um produto, cultura celular e meio de cultura, usos dos mesmos, extratos do meio de cultura celular, e de um produto biológico, biocombustível, sistema de captação de dióxido de carbono, uso do sistema de duas culturas, ou do sistema de captação de dióxido de carbono, instalações de geração de energia e de geração de biocombustível de produção de dióxido de carbono, uso de um extrato, ou de um biocombustível, e, métodos para produzir biocombustível e óleos vegetais

Info

Publication number: BRPI0924485A2
Application number: BRPI0924485-9A
Authority: BR
Inventors: Peter Andrew Whitton; Geoffrey Robert Dixon; William Timothy Merrell
Original assignee: Naturally Scient Technologies Ltd
Priority date: 2008-04-28
Filing date: 2009-04-28
Publication date: 2015-08-04
Also published as: WO2009133351A2; EP3002334B1; US20140199726A1; BRPI0911529B1; BRPI0911529A2; EP2281053A2; EP2281053B1; WO2009133351A3; DK2281053T3; HUE037762T2; US9447442B2; EP2664674A3; US20170067083A1; AU2009241909B2; PL2281053T3; US10465215B2; EP3002334A1; PL2311970T3; ES2421355T3; ES2428815T3

Abstract

Métodos e sistemas para produzir pelo menos um produto, cultura celular e meio de cultura, usos dos mesmos, extratos do meio de cultura celular, e de um produto biológico, biocolsustível, sistema de captação de dióxido de carbono, uso do sistema de duas culturas, ou do sistema de captação de dióxido de carbono, instalações de geração de energia e de geração de biocombustível de produção de dióxido de carbono, uso de um extrato, ou de um biocombustível, e, métodos para. Produzir biocombustíveis e óleos vegetais. A presente invenção fornece um método para produzir pelo menos um produto a partir de uma cultura de células vegetais, o método compreendendo a manutenção de uma ou mais culturas celulares de células vegetais sob condiçôes tais que as células cultivadas sintetizem e secretem pelo menos um produto no meio de cultura celular, e a extração do produto secretado do meio de cultura. Em outras modalidades, a presente invenção fornece sistemas de cultura celular, uso de sistemas de cultura celular para produzir um produto e capturar diáxido de carbono, biocombustivel, extratos de cultura celular e uso de extratos de cultura celular.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: "MÉTODOS

E SISTEMAS PARA PRODUZIR PELO MENOS UM PRODUTO, CULTURA

CELULAR E MEIO DE CULTURA, USOS DOS MESMOS, EXTRATOS DO MEIO DE CULTURA CELULAR, E DE UM PRODUTO BIOLÓGICO, BIOCOMBUSTÍVEL, SISTEMA DE CAPTAÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO, USO DO SISTEMA DE DUAS CULTURAS, OU DO SISTEMA DE CAPTAÇÃO

DE DIÓXIDO DE CARBONO, INSTALAÇÕES DE GERAÇÃO DE ENERGIA E

DE GERAÇÃO DE BIOCOMBUSTÍVEL DE PRODUÇÃO DE DIÓXIDO DE CARBONO, USO DE UM EXTRATO, OU DE UM BIOCOMBUSTÍVEL, E, MÉTODOS PARA PRODUZIR BIOCOMBUSTÍVEIS E ÓLEOS VEGETAIS" Divisão do pedido de patente n° PI 0911529-3, apresentado na fase nacional brasileira era 26 de outubro de 2010, baseado no pedido de patente internacional PCT/GB2009/001066, de 28 de abril de 2009.

Campo da Invenção A invenção refere-se à produção de óleos vegetais, ácidos graxos e outras fontes de biocombustivel a partir do desenvolvimento de células \^egetais em cultura de tecidos.

Introdução A lista ou debate de um documento publicado aparentemente antes deste relatório descritivo não deve necessariamente ser interpretado como um reconhecimento de que o documento é parte do estado da técnica ou que seja de conhecimento geral comum. É bem conhecido e relatado que o uso de combustíveis fósseis é nocivo ao meio ambiente e a atmosfera do planeta.

Também é sabido que os combustíveis fósseis são um recurso finito que não pode durar indefinidamente.

Como um resultado disto, houve rauita pesquisa e investigação de fontes alternativas de combustível tais como nuclear, eólica, solar, células combustíveis de hidrogênio e biocombustiveis. A demanda por combustíveis derivados biológicos, isto é, metil ésteres de ácidos graxos tem crescido de modo exponencial recentemente devido a várias iniciativas governamentais internacionais para reduzir a dependência nas fontes de combustíveis derivados do petróleo tais como óleo diesel e gasolina.

Para atender essa demanda houve um aumento O.cl ]DI?0SSclO sobre a agricultura para dedicar mais terra e recursos para o desenvolvimento de culturas oleaginosas tais como soja, colza e milho e de fato, portanto, existe menos terra disponível para a produção de gêneros alimentícios, Esta demanda também levou ao desmatamento de certas áreas para o plantio de culturas oleaginosas. É óbvio para aqueles versados na técnica que este processo é mais provável de conduzir a um aumento do aquecimento global e a pobreza do terceiro mundo do que alivia—lc -. A cultura de tecidos de células vegetais é conhecida como um método de propagação de vegetais ou para o cultivo de tecidos específicos de vegetais de modo a colher produtos de vegetal específicos. É também evidente que a produção de óleo vegetal para a produção de combustível é extremamente intensiva da terra visto que menos do que uma tonelada de óleo é produzida por acre de terra dedicada à sua produção. Isto é devido ao fato de que apenas as sementes do vegetal produzem óleo e apenas certos tecidos dentro da semente. O restante do tecido do vegetal é, portanto, desperdiçado neste método de produção. Da mesma forma, cada vegetal deve ser plantada a uma certa distância de seu vizinho (esta distância será dependente da espécie de vegetal utilizada).

Portanto, tornou-se evidente que para satisfazer a crescente demanda mundial por bíocombustíveís, nesse caso, uma fonte ou método alternativo de produção destes combustíveis é necessário. O atual processo para a produção de metil ésteres de ácidos graxos a partir dos óleos vegetais também possui uma grande desvantagem tal como na produção dos metil ésteres, o triglicerídeo no óleo é decomposto em ácidos graxos livres e glicerina. O volume de glicerina produzido por este método é atualmente mais do que a demanda de fontes industriais para o produto. Isto então levará a outros problemas no futuro, assim como métodos para a eliminação segura de glicerina em uma grande escala terão de ser desenvolvidos. É bem conhecido na técnica que as células vegetais podem ser mantidas na cultura de tecidos. A cultura de tecidos é um termo usado para descrever o processo onde as células vegetais são cultivadas fora de um vegetal intacta, em um meio adequado de nutrientes, A cultura de tecidos é definida como um método em que partes de um vegetal são transferidas para um ambiente artificial no qual elas podem continuar a sobreviver. 0 termo cultura de tecidos como entendido na técnica refere-se ao tecido cultivado que pode consistir de células vegetais individuais ou grupos de células vegetais, protoplastos ou todo ou partes inteiras de um órgão do vegetal.

Em cultura de tecidos, as células vegetais podem ser cultivadas em uma superfície sólida como grumos de cor clara conhecidos como cultura de calos ou como grupos individuais ou pequenos de células conhecidos como cultura em suspensão. As células cultivadas em cultura estão se dividindo ativamente e podem ser mantidas indefinídamente em um estado indiferenciado mediante a transferência das células para novos meios (subcultivo). As células cultivadas também podem ser induzidas a rediferenciar em plantas inteiras, A cultura de tecidos é bem conhecida no campo da biologia de vegetal e possui várias aplicações, por exemplo, pode ser usada para produzir grandes quantidades de vegetais ou matéria de vegetal em um curto período de tempo (micropropagação) .

As culturas de tecidos de vegetal podem ser iniciadas de quase toda parte do vegetal de origem (denominada explante), embora as partes mais novas do vegetal sejam, geralmente mais úteis visto que elas contêm mais células ativamente em divisão.

Embora a cultura de tecidos seja bem conhecida na técnica, diferentes plantas podem variar nas condições exatas requeridas para manter as células em cultura.

As células em cultura de tecidos geralir.ente são diferentes daquelas em um vegetal intacta. Também, é conhecido na técnica que as células vegetais cultivadas produzem quantidades diferentes e quantidades alteradas de metabólitos (Dicosmo and G Delle Monache, 1995, Phytochemistry, 39, 575-580). 0 presente inventor surpreendentemente demonstrou que as células cultivadas a partir da semente de Triticum vulgare e também da soja possuem surpreendente perfil de ácido graxo de tríglicerídeo ao dos compostos observados no vegetal inteira ou suas partes, exceto as células isoladas. O inventor produziu uma cultura de células vegetais isoladas de Triticum vulgare e produziu uma linhagem celular de vegetal estável em cultura.

Como as células vegetais se propagam dentro de poucos dias, é barato produzir grandes quantidades da célula cultivada através da subcultura. Portanto, as culturas de células vegetais de lavouras de vegetais que carregam óleo vegetal convencionais fornecem uma alternativa conveniente e barata para as culturas convencionais de óleo vegetal agricolamente produzidas. Ainda mais, a adição de inibidores de enzima {isto é, enzimas que atuam como inibidores, tais como lipase e esterase, como debatido mais abaixo) pode prevenir, reduzir ou reverter a adição de glicerina aos ácidos graxos e assim eliminar a necessidade de produção de resíduos durante a extração de ácidos graxos.

Descrição da Invenção De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é fornecido células vegetais cultivadas, por exemplo, do gênero Triticum (ou outro vegetal oleaginosa), caracterizadas pela sua capacidade de produzir tanto ácidos graxos livres quanto lipídeos ou óleos vegetais. A presente invenção será agora descrita mais além. Nas passagens que seguem diferentes aspectos da invenção são ainda definidas com maiores detalhes. Cada aspecto assim definido pode ser combinado cora qualquer outro aspecto ou número de aspectos a não ser que claramente indicado ao contrário. Em particular, qualquer aspecto apontado como preferido ou vantajoso pode ser combinado com qualquer outro aspecto ou aspectos indicados como sendo preferidos ou vantajosos.

No contexto de qualquer um dos seguintes aspectos da invenção, o termo "planta" é preferivelmente destinado a excluir algas. Assim, qualquer referência a um vegetal ou célula de vegetal poderá ser interpretada de incluir o significado de que não é ura organismo ou célula de algas.

As células da invenção são caracterizadas pelo fato de que elas produzem pelo menos um composto de ácido graxo ou óleo que pode ser utilizado como um combustível (ou biocombustivel) ou quimicamente modificado a fim de ser utilizado como um combustível (ou biocombustivel). De acordo com a invenção o termo produz é usado para descrever que as células vegetais criam um composto que pode depois ser retido dentro da célula, por exemplo, no vacúolo ou em um órgão de armazenagem, ou que pode ser secretado.

As células vegetais de acordo com a invenção foram isoladas de seu ambiente natural. Várias técnicas para o isolamento de células são conhecidas na técnica. Por exemplo, as células podem ser isoladas pelo corte de um pequeno pedaço de tecido de vegetal. Uma pessoa versada observará que qualquer um dos métodos conhecidos na técnica pode ser usado de acordo cora a invenção e será compreendido pela pessoa versada que a invenção pode ser realizada usando células isoladas de diferentes partes de uma ou mais plantas. Por exemplo, as células podem ser isoladas a partir da mesoderma, como exemplificado no Exemplo 1.

Também será entendido por uma pessoa versada na técnica que o número total de células isoladas pode variar.

Em principio, deve haver pelo menos uma célula visto que esta célula se dividirá e multiplicará. No entanto, partindo de uma única célula requer isolamento preciso de uma única célula e, portanto, é demorado- Conseqüer.temente, o número total de células de acordo com a invenção pode variar.

Os termos de "células em cultura" ou "células cultivadas" são usados aqui para se referir à cultura de tecidos de células vegetais. A cultura de tecidos se refere aos métodos em que células vegetais derivadas de qualquer parte do vegetal são cultivadas de forma isolada a partir de vegetais intactas era meio nutritivo sob condições controladas e estéreis. Os meios nutritivos comumente usados na técnica compreendem carboídrato como uma fonte de energia, sais, vitaminas, aminoácidos, minerais, hormônios dc crescimento de vegetais e outros compostos. 0 meio também pode compreender compostos antibacterianos e fungicidas para evitar a contaminação por bactérias e/ou fungos. Vários métodos diferentes de cultura de tecidos são bem conhecidos na técnica e uma pessoa versada observará que as células de acordo com. a invenção podem ser cultivadas de acordo com qualquer um desses métodos. Tais métodos incluem, por exemplo, a cultura de tecidos utilizando placas de Petri e meio de ágar sólido. Outro método de cultivo bem conhecido é o cultivo em suspensão em que as células são colocadas em suspensão em um liquido e armazenadas em frascos. Além disso, as células vegetais rambém podem ser cultivadas usando culturas de células vegetais aderentes em que as células são imobilizadas em géis, espumas ou membranas.

As células também são caracterizadas pelo fato de que elas são mantidas e propagadas em cultura. As culturas em suspensão de células vegetais podem ser preferíveis.

As células vegetais cultivadas de acordo com o primeiro aspecto da invenção podem ser obtidas através do isolamento das células de um vegetal inteira ou partes de um vegetal e a manutenção das células em um meio de cultura. Como descrito acima, os métodos para o isolamento e cultivo de células vegetais são bem conhecidos na técnica. Ά pessoa versada irá observar que as células vegetais cultivadas podem secretar compostos para o meio circundante. Conseqüentemente, em uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, as células cultivadas da invenção secretam pelo menos um composto que é um ácido graxo e/ou óleo no meio de cultura. Se as células de acordo com a invenção secretam o composto no meio circundante é então possível extrair a fração de ácido graxo e/ou óleo do meio para ser utilizado na fabricação de biocombustível.

