TW201632544A - Ｄｉｇ－３０５殺蟲ｃｒｙ毒素 - Google Patents

Abstract

本發明揭示DIG-305殺蟲蛋白質毒素、編碼此類毒素的聚核苷酸及產生此類毒素的轉殖基因植物。亦揭示使用此類毒素控制植物(尤其作物)害蟲的方法。揭示用於製備表現該等蛋白質毒素的轉殖基因植物的方法及在轉殖基因植物中偵測所主張的毒素及聚核苷酸的方法。

Description

DIG-305殺蟲CRY毒素 發明領域

本發明大體上關於應用於農業科學的分子生物學領域。本文揭示製造及使用所主張的核酸序列及胺基酸序列開發轉殖基因植物細胞及植物的併入保護劑的方法。

發明背景

蘇力菌(Bacillus thuringiensis，B.t.)為產生稱為δ內毒素或Cry蛋白質的殺蟲晶體蛋白質的土壤傳播的細菌。Cry蛋白質為藉由作用於敏感昆蟲的中腸細胞而起效的經口毒物。一些Cry毒素已顯示具有針對線蟲的活性。δ內毒素的詳盡清單在由Neil Crickmore維持的蘇力菌毒素命名網站維持且定期更新。(參見Crickmore等人1998，第808頁)。

鞘翅目為每年對作物造成大範圍損害的一群重要的農業害蟲。鞘翅目害蟲之實例包括玉米根蟲、苜蓿葉象甲、棉鈴象甲及日本甲蟲。西方玉米根蟲(WCR)，即西方玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)為北美最具破壞性的玉米根蟲物種之一且為美國中西部玉米 生長區域的特別關注點。北方玉米根蟲(NCR)，即北方玉米根螢葉甲(Diabrotica barberi Smith and Lawrence)為與WCR共同棲居於大量相同範圍的緊密相關物種。作為北美重要害蟲的根螢葉甲屬(Diabrotica)存在數個其他相關亞種：墨西哥玉米根蟲(MCR)，即墨西哥玉米根螢葉甲(D.virgifera zeae Krysan and Smith)；南方玉米根蟲(SCR)，即南方玉米根螢葉甲(D.undecimpunctata howardi Barber)；巴西玉米根螢葉甲(D.balteata LeConte)；D.undecimpunctata tenella；及黃瓜十一星葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)。美國農業部目前估計玉米根蟲每年造成十億美元的收入損失，包括八億美元的產量損失及兩億美元的處理成本。Cry毒素，包括Cry1B、Cry1I、Cry2A、Cry3、Cry7A、Cry8、Cry9D、Cry14、Cry18、Cry22、Cry23、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry43、Cry55、Cyt1A及Cyt2C(Frankenhuyzen,2009)家族成員，具有針對鞘翅目昆蟲的殺蟲活性。

雖然在轉殖基因植物中產生目前採用的Cry蛋白質可提供針對前述害蟲的強力保護，由此保護穀物產量，但是在人工侵染試驗中已出現害蟲成蟲，表明控制少於全部的昆蟲幼蟲。此外，抗性昆蟲群體的出現威脅Cry蛋白質在昆蟲害蟲控制中的長期耐用性。對Cry蛋白質具有抗性的鱗翅目昆蟲已出現在小菜蛾(Plutella xylostella)(Tabashnik,1994)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)(Janmaat及Myers,2003,2005)及棉鈴蟲(Helicoverpa zea)(Tabashnik等人，2008)範圍 內。鞘翅目昆蟲同樣已在該領域中出現對Cry蛋白質的抗性(Gassman等人PLoS ONE 2011年7月｜第6卷｜第7期｜e22629)。昆蟲對B.t.Cry蛋白質的抗性可經由數個機制出現(Heckel等人，2007；Pigott及Ellar,2007)。已在昆蟲內鑑別出Cry蛋白質的多個受體蛋白質類別，且各受體類別內存在多個實例。對具體Cry蛋白質的抗性可例如藉助於受體蛋白質的鈣黏素結構域的毒素結合部分內的突變而出現。另一種方式的抗性可經由原毒素加工蛋白酶來介導。

關注新Cry蛋白質的開發，從而提供額外管理鞘翅目昆蟲害蟲的工具。在轉殖基因植物中組合產生具有不同作用模式的Cry蛋白質將防止昆蟲抗性的出現且保護B.t.技術對昆蟲害蟲控制的長期效用。

發明概要

本發明係基於以本文中命名為DIG-305的Cry蛋白質毒素為主的殺蟲毒素的發現，包括DIG-305的變體、編碼此等毒素的核酸、使用該等毒素控制害蟲的方法、在轉殖基因宿主細胞中產生該等毒素的方法及表現該等毒素的轉殖基因植物。SEQ ID NO：2中天然DIG-305毒素的預測胺基酸序列表明DIG-305最佳歸類為Cry32家族。

如實例1中所述，發現編碼DIG-305蛋白質的核酸且自Dow AgroSciences LLC內部命名為PS246F10(亦稱為DBt11519)的B.t.菌株分離。測定全長編碼區的核酸序列，且由核酸序列推斷出全長蛋白質序列。在SEQ ID NO：1中 給出編碼DIG-305毒素的核酸序列。使用殺蟲蛋白質序列作為查詢的BLAST搜尋發現DIG-305毒素蛋白質與最近的殺蟲毒素Cry32Ca1(BAB78602)具有89%序列一致性且與最近公開揭示的序列(AGU13873,US20140096281)具有91%序列一致性。因此，DIG-305表示Cry32蛋白質家族內的新子類。

DIG-305毒素可單獨或與其他Cry毒素組合使用，諸如Cry34Ab1/Cry35Ab1(DAS-59122-7)、Cry3Bb1(MON88017)、Cry3A(MIR604)、嵌合Cry3A/Cry1Ab(eCry3.1Ab，FR8A，事件5307,WO 2008/121633 A1)、CryET33及CryET34、Vip1A、Cry1Ia、CryET84、CryET80、CryET76、CryET71、CryET69、CryET75、CryET39、CryET79、TIC809、TIC810及CryET74，以便控制鞘翅目昆蟲抗性群體的出現。另外，DIG-305毒素可單獨或與控制其他害蟲群體出現的其他Cry毒素組合使用，諸如Cry1F、Cry1Ab、Vip Cry2A、Cry1Da、Cry1Ia及Cry1Ac，以便控制鱗翅目抗性昆蟲群體的出現。

DIG-305殺蟲毒素亦可與控制其他昆蟲害蟲的RNAi方法組合使用。舉例而言，DIG-305殺蟲毒素可與抑制WCR或另一昆蟲害蟲的必需基因的dsRNA組合用於轉殖基因植物(Baum等人，2007)。此類目標基因包括例如玉米根蟲之液泡ATP酶、ARF-1、Act42A、CHD3、EF-1α、ROP、RNAPII及TFIIB。適合之目標基因的實例為液泡ATP酶，如WO2007035650中所揭示。

在一個實施例中，本發明提供一種經分離、處理或調配之DIG-305殺蟲毒素多肽，其包含選自由以下組成之群的核心毒素區段：(a)SEQ ID NO：2之大致2至大致685之殘基的胺基酸序列；(b)與SEQ ID NO：2之大致2至大致685之殘基的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及(c)具有至多20個並未不利影響SEQ ID NO：2之毒素的表現或活性的胺基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO：2之大致2至大致685之殘基的胺基酸序列；或(a)、(b)或(c)中任一者之殺蟲活性片段。

在某些實施例中，DIG-305殺蟲毒素多肽包含(a')SEQ ID NO：2之大致2至685之殘基的胺基酸序列；(b')與SEQ ID NO：2之大致2至685之殘基的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基酸序列；及(c')具有至多20個並未不利影響SEQ ID NO：2之毒素的表現或活性的胺基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO：2之大致2至685之殘基的胺基酸序列；或(a')、(b')或(c')中任一者之殺蟲活性片段。在其他實施例中，(a)、(b)、(c)、(a')、(b')或(c')之DIG-305殺蟲毒素多肽可連接至C端原毒素，例如cry1Ab或cry1Ac/cry1Ab嵌合毒素之C端原毒素。

在另一實施例中，本發明提供一種經分離、處理或調配之DIG-305殺蟲毒素多肽，其包含選自由以下組成之群的DIG-305核心毒素區段：(a)包含SEQ ID NO：2之殘基1至1241的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO：2之殘基1至1241的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的胺基 酸序列的多肽；及(c)包含具有至多20個並未不利影響SEQ ID NO：2之毒素的表現或活性的胺基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO：2之殘基1至1241的胺基酸序列的多肽；或(a)、(b)或(c)中任一者之殺蟲活性片段。

在另一實施例中，本發明提供一種包含本文所揭示之DIG-305殺蟲毒素的植物。在另一實施例中，本發明提供一種用於控制害蟲群體之方法，其包含使該群體與殺蟲有效量之本文所揭示之DIG-305殺蟲毒素接觸。在另一實施例中，本發明提供一種編碼本文所揭示之DIG-305殺蟲毒素的經分離核酸。在另一實施例中，本發明提供一種DNA構築體，其包含可操作地連接於並非來源於蘇力菌且能夠推動在植物中表現之異源啟動子的編碼DIG-305殺蟲毒素的核苷酸序列。本發明亦提供一種轉殖基因植物，其包含穩定併入至其基因體中之DNA構築體；及用於保護植物免遭害蟲之方法，其包含將該構築體引入至該植物中。

申請者藉由「經分離」意指核苷酸或多肽分子已藉由人手動自其天然環境移出且已置於不同環境中。因此，經分離之核苷酸及多肽分子包括已經純化、濃縮、或以其他方式呈現實質上不含蘇力菌細胞物質的DNA或蛋白質分子。經分離之DIG-305殺蟲多肽或核苷酸分子的實施例可具有少於約30%、少於約20%、少於約10%、少於約9%、少於約8%、少於約7%、少於約6%、少於約5%、少於約4%、少於約3%或小於約2%、或小於約1%(以乾重計)之污染性蛋白質(例如來自蘇力菌)。當經分離之DIG-305殺蟲多肽或 核苷酸實施例以重組方式產生時，則培養基材料、化學前驅物及/或非DIG-305殺蟲多肽或核苷酸佔經分離之DIG-305殺蟲多肽或核苷酸的少於約30%、少於約20%、少於約10%、少於約5%、少於約4%、少於約3%或小於約2%、或小於約1%(以乾重計)。

SEQ ID NO：1為編碼DIG-305毒素之DNA序列；3726 nt。

SEQ ID NO：2為推斷的DIG-305蛋白質序列；1241 aa。

SEQ ID NO：3為編碼全長DIG-305之玉米最佳化DNA序列；3723 nt。

較佳實施例之詳細說明

DIG-305殺蟲毒素：除SEQ ID NO：2之全長DIG-305毒素之外，本發明涵蓋其殺蟲活性變體。藉由術語「變體」，申請者意欲包括片段、某些缺失及插入突變體及某些融合或嵌合蛋白質。DIG-305包括一般與Cry毒素相關聯的三個結構域。作為描述本發明中所包括之DIG-305毒素變體的序言，其將適用於簡單綜述大體上三個結構域Cry毒素及尤其DIG-305蛋白質毒素的架構。

大部分蘇力菌δ-內毒素晶體蛋白質分子由兩個功能性區段組成。蛋白酶抗性核心毒素為第一區段且對應於蛋白質分子的約前半部分。完整~130kDa原毒素分子藉 由昆蟲腸道中之蛋白酶快速加工至抗性核心區段。藉由此加工缺失之區段將在本文中稱為「原毒素區段」。原毒素區段被認為參與毒素晶體形成(Arvidson等人，1989)。原毒素區段可以因此藉由減少毒素分子之蛋白酶加工(Haider等人，1986)或藉由減小毒素溶解性(Aronson等人，1991)限制核心對昆蟲之可接近性而傳達部分昆蟲之毒素特異性。甚至在某一類別內的B.t.毒素在一定程度上改變長度及自核心毒素區段轉移至原毒素區段的精確位置。自核心毒素區段轉移至原毒素區段將通常發生在全長毒素之約50%至約60%處。SEQ ID NO：2揭示部分DIG-305多肽之1241個胺基酸的序列，其中N端685個胺基酸包含DIG-305核心毒素區段。

已測定Cry1Aa1、Cry2Aa1、Cry3Aa1、Cry3Bb1、Cry4Aa、Cry4Ba及Cry8Ea1之三維晶體結構。核心毒素之此等結構明顯類似且由具有下文所述之特徵的三個不同結構域構成(評述於de Maagd等人，2003中)。

