BRPI0905675B1 - aparelho detector condutométrico sem contato para biossensores microfluídicos - Google Patents

Abstract

<b>aparelho detector condutométrico sem contato para biossensores microfluídicos.<d> aparelho detector condutométrico sem contato para biossensores microfluídicos que compreende um substrato de vidro contendo três eletrodos metálicos gravados sobre uma película de fotorresiste, os eletrodos metálicos tendo uma camada inferior e uma camada superior de metal facilitador de aderência ao substrato de vidro e à camada dielétrica, respectivamente; uma camada dielétrica depositada sobre os eletrodos, a camada dielétrica de um eletrodo sendo modificada quimicamente de modo a imobilizar moléculas de biotina em sua superfície; e uma camada de material elastoméríco contendo microcanais para manuseio de fluído selada irreversívelmente sobre o substrato e conectores colocados sobre o substrato de vidro.

Description

APARELHO DETECTOR CONDUTOMÉTRICO SEM CONTATO PARA BIOSSENSORES MICROFLUÍDICOS

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção se refere a um aparelho de detecção por detector condutométrico sem contato para medir interações moleculares entre receptores e ligantes. A presente invenção se aplica ao monitoramento de ensaios de ligação entre biomoléculas e, dependendo do tipo de interações biomoleculares, pode ser utilizada para diagnósticos clínicos, como no monitoramento de níveis de glicose, ácido úrico, proteínas, ou outras aplicações biomédicas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] A área de pesquisa referente aos microssistemas de análises totais (micro total analysis systems, pTAS), também denominados lab-on-a-chip ou, simplesmente, microssistemas analíticos foi implementada na década de 1990 e, atualmente, é uma tendência da Química Analítica Moderna. Desde o início da miniaturização, várias técnicas desenvolvidas em um laboratório químico puderam ser implementadas em microssistemas. Além de técnicas de separação, como eletroforese e cromatografia, métodos de pré-tratamento (incluindo extração, purificação, diluição, reação de derivação) da amostra e sistemas de detecção podem ser adaptados e integrados aos canais de injeção e separação, oferecendo vantagens relacionadas à redução do consumo de amostra e do tempo total de análise, conferindo ainda portabilidade e automação aos microssistemas.

[003] De um modo geral, os dispositivos analíticos vêm sendo utilizados para solucionar uma ampla variedade de problemas analíticos e bioanalíticos. Dentre os processos de pré-tratamento da amostra em microdispositivos, podem-se destacar a extração em fase sólida, purificação, préconcentração, mistura de soluções, e reações enzimáticas como digestão de proteínas ou síntese de DNA como na reação em cadeia da polimerase (PCR).

[004] Com o avanço na área de microfluídica e a

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2/17 redução do volume de amostra, o interesse em desenvolver ou adaptar sistemas de detecção para micro-escala tornou-se bastante relevante. Vários métodos de detecção podem ser adaptados para sistemas miniaturizados. Dentre eles pode-se mencionar a espectrometria de massas (MS, mass spectrometry), a fluorescência induzida a laser (LIF, laser-induced fluorescence), e os modos de detecção eletroquímica, como a amperometria e a condutometria.

[005] Dentre as modalidades eletroquímicas, a detecção amperométrica é a técnica eletroquímica mais explorada em microssistemas. Com o uso destes detectores, muitos compostos podem ser detectados sem derivatização (modificação química de sua estrutura) e com seletividade e sensibilidade, em alguns casos, comparáveis com a detecção por LIF. No entanto, o posicionamento do eletrodo de trabalho em relação ao microcanal (dentro, na saída ou fora do canal) é crítico, pois o potencial aplicado ao eletrodo de trabalho pode ser influenciado significativamente pela presença de um campo elétrico externo, como acontece nos microssistemas de eletroforese. Para a detecção amperométrica, os eletrodos podem ser fabricados na mesma plataforma ou em um dispositivo externo ao microssistema.

[006] Para a detecção condutométrica, os eletrodos são necessariamente fabricados e integrados na mesma plataforma que os microcanais. Ao contrário da detecção amperométrica, a condutometria é considerada um método de detecção universal e sua resposta independe da composição metálica do material do eletrodo. No entanto, os eletrodos podem estar em contato direto ou isolados fisicamente do canal microfluídico.

[007] Em ambos os casos (amperométricos e condutométricos), a integração dos eletrodos nos microssistemas requer cuidados para evitar a danificação das estruturas. Em outras palavras, a integração deve ser feita de modo que a selagem não fique comprometida e em temperaturas que não provoquem a degradação do material metálico.