Conforme explicado acima, uma forma de cultivo de tecido de células vegetais é a cultura em suspensão. Em uma cultura em suspensão, pequenos aglomerados de células são cultivados em um frasco colocado em suspensão em um meio de cultura. Os meios de cultura ou nutriente tipicamente compreendem carboidratos como uma fonte de energia, sais, vitaminas, aminoácídos, minerais, hormônios de crescimento do vegetal e outros compostos. Os frascos ou recipientes contendo as células e os meios de cultura são tipicamente armazenados em um agitador, ou contêm um mecanismo de agitação, para evitar que as células se sedimentem no fundo do frasco ou recipiente. As culturas em suspensão são geralmente sub-cultivadas em intervalos específicos, por exemplo, em torno de cada uma, duas, três, quatro ou cinco semanas (neste contexto "en torno" se refere a ± 4, 3, 2 ou 1 dias), para fornecer novos meios de crescimento e manter as células em um estado diferenciado ou indiferenciado.

De acordo com uma modalidade do primeiro aspecto da invenção, os meios em que as células são colocadas em suspensão e em que pelo menos um composto compreendendo ácido graxo e/ou óleo é secretado, podem ser coletados. O liquido resultante pode ser fracionado para remover o composto. Alternativamente, os meios podem fornecer as condições que resultam na separação passiva de ácido graxo e/ou óleo secretado do meio, para formar uma camada discreta que pode ser coletada.

Conseqüentemente, em uma modalidade do primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir pelo menos um ácido graxo e/ou óleo a partir de uma cultura em suspensão de células vegetais, o método compreendendo: (i) a manutenção de uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo sob condições tais que as células cultivadas sintetizam e secretam pelo menos um ácido graxo e/ou óleo no meio de cultura celular em suspensão, e (ii) a extração do assim seeretado pelo menos um ácido graxo e/ou óleo do meio de cultura celular em suspensão. 0 meio em suspensão de células vegetais da técnica tipicamente empregam um pH em torno de neutro (isto é, em torno do pH 7), quando diluido em uma concentração operacional de seus componentes. O presente inventor percebeu que tais condições de pH da cultura "padrão" não seria ideal para a liberação de ácidos graxos e/ou óleos pela cultura em suspensão de células vegetais do primeiro aspecto da invenção. A cultura em suspensões de células vegetais do primeiro aspecto da invenção pode ser mantida em una pH adequado para fazer com que os ácidos graxos e/ou óleos armazenados no vacúolo das células vegetais sejam liberados através do citosol das células vegetais, no meio de cultura celular em suspensão. Assim, a cultura em suspensão de células vegetais pode ser mantida em um pH que é tipicamente menor do que cerca do pH 7,0, 6,5, 6,0, ou mais preferivelmente 5,5, tal como em torno ou maior do que o pH 3,0 a cerca de 6,5, preferivelmente em torno ou maior do que o pH 3,5 a cerca de 5,5, mais preferivelmente em torno do pH 4,5 a cerca de 5,0 ou 5,5. Neste contexto, o termo "em torno de" pode se referir a + 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 unidade de pH. As culturas de células vegetais tipicamente se tornam inviáveis abaixo de cerca de pH 3,0, embora o limite exato deste possa variar entre diferentes culturas em suspensão de células vegetais dependendo, por exemplo, das espécie de vegetal ou tipo de célula a partir da qual a cultura celular é derivada, e pode ser determinado através de testes de rotina sobre uma base de cultura por cultura.

Na prática, a cultura era suspensa de células vegetais deve ser mantida em um pH acima do limite mais baixo de pH em que a cultura celular em questão torna-se inviável. Em qualquer caso, a maioria, senão todas, as culturas em suspensão células vegetais devem ser viáveis e produtiva na faixa de pH mais preferida de cerca de pH 4,5 a cerca de 5,5.

Assim, o meio de cultura celular em suspensão pode compreender um tampão que mantenha o meio de cultura celular em suspensão em torno do pH selecionado. Qualquer tampão adequado pode ser utilizado. Por exemplo, o tampão pode selecionado do grupo constituído de ácido cítrico e hidrogênio ortofosfato de dissódio, ou qualquer outro tampão não tóxico que não contenha metais pesados e/ou que seja adequado para uso na produção agrícola ou de alimentos , Δ força iônica do meio de cultura celular em suspensão pode, por exemplo, estar entre Ο,ΟΟΙΜ e 0,1M, preferivelmente entre 0,005 e 0,05M. Em uma modalidade, é preferível controlar a força iônica do meio de cultura celular em suspensão mediante a concentração de açúcares, em vez da concentração de sais, porque isso leva em conta as concentrações de açúcar mais elevadas, que também podem ser usadas como uma fonte de carbono pelas células na cultura. Tipicamente, o açúcar ou açúcares usados para controlar a fcrça iônica são mono- ou dissacarideos, tais como um ou mais de glicose, sacarose e/ou frutose. Ά concentração combinada de açúcares dentro do meio de cultura pode ser de cerca de 30 a 70g/l, 40 a 60g/l ou 50 a 60g/l. Em torno de 50g/l pode ser o ideal. Neste contexto, o termo "em torno de" refere-se a ± 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5g/l. A condutividade do meio de cultura celular em suspensão pode ser mantida em uma constante (por exemplo, mediante a limitação das flutuações na condutividade em não mais do que ± 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou substancialmente 0%) . A condutividade ideal variará de acordo com a espécie de vegetal utilizada na cultura, e isto pode ser determinado por experimentação rotineira pela pessoa versada. A condutividade pode ser monitorada e/ou controlada por meios bem conhecidos na técnica.

Em uma modalidade preferida, a viabilidade da cultura em suspensão de células vegetais é mantida durante a etapa de extração do assim secretado pelo menos um ácido graxo e/cu óleo a partir do meio de cultura celular em suspensão.

Em outras palavras, a etapa de extração do assim produzido pelo menos um ácido graxo e/ou óleo não requer qualquer interrupção, ou qualquer interrupção substancial do crescimento da cultura em suspensão de células vegetais que pode, por exemplo, ser avaliado pelo monitoramento do nivel de atividade respiratória como indicado pelo consumo de 02 e/ou produção de ácidos graxos e/ou óleo, em que o nivel de atividade respiratória e/ou produção de ácidos graxos e/ou óleo, durante a etapa de extração do assim secretado pelo menos um ácido graxo e/ou óleo do meio de cultura celular em suspensão, não deve cair para menos do que 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou substancialmente 100% do nível observado quando a etapa de extração não está sendo executada. Portanto, a presente invenção fornece um método que leva em conta a colheita continua de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo do meio de cultura celular em suspensão. Isto pode ser alcançado por pelo menos dois métodos.

Em um primeiro método para a colheita contínua, o pH no qual o meio de cultura celular em suspensão é mantido é selecionado para promover a secreção de ácidos graxos e/ou óleos das células cultivadas no meio de cultura celular e ainda promover a liberação dos ácidos graxos e/ou óleos secretados de uma emulsão dentro do meio de cultura celular em suspensão, tal como um pK ácido de aproximadamente, ou acima de, 4,5, tal como até cerca do pH 5,0, 5,5, 6,0 ou 6.5. Sem ser limitado pela teoria, o presente inventor acredita que, neste pH da cultura, o citoplasma das células vegetais cultivadas torna-se levemente acidificado, o que resulta na liberação de ácidos graxos e/ou óleos dos sítios de armazenamento intracelulares (tais como o vacúolo) dentro do citoplasma como uma micro-emulsão, seguido pela secreção/liberação dos ácidos graxos e/ou óleos no meio de cultura celular, em que o pH selecionado da cultura (junto dos outros parâmetros, incluindo a força iônica, temperatura e pressão) motiva a decomposição química da emulsão (se o pH da cultura for mais baixo do que cerca de 4.5, então a emulsão pode ser mantida dentro do meio de cultura celular, para que se observe o segundo método, abaixo). Como uma conseqüência da decomposição química da emulsão dentro do meio de cultura celular, o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo não emulsificado não é mais miscível com o meio aquoso de cultura celular e, portanto, se acumula como uma camada discreta sobre a superfície do meio de. cultura celular. Assim, a secreção do pelo menos um ácidc graxo e/ou óleo das células cultivadas no meio de cultura celular em suspensão circundante pode resultar na formação de um sistema bifásico em que o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo se acumula em uma camada separada no meio de cultura celular em suspensão. Em um tal sistema bifásico, a etapa de extração do assim secretado pelo menos um ácido graxo e/ou óleo do meio de cultura celular em suspensão pode compreender a extração direta do pelo menos um ácido graxo, e/ou óleo da camada que se forma dentro do sistema bifásico. Pode ser preferível não remover completamente da camada, de modo que ele também possa continuar a atuar como uma barreira ao movimento patogênico entre a atmosfera e o meio de cultura celular em suspensão.

Em um segundo método para colheita continua, o pH no qual o meio de cultura celular em suspensão é mantida está dentro da faixa de aproximadamente, ou maior do que, 3,0 a cerca de 4,5, preferivelmente um pH dentro da faixa de aproximadamente, ou maior do que 3,5 a cerca de 4,5, e este é selecionado para manter os ácidos graxos e/ou óleos assim secretados em uma emulsão dentro do meio de cultura celular em suspensão. Neste método, é necessário para coletar e processar uma parte, ou a totalidade, do meio de cultura celular em suspensão para extrair o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo. Tipicamente, isso é feito mediante a separação fisica de uma parte ou da totalidade do meio de cultura celular em suspensão das células cultivadas (opcionalmente, feito seqüencial ou simultaneamente com a adição de meio novo de cultura substituto), antes do processamento, tal como por filtração, diálise, filtração molecular ou centrifugação de Vórtice. Após o processamento do meio de cultura celular em suspensão para extrair o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo, o meio de cultura celular em suspensão assim processado pode ser devolvido ao recipiente de cultura para sustentar o crescimento continuo das células cultivadas. Tipicamente, a etapa de processamento do meio de cultura celular em suspensão para extrair o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo envolve submeter o meio de cultura celular em suspensão a uma etapa que rompe a emulsão e, assim, permite a geração de um sistema bifásico, do tipo acima descrito, em que o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo se acumula em uma camada discreta separada no meio de cultura celular em suspensão e pode ser coletado. Portanto, onde o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo assim secretado está presente no meio de cultura celular em suspensão como uma emulsão, pode ser extraído do meio de cultura celular em suspensão através do processamento da totalidade, ou parte, do meio de cultura celular em suspensão para quebrar a emulsão, opcionalmente após a separação do meio de cultura celular em suspensão das células cultivadas. A emulsão pode ser quebrada por qualquer meio adequado. Por exemplo, pode envolver a etapa de processamento do todo, ou parte, do meio de cultura celular em suspensão - (a) mediante a modificação de pelo menos uma condição do meio de cultura celular em suspensão selecionada do pH, força iônica, temperatura ou pressão de modo que o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo nele presente seja liberado de uma emulsão; aumentos na temperatura e/ou redução na pressão podem ser preferíveis visto que o meio tratado da forma mais conveniente pode ser devolvido adequado (por exemplo, mediante o subseqüente esfriamento e/ou permissão de um retorno à pressão original) para um retorno à cultura celular crescimento. Quando o pH e/ou a força iônica é modificada para quebrar a emulsão, então tipicamente a mesma condição será ainda modificada antes de retornar ao meio para o desenvolvimento da cultura celular para torná- lo adequado para manter as condições de cultura, e/ou (b) mediante o tratamento físico (mecânico) do meio de cultura celular em suspensão, tal como por centrifugação, de modo que o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo nele presente seja liberado.

Alternativamente, a emulsão do pelo menos um ácido graxo e/ou óleo pode ser extraída do meio de cultura celular em suspensão pela extração com solventes.

Em uma variante das modalidades debatidas acima, a invenção refere-se às células vegetais cultivadas de acordo com a invenção caracterizadas pelo fato de que as células são tratadas após o cultivo para remover o ácido graxo e/ou óleo. Em uma modalidade, as células são submetidas a lise e depois a extração de solvente é executada para remover o ácido graxo e/ou óleo. Em uma outra modalidade as células são comprimidas para remover o ácido graxo e/ou óleo. Em mais uma outra modalidade as células são homogeneizadas. A homogeneização pode ser utilizada antes da lavagem do ácido graxo e/ou óleo das células usando água ou outro solvente preferido.

Nesta modalidade variante em que as células da cultura são tratadas para remover o ácido graxo e/ou óleo, tal como por métodos envolvendo a lise celular, compressão ou homogeneização, o processo é um método que causa o rompimento do crescimento da cultura celular das células vegetais e, portanto, é um método para a colheita não contínua de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo do meio de cultura celular em suspensão* Em uma modalidade preferida o solvente orgânico compreende um álcool. Preferivelmente, o álcool é um álcool Ci a C4. Preferivelmente, o álcool é um álcool linear ou alguilico. O álcool pode ser preferivelmente metanol, etanol ou propanol.

Em outra modalidade, o solvente orgânico polar compreende um haloalcano. Preferivelmente, o haloaleano é um haloalcano Ci a C4. Também preferivelmente, o haloalcano compreende cloro. O cloro pode estar presente como Cli a CI4. Por exemplo, o haloalcano pode ser triclorometano (clorofórmio), clorometano ou díclorometano.

Outro solvente orgânico polar que pode ser usado é um carbonil alcano. Preferivelmente, o carbonil alcano compreende Ci a C4. Em uma modalidade preferida o carbonil alcano é acetona.

Também é possível usar combinações dos solventes orgânicos polares acima descritos. Por exemplo, o solvente pode compreender um álcool e um haloalcano, um álcool e um carbonil alcano ou um carbonil alcano e um haloalcano. Em uma modalidade preferida, o solvente compreende uma mistura de metanol e clorofórmio. Em uma outra modalidade preferida, a mistura de metanol e clorofórmio contém ambos os compostos em partes iguais.

