BRPI0921010B1

BRPI0921010B1 - método para produzir uma levedura tendo uma quantidade de alanina de 2,0 a 12,0% em peso em uma base de peso seco de um extrato de levedura

Info

Publication number: BRPI0921010B1
Application number: BRPI0921010A
Authority: BR
Inventors: Shibuya Ichiro; Odani Tetsuji
Original assignee: Asahi Breweries Ltd; Asahi Group Holdings Ltd
Priority date: 2008-11-18
Filing date: 2009-11-17
Publication date: 2020-01-21
Also published as: JPWO2010058558A1; JP5693231B2; AU2009318675B2; US20110223288A1; WO2010058558A1; CN102216443A; BRPI0921010A2; AU2009318675A1; EP2351829A4; EP2351829A1

Abstract

método para produzir uma tendo uma quantidade de alanina de 2,0 a 12,0% em peso em uma base de peso seco de um extrato de levedura é divulgado um método para produzir uma levedura rica em alanina que contém alanina em uma concentração alta. especificamente é divulgado um método para produzir uma levedura rica em alanina, que é caracterizado por submeter uma levedura na fase de desenvolvimento estacionária para a cultura líquida sob condições onde um meio de cultura líquido tem um valor de ph de não menos do que 7,5 e menor do que 11. também é especificamente divulgado um método para produzir uma levedura rica em alanina, que é caracterizada por ajustar o valor de ph de um meio de cultura líquido para uma levedura na fase de desenvolvimento estacionária a um valor não menor do que 7,5 e menor do que 11 e subsequentemente cultivar a levedura no meio de cultura líquido. nos métodos, a levedura pode ser saccharomyces cerevisiae ou candida utilis. ainda são especificamente divulgados: uma levedura rica em alanina produzida pelos métodos mencionados acima; um extrato de levedura rica em alanina que é extraído da levedura rica em alanina; uma composição de condimento caracterizada por compreender o extrato de levedura rico em alanina e um alimento ou bebida contendo alanina caracterizados por compreende a levedura rica em alanina, a extrato de levedura rica em alanina ou a composição de condimento.

Description

“MÉTODO PARA PRODUZIR UMA LEVEDURA TENDO UMA QUANTIDADE DE ALANINA DE 2,0 A 12,0% EM PESO EM UMA BASE DE PESO SECO DE UM EXTRATO DE LEVEDURA.” [Campo técnico]

A presente invenção refere-se a método para produzir uma levedura rica em alanina, uma levedura rica em alanina, um extrato de levedura rica em alanina, uma composição de condimento e um alimento ou uma bebida contendo extrato de levedura rico em alanina.

[Fundamentos da técnica]

Atualmente, principalmente em países avançados tais como Europa, EUA e Japão, condimentos naturais ou naturais interessados na saúde que não usam aditivos são requeridos em todo o mundo. Sob tais circunstâncias, na indústria do extrato de levedura, extratos adicionados de valor alto que têm uma quantidade alta de aminoácidos ativos de sabor tais como ácido glutâmico e ácidos nucléicos, e também têm delícia (umami) intensificado foram desenvolvidos.

Como para ácido glutâmico, o glutamato de sódio também foi difundido como um tempero químico. Entretanto, em anos recentes, um extrato de levedura contendo abundante não apenas em ácido glutâmico mas também outros aminoácidos é favorecido a partir do ponto de vista de saúde.

Por exemplo, a Literatura de Patente 1 descreve um extrato de levedura caracterizado em que a quantidade de aminoácido livre é de 25 % em peso ou mais e também a quantidade total de componentes ativos de sabor com base em ácido nucléico é de 2 % em peso ou mais.

Também, a Literatura de Patente 2 descreve uma composição de extrato de levedura derivada de uma levedura que pertence ao gênero Candida tropicalis, Candida lipolytica ou Candida utilis, em que a quantidade de um total aminoácido livre em um extrato de levedura é 3,0 % ou mais, a

Petição 870180055155, de 26/06/2018, pág. 10/12 quantidade de alanina em uma quantidade de aminoácido livre total é de 10 % ou mais, a quantidade de ácido glutâmico é de 25 % ou mais e a quantidade de histidina é de 10 % ou mais.

[Lista de Citação] [Literatura de Patente] [Literatura de patente 1]

Pedido de Patente Não Examinado Japonês, Primeira Publicação N°. 2007-49989 [Literatura de patente 2]

Patente Japonesa N° 3,519,572 [Sumário da Invenção] [Problema Técnico]

Entretanto, em métodos convencionais, a fim de incluir uma quantidade suficiente de um aminoácido livre no caso de produzir vários extratos usando-se uma proteína vegetal ou animal, operação toma-se complicada em muitos casos, por exemplo, é necessário realizar tratamentos de decomposição tal como proteína vegetal hidrolisada (HVP) e proteína animal hidrolisada (HAP). Além disso, foi requerido um método para produzir um extrato de levedura contendo um aminoácido ou semelhante em uma concentração mais alta do que aquela de um extrato de levedura que é, atualmente, comercialmente disponível. Particularmente, o desenvolvimento de um método capaz de produzir um extrato de levedura tendo um teor mais alto de alanina no extrato de levedura de uma maneira simples e fácil foi requerido. Isto ocorre porque enquanto muitos aminoácidos podem apresentar estringência, pode ser esperado que a estringência do extrato de levedura pode ser suprimido pelo controle da quantidade de alanina no extrato de levedura.