結構域I為七個α螺旋束，其中螺旋五由六個兩性螺旋圍繞。此結構域已牽涉孔形成且與包括溶血素及大腸桿菌素之其他成孔蛋白質具有同源性。DIG-305蛋白質之結構域I包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基大致1-320。

結構域II藉由三個反平行β摺疊一起封裝於β稜柱中而形成。此結構域之環在結合昆蟲中腸受體時發揮重要作用。在Cry1A蛋白質中，在結構域II β摺疊之頂端處表面暴露的環參與結合至鱗翅目鈣黏素受體。Cry3Aa結構域 II環以類似方式結合科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata Say)(CPB)之膜相關金屬蛋白酶(Ochoa-Campuzano等人，2007)。結構域II與包括卵黃及木菠蘿素之某些碳水化合物結合蛋白具有同源性。DIG-305蛋白質之結構域II包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基大致320-525。

結構域III為兩個反平行β摺疊之β夾層結構。此結構域在結構上與諸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶及其他之蛋白質的碳水化合物結合結構域相關。

保守B.t.序列塊2及3分別定位在靠近結構域2之N端及C端。因此，此等保守序列塊2及3為三個功能性結構域之間的近似邊界區。此等具有保守DNA及蛋白質同源性之區已用於工程改造重組B.t.毒素(美國專利第6090931號、WO1991001087、WO1995006730、美國專利第5736131號、美國專利第6204246號、美國專利第6780408號、WO1998022595、美國專利申請案第20090143298號及美國專利第7618942號)。DIG-305蛋白質之結構域III包含SEQ ID NO：2之胺基酸殘基大致526-685。

在鱗翅目昆蟲中，已報導Cry1A毒素結合某些類別的受體蛋白質，包括鈣黏素、胺基肽酶及鹼性磷酸酶，其他仍有待鑑別(Honée等人，1991；Pigott及Ellar,2007)。在鞘翅目昆蟲中，已鑑別Cry3Aa之兩種受體；已鑑別科羅拉多馬鈴薯甲蟲中之ADAM金屬蛋白酶(Biochemical and Biophysical Research Communications 362(2007) 437-442)、粉蟲屬(Tenebrio)中之鈣黏素(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY第284卷，第27號，第18401-18410頁，2009年7月3日)。考慮到蘇力菌毒素及害蟲之多樣性，預期將鑑別出額外受體，該等受體將包括額外類別之蛋白質及膜表面取代物。

已報導結構域I之α-螺旋1在受體結合後移除。Aronson等人(1999)證明結合至刷狀緣膜囊(BBMV)之Cry1Ac免於在緊跟α-螺旋1之後的殘基59處開始的蛋白酶K裂解；Cry1Ab提出類似結果。Gomez等人(2002)發現在BBMV受體結合後形成的Cry1Ab寡聚物缺乏結構域I之α-螺旋1部分。另外，Soberon等人(2007)已顯示Cry1Ab及Cry1Ac之N端缺失突變體缺乏涵蓋三維Cry結構上之α-螺旋1的大致60個胺基酸，該等突變體能夠在不存在鈣黏素結合的情況下將分子量約60kDa之單體組裝成前孔。此等N端缺失突變體據報導對Cry抗性昆蟲幼蟲具有活性。此外，Diaz-Mendoza等人(2007)描述43kDa及46kDa之Cry1Ab片段保留對地中海玉米螟(地中海普通蛭莖夜蛾(Sesamia nonagrioides))的活性。此等片段經證實包括Cry1Ab之胺基酸殘基116至423；然而未闡明精確胺基酸序列且此等蛋白水解片段之活性機制為未知的。Gomez等人(2002)、Soberon等人(2007)及Diaz-Mendoza等人(2007)之結果與報導Cry1AbN端缺失36個胺基酸導致殺蟲活性喪失的Hofte等人(1986)的結果形成對比。

DIG-305之胺基端缺失變體 在其一個態樣中，本 發明提供缺失一或多個α-螺旋之全部或一部分的DIG-305變體，以改良殺蟲活性且避免昆蟲出現抗性。進行此等修飾以提供具有改良屬性之DIG-305變體，該等屬性諸如改良的目標害蟲譜、效能及昆蟲抗性管理。在本發明之一些實施例中，標的修飾可影響原毒素活化效率及孔形成，從而使得昆蟲中毒。更特定言之，為提供具有改良屬性之DIG-305變體，描述移除編碼N端之DNA序列之一部分的逐步缺失。此類缺失移除結構域I中之全部α-螺旋1及全部或部分α-螺旋2，同時維持α-螺旋3至7之結構完整性。本發明因此部分關於藉由工程改造結構域I之α-螺旋組分以便更高效地形成孔而對Cry蛋白質功效進行的改良。更特定言之，本發明提供經改良DIG-305蛋白質，其經設計以在與Cry1蛋白質之結構域I中的α-螺旋1及2具有假定二級結構同源性的區中具有N端缺失。

在設計N端缺失變體的編碼序列時，將編碼甲硫胺酸的ATG起始密碼子插入在經設計以表現缺失變體的核苷酸序列的5'端處。對於經設計用於轉殖基因植物的序列，依循Varshavsky(1997)之「N端規則」可為有益的。已教示一些胺基酸在作為蛋白質N端殘基呈現時可造成蛋白質不穩定性及在真核細胞中降解。舉例而言，自酵母及哺乳動物細胞中之觀測結果收集的資料表明N端去穩定化胺基酸為F、L、W、Y、R、K、H、I、N、Q、D、E及可能存在的P。儘管蛋白質降解機制的特殊性可能在生物體之間略微相異，但是以上所見之N端去穩定化胺基酸的一致性的保留 表明類似機制可在植物細胞中起作用。舉例而言，Worley等人(1998)發現在植物中，N端規則包括鹼性及芳族殘基。其可為藉由靠近標的B.t.殺蟲蛋白質之α-螺旋3起點的植物蛋白酶蛋白質裂解暴露去穩定化N端胺基酸。此類加工可靶向裂解蛋白質以便快速衰減且限制B.t.殺蟲蛋白質積聚至不足以用於有效昆蟲控制之含量。因此，對於以去穩定化胺基酸中之一者開始的N端缺失變體的某些實例，指定G(甘胺酸)胺基酸之密碼子可添加在轉譯起始甲硫胺酸及去穩定化胺基酸之間。

蛋白酶敏感性變體 昆蟲腸道蛋白酶通常用以輔助昆蟲自飼料蛋白質獲得所需胺基酸。最佳理解的昆蟲消化蛋白酶為絲胺酸蛋白酶，其似乎為最常見的類型(Englemann及Geraerts,1980)，尤其在鱗翅目物種中。鞘翅目昆蟲之腸道相比鱗翅目昆蟲之腸道更多呈中性至酸性。大部分鞘翅目昆蟲幼蟲及成蟲(例如CPB)具有微酸性中腸，且半胱胺酸蛋白酶提供主要蛋白水解活性(Wolfson及Murdock,1990)。更精確而言，Thie及Houseman(1990)鑑別且表徵CPB中之半胱胺酸蛋白酶(組織蛋白酶B樣及組織蛋白酶H樣)及天冬胺醯基蛋白酶(組織蛋白酶D樣)。Gillikin等人(1992)表徵西方玉米根蟲幼蟲之腸道中之蛋白水解活性且主要發現半胱胺酸蛋白酶。美國專利第7230167號揭示西方玉米根蟲中存在歸因於組織蛋白酶G之蛋白酶活性。昆蟲腸道蛋白酶之多樣性及不同活性水準可影響昆蟲對具體B.t.毒素之敏感性。

在本發明之另一實施例中，蛋白酶裂解位點可在所需位置經工程改造以影響蛋白質在某些昆蟲害蟲之敏感幼蟲之中腸內的加工。此等蛋白酶裂解位點可藉由諸如化學基因合成或剪接重疊PCR之方法引入(Horton等人，1989)。絲胺酸蛋白酶識別序列例如可視情況插入在Cry蛋白質結構中之特定位點處以影響蛋白質在敏感幼蟲之中腸內在所需缺失點處之加工。可以此類方式採用之絲胺酸蛋白酶包括鱗翅目中腸絲胺酸蛋白酶，諸如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶等(Christeller等人，1992)。另外，憑經驗藉由定序用未經分級幼蟲中腸蛋白酶製劑產生之Cry蛋白質分解產物或藉由結合至刷狀緣膜囊鑑別之缺失位點可經工程改造以實現蛋白質活化。藉由基因缺失或藉由引入蛋白酶裂解位點產生之經修飾之Cry蛋白質對以下害蟲具有改良活性：鱗翅目害蟲，諸如歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、西南玉米螟(Diatraea grandiosella)、棉鈴蟲、小地老虎(Agrotis ipsilon)、草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、小蔗螟(Diatraea saccharalis)、白緣豆夜蛾(Loxagrotis albicosta)；鞘翅目害蟲，諸如西方玉米根蟲、南方玉米根蟲、北方玉米根蟲(亦即根螢葉甲屬(Diabrotica spp.))及其他目標害蟲。

同一家族之絲胺酸蛋白酶，諸如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及組織蛋白酶G樣蛋白酶；鞘翅目昆蟲半胱胺酸蛋白酶，諸如組織蛋白酶(B樣、L樣、O樣及K樣蛋白酶)(Koiwa 等人，2000；及Bown等人，2004)；鞘翅目昆蟲金屬蛋白酶，諸如ADAM10(Ochoa-Campuzano等人，2007)；及鞘翅目昆蟲天冬胺酸蛋白酶，諸如組織蛋白酶D樣及E樣、胃蛋白酶、瘧原蟲天冬胺酸蛋白酶(plasmepsin)及凝乳酶可藉由在所需加工位點處工程改造適當識別序列而進一步用於影響某些昆蟲害蟲之敏感幼蟲之中腸內的Cry蛋白質加工。

引入此類蛋白酶裂解位點之較佳位置在α-螺旋2B與α-螺旋3之間的「間隔子」區內。引入蛋白酶裂解位點之第二較佳位置在α-螺旋3與α-螺旋4之間的間隔子區內。經修飾之DIG-305殺蟲毒素蛋白質藉由基因缺失或藉由引入蛋白酶裂解位點來產生，以提供對昆蟲害蟲之改良活性，該等昆蟲害蟲包括(但不限於)玉米根蟲、苜蓿葉象甲、棉鈴象甲、日本甲蟲及其類似物。

存在能夠測定包含多肽之N端或C端殘基之胺基酸序列的各種技術。舉例而言，自動化埃德曼降解方法(Edman degradation methodology)可以依序方式使用，以測定具有至多30個胺基酸殘基之N端胺基酸序列，每一殘基具有98%精確性。另外，亦可能測定包含多肽羧基端之胺基酸序列(Bailey等人，1992；美國專利第6046053號)。因此，在一些實施例中，可表徵已藉助於例如藉由自昆蟲腸道製備之蛋白酶蛋白水解加工而活化之B.t.Cry蛋白質且鑑別活化毒素片段在N端或C端胺基酸。藉由在編碼序列中之適當位置引入或消除蛋白酶加工位點以允許或消除較大變異蛋白由昆蟲、植物或微生物蛋白酶蛋白質裂解而產生之 DIG-305變體屬於本發明之範疇內。此類操控之最終結果理解為產生與完整(全長)毒素蛋白質具有相同或更佳活性之毒素片段分子。

DIG-305毒素之結構域 DIG-305毒素之各別結構域(及與此類結構域90%、91%、92%、93、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致之變體)預期適用於與其他Cry毒素之結構域形成組合以提供害蟲毒性譜增加、效能改良或蛋白質穩定性增加之新毒素。DIG-305蛋白質之結構域I包含SEQ ID NO：2之大致胺基酸殘基1至320。DIG-305蛋白質之結構域II包含SEQ ID NO：2之大致胺基酸殘基321至525。DIG-305蛋白質之結構域III包含SEQ ID NO：2之大致胺基酸殘基526至685。結構域調換或改組為產生變化的δ-內毒素蛋白質的另一機制。結構域II及III可在δ-內毒素蛋白質之間調換，從而產生具有改良的殺蟲活性或目標譜的雜交或嵌合毒素。結構域II參與受體結合且結構域III結合某些類別之受體蛋白質且可能參與寡聚毒素前孔之插入。其他毒素中之一些結構域III取代已顯示產生針對甜菜夜蛾之優良毒性(de Maagd等人，1996)且存在關於Cry毒素結構域調換設計之指導(Knight等人，2004)。

產生重組蛋白質及測試其殺蟲活性之方法為此項技術中熟知的(參見例如Naimov等人，2001；de Maagd等人，1996；Ge等人，1991；Schnepf等人，1990；Rang等人，1999)。已研究Cry1A及Cry3A蛋白質之結構域I在膜中插入及形成孔的能力。結構域I之α-螺旋4及5在膜插入及孔形成 中發揮關鍵作用(Walters等人，1993；Gazit等人，1998；Nunez-Valdez等人，2001)，同時提出另一螺旋如傘骨般接觸膜表面(Bravo等人，2007；Gazit等人，1998)。