Em uma modalidade preferida o método mencionado acima de colheita não contínua pode incluir uma etapa em que as células vegetais podem ser secadas em um forno ou por outros métodos de remoção da água conhecidos das pessoas versadas na técnica. Ά célula de vegetal de produção de óleo na cultura em suspensão de células vegetais do primeiro aspecto da presente invenção pode ser uma célula de vegetal diferenciada, tal como uma célula que é especializada na produção e armazenamento de óleos, por exemplo, uma célula mesoderma. As células vegetais de produção de óleo podem ser capazes de realizar a fotossíntese, embora tipicamente não serão, em um nível que remove a necessidade com relação ao meio de cultura em que é cultivado para ser suplementado por açúcares, tais como glicose, sacarose e/ou frutose. R célula de vegetal de produção de óleo na cultura de suspensão celular de vegetal em suspensão de células vegetais do primeiro aspecto da presente invenção pode ser de um vegetal de produção de óleo, tal como um vegetal selecionada do grupo consistindo de Txiticum, Brassíca, Zea, Rhus, Olea e Glycine. O inventor surpreendentemente demonstrou que as células isoladas de um vegetal do gênero Tríticum e propagadas na cultura de acordo com métodos conhecidos na cécnica produzem um perfil muito semelhante de compostos de ácido graxo e óleo em comparação com o perfil de compostos de ácido graxo e óleo observado em um vegetal inteira Tríticum. Conseqüentemente, o inventor é o primeiro a mostrar que os óleos vegetais podem ser produzidos a partir do tecido de vegetais cultivadas.

Este é um resultado inesperado e surpreendente, visto que é conhecido na técnica que as células vegetais que são mantidas em cultura produzem diferentes quantidades de metabólitos do que as células in vivo. Em alguns casos, os xnetabólitos presentes no vegetal intacta estão ausentes nas células cultivadas (Delle Monache, 1995, Phytochemístry, 39, 575-580) . Para verificar que as células produzem ácidos graxos e/ou óleos essas frações podem ser identificadas usando técnicas químicas convencionais. Uma pessoa versada na técnica observará que tais técnicas incluem, mas não são limitados a ele, métodos cromatográficos e ressonância magnética nuclear. Portanto, a pessoa versada na técnica será capaz de identificar a presença de compostos de ácido graxo e/ou óleo nas células cultivadas da invenção utilizando métodos de rotina e conhecimento disponível na técnica.

De acordo com uma modalidade preferida do primeiro aspecto da invenção, as células vegetais utilizadas são do gênero Triticum. Em outra modalidade preferida as células são do gênero Zea. Em outra modalidade preferida as células são do gênero Rhus. Em outra modalidade preferida as células são do gênero Olea. Em outra modalidade preferida as células são do gênero Brassica. Em outra modalidade preferida as células são do gênero Glycine. Em outra modalidade preferida as células são do gênero de qualquer outro vegetal de produção de óleo adequada.

As células vegetais de produção de óleo podem, ou não, ser geneticamente modificadas, tais como para incorporar uma ou mais modificações genéticas (por exemplo, transgênicos) que aumentam o nivel, ou modificam o tipo, de ácido graxo e/ou óleo que produz. Como ainda debatido abaixo, isto pode incluir urna modificação genética para aumentar os niveis endógenos, ou codificar as enzimas lipase ou esterase não nativas (que podem, ou não, ser apresentadas com uma seqüência líder de secreção) para prevenir, reduzir ou reverter a gliceração de ácidos graxos e assim aumentar o nivel de produção de ácidos graxos livres com una concomitante redução na produção de óleos.

Como debatido acima, o meio de cultura em suspensão de células vegetais utilizado no primeiro aspecto da presente invenção (e/ou quaisquer outras culturas de células vegetais debatidas neste pedido) pode compreender um ou mais compostos anti-bacterianos e/ou fungicidas para evitar a contaminação por bactérias e/ou fungos. Quaisquer compostos antibacterianos e/ou fungicidas conhecidos na técnica podem ser usados, contanto que eles substancialmente não impeçam o crescimento da cultura em suspensão de células vegetais. Em uma modalidade, um ou mais compostos antibacterianos e/ou fungicidas é uma resina de vegetal, tal como uma resina (por exemplo, um extrato de raiz ou látex) obtida a partir de vegetais tais como os grupos de gênero Plper (por exemplo, Piper methysticum) e Populus (por exemplo, Populus candicans). Os compostos antibacterianos e/ou fungicidas exemplares são descritos em Whitton et al, 2003, Phytochemistry, 64, 673-679 e WO2Q05/072529, cujos conteúdos de ambos são aqui incorporados por referência. O pelo menos um ácido graxo e/cu óleo que é produzido e/ou extraído a partir do método do primeiro aspecto da presente invenção pode ser ainda processado para convertê- lo em um biocombustível, ou é opcionalmente ainda purificado e/ou utilizado em um processo a jusante tal como pela incorporação de um produto alimentício, cosmético, lubrificante ou qualquer outro produto que compreenda ácidos graxos, óleos vegetais, ou compostos derivados destes. Os métodos adequados para a purificação e processamento de ácidos graxos e óleos são conhecidos pela pessoa versada. Por exemplo, numerosos métodos para a conversão de óleo vegetal em biocombustível tais como metil ésteres de ácido graxo (FAME) são bem conhecidos na técnica e podem ser empregados para converter os ácidos graxos ou óleos resultantes obtidos pelo método do primeiro aspecio do presente invenção. Em particular, como debatido abaixo, a presente invenção também fornece um novo método para produzir biocombustíveis a partir de ácidos graxos e mono-, di- e triglicerí deos, e este novo método pode ser usado para converter os ácidos graxos ou óleos obtidos pelo método do primeiro aspecto da presente invenção em biocombustiveis.

Um ácido graxo ou óleo extraído e/ou purificado obtido de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção pode ser pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,8%, 99,9% ou substancialmente 100% (em peso) composto de ácidos graxos e/ou óleos. Os métodos são conhecidos r.a técnica, por exemplo, cromatografia gasosa ou eletroforese, para a avaliação da composição em peso percentual de ácidos graxos e/ou óleos.

Uma outra modalidade do primeiro aspecto da presente invenção fornece uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo como definido acima.

Uma outra modalidade do primeiro aspecto da presente invenção fornece um uso da cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo como definido acima para produzir pelo menos um ácido graxo e/ou óleo, em que o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo é secretado no meio de cultura celular em suspensão, e preferivelmente em que a secreção resulta na produção de um sistema bifásico no qual o secretado pelo menos um ácido graxo e/ou óleo se acumula em uma camada separada do meio de cultura celular em suspensão, como descrito acima.

Uma modalidade adicional do primeiro aspecto da presente invenção fornece um meio de cultura em suspensão de células vegetais tamponado tendo um pH ácido menor do que cerca de pH 7,0, 6,5, 6,0 ou 5,5, tal como em torno de ou maior do que pH 3,0 a cerca de 6,5, preferência em torno de ou maior do que pH 3,5 a cerca de 5,5, mais preferivelmente de cerca de pH 4,5 a cerca de 5,5, que é adequado para o cultivo de uma cultura em suspensão de células vegetais por um método de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção. 0 meio também pode compreender compostos antibacterianos e fungicidas para evitar a contaminação por bactérias e/ou fungos. O meio também pode compreender inibidores químicos ou de enzima (tais como lipase e esterase, como debatido mais abaixo) que pode prevenir, reduzir ou reverter a adição de glicerina nos ácidos graxos e assim eliminar a necessidade com relação a produção de resíduos durante a extração de ácidos graxos. O meio pode incluir outros componentes que são padrão nos meios de cultura de células vegetais e pode, por exemplo, basear-se no meio Murashíge e Skoog amplamente disponível. O meio de cultura em suspensão de células vegetais comumente utilizado na técnica compreende carboidrato como uma fonte de energia, sais, vitaminas, aminoácidos, minerais, hormônios do crescimento de vegetais e outros compostos, e qualquer um ou todos estes componentes também podem estar presentes no meio de cultura em suspensão de células vegetais tamponado da presente invenção. A força iônica do meio de cultura celular em suspensão pode, por exemplo, estar entre Ο,ΟΟΙΜ e 0,1M, preferivelmente entre 0,005 e 0,05K. Em uma modalidade, é preferível controlar a força iônica do meio pela concentração de açúcares, em vez da concentração de sais, pois isso permite maiores concentrações de açúcar, que também podem ser usadas como uma fonte de carbono pelas células na cultura. Tipicamente, o açúcar ou açúcares usados para controlar a força iônica são mono- ou dissacarídeos tais como uma ou mais de glicose, sacarose e/ou frutose. A concentração combinada de açúcares dentro do meio de cultura pode ser de cerca de 30 a 70g/l, 40 a 60g/l ou 50 a 60g/l. Em torno de 50g/l pode ser ideal.

Neste contexto, o termo "em torno de" refere-se a ± 5, 4, 3, 2, 1 ou 0,5g/l. Consequentemente o nivel de sais (tais como sais selecionados de um ou mais, tais como todos, de nitrato de amônio, ácido bórico, cloreto de cálcio anidro, cloreto de cobalto · 6H20, sulfato cúprico · 5H20, Na2~ EDTA, sulfato ferroso · 7H20, sulfato de magnésio, sulfato de manganês * H20, ácido molibdico (sal sódico) * 2H20, iodeto de potássio, nitrato de potássio, fosfato de potássio monobásico, sulfato de zinco · 7H20) pode ser mantido em niveis baixos ou típicos, tais como igual ou abaixo de cerca de 4,4g/l no total, apesar da obtenção de força iônica relativamente elevada no meio (neste contexto, o termo "cerca de" é usado para se referir aos valores que são ± 50%, 40%, 30%, 20%, 10%, 5%, 2% ou 1% do valor de base) . O meio de cultura em suspensão de células vegetais tamponado pode ainda compreender um ou mais compostos anti- bacterianos e/ou fungicidas como debatido acima. 0 meio de cultura em suspensão de células vegetais tamponado da invenção pode ser usado para manter uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo como definido pelo primeiro aspecto da presente invenção de modo que as células sintetizem e secretem pelo menos um ácido graxo e/ou óleo no meio de cultura celular em suspensão.

Em uma outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, também é fornecido um extrato de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo obtido pelo método do primeiro aspecto da invenção, ou um produto compreendendo o extrato, tal como uma produto alimentício, cosmético ou lubrificante, Em uma outra modalidade do primeiro aspecto da invenção, também é fornecido um produto que resulta do processamento de um extrato de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo obtido pelo método do primeiro aspecto da invenção. Um produto particularmente preferido é um biocombustivel, tal como FAME, produzido pelo processamento de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo obtido pelo método do primeiro aspecto da invenção, O biocombustivel produzido a partir de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo obtido pelo método do primeiro aspecto da invenção tipicamente possui uma distribuição altamente uniforme de comprimentos de cadeia de ácido graxo que não é observado nos biocombustiveis produzidos a partir de óleo vegetal coletado de vegetais inteiras. Sem ser limitado pela teoria, o presente inventor acredita que isto é devido às condições altamente consistentes experimentadas pelas células de produção de petróleo dentro da cultura celular em suspensão do primeiro aspecto da presente invenção, em comparação com as condições ambientais mais variáveis experimentadas pelas plantas inteiras, tais como as plantas inteiras cultivadas nos campos. Assim, enquanto que os biocoxnbustiveis de convenção, tais como FAME, derivados de óleo vegetal convencionalmente produzidos podem conter uma distribuição variável de comprimentos de cadeia de ácido graxo, tais como cerca de 5% ou mais fora de dois desvios padrão do comprimento de cadeia de ácido graxo predominante, o biocombustível produzido pelo método do primeiro aspecto da presente invenção pode ter uma distribuição de comprimentos de cadeia de ácido graxo em que não mais do que cerca de 5%, tal como não mais do que cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, cerca de 1%, cerca de 0,5% ou substancialmente 0% estão fora de dois desvios padrão do comprimento de cadeia de ácido graxo predominante. Neste contexto, o termo "cerca de" indica ± 0,5, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1%. R distribuição de comprimentos de cadeia de ácido graxo em um biocombustível pode ser avaliada através de técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo as técnicas debatidas abaixo nos exemplos. Uma pessoa versada na técnica observará que tais técnicas incluem, mas não são limitados a eles, os métodos cromatográficos e ressonância magnética nuclear. Portanto, a pessoa versada na técnica será capaz de identificar a presença e a distribuição de compostos de ácido graxo e/ou óleo nos biocombustíveis da invenção utilizando os métodos de rotina e conhecimento disponível na técnica.

No método anterior do primeiro aspecto da presente invenção, a célula de vegetal de produção de óleo que está presente na cultura em suspensão de células vegetais, tal como uma célula que é especializada na produção e armazenamento de óleos, por exemplo, uma célula mesoderma, pode possuir uma capacidade fotossintética baixa, ou mesmo inexistente. Ela, portanto, requer o fornecimento de uma carga de alimentação de carboidrato (por exemplo, como debatido acima, açúcares incluindo glicose, sacarose e/ou frutose) para atuar como uma fonte de energia e substrato para a síntese de ácidos graxos e/ou óleos. O presente inventor percebeu que seria conveniente e benéfico tirar vantagem da capacidade das culturas em suspensão de células vegetais fotossintéticas para produzir seus próprios açúcares a partir de luz, água e dióxido de carbono (C02) , através do processo fotossintético, de modo que os açúcares sejam produzidos para uso como fonte de energia para o crescimento das células vegetais de produção de óleo e como um substrato para a sua produção de ácidos graxos e/ou óleos. De fato, o inventor percebeu que seria possível tirar proveito do processo fotossintético, para usar uma cultura em suspensão de células vegetais fotossintéticas para gerar uma fonte de açúcar para uso por qualquer processo que utiliza os açúcares, tal como qualquer cultura de material biológico. Além disso, o inventor percebeu que isso permite a captura de C02 pela cultura em suspensão de células vegetais fotossintéticas, tal como o C02 que é liberado como um subproduto de outros processos, de modo que ele possa ser utilizado para produzir açúcares úteis e simultaneamente reduzir o nivel de C02 que é liberado pelos processos de emissão de C02, tais como os processos para a geração de eletricidade que utilizam combustíveis baseados em carbono, ou os processos microbiológicos (tais como para a produção de bioetanol) que liberam C02.