Com relação à Literatura de Patente 1, as operações, tais como o uso de uma enzima são complicadas.

Além disso, com relação à Literatura de Patente 2, além de uma operação complicada tal como o uso de uma enzima, uma levedura sujeita a um tratamento de mutação é usada, resultando em segurança deficiente, preferência e outros como um alimento.

Sob estas circunstâncias, a presente invenção foi realizada e um objetivo da presente invenção é fornecer a método para produzir uma levedura rica em alanina contendo alanina em uma concentração mais alta do que aquela de uma levedura convencional, uma levedura rica em alanina, um extrato de levedura rica em alanina, uma composição de condimento e um alimento ou bebida contendo alanina.

[Solução para o Problema]

Foi estudada intensamente a situação a fim de atingir o objetivo acima e observaram que a quantidade de alanina em uma levedura aumenta aumentando-se o pH de um fluido de cultura a um pH específico (mudando-se para uma região alcalina) durante a cultura da levedura em uma fase estacionária. Também foi observado que um extrato de levedura tendo uma quantidade alta de alanina pode ser produzida pela produção um extrato de levedura usando-se esta levedura, e, desta maneira, a presente invenção foi completada.

A presente invenção utiliza as seguintes constituições.

[1] A método para produzir uma levedura rica em alanina, que inclui cultura líquida de uma levedura em uma fase estacionária de proliferação sob a condição que o pH de um meio líquido é 7,5 ou mais alto e menor do que 11.

[2] O método para produzir uma levedura rica em alanina de acordo com [1], em que a cultura líquida inclui ajustar o pH de um meio líquido da levedura em uma fase estacionária de proliferação a 7,5 ou mais alto e menor do que 11 e cultivar a levedura na faixa de pH acima.

[3] O método para produzir uma levedura rica em alanina de acordo com [1] ou [2], em que a levedura é Saccharomyces cerevisiae ou

Candida utilis.

[4] Uma levedura rica em alanina obtida pelo método para produzir uma levedura rica em alanina de acordo com qualquer um de [1] a [3].

[5] Um extrato de levedura rica em alanina extraído da levedura rica em alanina de acordo com [4].

[6] Uma composição de condimento incluindo o extrato de levedura rica em alanina de acordo com [5].

[7] Um alimento e bebida contendo alanina, incluindo a levedura rica em alanina de acordo com [4], o extrato de levedura rica em alanina de acordo com [5] ou a composição de condimento de acordo com [6]. [Efeitos Vantajosos da Invenção]

De acordo com o método para produzir uma levedura rica em alanina da presente invenção, uma levedura rica em alanina tendo uma quantidade notavelmente aumentada de alanina pode ser produzida de uma maneira simples e fácil apenas mudando-se o pH de um meio líquido da levedura em uma fase estacionária para uma alcalina region.

Realizando-se uma operação de extração da levedura rica em alanina da presente invenção, um extrato de levedura rico em alanina contendo alanina em uma concentração alta é obtida.

[Breve Descrição dos Desenhos]

A Fig. 1 é um gráfico que mostra uma curva do aumento na contagem celular versus o tempo de cultura no Exemplo 1.

A Fig. 2 é um gráfico que mostra uma curva do aumento em peso de células de levedura secas versus o tempo de cultura no Exemplo 1.

A Fig. 3 é um gráfico que mostra uma mudança no pH de um meio líquido versus o tempo de cultura no Exemplo 1.

[Descrição das Formas de Realização]

O método para produzir uma levedura rica em alanina da presente invenção inclui cultura líquida de uma levedura em uma fase estacionária de proliferação sob a condição que o pH de um meio líquido é

7,5 ou mais alto e menor do que 11.

As formas de realização da presente invenção serão descritas em detalhes abaixo.

A levedura pode ser fungos unicelulares e seus exemplos específicos include fungos do gênero Saccharomyces, fungos do gênero Shizosaccharomyces, fungos do gênero Pichia, fungos do gênero Candida, fungos do gênero Kluyveromyces, fungos do gênero Williopsis, fungos do gênero Debaryomyces, fungos do gênero Galactomyces, fungos do gênero Torulaspora, fungos do gênero Rhodotorula, fungos do gênero Yarrowia, fungos do gênero Zygosaccharomyces e outros.

Entre estas leveduras, do ponto de vista da comestibilidade, Candida tropicalis, Candida lypolitica, Candida utilis, Candida sake, Saccharomyces cerevisiae e outros são preferíveis e as comumente usadas Saccharomyces cerevisiae e Candida utilis são as mais preferíveis.

