BRPI0905675A2 - aparelho detector condutométrico sem contato para biossensores microfluìdicos - Google Patents

Abstract

<B>APARELHO DETECTOR CONDUTOMéTRICO SEM CONTATO PARA BIOSSENSORES MICROFLUìDICOS.<D> Aparelho detector condutométrico sem contato para biossensores microfluídicos que compreende um substrato de vidro contendo três eletrodos metálicos gravados sobre uma película de fotorresiste, os eletrodos metálicos tendo uma camada inferior e uma camada superior de metal facilitador de aderência ao substrato de vidro e à camada dielétrica, respectivamente; uma camada dielétrica depositada sobre os eletrodos, a camada dielétrica de um eletrodo sendo modificada quimicamente de modo a imobilizar moléculas de biotina em sua superfície; e uma camada de material elastoméríco contendo microcanais para manuseio de fluído selada irreversívelmente sobre o substrato e conectores colocados sobre o substrato de vidro.

Description

APARELHO DETECTOR CONDUTOMÉTRICO SEM CONTATO PARABIOSSENSORES MICROFLUÍDICOS

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere a um aparelho de detecçãopor detector condutoraétrico sem contato para medir interaçõesmoleculares entre receptores e ligantes. A presente invençãose aplica ao monitoramento de ensaios de ligação entrebiomoléculas e, dependendo do tipo de interaçõesbiomoleculares, pode ser utilizada para diagnósticosclínicos, como no monitoramento de níveis de glicose, ácidoúrico, proteínas, ou outras aplicações biomédicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A área de pesquisa referente aos microssistemas deanálises totais (micro total analysis systems, pTAS), tambémdenominados lab-on-a-chip ou, simplesmente, microssistemasanalíticos foi implementada na década de 1990 e, atualmente,é uma tendência da Química Analítica Moderna. Desde o inícioda miniaturização, várias técnicas desenvolvidas em umlaboratório químico puderam ser implementadas emmicrossistemas. Além de técnicas de separação, comoeletroforese e cromatografia, métodos de pré-tratamento(incluindo extração, purificação, diluição, reação dederivação) da amostra e sistemas de detecção podem seradaptados e integrados aos canais de injeção e separação,oferecendo vantagens relacionadas à redução do consumo deamostra e do tempo total de análise, conferindo aindaportabilidade e automação aos microssistemas.

De um modo geral, os dispositivos analíticos vêm sendoutilizados para solucionar uma ampla variedade de problemasanalíticos e bioanalíticos. Dentre os processos de pré-tratamento da amostra em microdispositivos, podem-se destacara extração em fase sólida, purificação, pré-concentração,mistura de soluções, e reações enzimáticas como digestão deproteínas ou síntese de DNA como na reação em cadeia dapolimerase (PCR).

Com o avanço na área de microf luídica e a redução dovolume de amostra, o interesse em desenvolver ou adaptarsistemas de detecção para micro-escala tornou-se bastanterelevante. Vários métodos de detecção podem ser adaptadospara sistemas miniaturizados. Dentre eles pode-se mencionar aespectrometria de massas (MS, mass spectrometry), afluorescência induzida a laser (LIF, laser-inducedfluorescence), e os modos de detecção eletroquímica, como aamperometria e a condutometria.

Dentre as modalidades eletroquímicas, a detecçãoamperométrica é a técnica eletroquímica mais explorada emmicrossistemas. Com o uso destes detectores, muitos compostospodem ser detectados sem derivatização (modificação químicade sua estrutura) e com seletividade e sensibilidade, emalguns casos, comparáveis com a detecção por LIF. No entanto,o posicionamento do eletrodo de trabalho em relação aomicrocanal (dentro, na saída ou fora do canal) é crítico,pois o potencial aplicado ao eletrodo de trabalho pode serinfluenciado significativamente pela presença de um campoelétrico externo, como acontece nos microssistemas deeletroforese. Para a detecção amperométrica, os eletrodospodem ser fabricados na mesma plataforma ou em um dispositivoexterno ao microssistema.

Para a detecção condutométrica, os eletrodos sãonecessariamente fabricados e integrados na mesma plataformaque os microcanais. Ao contrário da detecção amperométrica, acondutometria é considerada um método de detecção universal esua resposta independe da composição metálica do material doeletrodo. No entanto, os eletrodos podem estar em contatodireto ou isolados fisicamente do canal microfluídico.

Em ambos os casos (amperométricos e condutométricos), aintegração dos eletrodos nos microssistemas requer cuidadospara evitar a danificação das estruturas. Em outras palavras,a integração deve ser feita de modo que a selagem não fiquecomprometida e em temperaturas que não provoquem a degradaçãodo material metálico.