Conseqüentemente, um segundo aspecto da presente invenção fornece um método para produzir um produto biológico, o método compreendendo - (i) a manutenção de uma primeira cultura celular em suspensão de células vegetais fotossintéticas sob condições que permitem as células cultivadas se submeterem a fotossíntese e desse modo gerar e liberar açúcares, tipicamente mono- e/ou dissacarideos {por exemplo, glicose, sacarose e/ou frutose), no meio de cultura circundante; e (ii) a manutenção de uma segunda cultura celular na presença do açúcar gerado pela primeira cultura celular em suspensão para permitir o crescimento da segunda cultura e a produção de um produto biológico. 0 produto biológico pode ser as células da segunda cultura celular, por exemplo, ele pode ser biomassa.

Alternativamente, o produto biológico pode ser sintetizado pelas células da segunda cultura celular. Os produtos biológicos sintetizados pela segunda cultura celular incluem pelo menos um ácido graxo e/ou óleo, um produto protéico (incluindo produtos protéicos codificados de forma recombinante) e/ou um metabólito, tal como o etar.ol.

As condições que permitem as células da primeira cultura celular em suspensão se submeterem a fotossintese tipicamente incluem a provisão de luz, água e dióxido de carbono. Preferivelmente ■ a luz de espectro total é fornecida. Preferivelmente dióxido de carbono em excesso é fornecido, isto é, o nivel de dióxido de carbono não é limitativo no processo fotossintético. A água é fornecida pelo ambiente aquoso do meio de cultura de células vegetais padrão.

Em uma modalidade do segundo aspecto da presente invenção, as células da primeira cultura celular em suspensão e as células da segunda cultura celular estão em comunicação de fluido entre si. Assim, por exemplo, elas podem ser misturadas entre si e cultivadas no mesmo meio e no mesmo recipiente. Alternativamente, as células da primeira cultura celular em suspensão e as células da segunda cultura celular podem ser mantidas em recipientes de cultura separados, mas estes recipientes de cultura separados podem ser conectados em uma comunicação de fluido entre si, de modo que os açúcares produzidos pela primeira (fotossintétíca) cultura celular em suspensão podem ser usado pelas células de segunda cultura celular. Isto pode ser conseguido, por exemplo, com um sistema de 2 tanques com um filtro entre os tanques para impedir a contaminação cruzada das linhagens celulares. Em outras palavras, a comunicação de fluido entre as células da primeira cultura celular em suspensão e as células da segunda cultura celular pode permitir que o açúcar liberado pelas células da primeira cultura celular em suspensão seja utilizado como uma fonte de carbono pelas células da segunda cultura celular.

Err\ uma outra modalidade do segundo aspecto da presente invenção, as células da primeira cultura celular em suspensão e as células da segunda cultura celular são cada uma cultivada em recipientes de cultura separados que não estão em comunicação de fluido entre si. Nesse caso, o açúcar liberado pelas células da primeira cultura celular em suspensão é coletado e, em seguida, alimentado nas células da segunda cultura celular para uso como uma fonte de carbono. Assim, o método do segundo aspecto da presente invenção pode compreender a etapa de extração de açúcar do meio de cultura da primeira cultura celular em suspensão e a outra etapa de alimentação do açúcar extraído na segunda cultura celular. O açúcar pode ser extraído do meio de cultura da primeira cultura celular em suspensão por qualquer meio adequado, tal como por diálise, filtragem molecular, cristalização e outros mais. 0 extrato pode ser ele próprio o meio de cultura que foi utilizado para a cultura da primeira cultura celular em suspensão (e, assim, enriquecido com açúcares da atividade fotossintética das células da primeira cultura celular em suspensão) a partir do qual as células da primeira cultura celular em suspensão foram removidas (por exemplo, por fíltração), em que o meio enriquecido com açúcar extraído é usado diretamente como o meio para a segunda cultura celular. Depois que a depleção dos açúcares do meio enriquecido com açúcar extraído ocorre, corão uma conseqüência do crescimento das células da segunda cultura celular nele, as células da segunda cultura celular podem ser removidas do meio esgotado de açúcar (por exemplo, por filtração) e o meio esgotado de açúcar livre de célula assim produzido pode ser devolvido para uso como o meio de cultura da primeira cultura celular em suspensão de modo que ele possa ser regenerado (isto é, enriquecido com açúcares a partir da atividade fotossintética das células da primeira cultura celular em suspensão) novamente. O açúcar pode ser extraído do meio de cultura da primeira cultura celular em suspensão por continuamente remover o açúcar do meio de cultura celular da primeira cultura celular. Em outras palavras, o açúcar pode ser removido do meio de cultura celular da primeira cultura celular, sem qualquer rompimento, ou qualquer rompimento substancial, do crescimento da primeira cultura celular que pode, por exemplo, ser avaliada pelo monitoramento do nível de atividade fotossintética como indicado pelo consumo de CO2 e/ou produção de açúcar, em que o nível de atividade fotossintética durante a coleta do açúcar não deve cair para menos do que 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% ou substancialmente .100% do nível observado antes da coleta de açúcar. As técnicas adequadas que permitem a remoção continua de açúcar são conhecidas na técnica e incluem, por exemplo, a diálise do meio de cultura.

Em uma modalidade do segundo aspecto da presente invenção, a segunda cultura celular é mantida na presença de açúcar gerado pela primeira cultura celular em suspensão em uma concentração de açúcar na faixa de 0,01M a 1,5M, preferivelmente na concentração em torno de 50g/l.

Todas as células podem ser cultivadas na segunda cultura celular do segundo aspecto da presente invenção.

Tipicamente, as células podem ser procarióticas ou eucarióticas, tais como as células bacterianas, fúngicas, vegetais, animais ou humanas. A fim de combinar o primeiro e o segundo aspectos da presente invenção, pode ser preferível que a segunda cultura celular seja uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo, tal como uma cultura que é descrita acima em relação ao primeiro aspecto da invenção. Alternativamente, o segundo aspecto da presente invenção pode ser utilizado independentemente do primeiro aspecto. Assim, por exemplo, a segunda cultura celular pode ser uma cultura de microorganismos, tais como bactérias ou fungos, incluindo leveduras. As leveduras exemplares incluem as espécies Saccharomyces. Em uma modalidade, a segunda cultura celular pode ser uma cultura celular para a fabricação de etanol ou outro biocombustivel equivalente (por exemplo, outro álcool) e, assim, as células na cultura celular podem ser um microorganismo, tal como levedura, que pode converter o açúcar no etanol, ou outro biocombustivel equivalente.

Assim, as células da segunda cultura celular podem ser microorganismos, tais como leveduras (por exemplo, uma espécie Saccharomyces) , e os produtos biológicos podem ser um álcool, tal como etanol.

Tipicamente, tais culturas podem, elas mesmas, produzir C02 como um produto residual, caso em que o CO2 produzido pela segunda cultura celular pode ser disponibilizado como uma única, ou complementar, fonte de C02 para a primeira cultura celular em suspensão de células vegetais fotossintéticas. Este circuito de liberação e captura de C02 pode auxiliar na tomada de tais processos de carbono-neutro (isto é, redução total da produção de CO2) .

Em uma modalidade preferida, a segunda cultura celular é uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo (tais como uma célula de vegetal diferenciada, por exemplo, uma célula de vegetal diferenciada que é especializada na produção e armazenagem de óleos, tal como uma célula mesoderma) e de fato o método do segundo aspecto da invenção pode ser um método para produzir pelo menos um ácido graxo e/ou óleo de uma cultura de células vegetais, o método compreendendo a manutenção de uma segunda cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo na presença do açúcar gerado pela primeira cultura celular em suspensão e sob condições tais que as células vegetais de produção de óleo cultivadas produzem pelo menos um ácido graxo e/ou óleo. Em uma modalidade particularmente preferida, as características do primeiro e segundo aspectos da presente invenção são combinadas. O método do segundo aspecto da invenção pode compreender a etapa de extração do produto biológico da segunda cultura celular. A natureza da etapa de extração dependerá da natureza do produto biológico e pode ser facilmente determinado pela pessoa qualificada. Quando o produto biológico produzido pela segunda cultura celular for pelo menos um ácido graxo e/ou óleo produzido por uma cultura de células vegetais, então pode ser extraído da segunda cultura celular através de qualquer técnica adequada, tal como qualquer um dos processos contínuos ou não contínuos debatidos acima no que diz respeita ao primeiro aspecto da presente invenção. C método do segundo aspecto da invenção também pode compreender a etapa de ainda purificar e/ou processar (incluindo a modificação química) o produto biológico assim extraído. A natureza das etapas de purificação e/ou processamento dependerá da natureza do produto biológico e pode ser facilmente determinada pela pessoa versada.

Onde o produto biológico produzido pela segunda cultura celular for pelo menos um ácido graxo e/ou óleo produzido por uma cultura de células vegetais, então o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo que é extraído pode depois ser ainda processado para convertê-lo em um biocombustível (tal como FAME), ou é opcionalmente ainda purificado e/ou utilizado em um processo a jusante tal como mediante a incorporação em um produto alimentício, cosmético ou lubrificante.

Em uma modalidade, as células vegetais fotossintéticas presentes na primeira cultura celular em suspensão do método do segundo aspecto da invenção podem, ou não, ser diferenciadas das células vegetais fotossintéticas. A célula de vegetal diferenciada pode ser uma célula que é especializada para a fotossíntese, tal como uma célula da folha ou tecido verde de um vegetal, incluindo paliçada, mesoderma da folha ou células do pecíolo. As células da paliçada podem ser particularmente preferidas.

As células vegetais fotossintéticas presentes na primeira cultura celular em suspensão do método do segundo aspecto da invenção podem possuir uma das mais características selecionadas de (1) como uma média do meio sobre 100 células aleatoriamente experimentadas a partir da primeira cultura celular em suspensão, as células vegetais fotossintéticas contêm, pelo menos 10, 15, 30, 40, 50 ou mais cloroplastos por célula; C ii) um teor de clorofila mais elevado (preferivelmente 2, 3, 4, 5, 10, 20 vezes ou mais) do que as células de uma cultura celular em suspensão mesoderma derivada da mesma espécie de vegetal, por exemplo, como determinado por um ensaio espectrofotométrico que compara a absorvência de uma amostra de teste em um comprimento de onda de 594 nm (que indica o teor de clorofila) com a absorvência da mesma amostra em um comprimento de onda de 1500nm (que indica a densidade celular) de modo que o teor de clorofila possa ser representado pela relação de Ãbs594 : Absi5Qo; (iii) a capacidade de produzir pelo menos 30, 40, 50 ou mais g/1 de açúcar (tal como glicose, sacarose e/ou frutose) quando mantidas em cultura celular em suspensão por uma semana em 20 a 24°C, sob pressão atmosférica, na presença de dióxido de carbono em excesso, e com a exposição à luz de espectro total, com intensidade em 594nm de 15,12 x 1Q“3 Watts; e/ou (iv) a capacidade de capturar pelo menos 50, 75, lOOmç ou mais de carbono, por lOOg de células em peso seco, por hora, quando mantidas em cultura celular em suspensão de 20 a 24°C, sob pressão atmosférica, na presença de dióxido de carbono em excesso, e com a exposição à luz de espectro total, com intensidade em 594 nm de 15,12 x IO-3 Watts.

As células vegetais fotossintéticas presentes na primeira cultura celular em suspensão do método do segundo aspecto da invenção podem ser isoladas de ura vegetal tolerante a cobre, tal como da Agrostis tenuls. A primeira cultura celular em suspensão de células vegetais fotossintéticas do segundo aspecto da presente invenção pode ter um nivel de cobre meio na cultura celular de 0,001 a 0,1M.

No método do segundo aspecto da presente invenção, a primeira cultura celular em suspensão de células vegetais fotossintéticas pode ser alimentada com dióxido de carbono a partir de uma fonte de dióxido de carbono selecionada de dióxido de carbono liquido ou dióxido de carbono gasoso. A fonte de dióxido de carbono liquido ou gasoso pode, ou não, ser obtida total ou parcialmente como um subproduto de um processo de produção de dióxido de carbono, tal como um processo de geração de energia que utiliza combustíveis de carbono, ou um processo de produção de biocombustivel (tal como o bioetanol ou outros alcoóis) por microrganismos {tais como levedura) que liberam dióxido de carbono.

Assim, em uma modalidade preferida do segundo aspecto da presente invenção, pelo menos a primeira cultura celular em suspensão, e opcionalmente também a segunda cultura celular, é ou são mantidas no local do processo de produção de dióxido de carbono, tal como no sítio de uma instalação de geração de energia (por exemplo, eletricidade), ou no sítio de uma instalação de geração de biocombustível (tal como bioetanol ou outro álcool), que gera dióxido de carbono como um subproduto.

Conseqüentemente, o segundo aspecto da presente invenção também fornece um sistema para produzir um produto biológico de duas culturas (por exemplo, como definido acima), compreendendo uma primeira cultura em suspensão de células vegetais e uma segunda cultura celular, cada uma como definido acima em relação ao segundo aspecto da presente invenção. 0 sistema de duas culturas pode ainda compreender uma fonte de geração de dióxido de carbono, e em que o dióxido de carbono assim gerado é alimentado para dentro da primeira cultura em suspensão de células vegetais. A fonte de geração de dióxido de carbono e a segunda cultura celular podem ser a mesma ou diferente.

