BRPI0906128A2 - molécula de ácido nucléico isolada, construção gênica, vetor, célula transgênica, método para obtenção de uma célula e de uma planta transgênica, polipeptìdeo isolado e purificado, composição pesticida biodegradável, método para o controle de uma praga, método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga - Google Patents

Abstract

MOLéCULA DE áCIDO NUCLéICO ISOLADA, CONSTRUçãO GêNICA, VETOR, CéLULA TRANSGêNICA, MéTODO PARA OBTENçãO DE UMA CéLULA E DE UMA PLANTA TRANSGêNICA, POLIPEPTìDEO ISOLADO E PURIFICADO, COMPOSIçãO PESTICIDA BIODEGRADáVEL, MéTODO PARA O CONTROLE DE UMA PRAGA, MéTODO DE OBTENçãO DE LINHAGENS TRANSGêNICAS RESISTENTES A UM INSETO PRAGA.A presente invenção pertence a um novo composto inseticida derivado de uma linhagem de Bacilius thuringiensis e refere-se ao campo de controle de pragas de plantas, particularmente ao controle do bicudo-do-algodoeiro - Anthonomus grandis. Mais especificamente, o objeto da invenção refere-se a um novo gene para uma nova delta-endotoxina designada Cry8Ha e a clonagem e expressão em Escherichia coli do gene que codifica para a proteína Cry8Ha. São fornecidas a seqúência nucleotídica e protéica codificadora da nova delta-endotoxina, vetores recombinantes e células hospedeiras. São ainda fornecidos processos e meios para a produção recombinante e o uso da nova delta-endotoxina para aplicação no controle do bicudo-do-algodoeiro. Adicionalmente, a invenção também fornece um gene sintético otimizado para expressão em plantas de algodão. Usando o gene aqui descrito, é possível a transformação de plantas, a partir das técnicas conhecidas pelos especialistas na área, para a expressão da endotoxina ativa contra o bicudo-do-algodoeiro.

Description

Relatório de Patente de Invenção: "MOLÉCULA DE ÁCIDO NUCLÉICO ISOLADA,CONSTRUÇÃO GÊNICA, VETOR, CÉLULA TRANSGÊNICA, MÉTODO PARAOBTENÇÃO DE UMA CÉLULA E DE UMA PLANTATRANSGÊNICA, POLIPEPTÍDEO ISOLADO E PURIFICADO, COMPOSIÇÃOPESTICIDA BIODEGRADÁVEL, MÉTODO PARA O CONTROLE DE UMAPRAGA, MÉTODO DE OBTENÇÃO DE LINHAGENS TRANSGÊNICASRESISTENTES A UM INSETO PRAGA".

CAMPO DA INVENÇÃO

O seguinte relatório descritivo da patente de invenção refere-se ao campo de controle deinsetos-praga que atacam lavouras agrícolas, utilizando métodos e composições quecompreendem δ-endotoxinas derivadas do microrganismo Bacillus thuringiensis.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

O algodoeiro é, dentre todas as plantas domésticas e cultiváveis, uma das mais atacadaspor doenças e insetos-praga, além de apresentar alta sensibilidade à ocorrência imposta porplanta daninhas (Beltrão, E. M., Souza, J. G. O agronegócio do algodão no Brasil. EmbrapaiBrasília, v.Ol, 1999). Dentre os principais insetos-praga, dcslaca-so o bicudo-do-algodoeiro,Anthonomus grandis (Boheman. C. H. Description of nevv species. In Schocnhorr, Genera e|species Curculionidum cum synonymia hujus Familiae. \ol. 7, pt. 2. Paris: Roret. 461p., 1843),considerado uma das pragas mais sérias da cultura do algodão, encontrando-se dispersa noMéxico, Cuba, Haiti, Venezuela, Colômbia, Paraguai e Brasil. Este inseto utiliza os botõesflorais e frutos do seu hospedeiro como fonte de alimento e local de desenvolvimento,causando prejuízos diretos à comercialização da fibra de algodão. Os níveis de infestaçãocrescem rapidamente e os prejuízos podem atingir até 100% da produção, caso as medidas decontrole não sejam adequadas. Este inseto representa um grande potencial de dano, sendoconsiderado praga-chave no planejamento e controle de insetos nocivos à cultura,principalmente devido à dificuldade de controle pelos inseticidas químicos.O algodoeiro e suas pragas coexistem por um longo período evolutivo. Planta e insetoformam um sistema morfológico e bioquímico interdependente e competitivo, resultando namaioria das vezes, na utilização de parte da planta pelo inseto. Essa parte utilizada representa odano causado pelo inseto à planta, e depende do tamanho da população da praga, e dahabilidade da planta em resistir ao ataque e de se recuperar do dano sofrido (Beltrão, E. M.JSouza, J. G. O agronegócio do algodão no Brasil. Embrapa: Brasília, v.01, 1999)j.

A interação planta versus inseto pode ser visualizada de pelo menos duas maneiras: doponto de vista do inseto, com a planta variando de adequada a completamente inadequadacomo hospedeira e, por outro lado, do ponto de vista da planta onde, quanto menor o númerode espécies e abundância de insetos associados a ela, e quanto menor o efeito que esses insetosexercem sobre elas, maior a sua resistência sobre esses insetos (Santos, W J Identificação,biologia, amostragem e controle das pragas do algodqeirq._ In: Embrapa Agropecuária Oeste;Embrapa Algodão. Algodão: tecnologia de produção., p. 296p. 2002).

Entre um extremo e outro de resistência das plantas aos insetos-praga, existe umcompleto e extensivo arsenal de mecanismos de ataque e contra-ataque a ação dos insetos, quevão desde um simples impedimento morfológico a complexos componentes fitoquímicos, queinterferem diretamente no processo metabólico envqlvido na utilização da planta comohospedeira do inseto. Em termos práticos, a resistência do algodoeiro aos insetos-pragarepresenta a habilidade de certas cultivares produzirem algodão de melhor qualidade em maiorquantidade que outros cultivares, sob ataque da mesma população de insetos-praga !(Freireju RjIC. Cultivares e produção de semente na Inejhcda da qudidade do algodão no nordeste ecentro-oeste do Brasil. Bcdetim ^ CNPA. 1997).

Na maioria dos países onde o algodão é cultivado, a vulnerabilidade às pragas representao principal problema desta cultura. Sem alternativas de controle mais eficazes, os produtores,de forma rotineira, continuam acreditando que os inseticidas químicos sejam a única forma deproteção das lavouras. Embora eficientes, são onerosos, potencialmente danosos ao homem, aomeio ambiente e, em longo prazo, ocasionam o desencadeamento de processos de resistência,ressurgimento de pragas e redução na incidência de inimigos naturais (Panizzi, A R- Efeito dçjinseticidas na população das principais pragas da soja. Àn. Soe. Entomol Brasil, v.6, p 264-|275. 1977). Diante isso, a presente invenção tem como objetivo aumentar a resistência deplantas, gerando plantas transgênicas, as quais sejam capazes de expressar genes de altaatividade entomotóxica, solucionando, consequentemente, o problema do uso abusivo deinseticidas químicos.

A introdução estável de genes éxógenos em plantas de algodão, com a finalidade deinduzir resistência a insetos-praga, é uma excelente alternativa para a diminuição de grandeparte dos problemas associados aos métodos químicos. Esta tecnologia reúne várias vantagens,principalmente pelo fato de não poluir o ambiente. Dados gerais demonstram que plantastransformadas de algodão não apresentaram efeitos negativos sobre o ambiente, sendo ascaracterísticas herdáveis e expressas normalmente na planta (Adamczyk, J. J., L. C, Adams L;C., Hardee, D. D. FieId efficacy and seasqnal expression profiles for terminal leaves of single;and double Bacillus thuringiensis toxin potton genotypes. JournaÍ of Économic Entomology;v.94, n.6, DÊC, p. 1589-1593. 2001).

A disponibilidade de microrganismos e compostos orgânicos na natureza para utilizaçãobiológica é muito grande, e os mesmos fornecem ampla variedade de matéria-prima para odesenvolvimento de novos produtos, com maior patogenicidade contra o inseto e amplo espectrode ação. Dentre estes microrganismos, uma grande descoberta foi a bactéria de solo Bacillusthuringiensis, a qual é amplamente utilizada como agente de controle biológico e como fonte demoléculas potenciais para programas biotecnológicos, destinados à obtenção de plantastransgênicas resistentes à insetos-praga. Com esta estratégia é possível reduzir em níveistoleráveis as populações de pragas agrícolas de interesse econômico (Perlak, F. J., R. W.Deaton, T. A. Ármstrong, R. L. Fuchs, S. R. Sims, J. T. Greenplate e D. A. Fischhoff. Insectresistant cotton plants. BiotechnologY (N y), v.8, n.lO,j3.939-943. Í99CÍj.

Embora já tenham sido identificadas e descritas algumas δ-endotoxinas com atividadesobre o bicudo-do-algodoeiro, o hábito endofítico desta praga dificulta ou até mesmoinviabiliza o emprego destas toxinas por meios convencionais, as quais são comercializadascomo bioinseticidas, como por exemplo, formulações protéicas contendo as toxinas Cry. Estesapresentam instabilidade no meio ambiente, baixo rendimento na purificação a partir de fontesnaturais, além da fácil perda de atividade destas toxinas pelas intempéries do ambiente comochuva e sol. Diante deste problema, a estratégia de maior eficiência é a utilização dos genescodificadores de toxinas Cry na geração de plantas geneticamente modificadas.O uso de genes codiflcantes para este tipo de proteínas entomotóxicas e a expressão dasmesmas em sistemas heterólogos (bactérias ou plantas transgênicas) contorna as dificuldadesgeradas pelo uso dos bioinseticidas. Esta estratégia vem se destacando nos últimos anos naárea da transgenia, devido à especificidade destas toxinas em relação aos insetos-praga,eficiência, expressão direcionada e sua inocuidade sobre animais e humanos. Desta forma,plantas geneticamente modificadas com resistência específica ao inseto-praga podem sergeradas em sistemas de alta eficiência.

Existem alguns genes e transgenes Bt com atividade para coleópteros, como, porexemplo, as plantas expressando um gene cry8 da empresa DU PONT DE MENOURS comtoxicidade para Leptinotarsa decemlineata (US20030177528)j, o milho transgênico com umgene cry8-like da PIONEER & DU PONT com toxicidade para Diabrotica virgifera,Diabrotiea undeeimpunctata howardi, Leptinotarsa decemlineata e Anthonomus grandis(US20060021096, como mencionado também nos pedidos de patente US7ÍÒ5332 eUS2005166284), Feng, S et al., 2005 também descrevem um gene cry8 modificado, ery8Ca,com atividade específica para insetos coleópteros (CN 1609220-A) e, mais recentemente, aPIONEER & DU PONT descrevem um gene sintético ery8 com toxicidade para Diabroticavirgifera virgifera em plantas monocotiledôneas como exemplo em plantas de milho (como;ínencionado no pedido de patente ÜS20060288448).

Atualmente, plantas expressando genes Bt do tipo cry8 são, em sua totalidade,monocotiledôneas (p.ex.: milho). Sendo assim, até a presente data, nenhuma invençãodescreveu um gene desta natureza, com potencial aplicação em plantas dicotiledôneas, como éo caso da planta de algodão.

Técnicas modernas de biologia molecular, como a construção de bibliotecascombinatórias, são utilizadas para desenvolver e identificar genes análogos mutantes comobjetivos específicos.

A construção de bibliotecas de genes análogos variantes, utilizando técnicas de evoluçãomolecular in vitro, têm sido empregada nas últimas três décadas. Esse fato se deve aosurgimento de ferramentas biotecnológicas, as quais servem como plataforma de engenhariagenética no desenvolvimento de novas moléculas com atividade melhorada, visandoprincipalmente a agricultura e a indústria farmacêutica ÍÇLing Yuan, L. Kurek, I., English, j]and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular BiologMReview. Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005). Existem diversas técnicas, as quais podem seraplicadas para gerar mutações em uma seqüência gênica, na presente invenção destaca-se atécnica de embaralhamento de DNA (Rosic, N. N., Huang, W., Johnston, W. A., James JjDevoss, J. J., Gillam, E. M. J, Extending the diversity of cytochrome P450 enzymes by DNAjIfamily shuffling. Gene, Vol. 35762, No of Pages 9,"2007; Ling Yuan, L. Kurek, I., Erigíish, J.'and Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular BiologyReviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392, 2005; Abéçassis, V., Porapon, D. and Truan, G, Highefficiency family shuffling based on multi-step PCR and in vivo DNA recombmation in yeast:.statistical analysis of a combinatorial library between human cytochrome P450 IAl and 1A2JNucleic Acids Research, Vol. 28, No, 20: E 88, 2000; Zhao, H. and Amold, F.H. Functionaland nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes.Proc. Natl. Acad. Sei. JJ.S. A., Vol._ 94, p. 7997 - 8000, 1997; Stemmerj W. P. C. Rapidevolution of a protein in vitro By DNA shufflina . líature. London, Vol. 370, p. 389 - 391j1994).

A técnica de embaralhamento de DNA consiste em uma evolução molecular dirigida, aqual gera mudanças pontuais na estrutura primária das. moléculas de DNA por meio demutações randômicas (Ling Yuan, L. Kurek, I.4 English, J. and Keenan, R. Laboratory-directedprotein evolution. Miçrobiology and Molecular Biology Reviews, Vol. 69, No. 3, p. 373 - 392,·2005; Stemmer, W. P. C. Rapid evolution of a protein in vitro By DNA shuffling. Naixire.ÍLondon, Vol. 370, p. 389 - 391, 1994, ÍJS5605793, US5811238, US5830721). O gene deinteresse é primeiramente fragmentado de forma aleatória em pequenas seqüências de 30-50pares de base, sendo este produto recombinado em uma reação de PCR (Reação da Polimeraseem Cadeia), a qual é conduzida sem adição de oligonucleotídeos. Em uma segunda reaçãoconsecutiva, são adicionados os produtos da primeira reação e oligonucleotídeos específicos.

Permite-se, desta forma, a amplificação de uma população de genes análogos mutantes/variantes (Stemmer, W. :P. C. Rapid evolution of a protein in vitro by Embaralhamento deDNA,, Nature. London, Vol. 370, p. 389 - 391, 1994; Zhao, H. and Amold, F.H. Functionaland nonfunctional mutations distinguished by random recombination of homologous genes.Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A., Vol. 94, p. 7997 - 8000,1997).A eficiência da técnica para produzir moléculas análogas de maior atividade biológicapôde ser comprovada em diversos trabalhos como, por exemplo, em Jager et al (Jager, S. A.)W., Jekel,P. Al and Janssen, D. B. Hybrid penicillin acylases with improved properties forsynthesis of (3-lactam antibiotics. Enzyme Aiid Microbial Technology, Vol. 40, p. 1335 1344, 2007), onde a atividade enzimática da penicilina aciclase aumentou em 90%. A técnicapode utilizar um único ou mais genes homólogos e seu sucesso dependente de um delicadoarranjo entre o tamanho da biblioteca, a diversidade biológica originada e de uma metodologiade seleção das variantes com a característica desejada (Ling Yuan, L. Kurek, I., English, J. andKeenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Micrpbiqlogy and Molecular BiologyReviews, Vol. 69, No. 3, p. 373- 392, 2005).;

A associação das técnicas de embaralhamento de DNA (criação de bibliotecascombinatórias) e apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display,tornam a seleção e a expressão de novas moléculas muito mais eficientes (Stoop, A. A.,·Jespers, L., Lasters, I., Eidering, E. And Parmekoek1 H. High-density mutagenesis bycombined DNA shuffling and Phage display to assign essential amino acid residues in protein-protein interaçtions: application to study stmcturé-function of plasminogen activation inhibitor(PAl-I). J. Mol. BioL, Vo 1 301p 1135 -1l47,2000).

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece moléculas que codificam novas δ-endotoxinas naturais,análogos mutantes e análogos sintéticos para o controle de insetos-praga, particularmente obicudo-do-algodoeiro (Anthonomus grandis), o qual apresenta susceptibilidade às novastoxinas.

São também aspectos da invenção, construções gênicas contendo as moléculas de ácidonucleico codificantes para as δ-endotoxinas, vetores de transformação e expressão, células eorganismos transgênicos, métodos para a expressão heteróloga das novas δ-endotoxinas emorganismos transgênicos, bem como o uso das mesmas no controle de pragas. A invençãocompreende, também, um método para obtenção de uma planta transgênica caracterizado porcompreender as seguintes etapas: a) transformar· uma célula de planta com uma construçãogênica de acordo com a reivindicação 4; b) cultivar a célula transformada, contendo aconstrução gênica de interesse estavelmente inserida em seu genoma, sob condições ideais decrescimento em cultura celular; e c) regenerar uma planta transgênica expressando o produtoda construção inserida, a partir da célula transformada e de obtenção de plantas transgênicas.

A invenção também fornece genes análogos sintéticos, os quais são otimizados paratransfòirnação e expressão dos mesmos em plantas, particularmente em plantas de algodão.

Outra concretização da invenção refere-se aos peptídeos sintéticos de δ-endotoxinasusados para o tratamento de plantas infectadas, no controle de insetos-praga e a utilizaçãodestes na elaboração de composições pesticidas biodegradáveis.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1: Amplificação do gene cry8. Reação de amplificação por PCR, utilizando-seoligonucleotídeos específicos descritos por Bravo et al (1998). Gel de agarose 1,0% coradocom brometo de etídio (A) Primeira rodada com os oligonucleotídeos descritos por Bravo et al(1998). Linha 1. Marcador de peso molecular 1 Kb ladder plus. Linha 2. Bandas amplificadasde aproximadamente 400 pb com o oligonucleotídeos cry8b, 2a. rodada. A seta indica oproduto provável desejado. Linha 3. Oligonucleotídeos cry8a, 2a. rodada. Linha 4.

Oligonucleotídeos cry8geral. Linha 5. Oligonucleotídeos cry8a, la. Rodada. Linha 6.

Oligoíiücleotídeos cty8geral, la. Rodada. (B) Segunda rodada com o oligonucleotídeo cry8bLinha 1. Marcador de peso molecular 1 Kb ladder plus. Linha 2 e 3. Amplificação utilizando1 μί da reação 1 (Figura A) e amostra da linha 2 com a banda de aproximadamente 450 pb.Figura 2: TAIL-PCR. Representação esquemática da técnica de TAIL-PCR (Liu etal., 1995). 1. Primeira amplificação com os oligonucleotídeos específico 1 e arbitrário. 2.Resultado da primeira amplificação gerando produtos inespecíficos (a, b) e o produtoespecífico (c). 3. Segunda amplificação com o mesmo oligonucleotídeo arbitrário eoligonucleotídeo específico mais interno gerando o segundo produto específico (d). 4. Terceiraamplificação com o mesmo oligonucleotídeo arbitrário e o oligonucleotídeo específico 3gerando o produto final (e). 5. Produto final específico.

Figura 3: Clonagem do gene cry8 da estirpe S811 por TAIL-PCR. Géis de agarose 1,0%corados com brometo de etídio e marcador de peso molecular 1 Kb ladder plus. (A) PrimeiroTAIL-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos arbitrários ADI, AD2, AD3, AD4, mostrandoas sucessivas rodadas de amplificações com cada oligonucleotídeos específico. (B) PrimeiroTAIL-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos arbitrários AD5, ADIO, ADl 1, W4, mostrandoas sucessivas rodadas de amplificações com cada oligonucleotídeos específico. (C) SegundoTAIL-PCR utilizando-se os oligonucleotídeos arbitrários AD3, AD4, AD2 e ADI, mostrandoas sucessivas rodadas de amplificações com cada oligonucleotídeo específico. As setasindicam os produtos potencialmente positivos que foram subseqüentemente clonados eseqüenciados.

Figura 4: Dendrograma do alinhamento da nova toxina Cry8Kal, obtido após as duasrodadas de TAIL-PCR. Análise com as demais toxinas Cry8 depositadas no banco de dadosaté o momento, mostrando a alta identidade entre elas e que o gene clonado codifica umaproteína distinta das demais. A escala indica que no espaço representado existe a troca de 0,1aa. O dendrograma foi feito utilizando o programa MEGA4 (Tamura K, Dudley J, Nei M &Kumar S (2007) MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) softwareversion 4.0. Molecular Biology and Evolution 24:1596-1599).

Figura 5: Mapa do vetor comercial pETIOl/D-TOPO para expressão heteróloga emEscherichia coli. Representação esquemática do vetor, incluindo o promotor pT7. PomotorT7: Induzido por IPTG permite a expressão em larga escala em algumas linhagens deEscherichia coli', Operon Iae (IaeO): Sítio de ligação do repressor Iac, importante para aredução da expressão basal das proteínas recombinantes (sua função pode ser regulada pelapresença ou ausência de glicose no meio de cultura); RBS: Sítio de ligação do ribossomo,localizado acima da região 5' do gene a ser clonado na posição idealpara início do processo detradução; Sítio de clonagem TOPO: Região que compreende a localização exata de onde oinserto será clonado; Epitopo V5 (Gly- Lys-Pro-Ile-Pro-Asn-Pro-Leu-Leu- Gly-Leu-Asp-Ser-Thr): Utilizado para a detecção de proteínas recombinantes por western blot utilizandoanticorpos anti-V5; 6His C-terminal: Importante para a purificação de proteínas, utilizandopara tal, resinas as quais possuem metal acoplado; Terminador T7: Seqüência dobacteriófago T7 que permite a finalização da transcrição dos genes; Promotor bla: Promotordo gene de resistência a ampicilina; Gene de resisteência a ampicilina β-lactamase):Seleciona os plasmídeos resistentes em E.colr, Origem de replicação pBR322 (ori):Elemento de replicação e manutenção do plasmídeo em E.coli.