A fim de realizar a presente invenção, após a levedura ser cultivada em um meio líquido contendo uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, um sal orgânico ou semelhante até uma fase estacionária, a levedura pode ser cultivada líquida sob a condição que o pH de um meio líquido da levedura em uma fase estacionária de proliferação é de 7,5 ou mais alto e menor do que 11.

Uma composição de meio destas cepas bacterianas não é particularmente limitada e as composições que são utilizadas de um método convencional podem ser usadas. Por exemplo, como a fonte de carbono, um ou dois ou mais tipos selecionados do grupo que consiste de glicose, sacarose, ácido acético, etanol, melados, uma solução de resíduo de polpa de sulfito e outros, que são utilizados na cultura convencional de microorganismos, são usados como a fonte de nitrogênio, um ou dois ou mais tipos selecionados do grupo que consiste de uréia, amônia, sais inorgânicos tais como sulfato de amônio, cloreto de amônio ou fosfato de amônio e substâncias orgânicas contendo nitrogênio, tais como líquido da maceração do milho (CSL), caseína, extrato de levedura ou peptona, são usados. Além disso, um componente de fosfato, um componente de potássio e um componente de magnésio pode ser adicionado ao meio e materiais brutos industriais convencionais tal como superfosfato de cálcio, fosfato de amônio, cloreto de potássio, hidróxido de potássio, sulfato de magnésio e cloridreto de magnésio podem ser usados. Além disso, sais inorgânicos tais como íons de zinco, cobre, manganês e ferro podem ser usados. Além disso, vitaminas, sustâncias associadas com ácido nucléico e outros podem ser adicionados.

Como uma forma de cultura, qualquer uma de cultura de batelada, cultura de semi-batelada e cultura contínua podem ser usados. Entretanto, a cultura de semi-batelada ou a cultura contínua são industrialmente utilizadas.

A condição de cultura em uma fase de proliferação logarítmica ou a condição de cultura antes do ajuste de pH pode estar de acordo com a condição geral para cultivar levedura e, por exemplo, a temperatura é de 20 a 40°C e é preferivelmente de 25 a 35°C e o pH é de 3,5 a 7,5 e é particularmente desejável de 4,0 a 6,0. Além disso, a condição aeróbica é preferida.

E preferível realizar a cultura enquanto a aeração e a agitação. A quantidade de aeração e a condição de agitação podem ser apropriadamente determinadas levando-se em conta o volume e o tempo de cultura e a concentração inicial de um fungo. Por exemplo, a cultura pode ser realizada enquanto a aeração de cerca de 0,2 a 2 volume por volume por minuto (V.V.M.) e agitação em cerca de 50 a 800 rpm.

O método de cultura líquida sob a condição que o pH de um meio líquido da levedura em uma fase estacionária de proliferação é de 7,5 ou mais alto e menor do que 11 não é particularmente limitado. Por exemplo, o pH de um meio líquido pode ser ajustado para ser igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 11 quando a cultura de levedura entrou em uma fase estacionária. Altemativamente, um meio líquido pode ser mudado pela adição de uréia a um meio em avanço tal que o pH naturalmente tome-se igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 11 com um lapso do tempo de cultura.

A quantidade de uréia ou semelhante a ser adicionada ao meio não é particularmente limitada e é preferivelmente de cerca de 0,5 a 5 % com relação ao meio, embora isto dependa da concentração celular da levedura para ser cultivada.

O método de ajustar o pH de um meio líquido deve ser igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 11 quando a levedura cultivada entrou em uma fase estacionária não é particularmente limitado. Por exemplo, um componente alcalino é apropriadamente adicionado e o pH de um meio líquido pode ser ajustado a mais do que 7,5 e menor do que 11 e preferivelmente ser maior do que 7,5 e menor do que 10.

O ajuste do pH pode ser realizado contanto que a levedura esteja em uma fase estacionária e é preferível realizar o ajuste do pH imediatamente antes da levedura entrar em uma fase estacionária. Isto ocorre não apenas porque a concentração de alanina na levedura pode ser suficientemente intensificada, mas também requer tempo até que a finalização de todas as etapas possa ser encurtada. Quando o pH do meio líquido da levedura em uma fase de proliferação logarítmica é ajustado deve ser igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 11, a proliferação da levedura é suprimida e, desta maneira o teor de alanina livre não é aumentado, que é desfavorável.

Os exemplos do componente alcalino incluem, mas não são limitados a, álcalis orgânicos tais como NH4OH (amônia aquosa), gás amônia, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de cálcio, e hidróxido de magnésio; bases alcalinas tais como carbonato de sódio e carbonato de potássio; álcalis orgânicos tais como uréia; e outros.

Entre estes componentes, amônia aquosa, gás amônia e uréia são preferíveis.

A temperatura e outras condições quando a levedura em uma fase estacionária é cultivada em um meio líquido tendo uma pH de mais do que 7,5 e menor do que 11 pode ser de acordo com a condição comum para cultivar levedura e por exemplo, a temperatura é de 20 a 40°C e é preferivelmente de 25 a 35°C.