Em uma modalidade preferida, o sistema de duas culturas do segundo aspecto da presente invenção é um sistema para produzir pelo menos um ácido graxo e/ou óleo, compreendendo una primeira cultura em suspensão de células vegetais como definido acima em relação ao segundo aspecto da presente invenção e uma segunda cultura em suspensão de células vegetais de células vegetais de produção de óleo como definido acima em relação ao primeiro e/ou segundo aspecto da presente invenção. O segundo aspecto da presente invenção também fornece um sistema de captura de dióxido de carbono compreendendo pelo menos a primeira cultura em suspensão de células vegetais como definido acima em relação ao segundo aspecto da presente invenção, e opcionalmente, também a segunda cultura celular como definida acima em relação ao segundo aspecto da presente invenção. 0 sistema captura de dióxido de carbono pode compreender uma fonte de geração de dióxido de carbono, caso em que o dióxido de carbono assin gerado é alimentado na primeira cultura em suspensão de células vegetais. O sistema captura de dióxido de carbono pode compreender uma segunda cultura em suspensão de células vegetais de células vegetais de produção de óleo como definido acima em relação ao primeiro e/ou segundo aspecto da presente invenção. O segundo aspecto da presente invenção também fornece a utilização do sistema de duas culturas, ou do sistema de captura de dióxido de carbono, para capturar o dióxido de carbono. Tipicamente, o dióxido de carbono que é capturado é o subproduto de um processo de produção de dióxido de carbono, tal como um processo de geração de energia (por exemplo, eletricidade) que utiliza combustíveis de carbono, ou um processo de produção de biocombust ivel (tal como bioetanol ou outro álcool) por microrganismos (tais como levedura) que libera dióxido de carbono. Esse uso pode ocorrer no sitio do processo de produção de dióxido de carbono, tal como no sitio de uma instalação de geração de energia (por exemplo, eletricidade), ou no sitio de uma instalação de geração de biocombustivel (tal como o bioetanol ou outro álcool) ou outro processo comercial, industrial ou natural, que gere o dióxido de carbono como um subproduto.

Conseqüentemente, o segundo aspecto da presente invenção também fornece uma instalação de geração de energia de geração de dióxido de carbono (por exemplo, eletricidade) compreendendo o sistema de duas culturas como definido acima pelo segundo aspecto da invenção, ou o sistema de captura de dióxido de carbono como definido acima pelo segundo aspecto da invenção. Em uma modalidade, o sistema de duas culturas ou o sistema de captura de dióxido de carbono pode produzir pelo menos um ácido graxo e/ou óleo a partir do dióxido de carbono capturado e, opcionalmente, o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo assim produzido pode ser utilizado direta ou indiretamente (por exemplo, pela primeira conversão em biocombustivel) para suplementar o combustível utilizado pela instalação de geração de energia. O segundo aspecto da presente invenção também fornece uma instalação de geração de biocombustivel de produção de dióxido de carbono (como bioetanol ou outro álcool) que compreende o sistema de duas culturas como definido acima pelo segundo aspecto da invenção, ou o sistema de captura de dióxido de carbono como definido acima pelo segundo aspecto da invenção. Os açúcares produzidos pela primeira cultura celular em suspensão de células vegetais fotossintéticas presentes dentro do sistema de duas culturas ou do sistema de captura de dióxido de carbono podem ser utilizados para suplementar o crescimento de microorganismos (tais como levedura) utilizados na produção de biocombustivel pela instalação de geração de biocombustivel. 0 segundo aspecto da presente invenção também fornece um extrato de um produto biológico obtido pelo método do segundo aspecto da presente invenção. Assim, o extrato pode ser um extrato de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo. O segundo aspecto da presente invenção também fornece um biocombustivel obtido através do processamento do extrato do pelo menos um ácido graxo e/ou óleo. 0 segundo aspecto da presente invenção também fornece a utilização de um extrato de um produto biológico obtido pelo método do segundo aspecto da presente invenção, ou um biocombustivel obtido pelo processamento do extrato, como uma fonte suplementar de combustível para um processo de produção de dióxido de carbono.

Nos métodos anteriores do primeiro aspecto e/ou segundo aspecto da presente invenção que envolve a produção de ácidos graxos e/ou óleos, a produção de biocombustiveis, tais como FAME, a partir de óleos (isto é, ácidos graxos conjugados com glicerina), requer uma reação que submete a lise o óleo para produzir o biocombustivel e um produto secundário de glicerol. Quando produzido em grandes quantidades, como seria necessário para gerar uma quantidade comercialmente relevante de biocombustivel a partir de óleos vegetais, o glicerol pode ser um produto secundário prejudicial e problemático. O presente inventor percebeu que seria conveniente e benéfico modificar a produção de óleos por culturas de células vegetais usando um inibidor de enzima que pode impedir, reduzir ou reverter a adição de glicerina nos ácidos graxos e assim reduzir ou eliminar a necessidade de produção de resíduos durante a extração de ácidos graxos. De fato, o inventor percebeu que seria possível levar vantagem dessa abordagem em qualquer método de fabricação de ácidos graxos e óleos em culturas de células vegetais.

Conseqüentemente, em um terceiro aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir pelo menos um ácido graxo a partir de uma cultura de células vegetais, o método compreendendo a manutenção de uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo na presença de um inibidor da gliceração de ácidos graxos de modo que as células cultivadas produzam pelo menos um ácido graxo. Conseqüentemente, o método pode incluir a etapa de adição de pelo menos um inibidor da gliceração de ácidos graxos a uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo. Alternativamente, o método pode envolver a utilização de células vegetais de produção de óleo que foram geneticamente modificados, tal como a incorporação de uma ou mais modificações genéticas para aumentar os níveis endógenos de uma enzima, ou codificar uma enzima não nativa (que pode, ou não, ser apresentada com uma seqüência líder de secreção para efetuar a secreção da enzima a partir da célula de vegetal), cuja enzima é capaz de prevenir, reduzir ou reverter a gliceração de ácidos graxos e assim aumentar o nível de produção de ácidos graxos livres com uma concomitante redução na produção de óleos- Os inibidores adequados que são capazes de prevenir, reduzir ou reverter a gliceração de ácidos graxos podem ser inibidores enzimáticos ou químicos de gliceração. Os inibidores enzimáticos incluem as enzimas de lipase e esterase. A lipase de gérmen de trigo ou colza pode ser preferível. Por exemplo, a lipase de gérmen de trigo é disponível da Sigma Aldrich.

As lipases adequadas (seqüências de DNA de codificação de lipase) também podem ser obtidas a partir de microrganismos tais como Candida antartica, Rhizopus oryzae, Mucor miehei e/ou Pseudomonas cepacia.

Existem muitas lipases comercialmente disponíveis que podem ser utilizadas. Por exemplo, uma lipase adequado pode ser selecionada da seguinte lista de lipases comercialmente disponível - lipase de Aspergillus niger (Sigma product code:62301), Aspergillus oryzae (Sigma product ccde:62285), Aspergillus sp. (Sigma product code:84205), Burkholdeha sp. (Sigma product code:75577), Candlda antarctica (Sigma product code:65986), Candida cylíndracea (Sigma product code:62302 ou 62316), Candida lipolytica (Sigma product code:62303), Candida rugosa (Sigma product code:L1754, 90860 ou L8525), Chromobacterium viscosum (Sigma product code:L0763), pâncreas humano (Sigma product code:L9780), Mucor javanicus (Sigma product code:L8906), Mucor miehei (Sigma product code:L9031 ou 62298), Penicillium camemberti (Sigma product code:96888), Penicillium roqueforti (Sigma product code:62308), pâncreas de porco (Sigma product code:L0382, L3126, 62313 ou 62300), Pseudomonas cepacia (Sigma product code:62309), Pseudomonas fluorescens (Sigma product code:28602 ou 95608), Pseudomonas sp. (Sigma product code:L9518), Rhizomucor miehei (Sigma product code:L4277), Rhizopus arrhízus (Sigma product code:62305), Rhizopus niveus (Sigma product code:62310), Rhizopus oryzae (Sigma product code:80612), Thermomyces lanuginosus (Sigma product code:L0777), Thermus flavus (Sigma product code:L3294), Thermus thermophilus (Sigma product code:L3419), ou gérmen de trigo (Sigma product code:L3001).

Paynich 2007, Microbiol & Mol. Gen., 445, 57-61, debate o uso de lipases em processos químicos para a produção de biocombustível a partir de óleos vegetais, em que é empregado em vez de um catalisador de base tal como o hidróxido de sódio para separar os óleos em ácidos graxos e glicerol. No entanto, Paynich adverte do efeito inibidor do glicerol liberado na atividade de lipase, devido à inibição competitiva. No terceiro aspecto da presente invenção, este efeito inibidor é atenuado pelo uso da lipase (ou outro inibidor da gliceração de ácido graxo) em um sistema "em cultura", em vez de um processo químico.

Onde um inibidor enzimático for usado, então o pH da cultura celular pode ser escolhido para otimizar a atividade do inibidor. Por exemplo, a lipase é tipicamente mais ativa em torno do pH 7. Conseqüentemente, ela pode ser benéfica para selecionar um pH de cultura que é o mais próximo possível do pH ideal da enzima. Naturalmente, isso pode resultar em um compromisso entre o melhor pH para a atividade inibidora enzimática e o melhor pH para secreção e coleta de ácidos graxos e os óleos da cultura em suspensão de células vegetais como debatido acima em relação ao primeiro aspecto da presente invenção. A pessoa versada será capaz de determinar o compromisso ideal entre esses aspectos concorrentes da invenção, dependendo do objetivo chave do processo. O terceiro aspecto da invenção pode empregar um nivel de inibidor que é capaz de reduzir o nivel de ácidos graxos submetidos a glicerina em até, ou pelo menos, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou mais, em comparação com o mesmo sistema de cultivo na ausência do inibidor. Por exemplo, o presente inventor observou que, quando lg da lipase de gérmen de trigo foi adicionado a lOOml da cultura em suspensão, o óleo resultante apresentou uma quebra com 8% do óleo sendo ácidos graxos não submetidos a glicerina quando comparado com a produto em suspensão de célula normal. Os níveis mais elevados de atividade da lipase devem ser esperados de resultar em mais de 8% de ácidos graxos não submetidos a glicerina. 0 terceiro aspecto da presente invenção pode ser combinado com um ou ambos os primeiro ou segundo aspecto da presente invenção para produzir pelo menos um ácido graxo e/ou óleo, através da manutenção de uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo tal como definido no primeiro ou segundo aspecto da presente invenção na presença de um inibidor da gliceração de ácidos graxos de modo que as células cultivadas produzam pelo menos um ácido graxo e, mais especificamente, um maior nível de ácidos graxos não submetidos a glicerina quando comparado com o mesmo sistema de cultura na ausência do inibidor. 0 método do terceiro aspecto da presente invenção pode ainda compreender a etapa de extração do pelo menos um ácido graxo. Conseqüentemente, o terceiro aspecto da presente invenção também fornece um extrato de ácido graxo obtido através do terceiro aspecto da presente invenção. O pelo menos um ácido graxo extraído pode, por exemplo, ser processado para produzir um biocombustível e, tal como o terceiro aspecto da presente invenção, também fornece um biocombustível obtido por esse processo. O terceiro aspecto da presente invenção também fornece uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo, compreendendo um inibidor da gliceração de ácidos graxos como definido acima. O terceiro aspecto da presente invenção também fornece a utilização da cultura celular em suspensão para produzir pelo menos um ácido graxo. Em uma modalidade desta utilização, pelo menos um ácido graxo e/ou óleo é secretado no meio de cultura celular em suspensão, por exemplo, de acordo com os métodos do primeiro aspecto da presente invenção. O terceiro aspecto da presente invenção também fornece um meio de cultura em suspensão de células vegetais compreendendo um inibidor da gliceração de ácido graxo. O meio de cultura em suspensão de células vegetais pode ser aquele como definido acima em relação ao primeiro aspecto da presente invenção.

Como debatido acima, os ácidos graxos e/ou óleos (tais como aqueles produzidos pelo primeiro, segundo ou terceiro aspecto da presente invenção) podem ser convertidos em biocombustívels, tais como FAME.

Os métodos adequados para alcançar essa conversão são bem conhecidos na técnica e qualquer um poce ser aplicado ao tratamento e processamento dos ácidos graxos e/ou óleos produzidos pelo primeiro,· segundo e/ou terceiro aspecto da presente invenção. Por exemplo, Paynich 2007, Microbiol &

Mol. Gen., 445, 57-61 revê vários métodos para a transesterificação de óleos vegetais para produzir biodiesel.

Conforme debatido em Paynich (supra), os métodos conhecidos da técnica para a transesterificação de óleos vegetais para produzir o biodiesel, tipicamente envolvem a reação de óleos vegetais com metanol na presença de um catalisador alcalino tal como hidróxido de sódio. Conforme debatido no Paynich, na página 58, 1- col. , linhas 9 a 12, estes métodos utilizam um grande volume em excesso de metanol em relação à quantidade de óleo vegetal usado, tipicamente em uma relação de 6:1 de metanol para óleo, que são ditos de serem necessários para conduzir a reação até o final. Com esta relação, Paynich relata, na página 58, col. 1, que um rendimento de 96,8% de biodiesel foi obtido a partir de açafrão. Da mesma forma, Bambase et al, 2007, J.

Chem. Technol. & Biotechnol, 82, 273-280 relata, no resumo, que metil ésteres de óleo de girassol bruto foram produzidos por metanólise utilizando um catalisador de hidróxido de sódio com relações de metano:óleo de 6:1 a 20:1. Navaraez et al, 2007, J. Am. Oil Chemists' Soc., 84, 971-977 relata sobre um método de metanólise de óleo de palma e utiliza uma relação molar de metanol de 6:1. Maio de 2004, J. Oil Palm Res., 16, 1-11 ensina uma relação molar de metanol para óleo de 10:1. A US 6.712.876 ensina as relações molares preferidas de metanol para triglicerídeos de ácido graxo de 15:1 a 30:1. Todos os métodos anteriores podem ser usados para produzir biocombustíveis a partir de ácidos graxos e/ou óleos produzidos pelo primeiro, segundo e/ou terceiro aspecto da presente invenção.