Figura 6: Esquema do sistema de ligação do produto de PCR no vetor de pETlOl/D-TOPO. (A) A extremidade coesiva do vetor onde o produto de PCR será clonado édemonstrada juntamente com a presença da enzima topoisomerase. (B) O produto de PCR édiretamente clonado pela adição dos 4 pares de bases do oligonucleotídeo de orientação direta.

A extremidade coesiva do vetor de clonagem (GTGG) invade a extremidade 5' do produto dePCR, anelando-se com as quatro bases adicionadas (CACC) e estabilizando o produto de PCRna orientação correta. A topoisomerase então cliva o pedaço sobressalente do produto de PCRpara que a ligação seja efetiva.

Figura 7: Análise por SDS-PAGE 12% da proteína recombinante Cry8Kal purificadapor cromatografia de afinidade (Ni-NTA). Linha 1. Marcador de peso molecular. Linha 2.Extrato total da E. coli expressando a proteína recombinante Cry8Kal. Linha 3. Fração nãoretida na resina Ni-NTA. Linhas 4, 5 e 6. Proteína Cry8Kal eluída da resina Ni-NTA emdiferentes concentrações para confirmação do grau de pureza da mesma. 5 μg (linhas 2, 3 e 4),10 μg (linha 5) e 15 μg (linha 6) de amostra foram adicionadas a tampão de amostra,submetidas a SDS-PAGE 12%, a 25 mA e coradas com nitrato de prata.

Figura 8: Bioensaios contra A. grandis e S. frugiperda com as toxinas Cry8Kal eCry8Kal recombinantes. (A) Bioensaio contra S. frugiperda utilizando Cry8Kal. Dieta desuperfície demonstrando mortalidade de 50% na concentração de 5 μ£/πιΙ.. (B) Bioensaiocontra A. grandis utilizando Cry8Kal. Dieta incorporada demonstrando mortalidade de 50%na concentração de 230 μg/mL. (C) Bioensaio contra A. grandis utilizando Cry8Kal. Dietaincoiporada demonstrando mortalidade de 50% na concentração de 160μg/mL. Como controlefoi utilizada a água de diálise na qual as proteínas foram submetidas. Todos os experimentosforam realizados em triplicatas com 30 insetos de A. grandis e 90 de S. frugiperda.

Figura 9. Esquema da Técnica de embaralhamento de DNA utilizando um único genecomo substrato. Esquema da amplificação do gene . cry8Kal com oligonucleotídeosespecíficos para inserção do sítio de restrição à enzima Sfil. Fragmentações, amplificações ereconstrução dos genes análogos mutantes.Figura lO. Interação entre BBMVs de A. grandis e fagos de fusão. Para a leitura daabsorbância foi utilizado o comprimento de onda de 405nm. R-Ia R-6 - Ciclos de seleção e onúmero de lavagens por ciclo. A maior absorbância, ou seja, maior número de fagos de fusãocom especificidade a BBMVs do inseto A. grandis, ocorreu a partir do 5o ciclo da seleção.

Figura 11. PCR de colônia de variantes BI utilizando oligonucleotídeos iniciadoresespecíficos. Foto de gel de agarose 1% exibindo DNA amplificado no tamanho esperado deaproximadamente 2000pb. Neste gel cinco colônias, além do controle positivo, apresentaram otamanho esperado (4, 6, 10, 17 e 18). 1 - Marcador 1 Kb plus® (INVITROGEN). 2 a 18 -Variantes do gene cry8Kal. 19 - Controle negativo (PCR sem DNA). 20 - Controle positivo,gene cry8Kal com oligonucleotídeos iniciadores específicos.

Figura 12. Bioensaio com larvas neonatas de A: grandis para a determinação daatividade inseticida das proteínas Cry8Kal e Cry8Ka5 (mutante). Controle - Controlenegativo, dieta sem a adição das proteínas em estudo. A - Mortalidade de larvas alimentadascom Cry8Kal; B - Mortalidade de larvas alimentadas com Cry8Ka5. Foi observado naconcentração de 6 μ§/πιΙ. de dieta um aumento de duas vezes na atividade inseticida da novamolécula.

Figura 13. Representação da estrutura modelada da toxina nativa Cry8Kal utilizandoprograma ModeIler e visualizada pelo PyMOL (Delano, W. L. The PyMOL MolecularGraphics System (2002) on Worid Wide Web http://www.pymol.org!. No análago Cry8Ka5 oesqueleto da estrutura permanece o mesmo sendo apenas as cadeias laterais dos resíduos deaminoácidos substituídas. Na Figura estão indicados os resíduos de aminoácidos de Cry8Kalque foram substituídos na seqüência do análogo Cry8Ka5. Em A, representação da moléculacom os três domínios I, II e III. Em B, Destaque para o domínio I, formado por sete a-hélices.

A arginina 132 substituída por glutamina esta localizada na hélice 3. Em C, destaque para astrês folhas β anti-paralelas do domínio II, com indicação dos resíduos de Cry 8 nativasubstituídos na molécula do análogo: tirosina 311 substituída em Cry8Ka5 por cisteína eprolina 372 pela alanina. Em D, o β sanduíche do Domínio ΠΙ, e indicação dos três resíduossubstituídos na molécula do análogo (arginina 559 por glicina, lisina 589 por ácido glutâmicoe ácido glutâmico 645 pela asparagina.Figura 14. Gráfico da atividade entomotóxica dos genes cry8 análogos ao gene nativocry8Kal. O bioensaio foi conduzido com os fagos de fusão. Legenda: C- - Controle negativoutilizando fagos HELPER. Cry8Kal - Proteína original expressa no sistema de fago. Cry8Ka2,Cry8Ka3, Cry8Ka4 e Cry8Ka5 - Variantes da toxina Cry8 expressas no sistema de fago.

Figura 15. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com as seqüências deCry8AB00.1, 50C (b) e Cry8Bbl. A primeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; asegunda linha, Cry8AB00.1, seqüência 3 da patente US 73297361; a terceira linha,Cry8AB00.1, seqüência 5 da patente US 7339092; a quarta linha, a seqüência de 50C (b) dapatente US 5554534; a quinta linha, Cry8Bbl, seqüência 15 da patente W02005083095; asexta linha, Cry8Bbl, seqüência 17 da patente W02005083095. Os números acima dosalinhamentos referem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foramalinhadas utilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)(Laridn, MA; Blackslúelds , G; Brown, NP; Chenna, R; McGettigan, PA; McWilliam, H;Valentin, F; Wallacej IM; Wilm, À; Lopez, R; Thompson, JD; Gibson, TJ; Higgins, DG.ClustalW and ClustalX versipn 2. Bioinformatics. 2007;23:2947-2948. doi:Il 0.1093/bioinfbrmatics/btm404)j

Figura 16. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com Cry8Bbl. Aprimeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; da segunda linha à 32a linha, Cry8Bbl,seqüências 1, 3, 5, 7, 11, 13, 17, 18, 21, 25, 29, 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 59, 61, 67, 69,71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 91 e 93 da patente W02005063996. Os números acima dosalinhamentos referem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foramalinhadas utilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/)(Larkin, MA; Blackshields , G; Brown, NP; Chenna, R; McGettigan, PA; McWilliam, H;jÍValentin, F; Walíace, IM; Wilml A; Lopez, R; Thompson, JD; Gibson, TJ; Higgins, D§jClustalW and ClustalX version 2. Bioinformatics. 2007;23:2947-2948. doi:Il 0.1093/bioinformatics/btm404)

Figura 17. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com Cry8Bbl. Aprimeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; da segunda linha à 31a linha, Cry8Bbl,seqüências 1, 3, 7, 11, 13, 17, 18, 21, 25, 29, 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 59, 61, 67, 69, 71,73,- 75, 77, 79, 81, 83, 91 e 93 da patente US 7105332. Os números acima dos alinhamentosreferem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foram alinhadasutilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) '(Larkin, MA;Blackshields , G; Brown, NP; Chenna, R; McGettigan, PA; McWilliam, H; Valentin, FWallace, IM; Wilm, A; Lopez1 R; Thompson, JD; Gibson, TJ; Higgins, DG. ClnstalW ana;ClustalX version 2 Bioinformatics. 2007;23:2947-2948. doh10.1093/bioinfonnatks/btni4Ó4)

Figura 18. Alinhamento da seqüência de nucleotídeos de Cry8Kal com Cry8Bbl. Aprimeira linha representa a seqüência de Cry8Kal; da segunda linha à 31a linha, Cry8Bbl,seqüências 1, 3, 7, 11, 13, 17, 18, 21, 25, 29, 33, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 59, 61, 67, 69, 71,73, 75, 77, 79, 81, 83, 91 e 93 da patente US 7378499. Os números acima dos alinhamentosreferem-se à posição de cada nucleotídeo na seqüência. As seqüências foram alinhadasutilizando o programa CLUSTALW2. (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) (Larkin, MA;Blackshields , G; Brown, NP; Chenna, R; McGettigan, PÃ; McWilliam, H; Valentin, F;Wallace, ,IM; Wilm, A; Lopez, R; Thompson, JD; Gibson, TJ; Higgins, DG. ClustalW andClustalX version 2. Bioinformatics. 2007;23:2947-2948." doi:10.1093/bipinfomatics/b

Figura 19. Alinhamento das seqüências de aminoácidos da nova δ-endotoxina Cry8Kalcom seqüências de Cry8. As seqüências foram alinhadas utilizando o programaCLUSTALW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/) (Larkinr MÃ;7j^ackshiefds^,^GBrowh, ;NP; Chenna, FlTMcGettigan PÃ McWilliam F;7wàllace, IM; Wilm5 A-Lopez5 R; Thompson, JD; Gibson, TJ; Higgins, DG. ClustalW and ClustalX version 2.Bioinformatics. 2007;2^3:2947-2948Γφ 10.1093/bioinfonnatk. Os resíduoscontendo * são aminoácidos conservados; : , substituições conservativas; . , substituiçõessemiconservati vas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Na presente invenção, foi identificado e clonado um novo gene pertencente à família cry8,com alta toxicidade a insetos coleópteros, especificamente ao bicudo-do-algodoeiro. Os códonsdesta seqüência foram otimizados para sua expressão em plantas, especificamente, para plantasde algodão. Além disso, foi construída uma biblioteca combinatória, através da técnica deembaralhamento de DNA, com o intuito de desenvolver genes análogos mutantes, os quaistambém codificam para a proteína da família Cry8. Os genes análogos mutantes gerados, assimcomo o gene original, possuem potencial efeito no controle do bicudo-do-algodoeiro.

Para alcançar o objetivo desejado, ou seja, genes de δ-endotoxinas com atividade sobre obicudo do algodoeiro, realizou-se inicialmente, uma varredura no banco de germoplasma de B.thuringiensis da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, com o intuito de identificarestirpes com atividade sobre o bicudo-do-algodoeiro. As estirpes efetivas tiveram seu materialgenético extraído e submetido a técnicas de biologia molecular para identificação, caracterizaçãoe posterior clonagem dos genes cry. A partir desta varredura, foi identificada uma estirpe,denominada S811, altamente efetiva contra o bicudo-do-algodoeiro.

Para a clonagem dos genes cry da estirpe S811 (Banco de Germoplasma, EmbrapaRecursos Genéticos e Biotecnologia) foi feita uma amplificação inicial por PCR comoligonucleotídeos específicos para diversas famílias de δ-endotoxinas. A amplificação comoligonucleotídeos específicos para a família Cry8 resultou em um fragmento de cerca de 500pb correspondente à extremidade 5' de um gene novo da família cry8. Para obter a seqüênciacompleta do gene foi utilizada a técnica de TAIL-PCR (Reação da Polimerase em Cadeia porEntrelaçamento Termal Assimétrico), com oligonucleotídeos específicos derivados dasseqüências previamente amplificadas e oito oligonucleotídeos iniciadores arbitrários. O TAIL-PCR consiste numa aplicação da técnica de PCR que permite o isolamento de segmentos deDNA adjacentes a seqüências conhecidas (Liu & Whittier, Efficient isoíation and mapping ofArabidopsis thaliana T-DNA insert junçtions by thermal asymmetricjnterlaçed PCR. Plant J„8: 457-463. 1995).

Resumidamente, são feitas seqüencialmente três reações de PCR utilizando trêsoligonucleotídeos seqüenciais específicos de um lado e Um oligonucleotídeo de seqüênciaarbitrária do outro lado. É feito um ciclo inicial a baixa estringência de modo a permitir oanelamento do oligonucleotídeo arbitrário com o segmento alvo de seqüência desconhecida,seguido de alguns ciclos a alta estringência de modo a favorecer o anelamento dooligonucleotídeo específico e a amplificação linear da seqüência alvo. Alternando-se ciclos dealta_e_ de baixa_estringência, são formadas moléculas dupla-fita e a-amplifieação-da seqüênciaalvo torna-se logarítmica. Num segundo e terceiro ciclo de amplificações produtos nãoespecíficos deixam de ser amplificados e são eliminados.Fragmentos amplificados no TAIL-PCR e, potencialmente positivos, foram clonados eseqüenciados em ambas as direções em um seqüenciador automático. No total, foramrealizadas duas reações seqüenciais de TAIL-PCR e amplificados 2688 pb (SEQ ID N0 1)equivalentes a 896 aminoácidos (SEQ ID N0 2) de um novo gene de B. thuringiensispertencente à família de δ-endotoxinas Cry8. A seqüência protéica predita do novo gene,denominado cry8Kal (nomenclatura 2 seguindo __rçgras. oficim§http://wwwJifesci.sussex^ apresenta os três domíniosestruturais característicos da extremidade N-terminal ativada das δ-endotoxinas e 240aminoácidos da extensão C-terminal. Esta seqüência original serviu como molde para ageração de análogos com atividade entomotóxica melhorada.

Para obtenção de genes cry análogos, com alta entomotoxicidade para o bicudo-do-algodoeiro, foi utilizado o gene cry8Kal isolado da cepa S811 de B. thuringiensis. Este genefoi utilizado como substrato no processo de originar genes variantes pela técnica deembaralhamento de DNA Os variantes foram selecionadas quanto a capacidade de se ligarema receptores presentes na membrana do intestino médio do bicudo-do-algodoeiro (BBMVs),pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display(Barbas III, C. F.; Burton, D. R.; Scott, J. K.; Silverman, G. J. Selection from antibodyíibraries. In: Phage display - AJaboratory manual -USAj Cold Spring Laboratory, p. 10.1-20, 2001).

Para a seleção dos variantes do gene cry8 da presente invenção utilizamos a técnica deapresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage Display (Zhang, Q., Bai, G.,Çheng, J., Yu, Y., Tian, W. and Yang, W. Use of an enhanced green fluorescence proteinlinked to a singíe chain fragment variable antibody to localize Bursapheienchus xylophilusceílulese. BiqscI ElIotechnol. Biochem, Voí. 71, No 6, p. Í514-Í520,2007; Andris-Widhop^J., Rader, C., Steinberger, P., Fuller, R., Barbas ΙΪΙ, C. F. Methods for the generation ofchicken monoclonal antibody fragments by Phage display. Journal of ImmunolqgicalMethods, Vol. 242, p. 159 - 181, 2000; Stoop? A. A., Jespers, L.,Tasters, I., Eldering, E. andPannekoek, H. High-density mutagenesis by combined DNA sWffling and Phage display tdassign essential amino acid residues in protein-protein interactions; _application to studystmcture-íunctiqn of plasmmogen actiyatiqn inhibitor 1 (PAI-I). J. MoL Biol., Voí. 3Ó1, pJ1135 - 1147, 2000; Barbas III, C. F., Bain, J. D., Hoekstra, D. M., And Lerner, R. A.Semisynthetic combinatorial antibody libraries: A chemical solution to the diversity problem.Proc. Nati. Acad. Sei. USA, Vol. 89, p. 4457 - 4461,1992)1

Ao final, a toxina nativa Cry8Kal, seus análogos mutantes e sintéticos tiveram seusefeitos entomotóxicos avaliados in vitro, por meio de bioensaios seletivos. Para isso, os genesanálogos selecionados foram clonados em vetores de expressão heteróloga (.Escherichia coli) eas toxinas recombinantes geradas utilizadas em bioensaios contra os insetos-praga doalgodoeiro (SEQID N0 5 a 12).

A invenção descreve novas entomotoxinas e métodos, os quais possibilitam a geração detecnologias capazes de controlar insetos-praga de grande interesse econômico. Maisespecificamente, os ácidos nucleicos (genes) da presente invenção, incluindo fragmentos evariantes dos mesmos, compreendem seqüências nucleotídicas, as quais codificam proteínas(polipeptídeos) entomotóxicas. As proteínas entomotóxicas descritas são biologicamenteativas contra alguns insetos-praga pertencentes à ordem Coleóptera, como por exemplo: obicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis\ o verme da raiz do milho ocidental, Diabrotieavirgifera virgifera; a vaquinha, Diabrotiea longieornis barberi; o besouro do pepino,Diabrotiea undecimpunetata howardi. Pragas adicionais incluem: larvas de besouros elatérioscomo Melanotus, Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp; besouro japonês, Popillia japoniea', larvabranca, Phyllophaga erinita; pulguinha do milho e do arroz, Chaetoenema puliearia] besourodo caule de girassol, Cylindrocupturus adspersus; besouro de semente de girassol cinza,Smieronyx sordidus; besouro de girassol, Zygogramma exelamationis; besouro de alfafa,Hypera nigrirostris; besouro 'sem asa' de crucíferas, Phyllotreta erueiferae\ besouro da batataColorado, Leptinotarsa deeemlineata', besouro 'sem asa' listrado, Phyllotreta striolata;besouro 'sem asa' listrado da raiz de mostarda, Phyllotreta nemorum e o besouro de ,Brassica,Meligethes aeneus.

Além das seqüências nucleotídicas, a presente invenção também descreve um vetor deexpressão compreendendo as seqüências gênicas codificadoras de proteínas com alta atividadeentompfóxiça.

As seqüências nucleotídicas da invenção possuem uso direto nos métodos de controledos insetos-praga, particularmente da ordem Coleoptera. A presente invenção provê novastécnicas, as quais não dependem do uso dos pesticidas químicos sintéticos tradicionais. Ainvenção diz respeito a pesticidas biodegradáveis ocorrendo naturalmente e genes codificandoos mesmos.

Em algumas concretizações a invenção provê um gene codificador para δ-endotoxinas dafamília Cry8, obtido de fontes naturais, denominado crySKal (seguindo nomenclatura oficial;destes genes; www.http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil Crickmore/ Bt.html). Foramcriados por mutação in vitro, genes análogos mutantes e genes sintéticos ao gene nativo,também codificadores de δ-endotoxinas. Em outras concretizações, a invenção provêmicrorganismos e plantas geneticamente modificados capazes de expressar (produzir) as novasδ-endotoxinas, bem como métodos envolvendo o uso dos ácidos nucléicos em composiçõese/ou produtos pesticidas para atuar contra os insetos-praga em questão. A invenção tambémestá relacionada às possíveis seqüências codificadoras ou aos fragmentos variantescodificadores de δ-endotoxinas.

Na descrição que segue, vários termos são utilizados extensivamente. As seguintesdefinições são providas para facilitar o entendimento da invenção.

Como descrito aqui, o termo "análogo" descreve seqüências nucleotídicas ou protéicasdiferentes das seqüências originais especificamente identificadas, onde um ou maisnucleotídeos ou resíduos de aminoácidos foram deletados, substituídos e/ou adicionados. Estasseqüências podem ser caracterizadas pela porcentagem de identidade de suas seqüências, poralgoritmos comuns empregados no estado da técnica, com as seqüências nucleotídicas (SEQID N0 1-2) ou protéicas (SEQ ID N0 3-4) descritas aqui. A identidade percentual é determinadapelo alinhamento de duas seqüências a serem comparadas, determinando o número de resíduosidênticos na porção alinhada, dividindo este número pelo número total de resíduos naseqüência pesquisada e multiplicando o resultado por 100. Esse alinhamento pode ser feitoatravés de ferramentas de domínio público, como BLASTN e BLASTP, disponíveis na páginado Centro Nacional para Informação Biotecnológica/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Oalinhamento de seqüência e o cálculo de porcentagem de identidade da presente invençãoforam realizados conforme descrito com as seqüências depositadas no Banco de Genes. AsFiguras 15-19 mostram o alinhamento da seqüência da presente invenção (Cry8Kal) com asseqüências descritas no estado da técnica.Como usado aqui, os termos "ácido nucléico" e "seqüências nucleotídicas" fazemreferência a um polímero desoxiribonucleotídeo de cadeia dupla (DNA), englobando análogosconhecidos que possuem a essência natural dos nucleotídeos naturais e hibridizamespecificamente com ácidos nucleicos de cadeia simples de maneira similar aos nucleotídeosocorrendo naturalmente.

O termo "oligonucleotídeo" é referido aqui como 'primers' e 'sondas' da presenteinvenção, e é definido como uma molécula de ácido nucleico compreendendo de dez a trintadeoxiribonucleotídeos, preferencialmente mais do que oito. O tamanho exato dosoligonucleotídeos é dependente dos fatores experimentais particulares de cada etapa doprocesso.

Conforme usado na presente invenção, os termos "codificador", "codificando" ou"codificado" significam que uma seqüência nucleotídica possui uma informação, a qual serátraduzida biologicamente da seqüência de nucleotídeo em uma sequencia proteica específica.A informação codificada de uma proteína é especificada pelos códons expressos na seqüêncianucleotídica. Estes códons são explorados por cada organismo vivo de maneira diferenciada,podendo partes de seqüências nucleotídicas distintas serem traduzidas biologicamente empeptídeos idênticos.