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Atualmente, um dos maiores desafios na era pósgenômica é a busca por uma completa descrição das interações entre moléculas biológicas, ou biomoléculas.

[009]

O termo interações biomoleculares está associado à ligação, interação ou associação entre biomoléculas, as quais conduzem a maioria dos processos naturais, como a transmissão de sinais nervosos, transcrições de genes e atividades enzimáticas. O biomoleculares tem contribuído para a estudo de interações revolução terapêutica, permitindo o desenvolvimento de vacinas e novos fármacos para o tratamento de doenças humanas. O avanço na descoberta destes novos compostos é resultado do melhor entendimento da interação entre um ligante e um receptor.

[0010] Sendo assim, a caracterização de interações biomoleculares é essencial para um entendimento básico de processos biológicos e na descoberta de novos fármacos. Para tal finalidade, o desenvolvimento de métodos simples e adequados para análise de interações biomoleculares (BIA, bíomolecular ínteractíon analysís) é o foco de muitos grupos de pesquisa. Independentemente do método de detecção empregado para monitorar uma BIA, é necessário notar que a interação biomolecular ocorre entre um ligante (ou analito, em caso de estudos analíticos), introduzido em fluxo, com um receptor (ou alvo, em casos exploratórios) imobilizado na superfície de um transdutor.

[0011] A imobilização de compostos biológicos (proteínas, anticorpos, açúcares, enzimas, ácidos nucléicos, DNA, vitaminas, etc.) confere alta seletividade e especificidade aos transdutores, os quais podem ser ópticos, piezelétricos ou eletroquímicos. Estes transdutores podem ser fabricados sobre a superfície de muitos substratos, incluindo metais, sílica, óxidos, silício, vidro, dentre outros. Devido à compatibilidade entre as técnicas de deposição de filmes finos e microfabricação, a obtenção de transdutores eletroquímicos vem ganhando destaque, uma vez que eletrodos podem ser fabricados em escala miniaturizada e,

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4/17 posteriormente, integrados com canais microfluídicos.

[0012] A construção destas superfícies funcionalizadas requer um estudo preliminar das estratégias de imobilização das biomoléculas, de modo a preservar suas respectivas atividades biológicas. A interação do analito com a biomolécula imobilizada (o sistema oposto também é valido, ou seja, o analito ou ligante é imobilizado) provoca a alteração de alguma das propriedades físico-químicas da superfície do sensor como, por exemplo, parâmetros eletroquímicos, como a capacitância dos eletrodos, a massa do material eletródico ou a temperatura de operação. Desse modo, as informações referentes ao processo de uma interação biomolecular podem ser convertidas em sinais elétricos, os quais são amplificados e transportados pelo transdutor. A intensidade do sinal é, geralmente, proporcional à concentração ou à quantidade de analito na amostra em análise.

[0013] Em geral, a imobilização de biomoléculas na superfície de um substrato pode ser realizada por (i) ligação covalente, (ii) adsorção física ou, ainda (iii) copolimerização da biomolécula com polímeros. Dos três tipos de imobilização a ligação covalente é a mais utilizada por apresentar vantagens referentes à estabilidade química, térmica e mecânica. Para a funcionalização de uma superfície, é necessário que o suporte sólido apresente um grupo funcional que viabilize a formação de uma ligação covalente com a biomolécula de interesse. Como muitos materiais não apresentam essa especificidade, o uso de filmes ou monocamadas contendo grupos reativos específicos é uma alternativa frequentemente utilizada para a funcionalização com o receptor alvo.

[0014] Comercialmente, há várias empresas que desenvolvem equipamentos para a mesma finalidade com conceitos baseados em princípios de ressonância plasmônica de superfície, ondas acústicas, variação de massa, ou ainda transferência de carga. O problema destes equipamentos é o custo elevado (na faixa de US$ 200.000,00), o que inviabiliza a implementação ampla em laboratórios ou clínicas de análise.

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Além disso, estes equipamentos requerem o uso de sensores comerciais dedicados, os quais também apresentam um custo alto (em média, U$ 300,00 a unidade).

OBJETO DA INVENÇÃO [0015] Em face ao exposto, existe a necessidade do desenvolvimento de um aparelho simples, de custo reduzido e de tecnologia nacional, ou seja, acessível para implementação em laboratórios ou clínicas de análise, a fim de monitorar interações biomoleculares em sistemas microfluídicos.

[0016] Assim sendo, a presente invenção traz soluções para indústrias farmacêuticas, clínicas, centros ou laboratórios de análises clínicas que necessitam de um sistema simples, robusto e de custo reduzido para desenvolvimento de diagnósticos, ou monitoramento de compostos de importância biológica para a saúde humana.

