BRPI0916555B1

BRPI0916555B1 - Usos de opioides ou miméticos de opioides para tratamento de pacientes com câncer resistente, e combinação farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0916555B1
Application number: BRPI0916555-0A
Authority: BR
Inventors: Erich Miltner; Claudia Friesen; Andreas Alt
Original assignee: Universitãt Ulm
Priority date: 2008-07-31
Filing date: 2009-01-29
Publication date: 2021-06-29
Also published as: DK2149372T3; US8901175B2; HUE031337T2; RU2011107280A; WO2010012319A1; PT2320900T; DK2320900T3; EP2149372B1; PL2149372T3; CN102159212A; PL2320900T3; CA2732497C; EP2320900B1; EP2149372A1; ES2596363T3; JP2011529454A; RU2520636C2; PT2149372E; JP5804945B2; US20110270011A1

Abstract

uso de opioides ou miméticos de opioides para o tratamento de pacientes com câncer resistente a presente invenção refere-se ao uso de opioides ou de miméticos de opioides para a produção de um medicamento para o tratamento de pacientes com câncer resistente.

Description

[001] A presente invenção se refere a novas estratégias para o tratamento de pacientes com câncer resistente.

[002] As terapias anticâncer são frequentemente ineficazes devido à resistência das células de tumor a radio e/ou quimioterapia. Quando a resistência é adquirida durante a terapia, muitas vezes se manifesta ou em uma quantidade reduzida de regressão do tumor para a mesma dose (ou da radiação ou a substância citotóxica) ou uma dose aumentada que é necessária para uma quantidade igual de regressão do tumor. Quando a resistência é intrínseca, isto é, não adquirida ou induzida devido ao tratamento anticâncer, as células de tumor já originalmente carecer de sensibilidade de um ou mais fármacos anticâncer ou radiação ionizante.

[003] A quimiossensibilidade das células de câncer muitas vezes varia em uma base individual. Para carcinoma de pâncreas, por exemplo, ele é conhecido, que apenas aproximadamente 25 % de todos os pacientes se beneficiam da gencitabina do fármaco anticâncer. Os outros 75 % são intrinsecamente resistentes a esta quimioterapia. Exemplos adicionais para as células de tumor com quimio e radiorresistência intrínseca são glioblastoma ou células de melanoma.

[004] A resistência adquirida ou intrínseca (ou não resposta) das células de tumor para radio e/ou quimioterapia que têm múltiplas reações e podem - como exemplificado acima - variar em uma base individual. Apesar da intensiva pesquisa os mecanismos exatos ainda permanecem evasivos. De qualquer modo, é conhecido que ou uma única mutação, por exemplo, no sítio de ligação da substância fármaco ou no processo de desintoxicação celular, pode ser responsável pela falta de ou quimiossensibilidade reduzida. Da mesma forma a manifestação de multirresistências a diversos fármacos anticâncer muitas vezes limita a eficácia dos tratamentos anticâncer.

[005] De significante importância clínica é o fenômeno da resistência a múltiplos fármacos (MDR) assim chamada. De acordo com conceito, proteínas de membrana, em outras palavras os membros das proteínas transportadoras cassete de ligação de ATP (ABC), tal como, a P-glicoproteína ou as proteínas associadas à resistência a múltiplos fármacos (MRP) são cada vez mais expressas, o que leva a uma efluência realçada de substâncias fármaco através do transporte ativo por meio da membrana da célula. Os pacientes apresentando uma resistência a múltiplos fármacos na maioria muitas vezes são resistentes a um amplo aspecto de fármacos citotóxicos.

[006] As resistências não estão limitadas a agentes quimioterápicos ou fármacos anticâncer; pacientes com câncer podem também apresentar ou uma resistência adquirida ou intrínseca para irradiação ionizante aplicada na radioterapia. Uma radiorresistência intrínseca é conhecida, por exemplo, a partir do melanoma e das células de glioblastoma.

[007] A radiorresistência pode também ser induzida por meio de exposição à pequenas ou doses fracionadas de radiação ionizante. Diversos estudos têm documentado este efeito in vitro até mesmo nas células humanas assim como em diversos modelos animais. Diferentes mecanismos de radioproteção celular podem estar envolvidos, tais como as alterações nos níveis de algumas proteínas nucleares e citoplasmáticas e, aumentado expressão de gene ou os processos de reparo do DNA.

[008] Deste modo, na oncologia existe uma grande necessidade de novas estratégias, que torna os tratamentos de câncer mais eficazes. Em particular, é o objetivo da presente invenção fornecer novos meios de tratamento de pacientes com câncer, que apresentam uma resistência a terapias convencionais anticâncer, tais como, fármacos anticâncer (quimioterapia) ou radioterapia ou para o tratamento de pacientes com câncer com células resistentes à apoptose.

[009] Este objetivo é revolvido por usar os opioides ou os miméticos de opioides no tratamento de radioterapia e/ou quimioterapia em pacientes com câncer resistente, uma vez que já foi constatado que opioides, capazes de inibir a proliferação da célula e ou o crescimento das células de câncer, podem superar as resistências nestas células de câncer. Por esse motivo estes opioides fornecem novas estratégias para o tratamento de pacientes, que até agora são considerados serem não tratável ou não eficazmente tratável por meio de métodos terapêuticos convencionais anticâncer. Este grupo de supostos pacientes com câncer não tratável pode ser também chamado de "não respondedor", "mau respondedor" ou "não quimiossensível" ou "não radiossensível" em pacientes com câncer.

[0010] Não obstante, foi constatado que os opioides e os miméticos de opioides podem superar a resistência à apoptose das células de câncer, e deste modo podem eficazmente ser clinicamente aplicado como substâncias anticâncer. Em particular, mais surpreendentemente, foi constatado que os opioides - em particular metadona - foram tão eficazes como os tratamentos por radiação e por quimioterapia convencional (por exemplo, doxorrubicina) com células de leucemia não resistentes (isto é, sensível), e que os linfócitos do sangue periférico normais sobreviveram após este tratamento. Em consequência, de acordo com uma modalidade da invenção, os opioides são também eficazes na morte das células de tumor, mas não substancialmente afetam das células normais saudáveis do paciente.

[0011] No contexto da presente invenção o termo "opioide" é definido como um grupo químico heterogêneo de substâncias naturais, sintéticas ou semissintéticas, trabalhando agonística ou antagonística em que todos podem se ligar aos receptores de opioide bem conhecidos, de preferência para o receptor de opioide μ e que são capazes de interromper a proliferação da células cancerígenas. O grupo de opioides inclui os opiáceos naturais, tais como, alcaloides tipo morfina, di-hidrocodeína, codeína e tebaína, assim como, opiáceos semissintéticos, derivados de opiáceos naturais (por exemplo, hidromorfona, hidrocodona, oxicodona, oximorfona, desomorfina, diacetilmorfina (Heroin), nicomorfina, dipropanoilmorfina, benzilmorfina e etilmorfina), ou opioides totalmente sintéticos, tais como, fentanila, petidina e metadona, tramadol ou propoxifeno. Da mesma forma, ele inclui peptídeos opioides endógenos, que podem ser produzidos naturalmente no corpo como endorfinas, dinorfinas ou encefalinas mas que podem ser também sintetizados.