Como usado aqui, o termo "antisense", usado no contexto da orientação de umaseqüência, de nucleotídeo, refere-se a uma seqüência complementar de uma sequenciacodificante de polinucleotídeo, que é operacionalmente ligada no sentido 3'-5' portanto, apartir da extremidade 5' de um gene. A cadeia antisense é complementar a cadeia deorientação sense gerando um mRNA final capaz de hibridizar com o mRNA produzido a partirda transcrição da seqüência original.

O termo "gene" corresponde a uma seqüência nucleotídica específica localizada em umaregião em particular do cromossomo, sendo responsável por codificar um produto finalespecífico. O gene também carrega em sua estrutura primária toda a informação necessáriapara os processos de transcrição e tradução biológica, como por exemplo, regiões promotoras ereguladoras da transcrição. No caso da presente invenção, gene compreende uma seqüêncianucleotídica codificadora correspondente as toxinas Ciy provenientes de Bacillusthuringiensis.O termo "vetor" diz respeito a um replicon, como plasmídeo, fago ou vírus, no qualoutras seqüências genéticas ou elementos (sejam eles de DNA ou RNA) podem ser ligados.Desta forma, os genes podem ser replicados juntamente com o vetor. Preferencialmente umdos vetores de interesse da presente invenção diz respeito ao fagomídeo. O termo "fagomídeo"diz respeito a um vetor que contém seqüência para replicação em fago e em bactéria, este vetortem características que atendem as especificações da célula hospedeira bem como agentesselecionadores e promotores. Um exemplo é o fagomídeo pComb3X (Ãndris-Widhopf, J.]Rader, C.; Steinberger, P.;Fuller,J^BaAasJni C1F. MetSods for the generation of chickenmonoclonal antibody fragmente by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242:'|159-181, 2000)', que tem como característica fusionar a seqüência de interesse ao gene daproteína III, do bacteriófago filamentoso M13, localizada no capsídeo viral. O termo "vetorrecombinante" é resultante da combinação de um vetor comercial com genes da presenteinvenção operacionalmente ligado a um polinucleotídeo endógeno e/ou heterólogo de interesseque por sua vez está operacionalmente ligado a um sinal de terminação. Tais vetores podemser obtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (PaioAlto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs(Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). Alguns, exemplos de vetores utilizados napresente invenção, mas não limitados, são os vetores pGEM-T easy (Promega Corporation),pETlOl/ D-TOPO (Invitrogen), pComb3X (Andns-Widhopf, J.^Rader, C.; SteiBberger,"P.;Fuller, R., Barbas III, G. F. Methods for the generation of chicken monoclonal antibodyíragmeiits by Phage display. Journal of Irnmunological M^ 242: 159-181, 2000). Aobtenção de vetores recombinantes compreendendo promotores ligados a ácidos nucleicos éconhecida no estado da técnica e pode ser encontrada em Sambrook et al. (Sambrook1 J iRussell, D. W., Molecular Cloning, A Laboratipiy Manual, 2nd ed., Cold Spring HarborLaboratory Press, í 989)1

Um "vetor de expressão" é um vetor especializado que contém um gene com regiõesregulatórias necessárias para a expressão em uma célula hospedeira. Tais vetores podem serobtidos comercialmente, incluindo aqueles fornecidos por Clontech Laboratories, Inc (PaioAlto, Calif.), Stratagene (La Jolla, Calif), Invitrogen (Carlsbad, Calif.), New England Biolabs(Beverly, Mass.) e Promega (Madison, Wis.). O termo "operacionalmente ligado" significaque as seqüências regulatórias necessárias para expressão da seqüência codificante estãocolocadas na molécula de DNA em posições apropriadas de maneira que quando juntadas àseqüência codificante, esta mantenha a fase de leitura adequada para efeito de sua expressão.Essa mesma definição é, às vezes, aplicada para o arranjo de seqüências codificantes eelementos controladores da transcrição (por exemplo, promotores, acentuadores ou"enhancers" e elementos de terminação) no vetor de expressão. Uma região codificanteexógena é tipicamente flanqueada por regiões regulatórias operacionalmente ligadas queregulam a expressão da região codificante exógena em uma célula transformada (podendo sermicrorganismo, vegetal ou animal). Uma região regulatória típica operacionalmente ligada auma região codificante exógena inclui um promotor, isto é, um fragmento de ácido nucléicoque pode causar transcrição de regiões codificantes exógenas, posicionado na região 5' daregião codificante exógena.

A presente invenção não está limitada para o uso de qualquer promotor, estes podem serinduzíveis, constitutivos e tecido-específicos. Preferencialmente, o promotor da presenteinvenção é do grupo dos promotores dos genes da fibra de algodão, podendo ser, mas nãoestando limitado a E6, H6S, Rac 13, LTP, ACP, Expansina, CAP, Anexina, FbL2A e actina 2.

O promotor pode conter elementos "enhancers". Um "enhancer" é uma seqüência deDNA que pode estimular a atividade do promotor. Ela pode ser um elemento inato dopromotor ou um elemento heterólogo inserido para aumentar o nível e/ou a tecido-especificidade de um promotor. "Promotores constitutivos" referem-se àqueles que dirigem aexpressão gênica em todos os tecidos e durante todo tempo. Promotores "tecido-específicos"ou "desenvolvimento-específicos" são aqueles que dirigem a expressão gênica quase queexclusivamente em tecidos específicos, tais como folhas, raízes, caules, flores, frutos ousementes, ou em estágios específicos do desenvolvimento em um tecido, como no início oufinal da embriogênese.

Conforme descrito anteriormente, a expressão "vetores de expressão" pode compreenderum promotor induzível operacionalmente ligado a uma seqüência de ácido nucléicocodificando a proteína pesticida da presente invenção. Promotores "induzíveis" podem dirigira expressão de um polinucleotídeo com o qual eles estejam operacionalmente ligados, em umtecido ou estágio específico do desenvolvimento ou respondendo a condições ambientais. Emum dos aspectos da invenção, vetores de expressão compreendem um promotor induzívelfirmemente regulado operacionalmente ligado à uma molécula de ácido nucleico codificandouma proteína pesticida. Tal vetor de expressão pode adicionalmente compreender um genemarcador de seleção (por exemplo, um gene codificando uma proteína que confere resistênciaa antibiótico) operacionalmente ligado a um promotor constitutivo ou a um promotor induzívelfirmemente regulado. Dependendo da aplicação, ele pode beneficiar a expressão da seqüênciade ácido nucleico codificando uma proteína pesticida através de um promotor induzível deinseto-praga. Em um aspecto da presente invenção pode ser vantajoso utilizar promotores quesão expressos localmente ou próximo do sítio de infecção da praga.

Em um dos aspectos da invenção, o promotor é um promotor expresso em plantas. Comousado aqui, o termo "promotor expresso em plantas" significa uma seqüência de DNA que écapaz de iniciar e/ou controlar a transcrição em uma célula de planta. Isso inclui qualquerpromotor de origem vegetal; qualquer promotor de origem não vegetal que seja capaz dedirecionar a síntese do gene presente no T-DNA de Agrobaterium; promotores tecido-específicos ou órgão-específicos, incluindo mas não limitados a promotores semente-específicos (W08903887), promotores específicos de órgãos primordiais (como mencionadono pedido de patente US20030175783,. An, Y.Q., Huang, S., MçDowell, J._M., McKinney, E.C., Meagher, R. B., Conserved expression of the Arabidopsis ACTl and ACT3 açtin subclassin organ primordia and m ature pollen. The Plant Cell 8, „15-30, 1996), promotores específicosde caule (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Keller, B., Sauer, N.,Lamb, C. J., Glycine-rich cell wall proteins inbean: Genestmcturea^protein with the vascular system. EMBO J. 7: 3625-3033, 1988), promotores específicos defolhas (como mencionado no pedidojde_pateníe yS2pp30175783, Hudspeth, R. L., Grulas hW., Structure and expressionof, ther maize gene encoding ;'·Λβ_.-:£lws£;h<^olp>imvatecarboxylase involved in C4 photosynthesis. Plant Mol Bioí 12;579-589, 1989), promotoresespecíficos de mesófilo, promotores específicos de raiz (como mencionado no pedido dépatente US20030175783, Keller, B., Lamb, C. J., Specific expression of a novel cell walíhydrox^roline-rich glycoprotein gene in lateral rootinitiation. Genes Devei. 3:1639-1646j1989), promotores específicos de tubérculos (como mencionado no pedido de patenteUS20030175783, Keil, M., Sánchez-Serrano, J. J., Willmitzer, L., Both wound-inducible andtuber-spceific expression are mediated by the promoter of a single member of the potatdproteihase inhibitor II gene family. EMBO J. 8: 1323:1335, 1989)], promotores específicos detecidos vasculares (como mencionado no pedido de patente US20030175783, Peleman J.,Saito, K., Cottyn, B., Engler8O-ZSeiirinck, J., Van Montagu M, Inze, D., Structure andjexpression analyses of the S-adenosylmethiomne synthetase gene family in Arabidopsiskhaliana. Gene 84: 359-369, 1989), promotores específicos de estames (WQ8910396,WO9213956), promotores específicos da zona de deiscência (WO9713865); e semelhantes.

Uma "seqüência líder" ou "seqüência sinal" na presente invenção significa umaseqüência de ácido nucleico que, quando operacionalmente ligada a uma molécula de ácidonucleico, permite a secreção do produto da molécula de ácido nucleico. A seqüência líder estápreferencialmente localizada na região 5' da molécula de ácido nucleico. Preferencialmente, aseqüência líder é obtida do mesmo gene que o promotor utilizado para dirigir a transcrição damolécula de ácido nucleico, ou é obtida do gene onde a molécula de ácido nucleico é derivada.Preferencialmente a presente invenção utiliza a seqüência sinal proveninente de uma cultivarde algodão brasileira.

O sinal de terminação da transcrição e a região de poliadenilação da presente invençãoinclui, mas não está limitado a, sinal de terminação de SV40, sinal de adenilação de HSV TK,sinal de terminação do gene da nopalina sintetase de Agrobacterium tumefasciens (NOS), sinalde terminação do gene da octopina sintetase, sinal de terminação do gene 19S e 35S do CaMV,sinal de terminação do gene da álcool desidrogenase de milho, sinal de terminação do gene damanopina sintetase, sinal de terminação do gene da beta-faseolina, sinal de terminação do geneda ssRUBISCO, sinal de terminação do gene da sucrose sintetase, sinal de terminação do vírusque ataca o Trifolium subterranean (SCSV), sinal de terminação do gene trpC de Aspergillusnidulans, e outros semelhantes.

Os termos "polipeptídeo", "peptídeo" e "proteína'' são usados de forma interrelacionadapara referir a um polímero de resíduos de aminoácidos. Os termos aplicam-se para polímerosde aminoácidos onde um ou mais resíduo de aminoácido é um análogo químico artificial deum aminoácido correspondente ocorrendo naturalmente, bem como para polímeros deaminoácidos ocorrendo naturalmente.Polipeptídeos da invenção podem ser produzidos ou através de um ácido nucleicodescrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular. Por exemplo, umaproteína trancada da invenção pode ser produzida pela expressão de um ácido nucleicorecorríbinante da invenção em uma célula hospedeira apropriada, ou alternativamente pelacombinação de procedimentos, tais como digestão utilizando protease e purificação.

O termo "substancialmente pura" refere-se a preparações compreendendo pelo menos50-60% de peso do componente de interesse (por exemplo, ácido nucleico, oligonucleotídeo,polipeptídeo, proteína, etc). Mais preferencialmente, a preparação compreende pelo menos75% de peso, e mais preferencialmente 90-99% de peso do componente de interesse. A purezaé medida por meio de métodos apropriados para o componente de interesse (por exemplo,espectometria de massa e similares).

O termo "proteína isolada" ou "proteína isolada e purificada" é, às vezes, utilizado napresente invenção. Este termo refere-se a uma proteína produzida pela expressão de umamolécula de ácido nucleico isolada da presente invenção. Alternativamente, este termo podereferir-se a uma proteína que foi suficientemente separada de outras proteínas as quais elapoderia estar naturalmente associada, tal como ela existe na sua forma "substancialmentepura": Θ termo "isolado" não exclui misturas sintéticas ou artificiais com outros compostos oumateriais, ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade fundamental daproteína, e que pode estar presente, por exemplo, em uma purificação incompleta, adição deestabilizadores, ou combinados dentro, por exemplo, em uma composição agriculturalmenteaceitável.

O termo "veículo agriculturalmente aceitável" refere-se a soluções nas quais umaproteína pesticida ou uma seqüência de ácido nucleico codificadora de uma proteína pesticidapossa ser mantida sem a alteração das propriedades funcionais da molécula da proteína aquidescrita para uso agrícola. Os veículos utilizados na presente invenção podem ser líquidos ousólidos. Veículos líquidos que podem ser utilizados para formar composições utilizandoproteína recombinante da presente invenção podem ser, mas não estão limitados a água ousolventes orgânicos, tais como polióis, ésteres, cloreto de metileno, álcool, ou óleo vegetal.Outros componentes que podem ser incluídos na formulação incluem umectantes,preservativos, espessantes, agentes antimicrobianos, antioxidantes, emulsificadores, polímerosformadores de filme e misturas destes. Umectantes podem incluir polióis, açúcares (tais comomelaço), glicóis e sais higroscópicos. Membranas vítreas, polímeros formadores de filmesincluem goma rosina, látex, pirrolidona polivinil, álcool polivinil, cloreto polivinil, polietileno,acetato de polivinil, e misturas destes. Aditivos opcionais adicionais incluem metil,metalcrilato, e misturas destes.

Os termos "análogo peptídico" ou "análogo mutante" significam um análogo natural oumutante de uma proteína, compreendendo uma série de fragmentos lineares ou discontínuosdaquela proteína e no qual pode ter um ou mais aminoácidos recolocado(s) com outro(s)aminoácido(s) e que pode ter sua atividade biológica alterada, auxiliada, aumentada oudiminuída quando comparada com a proteína parental nativa ou não-mutada.

O termo "atividade biológica" diz respeito a uma função ou um grupo de funçõesexecutado por uma molécula em um contexto biológico (isto é, em um organismo ousubstituto in vitro ou algum outro modelo similar). Para as proteínas entomotóxicas, aatividade biológica é caracterizada pelas propriedades físico-químicas como por exemplo,estruturação em domínios altamente hidrofóbicos, capazes de formar oligômeros, e afinidadepor membrana biologicas, causando a destruição das mesmas. Esta afinidade por membranaspode ser ocasionada pela presença de receptores específicos bem como pela simples interaçãoquímica entre ambas.

Como usado aqui, o termo "impactando insetos-praga" refere-se ao efeito de mudar nosinsetos a alimentação, crescimento, e/ou comportamento em qualquer estágio dodesenvolvimento, incluindo, mas não limitado a: matar o inseto; retardar o crescimento;impedir capacidade reprodutiva; atividade anti-alimentação; e outros semelhantes.

Os termos "atividade pesticida" e "atividade inseticida" são utilizados sinonimamentepara referir-se a atividade de um organismo ou uma substância (p.ex: uma proteína) que podeser medida por, mas não estando limitada a mortalidade da praga, perda de peso da praga,repelência à pragas, e outros comportamentos e mudanças físicas de uma praga depois daalimentação e exposição por um apropriado período de tempo. Dessa forma, o impacto daatividade pesticida deve ter pelo menos um parâmetro mensurável de aptidão da praga. Porexemplo, "proteínas pesticidas" são proteínas que desencadeiam a atividade pesticida por elasmesmas ou em combinação com outras proteínas. Endotoxinas e δ-endotoxina são proteínaspesticidas. Outros exemplos de proteínas pesticidas incluem, por exemplo, pentina-1 ejaburetox.

O termo "quantidade efetiva de pesticida" diz respeito a uma quantidade de umasubstância ou organismo que tem atividade pesticida quando presente no ambiente da praga.Para cada substância ou organismo, a quantidade efetiva de pesticida é determinadaempiricamente para cada praga afetada em um ambiente específico. Similarmente o termo"quantidade efetiva de pesticida" pode ser usado para referir a uma "quantidade efetiva depesticida" quando uma praga é um inseto-praga.

O termo "recombinantemente engenheirado" ou "engenheirado" diz respeito a utilizaçãoda tecnologia do DNA recombinante para gerar (engenheirar) uma mudança na estrutura daproteína baseando-se no entendimento do mecanismo de ação da mesma, podendo osaminoácidos serem introduzidos, deletados ou substituídos.

O termo "Embaralhamento de DNA" é utilizado para descrever um método empregadoem evolução molecular dirigida in vitro para gerar variantes de uma única seqüência gênica,ou duas ou mais seqüências gênicas homólogas por meio de recombinações de fragmentosgerados randomicamente, com recuperação de seqüências modificadas e com conseqüentemodificação de resíduos de aminoácidos na proteína codificada pelo análogo mutante.

O termo "apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - Phage display" dizrespeito a um sistema de expressão e de interações de proteínas fusionadas a bacteriófagos quepermitem uma varredura em células, tecidos ou órgãos a procura de pares receptores-ligantes,sendo esses ligantes proteínas que se ligam aos receptores presentes no alvo em estudo.

Como usado aqui, o termo "seqüência de nucleotídeo mutada" ou "mutação" ou"seqüência de nucleotídeo mutageneizada" diz respeito a uma seqüência de nucleotídeo quefoi mutada ou alterada para conter para conter um ou mais resíduos de nucleotídeos (p.ex.:pares de base) que não estão presentes no tipo selvagem ou na seqüência não-mutada. Talmutagênese ou alteração consiste de uma ou mais adições, deleções, ou substituições ourealocamento de resíduos de ácidos nucleicos.

O termo "análogo" ou "mutante" é utilizado para identificar um gene que foi alteradopor mutação e que o torna diferente do tipo selvagem ou da variação normal da população.Como usado aqui, o termo "melhora da atividade inseticida" ou "melhora da atividadepesticida" caracteriza um polipeptídeo ou uma δ-endotoxina da invenção que possui aatividade pesticida contra coleópteros melhorada em relação às outras δ-endotoxinas quesejam efetivas contra insetos. Para medir a melhora da atividade pesticida ou inseticida deve-se requerer uma demonstração de aumento da toxicidade de pelo menos 10%, contra o insetoalvo, e mais preferencialmente 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 100%,200% ou um maior aumento de toxicidade com relação à atividade inseticida das δ-endotoxinas Cry8 existentes que sejam ativas contra o mesmo inseto.

O termo "toxina" ou "endotoxina" está relacionado a um polipeptídeo, o qual aprensetaatividade tóxica inseticida. E conhecido, no estado da técnica, que as δ-endotoxinas deocorrência natural, são sintetizadas por B. thuringiensis, os quais esporulam liberando ainclusão cristalina protéica contendo a δ-endotoxina.

Para um interesse particular da invenção, foram otimizadas seqüências codificandoproteínas pesticidas desta invenção. Como usada aqui, os termos "seqüências de nucleotídeosotimizadas" ou "seqüências sintéticas" referem-se a ácidos nucleicos que são otimizados paraexpressão em um organismo particular. Seqüências de nucleotídeos otimizadas incluemaquelas seqüências que foram tão modificadas que o conteúdo GC da seqüência denucleotídeos passa a ficar alterado. Tal modificação na seqüência de nucleotídeo pode ou nãocompreender uma região codificadora. Onde a seqüência modificada de nucleotídeocompreende uma região codificadora, as alterações no conteúdo de GC podem ser feitas emvista de outro fenômeno genético, como por exemplo, a preferência de um códon por umorganismo particular ou a tendência do conteúdo de GC na região codificadora.

Em algumas concretizações da invenção, onde a seqüência de nucleotídeo otimizadacompreende a região codificadora, a alteração no conteúdo de GC não resulta em umamudança na proteína codificada pela seqüência de nucleotídeo. Em outras concretizações, aalteração no conteúdo de GC resulta em mudanças na proteína codificada que podem sermudanças em aminoácidos conservados que podem não alterar significantemente a função daproteína codificada. O conteúdo de GC de uma seqüência de nucleotídeo pode diferir daseqüência de nucleotídeo nativa em pelo menos 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%,ou 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%,20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%,26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%,42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, ou 50%, ou mais. Então, o conteúdo de GC deuma seqüência de nucleotídeo otimizada pode ser 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%,49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%,65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, ou80%, ou maior.

Um especialista no assunto tem conhecimento de que avanços no campo da biologiamolecular tais como uma mutagênese sítio-específica ou ao acaso, metodologia da reação depolimerase em cadeia (PCR), e técnicas da engenharia protéica dispõem de uma extensivacoleção de ferramentas e protocolos viáveis para o uso para alterar ou engenheirar ambas asseqüências de aminoácido e seqüências genéticas disfarçadas de proteínas de interesseagrícola. Então, as proteínas pesticidas da invenção podem ser alteradas de várias maneiras,incluindo substituição de aminoácido, deleções, truncações, e inserções. Métodos para taismanipulações são geralmente conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, uma seqüência deaminoácido variante da proteína pesticida da presente invenção pode ser preparada pelaintrodução de mutações dentro de um ácido nucleico sintético (p.ex.: molécula de DNA).Métodos para mutagênese e alterações em ácidos nucleicos são bem descritos no estado datécnica.