[0017] Perante os sistemas comerciais mencionados acima, direcionados para os mesmos propósitos, a presente invenção supera-os em termos de preço, simplicidade instrumental e de compatibilidade com a miniaturização, fator que permite a fabricação de eletrodos metálicos em escala micro e sua integração com sistemas microfluídicos contendo material de interesse biológico imobilizado quimicamente na superfície. Além disso, o sistema desenvolvido apresenta a possibilidade de monitoramento da interação em tempo real, selecionando o manuseio do fluido por ações eletrocinéticas ou hidrodinâmicas.

[0018] Com relação ao custo, o equipamento da presente invenção apresenta um custo final de aproximadamente R$ 2.000, 00 e os sensores podem ser fabricados por um valor em torno de R$ 10,00 no máximo, com base no segundo semestre de 2008.

[0019] O aparelho proposto na presente invenção apresenta algumas vantagens relacionadas não só ao custo instrumental, mas também à simplicidade e a flexibilidade do sistema operacional. O fluxo, por exemplo, pode ser manuseado pela aplicação de pressão ou pela aplicação de potenciais

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6/17 elétricos. Em ambos os casos, a vazão do fluxo pode ser controlada com precisão. Em adição, o sinal capturado pelos dois eletrodos pode ser monitorado em tempo real, de modo a visualizar na tela de um computador os eventos que ocorrem na escala micro.

[0020] Estes fatores tornam este produto industrializável e estimula sua produção em massa, sendo que os campos de aplicação são ilimitados (infinitos), uma vez que o sistema de detecção é universal.

[0021] A portabilidade deste sistema é, ainda, outra vantagem potencialmente aplicável às análises no campo e no point-of-care. O baixo custo sugere também o uso destes biossensores microfluídicos como protótipos descartáveis, fator esse considerado essencial para a produção industrial em massa e conseqüentemente sua inserção no campo das análises clínicas, médicas, bioanalíticas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0022] A presente invenção tem como objetivo o fornecimento de um aparelho simples, de uso fácil, robusto e de custo reduzido para detectar interações biomoleculares em sistemas microfluídicos.

[0023] Mais especificamente, a presente invenção tem como objetivo o fornecimento de um aparelho detector condutométrico sem contato (também denominado detector oscilométrico) para medir interações analito / ligante. Este tipo de aparelho detector condutométrico pode ser utilizado como ferramenta para monitorar ensaios de interações similarmente aos modos eletroquímicos clássicos convencionais.

[0024] Ao contrário dos métodos eletroquímicos amperométricos / voltamétricos convencionais, na detecção oscilométrica não há transferência de elétrons resultante de uma reação óxido-redução. Este diferencial é fundamental para preservar a integridade da biomolécula e, com isso, preservar sua atividade e função biológica.

[0025] A presente invenção compreende um aparelho detector condutométrico sem contato para microssistemas

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7/17 analítico contendo microcanais, eletrodos para detecção, camada dielétrica e biomolécula imobilizada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0026] O Anexo (A) e (B) mostra o aparelho detector fabricado seguindo o procedimento descrito nas Figuras 1, 2 e 3.

[0027] A Figura 1 representa a configuração de eletrodos/ microcanais do aparelho detector oscilométrico da presente invenção.

[0028] A Figura 2 mostra um fluxograma representativo do procedimento de fabricação do conjunto substrato/eletrodos aplicado no aparelho da presente invenção.

[0029] A Figura 3 mostra um fluxograma representativo do procedimento de fabricação dos microcanais do aparelho da presente invenção.

[0030] A Figura 4 representa um sistema de PECVD usado para deposição de materiais dielétricos nos eletrodos da presente invenção.

[0031] A Figura 5 é uma representação genérica do mecanismo de silanização empregado nos eletrodos do aparelho da presente invenção.

[0032] A Figura 6 representa o processo de imobilização química do receptor ou biomolécula com auxílio da radiação ultravioleta.

[0033]	A	Figura 7 é	uma	representação genérica	da
instrumentação	desenvolvida	para	um	experimento usando	o
aparelho detector	da presente	invenção.
[0034]	A	Figura 8 mostra	a	interface gráfica	do

software de controle e aquisição de dados do aparelho BIA-C⁴D.

[0035] A Figura 9 apresenta micrografias dos eletrodos do aparelho detector da presente invenção e detalhes inerentes ao processo de microfabricação e modificação química do mesmo.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0036] A presente invenção será agora descrita com relação aos desenhos em anexo que se destinam a ilustrar a presente invenção e não limitar a mesma à configuração

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8/17 ilustrada.