[0012] Os opioides são conhecidos por seu uso como analgésicos. O fato de que os receptores de opioide, especialmente receptores de opioide μ, são envolvidos na ativação de séries de reações de sinalização levando à apoptose foi previamente conhecido (Polakiewicz e outros, 1998). Na década passada foi constatado que os opioides podem promover a apoptose (Hatsukari e outros, 2003). Foi, além disso, discutido o uso de opioides para a indução de apoptose nas pequenas células de câncer de pulmão (Heusch & Maneckjee 1999). De qualquer modo, os mecanismos básicos não foram revelados, nem esses resultados sugerem o uso de opioides para superar as resistências aos tratamentos convencionais anticâncer.

[0013] De acordo com a invenção o opioide é capaz de inibir o crescimento e/ou a proliferação de células cancerígenas. Esta atividade pode incluir, por exemplo, atividade citostática ou citotóxica, assim como, interromper o crescimento das células e/ou tumores. A proliferação da células cancerígenas é o resultado da inibição da divisão celular. Em particular, os opioides ou os miméticos de opioides induzir a morte celular nos tumores. A morte celular no contexto da invenção inclui todos os tipos de células mortas. Isto pode incluir autofagia ou morte da célula apoptótica assim como necrótica. Em uma modalidade da invenção a morte celular é induzida pela ativação da série de reações independente de caspases ou dependente de caspases. De qualquer modo, opioides podem induzem a morte celular por meio de várias séries de reações. Em uma modalidade preferida da invenção, opioides induzem a apoptose nas células de câncer.

[0014] De modo geral, é conhecido que a apoptose pode ser induzida por meio de duas séries de reações bioquímicas principais. A "série de reações receptoras de morte" (ou série de reações extrínsecas) inclui o modelo induzido pelo receptor de TNF (fator de necrose tumoral) e o modelo induzido pelo receptor de Fas (o receptor de Fas é também conhecido como Apo-1 ou CD95). As ligações para estes receptores resultam na formação das séries de reações de sinalização induzidas por morte na célula, incluindo a ativação de caspases-8. A "série de reações mitocondriais" (ou série de reações intrínsecas) envolve a liberação de citocromo c a partir das mitocôndrias, ligação de Apaf-1 e ativação de procaspase-9. Diversos reguladores são conhecidos para ativar ou desativar as séries de reações da apoptose, tal como as proteínas pró-apoptóticas Bax e Bak ou asn proteínas antiapoptóticas Bcl-2, BclXL ou XIAP.

[0015] No contexto da invenção o termo "miméticos de opioides" é definido como uma substância, que ou indiretamente ou diretamente é capaz de induzir nas células de câncer substancialmente o mesmo efeito como opioides, em particular em vista dos efeitos da ligação dos opioides ao receptor de opioide (por exemplo, receptor μ) e/ou a indução da morte celular, em particular apoptose por meio da série de reações mitocondriais. O termo "miméticos de opioides" também inclui a substância que leva à superexpressão de receptores de opioide, tais como, por exemplo, cocaína, e com isso indiretamente induzem a morte celular.

[0016] Em uma modalidade da invenção opioides ou miméticos de opioides induzem a apoptose por meio de um ou mais dos mecanismos que seguem: i. clivagem de caspase-3 e PARP na célula de tumor ii. clivagem de caspase-9 e sub-regulagem de XIAP iii. sub-regulagem de BclXL.

[0017] De acordo com uma modalidade preferida da invenção, o opioide é um membro do grupo de metadona, compreendendo metadona D-/L-, levometadona, levacetilmetadol e piritramida. Todos estes opioides podem ser usados como sais. A forma racêmica de metadona D-/L- é de preferência fornecida na forma de um cloridrato. Em uma modalidade preferida da invenção, a metadona opioide induz a apoptose nas células de câncer por meio da série de reações mitocondriais.

[0018] De acordo com a invenção, os termos "resistência", "radiorresistência" ou "quimiorresistência" são definidos como uma sensibilidade reduzida de uma células cancerígenas para pelo menos uma terapia convencional de câncer, isto é, ou um fármaco anticâncer ou radioterapia. Um paciente sofrendo de um tal câncer é determinado como um paciente com câncer "resistente". Uma vez que a resistência pode ser intrínseca ou adquirida, a redução observada na sensibilidade é qualquer uma comparada às células de câncer "normais" totalmente sensíveis, que é responsiva à dosagem terapeuticalmente eficaz da radiação e/ou fármaco anticâncer aplicado comparada à sensibilidade original no início da terapia. No último caso, a resistência se manifesta ou em uma quantidade reduzida de regressão do tumor para a mesma dose (ou da radiação ou do fármaco anticâncer) ou uma dose aumentada que é necessária para uma quantidade igual de regressão do tumor.

[0019] Em uma modalidade particularmente preferida os opioides ou os miméticos de opioides são usados para tratar pacientes com câncer que apresentam uma ou mais das resistências subsequentes: o resistência à apoptose o resistência a múltiplos fármacos o resistência a fármaco anticâncer o resistência a fármaco citotóxico o resistência a espécies de oxigênio reativo o resistência a agentes causando lesão ao DNA o resistência a anticorpos tóxicos o resistência à doxorrubicina o única ou multirresistência, em particular a uma ou mais das seguintes substâncias fármaco : metotrexato, citarabina, cisplatina, etoposídeo, vincristina, paclitaxel (taxol), carboplatina, teniposídeo, dexametasona, prednisolona, ciclofosfamida, ifosfamida, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, mercaptopurina, fludarabina, 5-fluorouracila o resistência à irradiação (por exemplo, elétrons Auger, alfa, beta ou gama).

[0020] Por conseguinte, no contexto da presente invenção uma "resistência" pode ser ou total ou parcialmente; em outras palavras, os pacientes considerados tratáveis de acordo com a invenção podem apresentar uma sensibilidade reduzida ou até mesmo uma falta total de sensibilidade para os tratamentos convencionais anticâncer. Estes pacientes podem ser também determinados como "não respondedores" ou "mau respondedores".

[0021] Um outro sinônimo para um tumor ou câncer "resistente" é um tipo "refratário" de câncer, que pode também ser ou completamente ou parcialmente refratário. A resistência intrínseca pode ser, deste modo, também, determinada como um "câncer refratário primário". Uma forma particular de células de câncer refratário ou resistente como as assim chamadas "células cineticamente refratárias"; um fenômeno conhecido, por exemplo, das células de leucemia, quando as células são primeiro mortas, mas se reproduzem rapidamente em que um tratamento eficaz é quase possível.

[0022] Como usado no contexto da presente invenção o termo terapia ou tratamento "convencional" se refere a tratamento terapêutico comumente aceito e amplamente usado de um certo tipo de câncer, com base nos resultados das pesquisas anteriores e/ou aprovação reguladora.

[0023] Os fármacos anticâncer convencionais incluem agentes citotóxicos e citostáticos, que matam as células de câncer ou reduzem e/ou param seu crescimento ou proliferação. Os modos de ação destes fármacos anticâncer podem variar; os exemplos são antimetabólitos (por exemplo, citarabina, metotrexato, mercaptopurina ou clofarabina), agentes de reticulação de DNA (por exemplo, cisplatina e seus derivados), substâncias de intercalação de DNA (por exemplo, doxorrubicina), venenos de topoisomerase (por exemplo, etoposídeo), inibidores de quinase (por exemplo, cetuximab), esteroides (por exemplo, dexametasona) ou inibidores mitóticos (por exemplo, vincristina). Um exemplo para um tratamento convencional anticâncer de leucemia é a administração de doxorrubicina.