Existe uma tendência que a quantidade de alanina na levedura após o pH ter mudado para mais do que 7,5 e menor do que 11 atinge um pico e, a seguir, a quantidade diminui com um lapso de um tempo de cultura. Além disso, isto depende das condições tal como a concentração celular da levedura para ser cultivada, o pH e a temperatura. É suposto que quando excessivamente cultivado por um longo período sob condições alcalinas, uma influência de um álcali na levedura toma-se muito grande. Portanto, na presente invenção, um tempo de cultura ótimo pode ser apropriadamente selecionado para cada condição de cultura, particularmente, para cada pH após a mudança alcalina. Preparando-se um extrato de levedura usando-se a levedura em um pico, um extrato de levedura rica em alanina tendo uma quantidade muito alta de alanina de 2,0 % em peso ou mais e preferivelmente de 2,0 a 12,0 % em peso em uma base de peso seco, é obtida.

Na presente invenção, a quantidade de alanina na base de peso seco do extrato de levedura significa a razão (% em peso) de alanina contido nas partes sólidas obtidas pela secagem do extrato de levedura.

Como o método de medir a quantidade de alanina, por exemplo, isto pode ser medido pelo método de rotulação AccQ-Tag Ultra usando-se o mecanismo de análise de Acquity UPLC fabricado pela Waters (USA). Uma curva de calibração pode ser feita, por exemplo, usando-se uma solução padrão mista de aminoácido tipo H (fabricado pela Wako Pure

Chemical Industries, Ltd.).

A quantidade também pode ser medida usando-se um mecanismo de análise automática de aminoácido fabricado pela JEOL Ltd., Model JLC-500/V, mas o método não é particularmente limitado.

De acordo com o método da presente invenção, uma levedura contendo abundantemente e, particularmente, contendo alanina livre nas células pode ser produzida. Por esta razão, pela extração de um extrato de levedura a partir da levedura, um extrato de levedura abundantemente contendo alanina livre como um componente ativo de sabor satisfatório pode ser obtido de uma maneira simples e fácil. Visto que o extrato de levedura obtido desta maneira tem uma quantidade alta de alanina livre, estringência peculiar a um aminoácido é suprimida e o extrato de levedura é extrato de levedura mais satisfatório.

A presente invenção pode produzir levedura rica em alanina por uma etapa simples de realizar a mudança alcalina do meio líquido. Como descrito acima, não é necessário usar um meio particularmente especial, mas a levedura pode ser produzida usando-se um material bruto barato, tal como amônia.

De acordo com o método da presente invenção, uma levedura rica em alanina contendo alanina em uma concentração alta dentro das células de levedura é obtida. Entretanto, uma fração contendo alanina pode ser obtida da levedura rica em alanina.

Como o método de fracionar uma fração contendo alanina a partir da levedura rica em alanina, qualquer método pode ser usado contanto que este método seja usualmente realizado.

Um extrato de levedura rica em alanina pode ser produzido a partir de uma levedura rica em alanina cultivada pelo método acima. Como um método de produzir o extrato de levedura rica em alanina, qualquer método pode ser usado contanto que este seja um método que é usualmente realizado e um método de auto-digestão, um método de degradação de enzima, um método de extração alcalino, um método de extração de água quente e outros são utilizados. Comumente, é considerado que a alanina em um extrato de levedura obtido apenas pelo método de extração de água quente é alanina livre em uma quantidade aproximadamente total, diferente do extrato de levedura obtido pelo método de reação de enzima, tal como o método de auto-digestão.

A levedura rica em alanina da presente invenção contém uma grande quantidade de um aminoácido livre e, portanto, mesmo quando um extrato de levedura é simplesmente extraído apenas por um tratamento de água quente, um extrato de levedura tendo sabor satisfatório é obtido.

Portanto, a fim de intensificar a quantidade de um aminoácido ativo de sabor tal como alanina livre, um tratamento de hidrólise usando-se um ácido ou um álcali foi comumente realizado usando-se uma proteína vegetal ou animal. Entretanto, o hidrolisado de uma proteína tem um problema que esta contém MCP (cloropropanóis) que é suspeito de ser carcinogênico.

Ao contrário, visto que a levedura rica em alanina produzida pelo método da presente invenção tem originalmente um teor de aminoácido livre alto, um extrato de levedura tendo uma quantidade suficientemente alta de alanina livre pode ser preparada sem um tratamento de decomposição sem um ácido ou um álcali ou tratamento enzimático, após a levedura ser extraída pelo método de água quente ou semelhante. Isto é, usando-se a levedura rica em alanina da presente invenção, um extrato de levedura excelente tanto em propriedade ativa de sabor quanto segurança pode ser produzido de uma maneira simples e fácil.

Portanto, o extrato de levedura obtido pela presente invenção tem uma propriedade ativa de sabor muito alta e sendo usado em alimentos e bebidas, é possível produzir alimentos e bebidas tendo um sabor forte e riqueza.

Além disso, pela formulação de um extrato de levedura rica em alanina da presente invenção em pó, um extrato de levedura rico em alanina em pó é obtido e selecionando-se apropriadamente um fungo de levedura, um extrato de levedura m pó contendo 5,0 % em peso ou mais na base de peso seco de alanina é obtido.