[0037] A Figura 1 representa a configuração dos eletrodos/microcanais do aparelho detector oscilométrico da presente invenção. A Figura 1(a) é uma representação da geometria dos eletrodos para detecção dupla (e0 é o eletrodo de excitação, e1 é o eletrodo de referência e e2 é o detector seletivo do sistema biomolecular), as Figuras 1(b) e 1(c) são representações dos formatos possíveis dos microcanais (MC). Na Figura 1(a), o eletrodo de excitação da cela de detecção está indicado por e0, enquanto os dois eletrodos receptores estão representados por e1 e e2. Os círculos brancos na extremidade dos eletrodos indicam o local para fixação dos conectores elétricos. Nessa configuração inovadora de detecção dupla, a corrente gerada pela excitação promovida pelo eletrodo e0 é medida em dois sistemas idênticos, onde os eletrodos e1 e e2 são responsáveis por medir essas variações. Com base no que está sendo proposto nesta patente, um dos eletrodos receptores (e1, por exemplo) mede a corrente referente às variações de condutividade do meio, ou seja, da solução que passa no microcanal. Já o outro eletrodo (e2) contém uma modificação química em sua superfície e, deste modo, a resposta analítica é resultado não somente da variação de condutividade no interior do canal, mas também da interação entre o ligante imobilizado na superfície com o analito introduzido em solução. Neste caso, a resposta obtida no eletrodo e1, chamado aqui de eletrodo de referência ou eletrodo de controle, pode ser subtraída da resposta obtida no eletrodo e2, obtendo-se assim uma resposta específica após a subtração dos sinais. Na Figura 1(b), os números 1 e 2 indicam os reservatórios para entrada e saída de soluções, respectivamente. Já na Figura 1(c), os números 1, 2 e 3 indicam os reservatórios para entrada de solução tampão, solução de amostra e descarte, respectivamente. Nesta configuração, as soluções de tampão e de amostra (contendo o analito que terá interação com o ligante imobilizado na região do eletrodo e2) são introduzidas pelos pontos 1 e 2, respectivamente, com auxílio de uma bomba

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9/17 peristáltica, ou bombas seringas. Em ambos os casos, o fluido introduzido é direcionado para a região dos eletrodos com auxílio de válvulas solenóides. A solução que passa pelos eletrodos é então eliminada dos microcanais pelo reservatório 3, ou seja, reservatório de descarte da amostra. Em todos os reservatórios a introdução e a eliminação do fluido é auxiliada por tubos de silicone os quais permitem o acesso ao interior dos microcanais.

[0038] A plataforma microfluídica do aparelho detector da presente invenção é composta de PDMS/vidro e foi a escolhida para as aplicações biomoleculares. A plataforma de PDMS/vidro foi escolhida devido a sua robustez e facilidade de replicar microssistemas em larga escala em um tempo de fabricação relativamente curto. A moldagem dos canais em PDMS, por exemplo, pode ser completada em um intervalo de tempo de 2 h. O substrato de vidro foi escolhido para fabricar os eletrodos e garantir uma resistência mecânica após a integração dos microcanais. No entanto, muitas outras plataformas podem ser empregadas para a mesma finalidade, como vidro, poli(carbonato), poli(etileno), poliimida, poliéster, dentre outras. Especificamente para esta finalidade de aplicações biomoleculares, os microcanais foram confeccionados em PDMS e os eletrodos para C⁴D foram fabricados em substratos de vidro, usando processo fotolitográfico e deposição metálica por sputtering.

[0039] A Figura 2 apresenta um fluxograma representativo das etapas de fabricação dos eletrodos microfabricados para C⁴D (detecção condutométrica sem contato capacitivamente acoplada) aplicados no aparelho da presente invenção.

[0040] Os eletrodos do aparelho da presente invenção são fabricados por um processo fotolitográfico combinado com uma etapa de deposição metálica por sputtering, como representado na Figura 2. Inicialmente, a superfície de um substrato de vidro SV (etapa I) é revestida com uma camada (etapa II) de fotorresiste positivo (FRP) (Shipley 1811

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S1811) usando a técnica de spin-coating TSC. A camada deste FRP é espalhada sobre a superfície do substrato de vidro a uma velocidade de 4000 rpm durante 30 s. A espessura desta camada é de aproximadamente 0,80 pm. O FRP S1811 foi escolhido por apresentar capacidade de formar filmes finos uniformes e também por apresentar certa facilidade na remoção com solventes orgânicos. Essas características não impedem que outros fotorresistes sejam usados, desde que tais propriedades corroborem com o processo de microfabricação.