藉由進行有限數目之胺基酸缺失、取代或添加所形成之DIG-305變體針對SEQ ID NO：2之胺基酸序列的胺基酸缺失、取代及添加可易於以依序方式進行且此類變異對於殺蟲活性之效應可藉由生物分析來測試。假設變化數目受數目限制，此類測試不涉及不合理實驗。本發明包括核心毒素(SEQ ID NO：2之大致胺基酸1至685)之殺蟲活性變體，其中已進行至多10個、至多15個或至多20個胺基酸添加、缺失或取代。

本發明包括DIG-305殺蟲毒素變體，其具有與SEQ ID NO：2之胺基酸1至685 90%、91%、92%、93、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致的核心毒素區段。變體可藉由進行隨機突變來製造或變體可經設計。就所設計之突變體而言，當在造成生物活性或參與決定三維組態而最終產生生物活性之毒素關鍵區維持胺基酸一致性時，存在產生具有與天然毒素類似活性之變體的高機率。若取代為保守的，則亦將出現保留活性之高機率。胺基酸可置於以下類別中：非極性、不帶電極性、鹼性及酸性。一類胺基酸用相同類型之另一胺基酸置換之保守取代最不可能實質上改變變體之生物活性。表1提供屬於各類別之胺基酸實例清單。

在一些情況下，亦可進行非保守取代。關鍵因素為此等取代必須不會顯著減損毒素之生物活性。變體包括胺基酸序列由於突變誘發而相異的多肽。本發明涵蓋之變體蛋白質具有生物活性，亦即其繼續具有天然蛋白質之所需生物活性，亦即保留殺蟲活性。

變體蛋白質亦可經設計在序列水準上相異，但是保留相同或類似的整體基本三維結構、表面電荷分佈及其類似物。參見例如美國專利第7058515號；Larson等人(2002)；Stemmer(1994a,1994b,1995)及Crameri等人(1996a,1996b,1997)。美國專利第US 8,513,492 B2號

核酸 編碼DIG-305殺蟲毒素之經分離核酸為本發明之一個態樣。此包括編碼SEQ ID NO：2之核酸及其補體，以及編碼SEQ ID NO：2之殺蟲變體的其他核酸。術語「經分離」如上文所定義。由於遺傳密碼之冗餘，多種不同DNA序列可編碼本文所揭示之胺基酸序列。形成此等編碼相同或基本上相同之毒素的替代DNA序列完全屬於熟習此項技術者之技能。

基因合成 編碼本文所述之DIG-305殺蟲毒素之基因可藉由此項技術中熟知的多種方法來製造。舉例而言，合成基因區段及合成基因可藉由亞磷酸三酯及胺基磷酸酯化學方法製造(Caruthers等人，1987)且供應商可用以按 需求進行基因合成。全長基因可以多種方式進行組裝，包括例如藉由接合限制性片段或重疊寡核苷酸之聚合酶鏈反應組裝(Stewart及Burgin,2005)。另外，末端基因缺失可藉由使用位點特異性末端寡核苷酸之PCR擴增來進行。

編碼DIG-305殺蟲毒素之核酸可例如藉由目前由數個供應商中之任一者實施之方法進行合成構築來製造(例如美國專利第7482119號)。此等基因或其部分或變體亦可例如藉由使用基因合成儀及例如美國專利第5380831號之設計方法而以合成方式構築。或者，合成或天然存在之基因的變化形式可易於使用標準分子生物學技術進行點突變來構築。此等基因之片段亦可使用市售外切核酸酶或內切核酸酶根據標準程序來製造。舉例而言，諸如Bal31之酶或定點突變誘發可用於自此等基因之末端系統地切掉核苷酸。另外，編碼活性毒素片段之基因片段可使用多種限制酶來獲得。

給定DIG-305殺蟲毒素之胺基酸序列，編碼序列可藉由使用既定宿主偏好的同義密碼子逆向轉譯編碼序列且接著使用替代同義密碼子最佳化序列以移除可能在轉錄、轉譯或mRNA穩定性中造成問題之序列來設計。另外，同義密碼子可用於將終止密碼子引入非DIG-305閱讀框架(亦即閱讀框架2、3、4、5及6)中以消除雜散的長開放閱讀框架。

定量多肽或核酸序列一致性 兩個胺基酸序列或兩個核酸序列之一致性百分比出於最佳比較目的藉由首先 比對序列來確定。兩個序列之間的一致性百分比為該等序列共有的相同位置數的函數(亦即一致性百分比=相同位置數/位置總數(例如重疊位置)×100)。在一個實施例中，兩個序列之長度相同。兩個序列之間的一致性百分比可在允許有空隙或不允許有空隙的情況下，使用與上文所述類似的技術來確定。在計算一致性百分比時，通常對精確匹配進行計數。

兩個序列之間的一致性百分比的確定可使用數學算法來實現。此類算法的非限制性實例為Altschul等人(1990)及Karlin及Altschul(1990)之算法，其如Karlin及Altschul(1993)所修改且併入BLASTN及BLASTX程式中。BLAST搜尋可方便地用於鑑別核或蛋白質資料庫中與查詢序列同源(類似)的序列。可進行BLASTN搜尋(評分=100，字長=12)以鑑別與本發明所主張之核酸分子具有同源性的核苷酸序列。可進行BLASTX搜尋(評分=50，字長=3)以鑑別與本發明所主張之殺蟲蛋白質分子具有同源性的胺基酸序列。

出於比較目的，可採用空隙BLAST(Altschul等人，1997)以獲得空隙比對。或者，可使用PSI-Blast進行迭代搜尋，偵測分子間的遠緣關係(Altschul等人，1997)。當採用BLAST、空隙BLAST及PSI-Blast程式時，可使用相應程式的預設參數。參見www.ncbi.nlm.nih.gov。

用於序列比較之數學算法的非限制性實例為ClustalW算法(Thompson等人，1994)。ClustalW比較序列且 比對整個胺基酸或DNA序列，且因此可提供關於整個胺基酸序列或核苷酸序列之序列保守性的資料。ClustalW算法用於數個市售DNA/胺基酸分析軟體套件，諸如Vector NTI程式套(Invitrogen,Inc.,Carlsbad,CA)之ALIGNX模組。當用ALIGNX比對胺基酸序列時，吾人可方便地使用空隙開放罰分10、空隙擴展罰分0.1及blosum63mt2比較矩陣之預設評定胺基酸相似性(共同)百分比或兩個序列之間的一致性。當用ALIGNX比對DNA序列時，吾人可方便地使用空隙開放罰分15、空隙擴展罰分6.6及swgapdnamt比較矩陣之預設評定兩個序列之間的一致性百分比。

用於序列比較之數學算法的另一非限制性實例為Myers及Miller(1988)之算法。此類算法併入wSTRETCHER程式中，其為wEMBOSS序列比對軟體套件之一部分(可在http：//emboss.sourceforge.net/獲得)。wSTRETCHER使用經典動態程式化算法的修正計算兩個序列的最佳化全局比對，該算法使用線性空間。可指定用於計算比對的取代矩陣、空隙插入罰分及空隙擴展罰分。當利用wSTRETCHER程式比較核苷酸序列時，在評分矩陣文件EDNAFULL下可使用空隙開放罰分16及空隙擴展罰分4。當用於比較胺基酸序列時，在EBLOSUM62評分矩陣文件下可使用空隙開放罰分12及空隙擴展罰分2。

用於序列比較之數學算法的另一非限制性實例為Needleman及Wunsch(1970)之算法，其併入序列比對軟體套件GAP第10版及wNEEDLE(http：//emboss.sourceforge.net/) 中。GAP第10版可使用以下參數用以確定序列一致性或相似性：對於核苷酸序列，使用空隙權數50及長度權數3以及nwsgapdna.cmp評分矩陣確立一致性%及相似性%。對於胺基酸序列比較，使用空隙權數8及長度權數2以及BLOSUM62評分程式確定一致性%或相似性%。

wNEEDLE讀取兩個輸入序列，沿著其整個長度尋找最佳化比對(包括空隙)且將其最佳化全局序列比對寫入文件。該算法使用含有每一可能殘基或核苷酸匹配值之評分矩陣探索所有可能的比對且選擇最佳的。wNEEDLE發現具有最大可能評分的比對，其中該比對評分等於取自評分矩陣之匹配的總和減去由比對序列中之開放及擴展空隙引起的罰分。取代矩陣及空隙開放及擴展罰分為使用者指定的。當比較胺基酸序列時，使用預設空隙開放罰分10、空隙擴展罰分0.5及EBLOSUM62比較矩陣。當使用wNEEDLE比較DNA序列時，使用空隙開放罰分10、空隙擴展罰分0.5及EDNAFULL比較矩陣。

亦可使用等效程式。「等效程式」為所期望的對於所討論之任何兩個序列生成當與由ALIGNX、wNEEDLE或wSTRETCHER生成的相應比對相比時具有相同核苷酸或胺基酸殘基匹配及相同序列一致性百分比之比對的任何序列比較程式。一致性%為在所報導之比對區(包括該長度中之任何空隙)兩個序列之間相同匹配的百分比且相似性%為在所報導之比對區(包括該長度中之任何空隙)兩個序列之間的匹配百分比。

亦可藉由檢查人工進行比對。

重組宿主. 本發明之毒素編碼基因可引入多種多樣的微生物或植物宿主中。毒素基因表現直接或間接導致細胞內產生及維持殺蟲蛋白質。藉由適合的微生物宿主(例如假單胞菌屬(Pseudomonas))，該等微生物可應用於害蟲環境，在此其將增殖且被攝入。結果為害蟲控制。或者，容納毒素基因之微生物可在一定條件下處理，以便延長毒素活性且使重組宿主細胞穩定。經處理之細胞，其包含保留殺蟲活性之經處理之本發明之毒素多肽，可應用於目標害蟲環境以控制害蟲。

在B.t.毒素基因經由適合的DNA構築體(例如載體)引入至微生物宿主中且該宿主以活動狀態應用於環境之情況下，必需使用某些宿主微生物。選擇已知佔據一或多種所關注之作物的「植物圈」(葉面、葉圈、根圈及/或根面)的微生物宿主。選擇此等微生物以便能夠在具體環境(作物及其他昆蟲棲息地)中成功地與野生型原生微生物競爭，提供表現多肽殺害蟲劑之基因的穩定維持及表現及理想地提供使殺害蟲劑免於環境降解及不活化的改良。

已知大多數微生物存在於多種多樣的重要作物的葉面(植物葉之表面)及/或根圈(包圍植物根之土壤)。此等微生物包括細菌、藻類及真菌。以下微生物備受關注，諸如細菌，例如假單胞菌屬、伊文氏桿菌屬(Erwinia)、沙雷氏菌屬(Serratia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、黃單胞菌屬(Xanthomonas)、鏈黴菌屬(Streptomyces)、根瘤菌屬 (Rhizobium)、中華根瘤菌屬(Sinorhizobium)、紅假單胞菌屬(Rhodopseudomonas)、嗜甲基菌屬(Methylophilius)、農桿菌屬(Agrobacterium)、醋桿菌屬(Acetobacter)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、白念珠球菌屬(Leuconostoc)及產鹼桿菌屬(Alcaligenes)。以下植物圈細菌物種備受關注，諸如丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)、螢光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)、黏質沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋桿菌(Acetobacter xylinum)、根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)、放射形農桿菌(Agrobacterium radiobacter)、球形紅假單胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黃單胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(以前的苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti))、真養產鹼桿菌(Alcaligenes eutrophus)及棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)。另外受關注的為真菌，尤其酵母，例如酵母屬(Saccharomyces)、隱球菌屬(Cryptococcus)、克魯維酵母屬(Kluyveromyces)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、紅酵母屬(Rhodotorula)及短梗黴屬(Aureobasidium)，且植物圈酵母物種備受關注，諸如深紅酵母(Rhodotorula rubra)、黏紅酵母(R.glutinis)、海濱紅酵母(R.marina)、橙黃紅酵母(R.aurantiaca)、白色隱球菌(Cryptococcus albidus)、液化隱球菌(C.diffluens)、羅倫隱球菌(C.laurentii)、羅斯酵母(Saccharomyces rosei)、有抱酵母(S.pretoriensis)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、粉紅 擲孢酵母(Sporobolomyces roseus)、香氣擲孢酵母(S.odorus)、維羅納克魯維酵母(Kluyveromyces veronae)及出芽短梗黴(Aureobasidium pollulans)。經著色微生物備受關注。