Atualmente, um dos maiores desafios na era pós-genômicaé a busca por uma completa descrição das interações entremoléculas biológicas, ou biomoléculas.

O termo "interações biomoleculares" está associado àligação, interação ou associação entre biomoléculas, as quaisconduzem a maioria dos processos naturais, como a transmissãode sinais nervosos, transcrições de genes e atividadesenzimáticas. O estudo de interações biomoleculares temcontribuído para a revolução terapêutica, permitindo odesenvolvimento de vacinas e novos fármacos para o tratamentode doenças humanas. O avanço na descoberta destes novoscompostos é resultado do melhor entendimento da interaçãoentre um ligante e um receptor.

Sendo assim, a caracterização de interaçõesbiomoleculares é essencial para um entendimento básico deprocessos biológicos e na descoberta de novos fármacos. Paratal finalidade, o desenvolvimento de métodos simples eadequados para análise de interações biomoleculares (ΒΙΑ,biomolecular interaction analysis) é o foco de muitos gruposde pesquisa. Independentemente do método de detecçãoempregado para monitorar uma ΒΙΑ, é necessário notar que ainteração biomolecular ocorre entre um ligante (ou analito,em caso de estudos analíticos), introduzido em fluxo, com umreceptor (ou alvo, em casos exploratórios) imobilizado nasuperfície de um transdutor.

A imobilização de compostos biológicos (proteínas,anticorpos, açúcares, enzimas, ácidos nucléicos, DNA,vitaminas, etc.) confere alta seletividade e especificidadeaos transdutores, os quais podem ser ópticos, piezelétricosou eletroquímicos. Estes transdutores podem ser fabricadossobre a superfície de muitos substratos, incluindo metais,sílica, óxidos, silício, vidro, dentre outros. Devido àcompatibilidade entre as técnicas de deposição de filmesfinos e microfabricação, a obtenção de transdutoreseletroquímicos vem ganhando destaque, uma vez que eletrodospodem ser fabricados em escala miniaturizada e,posteriormente, integrados com canais microfluídicos.A construção destas superfícies funcionalizadas requerum estudo preliminar das estratégias de imobilização dasbiomoléculas, de modo a preservar suas respectivas atividadesbiológicas. A interação do analito com a biomoléculaimobilizada (o sistema oposto também é valido, ou seja, oanalito ou ligante é imobilizado) provoca a alteração dealguma das propriedades físico-químicas da superfície dosensor como, por exemplo, parâmetros eletroquímicos, como acapacitância dos eletrodos, a massa do material eletródico oua temperatura de operação. Desse modo, as informaçõesreferentes ao processo de uma interação biomolecular podemser convertidas em sinais elétricos, os quais sãoamplificados e transportados pelo transdutor. A intensidadedo sinal é, geralmente, proporcional à concentração ou àquantidade de analito na amostra em análise.

Em geral, a imobilização de biomoléculas na superfíciede um substrato pode ser realizada por (i) ligação covalente,(ii) adsorção física ou, ainda (iii) copolimerização dabiomolécula com polímeros. Dos três tipos de imobilização aligação covalente é a mais utilizada por apresentar vantagensreferentes à estabilidade química, térmica e mecânica. Para afuncionalização de uma superfície, é necessário que o suportesólido apresente um grupo funcional que viabilize a formaçãode uma ligação covalente com a biomolécula de interesse. Comomuitos materiais não apresentam essa especificidade, o uso defilmes ou monocamadas contendo grupos reativos específicos éuma alternativa freqüentemente utilizada para afuncionalização com o receptor alvo.

Comercialmente, há várias empresas que desenvolvemequipamentos para a mesma finalidade com conceitos baseadosem princípios de ressonância plasmônica de superfície, ondasacústicas, variação de massa, ou ainda transferência decarga. O problema destes equipamentos é o custo elevado (nafaixa de US$ 200.000,00), o que inviabiliza a implementaçãoampla em laboratórios ou clínicas de análise. Além disso,estes equipamentos requerem o uso de sensores comerciaisdedicados, os quais também apresentam um custo alto (emmédia, U$ 300,00 a unidade).

OBJETO DA INVENÇÃO

Em face ao exposto, existe a necessidade dodesenvolvimento de um aparelho simples, de custo reduzido ede tecnologia nacional, ou seja, acessível para implementaçãoem laboratórios ou clínicas de análise, a fim de monitorarinterações biomoleculares em sistemas microfluídicos.

Assim sendo, a presente invenção traz soluções paraindústrias farmacêuticas, clínicas, centros ou laboratóriosde análises clínicas que necessitam de um sistema simples,robusto e de custo reduzido para desenvolvimento dediagnósticos, ou monitoramento de compostos de importânciabiológica para a saúde humana.