[0041] Após o referido revestimento, uma máscara M (impressa em fotolito de maneira convencional via serviços especializado ou localmente em transparência de poliéster e impressora a laser comum) contendo a configuração dos eletrodos é posicionada sobre o substrato. Como é usado FRP, o desenho dos eletrodos é impresso em branco (ou imagem negativa), de modo a permitir a passagem da radiação UV (etapa III) nessa região. Dessa maneira, a imagem dos eletrodos é gravada na película de FRP sob exposição a radiação UV (10 mW cm^-2) por 20 s (etapa IV). Após a revelação da geometria dos eletrodos (etapa IV), em solução reveladora específica para este fotorresiste (AZ developer), os substratos são fixados na câmara de sputtering SP para deposição do metal (etapa V). Então, se obtém os eletrodos microfabricados EM após a remoção da camada fotorresiste (técnica conhecida como lift-off LO) usando acetona (etapa VI).

[0042] Como mencionado anteriormente, a resposta da C⁴D é independente da composição do material do eletrodo. No entanto, para a integração de eletrodos nos microssistemas biomoleculares, além da aderência com o substrato de vidro, é desejável que o metal dos eletrodos tenha compatibilidade com a camada dielétrica que reveste os mesmos. Com esses dois requisitos básicos, optou-se pela deposição de uma camada de Au, usando uma camada de Ti para melhorar a aderência dos eletrodos ao substrato. Devido aos problemas de aderência entre a camada de Au e a camada dielétrica, outra camada de Ti foi depositada sobre a camada de Au. Desse modo, os eletrodos para

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11/17 os ensaios biomoleculares são constituídos de Ti/Au/Ti. A qualidade da aderência foi avaliada mediante testes de resistência mecânica que não são descritos aqui.

[0043] A Figura 3 mostra o procedimento de fabricação dos microcanais empregados no aparelho da presente invenção. Os microcanais são fabricados em PDMS com conectores poliméricos (silicone) para integração com o sistema de bombeamento de fluxo para o aparelho.

[0044] Tubos de silicone (a) são fixados sobre o molde Mo de SU-8, como indicado na etapa (I) da Figura 3. O SU-8 é um fotorresiste negativo muito utilizado na confecção de moldes para prototipagem. A escolha do SU-8 para construir moldes se deve a alguns aspectos como alta resistência mecânica, facilidade de fabricar canais com razão de aspecto elevada e possibilidade de replicar/transferir a estrutura microfluídica gravada no molde para substratos poliméricos centenas de vezes. Os tubos de silicone são fixados especificamente sobre os reservatórios para entrada e saída das soluções. A fixação é feita com fita dupla-face disponível comercialmente, mantendo a extremidade inferior do tubo devidamente selada (com a fita). Após a fixação, um pré-polímero (por exemplo, Sylgard 184) é misturado com o agente de cura na proporção de 10:1 e adicionado/despejado sobre o molde (etapa II da Figura 3). Após a etapa de polimerização PLM (70 °C/1 h), os canais são desmoldados cuidadosamente, como indicado na etapa (III) da Figura 3, para manter os tubos de silicone fixados no PDMS.

[0045] Após a desmoldagem DM, a superfície do PDMS é oxidada (Figura 3 etapa IV) para converter os grupos SiOCH3 da superfície em SiOH. Essa etapa de oxidação é necessária para promover uma selagem irreversível, ou seja, de alta resistência mecânica, entre a superfície contendo os eletrodos e o sistema microfluídico. A oxidação é realizada durante 1 min., sob uma potência de 70 W (radiofrequência aplicada ao sistema de plasma) e uma pressão de O2 igual a 120 mTorr (16 Pa). Após a oxidação, os microcanais fabricados em PDMS são colocados em contato com o substrato de vidro SV (ver Figura 1), contendo

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12/17 os eletrodos isolados e modificados quimicamente (discutidos mais abaixo), obtendo uma selagem irreversível (Figura 3 etapa V) devido à formação de uma ligação Si-O-Si. Para simplificação, os eletrodos não estão representados na Figura 3. O processo de isolamento elétrico dos eletrodos será descrito em detalhes abaixo.

[0046] Para finalizar a fabricação, conectores elétricos são adaptados aos microssistemas biomoleculares. Para isso, orifícios são confeccionados no substrato de vidro, na região dos contatos elétricos, com uma ferramenta convencional usando brocas com pontas diamantadas (diâmetro de 1 mm). Os conectores são colados nestes orifícios usando cola condutora à base de resina epóxi. O Anexo mostra duas fotografias (A) e (B) desses microssistemas fabricados seguindo o processo descrito. As imagens (A) e (B) mostram os detalhes da integração dos canais em PDMS com a placa de vidro contendo os eletrodos fabricados e isolados com uma camada de SiO2. Os conectores elétricos e os tubos de silicone estão representados por a e b, respectivamente.