O desenho do gene sintético foi realizado com base na seqüência original do gene,incluindo a porção N-terminal da proteína com os três domínios responsáveis pela atividadeinseticida. No desenho do gene sintético foram modificados 262 pares de base, resultando naeliminação de 25 possíveis sinais de poliadenilação, 17 motivos de instabilidade, 95 códonspouco usados em plantas e no aumento do conteúdo de G-C de 35.6 para 43.8%. A seqüênciaprotéica final do gene sintético é idêntica a seqüência original, ou seja, permaneceu inalterada.

Entende-se que os polipeptídeos da invenção podem ser produzidos tanto pela expressãode um ácido nucleico descrito aqui, ou pelo uso de técnicas padrões de biologia molecular.

Sabe-se que proteínas pesticidas podem ser oligoméricas e variam em peso molecular,número de resíduos, componentes peptídicos, atividades contra pragas particulares, e outrascaracterísticas. No entanto, pelos métodos descritos aqui, proteínas ativas contra umavariedade de pragas podem ser isoladas e caracterizadas. As proteínas pesticidas da invençãopodem ser usadas em combinação com δ-endotoxinas Bt ou outras proteínas inseticidas paraaumentar a ação no inseto alvo. Além do mais, o uso de proteínas pesticidas da presenteinvenção em combinação com δ-endotoxinas de Bt ou outros princípios inseticidas de umanatureza diferente podem ter uma utilidade particular para prevenção e/ou manejo daresistência à inseto. Outros princípios inseticidas incluem, mas não estão limitados a inibidoresde protease (ambos serina e cisteína), lectinas, alfa-amilases, e peroxidases.

A invenção também diz respeito a microrganismos transformados com pelo menos umácido nucleico da presente invenção, com um gene quimérico compreendendo o ácidonucleico, ou com um vetor de expressão compreendendo o gene quimérico. Preferencialmente,o microrganismo é um que se multiplica em plantas. Mais preferencialmente, o microrganismoé uma bactéria colonizadora de raiz. Uma concretização da presente invenção diz respeito auma proteína pesticida encapsulada, que compreende um microrganismo transformadocompreendendo pelo menos uma proteína pesticida da invenção.

A invenção também provê composições pesticidas compreendendo um organismotransformado da invenção. Preferencialmente o microrganismo transformado está presente nacomposição pesticida em uma quantidade pesticida efetiva, junto com um veículo carregadoraceitável. A invenção também compreende composições pesticidas compreendendo umaproteína isolada da invenção, sozinha ou em combinação com um organismo transformado dainvenção e/ou uma proteína pesticida encapsulada da invenção, em uma quantidade inseticidaefetiva, junto com um veículo aceitável.

A invenção também provê um método de aumentar o alcance do inseto alvo através douso de proteínas pesticidas da invenção em combinação com pelo menos uma segundaproteína pesticida que seja diferente da proteína pesticida da invenção. Qualquer proteínapesticida conhecida no estado da técnica pode ser utilizada no método da presente invenção.Tais proteínas pesticidas incluem, mas não estão limitadas a δ-endotoxinas de Bt, inibidores deprotease, lectinas, alfa amilases, hidrolases acil Iipidicasi e peroxidases.

A invenção também compreende plantas transgênicas ou transformadas compreendendopelo menos uma seqüência nucleotídica da invenção. Preferencialmente, a planta éestavelmente transformada com um gene quimérico compreendendo pelo menos umaseqüência nucleotídica da invenção operacionalmente ligada a um promotor que dirige aexpressão em células vegetais. Como usado aqui, o termo "plantas transgênicas" ou "plantastransformadas" refere-se a uma planta que compreende dentro de seu genoma umpolinucleotídeo heterólogo. Geralmente, o polinucleotídeo heterólogo é integrado ao genomade uma, planta transgênica, de forma estável para que o polinucleotídeo seja passado paragerações sucessivas. O polinucleotídeo heterólogo pode ser integrado dentro do genomasozinho ou como parte de um vetor recombinante.

Como usado aqui, o termo "transgênico" inclui qualquer célula, linhagem celular, calos,tecidos, parte da planta, ou genótipo da planta que tem sido alterado pela presença do ácidonucleico heterólogo incluindo aqueles transgênicos inicialmente alterados bem como aquelescriados por cruzamento sexual ou propagação sexual do transgênico sexual.

O termo "plantas" refere-se a organismos fotossintéticos, ambos eucariotos eprocariotos, onde o termo "plantas desenvolvidas" refere-se a plantas eucariotas. O termorefere-se a plantas inteiras, órgãos vegetais (p.ex.: folhas, caules, raízes, flores, entre outros),sementes, células vegetais, e progênies dos mesmos. Partes das plantas transgênicas tambémestão incluídas dentro do escopo da invenção compreendendo, por exemplo, células vegetais,protoplastos, tecidos, calos, embriões, bem como flores, óvulos, caules, frutos, folhas, raízesoriginados de plantas transgênicas ou sua progênie previamente transformada com umamolécula de DNA da invenção e, portanto, consistindo de pelo menos parte das célulastransgênicas, são também objeto da presente invenção. Os ácidos nucleicos da invençãopodem ser utilizados para conferir tratos desejados em essencialmente qualquer planta. Então,a invenção possui uso sobre várias espécies de plantas, incluindo espécies dos gêneros Anona,Arachis, Artocarpus, Asparagus, Atropa, Avena, Brassica, Caríca, Citrus, Citrullus,Capsicum, Carthamus, Cocos, Coffea, Cucumis, Cucurbita, Daucus, Elaeis, Fragaria,Glycine, Gossypium, Helianthus, Heterocallis, Hordeum, Hyoseyamus, Lactuca, Linum,Loliumi Lupinus, Lycopersicon, Malus, Manihot, Majorana, Medicago, Nicotiana, Olea,Oryza, Panieum, Pannesetum, Passiflora, Persea, Phaseolus, Pistachia, Pisum, Pyrus,Prunus, Psidium, Raphanus, Ricinus, Secale, Senecio, Sinapis, Solanum, Sorghum,Theobromus, Trígonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vignà, e Zea. Particularmente a presenteinvenção diz respeito a plantas de algodão transformadas com as seqüências nucleotídicas dapresente invenção bem como fragmentos e derivados das mesmas, mais especificamenteplantas transformadas de Gossypium hirsutum.

Protocolos de transformação bem como protocolos para introduzir seqüências denucleotídeos dentro de plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou de célulavegetal, por exemplo, monocotiledôneas ou dicotiledôneas, alvos da transformação. Métodosviáveis de introduzir seqüências nucleotídicas em células vegetais e a subseqüente inserçãodentro do genoma vegetal são bem descritos no estado da técnica e podem ser, mas não estãolimitados a técnicas tais como eletroporação e microinjeção de protoplastos de células deplantas, ou a construção pode ser introduzida diretamente no tecido vegetal utilizando-semétodos balísticos, tais como bombardeamento de partículas recobertas com DNA.

Técnicas de microinjeção são conhecidas no estado da técnica e bem descritas emliteratura científica e patentária (Zhou, G., Wang, J., Zeng, Y., Huang, J., Qian, S., Liu, G.,Introduction of exogenous DNA into cotton embryos. Meth. in Enzymol., 101,433-448, 1983)(como mencionado no pedido de patente US4743548). A introdução de construções gênicasutilizando-se precipitações de polietileno glicol é descrita em Paszkowski et al. (Paszkowski,J., Shillito, R. D., Saul, M., Mandák, V., Hohn, T. Hohn, B., Potiykus, I., Direct gene transferrto plants. Èmbo I. 3; 2717-2722, 1984) (como mencionado no pedido de patenteUS20020152501). Técnicas de eletroporação são descritas em Fromm et al (Fromm, M- EiJTaylor, L. P. Waíbot, V., Èxpressipn of genes electroporated into monocot and dicot plantcells. Proc. Natl. AcadL Sei. USA 82:5824, 1985) (como mencionado no pedido de patente;US20020152501). Técnicas de transformações balísticas são descritas em Klein et al (Klein,T. M., Wolf,. E. D., Wu, JR., Sanfòrd, J. C. High velocity microprojectiles for deliveringnucleic acids into livingr cells. Nature_327:70-73, 1987) (como_mencionado no pedida depatente US20020152501).

Alternativamente, as construções gênicas podem ser combinadas com regiõesflanqueadoras de T-DNA apropriadas e introduzidas em um vetor convencional, o hospedeiroAgrobacterium tumefaciens. A função de virulência do hospedeiro Agrobacterium tumefaciensdirecionará a inserção das construções gênicas e marcador adjacente dentro do DNA da célulavegetal quando a célula é infectada pela bactéria. Técnicas de transformação mediadas porAgrobacterium tumefaciens, incluindo desarmamento e o uso de vetores binários, são bemdescritas na literatura científica (como mencionado no pedido de patente US 20020152501,

Horsch, R. B„ Fraley, R. T., Rogers, S. G., Sanders, P. R„ Lloyd, A., Hoffinann, NJInheritance of fimctional foreign genes in plants. Science 233:496-498, 1984; e Fraley, R. T\jRogersvS. G., Horsch, R. B., Sanders, P. R., Flick, J. S., Adams, S- P., Bittaer, M. L., Brand -L. A., Fink, C. L., Fry, J. S., Galluppii G. R., Goldberg, S. B., Hoffinann, N. L, Woo, S. CjExpression of bacterial genes in plant cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803, 1983).

Células de plantas transformadas derivadas de qualquer uma das técnicas detransformação descritas acima podem ser cultivadas para regenerar uma planta inteira quepossua o genótipo transformado e então o fenótipo desejado, tal como resistência a insetos.Tais técnicas de regeneração contam com a manipulação de certos fitohormônios em meio decrescimento de cultura de tecidos, tipicamente contendo um marcador biocida e/ou herbicida,que deve ser introduzido junto com a seqüência de nucleotídeos desejada. Regeneração deplantas a partir de cultura de protoplastos é descrita em Evans et al (Evans, D. E., and Bravo,J. E., Protoplasts Isolation and Culture, Handbook of Plant Cell Culture, vol. 1, 124-176,MacMillilan Publishing Company, New York,/1983); e Binding 1985 (Binding, H.,;Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRCJPress, Boca Raton, 1985) (como'mencionado no pedido de patente US20020152501). A regeneração pode ser também obtidaatravés de calos de planta, explantes, órgãos, ou parte da mesma. Tais técnicas de regeneraçãosão descritas geralmente em Klee et al (Klee, H., Horsch, R., Rogers, S., Âgrobacterium-·mediated plant transformation and its further appliçations to plant biology. Ann. Ver. OfPlantPhys, 38:467-486, 1987 (como mracionado no pedido de patente US2002015250T).

Sabe-se que os genes codificando as proteínas pesticidas podem ser usados paratransformar organismos patogênicos a insetos. Tais organismos incluem baculovírus, fungos,protozoários, bactérias, e nematóides.

Um gene codificando uma proteína pesticida da invenção pode ser introduzido através deum vetor viável dentro de um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro pode ser aplicado noambiente, ou em plantas, ou em animais. O termo "introduzido" no contexto de inserir umácido nucleico dentro de uma célula significa "transfecção" ou "transformação" ou"transdução" e inclui a incorporação de um ácido nucleico dentro de uma célula procarióticaou eucariótica onde o ácido nucleico pode ser incorporado dentro do genoma da célula (p.ex.:cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertido dentro de um repliconautônomo, ou expresso transientemente (p.ex.: RNAm transfectado).

Microorganismos hospedeiros têm sido conhecidos por ocupar a "fitosfera" (filoplano,filosfera, rizosfera, e/ou rizoplano) de uma ou mais cultivares de interesse selecionada(s).Esses microorganismos de interesse são selecionados para serem capazes de competir comsucesso em um meio ambiente particular com microorganismos selvagens, provendo umamanutenção e expressão estável do gene expressando a proteína pesticida, e desejavelmente,melhorar a proteção do pesticida da degradação ambiental e inativação.

Tais microorganismos incluem, mas não estão limitados a bactérias, algas e fungos.Particularmente os microorganismos incluem bactérias tais como Pseudomonas, Erwinia,Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius,Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, eAlcaligenes, fungos, particularmente leveduras, por exemplo, Saccharomyees, Cryptoeoceus,Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, e Aureobasidium. De particular interesseexistem as espécies bacterianas da fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonasfluoreseens, Serratia mareescens, Acetobacter xylinum, Agrobacteria, Rhodopseudomonasspheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, Clavibacterxyli e Azotobacter vinlandir e espécies de leveduras da fitosfera tais como Rhodotorula rubra,R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptoeoceus albidus, C. diffluens, C. laurentii,Saceharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus,Kluyveromyces veronae, e Aureobasidiumpollulans.

Existem vários métodos viáveis para introduzir um gene expressando a proteínapesticida dentro de um microrganismo hospedeiro sob condições que permitam a manutençãoe a expressão estável do gene. Por exemplo, vetores de expressão podem ser construídoscontendo a seqüência nucleotídica de interesse operacionalmente ligada a sinais regulatóriosde transcrição e tradução para expressão da seqüência de nucleotídeo. Quando uma seqüênciade nucleotídeo homóloga interna do organismo se encontra com a seqüência no vetor deexpressão, poderá haver uma recombinação entre elas e o gene que codifica a proteínapesticida se integrará no genoma do organismo hospedeiro de forma estável.Células hospedeiras viáveis, onde as células contendo a proteína pesticida serão tratadaspara prolongar a atividade da proteína pesticida na célula quando a célula tratada for aplicadano meio ambiente da praga alvo, podem incluir células de procariotos ou eucariotos,normalmente sendo limitadas àquelas células que não produzem substâncias tóxicas emorganismos superiores. No entanto, organismos que produzem substâncias tóxicas emorganismos superiores podem ser usados, desde que a toxina seja instável ou o nível deaplicação suficientemente baixo para evitar qualquer possibilidade de toxicidade a hospedeirosmamíferos. Particularmente os hospedeiros são procariotas e eucariotas menos desenvolvidoscomo os fungos. Exemplos de procariotos, ambos gram negativos e gram positivos, incluem,mas não estão limitados a Enterobacteriaceae, tais como Escheríchia, Erwinia, Shigella,Salmonella, e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, tais como Rhizobium; Spirillaceae, taiscomo Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum;Lactobacillaceae; Pseudomonadaeeae, tais como Pseudomonas e Aeetobaeter;Azotobacteraeeae e Nitrobaeteraeeae. Entre os eucariotos podem ser exemplificados osfungos, tais como Phyeomyeetes e Aseomyeetes, os quais incluem leveduras, tais comoSaccharpmyees e Schizosaceharomyees; e Basidiomyeetes, tais como Rhodotorula,Aureobasidium, Sporobolomyces, e semelhantes.

Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para opropósito de produzir a proteína pesticida incluem a facilidade de introdução do gene daproteína pesticida dentro do sistema de expressão, eficiência de expressão, estabilidade daproteína no hospedeiro, e a presença de capacidades genéticas auxiliares. Características deinteresse para o uso de uma microcápsula pesticida incluem qualidade protetora para opesticida, tais como espessura da parede celular, pigmentação, e empacotamento intracelularou formação de corpos de inclusão; afinidade foliar; ausência de toxicidade a mamíferos;atratividade para ingestão pelas pragas; facilidade de matar e fixar sem prejudicar a toxina; esemelhantes. Outras considerações incluem facilidade de formulação e manuseio, economia,estabilidade de estocagem, e semelhantes.

Organismos hospedeiros de particular f interesse incluem leveduras, tais comoRhodotorula spp., Aureobasidium spp., Saccharomyees spp., e Sporobolomyces spp.,organismos filoplanos tais como Pseudomonas spp., Erwinia spp., e Flavobaeterium spp., eoutros organismos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens,Saccharomyces eerevisiae, Bacillus thuringiensis, Eseheriehia eoli, Bacillus subtilis, e outrossemelhantes.

Na presente invenção, um microorganismo transformado (contendo a seqüênciacodifícadora da proteína pesticida da invenção) ou uma proteína pesticida isolada pode serformulado como um veículo carregador aceitável dentro de uma composição pesticida, quepode ser, por exemplo, uma suspensão, uma solução, uma emulsão, um pó, um grânulodispersível, um pó umedecido, um concentrado emulsificado, um aerosol, um grânuloimpregnado, um adjuvante, uma cápsula coberta, e também encapsulações em, por exemplo,substâncias poliméricas.

Tais composições divulgadas aqui podem ser obtidas pela adição de um agentesuperfície-ativo, um veículo carregador inerte, um preservativo, um umectante, um estimulantede alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, um emulsificador, umcorante, um protetor U.V. (ultra-violeta), um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante,doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciam o crescimento da planta.Um ou mais agroquímicos incluindo, mas não limitados a herbicidas, inseticidas, fungicidas,bactericidas, nematicidas, moluscocidas, acaricidas, reguladores de crescimento de planta,suportes de colheita, e fertilizantes, podem ser combinados com veículos carregadores,surfactantes ou adjuvantes normalmente utilizados em formulações, ou outros componentesutilizados para facilitar o manuseio e aplicação para uma praga alvo em particular.Carregadores e adjuvantes viáveis podem ser sólidos ou líquidos e correspondem a substânciasordinariamente empregadas em uma tecnologia de formulação, por exemplo, natural ousubstâncias minerais regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umidificantes, ligantes, oufertilizantes. Os ingredientes ativos da presente invenção são normalmente aplicados na formade composições e podem ser aplicados na área cultivada, plantas, ou sementes a ser tratadas.Por exemplo, as composições da presente invenção podem ser aplicadas em grãos naspreparações ou durante a estocagem em um silo de grãos, por exemplo. As composições dapresente invenção podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão com outroscompostos. Métodos de aplicar um ingrediente ativo da presente invenção ou uma composiçãoagroquímica da presente invenção que contenha pelo menos uma das proteínas pesticidasproduzidas pelas cepas bacterianas da presente invenção incluem, mas não estão limitados aaplicação foliar, cobertura de semente, e aplicação no solo. O número de aplicações e taxa deaplicação dependerá da intensidade da infestação pela praga correspondente.

Exemplos de materiais inertes incluem, mas não estão limitados a minerais inorgânicostais como kaolina, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, ou materiais botânicos tais comocortiça, caroço de milho em pó, massa do amendoim, massa do arroz, concha da noz.

As composições da presente invenção podem estar em uma forma viável para aplicaçãodireta ou como um concentrado da composição primária que requer diluição com umaquantidade viável de água ou outro diluente antes de ser aplicada. A concentração pesticida irávariar dependendo da natureza da formulação em particular, especificamente, se é umconcentrado ou será utilizado diretamente. A composição pode conter de 1 a 98% de umveículo inerte líquido ou sólido, e 0 a 50%, preferencialmente de 0,1% a 50% de umsurfactante. Essas composições serão administradas em uma taxa rotulada para produtoscomerciais, preferencialmente cerca de 0,01 Ib - 5,0 Ib por acre quando na forma seca e cercade 0,01 pts - 10 pts por acre quando na forma líquida.

As concretizações da presente invenção podem ser efetivas contra uma variedade depragas. Para os propósitos da presente invenção, as pragas incluem, mas não estão limitadas a,insetos, fungos, bactérias, nematóides, ácaros, patógenos protozoários, parasitas animais, esemelhantes. Pragas de particular interesse são insetos-praga, particularmente insetos-pragaque causam danos significativos para plantas agrícolas. Entende-se como "insetos-praga"insetos ,e outras pragas similares tais como, por exemplo, os insetos das ordens Diptera,Hymenoptera, Lepidoptera, Mallophaga, Homoptera, Hemiptera, Orthroptera, Thysanoptera,Dermaptera, Isoptera, Anoplura, Siphonaptera, Trichoptera, etc., particularmente Coleoptera,especialmente Anthonomus grandis, Diabrotica virgifera e Lepidoptera. Insetos-praga dapresente invenção da maioria das cultivares incluem, mas não estão limitadas a Milho:Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Helicoverpa zea, Spodoptera frugiperda, Diatraeagrandiosella, Elasmopalpus lignosellus, Diatraea saecharalis, Diabrotica virgifera virgifera,Diabrotica longieornis barberi, Diabrotica undeeimpunetata howardi, Melanotus spp.,Cyclocephala borealis, Cyclocephala immaculata, Popillia japoniea, Chaetoenema puliearia,Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Anuraphis maidiradieis, Blissus leueopterusleucopterus, Melanoplus femurrubrum, Melanoplus sanguinipes, Hylemya platura, Agromyzaparvicomis, Anaphothrips obscrurus, Solenopsis milesta, Tetranychus urticae', Sorgo: Chilopartellus, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Elasmopalpus lignosellus, Feltiasubterranea, Phyllophaga crinita, Eleodes, Conoderus, e Aeolus spp., Oulema melanopus,Chaetocnema pulicaría, Sphenophorus maidis, Rhopalosiphum maidis, Sipha flava, Blissusleucopterus leucopterus, Contarinia sorghicola, Tetranychus cinnabarinus, Tetranychusurticae; Trigo: Pseudaletia unipunctata, Spodoptera frugiperda, Elasmopalpus lignosellus,Agrotis orthogonia, Elasmopalpus lignosellus, Oulema melanopus, Hypera punctata,Diabrotica undecimpunetata howardi, Schizaphis graminum, Macrosiphum avenae,Melanoplus femurrubrum, Melanoplus dijferentialis, Melanoplus sanguinipes, Mayetioladestruetor, Sitodiplosis mosellana, Meromyza americana, Hylemya coaretata, Frankliniellafusca, Cephus einctus, Aceria tulipae; Girassol: Cylindrocupturus adspersus, Smieronyx fulus,Smicronyx sordidus, Suleima helianthana, Homoeosoma electellum, Zygogrammaexclamationis, Bothyrus gibbosus, Neolasioptera murtfeldtiana) Algodão: Heliothis virescens,lagarta-das-maçãs; Helicoverpa zea, lagarta da espiga do milho; Spodoptera exigua, lagarta docartucho; Pectinophora gossypiella, lagarta rosada; Anthonomus grandis, bicudo-do-algodoeiro; Aphis gossypii, pulgão-do-algodoeiro; Pseudatomoscelis seriatus, pulga saltadorado algodão; Trialeurodes abutilonea, mosca branca Bemisia tabaci; Melanoplus femurrubrum,gafanhoto; Melanoplus differentialis, gafanhoto; Thrips tabaci, tripes-do-fumo; Franklinkiellafusca, tripés; Tetranyehus cinnabarinus, ácaro vermelho; Tetranychus urticae, ácaro-rajado;Arroz: Diatraea saccharalis, Spodoptera frugiperda, Helicoverpa zea, Colaspis brunnea,Lissorhoptrus oryzophilus, Sitophilus oryzae, Nephotettix nigropictus, Blissus leucopterusleucopterus, Acrosternum hilare', Soja: Pseudoplusia includens, Anticarsia gemmatalis,Plathypena scabra, Ostrinia nubilalis, Agrotis ipsilon, Spodoptera exigua, Heliothis virescens,Helicoverpa zea, Epilachna varivestis, Myzus persicae, Empoasca fabae, Acrosternum hilare,Melanoplus femurrubrum, Melanoplus differentialis, Hylemya platura, Sericothrips variabilis,Thrips tabaci, Tetranychus turkestani, Tetranychus urticae', Cevada: Ostrinia nubilalis,Agrotis ipsilon, Schizaphis graminum, Blissus leucopterus leucopterus; Acrosternum hilare,Euschistus servus, Jylemya platura, Mayetiola destruetor, Petrobia latens; Canola:Vrevicoryne brassicae, Phyllotreta cruciferae, Phyllotreta striolata, Phyllotreta nemorum,Meligethes aeneus, Meligethes rufimanus, Meligethes nigrescens, Meligethes canadianus, eMeligethes viridescens; Batata, Leptinotarsa decemlineata.