Perante os sistemas comerciais mencionados acima,direcionados para os mesmos propósitos, a presente invençãosupera-os em termos de preço, simplicidade instrumental e decompatibilidade com a miniaturização, fator que permite afabricação de eletrodos metálicos em escala micro e suaintegração com sistemas microfluídicos contendo material deinteresse biológico imobilizado quimicamente na superfície.

Além disso, o sistema desenvolvido apresenta a possibilidadede monitoramento da interação em tempo real, selecionando omanuseio do fluido por ações eletrocinéticas ouhidrodinâmicas.

Com relação ao custo, o equipamento da presente invençãoapresenta um custo final de aproximadamente R$ 2.000,00 e ossensores podem ser fabricados por um valor em torno de R$10,00 no máximo, com base no segundo semestre de 2008.

O aparelho proposto na presente invenção apresentaalgumas vantagens relacionadas não só ao custo instrumental,mas também ã simplicidade e a flexibilidade do sistemaoperacional. O fluxo, por exemplo, pode ser manuseado pelaaplicação de pressão ou pela aplicação de potenciaiselétricos. Em ambos os casos, a vazão do fluxo pode sercontrolada com precisão. Em adição, o sinal capturado pelosdois eletrodos pode ser monitorado em tempo real, de modo avisualizar na tela de um computador os eventos que ocorrem naescala micro.

Estes fatores tornam este produto industrializável eestimula sua produção em massa, sendo que os campos deaplicação são ilimitados (infinitos), uma vez que o sistemade detecção é universal.

A portabilidade deste sistema é, ainda, outra vantagempotencialmente aplicável às análises no campo e no point-of-care. O baixo custo sugere também o uso destes biossensoresmicrofluídicos como protótipos descartáveis, fator esseconsiderado essencial para a produção industrial em massa econseqüentemente sua inserção no campo das análises clínicas,médicas, bioanalíticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção tem como objetivo o fornecimento deum aparelho simples, de uso fácil, robusto e de custoreduzido para detectar interações biomoleculares em sistemasmicrofluídicos.

Mais especificamente, a presente invenção tem comoobjetivo o fornecimento de um aparelho detectorcondutométrico sem contato (também denominado detectoroscilométrico) para medir interações analito / ligante. Estetipo de aparelho detector condutométrico pode ser utilizadocomo ferramenta para monitorar ensaios de interaçõessimilarmente aos modos eletroquímicos clássicosconvencionais.

Ao contrário dos métodos eletroquímicos amperométricos /voltamétricos convencionais, na detecção oscilométrica não hátransferência de elétrons resultante de uma reação óxido-redução. Este diferencial é fundamental para preservar aintegridade da biomolécula e, com isso, preservar suaatividade e função biológica.

A presente invenção compreende um aparelho detectorcondutométrico sem contato para microssistemas analíticocontendo microcanais, eletrodos para detecção, camadadielétrica e biomolécula imobilizada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

O Anexo (A) e (B) mostra o aparelho detector fabricadoseguindo o procedimento descrito nas Figuras 1, 2 e 3.

A Figura 1 representa a configuração de eletrodos/microcanais do aparelho detector oscilométrico da presenteinvenção.

A Figura 2 mostra um fluxograma representativo doprocedimento de fabricação do conjunto substrato/eletrodosaplicado no aparelho da presente invenção.

A Figura 3 mostra um fluxograma representativo doprocedimento de fabricação dos microcanais do aparelho dapresente invenção.

A Figura 4 representa um sistema de PECVD usado paradeposição de materiais dielétricos nos eletrodos da presenteinvenção.

A Figura 5 é uma representação genérica do mecanismo desilanização empregado nos eletrodos do aparelho da presenteinvenção.

A Figura 6 representa o processo de imobilização químicado receptor ou biomolécula com auxílio da radiaçãoultravioleta.

A Figura 7 é uma representação genérica dainstrumentação desenvolvida para um experimento usando oaparelho detector da presente invenção.

A Figura 8 mostra a interface gráfica do software decontrole e aquisição de dados do aparelho BIA-C4D.

A Figura 9 apresenta micrografias dos eletrodos doaparelho detector da presente invenção e detalhes inerentesao processo de microfabricação e modificação química domesmo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

A presente invenção será agora descrita com relação aosdesenhos em anexo que se destinam a ilustrar a presenteinvenção e não limitar a mesma à configuração ilustrada.

A Figura 1 representa a configuração doseletrodos/microcanais do aparelho detector oscilométrico dapresente invenção. A Figura 1(a) é uma representação dageometria dos eletrodos para detecção dupla (eO é o eletrodode excitação, el é o eletrodo de referência e e2 é o detectorseletivo do sistema biomolecular), as Figuras 1(b) e 1(c) sãorepresentações dos formatos possíveis dos microcanais (MC).