[0024] A radioterapia convencional pode também incluir a terapia por radiação, que significa o uso de radiação de alta energia dos raios x, raios alfa, beta e gama, elétrons Auger, raios Ultravioleta, nêutrons, prótons, e outras fontes para matar as células de câncer e encolher os tumores. A radiação pode originar de uma aparência do dispositivo do corpo (terapia por radiação de feixe externo), ou pode se originar de fontes radioativas colocadas no corpo na vizinhança das células de câncer (terapia por radiação interna). A terapia por radiação sistêmica usa uma substância radioativa, tal como um anticorpo monoclonal radiomarcado, que viaja na circulação sanguínea para atingir o tecido- alvo. As células de câncer radiorresistentes não ou apenas parcialmente respondem a estes tratamentos.

[0025] Como esboçado em detalhes acima, de acordo com uma modalidade da invenção opioides ou os miméticos de opioides são aplicados para superar ou "quebrar" a resistência adquirida ou intrínseca das células de câncer para tratamentos convencionais anticâncer e/ou tratamento por radiação ou resistência à apoptose. Em uma modalidade da invenção células de câncer consideradas tratáveis de acordo com a invenção expressam um receptor de opioide, em particular o receptor de opioide μ.

[0026] Em uma outra modalidade o grupo de cânceres inclui, mas não está limitado a leucemia, câncer de mama, glioblastoma, câncer de próstata, câncer de pulmão, câncer de pulmão não pequenas células (NSCLC), câncer cerebral, câncer do cólon, câncer colorretal.

[0027] Os Exemplos dos tipos de câncer, considerados serem tratáveis de acordo com a invenção, com resistência intrínseca para a irradiação são glioblastoma, o melanoma ou células de câncer do pâncreas. Câncer de mama, câncer de bexiga ou leucemia são muitas vezes resistentes a agentes quimioterápicos. Os exemplos dos tipos de câncer que muitas vezes adquirem resistência são o melanoma, carcinoma do cólon, tumores cerebrais glioblastoma, câncer cerebral, câncer pancreático, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de mama, câncer de pulmão, leucemia crônica ou osteossarcoma.

[0028] Em uma outra modalidade da invenção, os opioides ou os miméticos de opioides podem ser usados em combinação - isto é, como um composto - com tratamentos ou substâncias convencionais anticâncer, por exemplo, substâncias citostáticas ou citotóxicas ou radioterapia. Os opioides ou miméticos de opioides podem ser combinados, por exemplo, com substâncias naturais e/ou sintéticas anticâncer, substâncias citotóxicas naturais e/ou sintéticas, antibióticos, anticorpos citotóxicos, hormônios, psicofármacos, organismos naturalmente ou geneticamente modificados e substâncias dos organismos (por exemplo, plantas, micro-organismos, frutos), substâncias para dor, e/ou diferentes espécies de radiação não ligadas ou ligadas às substâncias (por exemplo, anticorpos). O paciente pode ou ser resistente ou não resistente a este tratamento.

[0029] Um "composto" significa uma preparação farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer um dos opioides ou miméticos de opioides (componente A) como definido de acordo com a invenção e pelo menos uma outra substância anticâncer (componente B). Este "composto" pode constituir uma única composição ou pelo menos duas composições, que podem ser administradas ao pacientes ou concomitantemente ou subsequentemente. As substâncias acima mencionadas são de preferência combinadas com metadona.

[0030] O composto da invenção pode ser vantajoso para o tratamento eficaz das células de câncer, uma vez que podem apresentar efeitos sinergísticos comparados às composições simples. Em particular o composto com metadona como componente A e um dos agentes como componente B como segue são possíveis: metotrexato, citarabina, cisplatina, etoposídeo, vincristina. Além do mais o tratamento combinatório também compreendendo os tratamentos por irradiação é possível.

[0031] Em uma modalidade preferida da invenção os opioides são usados para tratar cânceres não sólidos ou resistentes ou sensíveis, isto é, todas as malignidades haematológicas afetando o sangue, medula óssea e linfonodos, incluindo leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfática da célula B, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica e todas as pró-formas de leucemias, leucemia de célula pilosa, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin e mieloma múltiplo. Exemplo 1: Uso de metadona para o tratamento de células de leucemia e especialmente para o tratamento de células de leucemia, em que os fármacos anticâncer frequentemente usados nas terapias convencionais deixam de matar. Fármacos e reagentes

[0032] O cloridrato metadona D, L- (metadona, Sigma, Taufkirchen, Alemanha) foi recém-dissolvido em água destilada estéril antes de cada experiência para garantir a qualidade constante das preparações. Cultura de células

[0033] A linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide humana e CEM de linhagem de célula T de leucemia linfoblástica humana foram cultivadas em RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) contendo 10 % de soro de bezerro fetal (Biochrom, Berlin, Alemanha), HEPES a 10 mM, pH 7,3 (Biochrom), 100 U/mL de penicilina (GIBCO), 100 μg/mL de estreptomicina (GIBCO) e L-glutamina a 2 mM (Biochrom) a 37 °C e 5 % de CO2. CEMCD95R são resistentes a 1 μg/mL de anti-CD95 (Friesen e outros, 1996) e CEMDOXOR são resistentes a 0,1 μg/mL de doxorrubicina (Friesen e outros, 2004). CEMCD95R é resistente à apoptose e resistente a múltiplos fármacos. CEMCD95R é multirresistente a diversos fármacos anticâncer, tais como, metotrexato, citarabina, cisplatina, etoposídeo, vincristina e a gama- e beta-irradiação (Friesen e outros, 1996, Los e outros, 1997, Friesen e outros, 2007). Todas as linhagens de células usadas neste estudo foram livres de micoplasma. Indução de apoptose

[0034] As células de leucemia (1 x 105 células/mL) foram tratadas com metadona a 30, 20, 15, 10 μM em frascos de 150 mL ou em placas de 96 poços. Após 24 horas e 48 horas, a quantificação de apoptose foi medida por meio de fluxo de citometria como descrito (Carbonari e outros, 1994, Friesen e outros, 2003). Em resumo, para determinar a apoptose, as células foram lisadas com tampão Nicoletti contendo 0,1 % de citrato de sódio mais 0,1 % de Triton X-100 e iodeto de propídio de 50 μg/mL como descrito por Nicoletti e outros, (1991). A porcentagem das células apoptóticas foi medida por meio de análise de FSC/SSC ou de DNA hipodiploide (subG1) (Nicoletti e outros, 1991, Carbonari e outros, 1994). Os núcleos coloridos do iodeto de propídio (PI) ou os perfis da dispersão dianteira/dispersão lateral (FSC/SSC) das células foram analisados por meio de fluxo de citometria (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha). Isolamento de linfócitos do sangue periférico

[0035] Os linfócitos do sangue periférico (PBLs) foram isolados do sangue fresco de pessoas saudáveis. Os PBLs (1 x 106 célula em 1 mL) foram tratados com metadona a 30, 20, 15, 10 μM em placas de 96 poços. Após 24 horas e 48 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de fluxo de citometria como descrito (Carbonari e outros, 1994). Inibição de metadona induzida por ativação de caspase por meio de zVAD.fmk