[0047] De acordo com o° Anexo os conectores elétricos (a) são fixados na extremidade dos eletrodos usando cola condutora. Os dispositivos apresentados no Anexo (A) e (B) são exemplos de geometrias no formato de um microcanal simples e formato de Y, respectivamente. Conforme visualizado em B, o dispositivo tem um tamanho aproximado de uma memória flash (flash-drive), mas pode ser reduzido conforme a necessidade.

[0048] O isolamento elétrico dos eletrodos é obtido com a deposição de uma camada de SiO2 no substrato S através de processo convencional usando um sistema de PECVD (Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition) modelo PlasmaSystem (VacuTec) esquematicamente representado na Figura 4. De maneira bem simplificada, o referido processo consiste em introduzir uma mistura gasosa constituída de óxido nitroso e silana (SiH4 + N2O) no reator. O plasma gerado a partir de uma radiofreqüência RF com potência de 20 W promove a dissociação, a ionização e a excitação dos reagentes no reator. A presença

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13/17 de N2 tem a função de limpar a câmara reacional durante plasma. Em outras palavras, quando os gases são inseridos no reator, há a formação dos radicais Si· e O·, a partir da dissociação da silana e do óxido nitroso, respectivamente, os quais se combinam originando o óxido de silício.

[0049]

Como exemplo, a camada dielétrica depositada como acima é modificada quimicamente de modo a imobilizar moléculas de biotina em sua superfície. O processo de imobilização da biotina, usando reagentes com grupos fotossensíveis, é bem conhecido e já foi utilizado para caracterização de outros tipos de sensores, como os sensores ópticos e também os sensores baseados em medidas de impedância eletroquímica. Por esse motivo, este sistema modelo foi utilizado para avaliar a potencialidade da presente invenção.

Para esta finalidade, a referida camada dielétrica é primeiramente modificada com APTES (aminopropil-trietoxisilano). Em seguida, as moléculas de biotina, contendo grupos fotossensíveis em sua estrutura, são imobilizadas covalentemente com radiação UV. Ambos os procedimentos utilizados são descritos a seguir.

Silanização [0050]

Os substratos contendo os eletrodos isolados com uma camada de SiO2 são previamente submetidos a uma limpeza usando uma solução piranha (H2SO4:H2O2, 3:1 (v:v)) durante 30 min. Após a limpeza, os substratos são lavados com água desionizada, etanol e, em seguida, secos com N2.

[0051] Para silanização, uma solução de APTES (aminopropil-trietoxi-silano), em uma concentração de 3% (v/v), é preparada em um frasco volumétrico de 10 mL com diluição de 300 μL de APTES em etanol. Em seguida, os substratos recobertos com uma camada de 50 nm de SiO2 são imersos na solução de APTES e mantidos durante 3 h. A concentração e o tempo de sinalização podem ser ainda otimizados, visando à obtenção de uma superfície com maior área de recobrimento após a modificação química. Após a remoção dos substratos da solução de aminossilano, os mesmos são

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14/17 lavados com etanol absoluto para remover as moléculas adsorvidas (não ligadas covalentemente) à superfície dielétrica. Em seguida, os substratos são lavados extensivamente com água desionizada e, finalmente, secos com N2. A Figura 6 apresenta um esquema da reação de silanização e formação de monocamadas de APTES sobre a superfície dielétrica.

Imobilização de biotina [0052] Após a silanização, a superfície contendo grupos -NH2 é funcionalizada com moléculas de biotina com auxílio de radiação UV, conforme ilustrado na Figura 6. Inicialmente, o substrato contendo os eletrodos isolados EI (e com camada dielétrica silanizada) (etapa I) é revestido com uma camada de FRP (S1811) (etapa II) e em seguida exposto a radiação UV para gravação da área a ser funcionalizada (etapa III). Nesse ponto, modifica-se a região da camada dielétrica somente sobre o eletrodo e2. Após a etapa de fotogravação (etapa III), a região que recebeu radiação é revelada (IV) e uma alíquota (10 pL) de fotobiotina (FB), preparada em água na concentração de 0,1 mg/mL, é adicionada sobre essa região. Em seguida, a máscara fotogravada é posicionada sobre o substrato e submetida à radiação UV por 15 min (etapa V). Ao final desta etapa V, a camada de FRP é removida com etanol e a superfície é lavada com água. Após a lavagem, as moléculas de biotina MB ficam imobilizadas na superfície dos eletrodos, como representado na etapa VI da Figura 6. Basicamente, qualquer molécula contendo grupo fotossensível à radiação UV pode ser imobilizada como descrito acima. No entanto, outros modelos de imobilização que não requerem radiação UV também podem ser empregados para a mesma finalidade. Dentro desta possibilidade, várias biomoléculas como enzimas, DNA, proteínas, antígenos, anticorpos, aminoácidos, dentre outras, podem ser imobilizadas usando procedimentos químicos envolvendo interações covalentes ou eletrostáticas.