Na Figura 1(a), o eletrodo de excitação da cela de detecçãoestá indicado por eO, enquanto os dois eletrodos receptoresestão representados por el e e2. Os círculos brancos naextremidade dos eletrodos indicam o local para fixação dosconectores elétricos. Nessa configuração inovadora dedetecção dupla, a corrente gerada pela excitação promovidapelo eletrodo eO é medida em dois sistemas idênticos, onde oseletrodos el e e2 são responsáveis por medir essas variações.

Com base no que está sendo proposto nesta patente, um doseletrodos receptores (el, por exemplo) mede a correntereferente às variações de condutividade do meio, ou seja, dasolução que passa no microcanal. Já o outro eletrodo (e2)contém uma modificação química em sua superfície e, destemodo, a resposta analítica é resultado não somente davariação de condutividade no interior do canal> mas também dainteração entre o ligante imobilizado na superfície com oanalito introduzido em solução. Neste caso, a resposta obtidano eletrodo el, chamado aqui de eletrodo de referência oueletrodo de controle, pode ser subtraída da resposta obtidano eletrodo e2, obtendo-se assim uma resposta específica apósa subtração dos sinais. Na Figura 1 (b), os números 1 e 2indicam os reservatórios para entrada e saída de soluções,respectivamente. Já na Figura l(c), os números 1, 2 e 3indicam os reservatórios para entrada de solução tampão,solução de amostra e descarte, respectivamente. Nestaconfiguração, as soluções de tampão e de amostra (contendo oanalito que terá interação com o ligante imobilizado naregião do eletrodo e2) são introduzidas pelos pontos 1 e 2,respectivamente, com auxílio de uma bomba peristáltica, oubombas seringas. Em ambos os casos, o fluido introduzido édirecionado para a região dos eletrodos com auxílio deválvulas solenóides. A solução que passa pelos eletrodos éentão eliminada dos microcanais pelo reservatório 3, ou seja,reservatório de descarte da amostra. Em todos osreservatórios a introdução e a eliminação do fluido éauxiliada por tubos de silicone os quais permitem o acesso aointerior dos microcanais.

A plataforma microfluídica do aparelho detector dapresente invenção é composta de PDMS/vidro e foi a escolhidapara as aplicações biomoleculares. A plataforma de PDMS/vidrofoi escolhida devido a sua robustez e facilidade de replicarmicrossistemas em larga escala em um tempo de fabricaçãorelativamente curto. A moldagem dos canais em PDMS, porexemplo, pode ser completada em um intervalo de tempo de 2 h.

O substrato de vidro foi escolhido para fabricar os eletrodose garantir uma resistência mecânica após a integração dosmicrocanais. No entanto, muitas outras plataformas podem serempregadas para a mesma finalidade, como vidro,poli(carbonato), poli(etileno), poliimida, poliéster, dentreoutras. Especificamente para esta finalidade de aplicaçõesbiomoleculares, os microcanais foram confeccionados em PDMS eos eletrodos para C4D foram fabricados em substratos devidro, usando processo fotolitográfico e deposição metálicapor sputtering.

A Figura 2 apresenta um fluxograma representativo dasetapas de fabricação dos eletrodos microfabricados para C4D(detecção condutométrica sem contato capacitivamenteacoplada) aplicados no aparelho da presente invenção.

Os eletrodos do aparelho da presente invenção sãofabricados por um processo fotolitográfico combinado com umaetapa de deposição metálica por sputtering, como representadona Figura 2. Inicialmente, a superfície de um substrato devidro SV (etapa I) é revestida com uma camada (etapa II) defotorresiste positivo (FRP) (Shipley 1811 - S1811) usando atécnica de spin-coating TSC. A camada deste FRP é espalhadasobre a superfície do substrato de vidro a uma velocidade de4000 rpm durante 30 s. A espessura desta camada é deaproximadamente 0,80 μm. O FRP S1811 foi escolhido porapresentar capacidade de formar filmes finos uniformes etambém por apresentar certa facilidade na remoção comsolventes orgânicos. Essas características não impedem queoutros fotorresistes sejam usados, desde que taispropriedades corroborem com o processo de microfabricação.

Após o referido revestimento, uma máscara M (impressa emfotolito de maneira convencional via serviços especializadoou localmente em transparência de poliéster e impressora alaser comum) contendo a configuração dos eletrodos éposicionada sobre o substrato. Como é usado FRP, o desenhodos eletrodos é impresso em branco (ou imagem negativa), demodo a permitir a passagem da radiação UV (etapa III) nessaregião. Dessa maneira, a imagem dos eletrodos é gravada napelícula de FRP sob exposição a radiação UV (10 mW cm"2) por20 s (etapa IV) . Após a revelação da geometria dos eletrodos(etapa IV) , em solução reveladora específica para estefotorresiste (AZ developer), os substratos são fixados nacâmara de sputtering SP para deposição do metal (etapa V).