[0036] A inibição da ativação de caspase foi realizada como previamente descrito (Friesen e outros, 2007). Em resumo, o tripeptídeo de amplo espectro inibidor de caspases zVAD.fmk (benzoilcarbonil-Val-Ala-Asp-fluorometil cetona, Enzyme Systems Products, Dubli, USA) foi usado em uma concentração de 50 μmols/L. As células HL-60 e CEM foram pré-incubadas com zVAD.fmk 1 hora antes do tratamento com metadona. Após 24 horas e 48 horas a porcentagem das células apoptóticas foi medida por meio de análise de FSC/SSC ou DNA hipodiploide (subG1). Os núcleos coloridos do iodeto de propídio (PI) (Nicoletti e outros, 1991) ou os perfis da dispersão dianteira/dispersão lateral (FSC/SSC) das células (Carbonari e outros, 1994) foram analisados por meio de fluxo de citometria (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha). Análise Western blot

[0037] As análises Western blot foram feitas como descrito (Friesen e outros, 2004, Friesen e outros, 2003). A imunodetecção de PARP, caspase-3, caspase-9, caspase-8, XIAP, CD95, CD95-L, Bax, Bcl-XL e β-actina foi feita usando anticorpo policlonal de coelho anti- PARP (1:5000, Roche), anticorpo monoclonal de anti-caspase-3 do camundongo (1:1000, Cell-Signalling), anticorpo monoclonal de anticaspase-8 do camundongo (1:1000, Cell-Signalling), anticorpo policlonal de anti-caspase-9 ativo do coelho (1:1000, Cell-Signalling), anticorpo monoclonal anti-XIAp do camundongo (1:1000, Transduction-Laboratories, Lexington, Kentucky), anticorpo monoclonal anti-Fas do camundongo (anti-CD95) (1:1000, Transduction-Laboratories), anticorpo monoclonal ligando anti-Faz do camundongo (ligando anti-CD95) (1:250, BD, Pharmingen), anticorpo policlonal anti-Bax do coelho (1:250, Oncogene, Cambridge), anticorpo policlonal anti-Bcl-XS/L do coelho (1:1000, Santa-Cruz-Biotechnology, Santa-Cruz, CA), anticorpo policlonal anti-p21 do coelho (1:1000, Santa-Cruz), e anticorpo monoclonal anti-β-actina do camundongo (Sigma). IgG anti-camundongo de cabra conjugado com peroxidase ou IgG anticoelho de cabra conjugado com peroxidase (1:5000, SantaCruz) quando o anticorpo secundário foi usado para o sistema realçado de quimioluminescência (ECL, Amersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha). Igualmente a sobrecarga da proteína foi controlada por meio de detecção de β-actina.

[0038] Metadona induz a morte de células nas células de leucemia CEM e HL-60 através do apoptose com efeitos não tóxicos nas PBLs não leucêmicas

[0039] Nas leucemias e nos tumores sólidos os fármacos anticâncer foram mostrados para induzir o apoptose e para inibir a proliferação (Kaufmann & Earnshaw 2000). Por esse motivo, foi analisado se a metadona do fármaco opioide terapêutico pode, da mesma forma, inibir a proliferação e provocar o apoptose na CEM de linhagem de célula T de leucemia linfoblástica humana e a linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide humana comparável a fármacos anticâncer estabelecidos bem conhecidos (figura 1A, B). 24 horas e 48 horas após o tratamento com diferentes concentrações de metadona (30, 20, 15, 10 μM) uma forte indução de apoptose (figura 1A) e uma forte inibição do crescimento (figura 1B) foram detectadas nas células CEM e HL-60. Foi a seguir analisado se a metadona induz a apoptose também nos linfócitos do sangue periférico não leucêmicos (PBLs) (figura 1C). Os PBLs isolados foram incubados com diferentes concentrações de metadona (30, 20, 15, 10 μM). 24 horas e 48 horas após o tratamento com metadona foi constatado que a metadona não poderia matar os PBLs nas concentrações comparáveis usando para o tratamento de células de leucemia, tal como, CEM (figura 1C). Isto demonstra que a metadona induz a apoptose nas células de leucemia com efeitos não tóxicos nos PBLs não leucêmicos. Metadona quebra a resistência à doxorrubicina, resistência a CD95, e resistência a múltiplos fármacos nas células de leucemia

[0040] A resistência aos fármacos anticâncer é um fator de limitação no tratamento de pacientes com tumor e leucemia (Bergman & Harris 1997, Friesen e outros, 2003). Tem sido constatado que a metadona apresenta uma potente atividade antileucêmica e eficazmente mata células de leucemia. Por esse motivo foi analisado se a metadona pode também induzir a morte celular nas células de leucemia resistentes à doxorrubicina, as quais eram resistentes à apoptose. As células de leucemia CEM resistentes àdoxorrubicina (CEMDoxoR) foram tratadas com diferentes concentrações de metadona (30, 20, 15, 10 μM). 24 horas e 48 horas após o tratamento com metadona, a morte celular foi medida por meio de fluxo de citometria. Após o tratamento com metadona a 30, 20, 15 μM, uma forte indução de apoptose foi medida nas células CEMDoxoR resistentes a doxorrubicina, que foi similar àquela nas células CEM de leucemia sensíveis (figura 2), indicando que a metadona supera a resistência à doxorrubicina e a resistência à apoptose.

[0041] Foi a seguir examinado se a metadona pode também matar as células de leucemia, as quais eram resistentes a múltiplos fármacos. Por esse motivo as células CEMCD95R de leucemia resistentes a CD95, as quais eram resistentes a diversos fármacos anticâncer, tais como, etoposídeo, cisplatina, metotrexato, citarabina, doxorrubicina, vincristina, foram tratadas com diferentes concentrações de metadona (30, 20, 15, 10 μM). Após o tratamento com metadona a 30, 20, 15 μM, uma forte indução de apoptose nas células CEMCD95R de leucemia resistentes a CD95 foi medida após 24 horas e 48 horas, que foi similar àquela nas células CEM de leucemia sensíveis (figura 2). Isto sugere que a metadona induz não apenas uma forte indução de apoptose nas células de leucemia sensíveis, mas também matam as células de leucemia resistentes a doxorrubicina- e CD95-, que frequentemente empregam os fármacos anticâncer que deixam de matar (Friesen e outros, 1996, Los e outros, 1997). A metadona induz a morte celular dependente de caspases e ativa as mitocôndrias em células de leucemia sensíveis, resistentes à doxorrubicina, resistentes a CD95 e resistentes a multi-fármacos

[0042] A metadona induz a apoptose nas células de leucemia resistentes e sensíveis com não conhecimento dos mecanismos moleculares. Por esse motivo, o mecanismo e as moléculas efetoras que podem ser alterados por meio da morte celular da metadona ativada nas células de leucemia foram para serem examinados.