As células de levedura secas podem ser preparadas a partir de uma levedura rica em alanina cultivada pelo método acima. Como o método de preparar a célula de levedura seca, qualquer método pode ser usado contanto que este seja um método convencional. Entretanto, um método de liofilização, um método de secagem por pulverização, um método de secagem por tambor e outros são utilizados.

A levedura rica em alanina, células de levedura secas da levedura, um extrato de levedura preparado a partir da levedura e o extrato de levedura em pó da presente invenção pode ser formulado em uma composição de condimento. A composição de condimento pode consistir apenas do extrato de levedura da presente invenção ou pode conter outros componentes, tais como um estabilizante ou um conservante, além do extrato de levedura ou semelhante da presente invenção. A composição de condimento pode ser apropriadamente usado em vários alimentos e bebidas, similares às composições de tempero.

Além disso, a presente invenção refere-se a alimento e bebida contendo a levedura rica em alanina obtida pelo método acima ou o extrato de levedura rica em alanina extraído da levedura rica em alanina. Incluindo-se uma levedura rica em alanina ou semelhante da presente invenção, bebidas e alimentos contendo alanina em uma concentração alta podem ser eficazmente produzidos.

Estes alimentos e bebidas podem ser qualquer alimento e bebida contanto que estes sejam alimentos e bebidas aos quais a levedura seca, um extrato de levedura e uma composição de condimento contendo-os pode ser adicionados e exemplos destes incluem bebidas alcoólicas, bebidas refrescantes, alimentos fermentados, condimentos, sopas, pães, confeitos e outros.

A fim de produzir os alimentos e as bebidas da presente invenção, uma preparação obtida da levedura rica em alanina acima ou uma fração de uma levedura rica em alanina podem ser adicionada no processo de produção de alimentos e bebidas. Além disso, como um material bruto, a levedura rica em alanina podem ser usados como é.

A presente invenção será descrita em mais detalhes por meio de Exemplos, mas a presente invenção não é limitada aos seguintes Exemplos.

Exemplo 1

A cepa de Saccharomyces cerevisiae AB9813 foi cultivada, e a extração de extrato de uma cultura de levedura e a análise de alanina foi realizada, pelos métodos mostrados nos seguintes <1> a <8>.

<1> Pré-cultura

Dois meios consistindo da seguinte composição foram preparados (volume de 350 ml, frasco de Erlenmeyer com defletor de 2 L).

(Composição do meio)

Melados 8 %

Uréia 0,6 % (NH4)₂SO₄, 0,16 % (sulfato de arnônio) e (NH4)₂HPO4 0,08 % (fosfato de hidrogeno diamônio) (Método de preparação) (1) Melados {grau de açúcar 36 %, 167 ml) foi diluído a 750 ml com água milli-Q water e então cada 350 ml foi dispensado em um frasco de Erlenmeyer com defletor de 2 L.

(2) Desinfecção (1,21 °C, 15 min) foi realizado.

160 rpm (rotativa) horas (Quantidade de fungo de (3) No uso, uma quantidade 1/50 (cada 7 ml) de uma solução mista de componente de nitrogênio (xlOO) foi adicionado de maneira estéril a um meio apenas de melado.

(Condições de cultura)

Temperatura de cultura30°C

Agitação

Tempo de cultura inoculação: 300 mL) <2> Cultura principal Um meio consistindo da seguinte composição foi preparada em um volume de 2.000 mL (ajuste em 3 L na finalização de semi-batelada).

(Composição do meio) Cloreto de amônio 0,18 % (em termos de 3 L na finalização de semi-batelada) 5,3 g (NH4)₂HPO₄ 0,04 % (fosfato de hidrogeno diamônio, em termos da finalização de semi-batelada) 1,2 g

Subsequentemente, a cultura foi realizada sob as seguintes condições.

(Condição de cultura) Temperatura de cultura Aeração Agitação controle de pH

30°C

L/minuto

600 rpm

Controle de limite inferior pH 5,0 (com 10 % de amônia aquosa), nenhum controle de limite superior

Agente anti-espumante Carga de adecanato

Meio de semi-batelada Melados (grau de açúcar 36 %), volume 800 ml (com uma garrafa de Meio de 1 L, final 8 %) <3> mudança de pH

Então, imediatamente após a levedura cultivada ter entrado na fase estacionária, o pH do fluido de cultura foi mudado para uma região alcalina (a seguir, referido como a mudança de pH) com uma solução aquosa de NH4OH (10 %) (pH alvo: 9,0), seguido por uma cultura adicional da levedura. Após 48 horas do início da cultura principal, a cultura foi finalizada.

A Fig. 1 é um gráfico que mostra uma curva do aumento na contagem celular versus o tempo de cultura. A Fig. 2 é um gráfico que mostra uma curva do aumento no peso de células de levedura secas versus o tempo de cultura. A Fig. 3 é um gráfico que mostra uma mudança no pH de um fluido de cultura versus o tempo de cultura.