Os exemplos abaixo são colocados de forma a ilustrar e elucidar melhor a invenção enão podem ser tidos como forma de limitar a presente invenção.

EXEMPLOS

Técnicas usuais de biologia molecular (p.ex.: transformação de bactérias e eletroforeseem gel de agarose de ácidos nucleicos) estão descritas por meio de termos comumenteempregados. Detalhes da prática de tais técnicas são descritos em Sambrook et al (Sambrook,J., Russell, D. W., Molecular Cloning, Ã Laboratory Manual, 2pd ed., Cold Spring HarboxLaboratoiy Press. 1989);.

Exemplo 1 - Seleção da estirpe S811 de Bacillus thuringiensis proveniente do Banco deGermoplasma da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnológicos.

Em um trabalho prévio de Silva-Werneck et al. (Monerat, R. Gv Silva, S. F., Silva-Werneck, J. Ó. Gatálogqído bancojde germnplasma de Brasília:Embrapa-Çenargen, Documentos 60, 65 p., 2001), foram identificadas e caracterizadasdiversas estirpes pertencentes ao Banco de Germoplasma Microbiano da Embrapa RecursosGenéticos e Biotecnologia. Dentre estas, selecionou-se a estirpe S811 devido a sua elevadaatividade entomotóxica contra insetos da ordem Coleóptera, como, por exemplo, Anthonomusgrandis. A avaliação da toxicidade foi feita por meio de bioensaios seletivos, utilizando-secomo substrato o extrato protéico total da bactéria Bacillus thuringiensis S811.

Para obtenção do extrato bruto protéico a estirpe foi cultivada em meio de cultura caldonutritivo (MCCN; caldo nutriente 8 g/L, extrato de levedura 1 g/L e 1 g/L de fosfato depotássio monobásico) a 30°C, sob uma agitação de 200 rpm. Após 12 horas de cultivo, com acultura em fase vegetativa e após 48 - 72 horas com completa esporulação, pode-se obter omaterial genético e o extrato protéico bruto, respectivamente.

Exemplo 2 - Identificação, isolamento e caracterização do gene cry8 proveniente da estirpe deBacillus thuringiensis S811.A extração de DNA total do Bacillus thuringiensis S811 foi realizada de acordo com oprotocolo de CTAB (2 % CTAB, 0,2 % de β-mercaptoetanol). Após 12 horas de cultivo, 30mL da cultura, em fase vegetativa, foram centrifugados a 5000 rpm por 20 minutos. Osedimento foi congelado em nitrogênio líquido e macerado seguindo-se as descrições doprotocolo descrito por Romano, E. (Romano, E. Extração de DNAj de tecidos vegetaisTIn:lManual de transformação genética de plantas. A.C.M. Brasileiro & V.T.C. Carneiro (Eds).Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, Brasília, 1998). O produto final foi seco eressuspendido em 50 μί de água Milli-Q e, posteriormente, armazenado a -20°C.

Para identificação de genes codificadores de toxinas Cry na estirpe S811, foi utilizada atécnica de PCR (Reação em Cadeia da Polimerase). As amplificações foram realizadasutilizando oligonucleotídeos específicos para detecção de genes do subgrupo cryl '(Cerón, J.;Covarrubias, L.; Quintero, R.; Ortiz, A.; Õrtiz, M.; Aranda, E.; Lina, L., Bravo, A. PCRanalysis of the çryl insecticidal crystal family genes from Bacilliis thuringiensis. AppljEnviron. Microbiol., 60, 353-356, 1994; Çerón, J.; Ortizj A.; Quintero, R.; Güereca, L., BravoJA. Specific PCR primers directed to identify çryl and crylll genes within a Bacilluslthuringiensis strain collection. Ãppl.Environ. Microbiol.,61, 3826-3831, 1995) e ery8 (Bravo,A.; Sarabia, S.; Lopez, L.; Óntiveros? H.; Abarca, C.; Ortiz, A.; Ortiz, Mj.; Lina, L;. ViJlalobos,F.J.; Pena, G.; Nunez-Valdez, M.É.; Soberón, M.; Quintero, R. Charactenzation of cry Genesín a Mexican Bacillus thuringiensis Strain Collection. Appl. Environ. Microbiol., v. 64, p.4965-4972, Í998).

As condições de reação PCR contendo os oligonucleotídeos do grupo crylforam descritas por Cerón et al (Cerón, J.; Covarrubias, L.; Quintero, R.; Ortiz, A.; Ortiz, M.;Aranda, E.; Lina, L., Bravo, A. PCR analysis of the cryl insecticidal crystal family genes from'Bacillus thuringiensis. Appl. Environ,'Mjçrobioj.^ 60^ 353_*356, 1994) e as condições de reaçãode PCR contendo os oligonucleotídeos do grupo cry8 foram descritas por Bravo et al (BravojA.; Sarabia, S.; Lopez, L.; Ontiveros, H.; Abarca, C.; Ortiz, A.; Ortiz, M.; Lina^ L;. yijlaíobosjF.J.; Pena, G.; Nunez-Valdez, M-E1; Soberón, M.; Quintero, R- Characterization ofpy Genesin a Mexican BaciUus thuringiensis^Strain Collection. Appl. Environ. Microbioí., v. .64, pj4965:4972, 1998). Todas as reações foram realizadas em volumes de 25 μΐ-, contendo 2,5 μgde DNA total, 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 2 mM de MgCl2, 50 mM KCl, 200 mM de cada dNTP(deoxi-ribonucleotídeos trifosfato), 500 nM de cada oligonucleotídeo e 0,1 U^L de Taq DNApolimerase para cada amostra de DNA. A amplificação foi realizada em termociclador(MasterCicle Gradient Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturação prévia a 94 0C por2 minutos, repetição e 30 ciclos a 94 0C por 45 segundos (desnaturação), anelamento dosoligonucleotídeos por 45 segundos (temperatura específica para cada oligonucleotídeo), 72 0Cpor 2 minutos (extensão da DNA polimerase) e ao final uma extensão final de 72 0C por 5minutos. Os fragmentos amplificados por PCR foram separadas e visualizados em gel 0,8% deagarose. Os fragmentos de DNA foram excisados do gel e purificados utilizando-se kitGeneClean (BiolOl System) e quantificados por espectrofotometria. Os fragmentospurificados foram então ligados a 50 ng de vetor comercial pGEMT-easy (PROMEGA), narazão molar de 3:1 (inserto:vetor) com 4 υ/μί T4 DNA ligase e tampão 1 X no volume finalde 15 μι. Os vetores gerados foram utilizados para transformar células competentes deEscherichia coli por eletroporação. Os clones positivos foram identificados por PCR decolônia e tiveram seu DNA plasmidial extraído. Os DNAs plasmidiais obtidos foramseqüenciados em um seqüenciador automático ABI, utilizando-se oligonucleotídeos gerais T7,SP6, reverso e universal (Nag, D.K.,Huang, H.V. and Berg5 D.E. Bidirectiona!ChainterminationNucleotide Sequencing: Transposon Tn5seql as a_ Mobile Source of PrimerSites. Gene 64, 135-145.1988).

As seqüências obtidas foram comparadas com as seqüências do Banco de Dados(GeneBank e SwissProt) pelo programa BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)· Oalinhamento múltiplo das seqüências dos clones obtidos foi realizado com as seqüências maissimilares depositadas no Banco de Dados (GeneBank) foi feito pelo CLUSTALW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) (Thompson, J. D., D. G. Higgins e ;T. J. GibsonjCLUSTALW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment throughsequence weighting, po^jáot^ecifíc^g^ jjenalties^and weight matrix choice. Nucleic AcidgRes, v.22, n.22, ΝρνΙΙ,ρ,4673-4680. 1994).

A primeira reação de amplificação por PCR com os oligonucleotídeos específicos para afamília cry8, Bravo et al, 1998, teve como resultado um fragmento de 442 pb (Figura 1)correspondente à extremidade 5' de um novo gene pertencente a família ery8 (SEQ. ID NO.l).Como intuito de obter a seqüência completa do gene ery8, realizou-se duas rodadas deamplificação pela técnica de TAIL-PCR (Reação da Polimerase em Cadeia por EntrelaçamentoTermal Assimétrico) S(Liu, Ϋ.; Whittier, R-F. Thermal asymmetric interlaced PCR:Automatable amplification and sequencing of insert end fragmentsfrom Pl and YAC clonegfor chromosome walking. Genomics, v. 25, p. 674-681, 1995) (Figura 2). Esta técnica consisteuma aplicação da técnica de PCR que permite o isolamento de segmentos de DNA adjacentesa seqüências conhecidas, utilizando para tal o DNA genômico do organismo. A técnica utilizaoligonucleotídeos específicos seqüenciais, junto a pequenos oligonucleotídeos arbitráriosdegenerados de modo a controlar termicamente a eficiência de amplificação relativa deprodutos específicos e inespecíficos. Intercalando-se ciclos de altas e baixas estringências,produtos específicos são preferencialmente amplificados sobre produtos não-específicos.

Resumidamente, feitas três reações seqüenciais de PCR utilizando usandooligonucleotídeos específicos derivados das seqüências previamente amplificadas de um lado(Bravo, A.; Sarabia, S.; Lopez, L.;Õntiveros, H.; Abarca, C.; Òrtiz, A.; Òrtiz, M.; Linai L;jVillalobos, F.J.; Pena, G.; Nunez-Valdez, M.E.; Soberón, M.; Quintero, R. Characterization ofcry Genes in a Mexican Bacillus thuringiensis Strain Collection. Appl. Environ. MicrobioL, v.164, p. 4965-4972, 1998) e oito oligonucleotídeos arbitrários do outro (Liu5 Y.; Whittier, R.F.Thermal asymmetric interlaced PCR: Automatable amplification and sequencing of insert endfragments from Pl and YAC clones for chromosome walking. Genomics, v. 25, p. 674-68 Ij1995) Fragmentos foram amplificados, clonados, seqüenciados e analisados nas mesmascondições descritas anteriormente para a identificação inicial do gene.

O produto final, obtido pela técnica de TAIL-PCR, contém 2688 pb amplificado (SEQID N0 1) e codifica uma nova δ-endotoxina de 896 aminoácidos (SEQ ID N0 2). A análise daseqüência nucleotídica pelo programa BLASTn, tendo como padrão de busca o banco de dadosde patentes depositados no NCBI, indentificou a seqüência da presente invenção como sendocorrespondente à família Cry8, apresentando mais de 90% de identidade, como demonstradonos alinhamentos (Figuras 18, 19, 20 e 21).

Análises da seqüência protéica predita do novo gene Cry8 mostram a presença dos trêsdomínios estruturais característicos das δ-endotoxinas, em sua porção N-Terminal. As análisestambém demonstram a presença de mais 240 aminoácidos da extensão C-terminal da nova δ-endotoxina (Figura 3).O alinhamento das seqüências de aminoácidos da presente invenção com outrasproteínas patenteadas da família Cry8 mostra que a nova δ-endotoxina difere 80% das outrasseqüências de aminoácidos, apresentando cerca de 150 aminoácidos conservados (Figura 19).

Quando comparada a outras δ-endotoxinas, a nova δ-endotoxina Cry8, apresentoumaior similaridade com o gene cry8Aa (53% identidade e 67% similaridade), seguido dosgenes cry8Ba (53% identidade e 66% similaridade) e cry8Ca (49% identidade e 65%similaridade). A Figura 4 apresenta um dendograma do alinhamento da nova toxina Cry8 comas demais toxinas Cry8 depositadas no banco de dados até o momento atual. Na Figura 4podemos observar a alta identidade entre as toxinas. A escala indica que no espaçorepresentado existe a troca de pelo menos 0,1 aa.

As extremidades N-terminal e C-terminal da nova δ-endotoxina Cry8Kal apresentamalta identidade com outras δ-endotoxinas Cry8, enquanto os três domínios estruturais sãomenos conservados, particularmente o segundo e terceiro domínios (Tabela 1), que estãoenvolvidos na ligação ao receptor, sugerindo novas atividades/especificidades inseticidas parao gene isolado.

Tabela 1. Identidade média entre os domínios da δ-endotoxina Cry8Ga e os domínioscorrespondentes em outras δ-endotoxina Cry8.

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Exemplo 3 - Construção do vetor de expressão contendo o novo gene cry8Kal e obtenção datoxina recombinante.

Para expressão da proteína heteróloga foi utilizado o vetor de expressão comercialpET 101-D/TOPO (Invitrogen - Figura 5). O vetor foi adquirido em sua forma linearizada comuma extremidade abrupta e outra coesiva, complementar à extremidade do inserto de geneamplificado. Neste sistema, o produto de PCR é diretamente clonado pela adição dos quatropares de bases do oligonucleotídeo de orientação "sense". A extremidade coesiva do vetor declonagem (GTGG) invade a extremidade 5' do produto de PCR, anelando-se com as quatrobases adicionadas (CACC) e estabiliza o produto de PCR na correta orientação. Atopoisomerase então cliva a porção sobressalente do produto de PCR para que a ligação sejaefetiva (Figura 6). Os insertos podem ser clonados desta forma com 90% de eficiência.

Para amplificar o gene cry8 com as extremidades complementares, foram desenhadosoligonucleotídeos com base no códon de iniciação (ATG) dos genes, com adição da seqüênciaCACC na região 5' do oligonucleotídeo em orientação "sense", segundo instruções dofabricante do sistema pET Directional TOPO cloning (Invitrogen). O oligonucleotídeo"antisense" não possui o códon de terminação, pois o mesmo encontra-se logo após a cauda depoli-histidina (Figura 5). Estes oligonucleotídeos foram então utilizados em uma reação dePCR com volume final de 25 μί, contendo 400 nM de cada oligonucleotídeo, 200 mM dedNTPs, 1 X do tampão para a enzima pfu, 2,5 U de DNA polimerase pfu (Stratagene) e 10 ngdos genes ciy clonados no vetor pGEMT-easy (Invitrogen). A amplificação foi realizada emtermociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturaçãoprévia a 94 0C por 1,5 minuto uma repetição de 30 ciclos a 94 °C por 1 minuto (desnaturação);55 °C por 1 minuto (anelamento dos oligonucleotídeos) e 72 °C por 2 minutos (Extensão daDNA polimerase) e ao final uma extensão 72 °C por 5 minutos.

O produto gerado foi então submetido a uma reação de ligação nas seguintes condições:10 ng do produto de PCR, 200 mM de NaCl, 10 mM de MgC12, 1 μί do vetor pETIOl. Amistura foi incubada à temperatura ambiente, 25 °C, por 30 minutos. Células competentes deE. coli TOPlO foram transformadas com 3 μl do sistema de ligação (10 ng) por choquetérmico. Para este procedimento, os 10 ng de DNA foram misturados a 200 μί de célulascompetentes e a mistura incubada em gelo por 30 min. O choque térmico foi realizado por 3minutos a 42 °C. As células foram imediatamente transferidas para o gelo e subseqüentementeforam adicionados 500 μl de meio de cultura SOC (2% triptona; 0,5% extrato de levedura;0,05% NaCl; 2,5 mM KCl; 20 mM MgC12). Posteriormente, as células foram inoculadas em10 mL de meio de cultura Luria-Bertani ágar contendo 100 μΜ de ampicilina/mL e crescidasdurante 16 horas, a 37 °C. Para verificação de clones positivos foi realizada uma PCR decolônia, a qual utilizou como molde o DNA das bactérias transformadas e as mesmascondições descritas para a clonagem dos genes. Os clones positivos foram então inoculadosem 5 mL de meio Luria-Bertani ágar contendo 100 μΜ de ampicilina/mL.

Para expressão do novo gene, os plasmídieos gerados foram transformados por choquetérmico em células de Escherichia colí BL21 (DE) Star (Invitrogen). Foram adicionados 10 ngdos vetores pET101/cry8Kal em 200 μί de células competentes e incubou-se a mistura emgelo por 30 minutos. O choque térmico foi realizado por 3 min a 42 0C e, logo em seguida, amistura de células foi colocada no gelo. Em seguida, adicionou-se 250 μί de meio SOC eincubou-se por 30 minutos a 37 0C e 200 rpm de agitação. Após este período as células foraminoculadas em 10 mL de meio LB-amp e crescidas por 16 horas. Esta cultura foi entãoutilizada com pré-inóculo para a expressão. Para cada 100 mL de meio Luria-Bertoni foramadicionados a 5 mL do pré-inóculo. O material foi incubado a 37 0C com 200 rpm de agitação.

Após a cultura atingir a DOôoo entre 0,6-0,8 foi adicionado o indutor (IPTG) na concentraçãode 1 mM e a cultura permaneceu a 37 0C por mais 16 horas a fim de se obter a toxinarecombinante Cry8Kal. Determinadas as condições de cultura ideais para melhor rendimentoda expressão da proteína recombinante, as células foram inoculas em volumes de 500 mL.Após as 18 h de cultivo, o montante de células foi centrifugado por 10 minutos a 4000 geosobrenadante foi descartado. O precipitado de células foi ressuspenso em 10 mL de tampão deIise (50 mM de tampão fosfato pH 7,8; 300 mM NaCl, 10% glicerol, 0,5% triton X-100contendo ou não 2 mg/mL lisozima) e as células foram rompidas por ultra-som (3X5 min). Oproduto lisado foi então centrifugado por 15 min a 10000 g. O sobrenadante foi entãorecolhido, quantificado pela metodologia descrita por Lowry et ai. (Lowry, O. H., N. J.<Rosebrough, with the Folin phenol reagent. Biol Chem, v.193, n.l, Nov,p.265-275.1951).

Com o intuito de obter a toxina recombinante purificada, o sobrenadante obtido foisubmetido à cromatografia de afinidade a Níquel (Ni), utilizando-se 5 ml da resina Ni-NTA(ácido nitrilotriacético-Níquel), com a capacidade de reter 5-10 mg de proteína recombinantecom cayda de poli-histidina. A resina foi então empacotada em uma coluna de vidro eequilibrada com 4 volumes de coluna com solução de equilíbrio (50 mM de tampão fosfato desódio pH 7,8; 300mM NaCl e 10 mM imidazol). A amostra foi adicionada (não excedendo acapacidade total da resina) e a porção não retida, reservada e quantificada para análise. Oexcesso de material foi retirado com a adição de 3 volumes de coluna de tampão de equilíbrio.A lavagem foi realizada com 6 volumes de coluna de solução de lavagem (50 mM de tampãofosfato pH 7,8; 300 mM NaCl e 20 mM imidazol). A proteína foi eluída com dois volumes decoluna de tampão de eluição (50 mM de tampão fosfato pH 7,8; 300mM NaCl e 250 mMimidazol). O material eluído foi então dialisado contra 15 mM tampão carbonato (1,59 g deNa2CC>3 e 2,93 g de NaHCOí), quantificado por Lowry e submetido à eletroforeseunidimensional em gel de poliacrilamida 12 % (Figura 7). A Figura 7 mostra todo o processode expressão e purificação da nova δ-endotoxina, em gel de poliacrilamida 12%.

Exemplo 4 - Bioensaios seletivos contra o bicudo-do-algodoeiro para determinação daatividade entomotóxica da nova δ-endotoxina recombinante Cry8Ka 1.