[0043] As caspases desempenham um papel crítico na indução de apoptose por meio de fármacos anticâncer (Kaufmann & Earnshow 2000, Hengartner 2000). Por esse motivo, a análise Western blot foi usada para examinar se a metadona ativa a caspase nas células de leucemia HL-60 e CEM, assim como, nas células de leucemia resistentes à doxorrubicina CEMDoxoR, as quais eram resistentes à apoptose e nas células de leucemia CEMCD95R resistentes a CD95-, as quais eram resistentes a múltiplos fármacos e resistente à apoptose. Após o tratamento com diferentes concentrações de caspase-3 metadona (20, 15 μM) e PARP foram divididas em células de leucemia HL-60 e CEM (figura 3A) assim como nas células de leucemia resistentes à doxorrubicina CEMDoxoR e nas células de leucemia CEMCD95R resistentes a CD95-(figura 3B). A ativação de caspase-8, em que os fármacos anticâncer têm demonstrado induzir nas células de leucemia, não foi constatada após o tratamento com metadona. Para investigar o papel crítico da metadona na ativação de caspases, as células CEM e HL-60 foram pré-incubadas com o inibidor de caspases zVAD.fmk de amplo espectro. A incubação com zVAD.fmk quase completamente inibiu a apoptose induzida por metadona (figura 3C) sugerindo que as caspases são centrais para a apoptose induzida por metadona nas células de leucemia.

[0044] Os fármacos anticâncer foram mostrados ativar a série de reações mitocondriais assim como a série de reações de ligante/receptor em células de leucemia e tumor (Kaufmann & Earnshow 2000). Foi investigado se as mitocôndrias poderiam também desempenhar um papel de apoptose induzida por metadona nas células de leucemia. As células de leucemia CEM, HL-60, CEMDoxoR resistentes à doxorrubicina e células de leucemia CEMCD95R resistentes à CD95 foram tratadas com diferentes concentrações de metadona (20, 15 μM) (figura 4). Após 24 horas e 48 horas uma forte clivagem (fragmento de 37 kDa) de caspase-9 e uma forte sub-regulagem da caspase inibindo a proteína XIAP (proteína inibitória de apoptose ligada por X) foram constatadas nas células de leucemia HL-60 e CEM (figura 4A) assim como nas células de leucemia resistentes à doxorrubicina CEMDoxoR e nas células de leucemia CEMCD95R resistentes a CD95 (figura 4B), que foram resistentes a múltiplos fármacos e à apoptose.

[0045] As alterações mitocondriais são reguladas por meio dos membros da famíllia pró- e antiapoptótica. Após 24 horas e 48 horas uma forte sub-regulagem de Bcl-xL foi constatada em HL-60 e em células CEM de leucemia (figura 4A) assim como nas células CEMCD95R de leucemia resistentes à doxorrubicina e em células de leucemia CD-95 CEMDoxoR resistentes (figura 4B) após o tratamento com diferentes concentrações de metadona (20, 15 μM). Até a regulação de Bax não foi constatada após o tratamento com metadona nas células de leucemia.

[0046] Não obstante, até a regulação de ligantes de indução de morte e receptores de indução de morte, tais como, CD95, em que os fármacos anticâncer têm se mostrado regulares, não foi constatado após o tratamento com metadona nas células de leucemia (dados não mostrados). Isto indica que a metadona induz a apoptose diretamente por meio da ativação da série de reações mitocondriais intrínsecas nas células sensíveis assim como nas de leucemia resistentes. Exemplo 2: A metadona induz a apoptose nas células de glioblastoma

[0047] O glioblastoma é o mais agressivo e o mais comum tipo de tumores cerebrais primários. As células de glioblastoma são conhecidas por serem altamente resistentes a agentes quimioterápicos e irradiação. O tratamento pode envolver a quimioterapia e a radioterapia, mas estas medidas são apenas paliativas e não fornecem a cura. Além do mais, muitos fármacos não podem atravessar a barreira hematoencefálica e são, por esse motivo, inúteis no tratamento de glioblastoma. A metadona é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica. O efeito da metadona nas células de glioblastoma foi examinado. Não obstante, o efeito da metadona em combinação com as concentrações terapêuticas de doxorrubicina nas células de glioblastoma foi testado.

[0048] A linhagem de célula de glioblastoma humana A172 foi cultivada em DMEN (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) contendo 10 % de soro de bezerro fetal (Biochrom, Berlin, Alemanha), HEPES a 10 mM, pH 7,3 (Biochrom), 100 U/mL de penicilina (Invitrogen), 100 μg/mL de estreptomicina (Invitrogen) e L-glutamina a 2mM (Biochrom) a 37 °C e 5 % de CO2.

[0049] Antes do tratamento com metadona, as células de glioblastoma foram semeadas em uma densidade de 7000 células/cm2 e o tratamento foi realizado 24 horas após a semeadura da célula.

[0050] As células de glioblastoma A172 (7000 células/cm2) foram tratadas com 30, 20 μg/mL de metadona em frascos de 75 cm2. Após 120 horas, 144 horas e 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de fluxo de citometria. Para determinar a apoptose, as células foram lisadas com tampão de Nicoletti contendo 0,1 % de citrato de sódio mais 0,1 % de Triton X-100 e iodeto de propídio de 50 μg/mL. Os núcleos coloridos de iodeto de propídio (PI) foram analisados por meio de fluxo de citometria (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha).

[0051] Após 120 horas, 144 horas e 168 horas, as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como segue: 100 x (experimentalmente células mortas (%) - células mortas espontâneas no meio celular (%) /(100% - células mortas espontâneas no meio (%)). O tratamento com metadona resultou em mais do que 20% células mortas após 120 horas e mais do que 80% células mortas após 168 horas após o tratamento com 20 μg/mL metadona. O tratamento com metadona resultou em mais do que 85 % das células mortas após 120 horas e quase 100 % das células mortas após 168 horas após o tratamento com 30 μg/mL de metadona (figura 5). Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. Isto demonstra que metadona induz a elevadas taxas de apoptose nas células de glioblastoma. Exemplo 3: Metadona mostra os efeitos sinergísticos em combinação com doxorrubicina para a indução de apoptose nas células de glioblastoma

[0052] As células de glioblastoma A172 (7000 células/cm2) foram tratadas com uma concentração terapêutica de 0,1 μg/mL de doxorrubicina (doxorrubicina, colunas brancas), com uma baixa concentração de 1 μg/mL de metadona (metadona, colunas pretas), e com 0,1 μg/mL de doxorrubicina na adição de 1 μg/mL de metadona (doxorrubicina + metadona, colunas tracejadas). Após 72 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de fluxo de citometria. Para determinar a apoptose, as células foram lisadas com tampão Nicoletti contendo 0,1 % de citrato de sódio mais 0,1 % de Triton X100 e 50 μg/mL de iodeto de propídio. Os núcleos coloridos de iodeto de propídio (PI) foram analisados por meio de citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha).

[0053] A combinação de uma concentração terapêutica de doxorrubicina com baixas concentrações de metadona tiveram um forte efeito apoptótico nas células testadas de glioblastoma (figura 6). Este teste mostra que a metadona revela os efeitos sinergísticos quando aplicada juntamente com outros agentes quimioterápicos, aqui doxorrubicina. Exemplo 4: Indução de apoptose nas células de leucemia empregando cocaína

[0054] As células CEM (coluna branca) e HL-60 (coluna preta) foram tratadas com 1000 μg/mL de cocaína. Após 48 horas as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como segue: 100 x (células mortas experimentais (%) - células mortas espontâneas no meio (%)) /(100 % - células mortas espontâneas no meio (%)). Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10%. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes.