[0053] Após as etapas de silanização e funcionalização da superfície dos eletrodos com biotina, os canais do aparelho detector da presente invenção são integrados ao substrato

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15/17 conforme descrito anteriormente (ver descrição da Figura 3). A imobilização das moléculas de biotina ocorre em função da formação de uma ligação amida entre o grupo -NH2 e a carbonila da uréia presente na estrutura da biotina, disponível comercialmente na forma de um sal de acetato de fotobiotina.

[0054] A Figura 7 é uma representação genérica da instrumentação desenvolvida para um experimento de análise de interação biomolecular por detecção condutométrica sem contato usando um aparelho da presente invenção. Na Figura 8 os pontos a, b e c indicam tubos de Tygon® utilizados para conexões entre as bombas seringas e as válvulas solenóide V1 e V2, entre as válvulas V1 e V2 e um reservatório para descarte de soluções b e entre as válvulas V1 e V2 e o microssistema c. O ponto d indica a conexão elétrica entre os eletrodos do microssistema e a interface de aquisição com entradas e saídas analogias/digitais (A/D) e digitais/analógicas (D/A), enquanto o ponto e representa a conexão entre a placa de aquisição e o computador, através de comunicação USB. As válvulas para acionamento dos canais da amostra e do tampão estão representadas por V1 e V2, respectivamente.

0055]

Para o experimento conduzido, o fluido foi manuseado inicialmente com auxílio de uma bomba seringa. Como descrito na Figura 3, tubos poliméricos são adaptados aos microssistemas de PDMS, durante a etapa de polimerização, facilitando a conexão com os tubos Tygon® utilizados no sistema de bombeamento. Neste experimento é utilizada a geometria de canais microfluídicos no formato em Y. Duas válvulas solenóides V1 e V2 são adaptadas ao sistema de modo a automatizar a etapa do transporte de soluções nos canais microfluídicos. As válvulas solenóides V1 e V2 são alimentadas com 12 V e o circuito eletrônico desenvolvido para controle de ambas as válvulas não são parte do escopo da presente invenção. Embora duas válvulas tenham sido utilizadas, o circuito foi projetado de modo a permitir a implementação de outras duas válvulas, totalizando quatro. Embora uma geometria no formato de Y tenha sido utilizada para demonstrar a potencialidade do sistema

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16/17 desenvolvido, geometrias contendo um simples canal ou ainda contendo múltiplos canais em paralelo podem ser utilizadas para o mesmo protótipo, permitindo inclusive explorar análise de interações com diferentes analitos simultaneamente.

[0056] Como visualizado na Figura 7, um sinal de alta freqüência (centenas de kHz) é aplicado ao eletrodo de excitação (e0) pelo gerador de funções GF. Em conseqüência desta excitação, um fluxo de corrente é gerado podendo ser registrado nos eletrodos receptores (e1 e e2). O transporte do fluido é induzido, inicialmente, por uma bomba seringa BS usando duas válvulas solenóides (V1 e V2). A conexão entre a bomba seringa BS e as válvulas V1 e V2, válvulas V1 e V2 e reservatório para descarte, e válvulas V1 e V2 e microssistema BIA-C4D estão indicadas pelos pontos a, b e c, respectivamente. O descarte é representado por D. Estas conexões são realizadas com auxílio de tubos de Tygon®, com diâmetro de 0,1 mm.

[0057] O sinal resultante é registrado pelos eletrodos receptores (e1 e e2), enviado via d para a interface analógica/digital A/D e daí via e para o módulo de aquisição de dados MAD e monitorado, em tempo real, na tela principal do software de aquisição, cuja tela principal está apresentada em detalhes na Figura 8. Como visualizado, o tempo de cada etapa envolvida (introdução da amostra ou do tampão) pode ser controlado pela interface gráfica disponibilizada no programa. O acionamento dos canais pode ser monitorado em tempo real pela indicação do LED (Light Emitting Diode) na interface. Mesmo com a implementação do sistema de bombeamento hidrodinâmico, o uso de potenciais elétricos (controle eletrocinético) pode ser, alternativamente, empregado para a mesma finalidade.