Com a finalidade de verificar a atividade das toxinas recombinantes foram realizados osbioensaios seletivos contra os insetos-praga de interesse. Os bioensaios seletivos foramrealizados segundo Praça et al (Praça, L. Bi, Batista,C., Martins, E. S., Siqueira, C. BjDias; D. G. S., Gomes, A. C. M. M., Falcão, R., Monnerat, G. R. Estirpes De Bacillusithuringiensis Efetivas Contra Insetos Das Ordens' Lepidoptera., Coleoptera E Díptera. Brasília:Embrapa-Cenargen. 2004, VoL 39, No 1, p. 11-16), incorporando-se 50 μg/mL, 100 μg/níL,200 μg/mL da nova toxina recombinante Cry8Kal em 5 mL de dieta artificial (a 50 °C),vertida em Placas de Células de 6 poços NUNC™. Após solidificação da dieta, foram feitos 15furos de aproximadamente 0,6 mm , onde as larvas neonatas (uma por furo) foram inseridas,sendo realizada a leitura no sétimo dia ^Monnerat, RvG., Dias,S;C., Oliveira^Neto; O.B. dejNobre, S.D., Silva-Werneck, J.O. E Sa, M.F.G. de. Criação Massal Do Bicudo-do-aigodoeiroÂnthonomus Grandis Em Laboratório. Brasília: Émbrapa-Cenargen, 2000. 4p. ComunicadoTécnico, 46)J Os bioensaios foram repetidos três vezes e utilizou-se como controle positivoutilizou-se culturas da estirpe de Bacillus thuringiensis S811, contendo o gene cry8 nativo e,como controle negativo, 15 mM tampão carbonato.

Como controle externo ao experimento realizou-se bioensaios contra larvas neònatas deSpodoptera frugiperda. Os bioensaios mostraram atividade tóxica significativa da cultura de

Bacillus thuringiensis expressando a toxina:· Cry8Kal nativa, bem como da toxinarecombinante pura, sobre Anthonomus grandis (Figura 8). Desta forma, foi confirmada aatividade entomotóxica do gene cry8Kal.

Exemplo 5 - Geração de genes mutantes, análogos ao gene cry8Kal nativo, altamenteeficazes no controle de Anthonomus grandis pela técnica de embaralhamento de DNA.

A construção de biblioteca de genes recombinantes análogos ao novo gene cry8 é umaimportante estratégia biotecnológica, contribuindo de modo importante em programas demelhoramento de plantas, via transformação genética para geração de transgênicos. Estatecnologia disponibiliza uma variedade de novas moléculas com potencial uso natransformação de plantas visando o controle do inseto-alvo, bem como a melhoria da atividadeinseticida de novas proteínas codificadas pelos genes recombinantes. Este fator torna-se aindamais relevante quando levamos em consideração os baixos níveis de expressão destasproteínas heterólogas em plantas geneticamente transformadas.

Uma vez confirmada a atividade entomotóxica da nova δ-endotoxina Cry8Kal contra oinseto-praga Anthonomus grandis, partiu-se para a estratégia de obtenção in vitro de novosgenes, análogos ao gene cry8, codificadores para a mesma toxina Cry8Kal. Para isso, o genenativo cry8Kal foi re-amplificado por PCR com oligonucleotídeos específicos para seqüênciagênica em questão, os quais contêm a seqüência da enzima de restrição Sfil (5 OGCCNNNNNGGCC3'). Estes oligonucleotídeos foram desenhados em nosso laboratório utilizando-secomo molde a seqüência gênica nativa cry8Kal e introduzem às extremidade 5'e 3' do genenativo a seqüência da enzima em questão (oligonucleotídeo 5': SfiI F - 5'CCCGGCCCAGGCGGCCGACCACGCGTATCGA 3' e oligonucleotídeo 3': SfiI R - 5'CCCGGCCGGCCTGGCCGTTCAAGGAACCGTT 3'). Estes oligonucleotídeos foram então utilizados em umareação de PCR com volume final de 25 \iL, contendo 300nM de cada oligonucleotídeoespecífico, 200 nM de dNTPs, 1 X do tampão para a enzima taq (PHT), 1 U de DNApolimerase taq (PHT) e 400 ng de DNA cry8Kal (ativo. A amplificação foi realizada emtermociclador (Mastercycler Gradient -τ Eppendorf) sob as seguintes condições: desnaturaçãoprévia a 95 0C por 5 minutos; uma repetição de 29 ciclos a 95 0C por 40 segundos(desnaturação), 45 0C por 40 segundos (anelamento dos oligonucleotídeos) e 72 0C por 40segundos (Extensão da DNA polimerase) e ao final uma extensão 72 0C por 2 minutos.A reação gerou um produto de 2000 pb (pares de base), o qual foi submetido a umaeletroforese em gel de agarose 1%, a 100 Volts por 90 minutos. O fragmento gênico foiexcisado e eluído do gel de agarose utilizando-se o kit Geneclean Π (Qbiogene). Foramdigeridos 100 μg do novo produto de DNA (SfiHcry8Kal/SfiI) com a enzima SfiI por 24 horasa 50 °C. O produto da digestão enzimática foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose1%, excisado e eluído do gel. Ao final, obteve-se aproximadamente 40μg do novo produto deDNA (SfiIlcry8Kal/SfiI) digerido com SfiI.

Seguindo o protocolo da técnica de embaralhamento de DNA descrito por Stemmer,W.P.C.et ai., (Stemmer, W. P. C. Rápid evolution of aproteinJn yitro By Embaralhamento deFO DNA. Nature. London, 1994, Vol. 370, p. 389 - 391; Zhao, H. and Amold, F.H. Functionaland_ nonfunctional mutationsdistinguished by random recombination of homologous genesjProc. Natl. Acad. Sei, USA., 1997, VoL 94, p. 7997 - 8000), foi realizada a digestão, com anuclease DNAseI, de 10μg do novo produto de DNA (SfiI/cry8Kal/Sfií) digerido com SfiI. Areação foi conduzida em tampão próprio da enzima com 10 U da mesma e interrompida pelaadição de 26 mM de EDTA (Ácido 4-acético 2-amino etileno). Após esta etapa, o produtogênico é completamente fragmentado gerando pequenos pedaços gênicos de 30 a 50 pb, osquais foram purificados com o Kit High Pure PCR Product Purification® (Roche). Osfragmentos purificados foram utilizados em uma reação de PCR, a qual seguiu as seguintescondições: 100 ng do produto puro digerido com DNAseI, 1 X do Tampão Taq Platinum, 2.5mM de dNTPs, 0.5 mM de MgSO4, 2,5 U de Taq Platinum High Fidelity DNA polimerase. Areação de PCR foi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob asseguintes condições: desnaturação prévia a 95 0C por 2 minutos, uma repetição de 43 ciclos a95 0C por 1 minuto (desnaturação); 44 0C por 1 minuto (anelamento dos fragmentos) e 72 0Cpor 1 minuto com acréscimo de 5 segundos por ciclo (Extensão da DNA polimerase) e ao finaluma extensão 72 0C por 7 minutos.

Esta reação de embaralhamento de DNA é conduzida sem a adição de oligonucleotídeos,o que gera ao final um montante de fragmentos de tamanhos variados. Este novo produto éentão utilizado na segunda reação de PCR como molde, nas seguintes condições: 1/3 dovolume dõ produto da primeira reação (molde), 1 X do Tampão Taq Platinum, .0,2 mMdNTPs, 0,8 μΜ dos oligonucleotídeos específicos Sfil F e Sfil R, 2mM de MgSO4 e 25 U namistura de 1:1 Taq Platinum High Fidelity (Invitrogen)/Taq PHT. A reação de amplificaçãofoi realizada em termociclador (Mastercycler Gradient - Eppendorf) sob as seguintescondições: desnaturação prévia a 95 0C por 2 minutos, uma repetição de 10 ciclos a 95 0C por30 segundos (desnaturação); 45 0C por 30 segundos (anelamento dos fragmentos), 72 0C por 1minuto (extensão da DNA polimerase), outra repetição de 14 ciclos a 95 0C por 30 segundos(desnaturação), 43 0C por 30 segundos (anelamento do produto), 72 0C por 42 segundos(extensão da DNA polimerase) com acréscimo de 20 segundos por ciclo e ao final umaextensão 72 0C por 7 minutos.

Sendo assim, o gene original é reconstituído com modificações em sua estruturanucleotídica, seja pela introdução, deleção ou substituição de nucleotídeos. Este produto final,reconstmído foi submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1%, a 100 Volts por 90minutos, excisado e eluído do gel com o Kit Geneclean® II (Qbiogene). O produto purificado,aproximadamente 25 μg, foi então digerido com a enzima de restrição Sfil (condiçõesanteriores) e submetido a uma eletroforese em gel de agarose 1% , a 100 Volts por 90 minutos.

A banda no tamanho aproximado do gene original (aproximadamente 2000 pb) foi excisada dogel e o DNA eluído pelo Geneclean II Kit (Qbiogene) (Figura 9).

O produto final (população de genes recombinados) com adaptadores específicos torna-se apto à clonagem no vetor pCOMB3X (Andris-Widhopf, J.; Rader, C.; Steinberger, P.;Full er, R., Barbas III, C. F. Methods for the generation of chicken monoclonal antibodyfragments by Phage display. Journal of Immunological Methods, 242: 159-181, 2000). Assim,os novos genes reconstruídos (análogos ao gene nativo cry8Kal) foram clonados no vetor comauxílio da enzima T4 DNA Ligase® (Invitrogen) e este utilizado para transformar células deEscherichia eoli XLl-Blue® (Stratagene), via eletroporaçao, nas seguintes condições:capacitância 25 uFD, resistência 200 Ω, voltagem 2,5 KVolts. Os transformantes foram entãosemeados em placas contendo meio de cultura Luria-Bertani Agar e Ampicilina® USB (100μg/ mL). Após 17 horas a 37 0C as colônias crescidas em meio seletivo indicam o título dabiblioteca contendo IO5 transformantes.

Esta biblioteca de análogos de cry8Kal gerada por embaralhamento de DNA efusionados a proteína III do capsídeo do fago filamentoso M13 (fagos de fusão) foi entãoselecionada pela técnica de apresentação de proteínas na superfície de bacteriófagos - PhageDisplayi (Barbas ΙΠ, C. F.; Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. SeIegtion from antibodylibraries. In: Phage display - Ã Laboratory Manual - USA: CoId Spring Laboratory, 10.1 —{[Ϊ0.20, 2€K>ll utilizando como ligantes BBMVs de A. grandis (Francis, B. R., Maaty, W. STÃJjBulla- Jr, L. A. Effects of Midgut-Protein-Preparative and Ligand Binding Procedures on the{Toxin Binding Characteristics of BT-Rl, a Common High-Affinity Receptor in Manduca sextafe CrylA Bacillus thuringiensis Toxins. Applied arid Environmental Microbiology. June1998, Vol. 64, No. 6, ρ. 2158-2165).

O cultivo de células de E. coli XLl-Blue transformadas, em meio SB contendo IOOpg mL"carbenicilina, 5pg mL"1 tetraciclina, foi incubado em 37 0C com agitação até atingir densidadeóptica A550 = 0.6-0.8. Então, IxlO12 pfu mL"1 do fago auxiliar (VCSM13® Stratagene) foiadicionado para produzir fagos de fusão contendo os análogos do cry8Kal, incubados por 2 h a37 0C. Adicionou-se Canamicina IOOpg mL"1, e a incubação seguiu por 12 h a 37 0C. As célulascoletadas por centrifugação foram guardadas a :20 0C para posterior preparação de DNA. Osfagos dé fusão foram precipitados com PEG-8000 (4% p/v) durante 30 minutos no gelo e apóscentrifugação ressuspendidos em 2 mL of 1% (p/v) ASB (Albumina de soro bovino) em soluçãosalina. Coletados após centrifugação, a preparação de fagós de fusão é utilizada nos ciclos deseleção.

No procedimento de seleção por afinidade de ligação, os fagos fusionados foramdepositados em poços de uma placa de microtitulação previamente sensibilizados com BBMVs(100 pg pL"1), extraídas da membrana do intestino de larvas do bicudo do algodoeiro. A cadaciclo de seleção, os poços são lavados com solução PBS-Tween (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl,12mM Na2HP04, 1.2 mM KH2PO4 and 0.05% Tween 20®) e, os fagos específicos, eluídos embaixo pH, são usados para transfectar novas células de E. coli. As partículas de fagosamplificadas são utilizadas no sucessivo ciclo de seleção. O procedimento envolveu cinco ciclosde lavagem, eluição e amplificação. A titulação das colônias coletadas em cada ciclo é feito peloplaqueamento de colônias em diluições seriais em meio SB-agar contendo carbenicilina 100 pgmL"1. As colônias isoladas do montante de fagos específicos eluídos no quinto ciclo de seleção(apresentando o maior título e portanto, representando o ciclo de enriquecimento de fagosespecíficos) Figura 10 foram amplificadas com oligonucleotídeos específicos para o genecry8Kal. Colônias mostrando amplificação em PCR e contendo aproximadamente 2000bp(tamanho do gene original) foram selecionadas para a expressão em fagos Figura 11.

O gene cry8Kal e os genes análogos selecionados no quinto ciclo de seleção foramexpressados em meio seletivo (1% MOPS, 2% Extrato de Levedura, 3% triptona, 100 μg mL~'ampicilina, 5 μg mL"1 tetraciclina, 100 μg mL"1 Canamicina, pH 7.0) contendo o fago auxiliarVCSM13, com incubação de 18 h a 37°C. O cultivo foi centrifugado e os fagos coletadosprecipitados com solução PEG-NaCl (20% Polietileno-Glicol 8000, 15% Cloreto de Sódio)durante 30 minutos no gelo. Após a centrifigação os fagos foram ressuspendidos em soluçãosalina TBS (5 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, pH 7.5), novamente centrifugados, coletados earmazenados a 4°C para utilização imediata em bioensaios.

Os análogos selecionados foram avaliados por meio de bioensaios seletivos contra aslarvas de Anthonomus grandis, sendo aqueles que apresentaram maior atividade entomotóxicasubmetidos a uma reação de seqüenciamento nas seguintes condições: 400-800 ng de DNAplasmidial contendo os análogos e 4 pM de oligonucleotídeos específicos (Sfil R e Sfd F) emum seqüenciador automático modelo 3130 xL Genetic Analyzer (APPLIED BIOSYSTEMS).

Ao final, foram selecionadas quatro seqüências análogas ao novo gene cry8Kal, as quaisestão descriminadas na Tabela 2. As novas moléculas geradas pela recombinação do genecry8Kal apresentaram diferenças significativas de 13,29 a 16,33% pares de bases e de 2,10 a5,11% de resíduos de aminoácidos modificados (Tabela 2). Para a análise das seqüências eclassificação das mesmas como análogas do gene nativo cry8Kal, estas moléculas foramagrupadas por similaridade de seqüências nucleotídicas obedecendo ao sistema denomenclatura para toxinas Cry (http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil Crickmore/Bt/).Devido a uma variação < 5% entre as toxinas análogas e a toxina nativa Cry8Kal, as novasseqüências foram classificadas na família das toxinas Cry8, sendo posteriormente nomeadas deCry8Ka2, Cry8Ka3, Cry8Ka4 e Cry8Ka5 (Tabela 2) (SEQID N0 5-12).Tabela 2. Modificações de bases nucleotídicas e de resíduos de aminoácidos gerados pelatécnica de embaralhamento de DNA no gene cry8Kal e mortalidade de larvas neonatasde Anthonomus grandis alimentadas com as proteínas expressas no sistema de fago.

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Apesar do elevado número de mutações nucleotídicas nas seqüências geradas (de 13 a16%) ocorreram poucas modificações de resíduos de aminoácidos (de 2 a 5%) sendo geradotambém a deleção de resíduos de aminoácido na extremidade 5' das variantes. A novamolécula Cry8Ka5 se mostrou aproximadamente 3 vezes mais ativa que a molécula original(Cry8Kal) exibindo uma mortalidade de 77% das larvas neonatas alimentadas com dietacontendo 6 μg de proteína por mL de dieta (Figura 12).

Exemplo 6 - Determinação da estrutura terciária in silico das toxinas nativa Cry8Kal eanáloga Cry8Ka5.

As estruturas terciárias das toxinas Cry8Kal e do análogo Cry8Ka5 foram preditas insilico, sendo modeladas pela modelagem molecular utilizando como molde as estruturas decristal das toxinas Cry3Bbl e Cry3A (jljió.pdb; Galitsky, N., CodyilV.; Wojtczak, À ; Ghosh,D.; Luft, J. R.; Pangbomr W. & EngJish., L. Structure of insecticidaj bactéria] δ-endotoxin'Cry3Bbl οΐ Bacillus thuríngiensis. Acta Crystallpgraphica, Section D, BiologicalCrystallography? 57: 1101-1109, 2001) e Cry3A (Idlc.pdb; Li, J.; Carrol, J., Ellar, D. J. Crystalstructure of insecticidal δ-endotoxin from Bacillus thunngiensis^í 2.5A resolution. NatureJ353: 815-821, 199jj) depositadas no Banco de Dados de estrutura de Proteínas (PDB), Oalinhamento de seqüências múltiplas contendo as sequencias das estruturas moldes e datoxinas para modelar foi submetido para o programa Modeller Version 9.2 (Sali A, BlundellTL: Gomparative protein modeliing by satisfaction of spatial restraints. J Mol Biol 1993,1534(3):779-815

Os modelos obtidos pelo programa Modeller foram analisados quanto suaspropriedades estereoquímicas pelo programa PROCHECK (Laskowski RA, Macarthur MW]Moss PS, Thomton JM: Procheck - a Program to Check the Stereochemical Quality of ProteinStructures. Journal óf Applied Crystallography 1993,26:283-291)]

Os modelos de Cry8Kal e do análogo Cry8Ka5 mostraram o mesmo esqueletoestrutural, sendo diferenças observadas apenas nas cadeias laterais dos aminoácidossubstituídos no análogo. As estruturas original e análoga Ciy8Ka5 apresentam os trêsdomínios funcionais conservados (I, II, e III), típicos das toxinas Cry, sendo todas as mutaçõese/ou substituições localizadas na superfície externa da molécula (Figura 13).

Exemplo 7 - Bioensaios seletivos contra o bicudo-do-algodoeiro para determinação daatividade entomotóxica da nova δ-endotoxina recombinante Cry8Kal e seus análogosCry8Ka2, Cry8Ka3, Cry8Ka4 e Cry8Ka5.

Os bioensaios seletivos foram realizados seguindo as mesmas condições previamentedescritas no exemplo 3 desta invenção. A Figura 14 demonstra os resultados referentes asatividades entomotóxicas determinadas.

Exemplo 8 - Desenho de um gene cry8Kal sintético otimizado para expressão em plantas dealgodão.

O desenho do gene cry8Kal sintético foi baseado na seqüência do gene cry8Kal nativo,incluindo os três domínios responsáveis pela atividade inseticida, constituída de 666aminoácidos. No desenho do gene cry8Kal sintético foram modificados 262 pares de base,resultando na eliminação de 25 possíveis sinais de poliadenilação, 17 motivos de instabilidade,95 códons pouco usados em plantas e no aumento do conteúdo de G-C de 35.6 para 43.8%. Aseqüência protéica final do gene cry8Kal sintético (SEQ ED N0 4) é idêntica a seqüênciaoriginal (SEQ ID N0 2). Um resumo das modificações introduzidas é apresentado na Tabela 3.Tabela 3. Modificações introduzidas na seqüência nucleotídica do gene cry8Kal sintéticoe os parâmetros levados em consideração para modificações da seqüência (SEQS ID 03 e 04).

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Para modificar a seqüência do gene cry8Kal foi utilizada a metodologia Ligação Diretado Molde por Reação da Polimerase em Cadeia - TDL-PCR, descrita por Strizhov et al.(Strizhov, N.; Keller, M.; Mathur, J.; Kqncz-Kálmán, K.; Bosch, D.; Prudovsky, E.; Schell, J.;Sneh5 B. ; Konczl C.; Zilberstein, A. A synthetic crylC gene, encoding a Bacillus thuringiensisendotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa and tobacco. Proc. Natl. Acad. Sei. USA,v. 93, p. 15012-15017, 1996),

A seqüência do gene cry8Kal foi dividida em três blocos denominados A, B e C com595, 665 e 753 pb, respectivamente. Os blocos AeB são delimitados por um sítio de Nde I eos blocos BeC por um sítio de Spe I. Para a síntese do bloco A foram desenhados 6'oligonucleotídeos', para o bloco B, 7 'oligonucleotídeos' e para o bloco C, 9'oligonucleotídeos'. Os oligonucleotídeos nas extremidades de cada bloco contêm seqüênciasúnicas não complementares ao gene original, para a posterior amplificação seletiva por PCR.Dentro de cada bloco não há sobreposição na seqüência dos oligonucleotídeos.

Exemplo 9 - Construção do gene sintético cry8Kal otimizado para expressão em plantas dealgodão.

Resumidamente, a metodologia utilizada, 'template directed ligation-PCR' - TDL-PCR, descrita por Strizhov et al. £Strizhov, _N.; Kejler, M.; MathurpJ.; Koncz^Káhn&i,Bosch, D.; Prudovsky, E.; Schell, J.; Stteh5 B.; Koncz, C.; Zilberstein, Ã. A synthetic crylôgene, encoding a Bacillus thuringiensis endotoxin, confers Spodoptera resistance in alfalfa andíobacco. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 93, ρ. 15Q12-15Õ17,1996Í consiste das seguintesetapas: (1) Análise da seqüência e síntese química dos oligonucleotídeos com as modificaçõesa serem introduzidas; (2) Produção de DNA fita simples, da seqüência do gene, e que seráutilizado como molde na etapa subseqüente; (3) Anelamento dos oligonucleotídeos com oDNA molde fita simples, parcialmente complementar, derivado do gene original, e ligação dosoligos utilizando uma DNA ligase; (4) Amplificação seletiva e síntese da segunda fita do DNAsintético por PCR, com oligonucleotídeos complementares apenas ao DNA sintético; (5)Montagem do gene, subclonagem e seqüenciamento.