No entanto, o inventor presente reconheceu que os métodos da técnica anterior de produção de combustível contam com um grande excesso de metanol, que pode ser caro e também resultar em um alto nível de contaminação de metanol do assim produzido biocombustível (por exemplo, FAME) , tal como potencialmente um nivel de 50 a 60% (v/v) , ou superior, de metanol para biocombustível no produto de biocombustível resultante. 0 presente inventor surpreendentemente observou que é possível alcançar uma conversão eficiente de ácidos graxos e/ou óleos em biocombustíveis mediante o uso de quantidades muito mais baixas de metanol. Especificamente, o presente inventor tem mostrado que é possível obter um rendimento de 93,4% utilizando uma relação de metanol para óleo de cerca de 1:7,5. Em comparação com os métodos da técnica anterior debatidos acima, esta é uma diminuição significativa na quantidade de metanol utilizado, com apenas uma pequena redução na produtividade. Por exemplo, em comparação com o debate em Payních (supra) de um rendimento de 96,8% de biodiesel a partir do açafrão quando se utiliza uma relação de metanol:óleo de 6:1, o presente inventor conseguiu um processo que utiliza aproximadamente 45 vezes menos metanol, mas apenas apresenta uma queda de rendimento de cerca de 3,4%. Isso pode significativamente reduzir os custos com base em metanol do processo de conversão de biocombustivel. Além disso, os níveis de contaminação de metanol do biocombustivel assim produzido (por exemplo, FAME) podem ser substancialmente reduzidos tais como para menos do que 20%, 15%, 10%, 5% (v/v) ou menos.

Conseqüentemente, em um quarto aspecto da presente invenção, é fornecido um método para produzir biocombustíveis de pelo menos um ácido graxo e/ou mono-, di- e/ou tri-glicerideos compreendendo a reação de - • um primeiro volume do pelo menos um ácido graxo e/ou mono-, di- e/ou tri-glicerideos com * um segundo volume de um reagente selecionado de um álcool, alcano ou alqueno, * na presença de um catalisador de base, desse modo para formar o biocombustível, em que a relação do primeiro volume para c segundo volume é maior do que 1:6, tal como pelo menos 1:5, 1:4, 1:3, 1:2 ou 1:1. Por exemplo, o primeiro volume do pelo menos um ácido graxo e/ou mono-, di- e/ou tri-glicerideos pode ser maior do que o segundo volume do reagente, isto é, mais do que 1:1, tal como entre 1:1 a 10:1, por exemplo, pelo menos, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1 ou 7:1, opcionalmente menos do que 9:1 ou 8:1, mais preferivelmente em torno de 7,5:1. O biocombustível produzido pelo método do quarto aspecto da invenção pode ser um metil éster de ácidos graxos (FAME). O pelo menos um ácido graxo e/ou mono-, di- e/ou tri- glicerídeos pode compreender unidades de ácido graxo com um comprimento de cadeia de C8-C30. Em uma modalidade, a distribuição de comprimentos de cadeia de ácido graxo não é mais do que cerca de 5%, tal como não mais do que cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, cerca de 1%, cerca de 0,5% ou substancialmente 0% fora dos dois desvios padrão do comprimento da cadeia de ácido graxo predominante. O ácido graxo e/ou mono-, di- e/ou tri-glicerídeos podem ser pelo menos um ácido graxo ou óleo como produzido por uma cultura celular em suspensão de células vegetais de produção de óleo, tais como aquelas definidas por qualquer um dos primeiro, segundo ou terceiro aspectos da presente invenção. 0 reagente usado pelo método do quarto aspecto da invenção pode ser selecionados a partir de um álcool C1-C8, alcano C1-C8 ou alqueno C1-C8. Em uma modalidade, é metanol. O catalisador de base utilizado pelo método do quarto aspecto da invenção pode ser selecionados de um hidróxido de metal do Grupo I, tal como LiGH, NaOH, KOH. O NaOH pode ser preferível. Os níveis adequados de catalisador de base podem ser determinados por técnicas rotineiras, mas podem, por exemplo, estar na faixa de 0,1% p/v a 10% p/v, preferivelmente em uma porcentagem de massa para volume de C,5% a 2% p/v. 0 método do quarto aspecto da invenção pode compreender as seguintes etapas - (i) misturar o primeiro volume do pelo menos um ácido graxo e/ou mono-, di- e/ou triglicerideos e o segundo volume de um reagente selecionado de um álcool, alcano ou alqueno, na presença do catalisador de base durante um período de tempo selecionado de 1 a 72 horas {preferivelmente de 6 a 48 horas, tal como em torno de 6, 12, 24 ou 48 horas) em uma temperatura selecionada de 50 a 150°C (preferivelmente de 60 a 100°C, tal como cerca de 65°C) ; (ií) reduzir a temperatura da mistura de reação (por exemplo, em torno da temperatura ambiente, isto é, de 15 a 30°C, tal como em terno de 20°C) e continuar com a mistura na temperatura reduzida durante um período de tempo selecionado de 12 a 48 horas (preferivelmente de 16 a 24 horas, tal como em torno de 6, 12, 24 ou 48 horas); (iíi) permitir que a mistura de reação se estabeleça de modo que uma camada de glicerina se separa de uma camada de biocombustível (por exemplo, por permitir a mistura de reação descansar em torno da temperatura ambiente durante cerca de 1 hora, ou por centrifugação) ; e (iv) separar a glicerina e as camadas de biocombustível para obter um extrato de biocombustível; e (v) opcionalaente, tratar o extrato de biocombustível obtido da etapa (iv) para reduzir o comprimento de cadeia das unidades de ácido graxo, preferivelmente para aumentar o nível de octano, por exemplo, mediante o tratamento com peróxido de hidrogênio + cloreto de ferro (III) ou reagentes equivalentes, ou por craqueamento térmico ou ácido térmico utilizando as técnicas conhecidas no ofício. O método do quarto aspecto da invenção pode fornecer um rendimento de biocombustível que é maior do que 50%, tal como maior do que 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92% ou 93%, preferivelmente na faixa de 93 a 94%. O biocombustível produzido pelo método do quarto aspecto da invenção pode ter um teor de metanol menor do que 50% (v/v) , tal como menos do que 40%, 30%, 20% ou 10% (v/v). O biocombustível produzido pelo método do quarto aspecto da invenção pode ter uma distribuição de comprimentos de cadeia de ácido graxo em que não mais do que cerca de 5%, tal como não mais do que cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, cerca de 1%, cerca de 0,5% ou substancialmente 0% está fora dos dois desvios padrão do comprimento de cadeia de ácido graxo predominante. O quarto aspecto da presente invenção também fornece um biocombustível obtido pelo método do quarto aspecto.

Conseqüentemente, o biocombustível assim obtido pode, por exemplo, possuir - (a) um teor de metanol menor do que 50% {v/v) , tal como menos do que 40%, 30%, 20% ou 10% (v/v) e/ou; (b) uma distribuição de comprimentos de cadeia de ácido graxo em que não mais do que cerca de 5%, tal como não mais do que cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%, cerca de 1%, cerca de 0,5% ou substancialmente 0% está fora dos dois desvios padrão do comprimento de cadeia de ácido graxo predominante.

Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 é um diagrama esquemático do estágio 1 de um processo de extração como descrito no Exemplo 1, e mostra o tratamento térmico das células. A Figura 2 é um diagrama esquemático do estágio 2 de um processo de extração como descrito no Exemplo 1, e mostra a extração com solventes das células. A Figura 3 é um diagrama esquemático do estágio 3 de um processo de extração como descrito no Exemplo 1, e mostra a extração com solventes das células. A Figura 4 é um diagrama esquemático do estágio 4 de urti processo de extração como descrito no Exemplo 1, e mostra a extração com solventes das células. A Figura 5 mostra a Tabela 1, conforme debatido no Exemplo 2 abaixo. A Figura 6 mostra a conexão entre o pH da cultura e o nível de ácidos graxos e óleos secretados e coletados de um sistema bifásico, conforme descrito no Exemplo 3. A Figura 7 mostra um mecanismo exemplar para o uso em um sistema de cultura de duas células como descrito no Exemplo 6, em que o termo "cloroplasto" é usado para se referir a um tanque de cultura em suspensão de células vegetais fotossintética e o termo "vacúolo" é usado para se referir a um tanque de cultura em suspensão de células vegetais de produção de óleo. A Figura 8 mostra a análise de cromatografia gasosa da distribuição de óleos e ácidos graxos não submetidos a glicerina em um extrato retirado da cultura em suspensão como descrito na seção 6.2 do Exemplo 1. A invenção será ainda compreendida com referência aos seguintes exemplos experimentais não limitativos. EXEMPLO 1 As Figuras de 1 a 4 mostram um diagrama esquemátíco de um processo de extração. 1.1 A Figura 1 mostra o tratamento térmico de células secadas por congelamento, que representa o Estágio 1, em que as células da cultura celular em suspensão de T. vulgare PAW-NS-l foram aquecidas durante 8 horas em um forno fixado em 100°C. 1.2 A Figura 2 mostra o estágio 2 de um processo de extração para a extração de solvente das células tratados termicamente. No Estágio 2: a) As células tratadas termicamente são submetidas a refluxo durante uma hora em uma mistura de 1:1 de clorofórmio e metanol. b) A mistura de célula: solvente é filtrada. c) O solvente é removido por evaporação rotativa. 0 residuo contendo extrato ativo bruto é re-dissolvido em clorofórmio e prossegue para o Estágio 3. d) 0 solvente usado é destilado e passado por um ciclo de volta à câmara de refluxo para a reutilização. e) As células utilizadas são eliminadas. 1.3 A Figura 3 mostra o estágio 3 de um processo de extração para a extração de solvente das células tratadas termicamente. No Estágio 3: a) O residuo ativo bruto em clorofórmio é misturado com igual volume de água destilada e misturado. b) As fases são deixadas separar, e um macho de tarraxa medido é usado para remover o clorofórmio até uma câmara.

c) O solvente é removido pela evaporação rotativa. O residuo contendo extrato ativo bruto é re-dissolvido em metanol e prossegue para o Estágio 4. d) 0 solvente usado é destilado e passado por um ciclo de volta para a câmara de mistura para a reutilização. e) A água é eliminada. 1.4 A Figura 4 mostra o estágio 4 de um processo de extração para a extração de solvente das células tratadas termicamente. No Estágio 4: a) O resíduo ativo bruto em metanol é misturado com um volume igual de hexano e misturado, b) As fases são deixadas separar, e um macho de tarraxa medido é usado para remover o metanol até uma câmara.

c) O solvente é removido por evaporação rotativa. O residuo contendo extrato ativo puro é obtido. d) O solvente usado é destilado e passado por um ciclo de volta para a câmara de mistura para a reutilização. e) O hexano usado é destilado e reutilizado. 5.0 Indução e Manutenção da cultura celular em suspensão de Triticum 5.1 Inicio das culturas de calo de Triticum - preparação dos meios. 5.2 Inicio das cultura de calo de Triticum - esterilização do tecido de vegetal. 5.3 Preparação dos meios. 5.4 Inoculação e subcultura. 5.1 Início das culturas de calo de Triticum: preparação do meio de indução de calos Solução de meio de indução de calos; H2O destilada em 100%; 3,0% de sacarose; e 1,0% de NLAA (ácido naftaleno acético); solução de matéria-prima 0,004%; 0,44% de meio em pó de Murashige e Skoog Basal.

Equipamento: Garrafa de vidro com tampa, agitador magnético, placas de cultura de vegetal plásticas estéreis; pipetas de vidro; medidor de pH, autoclave; gabinete de fluxo laminar, balança, Nescofilm; Phytagel; solução de NaOH 1M, solução de NaOH 0,1M, a) Meio de indução de calos foi preparado usando o meio Murashige e Skoog (MS) obtido da Sigma, com 3% de. sacarose e 1% de ácido naftaleno acético (a partir de uma solução de matéria-prima concentrada de 0,004% p/v. b) O pH do meio preparado foi ajustado para pH 5,75 e solidificado com Phytagel 0,2%. c) O meio foi submetido a autoclave durante 20 min em 121°C e depois despejado em placas de cultura de tecido de vegetal plásticas estéreis. 5.2 Início das culturas de calo de Triticumz esterilização do tecido de vegetal Reagentes: Meio preparado anteriormente (seção 5.1); tecido de vegetal de Triticum vulgare.

Equipamento: Provetas de vidro estéreis; água destilada estéril; bisturi estéril; pinças estéreis; solução de branqueamento a 10%, solução de etanol a 70%; solução de NaOH 1M, solução de NaOH 0,1M. a) Tecido de vegetal de Triticum foi esterilizado por imersão em etanol a 70% durante 2 minutos, seguido pela imersão em solução de branqueamento a 10% durante 10 minutos. b) Trlticum foi depois lavado três vezes com água destilada estéril (submetido a autoclave). c) O Trlticum estéril foi assepticamente cortado em formatos de disco em um gabinete de fluxo laminar estéril. d) As fatias de Trlticum foram colocadas sobre as placas preparadas contendo meio de indução de calo, e as placas foram seladas com Nescofilm. e) As placas foram colocadas no escuro a 27 °C e a formação de calo começou a aparecer após cerca de 1 mês. 5.3 Preparação do meio para as culturas estabelecidas Reagentes: H2O destilado a 100%; 3% de sacarose, 0,44% de meio em pó de Murashige e Skoog Basal? 1% de NAA (ácido naftaleno acético); solução de matéria prima a 0,004%; solução de vitamina a 0,01% (0,05% de piridoxalidrocloreto, 0,10% de dicloreto de tiamina e 0,05% g de ácido nicotinico); solução de NaOH 1M; solução de NaOH 0,1M.