本發明之經分離毒素多肽及組成物. 本發明之DIG-305殺蟲毒素多肽可經處理或製備以例如製造經調配殺害蟲組成物。經調配殺害蟲組合物之實例包括蛋白質組成物、可噴塗蛋白質組成物、誘鉺基質或在其他遞送系統中。在一個實例中，表現本發明之DIG-305殺蟲毒素之B.t.細胞或重組宿主細胞可使用標準技術培養基及醱酵技術來培養。在醱酵週期完成後，來自醱酵液之B.t.孢子或其他重組宿主細胞及/或毒素晶體可藉由此項技術中已知之方法分離。B.t.孢子或重組宿主細胞亦可在施用或經調配施用至植物之前加以處理。舉例而言，經分離之B.t.孢子及/或毒素晶體可經化學處理以延長殺蟲活性且因此包括本發明之經處理多肽。B.t.毒素多肽在重組宿主中生長且隨後處理B.t.以延長殺蟲活性之方法為已知的且已公開。參見例如美國專利第4,695,462號及第4,695,455號及Gaertner等人，1993。

本發明之經分離或處理之DIG-305殺蟲毒素可調配成以下組成物：細粉狀微粒固體顆粒、丸粒、可濕潤粉末、粉劑、水性懸浮液或分散液、乳液、噴霧劑、液態濃縮物或其他殺蟲調配物。此等殺蟲調配物藉由使本文中之DIG-305殺蟲多肽與佐劑、稀釋劑、界面活性劑、分散劑、惰性載劑及其他組分組合來製造以便於操作及施用以控制一或多種目標害蟲。此類調配物成分為此項技術中已知 的，同樣施用方法及確定提供所需殺蟲活性之B.t.孢子及/或經分離DIG-305多肽晶體之含量的方法亦是如此。

控制昆蟲害蟲之方法. 當昆蟲與經由殺蟲組成物(例如經調配蛋白質組成物、可噴塗蛋白質組成物、誘鉺基質、轉殖基因植物表現或其他遞送系統遞送之有效量之本文所揭示之DIG-305毒素接觸時，結果通常為昆蟲死亡，或昆蟲不以產生可用於昆蟲之毒素的源頭為食。

標的蛋白質毒素可以多種方式「施用」或提供以接觸目標昆蟲。舉例而言，本發明之DIG-305殺蟲毒素可在與佐劑、稀釋劑、載劑等一起調配得到呈細粉狀微粒固體、顆粒、丸粒、可濕潤粉末、粉劑、水性懸浮液或分散液及乳液形式之組成物後施用。或者，DIG-305殺蟲多肽可藉由可使用且此項技術中熟知的轉殖基因植物(其中該蛋白質藉由該植物產生且存在於該植物中)遞送。毒素基因之表現亦可在植物之特定組織(諸如根、葉等)中選擇性實現。此可經由例如使用組織特異性啟動子來實現。噴塗施用為另一個實例且亦為此項技術中已知的。標的蛋白質可經適當調配以用於所需最終用途，且接著在發現侵染之前、在發現目標昆蟲之後、在發現侵染之前且在發現目標昆蟲之後及其類似情況噴霧(或以其他方式施用)於有待保護之植物上及/或植物周圍/植物附近。舉例而言，誘鉺顆粒亦可使用且為此項技術中已知的。

轉殖基因植物. 本文所揭示之DIG-305殺蟲毒素可用於保護幾乎任何類型之植物免受昆蟲害蟲損害。此類 植物之實例包括馬鈴薯、茄子、番茄、胡椒、菸草及茄科中之其他植物。此類植物之其他實例包括玉米、向日葵、大豆、棉花、芥花、稻穀、高梁、小麥、大麥、蔬菜、觀賞性植物、胡椒(包括辣椒)、糖用甜菜、水果及草皮等。使植物轉型之方法為此項技術中熟知的且說明性轉型方法描述於實例中。

本發明之一較佳實施例為用編碼DIG-305殺蟲毒素、殺蟲蛋白或其變體之基因使植物轉型。經轉型植物藉助於經轉型植物細胞中存在控制量之標的殺蟲蛋白或其變體而抗昆蟲目標害蟲侵襲。藉由將編碼B.t.殺蟲毒素之殺蟲特性的遺傳物質併入至具體昆蟲害蟲食用之植物的基因體中，成蟲或幼蟲將在進食食用植物之後死亡。單子葉及雙子葉分類之許多成員已經轉型。轉殖基因農作物以及水果及蔬菜受到商業關注。此類作物包括(但不限於)玉米、稻穀、大豆、芥花、向日葵、苜蓿、高梁、小麥、棉花、花生、蕃茄、馬鈴薯及其類似物。存在數種技術用於將外來遺傳物質引入至植物細胞中及用於獲得穩定維持及表現引入基因之植物。此類技術包括使塗佈於微粒上之遺傳物質直接加速進入細胞中(美國專利第4945050號及美國專利第5141131號)。植物可使用農桿菌屬技術進行轉型，參見美國專利第5177010號、歐洲專利第EP131624B1號、歐洲專利第EP159418B1號、歐洲專利第EP176112B1號、美國專利第5149645號、EP120516B1、美國專利第5464763號、美國專利第4693976號、歐洲專利第EP116718B1號、歐洲專利 第EP290799B1號、歐洲專利第EP320500B1號、歐洲專利第EP604662B1號、美國專利第7060876號、美國專利第6037526號、美國專利第6376234號、歐洲專利第EP292435B1號、美國專利第5231019號、美國專利第5463174號、美國專利第4762785號、美國專利第5608142號及美國專利第5159135號。其他轉型技術包括WHISKERS^TM技術，參見美國專利第5302523號及美國專利第5464765號。電穿孔技術亦已用於使植物轉型，參見WO1987006614、美國專利第5472869號、美國專利第5384253號、WO199209696、美國專利第6074877號、WO1993021335及美國專利第5679558號。除了許多用於使植物轉型之技術之外，亦可改變與外源基因接觸之組織類型。此類組織將包括(但不限於)胚性組織、I型及II型愈傷組織、下胚軸、分生組織及其類似物。幾乎全部植物組織可在反分化期間使用屬於熟習此項技術者之技能內的適當技術進行轉型。

編碼DIG-305殺蟲毒素之基因可使用如上文所揭示之此項技術中熟知的多種技術插入至植物細胞中。舉例而言，大多數包含允許選擇經轉型微生物細胞之標記及在大腸桿菌中起作用之複製系統的選殖載體可用於製備及修飾外源基因以便插入至高等植物中。此類操控可包括例如視預期用途需要插入突變、截短、添加或取代。載體包含例如pBR322、pUC系列、M13mp系列、pACYC184等。因此，編碼Cry蛋白質或變體之序列可在適合的限制性位點插 入至載體中。所得質體用於大腸桿菌之轉型，具有其之細胞在適合的培養基中培育，接著收集且溶解以便回收可加工數量之質體。序列分析、限制性片段分析、電泳及其他生物化學-分子生物學方法一般作為分析方法來進行。在每次操控之後，所用DNA序列可裂解且接合至下一DNA序列。每一經操控DNA序列可選殖於相同或其他質體中。

使用含T-DNA之載體轉型植物細胞已被集中研究且充分描述於歐洲專利第EP120516B1號；Lee及Gelvin(2008)、Fraley等人(1986)及An等人(1985)中，並在本領域中沿用已久。

一旦所插入之DNA已整合至植物基因體中，其在後續各代中相對穩定。用於使植物細胞轉型之載體通常含有可選標記基因，該標記基因編碼賦予經轉型植物細胞對除草劑或抗生素(諸如草胺膦畢拉草(phosphinothricin Bialaphos)、卡那黴素(Kanamycin)、新黴素(Neomycin)、G418、博萊黴素(Bleomycin)、潮黴素(Hygromycin))之抗性的蛋白質；或編碼對草甘膦(glyphosate)、甲胺喋呤(methotrexate)、咪唑啉酮(imidazolinone)、磺醯脲(sulfonylurea)及三唑并嘧啶(triazolopyrimidine)除草劑(諸如氯磺隆(chlorosulfuron)、溴苯腈(bromoxynil)、茅草枯(dalapon)及其類似物)之抗性或耐受性的基因。另外受關注的為賦予對諸如精吡氟氯禾靈(haloxyfop)、快伏草(quizalofop)、禾草靈(diclofop)及其類似物之除草劑之耐受性的基因，如由AAD基因所例示(美國專利申請案第 20090093366號)。因此，單獨採用之可選標記基因應允許選擇經轉型細胞，而不含插入DNA之細胞的生長受到選擇性化合物抑制。

許多技術可用於將DNA插入至宿主植物細胞中。彼等技術包括用由根癌農桿菌或毛根農桿菌(Agrobacterium rhizogenes)遞送之T-DNA作為轉型劑轉型。此外，可採用植物原生質體與含有待遞送DNA之脂質體融合、直接注射DNA、基因槍轉型(微粒轟擊)或電穿孔以及其他可能方法。

在本發明之一較佳實施例中，植物將用蛋白質編碼區之密碼子使用已經最佳化用於植物之基因轉型。參見例如美國專利第5380831號。舉例而言，本發明之DIG-305殺蟲毒素可經最佳化以便在以下雙子葉植物中表現，諸如馬鈴薯、茄子、番茄、胡椒、菸草及茄科中之其他植物。本發明之DIG-305殺蟲毒素亦可經最佳化以便在其他雙子葉植物中或在諸如玉蜀黍(Zea mays)(玉米)之單子葉植物中表現。另外，有利的是，使用編碼截短毒素之植物。截短毒素通常將編碼全長毒素之約55%至約80%。用於形成適用於植物之合成B.t.基因的方法為此項技術中已知的(Stewart 2007)。

與轉型技術無關，基因較佳併入基因轉移載體中，該載體藉由在載體中包括植物啟動子而用以在植物細胞中表現B.t.殺蟲毒素基因及變體。除了植物啟動子之外，來自多種來源之啟動子可在植物細胞中有效用以表現外源 基因。舉例而言，可使用細菌來源之啟動子，諸如章魚鹼合成酶啟動子、胭脂鹼合成酶啟動子、甘露鹼合成酶啟動子；病毒來源之啟動子，諸如花椰菜嵌紋病毒(CaMV)之35S及19S啟動子及其類似物。植物來源之啟動子包括(但不限於)核酮糖-1,6-二磷酸(RUBP)羧化酶小次單位(ssu)、β-伴大豆球蛋白啟動子、菜豆蛋白啟動子、ADH(醇脫氫酶)啟動子、熱休克啟動子、ADF(肌動蛋白解聚合因子)啟動子及組織特異性啟動子。啟動子亦可含有可改良轉錄效率之某些強化子序列元件。典型強化子包括(但不限於)ADH1-內含子1及ADH1-內含子6。可使用組成性啟動子。組成性啟動子在幾乎所有細胞類型中及在幾乎所有時間引導連續基因表現(例如肌動蛋白、泛素、CaMV 35S)。組織特異性啟動子負責特定細胞或組織類型(諸如葉或種子)中之基因表現(例如玉米蛋白、油質蛋白、油菜籽蛋白、ACP(醯基載體蛋白質))，且亦可使用此等啟動子。亦可使用在植物發育之某一階段期間具有活性以及在特定植物組織及器官中具有活性之啟動子。此類啟動子之實例包括(但不限於)根特異性、花粉特異性、胚特異性、玉米穗黃特異性、棉花纖維特異性、種子內胚乳特異性、韌皮部特異性啟動子及其類似物。

在某些情況下，可能需要使用誘導性啟動子。誘導性啟動子負責回應於以下特定信號之基因表現，諸如：物理刺激(例如熱休克基因)；光(例如RUBP羧化酶)；激素(例如糖皮質激素)；抗生素(例如四環素)；代謝物；及應力 (例如乾旱)。可使用在植物中起作用之其他所需轉錄及轉譯元件，諸如5'未轉譯前導序列、RNA轉錄終止序列及聚腺苷酸添加信號序列。許多植物特異性基因轉移載體為此項技術中已知的。

本發明包括並非分化全能(非分化全能)之植物細胞、並非繁殖材料之植物細胞(例如，一些實施例中之葉細胞；種子細胞自一些實施例排除)及不能分化成完整植物之植物細胞。本發明包括具有除再生成完整植物以外之用途的植物細胞。舉例而言，該等植物細胞可用於產生蛋白質(諸如本發明之DIG-305蛋白質)。因此，本發明之植物細胞包括具有除分化全能以外之用途的植物細胞(亦即，本發明之一些細胞無法再生成完整植物)。然而，一些實施例包括種子細胞及可再生成完整植物之植物細胞。