Então, se obtém os eletrodos microfabricados EM após aremoção da camada fotorresiste (técnica conhecida como lift-off LO) usando acetona (etapa VI).

Como mencionado anteriormente, a resposta da C4D éindependente da composição do material do eletrodo. Noentanto, para a integração de eletrodos nos microssistemasbiomoleculares, além da aderência com o substrato de vidro, édesejável que o metal dos eletrodos tenha compatibilidade coma camada dielétrica que reveste os mesmos. Com esses doisrequisitos básicos, optou-se pela deposição de uma camada deAu, usando uma camada de Ti para melhorar a aderência doseletrodos ao substrato. Devido aos problemas de aderênciaentre a camada de Au e a camada dielétrica, outra camada deTi foi depositada sobre a camada de Au. Desse modo, oseletrodos para os ensaios biomoleculares são constituídos deTi/Au/Ti. A qualidade da aderência foi avaliada mediantetestes de resistência mecânica que não são descritos aqui.

A Figura 3 mostra o procedimento de fabricação dosmicrocanais empregados no aparelho da presente invenção. Osmicrocanais são fabricados em PDMS com conectores poliméricos(silicone) para integração com o sistema de bombeamento defluxo para o aparelho.

Tubos de silicone (a) são fixados sobre o molde Mo deSU-8, como indicado na etapa (I) da Figura 3. O SU-8 é umfotorresiste negativo muito utilizado na confecção de moldespara prototipagem. A escolha do SU-8 para construir moldes sedeve a alguns aspectos como alta resistência mecânica,facilidade de fabricar canais com razão de aspecto elevada epossibilidade de replicar/transferir a estruturamicrofluídica gravada no molde para substratos poliméricoscentenas de vezes. Os tubos de silicone são fixadosespecificamente sobre os reservatórios para entrada e saídadas soluções. A fixação é feita com fita dupla-facedisponível comercialmente, mantendo a extremidade inferior dotubo devidamente selada (com a fita). Após a fixação, um pré-polímero (por exemplo, Sylgard 184) é misturado com o agentede cura na proporção de 10:1 e adicionado/despejado sobre omolde (etapa II da Figura 3). Após a etapa de polimerizaçãoPLM (70 °C/l h), os canais são desmoldados cuidadosamente,como indicado na etapa (III) da Figura 3, para manter ostubos de silicone fixados no PDMS.

Após a desmoldagem DM, a superfície do PDMS é oxidada(Figura 3 etapa IV) para converter os grupos SiOCH3 dasuperfície em SiOH. Essa etapa de oxidação é necessária parapromover uma selagem irreversível, ou seja, de altaresistência mecânica, entre a superfície contendo oseletrodos e o sistema microfluídico. A oxidação é realizadadurante 1 min., sob uma potência de 70 W (radiofreqüênciaaplicada ao sistema de plasma) e uma pressão de O2 igual a120 mTorr (16 Pa). Após a oxidação, os microcanais fabricadosem PDMS são colocados em contato com o substrato de vidro SV(ver Figura 1), contendo os eletrodos isolados e modificadosquimicamente (discutidos mais abaixo), obtendo uma selagemirreversível (Figura 3 etapa V) devido à formação de umaligação Si-O-Si. Para simplificação, os eletrodos não estãorepresentados na Figura 3. O processo de isolamento elétricodos eletrodos será descrito em detalhes abaixo.

Para finalizar a fabricação, conectores elétricos sãoadaptados aos microssistemas biomoleculares. Para isso,orifícios são confeccionados no substrato de vidro, na regiãodos contatos elétricos, com uma ferramenta convencionalusando brocas com pontas diamantadas (diâmetro de 1 mm). Osconectores são colados nestes orifícios usando cola condutoraà base de resina epóxi. O Anexo mostra duas fotografias (A) e(B) desses microssistemas fabricados seguindo o processodescrito. As imagens (A) e (B) mostram os detalhes daintegração dos canais em PDMS com a placa de vidro contendoos eletrodos fabricados e isolados com uma camada de SiO2. Osconectores elétricos e os tubos de silicone estãorepresentados por a e b, respectivamente.

De acordo como Anexo os conectores elétricos (a) sãofixados na extremidade dos eletrodos usando cola condutora.Os dispositivos apresentados no Anexo (A) e (B) são exemplosde geometrias no formato de um microcanal simples e formatode Y, respectivamente. Conforme visualizado em Β, odispositivo tem um tamanho aproximado de uma memória flash{flash-drive), mas pode ser reduzido conforme a necessidade.