Equipamentos: garrafa de vidro de 1 L; agitador magnético, 20 frascos cônicos de 250ml; 20 folhas de papel alumínio de aproximadamente 20 x 20 cm; pipetas de vidro; medidor de pH, autoclave, gabinete de fluxo laminar; balança. Método: a) Misturar de 3% de sacarose, 0,44% de MS em pó, 1% de matéria-prima de ΝΆΑ e 0,01% de matéria-prima de vitamina e preparar em 100% com H2O destilado. b) Misturar usando um agitador magnético até que todos os componentes secos estejam dissolvidos, depois ajustar o pH com 1M e 0,1M NaOH, para 5,75. c) Tomar os 20 frascos cônicos de 250ml. Para adicionar 50ml de cada meio e selar o gargalo do frasco com uma folha. Esterilizar em autoclave, a 121°C, 103 kPa, durante 25 minutos. d) Imediatamente após a esterilização, colocar os frascos no gabinete de fluxo laminar e deixar esfriar para a temperatura ambiente. 5.4 Inoculagão e subcultura das culturas estabelecidas Reagentes: calos friáveis, etanol a 70%.

Equipamento: gabinete de fluxo laminar, queimador Bunsen; meio preparado; 20 folhas de papel aluminio estéreis de aproximadamente 20 x 20 cm; Vários pares de pinças ou fórceps pequenos; espátulas largas com orifícios. Método: a) Esterilizar dentro do gabinete de fluxo laminar com etanol a 70%. b) esterilizar todas as pinças e espátulas mediante a imersão em etanol a 70%, seguida de fogo até a brasa. Deixe esfriar dentro do gabinete de fluxo'laminar.

Inoculação inicial: a) Remover a folha do frasco de meio preparado. b) Tomar as pinças esterilizadas e remover as peças de tamanho muito curto dos calos friáveis do tecido de vegetal. Fragmentar-se em células finamente dispersas e adicionar ao frasco. Objetivo de adicionar aproximadamente 5 g de tecido em 5Qml de meio (10% p/v). c) Abrasar o gargalo do frasco, e cobrir com uma folha de papel alumínio estéril. d) Colocar o frasco em um agitador a 120 rpm, em um ambiente escuro aquecido para 27°C. Deixar até que uma cultura celular em suspensão dispersa espessa possa ser observada (aproximadamente 2 semanas).

Subcultura: a) Remover o papel alumínio do frasco de meio preparado. b) Remover o papel alumínio do frasco contendo as culturas celulares em suspensão dispersas (produzidas pela inoculação inicial, ponto 6). c) Tomar uma espátula larga com orifícios, esterilizar, deixar esfriar e tirar as células. Adicionar estas células ao meio novo. Objetivo de adicionar aproximadamente 5 g de tecido em 50ml de meio. d) Abrasar o gargalo do frasco, e cobrir com uma folha de papel alumínio estéril. e) Colocar o frasco em um agitador a 120 rpm, em um ambiente escuro aquecido a 27°C. Após 14 dias, usar a cultura celular em suspensão para outras subculturas. 6.0 Cultura celular em suspensão 6.1 Preparação do meio para culturas celulares em suspensão Reagentes: H20 destilado a 100%; 3% de sacarose; 0,44% de meio em pó de Murashige e Skoog; 1% de NAA (ácido naftaleno acético); solução de matéria prima a 0,004%; solução de vitamina a 0,01% (0,05% piridoxalidrocloreto, 0,10% dicloreto de tiamina e 0,05% ácido nicotínico), solução de NaOH 1M, solução de NaOH 0,1M. Método: a) Misturar 3% de sacarose, 0,44% de MS em. pó, 1% de matéria-prima de NAA e 0,01% de matéria prima de vitamina e preparar em 100% com H20 destilado. b) Misturar até que todos os componentes secos se dissolvam, depois ajustar o pH com 1M e 0,1M NaOH, para 5,75. c) Esterilizar o meio e deixar esfriar para a temperatura ambiente antes do uso. 6.2 Subcultura de culturas celulares em suspensão Reagentes: células friáveis; meio preparado anteriormente (seção 5.1) Método: a) Tomar a cultura celular em suspensão na fase exponencial de crescimento. b) Filtrar as células do meio, e utilizar estas células para inoculer o meio novo. Objetivo de adicionar células ao meio em aproximadamente 10% p/v. c) Agitar o recipiente de cultura em 120 rpm, a 27°C, e em condições de escuro. d) Para outras subculturas, as células devem ser usadas quando a cultura tiver alcançado a fase de crescimento logarítmico. e) Para a colheita do composto ativo, as células devem ser usadas quando a cultura tiver alcançado a fase estacionária. EXEMPLO 2 Este exemplo fornece um relatório sobre a produção de biocombustível a partir de óleo vegetal. 0 método empregado foi como se segue - Produção de Biocombustível Estágio 1: 0 óleo vegetal foi misturado com uma solução 1,04M de hidróxido de sódio (NaOH) em metanol (MeOH) , na relação de 187ml de óleo a 25ml de solução de NaOH/MeOH. Isso foi misturado em 65°C durante 6 horas, e deixado misturar durante a noite (16 horas) em temperatura ambiente, 20°C. Após este tempo, a mistura foi deixada estabelecer durante 1 hora na temperatura ambiente, após cujo tempo 2 camadas se formaram. A camada inferior (glicerina) foi removida usando um funil de separação e a camada superior foi retida para outra análise e tratamento.

Estágio 2: A reação Fenton foi induzida na camada superior. Este estágio foi executado no exaustor, usando um protetor de face. 0 peróxido de hidrogênio (33%) e o cloreto de ferro (III) foram adicionados em uma relação de peso de 50:1 (em Moles, a relação foi de 10:1). Primeiro o cloreto de ferro (III) foi adicionado, e em seguida o peróxido de hidrogênio, que foi adicionado por gotejamento devido à reação ser exotérmica, e produzir um gás. O Estágio 2 foi executado em duplicata: um frasco foi agitada na temperatura ambiente durante 72 horas, o outro foi agitado no vaporizador rotativo (na pressão armosférica) em 65°C durante 72 horas. Em intervalos de 24 horas, os frascos seriam interrompidos durante uma hora para permitir o estabelecimento, depois lml da camada superior foi retirado e colocado em um frasco para a análise de GC.

Análise de GC

As amostras foram analisadas em um Agilent 6890N

Netwoxk GC ' System, com um 5973 NetWork Mass selective Detector. A Coluna era um 190915-433/HP-5MS, 0f25mm x 30m x 0,25pm, capilar, com hélio como a fase móvel. O método foi adaptado a partir de um método Agilent para a separação de triglicerideos: Temp. de partida: 50°C

Temp. final: 350°C: Inclinação: 153C per min Tempo de partida: 1 min Tempo no Final: 0 min O volume de injeção foi Ιμΐ.

Salvo em GC como óleo 4 Análise do Ponto de Vaporização Instantânea Executada usando um dispositivo de copo fechado Seta- Point série 3.

Análise da Viscosidade Executada com um Viscosimetro Brookfield DV-E em temperatura ambiente (20°C) , a 100 rpm.

Resultados Os resultados desta experiência são mostrados na Tabela 1 da Fig. 5A e 5B e Tabelas 2 e 3 apresentadas abaixo.

Tabela 2. Medições da viscosidade das amostras.

Tabela 3. Pontos de vaporização instantânea das amostras.

Chave para as Tabelas 1, 2 e 3: Mostra 1: óleo vegetal não tratado Mostra 2: camada superior, estágio 1 Amostra 3: Estágio 1, 65°C, após 24 horas Amostra 4: Estágio 1, temperatura ambiente, após 24 horas Amostra 5: Estágio 1, 65°C, após 48 horas Amostra 6: Estágio 1, temperatura arr.biente, após 4 8 horas Amostra 7: Estágio 1, 100°C após 48 horas Debate e Conclusão Estágio 1: Nosso método produziu, a partir de 561ml de óleo vegetal, 524ml de metil ésteres após o tratamento do Estágio 1, Este é um rendimento de 93,4%. A viscosidade foi reduzida por um fator de aproximadamente 6, seguinte ao tratamento do estágio 1. O ponto de vaporização instantânea do produto do Estágio 1 foi 12°C mais elevado do que aquele do óleo vegetal não tratado. Houve algumas indicações da literatura que o biodiesel possui um ponto de vaporização instantânea mais elevado que outros hidrocarbonetos, Pode ser observado a partir da GC que após o estágio 1, a camada superior parece ser totalmente preparada de metil ésteres (com a exceção de alguns compostos de traço). 96,5% dos ésteres são os isômeros de ácido oléico C18, e quase todos estes são a forma (z) : ácido 9-octadecenóico (z) - metil éster. Em torno de 6% é o isômero 11, A amostra de camada TOP 2 foi usada para o próximo estágio.

Estágio 2: Fica evidente que o ponto de vaporização instantânea da amostra foi reduzido em 25°C após a reação de Fenton seguido pelo aquecimento a 100°C. Onde a amostra foi misturada em temperatura ambiente, só reduz o ponto de vaporização instantânea em 15°C. A partir da análise de GCMS, pode ser observado que após 24 horas a 65°C, ainda o maior composto por grande diferença (78,17%) é o ácido 9-octadecenóico (z) - metil éster, mas, além disso, houve agora 13% do isômero 8, que não esteve presente no Estágio 1. Após 24 horas em temperatura ambiente, o maior composto (84,59%) ainda era o ácido 9-octadecenóico (z) - metil éster. Um novo composto, 9, 12, 15-octadecatrien-l-ol, foi o segundo maior (12,44%).

Após 48 horas a maior quantidade ainda é o ácido 9- octadecenóico (z) - metil éster (77,07%). Quando após 24 horas, o segundo pico maior é o isômero 8.

Quantidades requeridas As quantidades de cada componente utilizado para produzir um litro da mistura C18 C8 1050ml de óleo vegetal 144ml de uma solução de NaOH/MeOH 1,04SM 46ml de peróxido de hidrogênio a 33% 2g de Fe111 EXEMPLO 3 Este exemplo descreve o otimização do pH da cultura celular em suspensão de células de produção de óleo. Método A cultura original como descrita na seção 6.2 do Exemplo 1 foi completamente agitada durante dez minutos para obter uma mesma suspensão de células, em seguida as alíquotas foram tomadas.

As alíquotas da cultura celular de produção de óleo principal foram tamponadas em vários valores de pH conforme indicado na tabela 4, abaixo, e a quantidade de óleo produzido por uma alíquota de lOOrtil, com base no óleo que foi coletado na superfície do meio de cultura celular que pode ser retirado com uma pipeta, foi medido em um cilindro de medição durante um período de 14 dias. 0 tamponamento do pH foi alcançado com ácido cítrico e hidrogênio ortofosfato dissódico de acordo com o método da European Pharmacopoeia.

Resultados: Os resultados desta experiência sâo apresentados na Tabela 4 e Figura 6.

Tabela 4; ρΗ , 00 ,50 , 00 , 50 , 00 ,50 , 00 , 50 Volume de óleo produzido (ml) , 20 , 30 , 50 , 70 , 83 , 15 , 97 * *(morte celular decorrido em pH 3,5) Debate e Conclusão Os dados mostram que mais óleo é liberado no pH ideal de 4,5 e que abaixo deste pH o ideal não é obtido devido à toxicidade ácida no meio e morte celular associada. Acima do nível de pH 4,5 a separação ideal não foi alcançada devido à formação da emulsão não ser tão eficiente. EXEMPLO 4 Este exemplo descreve o efeito da adição de lipase na produção de ácidos graxos na cultura de tecidos.

Analisado pela cromatografia gasosa da distribuição de óleos e ácidos graxos não submetidos a glicerina em um extrato retirado de uma suspensão celular "normal", isto é, a cultura em suspensão como descrito na seção 6.2 do Exemplo 1, é mostrada na Figura 8. A lipase de gérraen de trigo foi adquirida da Sígma- Aldrich. lg da lipase foi adicionado a lOOml da cultura em suspensão como descrito na seção 6,2 do Exemplo 1. 0 óleo resultante, como coletado da carnada superior da cultura utilizando uma pipeta e analisado pela cromatografia gasosa, apresentou um colapso com 8% do óleo sendo ácidos graxos não submetidos a glicerina quando comparado com produto em suspensão de célula normal. EXEMPLO 5 Este exemplo descreve o uso de um sistema de cultura de duas células de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. 0 meio basal de Murashige e Skoog foi preparado e o ácido alfa naftalênico adicionado em uma concentração de Ο,ΟΙΜ. O meio foi inoculado com células contendo cloroplastos de Agrostis tenuis e incubado como uma cultura celular em suspensão durante 28 dias na presença de luz e a 22°C.

Após o periodo de incubação de vinte e oito dias o meio foi retirado e o aumento na concentração de açúcar foi medido utilizando refratometria. A concentração de açúcar no meio foi observada estar acima de 50g/l. Este meio foi então incubado com células de produção de óleo de colza e incubado durante mais vinte e oito dias após o qual o periodo de uma camada de óleo se formou acima da camada do meio.

Para dimensionar este processo até os níveis industriais, por exemplo, desenvolver a cultura celular em suspensão de células contendo cloroplasto (isto é, fotossintéticas) no meio de cultura usando uma corrente de ar de cerca de 3660 litros por minuto para um tanque de 20.000 litros em uma densidade de CO2 de cerca de 10% com uma eficiência de absorção de cerca de 4 0%. Em uma menor escala, por exemplo, utilizando 3 litros de cultura, pode- se passar 0,55 litro por minuto de uma mistura de CÜ2/ar de 10% através disto para ter o mesmo rendimento relativo.