含有昆蟲抗性(IR)性狀之轉殖基因作物在整個北美之玉米及棉花植物中為普遍的，且此等性狀之使用在全球擴張。組合IR及耐除草劑(HT)性狀之商業轉殖基因作物已由多個種子公司開發。此等包括由B.t.殺蟲蛋白質賦予之IR性狀與以下HT性狀之組合，諸如對乙醯乳酸合成酶(ALS)抑制劑，諸如磺醯脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、磺醯基苯胺及其類似物；麩醯胺酸合成酶(GS)抑制劑，諸如畢拉草、草銨膦及其類似物；4-羥基苯基丙酮酸二加氧酶(HPPD)抑制劑，諸如甲基磺草酮(mesotrione)、異噁唑草酮(isoxaflutole)及其類似物；5-烯醇丙酮醯莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)抑制劑，諸如草甘膦及其類似物；及乙醯基輔酶 A羧化酶(ACCase)抑制劑，諸如精吡氟氯禾靈、快伏草、禾草靈及其類似物之耐受性。其他實例為已知的，其中轉殖基因提供之蛋白質提供對以下除草劑化學類別之植物耐受性，諸如苯氧酸除草劑及吡啶氧基乙酸酯生長素除草劑(參見WO2007053482)、或苯氧酸除草劑及芳氧基苯氧基丙酸酯除草劑(參見美國專利申請案第20090093366號)。經由IR性狀控制多個害蟲問題之能力為有價值的商業產品概念，且若昆蟲控制性狀及野草控制性狀組合在同一植物中，則此產品概念之便利性增強。另外，改良價值可經由單個植物之由B.t.殺蟲蛋白質(諸如本發明之B.t.殺蟲蛋白質)賦予之IR性狀與一或多個額外HT性狀(諸如上文所提及之HT性狀)之組合，加一或多個額外輸入性狀(例如由來源於B.t.或其他殺蟲蛋白質賦予之其他昆蟲抗性、藉由諸如RNAi及其類似物之機制賦予的昆蟲抗性、線蟲抗性、疾病抗性、應力耐受性、改良的氮氣利用率及其類似物)或輸出性狀(例如高油含量、健康油組成、營養改良及其類似物)來獲得。此類組合可經由習知育種(育種堆疊)或共同作為涉及同時引入多個基因之新穎轉型事件(分子堆疊或共轉型)來獲得。益處包括管理昆蟲害蟲之能力及在作物中改良野草控制以向生產者及/或消費者提供次要益處。因此，本發明可用於與其他性狀組合以提供改良作物品質與靈活且成本有效地控制任何數目之農藝問題之能力的完整農藝封裝。

目標害蟲. 本發明之DIG-305殺蟲毒素尤其適用於控制昆蟲害蟲。鞘翅目昆蟲為每年造成極大量損害之一 群重要的農業、園藝及家庭害蟲。此大昆蟲目涵蓋攝食葉面及根之幼蟲及成蟲，包括例如以下昆蟲科之成員：葉甲科(Chrysomelidae)、瓢蟲科(Coccinellidae)、象甲科(Curculionidae)、皮蠹科(Dermestidae)、叩甲科(Elateridae)、金龜子科(Scarabaeidae)、木蠹蟲科(Scolytidae)及偽步行蟲科(Tenebrionidae)。此等科內包括葉甲科中之葉甲及潛葉蟲、馬鈴薯甲蟲(例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲)、葡萄肖葉甲(Colaspis brunnea Fabricius)、黑角負泥蟲(Oulema melanopus Linnaeus)、向日葵甲蟲(Zygogramma exclamationis Fabricius)及瓢蟲科中之甲蟲(例如墨西哥豆瓢蟲(Epilachna varivestis Mulsant))。其他實例為金龜子科中之金龜子及其他甲蟲(例如日本甲蟲(Popillia japonica Newman)、北方圓頭犀金龜(蠐螬，Cyclocephala borealis Arrow)、南方圓頭犀金龜(蠐螬，Cyclocephala immaculata Olivier)、歐洲金龜子(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)、蠐螬(Phyllophaga crinita Burmeister)、胡蘿蔔甲蟲(Ligyrus gibbosus De Geer)及黑金龜屬(Holotrichia spp)及鰓角金龜屬(Melolontha spp.)之金龜子)。鞘翅目昆蟲之其他實例為象甲(例如棉鈴象甲(Anthonomus grandis Boheman)、稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel)、穀象甲(Sitophilus grananus Linnaeus)、米象甲(Sitophilus oryzae Linnaeus)及三葉草葉象(Hypera punctata Fabricius))。亦包括玉米象甲(Sphenophorus maidis Chittenden)、跳甲(例如玉米跳甲(Chaetocnema pulicara Melsheimer)及十字花科跳甲 (Phyllotreta cruciferae Goeze))、斑點黃瓜甲蟲(Diabrotica undecimpunctata)及根蟲(例如西方玉米根蟲(西方玉米根螢葉甲)、北方玉米根蟲(北方玉米根螢葉甲)、墨西哥玉米根蟲((MCR)墨西哥玉米根螢葉甲)、巴西玉米根螢葉甲、D.undecimpunctata tenella、黃瓜十一星葉甲(D.u.undecimpunctata Mannerheim)及南方玉米根蟲(南方玉米根螢葉甲))。鞘翅目害蟲之其他實例為麗金龜科(Rutelinae)甲蟲，諸如異麗金龜屬(Anomala)(包括A.marginata、A.lucicola、A.oblivia及東方麗金龜(A.orientalis))。額外鞘翅目昆蟲為皮蠹科之地毯甲蟲、叩甲科之鐵線蟲(例如梳爪叩頭蟲屬(Melanotus spp.)、寬胸叩頭蟲屬(Conoderus spp.)、Limonius spp.、細胸叩頭蟲屬(Agriotes spp.)、叩甲屬(Ctenicera spp.)、金針蟲屬(Aeolus spp.))、木蠹蟲科之樹皮甲蟲及偽步行蟲科之甲蟲(例如偽金針蟲屬(Eleodes spp)。一般而言，以上列出之任何屬(及其他)亦可藉由包括DIG-305殺蟲多肽單獨或與另一殺蟲劑之組合的殺蟲組成物而靶向作為本發明之一部分。此等屬中之任一者的任何額外昆蟲(作為目標)亦包括在本發明之範疇內。

涵蓋DIG-305殺蟲毒素控制作物之鞘翅目害蟲的用途。在一些實施例中，Cry蛋白質可經濟地用於控制昆蟲害蟲，包括(但不限於)例如根蟲，諸如西方玉米根蟲(西方玉米根螢葉甲)、北方玉米根蟲(北方玉米根螢葉甲)及南方玉米根蟲(南方玉米根螢葉甲)；及螬，諸如北方圓頭犀金龜、南方圓頭犀金龜及日本甲蟲之幼蟲。

鱗翅目昆蟲為每年造成極大量損害之另一群重要的農業、園藝及家庭害蟲。本發明提供DIG-305毒素與其他殺蟲劑之組合控制此目內之昆蟲害蟲的用途，其屬於本發明之範疇內。此昆蟲目涵蓋攝食葉面及根之幼蟲及成蟲，包括例如以下昆蟲科之成員：燈蛾科(Arctiidae)、麥蛾科(Gelechiidae)、尺蠖蛾科(Geometridae)、枯葉蛾科(Lasiocampidae)、毒蛾科(Lymantriidae)、夜蛾科(Noctuidae)、螟蛾科(Pyralidae)、透翅蛾科(Sesiidae)、天蛾科(Sphingidae)、大蛾科(Tineidae)及卷葉蛾科(Tortricidae)。鱗翅目昆蟲害蟲包括(但不限於)：小蠟螟(Achoroia grisella)、西部黑頭長翅卷蛾(Acleris gloverana)、黑頭長翅卷蛾(Acleris variana)、棉褐帶卷蛾(Adoxophyes orana)、小地老虎(黑切根蟲)、棉葉波紋葉蛾(Alabama argillacea)、秋尺蠖(Alsophila pometaria)、臍橙螟(Amyelois transitella)、地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、桃枝麥蛾(Anarsia lineatella)、禮紋犀額蛾(Anisota senatoria)、柞蠶(Antheraea pernyi)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黃卷蛾屬(Archips sp.)、帶卷蛾屬(Argyrotaenia sp.)、粗皮夜蛾(Athetis mindara)、家蠶(Bombyx mori)、棉潛蛾(Bucculatrix thurberiella)、粉斑螟蛾(Cadra cautella)、色卷蛾屬(Choristoneura sp.)、向日葵細卷葉蛾(Cochylls hospes)、紋黃豆粉蝶(Colias eurytheme)、米螟(Corcyra cephalonica)、Cydia latiferreanus、蘋果蠹蛾(Cydia pomonella)、核桃舟蛾(Datana integerrima)、西伯利亞松毛蟲(Dendrolimus sibericus)、葡萄小卷葉野螟(Desmia feneralis)、甜瓜絹野螟(Diaphania hyalinata)、黃瓜絹野螟(Diaphania nitidalis)、西南玉米螟、小蔗螟、白尺蠖蛾(Ennomos subsignaria)、墨西哥稻螟(Eoreuma loftini)、菸草粉螟(Esphestia elutella)、菩提松尺蠖(Erannis tilaria)、鹽澤燈蛾(Estigmene acrea)、Eulia salubricola、Eupocoellia ambiguella、葡萄螟蛾(Eupoecilia ambiguella)、黃毒蛾(Euproctis chrysorrhoea)、暗緣地老虎(Euxoa messoria)、大蠟螟(Galleria mellonella)、梨小食心蟲(Grapholita molesta)、葡萄葉菸翅斑蛾(Harrisina americana)、Helicoverpa subflexa、棉鈴蟲(玉米穗蟲)、菸芽夜蛾(Heliothis virescens)、行列半白大蠶蛾(Hemileuca oliviae)、向日葵螟(Homoeosoma electellum)、美國白蛾(Hyphantia cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia lycopersicella)、鐵杉尺蠖(Lambdina fiscellaria fiscellaria)、西方鐵杉尺蠖(Lambdina fiscellaria lugubrosa)、柳毒蛾(Leucoma salicis)、葡萄漿果小卷蛾(Lobesia botrana)、白緣豆夜蛾(西方豆切根蟲)、黃綠條螟(Loxostege sticticalis)、舞毒蛾(Lymantria dispar)、Macalla thyrisalis、天幕毛蟲屬(Malacosoma sp.)、甘藍夜蛾(Mamestra brassicae)、蓓帶夜蛾(Mamestra configurata)、番茄天蛾(Manduca quinquemaculata)、菸草天蛾(Manduca sexta)、豆莢野螟(Maruca testulalis)、斑馬紋夜蛾(Melanchra picta)、冬尺蠖蛾(Operophtera brumata)、古毒蛾屬(Orgyia sp.)、歐洲玉米螟、春尺蠖(Paleacrita vernata)、莖蛀蟲(Papiapema nebris)(常見莖蛀蟲)、美洲大芷鳳蝶(Papilio cresphontes)、紅鈴蟲(Pectinophora gossypiella)、加州株蟲(Phryganidia californica)、斑幕潛葉蛾(Phyllonorycter blancardella)、暗脈菜粉蝶(Pieris napi)、菜粉蝶(Pieris rapae)、苜蓿綠夜蛾(Plathypena scabra)、Platynota flouendana、荷蘭石竹小卷蛾(Platynota stultana)、朝鮮薊羽蛾(Platyptilia carduidactyla)、印度穀螟(Plodia interpunctella)、小菜蛾(Plutella xylostella)、美國紋白蝶(Pontia protodice)、一星黏蟲(Pseudaletia unipuncta)(行軍蟲)、大豆夜蛾(Pseudoplasia includens)、雜食尺蠖(Sabulodes aegrotata)、紅山背舟蛾(Schizura concinna)、麥蛾(Sitotroga cerealella)、蘋白小卷峨(Spilonta ocellana)、草地黏蟲(秋天行軍蟲)、甜菜夜蛾、Thaurnstopoea pityocampa、Ensola bisselliella、粉紋夜蛾、溫室螟蛾(Udea rubigalis)、Xylomyges curiails及蘋果巢蛾(Yponomeuta padella)。

亦涵蓋DIG-305殺蟲毒素控制寄生線蟲之用途，該等寄生線蟲包括(但不限於)根結線蟲(Meloidogyne incognita)及大豆異皮線蟲(Heterodera glycines)。

抗毒素抗體. 針對本文所揭示之毒素或等效毒素或此等毒素之片段的抗體可易於使用此項技術中之標準程序製備。此類抗體適用於使用標準ELISA方法偵測DIG-305毒素之存在。