O isolamento elétrico dos eletrodos é obtido com adeposição de uma camada de SiO2 no substrato S através deprocesso convencional usando um sistema de PECVD (PlasmaEnhanced Chemical Vapor Deposition) modelo PlasmaSystem(VacuTec) esquematicamente representado na Figura 4. Demaneira bem simplificada, o referido processo consiste emintroduzir uma mistura gasosa constituída de óxido nitroso esilana (SiH4 + N20) no reator. O plasma gerado a partir deuma radiofreqüência RF com potência de 20 W promove adissociação, a ionização e a excitação dos reagentes noreator. A presença de N2 tem a função de limpar a câmarareacional durante o plasma. Em outras palavras, quando osgases são inseridos no reator, há a formação dos radicais Si.e O., a partir da dissociação da silana e do óxido nitroso,respectivamente, os quais se combinam originando o óxido desilício.

Como exemplo, a camada dielétrica depositada como acimaé modificada quimicamente de modo a imobilizar moléculas debiotina em sua superfície. O processo de imobilização dabiotina, usando reagentes com grupos fotossensíveis, é bemconhecido e já foi utilizado para caracterização de outrostipos de sensores, como os sensores ópticos e também ossensores baseados em medidas de impedância eletroquímica. Poresse motivo, este sistema modelo foi utilizado para avaliar apotencialidade da presente invenção. Para esta finalidade, areferida camada dielétrica é primeiramente modificada comAPTES (aminopropil-trietoxi-silano). Em seguida, as moléculasde biotina, contendo grupos fotossensíveis em sua estrutura,são imobilizadas covalentemente com radiação UV. Ambos osprocedimentos utilizados são descritos a seguir.

Silanização

Os substratos contendo os eletrodos isolados com umacamada de SiO2 são previamente submetidos a uma limpezausando uma solução piranha (H2SO4IH2O2, 3:1 (v:v) ) durante 3 0min. Após a limpeza, os substratos são lavados com águadesionizada, etanol e, em seguida, secos com N2.

Para silanização, uma solução de APTES (aminopropil-trietoxi-silano) , em uma concentração de 3% (v/v), épreparada em um frasco volumétrico de 10 mL com diluição de300 μl; de APTES em etanol. Em seguida, os substratosrecobertos com uma camada de 50 nm de SiO2 são imersos nasolução de APTES e mantidos durante 3 h. A concentração e otempo de sinalização podem ser ainda otimizados, visando àobtenção de uma superfície com maior área de recobrimentoapós a modificação química. Após a remoção dos substratos dasolução de aminossilano, os mesmos são lavados com etanolabsoluto para remover as moléculas adsorvidas (não ligadascovalentemente) à superfície dielétrica. Em seguida, ossubstratos são lavados extensivamente com água desionizada e,finalmente, secos com N2. A Figura 6 apresenta um esquema dareação de silanização e formação de monocamadas de APTESsobre a superfície dielétrica.

Imobilização de biotina

Após a silanização, a superfície contendo grupos -NH2 éfuncionalizada com moléculas de biotina com auxílio deradiação UV, conforme ilustrado na Figura 6. Inicialmente, osubstrato contendo os eletrodos isolados EI (e com camadadielétrica silanizada) (etapa I) é revestido com uma camadade FRP (S1811) (etapa II) e em seguida exposto a radiação UVpara gravação da área a ser funcionalizada (etapa III) . Nesseponto, modifica-se a região da camada dielétrica somentesobre o eletrodo e2. Após a etapa de fotogravação (etapaIII) , a região que recebeu radiação é revelada (IV) e umaalíquota (10 μΙΟ de fotobiotina (FB) , preparada em água naconcentração de 0,1 mg/mL, é adicionada sobre essa região. Emseguida, a máscara fotogravada é posicionada sobre osubstrato e submetida à radiação UV por 15 min (etapa V) . Aofinal desta etapa V, a camada de FRP é removida com etanol ea superfície é lavada com água. Após a lavagem, as moléculasde biotina MB ficam imobilizadas na superfície dos eletrodos,como representado na etapa VI da Figura 6. Basicamente,qualquer molécula contendo grupo fotossensível à radiação UVpode ser imobilizada como descrito acima. No entanto, outrósmodelos de imobilização que não requerem radiação UV tambémpodem ser empregados para a mesma finalidade. Dentro destapossibilidade, várias biomoléculas como enzimas, DNA,proteínas, antígenos, anticorpos, aminoácidos, dentre outras,podem ser imobilizadas usando procedimentos químicosenvolvendo interações covalentes ou eletrostáticas.