A Tabela 3 mostra as modificações introduzidas na seqüência nucleotídica do genecry8Kal sintético. A Tabela também mostra os parâmetros levados em consideração paramodificações da seqüência.

Modificações das concretizações aqui apresentadas, relacionadas com a presenteinvenção, poderão ser idealizadas por especialistas na matéria a que esta invenção se refere,partindo-se dos ensinamentos apresentados na presente descrição e respectivas Figuras.Portanto, entende-se que a invenção não se limita às concretizações especificamentedivulgadas e que eventuais modificações e outras concretizações podem ser incluídas dentrodo escopo da invenção aqui divulgada.

Todas as publicações e os pedidos de patentes mencionados no relatório descritivo sãoindicativos do estado da técnica à qual pertence esta invenção. Todas as publicações e ospedidos de patentes são aqui incorporados por referência.LISTAGEM DE SEQUENCIAS

INFORMAÇÃO GERAL:NÚMERO DE SEQ ID N0 12

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 1TAMANHO: 2710TIPO: DNA

ORGANISMO: Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 1

ATGAGTCCAAATAATCTAAATGAATATGAAATTATAGATGCGACACCTTCTACATCTGTATCTAATGATTCTACCAGATACCCTTATGCGAATGAGCCCACAAATGCGTTACAAAATATGAATTATAAGGATTATTTAAGAATGTCTGAAGGTTACGATAATAAATATTTTGCAAATCCTGAAGTGTTTGCTGCACCAGGTGGGATTACAACTGGAATTACTATAGTTACTAAATTACTGGGGTGGTTAGGACTTCCATTTGCTGGGGAAACAGGGATGGCTCTTAATTTCATTCTAGGTCTATTATGGCCAACATCAGGAAACCCGTGGGCTGAACTAATGATATTGGTAGAAGAACTCATAAATCAAAAAATAGAAGAGACTGTAAGAAACAAAGCACTAGCGGATTTGGGCAATTCAGGTAGAGCCTTACGATCCTATTTAAACGCATTTGAAGATTGGCAAAAAAACCCTAATATCTTTCGGAGTAAAGAGTTAGTAAAAGAAAGATTTTCAAACGCGGAACATTCATTACGTACCGAAATGAGTTCTTTTGCCATAAGAGGATTTGAAATTCCTCTTTTAGCAACATATGCACAAGCTGCGAATTTACATTTATTTCTAATTAAAGATATTCAAATTTATGGAAAAGAATGGGGATATACTCAAGCCGATATTGACTTATTTTATAGAGAACAAGTAGAGTTTACGAAAGAATACACCGAACACTGTATTAATATTTATAATGATGGTTTAAATCAATTAAAAGGTTCGAATGCTAAGCAATGGATTGCATTTAATCGCTTCCGTAGAGAAATGACATTGACGGTACTGGATGTAGTTGCATTATTCCCGAACTATGATGTACGTATGTACCCTATAAAAACAACTACAGAGCTAACGAGAACAATTTATACCGATCCACTTGGTTACACGAAAACGGGTTCTAGTAGTACACCACCATGGTATAATTATGGATCTAGTTTCTCATATATAGAAAGTGTAGCGATTCCAGCCCCTAGTCTGGTTAAGTGGTTAAGTCAGATTGAAATTTATTCGAAATCCGCAAGGGCTACACCGCAAAGTGCGGATTATTGGGCAGGACATACAATAACATATCACTATAGTGGAGATGATGGTCAAGCAGTACCTAATTATGGAGATAGAACGAATCCTGTAATTGTAAATCGTTATAATTTTGAGCAGGCTGACATTTATAGAGTTTCATCATCTGTTGCTTCAAGTACAACTAGTGGTGTTAAATTATTAACTACTAAGGCTATATTTGATGGCATAAGTACAAACAATGGACTAGTGAGTTACATGTATGAAAAATTATCGAACTTTTTTAATGAAidTAAAAGATACAATTACAGAGCTACCTGTTCAGATATCCAGTCCTCCTACCTACGGGGATGCTGAACAGTACAGTCATCGGCTATCCTATGTTTCTAATGCTCCAACAGAGTACTCTTCGGGCGGACATTTAATTTTGGGACTAATCCCAGTACTGGGTTGGACGCATACTAGTTTAACTCAAACAAATCAGATACATTCTGACTCAATTACTCAAATTCCAGCTGTTAAAGCAAATAGTGTTAGTTCTTATGTTACTGTTGAAAAGGGAACAGGCTTTACAGGTGGAGATTTAGTGAAATTCTCCACTGGATTCATGTCTACAGGAATACAGTTTAATTTAAAGATAGAAGAAAGAAAGCGTTATCGTATCCGTATACGATATGCCGCTGATGTTAATGCTACTCTATCTGCACTTGGATTAAATGATGCATTTATTAACATTAAATCGACAATGTCTCAAGACACACCATTGAAGTATAACGATTTCCAATATGCAGAAGCTGACAAAACAGTGCATTTATACAATCCTCGTTTTTCTTTATATTTAGAAAATTCAGATCAATCCGGGAAAAGTATTTATATAGATCGAATCGAATTCATCCCAGTAGATGAGACCTATGAAGCAGAACAAGATCTTGAAAATGCAAAGAAAGCAGTGAATGCTTTGTTTACGAATACAAAAGATGGATTACGACCAGGCGTAACGGATTATGAAGTAAATCAAGCGGCAAACTTAGTCGAATGCCTATCAGATGATTTGTATCCAAATGAAAAACGCTTGTTATTTGATGCAGTCAGAGAGGCAAAACGACTTAGCGAGGCACGAAACCTGCTTCAAGATCCAGATTTCCAAGAGATAAATGGAGAAAATGGATGGACTGCAAGTACAGGAATTGAGGTTGTAGAAGGGGACGCTTTATTTAAAGGGCGTTATCTACGCCTACCGGGTGCACGACAAATTGATACGGAAACGTATCCAACGTATTTGTATCAAAAAATTGACGAAGGTGTATTAAAGCCATACACAAGATATAGACTGAGAGGCTTTGTCGGAAGAAGTCAAGGATTAGAAATTTATACGATTCGTCACCAAACGAATCGAATTGTAAAAAATGTACCGGATAATTTATTGCCAGATGCATCTCCTGGAAATGCTGGTGATGGAATCAATCGATGCAGCGAACAAAAGTATGTAAATAGTCGTCTAGAAGGAGAAAAAGGCTTACCAAATGGCAGTCGTTCTGCTGAAGCGCATGAGTTCTCAATCCCTATCGATACAGGTGAAATCGATTACAATGAAAATGCAGGAATATGGGTTGGGTTTAAGATTACGGACCCAGAGCAAAAACAAC

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 2TAMANHO: 903TIPO: PROTEICAORGANISMO: Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 2

MSPNNLNEYEIIDATPSTSVSNDSTRYPYANEPTNALQNMNYKDYLRMSEGYDNKYFANPE VFAAPGGITTGITIVTKLLGWLGL PFAGETGMALNFILGLLWPTSGNPWAELMILVEELINQKIEETVRNKALADLGNSGRALRSYLNAFEDWQKNPNIFRSKELVKERFSNAEHSLRTEMSS FAIRGFEIPLLATYAQAANLHLFLIKDIQIYGKEWGYTQADIDLF YREQVEFTKEYTEHCINIYNDGLNQLKGSNAKQWIAFNRFRREMTLTVLDWALFPNYDVRMYPIKTTTELTRTIYTDPLGYTKTGSSSTPPWYNYGSSFSYIESVAIPAPSLVKWLSQIEIYSKS ARATPQS AD YWAGHTIT YH YSGDDGQAVPNYGDRTNP VIVNRYNFEQADIYRVS S SVASSTTSGVKLLTTKAIFDGISTNNGLVSYMYEKLSNFFNELKDTITELPVQISSPPTYGDAEQYSHRLS YVSNAPTEYSSGGHLILGLIPVLGWTHTSLTQTNQIHSDSITQIPAVKANSVSSYVTVEKGTGFTGGDLVKFSTGFMSTGIQFNLKIEERKRYRIRIRYAAD VNATLSALGLNDAFINIKSTMSQDTPLKYNDFQYAEADKTVHLYNPRFSLYLENSDQSGKSIYIDRIEFIPVDETYEAEQDLENAKKAVNALFTNTKDGLRPGVTDYEVNQAANLVECLSDDLYPNEKRLLFDAVREAKRLSEARNLLQDPDFQEINGENGWTASTGIEWEGDALFKGRYLRLPGARQIDTETYPTYLYQKIDEGVLKPYTRYRLRGFVGRSQGLEIYTIRHQTNRIVKNVPDNLL PDAS PGNAGDGINRCS EQKYVNS RLEGE KGL PNGSRS AEAHEFSIPIDTGEIDYNENAGIWVGFKITDPEQKQ

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 3TAMANHO: 2001TIPO: DNA

ORGANISMO: Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 3

ATGAGTCCAAACAACCTTAACGAATATGAGATTATCGATGCTACCCCTTCTACATCTGTTTCTAACGATTCTACCAGATACCCTTATGCTAACGAGCCTACAAATGCTTTGCAGAACATGAATTACAAGGATTACTTGAGAATGTCCGAGGGTTACGACAACAAGTATTTCGCAAACCCTGAGGTGTTCGCTGCACCAGGTGGGATCACAACTGGAATTACTATCGTTACTAAGTTGCTTGGTTGGTTGGGACTTCCATTCGCTGGGGAGACCGGTATGGCTCTTAACTTCATTCTTGGTCTTTTGTGGCCAACATCAGGAAACCCTTGGGCTGAGCTTATGATCTTGGTTGAAGAGCTCATCAACCAGAAGATCGAAGAGACTGTGAGAAACAAGGCACTTGCTGATTTGGGCAATTCAGGTAGAGCCTTGAGATCCTACTTGAACGCATTCGAGGATTGGCAGAAGAACCCTAACATCTTCAGGAGTAAGGAGTTGGTTAAAGAAAGATTCTCAAACGCTGAACATTCCTTGCGTACCGAGATGAGCTCTTTCGCCATCAGAGGATTCGAGATTCCTCTTTTGGCAACATATGCTCAAGCTGCTAACTTGCATTTGTTCCTCATCAAGGATATTCAAATCTACGGAAAGGAGTGGGGATACACTCAAGCCGATATTGACTTGTTCTACAGAGAGCAAGTGGAGTTTACTAAGGAGTACACCGAGCACTGTATCAATATCTATAACGATGGTTTGAACCAGTTGAAGGGTTCTAATGCTAAGCAATGGATTGCTTTCAATAGGTTCCGTAGGGAAATGACCTTGACTGTTCTTGATGTGGTTGCCTTGTTCCCTAACTACGATGTTCGTATGTACCCTATCAAGACAACTACAGAGCTTACCAGAACAATCTACACCGATCCACTTGGTTACACTAAGACCGGTTCTAGTAGCACACCACCATGGTACAACTATGGATCTAGTTTCTCCTACATCGAAAGTGTTGCTATTCCAGCCCCTAGTCTTGTTAAGTGGTTGAGTCAGATTGAGATCTATTCTAAGTCCGCAAGGGCTACACCTCAAAGTGCTGATTACTGGGCAGGACATACCATCACATACCACTACAGCGGAGATGATGGTCAAGCAGTTCCTAACTATGGAGATAGAACTAATCCTGTGATTGTGAACCGTTACAACTTCGAGCAGGCTGACATCTACAGAGTTTCATCCTCTGTTGCTTCCAGTACAACTAGTGGTGTTAAGTTGTTGACTACTAAGGCTATCTTCGATGGTATCAGTACCAACAATGGACTTGTGAGTTACATGTATGAGAAGTTGTCTAACTTCTTTAACGAACTCAAGGATACAATTACAGAGCTTCCTGTTCAGATCTCCAGTCCTCCTACCTACGGTGATGCTGAGCAGTACAGCCATAGGCTTTCCTACGTTTCTAACGCTCCAACAGAGTACTCTTCTGGTGGACACTTGATTTTGGGACTTATCCCAGTTCTTGGTTGGACCCATACCAGTTTGACTCAGACAAACCAGATCCATTCTGACTCAATTACTCAGATTCCAGCTGTTAAGGCAAACAGTGTTAGCTCTTACGTTACTGTTGAGAAGGGAACAGGCTTCACAGGTGGAGATTTGGTGAAGTTCTCCACCGGATTCATGTCTACCGGAATCCAGTTCAACTTGAAGATCGAAGAGAGAAAGCGTTACCGTATCCGTATTAGATATGCTGCTGATGTTAATGCTACTCTCTCTGCACTTGGATTGAATGATGCATTCATTAACATTAAGTCCACAATGTCTCAGGACACCCCTTTGAAGTACAACGATTTCCAATATGCAGAGGCTGACAAGACAGTGCATTTGTACAACCCTCGTTTCTCTTTGTACTTGGAAAACTCAGATCAATCCGGGAAGAGTATCTACATCGATAGAATCGAGTTCATCCCAGTGGATGAGACCTACGAGGCAGAGCAAGATCTTGAATGA

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 4TAMANHO: 666TIPO: PROTÉICA

ORGANISMO: Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 4

MSPNNLNEYEIIDATPSTSVSNDSTRYPYANEPTNALQNMNYKDYLRMSEGYDNKYFANPEVF AAPGGITTGITIVTKLLGWLGLP FAGETGMALNFILGLLWPTSGNPWAELMILVEELINQKIEETVRNKALADLGNSGRALRS YLNAFEDWQKNPNIFRS KELVKERFSNAEHSLRTEMS S FAIRGFEIPLLATYAQAANLHLFLIKDIQIYGKEWG YTQADIDLF YREQVE FTKE YTEHCINI YNDGLNQLKGSNAKQWIAFNRFRREMTLTVLDWALFPNYDVRMYPrKTTTELTRTIYTDPLGYTKTGSSSTPPWYNYGSSFSYIESVAIPAPSLVKWLSQIEIYSKSARATPQS AD YWAGHTIT YHYSGDDGQAVPNYGDRTNPVIVNRYNFEQADIYRVS S S VASSTTSGVKLLTTKAIFDGISTNNGLVSYMYEKLSNFFNELKDTITELPVQISSPPTYGDAEQYSHRLSYVSNAPTEYSSGGHLILGLIPVLGWTHTSLTQTNQIHSDSITQIPAVKANSVSSYVTVEKGTGFTGGDLVKFSTGFMSTGIQFNLKIEERKRYRIRIRYAADVNATLSALGLNDAFINIKSTMSQDTPLKYNDFQYAEADKTVHLYNPRFSLYLENSDQSGKSIYIDRIEFIPVDETYEAEQDLE

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

SEQ ID N0 5TAMANHO: 1982TIPO: DNA SINTÉTICO

ORGANISMO: Derivado de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 5

ATGAGACCAAATAATCTAAATGAATATGAAATTATAGATGCGACACCTTCTACATCTGTATCTAATGATTCTACCAGATACCCTTATGCGAATGAGCCCACAAATGCGTTACAGAATATGAATTATAAGGATTACTTAAGAATGTCTGAAGGTTACGATAATAAATATTTTGCAAATCCTGAAGTGTTTGCTGCACCAGGTGGGATTACAACTGGAATTACTATAGTTACTAAATTACTGGGGTGGTTAGGACTTCCATTTGCTGGGGAAACAGGGATGGCTCTTAATTTCATTCTAGGTCTATTATGGCCAACACCAGGAAACCCGTGGGCTGAACTAATGATATTGGTAGAAGAACTCATAAATCAAAAAATAGAAGAGACTGTAAGAAACAAAGCACTAGCGGATTTGGGCAATTCAGGTAGAGCCTTACAATCCTATTTAAACGCATTTGAAGATTGGCAAAAAAACCCTAATATCTTTCGGAGTAAAGAGTTAGTAAAAGAAAGATTTTCAAACGCGGAACATTCATTACGTACCGAAATGAGTTCTTTTGCCATAAGAGGATTTGAAATTCCTCTTTTAGCAACATATGCACAAGCTGCGAATTTACATTTATTTCTAATTAAAGATATTCAAATTTATGGAAAAGAATGGGGATATACTCAAGCCGATATTGACTTATTTTATAGAGAACAAGTAGAGTTTACGAAAGAATACACCGAACACTGTATTAATATTTATAATGATGGTTTAAATCAATTAAAAGGTTCGAATGCTAAGCAATGGATTGCATTTAATCGCTTCCGTAGAGAAATGACATTGACGGTACTGGATGTAGTTGCATTATTCCCGAACTATGATGTACGTATGTACCCTATAAAAACAACTACAGAGCTAACGAGAACAATTTATACCGATCCACTTGGTTACACGAAAACGGGTTCTAGTAGTACACCACCATGGTGTAATTATGGATCTAGTTTCTCATATATAGAAAGTGTAGCGATTCCAGCCCCTAGTCTGGTTAAGTGGTTAAGTCAGATTGAAATTTATTCGÂÃATCCGCAAGGGCTACACCGCAAAGTGCGGATTATTGGGCAGGACATACAATAACATATCACTATAGTGGAGATGATGGTCGAGCAGTAGCTAATTATGGAGATAGAACGAATCCTGTAATTGTAAATCGTTATAATTTTGAGCAGGCTGACATTTATAGAGTTTCATCATCTGTTGCTTCAAGTACAACTAGTGGTGTTAAATTATTAACTACTAAGGCTATATTTGATGGCATAAGTACAAACAATGGACTTGTGAGTTACATGTATGAGAAGTTGTCTAACTTCTTTAACGAACTCAAGGATACAATTACAGAGCTTCCTGTTCAGATCTCCAGTCCTCCTACCTACGGTGATGCTGAGCAGTACAGCCATAGGCTTTCCTACGTTTCTAACGCTCCAACAGAGTACTCTTCTGGTGGACACTTGATTTTGGGACTTATCCCAGTTCTTGGTTGGACCCATACCAGTTTGACTCAGACAAACCAGATCCATTCTGACTCAATTACTCAGATTCCAGCTGTTAAGGCAAACAGTGTTAGCTCTTACGTTACTGTTGAGAAAGGGACAGGCTTTACAGGTGGAGATTTGGAAATTTCCACTGGATTCATGTTCACAGGAATACAGTTTAATTTAAAGATAGAAGAAGGAAAGCGTTATCGTATCCGTATACGATATGCCGCTGATGTTAATGCTACTCTATCTGCACTTGGATTAAATGGTGCATTTATTAACATTGAATCGACAATGTCTCAAGACACACCATTGAAGTATAACGATTTCCAATATGCAGAAGCTGACAAAACAGTGCATTTATACAATCCTCGTTTTTCTTTATATTTAGAAAATTCAGATCAATCCGGGAAAAGTATTTATATAGATCGAATCGAATTCATCCCAGTAGATAACGGTTCCTTGAACGG

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 6TAMANHO: 660TIPO: PROTÉICAORGANISMO: Derivada de Bacillus thuringlensisSEQÜÊNCIA: 6

MRPNNLNEYEIIDATPSTSVSNDSTRYPYANEPTNALQNMNYKDYLRMSEGYDNKYFANPEVFAAPGGITTGITIVTKLLGWLGLPFAGETGMALNFILGLLWPTPGNPWAELMILVEELINQKIEETVRNKALADLGNSGRALQSYLNAFEDWQKNPNIFRSKELVKERFSNAEHSLRTEMSSFAIRGFEIPLLATYAQAANLHLFLIKDIQIYGKEWGYTQADIDLFYREQVEFTKEYTEHCINIYNDGLNQLKGSNAKQWIAFNRFRREMTLTVLDWALFPNYDVRMYPIKTTTELTRTIYTDPLGYTKTGSSSTPPWCNYGSSFSYIESVAIPAPSLVKWLSQIEIYSKSARATPQSADYWAGHTITYHYSGDDGRAVANYGDRTNPVIWRYNFEQADIYRVSSS^A.SSTTSGVKLLTTKAIFDGISTNNGLVSYMYEKLSNFFNELKDTITELPVQISSPPTYGDAEQYSHRLSYVSNAPTEYSSGGHLILGLIPVLGWTHTSLTQTNQIHSDSITQIPAVKANSVSSYVTVEKGTGFTGGDLEISTGFMFTGIQFNLKIEEGKRYRIRIRYAADVNATLSALGLNGAFINIESTMSQDTPLKYNDFQYAEADKTVHLYNPRFSLYLENSDQSGKSIYIDRIEFIPVDNGSLN