使用探針偵測. 鑑別本發明之毒素及基因之另一方法為經由使用寡核苷酸探針。此等探針為可偵測之核 苷酸序列。此等序列可藉助於適當放射性標記變得可偵測或可如美國專利第6268132號中所述使得本身帶有螢光。如此項技術中所熟知，若探針分子及核酸樣品藉由在兩個分子之間形成強鹼基配對鍵而雜交，則可合理地假定探針與樣品具有實質上序列同源性。雜交較佳如例如Keller及Manak(1993)中所述，在嚴格條件下藉由此項技術中熟知的技術來進行。探針偵測提供以已知方式測定雜交是否已出現之手段。此種探針分析提供鑑別本發明之毒素編碼基因的快速方法。根據本發明用作探針之核苷酸區段可使用DNA合成儀及標準程序來合成。此等核苷酸序列亦可用作PCR引子以擴增本發明之基因。

雜交. 如分子生物學技術人員所熟知，兩個核酸之相似性可藉由其雜交趨勢來表徵。如本文所用，術語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」意欲指相比對於其他序列，探針將在可偵測地較大程度上與其目標序列雜交(黏接)(例如超過先前技術至少2倍)。嚴格條件與序列相關，且將隨情況不同而不同。藉由控制雜交及/或洗滌條件之嚴格性，可鑑別與探針100%互補之目標序列(同源探測)。或者，可調節條件嚴格性以允許序列中存在一些錯配，以便偵測較低程度的相似性(異源探測)。一般而言，探針長度少於約1000個核苷酸、較佳長度少於500個核苷酸。

通常，嚴格條件應為在pH 7.0至pH 8.3下之鹽濃度小於約1.5M Na離子，通常約0.01至1.0M Na離子濃度(或其他鹽)且溫度為對於短探針(例如10至50個核苷酸)至少約 30℃且對於長探針(例如大於50個核苷酸)至少約60℃之條件。嚴格條件亦可藉由添加去穩定化劑(諸如甲醯胺)來實現。例示性低嚴格性條件包括在37℃下在30%至35%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS(十二烷基硫酸鈉)之緩衝溶液下雜交及在50℃至55℃下在1×至2×SSC(20×SSC=3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中洗滌。例示性中等嚴格性條件包括在37℃下在40%至45%甲醯胺、1.0M NaCl、1% SDS中雜交及在55℃至60℃下在0.5×至1×SSC中洗滌。例示性高嚴格性條件包括在37℃下在50%甲醯胺、1M NaCl、1% SDS中雜交及在60℃至65℃下在0.1×SSC中洗滌。視情況，洗滌緩衝液可包含約0.1%至約1% SDS。雜交持續時間一般小於約24小時，通常約4至約12小時。

特異性通常與雜交後洗滌相關，關鍵因素為最終洗滌溶液之離子強度及溫度。對於DNA/DNA雜交，熱熔點(T_m)為50%之互補目標序列與完全匹配之探針雜交的溫度(在定義離子強度及pH下)。每1%錯配，T_m減小約1℃；因此，可調節T_m、雜交條件及/或洗滌條件以促進具有所需一致性之序列黏接。舉例而言，若尋求具有>90%一致性之序列，則T_m可降低10℃。一般而言，選擇低於特定序列及其補體在定義離子強度及pH下之T_m約5℃的嚴格條件。然而，高度嚴格條件可採用在比T_m低1℃、2℃、3℃或4℃下雜交及/或洗滌；中度嚴格條件可採用在比T_m低6℃、7℃、8℃、9℃或10℃下雜交及/或洗滌，且低嚴格條件可採用在比T_m低11℃、12℃、13℃、14℃、15℃或20℃下雜交及/或 洗滌。

T_m(℃)可以實驗方式確定或可藉由計算估計。對於DNA-DNA雜交，T_m可由Meinkoth及Wahl(1984)之等式估計：T_m(℃)=81.5℃+16.6(log M)+0.41(%GC)-0.61(%甲醯胺)-500/L；其中M為單價陽離子莫耳濃度，%GC為DNA中之鳥嘌呤及胞嘧啶核苷酸之百分比，%甲醯胺為雜交溶液中甲醯胺之百分比(w/v)且L為鹼基對雜交長度。

或者，T_m藉由下式描述(Beltz等人，1983)。

T_m(℃)=81.5℃+16.6(log[Na+])+0.41(%GC)-0.61(%甲醯胺)-600/L

其中[Na+]為鈉離子莫耳濃度，%GC為DNA中之鳥嘌呤及胞嘧啶核苷酸之百分比，%甲醯胺為雜交溶液中甲醯胺之百分比(w：v)且L為鹼基對雜交長度。

使用等式、雜交及洗滌組成物及所需T_m，一般技術者應理解原有描述之雜交嚴格性及/或洗滌溶液之變化。若所需程度的錯配導致T_m小於45℃(水溶液)或32℃(甲醯胺溶液)，則較佳增加SSC濃度以便可使用較高溫度。對於核酸雜交之詳盡指導見於Tijssen(1993)及Ausubel等人(1995)。亦參見Sambrook等人(1989)。

南方墨點上之固定DNA與放射性標記之基因特異性探針雜交可藉由標準方法來進行(Sambrook等人，見上文)。用於標記聚核苷酸探針之放射性同位素可包括32P、 33P、14C或3H。放射性同位素併入至聚核苷酸探針分子中可藉由分子生物學領域中之技術人員熟知的數種方法中之一者來進行。(參見例如Sambrook等人，見上文)。一般，雜交及後續洗滌可在嚴格條件下進行，以便偵測與所主張之毒素編碼基因同源的目標序列。對於雙股DNA基因探針，雜交可在比DNA雜交物T_m低20℃至25℃下在6×SSPE、5×登哈特氏溶液(Denhardt's Solution)、0.1% SDS、0.1mg/mL變性DNA(20×SSPE為3M NaCl、0.2M NaHPO₄及0.02M EDTA(乙二胺四乙酸鈉鹽)；100×登哈特氏溶液為20gm/L聚乙烯吡咯酮、20gm/L Ficoll 400型及20gm/L牛血清白蛋白(部分V))中進行隔夜。

洗滌可通常進行如下：在室溫下在1×SSPE、0.1% SDS中進行15分鐘兩次(低嚴格性洗滌)。在T_m-20℃下在0.2×SSPE、0.1% SDS中進行15分鐘一次(中等嚴格性洗滌)。

對於寡核苷酸探針，雜交可在比雜交物T_m低10℃至20℃下在6×SSPE、5×登哈特氏溶液、0.1% SDS、0.1mg/mL變性DNA中進行隔夜。寡核苷酸探針之T_m可藉由下式確定(Suggs等人，1981)。

T_m(℃)=2(T/A鹼基對之數目)+4(G/C鹼基對之數目)

洗滌可通常進行如下：在室溫下在1×SSPE、0.1% SDS中進行15分鐘兩次(低嚴格性洗滌)。在雜交溫度下在1×SSPE、0.1% SDS中進行15分鐘一次(中等嚴格性洗滌)。

用於雜交之探針分子及在探針與目標分子之間形成的雜交分子可藉由除放射性標記以外之手段而變得可 偵測。此類替代方法意欲屬於本發明之範疇內。

本文中提及或列舉之全部專利、專利申請案、臨時申請案及公開案以全文引用之方式併入，至其不與本說明書之明確教示內容不一致之程度。

藉由在本文中使用術語「遺傳物質」，其意欲包括所有基因、核酸、DNA及RNA。術語「dsRNA」係指雙股RNA。對於聚核苷酸、DNA、RNA、寡核苷酸及引子之核苷酸殘基的名稱及對於蛋白質之胺基酸殘基的名稱，在本文件通篇採用標準IUPAC縮寫。核酸序列以標準5'至3'方向呈現，且蛋白質序列以標準胺基(N)端至羧基(C)端方向呈現。

應瞭解，本文所述之實例及實施例僅出於說明之目的，且根據其之各種修改或變化將由熟習此項技術者提出且包括在本申請案之精神及範圍內及隨附申請專利範圍之範疇內。此等實例不應視為限制。

除非特定指示或暗示，否則如本文所用之術語「一(a/an)」及「該」表示「至少一個/種」。

除非另外指出，否則所有百分比均以重量計且所有溶劑混合物比例均以體積計。所有溫度均以攝氏度為單位。

實例1

分離編碼DIG-305毒素之基因

除非另外指明，否則此實例及後續實例中所述之分子生物學及生物化學操控藉由如例如Ausubel等人(1995) 及Sambrook等人(1989)及其更新中所揭示之標準方法來進行。編碼在本文中稱為DIG-305之殺蟲Cry蛋白質的核酸自亦稱為DBt10340之B.t.菌株PS18A分離。聚合酶鏈反應(PCR)之簡併正向及逆向引子經設計且用於擴增基因體DNA庫之與Cry32同源的DNA片段。擴增片段之測定序列用於基因體步行以獲得DIG-305之完整開放閱讀框架。SEQ ID NO：1為編碼全長DIG-305蛋白質之3726 bp核苷酸序列。SEQ ID NO：2為由SEQ ID NO：1推斷之全長DIG-305蛋白質之1241個胺基酸的序列。

實例2

細菌宿主中之DIG-305嵌合毒素

使用標準選殖方法構築經工程改造以生產如上所述之DIG-305嵌合毒素之螢光假單胞菌(Pf)表現質體，該嵌合毒素由DIG-305核心毒素編碼序列(編碼胺基酸1-685)及Cry1Ab原毒素編碼區段組成，各由玉米最佳化編碼序列編碼。限制性內切核酸酶自New England BioLabs(NEB；Ipswich,MA)獲得且T4 DNA接合酶(Invitrogen)用於DNA接合。使用NucleoSpin®質體套組(Macherey-Nagel Inc,Bethlehem,PA)，按照供應商說明書進行質體製備。在瓊脂糖Tris-乙酸鹽凝膠電泳之後，使用QIAquick凝膠提取套組(Qiagen)純化DNA片段。線性化載體用NEB Antarctic磷酸酶進行磷酸酶處理以增強重組分子之形成。

基本選殖策略需要將具有DIG-305 Cry1Ab嵌合體編碼序列(CDS)之DNA片段在例如SpeI及SalI限制性位點 處次選殖至pDOW1169中，藉此將DIG-305嵌合體CDS置於質體pKK223-3(PL Pharmacia,Milwaukee,WI)之Ptac啟動子及rrnBT1T2終止子的表現控制下。pDOW1169為中等拷貝質體，在可引入含有蛋白質編碼區之DNA片段的限制酶識別位點之前有RSF1010複製起點、pyrF基因及核糖體結合位點(美國專利第7618799號)。表現質體藉由電穿孔轉型至DC454(具有突變△pyrF及lsc：：lacIQI之近似野生型螢光假單胞菌菌株)或其衍生物中，在SOC-大豆水解產物培養基中回收且塗覆在選擇性培養基(缺少尿嘧啶之M9葡萄糖瓊脂，Sambrook等人，見上文)上。轉型及選擇方法之詳情一般可描述於以引用的方式併入本文中之Squires等人(2004)、美國專利申請案第20060008877號、美國專利第7681799號及美國專利申請案第20080058262號中。重組菌落藉由小規模純化質體DNA之限制性分解來鑑別。

用於表徵及昆蟲生物分析之DIG-305嵌合體藉由搖瓶生長之含有表現構築體之螢光假單胞菌菌株產生。使用在補充有葡萄糖及微量元素之M9培養基中生長的種子培養物來接種成分確定之基本培養基。在30℃下在震盪下初始培育24小時之後，藉由添加異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導DIG-305嵌合體編碼序列表現。在誘導時及在誘導後之多個時間對培養物進行取樣。藉由在600nm下之光學密度(OD₆₀₀)量測細胞密度。亦可採用適用於螢光假單胞菌生長之其他培養基，例如，如Huang等人2007及美國專利申請案第20060008877號中在產生不溶性B.t.殺蟲蛋 白包涵體(IB)之螢光假單胞菌醱酵之細胞所述。簡言之，將細胞溶解，藉由離心製備離心塊及清液層部分，將離心塊再懸浮且藉由在溶解緩衝液中再懸浮來反覆洗滌，直至清液層變成無色且IB離心塊變得堅硬且呈灰白色為止。洗滌最終離心塊，再懸浮於含有2mM EDTA之無菌過濾蒸餾水中且在-80℃下儲存。清液層部分藉由管柱層析富集重組蛋白質。

藉由SDS-PAGE分析製備物。相對於在相同凝膠上運行之牛血清白蛋白(BSA)樣品，藉由比較各帶之光密度值進行目標帶之定量以產生標準曲線。接著，使用拋棄式PD-10管柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)將樣品緩衝液更換成10mM CAPS(3-(環己胺基)1-丙磺酸)pH10。