Após as etapas de silanização e funcionalização dasuperfície dos eletrodos com biotina, os canais do aparelhodetector da presente invenção são integrados ao substratoconforme descrito anteriormente (ver descrição da Figura 3).A imobilização das moléculas de biotina ocorre em função daformação de uma ligação amida entre o grupo -NH2 e acarbonila da uréia presente na estrutura da biotina,disponível comercialmente na forma de um sal de acetato defotobiotina.

A Figura 7 é uma representação genérica dainstrumentação desenvolvida para um experimento de análise deinteração biomolecular por detecção condutométrica semcontato usando um aparelho da presente invenção. Na Figura 8os pontos a, b e c indicam tubos de Tygon utilizados paraconexões entre as bombas seringas e as válvulas solenóide Vle V2, entre as válvulas Vl e V2 e um reservatório paradescarte de soluções b e entre as válvulas Vl e V2 e omicrossistema c. 0 ponto d indica a conexão elétrica entre oseletrodos do microssistema e a interface de aquisição comentradas e saídas analogias/digitais (A/D) edigitais/analógicas (D/A), enquanto o ponto e representa aconexão entre a placa de aquisição e o computador, através decomunicação USB. As válvulas para acionamento dos canais daamostra e do tampão estão representadas por Vl e V2,respectivamente.

Para o experimento conduzido, o fluido foi manuseadoinicialmente com auxílio de uma bomba seringa. Como descritona Figura 3, tubos poliméricos são adaptados aosmicrossistemas de PDMS, durante a etapa de polimerização,facilitando a conexão com os tubos Tygon utilizados nosistema de bombeamento. Neste experimento é utilizada ageometria de canais microfluídicos no formato em Y. Duasválvulas solenóides Vl e V2 são adaptadas ao sistema de modoa automatizar a etapa do transporte de soluções nos canaismicrofluídicos. As válvulas solenóides Vl e V2 sãoalimentadas com 12 V e o circuito eletrônico desenvolvidopara controle de ambas as válvulas não são parte do escopo dapresente invenção. Embora duas válvulas tenham sidoutilizadas, o circuito foi projetado de modo a permitir aimplementação de outras duas válvulas, totalizando quatro.Embora uma geometria no formato de Y tenha sido utilizadapara demonstrar a potencialidade do sistema desenvolvido,geometrias contendo um simples canal ou ainda contendomúltiplos canais em paralelo podem ser utilizadas para omesmo protótipo, permitindo inclusive explorar análise deinterações com diferentes analitos simultaneamente.

Como visualizado na Figura 7, um sinal de altafreqüência (centenas de kHz) é aplicado ao eletrodo deexcitação (eO) pelo gerador de funções GF. Em conseqüênciadesta excitação, um fluxo de corrente é gerado podendo serregistrado nos eletrodos receptores (el e e2) . O transportedo fluido é induzido, inicialmente, por uma bomba seringa BSusando duas válvulas solenóides (VI e V2). A conexão entre abomba seringa BS e as válvulas Vl e V2, válvulas Vl e V2 ereservatório para descarte, e válvulas Vl e V2 emicrossistema BIA-C4D estão indicadas pelos pontos a, b e c,respectivamente. O descarte é representado por D. Estasconexões são realizadas com auxílio de tubos de Tygon°, comdiâmetro de 0,1 mm.

O sinal resultante é registrado pelos eletrodosreceptores (el e e2) , enviado via d para a interfaceanalógica/digital A/D e daí via e para o módulo de aquisiçãode dados MAD e monitorado, em tempo real, na tela principaldo software de aquisição, cuja tela principal estáapresentada em detalhes na Figura 8. Como visualizado, otempo de cada etapa envolvida (introdução da amostra ou dotampão) pode ser controlado pela interface gráficadisponibilizada no programa. 0 acionamento dos canais podeser monitorado em tempo real pela indicação do LED (LightEmitting Diode) na interface. Mesmo com a implementação dosistema de bombeamento hidrodinâmico, o uso de potenciaiselétricos (controle eletrocinético) pode ser,alternativamente, empregado para a mesma finalidade.

A Figura 9 apresenta micrografias ópticas mostrando em(A) a geometria dos eletrodos do aparelho detectoroscilométrico da presente invenção e a região delimitadasobre a superfície do SiO2 para modificação química commagnificação de 25 χ em (B) e 100 χ em (C), respectivamente.