Como mostrado na Fig. 1, foi confirmado que o aumento na contagem celular (xlO⁶ células/ml) atingiu o estado estacionário após 18 horas de cultivo e a levedura entrou na fase estacionária de proliferação. Além disso, o peso de células de levedura secas (g/L) também entrou em um estado aproximadamente estacionário após 24 horas de cultivo e uma fase estacionária de proliferação foi confirmada. O pH do fluido de cultura foi medido e, como um resultado, como mostrado na Fig. 3, o pH foi mudado para uma região alcalina (7,5 ou mais alto e menor do que 11), após a levedura ter entrado na fase estacionária de proliferação.

<4> Método de coleta de célula (1) O fluido de cultura em que a levedura foi a cultura principal foi transferido a um tubo de centrifugação de plástico de 50 ml (Falcon 2070) e centrifugação (3.000 g, 20°C, 5 minutos, HP-26) foi realizado.

(2) O sobrenadante foi descartado e os grânulos foram colocados em suspensão em 20 ml de água milli-Q e então centrifugação (3.000 g, 20°C, 5 minutos, HP26) foi realizada. Esta operação foi repetida duas vezes.

(3) O sobrenadante foi descartado, e os grânulos foram colocados em suspensão em 20 ml de água milli-Q water.

<5> Medição do peso de células de levedura secas

De um prato de alumínio (diâmetro 5 cm) que foi pesado em avanço foram retirados 2 ml de uma suspensão de levedura e esta foi secada a 105°C por 4 horas.

Um peso após a secagem (peso após a secagem da levedura) foi medido e o peso das partes sólidas (peso de células de levedura secas, unidade g/L) foi calculado pela seguinte equação (1).

Peso após a secagem - peso da do prato de alumínio — peso de células de levedura secas (1) <6> Preparação de solução de extrato pelo método de extração de água quente (1) A suspensão de levedura remanescente (cerca de 18 ml) foi centrifugada (3.000 g, 20°C, 5 minutos, HP-26).

(2) A suspensão remanescente (1,5 ml) foi transferida a um tubo de Eppendorf e o tubo foi transferido a um aquecedor de bloco e então aquecido a 80°C por 30 minutos (conversão no extrato). Altemativamente, este pode ser excessivamente aquecido em um banho quente a 100°C por 10 minutos (conversão no extrato).

(3) A seguir, o sobrenadante (solução de extrato) foi separado por centrifugação (6.000 g, 4°C, 5 minutos).

<7> Método para a medição da taxa de decomposição

A solução do extrato (500 pl) foi retirada de um prato de alumínio e secada a 105°C por 4 horas. A seguir, uma razão em peso do extrato (p/p) foi calculada a partir de um peso seco antes da conversão em um extrato.

<8> Método para a medição de uma quantidade de alanina

A quantidade de alanina por peso de células de levedura secas de cada da levedura antes da mudança de pH e levedura após a mudança de pH foi medida. Especificamente, a quantidade de alanina foi medida pelo método de rotulação AccQ-Tag Ultra usando-se o mecanismo de análise Acquity UPLC fabricado pela Waters (USA). No método de medição, a alanina livre em uma amostra pode ser seletivamente determinada. Uma curva de calibração foi feita usando-se uma solução padrão mista de aminoácido (tipo H) (fabricado pela 5 Wako Pure Chemical Industries Ltd.), os resultados de medição são mostrados na Tabela 1.

Tabela 1

	30°C, pH alvo: 9	30°C, pH alvo: 9
	Antes da mudança	Após a mudança
Peso de células de levedura secas (g/L)	87,3	87,9
Alanina (% em peso em células de levedura secas)	1,6	2,4

Como está evidente a partir dos resultados acima, a quantidade de alanina em levedura é, na maioria, aumentada em tomo de 1,5 vez 10 imediatamente após a mudança de pH e, a seguir, uma quantidade de alanina do que aquela antes da mudança de pH pode ser mantida.

Como está evidente a partir do resultado acima, a alanina na levedura é aumentada pela cultura adicional de levedura pelo ajuste do pH deve ser igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 11 após uma fase 15 estacionária.

Como descrito acima, no presente Exemplo, a alanina livre na amostra é medida e, portanto, a quantidade desta mostrada na Tabela I é uma quantidade de alanina livre.

Exemplo 2

Então, tanto a quantidade de alanina por peso de células secas da levedura preparada da mesma maneira como no Exemplo 1 (pH 9,0) quanto a quantidade de alanina na base de peso seco de um extrato de levedura preparadas a partir desta levedura foram medidas. Os resultados da medição são mostrados na Tabela 2.

Tabela 2

pH alvo		Quantidade de alanina (% em peso das células de levedura secas)	Quantidade de alanina (% em peso das células de levedura secas)
9,0	Antes da mudança depH	1,4	5,7
Depois da mudança de pH	2,2	8,9

Como mostrado na Tabela 2, a quantidade de alanina (% em peso) no peso da célula fúngica seca foi aumentado de 1,4 % em peso a 2,2 % em peso por uma mudança de pH. Também em um extrato de levedura preparado a partir destas leveduras, a quantidade de alanina (% em peso) em uma base de peso seco foi aumentado de 5,7 % em peso a 8,9 % em peso, similarmente. Isto é, foi confirmado que um extrato de levedura tendo uma quantidade alta de alanina é obtido preparando-se um extrato de levedura a partir da levedura rica em alanina produzida usando o método da presente invenção.