相對於背景減去之BSA標準品，藉由SDS-PAGE分析且定量濃縮提取物以產生標準曲線，從而計算DIG-305嵌合體之濃度。

實例3

設計DIG-305 B.t.殺蟲毒素之植物最佳化編碼序列

植物分子生物學之技術人員應理解，多個DNA序列可經設計以編碼單個胺基酸序列。增加所關注蛋白質之編碼區表現的常見手段為以一定方式定製編碼區使其密碼子組成類似於預定表現基因之宿主的整體密碼子組成。關於合成基因設計及產生之指導可見於例如WO1997013402、美國專利第6166302號及美國專利第5380831號中。

設計且合成具有玉米密碼子傾向之DNA序列以在轉殖基因單子葉植物中產生DIG-305殺蟲蛋白。玉米(Zea mays L.)之密碼子使用表由自GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)中寄存之序列獲得的數百種蛋白質編碼序列計算得到。在省略使用少於該胺基酸所用總密碼子之約10%的任何同義密碼子之後，計算重新調整之玉米密碼子集合。

為衍生編碼SEQ ID NO：3之DIG-305蛋白質核心毒素或其殺蟲片段或DIG-305嵌合毒素之玉米密碼子最佳化DNA序列，對以實驗方式測定之編碼毒素之(天然)DIG-305 DNA序列(SEQ ID NO：1)進行密碼子取代，使得所得DNA序列具有玉米最佳化密碼子傾向表之全部密碼子組成。對序列進行進一步改進以消除不當限制酶識別位點、可能存在的植物內含子剪接位點、A/T或C/G殘基之長期使用及可能干擾植物細胞編碼區之mRNA穩定性、轉錄或轉譯的其他基元。進行其他變化以引入所需限制酶識別位點且消除長的內部開放閱讀框架(除+1以外的框架)。此等變化全部在保留玉米偏向之重新調整的密碼子組成的限制內進行。編碼DIG-305核心毒素之玉米最佳化DNA序列揭示為SEQ ID NO：3。

實例4

在細菌宿主中構築編碼DIG-305毒素之表現質體

使用標準選殖方法構築經工程改造以產生由玉米最佳化編碼序列編碼之DIG-305的螢光假單胞菌(Pf)表現質體。限制性內切核酸酶自New England BioLabs(NEB； Ipswich,MA)獲得且T4 DNA接合酶(Invitrogen)用於DNA接合。使用NucleoSpin®質體套組(Macherey-Nagel Inc,Bethlehem,PA)，按照供應商說明書進行質體製備。在瓊脂糖Tris-乙酸鹽凝膠電泳之後，使用QIAquick凝膠提取套組(Qiagen)純化DNA片段。線性化載體用NEB Antarctic磷酸酶進行磷酸酶處理以增強重組分子之形成。

將具有如由SEQ ID NO：3提供之DIG-305編碼序列(CDS)的DNA片段在例如SpeI及SalI限制性位點處次選殖至pDOW1169中，藉此將DIG-305 CDS置於質體pKK223-3(PL Pharmacia,Milwaukee,WI)之Ptac啟動子及rrnBT1T2終止子的表現控制下。pDOW1169為中等拷貝質體，在可引入含有蛋白質編碼區之DNA片段的限制酶識別位點之前有RSF1010複製起點、pyrF基因及核糖體結合位點(美國專利第7618799號)。表現質體(pDAB107162，含有DIG-305編碼序列)藉由電穿孔轉型至DC454(具有突變△pyrF及lsc：：lacIQI之近似野生型螢光假單胞菌菌株)或其衍生物中，在SOC-大豆水解產物培養基中回收且塗覆於選擇性培養基(缺少尿嘧啶之M9葡萄糖瓊脂，Sambrook等人，見上文)上。轉型及選擇方法一般可描述於以引用的方式併入本文中之Squires等人(2004)、美國專利申請案第20060008877號、美國專利第7681799號及美國專利申請案第20080058262號中。重組菌落藉由小規模純化質體DNA之限制性分解來鑑別。所得表現菌株在陶氏益農公司重組菌種保藏中心(Dow AgroSciences Recombinant Culture Collection)中稱為DPf21990。

實例5

製備DIG-305蛋白質樣品

用於表徵及昆蟲生物分析之DIG-305藉由在搖瓶生長之含有表現質體pDAB107162之螢光假單胞菌菌株DPf21990中表現DIG-305來產生。使用在補充有葡萄糖及微量元素之M9培養基中生長的種子培養物來接種具有5%丙三醇之成分確定之基本培養基(Teknova目錄號3D7426,Hollister,CA)。在30℃下在震盪下初始培育24小時之後，藉由添加異丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導DIG-305編碼區表現。在誘導時及在誘導後之多個時間對培養物進行取樣。藉由在600nm下之光學密度(OD₆₀₀)量測細胞密度。亦可採用適用於螢光假單胞菌生長之其他培養基，例如，如Huang等人2007及美國專利申請案第20060008877號中所述。簡言之，將細胞溶解，藉由離心收集IB離心塊，將IB再懸浮且藉由在溶解緩衝液中再懸浮來反覆洗滌，直至清液層變成無色且IB離心塊變得堅硬且呈灰白色為止。洗滌最終離心塊，再懸浮於含有2mM EDTA之無菌過濾蒸餾水中且在-80℃下儲存。

藉由SDS-PAGE分析IB製備物。相對於在相同凝膠上運行之牛血清白蛋白(BSA)樣品，藉由比較各帶之光密度值進行目標帶之定量以產生標準曲線。隨後使用碳酸鈉緩衝液自包涵體提取目標蛋白質且在平台上在4℃下溫和搖動隔夜。離心溶解的DIG-305且濃縮所得清液層。接著， 使用拋棄式PD-10管柱(GE Healthcare,Piscataway,NJ)將樣品緩衝液更換成10mM CAPS(3-(環己胺基)1-丙磺酸)pH10。

相對於背景減去之BSA標準品，藉由SDS-PAGE分析且定量濃縮提取物以產生標準曲線，從而計算DIG-305之濃度。

實例6

DIG-305殺蟲毒素之昆蟲活性

測試且發現DIG-305對鞘翅目昆蟲西方玉米根蟲(西方玉米根螢葉甲)之幼蟲具有殺蟲活性。

在用西方玉米根蟲(西方玉米根螢葉甲)之幼蟲進行之生物分析中，測試含有經純化蛋白質(溶解或作為包涵體；表2)之溶液的殺蟲活性。昆蟲卵自CROP CHARACTERISTICS,INC.(Farmington,MN)獲得。

在128孔生物分析托盤中進行西方玉米根螢葉甲生物分析，且使用Dow AgroSciences LLC專用的根蟲飼料並使用80至100μl等分試樣溶液處理飼料表面。風乾經處理托盤且將一個單獨幼蟲寄存在經處理飼料表面上。感染孔接著用透明塑膠黏合片密封，通風以允許氣體交換(C-D International,Pitman,NJ)。將生物分析托盤保持在受控環境條件(28℃，40%相對濕度，16：8h亮：暗光週期)下5天。在所有生物分析中記錄暴露於各蛋白質樣品之昆蟲的總數、死昆蟲數及存活昆蟲之重量。使用胰蛋白酶活化之Cry3Aa作為陽性對照。陰性對照包括水；未處理；Cry1Fa；20mM 檸檬酸鈉p.H.3.5；及10mM CAPS pH 10。

計算各處理之死亡率百分比及生長抑制百分比。生長抑制(GI)計算如下：GI=[1-(TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)]

其中TWIT為處理中昆蟲之總重量，TNIT為處理中昆蟲之總數，TWIBC為背景檢查(緩衝液對照)中昆蟲之總重量且TNIBC為背景檢查(緩衝液對照)中昆蟲之總數。生物分析結果彙總於下表2中。重複的生物分析證實攝入DIG-305製備物導致西方玉米根蟲死亡及生長抑制(表2)。

溶解來自包涵體之DIG-305蛋白質(10mM CAPS pH10)且針對西方玉米根蟲進行測試。

實例7

農桿菌轉型

使用標準選殖方法構築二元植物轉型及表現質體。自NEB獲得限制性內切核酸酶及T4 DNA接合酶。使用 NucleoSpin®質體製備套組或NucleoBond® AX Xtra Midi套組(均來自Macherey-Nagel)，按照製造商說明書進行質體製備。在凝膠分離之後，使用QIAquick PCR純化套組或QIAEX II凝膠提取套組(均來自Qiagen)純化DNA片段。

包含編碼DIG-305殺蟲毒素之核苷酸序列的DNA由供應商(例如DNA2.0,Menlo Park,CA)合成且作為選殖片段供應在質體載體中。編碼其他DIG-305毒素之其他DNA序列藉由含有適當核苷酸序列之構築體的標準分子生物學操控來獲得。將編碼經修飾DIG-305片段之DNA片段在適當限制性位點處接合至其他DIG-305殺蟲毒素編碼區片段或其他B.t.(Cry)編碼區片段，以獲得編碼所需全長DIG-305毒素蛋白質之編碼區。

將DIG-305殺蟲毒素之全長或經修飾編碼序列(CDS)在NcoI及SacI限制性位點處次選殖至植物表現質體中。利用例如Gateway^®技術或標準限制酶片段選殖程序，將在植物表現元件(例如植物可表現啟動子、3'端轉錄終止及聚腺苷酸添加決定子及其類似物)之控制下含有適當Cry編碼區的所得植物表現卡匣次選殖至二元載體質體中。舉例而言，若採用Gateway^®技術，則LR Clonase^TM(Invitrogen)可用於將全長及經修飾基因植物表現卡匣重組於二元植物轉型質體中。當質體存在於大腸桿菌及農桿菌細胞中時，二元植物轉型載體包括賦予對抗生素大觀黴素(spectinomycin)之抗性的細菌可選標記基因。二元載體質體亦包括在所需宿主植物中起作用之植物可表現可選標記基 因，亦即編碼對抗生素卡那黴素、新黴素及G418之抗性的轉座子Tn5之胺基醣苷磷酸轉移酶基因(aphII)。

製備根癌農桿菌菌株Z707S(Z707之鏈黴素抗性衍生物；Hepburn等人，1985)之電勝任細胞且使用電穿孔轉型(Weigel及Glazebrook,2002)。在電穿孔之後，將1mL YEP培養液(gm/L：酵母提取物，10；蛋白腖，10；NaCl，5)添加至光析槽中，且將細胞-YEP懸浮液轉移至15mL培養管以便在28℃下水浴中在恆定攪拌下培育4小時。將細胞塗覆在具有大觀黴素(200μg/mL)及鏈黴素(250μg/mL)之YEP加瓊脂(25gm/L)上且將培養盤在28℃下培育2-4天。選擇充分分離之單個菌落且於具有大觀黴素及鏈黴素之新鮮YEP+瓊脂培養盤上劃線，並在28℃下培育1-3天。

藉由使用載體特異性引子與由經選擇之農桿菌菌落製備之模板質體DNA的PCR分析證實二元植物轉型載體中存在DIG-305殺蟲毒素基因插入物。使用Qiagen Spin Mini Preps按照製造商說明書自如前所述在具有大觀黴素及鏈黴素之YEP中生長之15mL隔夜培養物之4mL等分試樣提取細胞集結粒。包括來自用於農桿菌電穿孔轉型之二元載體的質體DNA作為對照。使用來自Invitrogen之Taq DNA聚合酶，按照製造商說明書在0.5×濃度下完成PCR反應。PCR反應在經程式化處於以下條件之MJ Research Peltier熱循環儀中進行：步驟1)94℃，3分鐘；步驟2)94℃，45秒；步驟3)55℃，30秒；步驟4)72℃，1分鐘每kb預期產物長度；步驟5)29次返回步驟2；步驟6)72℃，10分鐘。反 應在循環之後維持在4℃下。擴增產物藉由瓊脂糖凝膠電泳(例如0.7%至1%瓊脂糖，w/v)分析且藉由溴化乙錠染色目測。選擇PCR產物與質體對照一致的菌落。

藉由限制性消化物指紋圖譜定位藉由農桿菌操控之技術人員熟知的標準分子生物學方法由候選農桿菌分離株製備之質體DNA來證實另一二元植物轉型載體含有DIG-305殺蟲毒素基因插入物。