[0055] Os resultados indicam que cocaína é capaz de induzir a apoptose nas células CEM, como mostrado na figura 7. Exemplo 5: Indução de apoptose nas células de câncer isoladas dos pacientes ex vivo usando D,L-metadona exclusivamente ou em combinação com fludarabina

[0056] As células B-ALL (leucemia linfática da Célula B) e CLL (leucemia linfática crônica) foram isoladas dos pacientes ex vivo. Estas células foram tratadas com diferentes concentrações de D,L-metadona ou D,L-metadona na adição de fludarabina.

[0057] Em um primeiro estudo, as células B-ALL (leucemia linfática da Célula B) (50000 células/100 μL) foram tratadas com metadona a 30, 20, 15, 10 μM. Após 48 horas e 72 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Os resultados indicam que metadona a quase 10 μM foi suficiente para induzir a apoptose em até mais de 80 % das células tratadas durante 72 horas (vide figura 8).

[0058] Em um segundo estudo, as células CLL (leucemia linfática crônica) (50000 células/200 μL) foram tratadas com 30, 10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3 e 0,1 μg/mL de metadona exclusivamente ou na adição de fludarabina a 0,1 μM. Após 24 horas e 48 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Os resultados indicam que apoptose foi induzida em 100 % das células quase após 24 horas, quando combinando 3 μg/mL de metadona com fludarabina a 0,1 μM (vide figura 9).

[0059] Em um terceiro estudo, células CLL (leucemia linfática crônica) (50000 células/200 μL) foram tratadas com 30, 10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de metadona exclusivamente ou na adição de fludarabina a 0,1 μM. Após 24 horas e 48 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Os resultados indicaram que apoptose foi induzida em quase 50 % das células após 48 horas, quando combinando 3 μg/mL de metadona com fludarabina a 0,1 μM. A apoptose foi induzida em mais do que 90 % das células após 48 horas, quando combinando 30 μg/mL de metadona com fludarabina a 0,1 μM (vide figura 10).

[0060] Deste modo, como sugerido pelos estudos, metadona exclusivamente ou em combinação com um tratamento citostático é bem-sucedida nas células de câncer isoladas dos pacientes ex vivo. Exemplo 6: Indução de apoptose nas células de leucemia usando buprenorfina em combinação com doxorrubicina

[0061] A buprenorfina foi usada sucessivamente em combinação com doxorrubicina para induzir a apoptose nas células de leucemia HL-60 in vitro. A buprenorfina é um fármaco opioide semissintético, também usado como analgésico. Ela é um agonista receptor de opioide.

[0062] A linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de buprenorfina exclusivamente ou na adição de 0,003 μg/mL ou 0,001μg/mL de doxorrubicina. Após 144 horas ou 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo.

[0063] Os resultados indicaram que 20 μg/mL de buprenorfina foram suficientes para induzir apoptose em mais do que 90% das células após 144 horas. O mesmo resultado foi obtido quando adicionando 0,003 μg/mL de doxorrubicina. A apoptose foi induzida em quase 100 % das células quando combinando 10 μg/mL de buprenorfina com 0,003 μg/mL de doxorrubicina e incubanando as células durante 168 horas (vide figura 13).

[0064] Exemplo 7: Indução de apoptose nas células de leucemia usando fentanila em combinação com doxorrubicina

[0065] A fentanila foi usada sucessivamente em combinação com a doxorrubicina para induzir a apoptose nas células de leucemia CEM in vitro. A fentanila é um opioide sintético, que é frequentemente usado como analgésico no tratamento de dor do câncer. A fentanila é um agonista receptor de opioide μ.

[0066] A linhagem de célula CEM de leucemia da célula T humana (10000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3,1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de fentanila exclusivamente ou na adição de 0,02 μg/mL de doxorrubicina. Após 48 horas e 72 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo.

[0067] Os resultados indicaram que fentanila sucessivamente induziu apoptose em mais do que 85 % das células após 72 horas, quando combinando 30 μg/mL de fentanila com 0,02 μg/mL de doxorrubicina (vide figura 14). Exemplo 8: Indução de apoptose nas células de leucemia usando morfina

[0068] A morfina foi usada sucessivamente sozinha e em combinação com doxorrubicina para a indução de apoptose nas células de leucemia HL-60. A morfina é um opiáceo que é comumente usado como analgésico no tratamento de dor do câncer. A morfina é um agonista do receptor de opioide μ.

[0069] Em um primeiro estudo, as células HL-60 de leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foram tratadas com 30,10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 μg/mL de morfina. Após 120 horas ou 144 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Os resultados indicaram que após 144 horas a apoptose foi induzida em 40 % das células quando aplicando 40 μg /mL de morfina, vide, figura 15).

[0070] Em um segundo estudo, as células HL-60 de leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foram tratadas com 1, 0,5, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 μg/mL de morfina. Após 96 horas, 120 horas, 144 horas e 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Os resultados indicaram que após 168 horas a apoptose foi induzida em mais do que 50 % das células, quando aplicando 1 μg/mL de morfina (vide figura 16).

[0071] Em um terceiro estudo, as células HL-60 de leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foram tratadas com 30,10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de morfina somente ou em adição de 0,003 μg/mL ou 0,001 μg/mL de doxorrubicina. Após 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Os resultados indicam que apoptose foi induzida em 50 % das células quando aplicando 1 μg/mL de morfina em combinação com 0,001 μg/mL de doxorrubicina (vide figura 17).

[0072] Deste modo, como sugerido por estes estudos, o opiáceo e a morfina agonista do receptor μ podem ser usados sucessivamente para induzir a apoptose nas células de leucemia.

[0073] A literatura a seguir citada aqui é incorporada por referência: Bergmann JP, Harris D. Radioresistance, chemoresistance and apoptosis resistance. Radiation Oncology 1997; 27:47-57. Carbonari M, Cibati M, Cherchi M, e outros, Detection and characterization of apoptotic peripheral blood lymphocytes in human immunodeficiency virus-infection and cancer chemotherapy by a novel flow immunocytometric method. Blood 1994; 83:1268-77. Friesen C, Glatting G, Koop B, e outros, Breaking chemo- and radioresistance with [213Bi]anti-CD45 antibodies in leukaemia cells. Cancer Res 2007; 67(5):1950-8. Friesen C, Herr I, Krammer PH, Debatin KM. Involvement of the CD95 (APO-1/FAS) receptor/ligand system in drug-induced apoptosis in leukaemia cells. Nat Med 1996; 2(5):574-7. Friesen C, Kiess Y, Debatin KM. A critical role of glutathione in determining apoptosis sensitivity and resistance in leukaemia cells. Cell Death Differ 2004; 11(Suppl 1):S73-85. Friesen C, Lubatschofski A, Kotzerke J, Buchmann I, Reske SN, Debatin KM. Beta-irradiation used for systemic radioimmunotherapy induces apoptosis and activates apoptosis pathways in leukaemia cells. Eur J Nucl Med 2003; 30:1251-61. Hatsukari I, Hitosugi N, Matsumoto I, Nagasaka H, Sakagami H. Induction of early apoptosis marker by morphine in human lung and breast carcinoma cell lines. Anticancer Res. 2003 May-Jun; 23(3B):2413-7. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000; 407(6805):770-6. Heusch WL, Maneckjee R. Effects of bombesin on methadone-induced apoptosis in lung cancer cells. Cancer Lett 1999; 136:177-85. Kaufmann SH, Earnshaw WC. Induction of apoptosis by cancer therapy. Experimental Cell Research 2000; 256: 42-9. Los M, Herr I, Friesen C, Fulda S, Schulze-Osthoff K, Debatin K-M. Cross-resistance of CD95- and drug-induced apoptosis as a consequence of deficient activation of caspases (ICE/Ced-3 proteases). Blood 1997; 90(8):3118-29. Milas L, Raju U, Liao Z, Ajani J. Targeting molecular determinants of tumour chemo-radioresistance. Semin Oncol 2005; 32:78-81. Nicoletti I, Migliorati G, Pagliacci MC, Grignani F, Riccardi C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Meth 1991;139:271-9. Polakiewicz RD, Schieferl SM, Gingras AC, Sonenberg N, Comb MJ. Mu-Opioid receptor activates signalling pathways implicated in cell survival and translational control. J Biol Chem. 1998 Sep 4; 273(36):23534-41. Figuras Figura 1:

[0074] a figura 1 indica que a metadona opioide eficazmente induz a apoptose nas células de leucemia, mas não afeta as células saudáveis PBL não leucêmicas. 1A: As células CEM e HL-60 foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado. Após 24 horas (barras brancas) e 48 horas (barras pretas) as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como segue: 100 x (células mortas experimentais (%) - células mortas espontâneas no meio (%)) /(100 % - células mortas espontâneas no meio (%)). Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio padrão (SD) de menos do que 10 %. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. 18: As células CEM e HL-60 (2 x 105 células/mL) foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado ou depositadas não tratadas (Co, controle). Após 0 hora (barras brancas), 24 horas (barras pretas) e 48 horas (barras tracejadas) o número de células em 1 mL foi contado. Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10%. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. 1C: células CEM (barras pretas) e PBLs (barras brancas) foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado. Após 24 horas e 48 horas as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como descrito na figura 1A. Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10 %. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. Figura 2:

[0075] a figura 2 mostra que a metadona opioide induz a apoptose nas células resistentes a CD95 (CEMCD95R) e nas resistentes à doxorrubicina (CEMDoxoR) com taxas de apoptose comparáveis às de leucemia de origem sensíveis CEM.

[0076] As células de leucemia CEM (barras pretas), CEMCD95R (barras brancas) e CEMDoxoR (barras tracejadas) foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado. Após 24 horas e 48 horas as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio da análise de hipodiploide de DNA. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como descrito na figura 1A. Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10 %. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. Figura 3:

[0077] a figura 3 mostra que a metadona opioide induz a morte dependente de caspase nas células de leucemia sensíveis (HL-60, CEM), nas resistentes à doxorrubicina (CEMDoxoR) e nas resistentes a CD95 (CEMCD95R), as quais eram resistentes a múltiplos fármacos e resistentes à apoptose. 3A: e 3B: Metadona induzida por ativação de clivagem de caspase-3 e PARP nas células HL-60, CEM, CEMDoxoR e CEMCD95R. As células A, HL-60, CEM, B, CEMDoxoR, CEMCD95R foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado ou depositadas não tratadas (Controle). Após 24 horas e 48 horas análises Western blot para caspase-3 e PARP foram realizadas. O fragmento ativo de caspase-3 foi detectado a ~19 e 17 kDa e o produto dividido de PARP a ~ 85 kDa. Igualmente a sobrecarga da proteína foi controlada por meio de anticorpo de ação anti-beta 3C: Inibição da ativação de caspase com blocos de zVAD.fmk de apoptose induzida por metadona nas células CEM e HL- 60. As células CEM e HL-60 foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado na ausência (barras pretas, meio) ou presença (barras brancas, zVAD.fmk a 50 μM) de zVAD.fmk a 50 μM. Após 48 horas as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como descrito na figura 1A. Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10 %. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. Figura 4:

[0078] a figura 4 mostra que a metadona opioide ativa a série de reações mitocondriais nas células de leucemia sensíveis (HL-60, CEM), nas resistentes à doxorrubicina (CEMDoxoR) e nas resistentes a CD95 (CEMCD95R), as quais eram resistentes a múltiplos fármacos e resistente à apoptose. 4A e 4B: A ativação induzida por metadona de caspase-9, sub-regulagem de XIAP e sub-regulagem de células Bcl-xL em HL-60, CEM, CEMDoxoR e CEMCD95R.

[0079] As células HL-60, CEM (4A), CEMDoxoR, CEMCD95R (4B) foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado ou depositadas não tratadas (Controle). Após 24 horas e 48 horas análises Western blot para caspase-9, XIAP, e Bcl-xL foram realizadas. O framento ativo de caspase-9 foi detectado a ~37 kDa, XIAP foi detectado a ~58 kDa e Bcl-xL foi detectado a ~30 kDa. Igualmente a sobrecarga da proteína foi controlada por meio de anticorpo de ação anti-beta. Figura 5:

[0080] A figura 5 indica que a metadona opioide induz a apoptose nas células de glioblastoma.

[0081] As células de glioblastoma A172 foram tratadas com diferentes concentrações de metadona como indicado. Após 120 horas (colunas brancas), 144 horas (colunas pretas) e 168 horas (colunas tracejadas) as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide.

[0082] A porcentagem da morte celular específica foi calculada como segue: 100 x (células mortas experimentais (%) - células mortas espontâneas no meio (%)) /(100 % - células mortas espontâneas no meio (%)). Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10 %. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. Figura 6:

[0083] a figura 6 indica que a apoptose pode ser sucessivamente induzida nas células de glioblastoma por usar a combinação de concentrações terapêuticas de doxorrubicina e baixas concentrações de metadona.

[0084] As células glioblastoma A172 (7000 céluas/cm2) foram tratadas com uma concentração terapêutica de 0,1 μg/mL de doxorrubicina (doxorrubicina, colunas brancas), com uma baixa concentação de 1 μg/mL de metadona (metadona, colunas pretas), e com 0,1 μg/mL de doxorrubicina na adição de 1 μg/mL de metadona (doxorrubicina + metadona, colunas tracejadas). Após 72 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Para determinar a apoptose, as células foram lisadas com tampão Nicoletti contendo 0,1 % de citrato de sódio mais 0,1 % de Triton X100 e 50 μg/mL de iodeto de propídio. Os núcleos coloridos de iodeto de propídio (PI) foram analisados por meio de citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton Dickinson, Heidelberg, Alemanha). Figura 7:

[0085] A figura 7 indica que a apoptose pode ser sucessivamente induzida nas células CEM, empregando a cocaína opioide.

[0086] As células CEM (coluna branca) e HL-60 (coluna preta) foram tratadas com 1000 μg/mL de cocaína. Após 48 horas as porcentagens das células apoptóticas foram medidas por meio de análise de DNA hipodiploide. A porcentagem da morte celular específica foi calculada como segue: 100 x (células mortas experimentais (%) - células mortas espontâneas no meio (%)) /(100 % - células mortas espontâneas no meio (%)). Os dados são apresentados como média das triplicatas com um desvio-padrão (SD) de menos do que 10 %. Os resultados similares foram obtidos em três experiências independentes. Figura 8:

[0087] a figura 8 indica que D,L-metadona induz a morte celular nas céulas pré B-ALL (leucemia linfática da Célula B) isoladas dos pacientes ex vivo.