Quanto melhor a taxa de absorção de CO2 na cultura fotossintética, tanto mais eficiente o processo. A eficiência de absorção de CO2 diretamente será correlativa com dois fatores - 1. O tamanho da bolha: quanto menor a bolha tanto mais eficiente ela será, de modo ideal as bolhas terão um diâmetro médio moderado no ponto de introdução no meio de cultura de cerca menor do que lmm, tal como menos do que 0,5mm, 0,4mm, 0, 3mm, 0,2mm, Q,lmm, 90μκι, 80pm, 70pm, 60μηα, SOpm, 40pm, 30pm, 20ym, ou 10pm. 2. A duração de tempo para a bolha ficar na cultura: quanto mais alta a coluna da cultura tanto mais tempo a bolha leva para transitar até o meio e, em conseqüência, çasta mais tempo no meio. Tipicamente, a altura da coluna é até cerca de 0,5 metro, 1 metro, 2 metros, 3 metros, 4 metros ou 5 metros de altura (neste contexto, o termo cerca de é usado para se referir a ± 05, 0,4, 0,3, 0,2 ou 0,1 metro). A taxa de absorção de CO2 pode ser avaliada mediante a comparação do teor de C02 (densidade) do gás introduzido na cultura com o teor de C02 (densidade) da corrente de exaustão· Visto que a introdução de gases em uma cultura celular em suspensão pode causar esfriamento adiabático de expansão, pode ser adequado ajustar a temperatura da alimentação de gás (por exemplo, mediante a passagem do tubo de alimentação através de um banho de água aquecida) , ou levar em conta a expansão gasosa, antes da sua introdução na cultura, para minimizar ou reduzir o impacto sobre a temperatura da cultura. EXEMPLO 6 O exemplo a seguir descreve o mecanismo para uso em um sistema de cultura de duas células de acordo com o segundo aspecto da presente invenção. O modelo se baseia em dois tanques de culturas em suspensão de células vegetais fotossintéticas por tanque de cultura em suspensão de células vegetais de produção de óleo. Com um grande número suficiente de múltiplos tanques de cada tipo de cultura (por exemplo, em uma instalação de produção em escala total) isso pode ser compensado com o equivalente de cerca de 1,6 tanques de culturas em suspensão de células vegetais fotossintéticas por tanque de cultura celular em suspensão de produção de óleo vegetal.

Os tamanhos de cada tanque contêm em torno de 20.000 litros de meio. O tanque de cultura em suspensão de células vegetais de produção de óleo produz ácidos graxos e óleos em uma taxa de 10% (volume) a cada 10 dias, isto é, 1% por dia, ou 200 litros por dia.

Cada litro de óleo requer cerca de l,6kg de sacarose (1.600 gramas) ou equivalente de açúcar. A cultura em suspensão de células vegetais fotossintéticas pode ser cultivada para produzir, e mantida em, uma concentração de meio de cultura de 50 gramas de sacarose por litro de cultura. O açúcar é tipicamente em torno de 58% em massa de massa, desse modo 29ml de água precisa ser reposta diariamente por litro de meio de cultura em suspensão de células vegetais fotossintéticas. A instalação de um mecanismo exemplar para uso neste método é mostrada na Figura 7, em que o termo wcloroplasto" é usado para se referir a um tanque de cultura em suspensão de células vegetais fotossintéticas e o termo "vacúolo" é usado para se referir a um tanque de cultura em suspensão de células vegetais de produção de óleo.

Em uma base diária a instalação na Fig. 7 pode ser operada como se segue: 1. Bombear 6400 litros de meio filtrado do tanque Vacuole para a instalação de mistura 2. Adicionar 600 litros de água purificada acrescido dos constituintes para 600 litros de meio (60000 * 1/100) nos recipientes de mistura e misturar ¢60.000 litros de meio sendo o volume total do meio) 3. Bombear 3500 litros desta mistura em cada recipiente de cloroplasto. Isso substitui a quantidade de água utilizada pelo cloroplasto em um prazo de 24 horas. O meio de cloroplasto deve agora estar na concentração adequada para substituir o meio retirado do tanque de vacúolo. 4. Bombear de 3200 litros de cada tanque de cloroplasto para o tanque de vacúolo.

Isso será operado em um ciclo de 24 horas. No entanto, se um sistema de pulso foi utilizado a cada hora, o que deve melhorar a estabilidade das culturas, então cada pulso seria l/24th do acima, isto é, o processo diário acima das etapas de 1 a 4 pode ser operado de forma mais regular, tal como a cada hera, e os volumes reduzido proporcionalmente em conformidade.

Outra descrição: A presente invenção também fornece um método para produzir óleos vegetais a partir das linhagens celulares da cultura de tecido derivadas das plantas. Os óleos vegetais produzidos podem ser utilizados para fabricar biocombustíveis. As enzimas podem ser utilizadas neste método para inibir a gliceração dos ácidos graxos. As células produzidas durante o estágio de cultura de tecido desre método podem ser fermentadas para produzir etanol, e opcionalmente o etanol pode ser utilizado como fonte de combustível. Os óleos vegetais produzidos pelo método podem ser de uma forma que é idêntica àquela produzida pelo vegetal de origem através dos métodos convencionais.

Claims

1. Método para a produção de um produto caracterizado pelo fato de compreender (I) a manutenção de uma primeira cultura celular de células vegetais em suspensão em condições que permitem às células cultivadas fotossintetizar e, assim, gerar e secretar açúcares, geralmente mono e/ou dissacarídeos (por exemplo, glicose, sacarose e/ou frutose) no meio de cultura circundante; e (II) a manutenção de uma segunda cultura de células na presença do açúcar gerado pela primeira cultura de células em suspensão para permitir o crescimento da segunda cultura e a produção de um produto.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as células fotossintét icas do vegetal presentes na primeira cultura de células em suspensão são células vegetais fotossintéticas diferenciadas, tal como uma célula que é especializada para a fotossintese, como uma célula de folha ou tecido verde de um vegetal, compreendendo células em paliçada de mesoderraa, folha e peciolo, mais preferencialmente células em paliçada.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que as células fotossintéticas do vegetal presentes na primeira cultura de células em suspensão são isoladas de um vegetal tolerante a cobre, como de Agrostis tenuis.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a primeira cultura celular de células vegetais fotossintéticas em suspensão tem um nível de cobre médio na cultura de células de até 0,1 M.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que as condições que permitem que as células da primeira cultura de células em suspensão a fotossintetizar compreende o fornecimento de dióxido de carbono e luz,

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que as células da primeira cultura de células em suspensão e as células da segunda cultura celular estão: (I) em comunicação fluida com entre si, opcionalmente de tal forma que a primeira cultura de células em suspensão e as células da segunda cultura em suspensão são cultivadas em recipientes separados que são ligados em comunicação fluida ou são misturados e cultivados no mesmo meio, de preferência tal que a comunicação fluida permite o açúcar secretado pelas células da primeira cultura de células em suspensão a ser utilizada como fonte de carbono pelas células da segunda cultura celular, ou (II) são cultivadas em vasos de cultura separados que não estão em comunicação fluida entre si, caso em que o método opcionalmente compreende a etapa de extração de açúcar do meio de cultura da primeira cultura de células em suspensão e a etapa adicional de alimentar a segunda cultura de células com o açúcar extraído, de preferência em que a etapa de extração de açúcar do meio de cultura da primeira cultura de células em suspensão compreende separar o meio contendo açúcar da primeira cultura celular das células presentes neste, por exemplo, por filtração, ou continuamente removendo açúcar do primeiro meio de cultura de células, por exemplo, por díálise do meio de cultura.

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a segunda cultura celular é mantida na presença de açúcares gerados pela primeira cultura de células em suspensão com uma concentração de açúcar na faixa de 20g/L a 400 g/L, de preferência no concentração de cerca de 50g/L.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que as células da segunda cultura de células são procarióticas ou eucarióticas, tais como células de bactérias, fungos, vegetais, animais ou humanas, ou microorganismos, como leveduras (por exemplo, da espécie Saccharomyces).

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o produto é (a) as células da segunda cultura celular, ou (b) um produto que é sintetizado pelas células da segunda cultura celular, como um produto selecionado do grupo consistindo em pelo menos um ácido graxo e/ou óleo, um produto protéico (inclusive produtos de proteína recombinante codificada) e um metabólito, como o etanol.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de extração do produto da segunda cultura de células, e, opcionalmente, ainda purificar ou processar do produto então extraído.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de ser para a produção de pelo menos um ácido graxo e/cu óleo a partir de uma cultura de células vegetais, compreendendo a manutenção de uma segunda cultura de células vegetais produtoras de óleo em suspensão na presença do açúcar gerado pela primeira cultura de células em suspensão e em condições tais que a cultura de células vegetais produtoras de óleo produz pelo menos um ácido graxo e/ou óleo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de ainda compreender a etapa de extrair o pelo menos ura ácido graxo e/ou óleo a partir da segunda cultura de células vegetais produtoras de óleo em suspensão e, opcionalmente, ainda processá-lo para convertê-lo em um biocombustivel, ou opcionalmente ainda purificá-lo e/ou usá-lo em um processo a jusante, como incorporação em um produto alimentício, cosmético, ou lubrificante.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizado pelo fato de que as etapas de manutenção de uma segunda cultura de células vegetais produtoras de óleo em suspensão na presença do açúcar gerado pela primeira cultura de células em suspensão, em condições tais que a culcura de células vegetais produtoras de óleo produz pelo menos um ácido graxo e/ou óleo e, opcionalmente, extrair o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo a partir da segunda cultura de células vegetais produtoras de óleo em suspensão, são realizadas de acordo com um método que compreende: (I) manter a segunda cultura de células vegetais produtoras de óleo em suspensão em condições tais que as células cultivadas sintetizam e secretam pelo menos um ácido graxo e/ou óleo no meio de cultura celular em suspensão; e, opcionalmente, (II) extrair o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo secretado a partir do meio de cultura celular em suspensão.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um ácido graxo e/ou óleo extraído é então processado para convertê-lo em um biocombustível ou, opcionalmente, é adicionalmente purificado e/ou utilizado em um processo a jusante, como por incorporação um produto alimentício, cosmético, ou lubrificante.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que a primeira cultura celular de células vegetais fotossintéticas em suspensão é alimentada com dióxido de carbono a partir de uma fonte de dióxido de carbono selecionada a partir de dióxido de carbono líquido ou dióxido de carbono gasoso e, opcionalmente, em que a fonte de dióxido de carbono liquido ou gasoso é obtida de um subproduto de um processo de produção de dióxido de carbono, tal como um processo de geração de energia que utiliza combustíveis de carbono, ou um processo de produção de biocombustíveis (como etanol ou outro álcool) por microorganismos (como levedurass) que secreta dióxido de carbono, caso em que, de preferência, a primeira cultura celular em suspensão e, opcionalmente, também a segunda cultura de células é ou são mantidas no local do processo de produção de dióxido de carbono, como no local de uma instalação de geração de energia, ou em no local de uma instalação de geração de biocombustiveis (como etanol ou outro álcool), que geram dióxido de carbono como um subproduto.

16. Uso de um sistema para produzir um produto caracterizado pelo fato de que o sistema é um sistema de cultura dupla cultura compreendendo uma primeira cultura de células e uma segunda cultura de células, em que a primeira cultura de células é uma cultura celular de células vegetais fotossintéticas em suspensão que é mantida sob condições que permitem às células cultivadas fotossintetizar e, assim, gerar e secretar açúcares, geralmente mono e/ou dissacarídeos {por exemplo, glicose, sacarose e/ou frutose) no meio de cultura circundante, e a segunda cultura celular é mantida na presença do açúcar gerado pela primeira cultura celular em suspensão para permitir o crescimento da segunda cultura e a produção de um produto.

17. Uso de sistema para capturar dióxido de carbono caracterizado pelo fato de que o sistema compreende pelo menos uma primeira cultura de células vegetais fotossintéticas em suspensão que é mantida em condições que permitem às células cultivadas fotossitetizar e, assim, gerar e secretar açúcares, geralmente mono e/ou dissacarideos (por exemplo, glicose, sacarose e/ou frutose) no meio de cultura circundante e, opcionalmente, também uma segunda cultura de células que é mantida na presença do açúcar gerado pela primeira cultura de células em suspensão para permitir o crescimento da segunda cultura e a produção de um produto, opcionalmente onde o sistema compreende ainda uma fonte de geração dióxido de carbono, e no qual o dióxido de carbono então gerado é alimentado na primeira cultura celular vegetal em suspensão.

18. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 ou 17, caracterizado pelo fato de ser para capturar dióxido de carbono, em que o dióxido de carbono que é capturado é o subproduto de um processo que produz dióxido de carbono, tal como um processo de geração de energia que utiliza combustíveis de carbono, ou um processo de produção de bíocombustível (como o bioetanol ou álcool outras) por microorganismos (como levedura) que secreta dióxido de carbono.

19. Sistema de dupla cultura para a produção de um produto compreendendo uma primeira cultura de células e uma segunda cultura de células caracterizado pelo fato de que a primeira cultura de células é uma cultura celular de células vegetais fotossintéticas em suspensão, que é mantida em condições que permitem às células cultivadas fotossintetizar e, assim, gerar e secretar açúcares, geralmente mono e/ou dissacarideos (por exemplo, glicose, sacarose e/ou frutose) no meio de cultura circundante, e a segunda cultura celular é mantida na presença de um açúcar gerado pela primeira cultura de células em suspensão para permitir o crescimento da segunda cultura e a produção de um produto.

20. Artigo gerador de energia produtor de dióxido de carbono ou gerador de biocombustível {como o bioetanol ou outro álcool) produtor de dióxido de carbono caracterizado pelo fato de compreender um sistema duplo de cultura conforme definido na reivindicação 16, ou o sistema tal como definido na reivindicação 18 ou 19.

21. Extrato caracterizado pelo fato de ser obtido pelo método tal como definido nas reivindicações 10, 12 ou 13.

22. Extrato, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos um ácido graxo e/ou óleo obtido pelo método como definido na reivindicação de 12 ou 13.

23. Produto, tal como cosmético, alimentício ou lubrificante caracterizado pelo fato de ser obtido pelo tratamento a jusante e/ou incorporação do extrato definido na reivindicação 21.

24. Biocombustível caracterizado pelo fato de ser obtido pelo processamento do extrato de pelo menos um ácido graxo e/ou óleo definido na reivindicação 22.

25. Uso de um extrato conforme definido na reivindicação 21 ou 22, um produto acordo com a reivindicação 23, ou um biocombustível conforme definido na reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser como uma fonte suplementar de combustível para um processo de produção de dióxido de carbono.