Exemplo 3

Subsequentemente, com relação à um extrato de levedura produzido a partir da levedura preparada na mesma maneira como no Exemplo 1 (pH 9,0), e extratos de levedura comercialmente disponíveis (Exemplos comparativos 1 a 8), a quantidade de alanina por peso seco do extrato foi medido, seguido pela comparação. Além disso, alanina foi medida na mesma maneira como no Exemplo 1. A quantidade de alanina (% em peso) em uma base de peso seco do extrato de levedura respectivo, que foram obtidos como um resultado da medição, são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3

Amostras	ex. 3	Ex. 1 comp.	Ex. 2 comp.	Ex. 3 comp.	Ex. 4 comp.
Quantidade no extrato		Produto da companhia A	Produto da companhia B	Produto da companhia C	Produto da companhia D
Alanina (% em peso)	8,9	0,9	0,0	1,8	1,4

Amostras	Ex. 5 comp.	Ex. 6 comp.	Ex. 7 comp.	Ex. 8 comp.
Quantidade no extrato	Produto da companhia E	Produto da companhia F	Produto da companhia G	Produto da companhia H
Alanina (% em peso)	0,8	0,3	0,9	0,5

Como é evidente a partir dos resultados, o extrato de levedura da presente invenção contém uma quantidade notavelmente ampla de alanina, que é um aminoácido tendo uma propriedade ativa do sabor e é sugerido que este extrato de levedura é preferível como um condimento.

Exemplo 4

Além disso, uma sopa de missô e a sopa de caldo de carne foram feitas usando um pó de extrato de levedura (derivado de Saccharomyces cerevisiae) obtido pela formulação, um extrato de levedura produzido a partir da levedura preparada na mesma maneira como no Exemplo 1 (pH 9,0), em um pó. A quantidade do extrato de levedura misturado com a sopa de missô ou a sopa de caldo de carne é de 0,2 %.

Como exemplo comparativo, usando Meast Powder N (fabricado por ASAHT FOOD e HEALTHCARE CO., LTD.), uma sopa de missô e uma sopa de caldo de carne foram preparadas similarmente, a avaliação sensorial foi realizada pelo seguinte método.

(Método de avaliação)

Um teste sensorial comparativo foi realizada usando uma comparação de dois pontos cegos por 10 participantes profissionais. Como um teste comparativo de 2 pares, um teste t foi realizado.

(Critério de avaliação)

Com relação aos três itens, sabor salgado (efeito de redução do sal), delícia e gosto, uma avaliação de grau 5 foi realizada, assumindo que a uma sopa de missô como um padrão ou a sopa de caldo de carne como um padrão é 0.

forte = +2, levemente forte = +1,

Nenhum = Ο levemente fraca = -1, fraca - -2.

Os resultados da sopa de missô são mostrados na Tabela 4 e os resultados da sopa de caldo de carne são mostrados na Tabela 5.

Tabela 4

	Desvio padrão	0,88	0,97	o'	0,82	0,82	0,79
	Média	0,10	0,40	0,80	-0,30	o	0,20

	Painéis 1		X—*<	Τ-Ή 1		O	©	©	---------------------------¹-----------------------------------------------------------¹-----------------------------------------------------------1-----------------------------------------------------------1 1 Teste T para os dados em pares
·—1	©	<—<	T·—	X—-H 1	rH	©
w	o	X“'<	O1	©	©	©
	o	x—H		©	x—-H	©
w	1—H	©	©	1	1	©
M	1	X— l	©	©	t—< f	1
	Q	x—4 1	OI	x——4	OI 1	x—H	©
U	r—-(	x—-H	O	V“—<	©	©
PQ	x—4	©	OI	©	o	(N
	1	©	©	©	Χ'·4	X—<
	Itens	Sabor salgado	Delícia	Gosto	Sabor salgado	Delícia	Gosto
Amostras	exemplos	Meast Powder N (exemplo comparativo)

	Desvio padrão	t—H o'	0,99	i— o'	0,82	0,82	0,84
	Média	0,50	0,90	0,50	0,00	0,00	0,40

Tabela 5

Como é evidente a partir dos resultados da Tabela 4, na sopa de missô, existe uma diferença na média do sabor salgado e delícia e existe uma diferença significante no gosto. A partir dos resultados da Tabela 5, na sopa de caldo de carne, existe uma diferença na média do sabor salgado e gosto e existe uma diferença significante na delícia. É considerado que este é por causa do extrato de levedura da presente invenção que tem uma quantidade altamente significante de alanina comparada com um extrato de levedura convencional.

Exemplo 5

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada é a cepa Saccharomyces cerevisiae ABS1, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois o mudança de pH são mostrados na Tabela 5.