[0088] As células B-ALL (leucemia linfática da Célula B) (50000 células/100 μL) foram tratadas com metadona 30, 20, 15, 10 μM. Após 48 horas (barras pretas) e 72 horas (barras brancas) a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 9:

[0089] a figura 9 indica que D,L-metadona em combinação com fludarabina induz a morte celular nas células CLL resistentes (leucemia linfática crônica) isoladas dos pacientes ex vivo. As células CLL (leucemia linfática crônica) (50000 células/200 μL) foram tratadas com 30, 10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de metadona exclusivamente (barras brancas) ou na adição de fludarabina a 0,1 μM (barras pretas). Após 24 horas e 48 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo.

[0090] Figura 10:

[0091] A figura 10 indica que D,L-metadona em combinação com fludarabina induz a morte celular nas células CLL resistentes (leucemia linfática crônica) isoladas dos pacientes ex vivo.

[0092] As células CLL (leucemia linfática crônica) (50000 células/200 μL) foram tratadas com 30, 10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de metadona exclusivamente (barras brancas) ou na adição de fludarabina a 0,1 μM (barras pretas). Após 24 horas e 48 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 11:

[0093] A figura 11 mostra a indução de apoptose na linhagem de célula da leucemia da célula BB humana Tanoue tratada com doxorrubicina + metadona in vitro.

[0094] A linhagem de célula B-ALL (leucemia linfática da Célula B) Tanoue (5000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3, 1 μg/mL de metadona exclusivamente (barras brancas) ou na adição de 0,03 μg/mL de doxorrubicina (barras pretas). Após 96 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 12:

[0095] A figura 12 mostra a indução de apoptose na linhagem de célula de leucemia precursora da célula B humana Nalm6 tratada com doxorrubicina + metadona in vitro.

[0096] A linhagem de célula B-ALL (leucemia linfática da Célula B) Nalm6 (5000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3, 1 μg/mL de metadona exclusivamente (barras brancas) ou na adição de 0,01 μg/mL doxorrubicina (barras pretas). Após 96h, 120 horas, 144 horas, 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 13:

[0097] A figura 13 mostra a indução de apoptose na linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide aguda humana tratada com doxorrubicina + buprenorfina in vitro.

[0098] A linhagem de célula HL-60 leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de buprenorfina exclusivamente (barras brancas) ou na adição de 0,003 μg/mL ou 0,001μg/mL de doxorrubicina (barras pretas). Após 144 horas ou 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 14:

[0099] A figura 14 mostra a indução de apoptose linhagem da célula de leucemia CEM da célula T humana tratada com doxorrubicina + fentanila in vitro.

[00100] A linhagem de célula da célula CEM de leucemia T (10000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3,1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL fentanila exclusivamente (barras brancas) ou na adição de 0,02 μg/mL de doxorrubicina (barras pretas). Após 48 horas e 72 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. figura 15:

[00101] A figura 15 mostra a indução de apoptose na linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide aguda humana tratada com morfina in vitro.

[00102] A linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 μg/mL de morfina. Após 120 horas (barras brancas) ou 144 horas (barras pretas) a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 16:

[00103] A figura 16 mostra a indução de apoptose na linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide aguda humana tratada com morfina in vitro.

[00104] A linhagem de célula HL-60 de leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foi tratada com 1, 0,5, 0,3, 0,1, 0,03, 0,01 μg/mL de morfina. Após 96 horas (barras brancas), 120 horas (barras pretas), 144 horas (barras tracejadas) e 168 horas (barras cinzenta) a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo. Figura 17:

[00105] A figura 17 mostra a indução de apoptose na HL-60 da leucemia mieloide aguda humana tratada com doxorrubicina + morfina in vitro.

[00106] A linhagem de célula HL-60 leucemia mieloide aguda humana (5000 células/100 μL) foi tratada com 30,10, 5, 3, 1, 0,5, 0,3, 0,1 μg/mL de morfina exclusivamente (barras brancas) ou na adição de 0,003 μg/mL (barras pretas) ou 0,001 μg/mL doxorrubicina (barras cinzentas). Após 168 horas a quantificação de apoptose foi medida por meio de citometria de fluxo.

Claims

1. Uso de opioides capazes de inibir a proliferação de células cancerígenas, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um fármaco para tratamento de pacientes com câncer resistente, sendo que os ditos opioides são selecionados do grupo consistindo em morfina, di-hidrocodeína, codeína, tebaína, hidromorfona, hidrocodona, oxicodona, oximorfona, nicomorfina, dipropanoilmorfina, benzilmorfina, etilmorfina, fentanila, petidina, metadona, tramadol, propoxifeno, endorfinas, dinorfinas e encefalinas, e sendo que os pacientes sofrem de um dos seguintes cânceres: leucemia, câncer cerebral, melanoma, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de bexiga, carcinoma do cólon, câncer de fígado, câncer ovariano, câncer de mama, câncer de pulmão, leucemia crônica ou osteossarcoma.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o paciente com câncer apresenta pelo menos uma resistência do grupo que segue: resistência à apoptose, quimiorresistência, radiorresistência.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o paciente apresenta ou uma resistência adquirida ou uma intrínseca.

4. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o paciente apresenta uma ou mais das resistências subsequentes: i. resistência à apoptose ii. resistência a múltiplos fármacos iii. resistência a fármaco anticâncer iv. resistência a fármaco citotóxico v. resistência a espécies de oxigênio reativo vi. resistência a agentes causando lesão ao DNA vii. resistência a anticorpos tóxicos viii. resistência à doxorrubicina ix. única ou multirresistência, em particular a uma ou mais das seguintes substâncias fármaco: metotrexato, citarabina, cisplatina, etoposídeo, vincristina, paclitaxel (taxol), carboplatina, teniposídeo, dexametasona, prednisolona, ciclofosfamida, ifosfamida, doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina, mercaptopurina, fludarabina, 5-fluorouracila. x. Resistência à irradiação (por exemplo, elétrons Auger, alfa, beta ou gama).

5. Uso de opioides, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um fármaco para tratamento de tumores não sólidos do grupo consistindo em leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfática da célula B, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crônica, leucemia linfocítica crônica, pró-formas de leucemias, leucemia de célula pilosa, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin e mieloma múltiplo.

6. Uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o referido opioide ou é capaz de induzir a série de reações mitocondriais de apoptose nas células de câncer.

7. Uso, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o referido opioide é capaz de induzir a apoptose por meio de pelo menos uma das reações que seguem: i. clivagem de caspase-3 e PARP na célula de tumor ii. clivagem de caspase-9 e sub-regulagem de XIAP iii. sub-regulagem de BclXL..

8. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido opioide pertence ao grupo da metadona.

9. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 8, caracterizado pelo fato de que o referido opioide é a forma de cloridrato de D-/L-metadona.

10. Uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido opioide é selecionado a partir do grupo consistindo em fentanila, buprenorfina e morfina.

11. Combinação farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de: um opioide (componente A), e pelo menos um agente anticâncer adicional (componente B), o qual é selecionado a partir do grupo consistindo em metotrexato, citarabina, cisplatina, etoposídeo, vincristina, especialmente doxorrubicina, irradiação beta ou irradiação gama.