實例8

在雙子葉植物中產生DIG-305殺蟲毒素

芥菜(Arabidopsis)轉型擬南芥(Arabidopsis thaliana)Col-01使用浸花法轉型(Weigel及Glazebrook,2002)。使用經選擇之農桿菌菌落接種1mL至15mL含有用於選擇之適當抗生素之YEP培養液的培養物。培養物在28℃下在220rpm恆定攪拌下培育隔夜。使用每一培養物接種兩份500mL含有用於選擇之適當抗生素之YEP培養液的培養物，且新培養物在28℃下在恆定攪拌下培育隔夜。細胞在室溫下在大致8700×g下集結10分鐘，且棄去所得清液層。將細胞集結粒溫和地再懸浮於500mL滲透培養基中，該培養基含有1/2×穆拉希吉及斯庫克鹽(Murashige and Skoog salt)(Sigma-Aldrich)/甘博格(Gamborg)氏B5維生素(Gold BioTechnology,St.Louis,MO)、10%(w/v)蔗糖、0.044μM苯甲基胺基嘌呤(10μL/L於DMSO中之1mg/mL儲備液)及300μL/L Silwet L-77。將大致1月齡之植物浸入培養基中15秒，小心確保淹沒最新的花序。接著，將植物側放且覆 蓋(透明或不透明)24小時，用水洗滌並豎放。植物在22℃下在16小時亮/8小時暗之光週期下生長。在浸漬之後大致4週，收穫種子。

芥菜生長及選擇使新鮮收穫之T1種子在乾燥劑存在下在室溫下乾燥至少7天。將種子懸浮於0.1%瓊脂/水(Sigma-Aldrich)溶液中且隨後在4℃下分層2天。為準備種植，將10.5吋×21吋發芽托盤(T.O.Plastics Inc.,Clearwater,MN)中之Sunshine Mix LP5(Sun Gro Horticulture Inc.,Bellevue,WA)用細蛭石覆蓋，用霍格蘭(Hoagland)氏溶液(Hoagland及Arnon,1950)地下灌溉直至濕潤為止，接著允許排水24小時。將分層種子播種於蛭石上且用濕蓋(KORD Products,Bramalea,Ontario,Canada)覆蓋7天。種子發芽且植物在Conviron^TM生長箱(型號CMP4030或CMP3244；Controlled Environments Limited,Winnipeg,Manitoba,Canada)中在長日照條件(16小時亮/8小時暗)下在120-150μmol/m²sec之光強度下在恆定溫度(22℃)及濕度(40-50%)下生長。植物起初用霍格蘭氏溶液澆水且隨後用去離子水澆水，以保持土壤潮濕但不濕。

播種後5-6天移除蓋且向植物噴灑化學選擇劑以殺死由未轉型種子發芽之植物。舉例而言，若由二元植物轉型載體提供之植物可表現之可選標記基因為pat或bar基因(Wehrmann等人，1996)，則經轉型植物可藉由噴灑Finale(5.78%草銨膦銨，Farnam Companies Inc.,Phoenix,AZ.)之1000×溶液來選擇。間隔5-7天進行兩次後續噴灑。在最終 噴灑之後的7-10天鑑別存活者(有效生長的植物)且移栽至用Sunshine Mix LP5準備之盆中。移栽植物用濕蓋覆蓋3-4天且置於在上文提及之生長條件下之Conviron^TM生長箱中。

雙子葉植物轉型之技術人員應理解，當使用其他植物可表現之可選標記基因(例如耐除草劑基因)時，可用其他選擇轉型植物之方法。

轉殖基因芥菜之昆蟲生物分析 表現DIG-305殺蟲毒素蛋白質之轉殖基因芥菜植株在人工飼料覆蓋分析中證實具有針對敏感昆蟲物種之活性。自轉殖基因及非轉殖基因芥菜植株提取之蛋白質藉由適當方法定量且調節樣品體積以使蛋白質濃度歸一化。在如上所述之人工飼料上進行生物分析。在作為背景檢查處理之分析中包括非轉殖基因芥菜及/或緩衝液及水。

實例9

用於生成超二元載體之農桿菌轉型

農桿菌超二元系統方便地用於單子葉植物宿主之轉型。用於構築及驗證超二元載體之方法為沿用已久的。參見例如歐洲專利第EP604662B1號及美國專利第7060876號。使用標準分子生物學及微生物學方法生成超二元質體。使用如上文關於二元載體所述之方法進行超二元質體結構之核對/驗證。

實例10

在單子葉植物中產生DIG-305殺蟲毒素

農桿菌介導之玉米轉型 將來自Hi-II F₁雜交之 種子(Armstrong等人，1991)種植於含有95%Metro-Mix 360無土生長培養基(Sun Gro Horticulture,Bellevue,WA)及5%黏土/壤土之混合物的5加侖盆中。植物在使用高壓鈉燈及金屬鹵化物燈之組合及16：8小時亮：暗光週期之溫室中生長。為獲得未成熟F₂胚用於轉型，進行受控近緣授粉。在授粉後8-10天分離未成熟的胚，此時胚的大小為大致1.0至2.0mm。

感染及共培養 玉米穗藉由用液體皂擦洗，浸沒在70%乙醇中2分鐘且接著浸沒在20%市售漂白劑(0.1%次氯酸鈉)中30分鐘，隨後用無菌水沖洗來進行表面滅菌。含有超二元載體之懸浮農桿菌細胞藉由將在含有100mg/L大觀黴素、10mg/L四環素及250mg/L鏈黴素之YEP固體培養基上在28℃下生長2-3天之1-2環細菌轉移至5mL含有100μM乙醯丁香酮之液體感染培養基(LS基本培養基(Linsmaier及Skoog,1965)、N6維生素(Chu等人，1975)、1.5mg/L 2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、68.5gm/L蔗糖、36.0gm/L葡萄糖、6mML-脯胺酸pH 5.2)中來製備。使溶液渦旋直至獲得均一懸浮液為止，且使用具有紫色濾光片之Klett-Summerson色度計將濃度調節至200Klett單位之最終密度，或在600nm下量測之等效光學密度(OD₆₀₀)。將未成熟的胚直接分離至含有2mL感染培養基之微量離心管中。移除培養基且置換成1mL具有200Klett單位或等效OD₆₀₀之密度的農桿菌溶液，且農桿菌及胚溶液在室溫下培育5分鐘且隨後轉移至共培養培養基(LS基本培養基、N6維生素、 1.5mg/L 2,4-D、30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯胺酸、0.85mg/L AgNO₃、100μM乙醯丁香酮、3.0gm/L結冷膠(PhytoTechnology Laboratories.,Lenexa,KS)，pH 5.8)中，在25℃下在暗條件下培育5天。

在共培養之後，將胚轉移至選擇性培養基，之後經大致8週之過程獲得經轉型分離株。為選擇經含有植物可表現之pat或bar可選標記基因之超二元質體轉型之玉米組織，將基於LS之培養基(LS基本培養基、N6維生素、1.5mg/L 2,4-D、0.5gm/L MES(2-(N-嗎啉基)乙磺酸單水合物；PhytoTechnologies Labr.)、30.0gm/L蔗糖、6mM L-脯胺酸、1.0mg/L AgNO₃、250mg/L頭孢噻肟(cefotaxime)、2.5gm/L結冷膠，pH 5.7)與畢拉草(Gold BioTechnology)一起使用。將胚轉移至含有3mg/L畢拉草之選擇培養基，直至獲得胚性分離株為止。回收的分離株藉由間隔2週轉移至新鮮選擇培養基而擴大，以便用於再生及進一步分析。

玉米轉型之技術人員應理解，當使用其他植物可表現之可選標記基因(例如耐除草劑基因)時，可用其他選擇轉型植物之方法。

再生及種子產生 為了再生，將培養物轉移至「28」誘導培養基(MS鹽及維生素，30gm/L蔗糖、5mg/L苯甲基胺基嘌呤、0.25mg/L 2,4-D、3mg/L畢拉草、250mg/L頭孢噻肟、2.5gm/L結冷膠，pH 5.7)，在低光照條件(14μEm^-2s^-1)下1週，接著在高光照條件(大致89μEm^-2s^-1)下1週。組織隨後轉移至「36」再生培養基(除缺少植物生長 調節劑之外，與誘導培養基相同)。當小植株生長至3-5cm長時，將其轉移至含有SHGA培養基(Schenk及Hildebrandt(1972)鹽及維生素)；PhytoTechnologies Labr.)、1.0gm/L肌醇、10gm/L蔗糖及2.0gm/L結冷膠，pH 5.8)之玻璃培養管，以允許芽及根進一步生長及發育。將植物移栽至與本文先前所述相同的土壤混合物且在溫室中生長至開花。為產生種子進行受控授粉。

實例11

轉殖基因玉米之生物分析

藉由習知生物分析方法(參見例如Huang等人，2006)證實在植物細胞中產生之DIG-305殺蟲毒素的生物活性。吾人能夠例如藉由在受控飼喂環境中給目標昆蟲飼喂來源於產生DIG-305殺蟲毒素之植物的各種植物組織或組織碎片來證明功效。或者，可自來源於產生DIG-305殺蟲毒素之植物的各種植物組織製備蛋白質提取物且將提取的蛋白質併入如本文先前所述之人工飼料生物分析中。應理解，此類飼喂分析之結果有待與採用來自不產生DIG-305殺蟲毒素之宿主植物的適當對照組織類似進行的生物分析或其他對照樣品相比。

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<110> 陶氏農業科學公司

<120> DIG-305殺蟲CRY毒素

<130> 76821

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 3726

<212> DNA

<213> 蘇力菌

<400> 1

<210> 2

<211> 1241

<212> PRT

<213> 蘇力菌

<400> 2

<210> 3

<211> 3723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 玉米最佳化

<400> 3

Claims (20)

1. 一種經分離、處理或調配之DIG-305殺蟲毒素多肽，其包含一包括選自由以下組成之群之胺基酸序列的核心毒素區段：(a)SEQ ID NO：2之殘基2至685；(b)與SEQ ID NO：2之殘基2至685的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的序列；及(c)具有至多20個並未不利影響由SEQ ID NO：2編碼之毒素的表現或活性的胺基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO：2之殘基2至685；或其殺蟲活性片段。
2. 如請求項1之經分離、處理或調配之多肽，其包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
3. 如請求項1之經分離、處理或調配之多肽，其中該核心毒素區段連接至除DIG-305以外之Cry毒素的C端原毒素部分。
4. 如請求項3之經分離、處理或調配之多肽，其中該多肽為嵌合蛋白質且該C端原毒素部分包含cry1Ab或cry1Ac/cry1Ab嵌合毒素之C端原毒素部分。
5. 如請求項4之經分離、處理或調配之多肽，其中該C端原毒素部分包含Cry1Ab之C端原毒素部分。
6. 如請求項5之經分離、處理或調配之多肽，其中該C端原毒素部分包含cry1Ac/cry1Ab嵌合毒素之C端原毒素部 分。
7. 一種用於控制害蟲群體之方法，其包含使該群體與殺害蟲有效量之如請求項1至6中任一項之多肽接觸。
8. 如請求項1至6中任一項之多肽，其具有針對鞘翅目害蟲之活性。
9. 如請求項1至6中任一項之多肽，其具有針對玉米根蟲之活性。
10. 一種組成物，其包含如請求項1至6中任一項之多肽。
11. 如請求項10之組成物，其中該組成物為包含經調配DIG-305殺蟲毒素之可噴塗蛋白質組成物、囊封的蛋白質組成物或誘鉺基質。
12. 一種核酸構築體，其中該構築體包含一以重組方式連接至編碼DIG-305殺蟲毒素之序列的異源核酸序列，該DIG-305殺蟲毒素包含一包括選自由以下組成之群之胺基酸序列的核心毒素區段：(a)SEQ ID NO：2之殘基2至685；(b)與SEQ ID NO：2之殘基2至685的胺基酸序列具有至少90%序列一致性的序列；及(c)具有至多20個並未不利影響由SEQ ID NO：2編碼之毒素的表現或活性的胺基酸取代、缺失或修飾的SEQ ID NO：2之殘基2至685；或其殺蟲活性片段。
13. 如請求項12之核酸構築體，其中該異源核酸序列為一能夠推動在植物中表現之啟動子序列。
14. 如請求項13之核酸構築體，其中該編碼多肽之序列是經密碼子最佳化以便在植物中表現。
15. 如請求項14之核酸構築體，其中該啟動子能夠推動在玉米中表現且該編碼多肽之序列是經密碼子最佳化以便在玉米中表現。
16. 如請求項12至15中任一項之核酸構築體，其中該編碼多肽之序列包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：7。
17. 如請求項16之核酸構築體，其中該構築體為載體且該載體包含SEQ ID NO：3。
18. 如請求項14之核酸構築體，其中該啟動子能夠推動在馬鈴薯中表現且該編碼多肽之序列是經密碼子最佳化以便在馬鈴薯中表現。
19. 一種轉殖基因植物，其包含穩定併入至其基因體中之如請求項中12至18中任一項之核酸構築體。
20. 一種用於保護植物免遭害蟲之方法，其包含將如請求項12至18中任一項之構築體引入至該植物中。