A geometria ideal para o aparelho detector de detecçãodupla da presente invenção é composta por três eletrodos,sendo um responsável pela excitação da cela (eO) e os outrosdois (el e e2) pelo registro do sinal resultante. Nestaconfiguração de eletrodos, o primeiro eletrodo receptor (el)é usado para fazer a leitura de referência (ou de controle) eo segundo eletrodo receptor (e2) é usado para registrar osinal das interações específicas. Dessa forma, o eletrodo eldará uma resposta referente ao fluxo que estiver passandopelo detector, incluindo a condutividade do eletrólito etambém do analito de interesse, no exemplo, a avidina. Umalinha de base constante não é esperada, pois a condut ividadeda solução de avidina poderá promover um deslocamento nosinal. Já o eletrodo e2 dará uma resposta global, incluindo aresposta do fluxo mais o sinal relacionado com a interaçãobiomolecular específica entre o ligante e o receptor; noexemplo, entre biotina e avidina. Nas imagens da Figura" IO(B)e 10(C) é possível observar que apenas a extremidade doeletrodo e2 foi delimitada para modificação.

Para o sistema modelo de interação entre avidina ebiotina, a resposta em função da concentração foi investigadanas concentrações de 5, 10, 20, 30 e 60 μg ml/1. Observou-seque a resposta do detector é linear na faixa entre 5 e 100 μgml/1. O coeficiente de correlação para estes dados foi iguala 0,9857. O limite de detecção para a interação entreavidina-biot ina foi igual a 5 μg ml/1' Estes valores (dolimite de detecção) podem ser melhorados em função do aumentoda área de cobertura da superfície modificada.

Claims (17)

1. Aparelho detector condutométrico sem contato parabiossensores microfluidicos, caracterizado pelo fato decompreender:um substrato de vidro contendo três eletrodos metálicosgravados sobre uma película de fotorresiste, os eletrodosmetálicos tendo uma camada inferior e uma camada superior demetal facilitador de aderência ao substrato de vidro e àcamada dielétrica, respectivamente;uma camada dielétrica depositada sobre os eletrodos, acamada dielétrica de um eletrodo sendo modificadaquimicamente de modo a imobilizar moléculas em suasuperfície;uma camada de material elastomérico contendo microcanaispara manuseio de fluido e conectores colocada sobre osubstrato de vidro selada irreversivelmente sobre osubstrato.

2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o substrato de vidro pode sersubstituído por outros materiais como PDMS, poliéster,poli(estireno), poli(metilmetacrilato) (PMMA),poli(carbonato), poliimida, poli(uretana) e outros materiaiselastoméricos ou termoplásticos.

3. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato de os três eletrodos metálicos seremum eletrodo de excitação da cela (eO), um eletrodo dereferência (el) e um eletrodo de registro de interaçõesespecíficas (e2).

4. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1, 2 e 3,caracterizado pelo fato de poder acrescentar eletrodosadicionais para detecção múltipla de diferentes ensaiossimultaneamente.

5. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 4,caracterizado pela geometria de detecção incluir mais quetrês eletrodos.

6. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 4,caracterizado pelo fato dos três eletrodos metálicos serem deouro.

7. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 6,caracterizado pelo fato de os eletrodos poderem serconfeccionados com materiais condutores selecionados do grupoque compreende cobre, platina, titânio, alumínio, carbono,níquel e cromo.

8. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato dos três eletrodos metálicos de ouroterem revestimento inferior e superior de Ti.

9. Aparelho, de acordo com a reivindicação 7,caracterizado pelo fato de alternativamente usar uma camadade cromo, promovendo aderência similar àquela obtida com acamada de Ti.

10. Aparelho, de acordo com as reivindicações de 1 a 9,caracterizado pelo fato da camada dielétrica depositada sobreos três eletrodos ser constituída por óxido de silício.

11. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 10,caracterizado pelo fato de usar outras camadas dielétricas,como óxido de titânio ou nitreto de silício.

12. Aparelho, de acordo com a reivindicação 3,caracterizado pelo fato do eletrodo de registro de interaçõesespecíficas (e2) conter uma camada dielétrica modificada combiotina.

13. Aparelho, de acordo com as reivindicações 3 e 12,caracterizado pelo fato do eletrodo de registro de interaçõesespecíficas ser modificado com outras biomoléculas (comoanticorpos, enzimas, açúcares, proteínas, DNA, antígenos,aminoácidos) para aplicações biomédicas.

14. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 13,caracterizado pela geometria de detecção incluir mais quetrês eletrodos.

15. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 14,caracterizado pelo fato dos eletrodos serem fabricados emmicrocanais independentes e paralelos.

16. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 15,para monitorar interações entre biomoléculas baseando-se emmedidas de variações de condutividade na superfície deeletrodos modificados quimicamente.

17. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 16,caracterizado pelo fato dos eletrodos de detecção não estaremem contato direto com a solução, correspondendo assim a umsistema de detecção condutométrica sem contato paramonitoramento de interações biomoleculares.