[0058] A Figura 9 apresenta micrografias ópticas mostrando em (A) a geometria dos eletrodos do aparelho detector oscilométrico da presente invenção e a região delimitada sobre a superfície do SiO2 para modificação química com magnificação de 25 x em (B) e 100 x em (C), respectivamente.

[0059] A geometria ideal para o aparelho detector de

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17/17 detecção dupla da presente invenção é composta por três eletrodos, sendo um responsável pela excitação da cela (e0) e os outros dois (e1 e e2) pelo registro do sinal resultante. Nesta configuração de eletrodos, o primeiro eletrodo receptor (e1) é usado para fazer a leitura de referência (ou de controle) e o segundo eletrodo receptor (e2) é usado para registrar o sinal das interações específicas. Dessa forma, o eletrodo e1 dará uma resposta referente ao fluxo que estiver passando pelo detector, incluindo a condutividade do eletrólito e também do analito de interesse, no exemplo, a avidina. Uma linha de base constante não é esperada, pois a condutividade da solução de avidina poderá promover um deslocamento no sinal. Já o eletrodo e2 dará uma resposta global, incluindo a resposta do fluxo mais o sinal relacionado com a interação biomolecular específica entre o ligante e o receptor; no exemplo, entre biotina e avidina. Nas imagens da Figura 10(B) e 10(C) é possível observar que apenas a extremidade do eletrodo e2 foi delimitada para modificação.

[0060] Para o sistema modelo de interação entre avidina e biotina, a resposta em função da concentração foi investigada nas concentrações de 5, 10, 20, 30 e 60 μg mL^-1. Observou-se que a resposta do detector é linear na faixa entre 5 e 100 μg mL^-1. O coeficiente de correlação para estes dados foi igual a 0,9857. O limite de detecção para a interação entre avidinabiotina foi igual a 5 μg mL^-1· Estes valores (do limite de detecção) podem ser melhorados em função do aumento da área de cobertura da superfície modificada.

Claims (10)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Aparelho detector condutométrico sem contato para biossensores microfluídicos, caracterizado pelo fato de compreender:

   um substrato de vidro (SV) contendo três eletrodos metálicos, sendo um eletrodo de excitação da cela (e0), um eletrodo de referência (e1) e um eletrodo de registro de interações específicas (e2), gravados sobre uma película de fotorresiste (FR), os referidos eletrodos metálicos tendo uma camada inferior e uma camada superior de metal facilitador (M) de aderência ao substrato de vidro (SV) e à camada dielétrica, respectivamente;

   uma camada dielétrica depositada sobre os eletrodos (e0, e1, e2), a camada dielétrica de um eletrodo sendo

   modificada quimicamente de modo a imobilizar moléculas em sua superfície; uma camada de material elastomérico contendo microcanais (MC) para manuseio de fluido e conectores colocada sobre o substrato de vidro (SV) selada irreversivelmente sobre o substrato (S). 2. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o substrato de vidro (SV)

   pode ser substituído por outros materiais como PDMS, poliéster, poli(estireno), poli(metilmetacrilato) (PMMA), poli(carbonato), poliimida, poli(uretana) e outros materiais elastoméricos ou termoplásticos.

   3. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de os três eletrodos metálicos (e0; e1 e e2) serem de ouro. 4 . Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de os eletrodos poderem ser

   confeccionados com materiais condutores selecionados do grupo que compreende cobre, platina, titânio, alumínio, carbono, níquel e cromo.

   5. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de os três eletrodos metálicos de

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2. 2/2 ouro terem revestimento inferior e superior de Ti.
3. 6. Aparelho, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de alternativamente usar uma camada de cromo, promovendo aderência similar àquela obtida com a camada de Ti.
4. 7. Aparelho, de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de a camada dielétrica depositada sobre os três eletrodos ser constituída por óxido de silício.
5. 8. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de usar outras camadas dielétricas, como óxido de titânio ou nitreto de silício.
6. 9. Aparelho, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o eletrodo de registro de interações específicas (e2) conter uma camada dielétrica modificada com biotina.
7. 10. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1, caracterizado pelo fato de o eletrodo de registro de interações específicas ser modificado com outras biomoléculas (como anticorpos, enzimas, açúcares, proteínas, DNA, antígenos, aminoácidos) para aplicações biomédicas.
8. 11. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de os eletrodos serem fabricados em microcanais (MC) independentes e paralelos.
9. 12. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser para biomoléculas baseando-se em monitorar interações entre medidas de variações de condutividade na superfície de eletrodos modificados quimicamente.
10. 13. Aparelho, de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de os eletrodos de detecção não estarem em contato direto com a solução, correspondendo sistema de detecção condutométrica sem contato a um para monitoramento de interações biomoleculares.