Exemplo 6

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada é a cepa Saccharomyces cerevisiae ABS2, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina fora realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pH são mostrados na Tabela 6.

Exemplo 7

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada é a Saccharomyces cerevisiae ABS 3, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pH são mostrados na Tabela 6.

Exemplo 8

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada foi Camellia (levedura de pão), uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pH são mostrados na Tabela 6.

Exemplo 9

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada foi a cepa Candida utilis ABC1, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pEl são mostrados na Tabela 6.

Exemplo 10

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada foi a cepa Candida utilis ABC2, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pH são mostrados na Tabela 6.

Exemplo 11

Na mesma maneira como no Exemplo 1, exceto que a levedura para ser cultivada foi a cepa Candida utilis ABC3, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato a partir de um fluido de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pH são mostrados na Tabela 6.

Tabela 6

Cepas bacterianas	pH apresentad 0	Antes da mudança de pH	Depois da mudança de pH
Alanina (% em peso nas células de levedura secas)	Alanina (% em peso nas células de levedura secas)
Saccharomyces cerevisiae ABSI	8,0	1,13	1,68
Saccharomyces	8,0	0,37	0,58

cerevisiae ABS2
Saccharomyces cerevisiae ABS3	8,0	0,44	1,92
Camellia (levedura de Baker)	8,0	0,27	2,71
Candida utilis ABC1	8,0	0,26	1,01
Candida utilis ABC2	8,0	0,15	1,16
Candida utilis ABC3	8,0	0,14	2,77

Como é evidente a partir dos resultados da Tabela 6, um fenômeno de aumento em uma quantidade de alanina foi confirmado pela mudança de pH, também em outras cepas de Saccharomyces cerevisiae e a levedura de outros gêneros que são testadas no Exemplos. Além disso, a 5 quantidades (% em peso) de alanina no extrato antes e depois da mudança de pH dos Exemplos 5 a 11 são como segue.

___________Experimento N°: antes da mudança -> após a mudança)

(Exemplo 5:	4,05	_>	10,03),
(Exemplo 6:	1,17	_>	5,99),
(Exemplo 7:	1,55	_>	6,03),
(Exemplo 8:	0,96	->	4,20),
(Exemplo 9:	1,05	->	10,10),
(Exemplo 10:	0,54	_>	3,98),
(Exemplo 11:	0,61	->	8,46).

Exemplo 12

Na mesmo como aquele do Exemplo 1, exceto que a levedura a ser cultivada foi a cepa Saccharomyces cerevisiae ABS4 e o pH apresentado de mudança de pH foi em unidades de 0,5 entre 7,0 a 9,5, uma levedura foi cultivada e a extração de um extrato de cultura de levedura e análise de alanina foram realizados. Os valores medidos de uma quantidade de alanina antes e depois da mudança de pH são mostrados na Tabela 7.

Tabela 7

Saccharomyces cerevisiae	Ajuste de pH	Antes da mudança de PH	Após a mudança de pH
Alanina (% em peso em células de levedura secas)	Alanina (% em peso em células de levedura secas
ABS4	7,0	3,34	5,61

ABS4	7,5	3,43	5,46
ABS4	8,0	3,60	9,43
ABS4	8,5	2,95	11,30
ABS4	9,0	4,39	6,84
ABS4	9,5	3,28	4,74

Como é evidente a partir dos resultados da Tabela 7, um aumento em uma quantidade de alanina de 4,0 a 12,0 % em peso foi visto no caso de todos os ajustes de pH e também na cepa de Saccharomyces cerevisiae ABS4.

[Aplicabilidade Industrial]

De acordo com o método para produzir uma levedura rica em alanina da presente invenção, uma levedura contendo alanina mantida em uma concentração alta nas células pode ser obtida e portanto a presente invenção pode ser utilizada no campo da indústria alimentícia, tal como produção de um extrato de levedura.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para produzir uma levedura tendo uma quantidade de alanina de 2,0 a 12,0% em peso em uma base de peso seco de um extrato de levedura, caracterizado pelo fato de que compreende:

cultivar em meio líquido uma levedura em uma fase logarítmica de proliferação em um pH de 3,5 a 7,5 e uma temperatura de 20 a 40°C; e cultivar em meio líquido uma levedura em uma fase estacionária de proliferação sob a condição que o pH de um meio líquido é igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 10.
2. Método para produzir uma levedura tendo uma quantidade de alanina de 2,0 a 12,0% em peso em uma base de peso seco de um extrato de levedura acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a cultura líquida compreende adicionalmente ajustar o pH do meio líquido da levedura em uma fase estacionária de proliferação deve ser igual a ou maior do que 7,5 e menor do que 10 e cultivar a levedura na faixa de pH acima.
3. Método para produzir uma levedura tendo uma quantidade de alanina de 2,0 a 12,0% em peso em uma base de peso seco de um extrato de levedura de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae ou Candida utilis.
4. Método para produzir uma levedura tendo uma quantidade de alanina de 2,0 a 12,0% em peso em uma base de peso seco de um extrato de levedura de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que a levedura é Saccharomyces cerevisiae.