CARACTERITICAS DA SEQUENCIA:SEQ ID Ne 7

TAMANHO: 1991

TIPO: DNA SINTÉTICO

ORGANISMO: Derivado de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 7

ATGAGACCAAATAATCTAAATGAATATGAAATTATAGATGCGACACCTTCTACATCTGTATCTAATGATTCTACCAGATACCCTTATGCGAATGAGCCCACAAATGCGTTACAAAATATGAATTATAAGGATTACTTAAGAATGTCTGAAGGTTACGATAATAAATATTTTGCAAATCCTGAAGTGTTTGCTGCACCAGGTGGGATTACAACTGGAATTACTATAGTTACTAAGTTACTGGGGTGGTTAGGACTTCCATTTGCTGGGGAAACAGGGATGGCTCTTAATTTCATTCTAGGTCTATTATGGCCAACATCAGGAAACCCGTGGGCTGAACTAATGATATTGGTAGAGGAACTCATAAATCAAAAAATAGAAGAGACTGTAAGAAACAAAGCACTAGCGGATTTGGGCAATTCAGGTAGAGCCTTACAATCCTATTTAAACGCATTTGAAGATTGGCAAAAAAACCCTAATATCTTTCGGAGTAAAGAGTTAGTAAAAGAAAGATTTTCAAACGCGGAACACTCATTACGTACCGAAATGAGTTCTTTTGCCATAAGAGGATTTGAAATTCCTCTTTTAGCAACATATGCACAAGCTGCGAATTTACATTTATTTCTAATTAAAGATATTCAAATTTATGGAAAAGAATGGGGATATACTCAAGCCGATATTGACTTATTTTATAGAGAACAAGTAGAGTTTACGAAAGAATACACCGAACACTGTATTAATATTTATAATGATGGTTTAAATCAATTAAAAGGTTCGAATGCTAAGCAATGGATTGCATTTAATCGCTTCCGTAGAGAAATGACATTGACGGTACTGGATGTAGTTGCATTATTCCCGAACTATGATGTACGTATGTACCCTATAAAAACAACTACAGAGCTAACGAGAACAATTTATACCGATCCACTTGGTTACACGAAAACGGGTTCTAGTAGTACACCACCATGGTGTAATTATGGATCTAGTTTCTCATATATAGAAAGTGTAGCGATTCCAGCCCCCAGTCTGGTTAAGTGGTTAAGTCAGATTGAAATTTATTCGAAATCCGCAAGGGCTACACCGCAAAGTGCGGATTATTGGGCAGGACATACAATAACATATCACTATAGTGGAGATGATGGTCAAGCAGTAGCTAATTATGGAGATAGAACGAATCCTGtAATTGTAAATCGTTATAATTTTGAGCAGGCTGACATTTATAGAGTTTCATCATCTGTTGCTTCAAGTACAACTAGGGGTGTTAAATTATTAACTACTAAGGCTATCTTCGATGGTATCAGTACCAACAATGGACTTGTGAGTTACATGTATGAGAAGTTGTCTAACTTCTTTAACGAACTCAAGGATACAATTACAGAGCTTCCTGTTCAGATCTCCAGTCCTCCTACCTACGGTGATGCTGAGCAGTACAGCCATAGGCTTTCCTACGTTTCTAACGCTCCAACAGAGTACTCTTCTGGTGGACACTTGATTTTGGGACTTATCCCAGTTCTTGGTTGGACCCATACCAGTTTGACTCAGACAAACCAGATCCATTCTGACTCAATTACTCAAATTCCAGCTGTTAAAGCAAATAGTTTAGTGTTAGTTCTTATGTTACTGTTAGAAAAGGGAACAGGCTTTACAGGTGGAGATTTAGTGAAATTCTCCACTGGATTCATGTCTACAGGAATACAGTTTAATTTAAAGATAGAAGAAGGAAAGCGTTATCGTATCCGTATACGATATGCCGCTGATGTTAATGCTACTCTATCTGCACTTGGATTAAATGATGCATTTATTAACATTGAATCGACAATGTCTCAAGACACACCATTGAAGTATAACGATTTCCAATATGCAGAAGCTGACAAAACAGTGCATTTATACAATCCTCGTTTTTCTTTATATTTAGAAAATTCAGATCAATCCGGGAAAAGTATTTATATAGATCGAATCGAATTCATCCCAGTAGATAACGGTTCCTTGAACGG

CARACTERÍSTICAS DA SEQUENCIA:SEQ ID N0 8TAMANHO: 663

TIPO: PROTÉICA

ORGANISMO: Derivada de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 8

MRPNNLNEYEIIDATPSTSVSNDSTRYPYANEPTNALQNMNYKDYLRMSEGYDNKYFANPEVFAAPGGITTGITIVTKLLGWLGLPFAGETGMALNFILGLLWPTSGNPWAELMILVEELINQKIEETVRNKALADLGNSGRALQSYLNAFEDWQKNPNIFRSKELVKERFSNAEHSLRTEMSSFAIRGFEIPLLATYAQAANLHLFLIKDIQIYGKEWGYTQADIDLFYREQVEFTKEYTEHCINIYNDGLNQLKGSNAKQWIAFNRFRREMTLTVLDWALFPNYDVRMYPIKTTTELTRTIYTDPLGYTKTGSSSTPPWCNYGSSFSYIESVAIPAPSLVKWLSQIEIYSKSARATPQSADYWAGHTITYHYSGDDGQAVANYGDRTNPVIVNRYNFEQADIYRVSSSVASSTTRGVKLLTTKAIFDGISTNNGLVSYMYEKLSNFFNELKDTITELPVQISSPPTYGDAEQYSHRLSYVSNAPTEYSSGGHLILGLIPVLGWTHTSLTQTNQIHSDSITQIPAVKANSLVL VLMLLLEKGTGFTGGDLVKFSTGFMSTGIQFNLKIEEGKRYRIRIRYAAD VNATiSALGLNDAFINIESTMSQDTPLKYNDFQYAEADKTVHLYNPRFSLYLENSDQSGKSIYIDRIEFIPVDNGSLN

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 9TAMANHO: 1989TIPO: DNA SINTÉTICO

ORGANISMO: Derivado de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 9

ATGAGACCAAATAATCTAAATGAATATGAAATTATAGATGCGACACCTTCTACATCTGTATCTAATGATTCTACCAGATACCCTTATGCGAATGAGCCCACAAATGCGTTACAAAATATGAATTATAAGGATTACTTAAGAATGTCTGAAGGTTACGATAATAAATATTTTGCAAATCCTGAAGTGTTTGCTGCACCAGGTGGGATTACAACTGGAATTACTATAGTTACTAAATTACTGGGGTGGTTAGGACTTCCATTTGCTGGGGAAACAGGGATGGCTCTTAATTTCATTCTAGGTCTATTATGGCCAACATCAGGAAACCCGTGGGCTGAACTAATGATATTGGTAGAAGAACTCATAAATCAAAAAATAGAAGAGACTGTAAGAAACAAAGCACTAGCGGATTTGGGCAATTCAGGTAGAGCCTTACAATCCTATTTAAACGCATTTGAAGATTGGCAAAAAAACCCTAATATCTTTCGGAGTAAAGAGTTAGTAAAAGAAAGATTTTCAAACGCGGAACATTCATTACGTACCGAAATGAGTTCTTTTGCCATAAGAGGATTTGAAATTCCTCTTTTAGCAACATATGCACAAGCTGCGAATTTACATTTATTTCTAATTAAAGATATTCAAATTTATGGAAAAGAATGGGGATATACTCAAGCCGATATTGACTTATTTTATAGAGAACAAGTAGAGTTTACGAAAGAATACACCGAACACTGTATTAATATTTATAATGATGGTTTAAATCAATTAAAAGGTTCGAATGCTAAGCAATGGATTGCATTTAATCGCTTCCGTAGAGAAATGACATTGACGGTAÇTGGATGTAGTTGCATTATTCCCGAACTATGATGTACGTATGTACCCTATAAAAACAACTACAGAGCTAACGAGAACAATTTATACCGATCCACTTGGTTACACGAAAACGGGTTCTAGTAGTACACCACCATGGTGTAATTATGGATCTAGTTTCTCATATATAGAAAGTGTAGCGATTCCAGCCCCTAGTCTGGTTAAGTGGTTAAGTCAGATTGAAATTTATTCGAAATCCGCAAGGGCTACACCGCAAAGTGCGGATTATTGGGCAGGACATACAATAACATATCACTATAGTGGAGATGATGGTCAAGCAGTACCTAATTATGGAGATAGAACGAATCCTGTAATTGTAAATCGTTATAATTTTGAGCAGGCTGACATTTATAGAGTTTCATCATCTGTTGCTTCAAGTACAACTAGTGGTGTTAAATTATTAACTACTAAGGCTATATTTGATGGCATAAGTACAAACAATGGACTAGTGAGTTACATGTATGAGAAGTTGTCTAACTTCTTTAACGAACTCAAGGATACAATTACAGAGCTTCCTGTTCAGATCTCCAGTCCTCCTACCTACGGTGATGCTGAGCAGTACAGCCATAGGCTTTCCTACGTTTCTAACGCTCCAACAGAGTATTTTTCGGGCGGACATTTTAATTTTGGGACTAATTCCCCAGTACTTGGTTGGACGCATACTAGTTTAACTCCAAACCAAATCAGATACCATTCTGACTCAATTACTCAAATTCCAGCTGTTAAAGCAAATAGTGTTAGTTCTTATGTTACTGTTGAAAAGGGAACAGGCTTTACAGGTGGAGATTTAGTGAAATTCTCCACTGGATTCATGTCTACAGGAATACAGTTTAATTTAAAGATAGAAGAAGGAAAGCGTTATCGTATCCGTATACGATATGCCGCTGATGTTAATGCTACTCTATCTGCACTTGGATTAAATGATGCATTTATTAACATTGAATCGACAATGTCTCAAGACACACCATTGAAGTATAACGATTTCCAATATGCAGAAGCTGACAAAACAGTGCATTTATACAATCCTCGTTTTTCTTTATATTTAGAAAATTCAGATCAATCCGGGAAAAGTATTTATATAGATCGAATCGAATTCATCCCAGTAGATAACGGTTCCTTGAAC

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0 10TAMANHO: 663TIPO: PROTÉICA

ORGANISMO: Derivada de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 10

MRPNNLNEYEIIDATPSTSVSNDSTRYPYANEPTNALQNMNYKDYLRMSEGYDNKYFANPEVFAAPGGITTGITIVTKLLGWLGLPFAGETGMALNFILGLLWPTSGNPWAELMILVEELINQKIEETVRNKALADLGNSGRALQSYLNAFEDWQKNPNIFRSKELVKERFSNAEHSLRTEMSSFAIRGFEIPLLATYAQAANLHLFLIKDIQIYGKEWGYTQADIDLFYREQVEFTKE YTEHCINIYNDGLNQLKGSNAKQWIAFNRFRREMTLTVLDWALFPNYDVRMYPIKTTTELTRTIYTDPLGYTKTGSSSTPPWCNYGSSFSYIESVAIPAPSLVKWLSQIEIYSKSARATPQSADYWAGHTITYHYSGDDGQAVPNYGDRTNPVIVNRYNFEQADIYRVSSSVASSTTSGVKLLTTKAIFDGISTNNGLVSYMYEKLSNFFNELKDTITELPVQISSPPTYGDAEQYSHRLS YVSNAPTEYFSGGHFNFGTNSPVLGWTHTSLTPNQIRYHSDSITQIPAVKANSVSS YVTVEKGTGFTGGDLVKFSTGFMSTGIQFNLKIEEGKRYRIRIRYAAD VNATLSALGLNDAFINIESTMSQDTPLKYNDFQYAEADKTVHLYNPRFSLYLENSDQSGKSIYIDRIEFIPVDNGSLNCARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:SEQ ID N0. 11

TAMANHO: 1947

TIPO: DNA SINTÉTICO

ORGANISMO: Derivado de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 11

ATGCGACACCTTCTACATCTGTATCTAATGATTCTACCAGATACCCTTATGCGAATGAGACCAAATAATGCGTTACAAAATATGAATTATAAGGATTACTTAAGAATGTCTGAAGGTTACGATAATAAATATTTTGCAAATCCTGAAGTGTTTGCTGCACCAGGTGGGATTACAACTGGAATTACTATAGTTACTAAATTACTGGGGTGGTTAGGACTTCCATTTGCTGGGGAAACAGGGATGGCTCTTAATTTCATTCTAGGTCTATTATGGCCAACATCAGGAAACCCGTGGGCTGAACTAATGATATTGGTAGAAGAACTCATAAATCAAAAAATAGAAGAGACTGTAAGAAACAAAGCACTAGCGGATTTGGGCAATTCAGGTAGAGCCTTACAATCCTATTTAAACGCATTTGAAGATTGGCAAAAAAACCCTAATATCTTTCGGAGTAAAGAGTTAGTAAAAGAAAGATTTTCAAACGCGGAACATTCATTACGTACCGAAATGAGTTCTTTTGCCATAAGAGGATTTGAAATTCCTCTTTTAGCAACATATGCACAAGCTGCGAATTTACATTTATTTCTAATTAAAGATATTCAAATTTATGGAAAAGAATGGGGATATACTCAAGCCGATATTGACTTATTCTATAGAGAACAAGTAGAGTTTACGAAAGAATACACCGAACACTGTATTAATATTTATAATGATGGTTTAAATCAATTAAAAGGTTCGAATGCTAAGCAATGGATTGCATTTAATCGCTTCCGTAGAGAAATGACATTGACGGTACTGGATGTAGTTGCATTATTCCCGAACTATGATGTACGTATGTACCCTATAAAAACAACTACAGAGCTAACGAGAACAATTTATACCGATCCACTTGGTTACACGAAAACGGGTTCTAGTAGTACACCACCATGGTGTAATTATGGATCTAGTTTCTCATATATAGAAAGTGTAGCGATTCCAGCCCCTAGTCTGGTTAAGTGGTTAAGTCAGATTGAAATTTATTCGAAATCCGCAAGGGCTACACCGCAAAGTGCGGATTATTGGGCAGGACATACAATAACATATCACTATAGTGGAGATGATGGTCAAGCAGTAGCTAATTATGGAGATAGAACGAATCCTGTAATTGTAAATCGTTATAATTTTGAGCAGGCTGACATTTATAGAGTTTCATCATCTGTTGCTTCAAGTACAACTAGTGGTGTTAAATTATTAACTACTAAGGCTATATTTGATGGCATAAGTACAAACAATGGACTAGTGAGTTACATGTATGAAAAATTATCGAACTTTTTTAATGAACTAAAAGATACAATTACAGAGCTACCTGTTCAGATATCCAGTCCTCCTACCTACGGGGATGCTGAACAGTACAGTCATCGGCTATCCTATGTTTCTAATGCTCCAACAGAGTACTCTTCGGGCGGACATTTAATTTTGGGACTAATCCCAGTACTGGGTTGGACGCATACTAGTTTAACTCAAACAAATCAGATACATTCTGACTCAATTACTCAAATTCCAGCTGTTAAAGCAAATAGTGTTAGTTCTTATGTTACTGTTGAAAAGGGAACAGGCTTTACAGGTGGAGATTTAGTGAAATTCTCCACTGGATTCATGTCTACAGGAATACAGTTTAATTTAAAGATAGAAGAAGGGAAGCGTTATCGTATCCGTATACGATATGCCGCTGATGTTAATGCTACTCTATCTGCACTTGGATTAAATGATGCATTTATTAACATTGAATCGACAATGTCTCAAGACACACCATTGAAGTATAACGATTTCCAATATGCAGAAGCTGACAAAACAGTGCATTTATACAATCCTCGTTTTTCTTTATATTTAGAAAATTCAGATCAATCCGGGAAAAGTATTTATATAGATCGAATCGAATTCATCCCAGTAGATAACGGTTCCTTGAAC

CARACTERÍSTICAS DA SEQÜÊNCIA:

SEQ ID N0 12TAMANHO: 649TIPO: PROTÉICAORGANISMO: Derivada de Bacillus thuringiensisSEQÜÊNCIA: 12

MRHLLHL YLMILPDTLMRMRPNNALQNMNYKD YLRMS EGYDNKYFANPE VFAAPGGITTGITIVTKLLGWLGL P FAGETGMALNFILGLLWPTSGNPWAELMILVEELINQKIEETVRNKALADLGNSGRALQSYLNAFEDWQKNPNIFRSKELVKERFSNAEHSLRTEMSSFAIRGFEIPLLATYAQAANLHLFLIKDIQIYGKEWGYTQADIDLFYREQVEFTKEYTEHCINIYNDGLNQLKGSNAKQWIAFNRFRREMTLTVLDWALFPNYDVRMYPIKTTTELTRTIYTD

PLGYTKTGSSSTPPWCNYGSSFSYIESVAIPAPSLVKWLSQIEIYSKSARATPQSADYWAGHTITYHYSGDDGQAVANYGDRTNPVIVNRYNFEQADIYRVSSSVASSTTSGVKLLTTKAIFDGISTNNGLVSYMYEKLSNFFNELKDTITELPVQISSPPTYGDAEQYSHRLSYVSNAPTEYSSGGHLILGLIPVLGWTHTSLTQTNQIHSDSITQIPAVKANSVSSYVTVEKGTGFTGGDLVKFSTGFMSTGIQFNLKIEEGKRYRIRIRYAADVNATLSALGLNDAFINIESTMSQDTPLKYNDFQYAEADKTVHLYNPRFSLYLENSDQSGKSIYIDRIEFIPVDNGSLN

Claims (28)

1. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizada por codificar uma proteína comatividade sobre insetos-praga onde a referida molécula compreende uma seqüêncianucleotídica capaz de codificar uma proteína tendo ao menos 95% de identidade com aseqüência de aminoácidos da seqüência SEQID N°. 2.

2. Molécula de ácido nucléico isolada de acordo com a reivindicação 1, caracterizadapelo fato de o inseto praga ser preferencialmente o bicudo-do-algodoeiro.

3. Molécula de ácido nucléico isolada caracterizada por apresentar os domínios I, II eIII, original e/ou otimizada para expressão em plantas, onde a seqüência nucleotídicacompreende a seqüência descrita na SEQID N0. 3.

4. Construção gênica caracterizada por compreender:a) um polinucleotídeo compreendendo a seqüência descrita em SEQID N0. 3; eb) um promotor ativo, operacionalmente ligado ao polinucleotídeo definido em(a).

5. Vetor caracterizado por compreender a molécula de ácido nucléico isolada de acordocom a reivindicação 1, ou um fragmento desta.

6. Vetor de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de o referido vetor sercapaz de promover a expressão da molécula de interesse ou um fragmento desta.

7. Célula transgênica caracterizada por conter uma seqüência polinucleotídica otimizadapara expressão em plantas, onde o polinucleotídeo compreende a seqüência descrita naSEQIDN0. 3.

8. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de acélula consistir de uma célula vegetal.

9. Célula transgênica de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de acélula consistir de uma célula microbiana.

10. Método para obtenção de uma célula transgênica, caracterizado por compreender as-seguintes etapas:a) transformar uma célula com uma construção gênica de acordo com areivindicação 4; eb) regenerar a célula transformada, contendo a construção gênica de interesseestavelmente inserida em seu genoma, sob condições ideais de crescimento emcultura celular; ec) expressar o produto gênico da construção inserida na célula regenerada.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a célula ser deum microorganismo.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de omicroorganismo ser uma bactéria colonizadora de raiz.

13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de a célula seruma célula vegetal.

14. Método para obtenção de uma planta transgênica caracterizado por compreender asseguintes etapas:a) transformar uma célula de planta com uma construção gênica de acordo com areivindicação 4;b) cultivar a célula transformada, contendo a construção gênica de interesseestavelmente inserida em seu genoma, sob condições ideais de crescimento emcultura celular; ec) regenerar uma planta transgênica expressando o produto da construçãoinserida, a partir da célula transformada.

15. Método de acordo com a reivindicação 14 caracterizado pelo fato de a planta sermonocotiledônea ou dicotiledônea.

16. Método de acordo com a reivindicação 15 caracterizado pelo fato de a dicotiledônèa.ser uma planta de algodão.

17. Polipeptídeo isolado e purificado, caracterizado por compreender a seqüência deaminoácidos como descrito na SEQ ID N0. 2.

18. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por exibir atividadeinseticida, quando administrado oralmente, a larvas de insetos susceptíveis.

19. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por exibir atividadeinseticida, quando fornecido em uma dieta administrada oralmente a uma larva de insetocoleóptero.

20. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de a larva deinseto ser uma larva de bicudo-do-algodoeiro.

21. Polipeptídeo isolado, caracterizado pelo fato deste ser codificado por um segmentode ácido desoxirribonucléico nucléico compreendendo a fase aberta de leitura descritana SEQ ID N0. 3, do nucleotídeo 001 ao nucleotídeo 2001.

22 Polipeptídeo isolado de acordo com as reivindicações 17 e 21, caracterizado por seruma δ-endotoxina.

23. Composição pesticida biodegradável caracterizada por compreender umaconcentração eficaz do polipeptídeo isolado de acordo com a reivindicação 22 ouanálogo mutante, em um veículo carreador agronomicamente aceitável.

24. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de o veículo carreador aceitável ser um microorganismotransformado.

25. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de que um veículo carreador aceitável pode ser um agentesuperfície-ativo, um veículo carreador inerte, um preservativo, um umectante, umestimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um ligante, umemulsificador, um corante, um protetor uv (ultra-violeta), um tampão, um agentè defluxo ou fertilizante, doadores de micronutriente, ou outras preparações que influenciamo crescimento da planta.

26. Composição pesticida biodegradável de acordo com a reivindicação 23,caracterizada pelo fato de o polipeptídeo de acordo com a reivindicação 22 ser usado emcombinação com δ-endotoxinas Bt ou outras proteínas inseticidas.

27. Método para o controle de uma praga caracterizado por compreender:a) detectar a ocorrência da praga em um ambiente;b) promover o contato da praga com uma proteína pesticida isolada ou com umacomposição da invenção, em que a referida proteína consiste da seqüência deaminoácidos descrita em SEQ ID N°. 4.

28. Método de obtenção de linhagens transgênicas resistentes a um inseto praga,caracterizado por compreender as seguintes etapas:a) transformar uma cultivar de interesse com uma construção gênica de acordocom a reivindicação 4;b) regenerar linhagens transgênicas contendo a referida construção estavelmenteintegrada em seus genomas;c) selecionar as linhagens transgênicas com os maiores níveis de expressão da δ-endotoxina da invenção.