BRPI0901659B1 - Micropartículas compreendendo minoxidil, processo de produção e composição compreendendo micropartículas - Google Patents

Abstract

micropartículas compreendendo minonidil, processo de produção e composição compreendendo micropartículas. a presente invenção descreve micropartículas de quitosana compreendendo minoxidil, o processo de produção destas partículas e composições compreendendo as mesmas. em especial, essas composições podem ser utilizadas por via tópica, possuindo uma liberação lenta, o que diminui a necessidade de diversas aplicações ao longo do dia. pode-se ainda aplicar a iontoforese para promover uma maior entrada dessas partículas no interior da pele.

Description

[001] A presente invenção descreve micropartículas de quitosana compreendendo minoxidil, o processo de produção destas partículas e composições compreendendo as mesmas. Em especial, essas composições podem ser utilizadas por via tópica, possuindo uma liberação lenta, o que diminui a necessidade de diversas aplicações ao longo do dia. A presente invenção se situa no campo na medicina, biomedicina, química, farmácia e nanotecnologia.

Antecedentes da Invenção

Micropartículas como sistema de liberação de fármacos [002] As micropartículas poliméricas são definidas como partículas com tamanhos na faixa de micrômetros (PITAKSUTEEPONG et al, 2007). Este tipo de sistema de liberação de fármacos é bastante estudado para aplicação tópica por ser capaz de proteger, sustentar e até restringir a permeação transdérmica de fármacos através da pele, fazendo com que ele permaneça mais retido no tecido cutâneo (DE JALON et al., 2001). De Jalon et al. (2001), por exemplo, estudaram a distribuição de micropartículas contendo rodamina como sonda fluorescente em pele de porco após aplicação tópica in vitro. Os autores verificaram que as micropartículas desenvolvidas conseguiam atravessar o estrato córneo e atingiam a epiderme viável sem, no entanto, cair na circulação. Outra vantagem associada ao uso de nano e micropartículas poliméricas é a sua facilidade de preparação com polímeros biodegradáveis, além da alta estabilidade delas em fluidos biológicos e/ou durante o armazenamento. Desta forma, após a administração, sabe-se que as micropartículas poliméricas permanecem no sítio de aplicação e o fármaco é liberado por difusão, reações químicas, degradação de polímero ou mecanismo de troca iônica, dependendo do polímero utilizado e de sua interação com o fármaco encapsulado (DING, 1998).

Minoxidil

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2/24 [003] Minoxidil (2,4-diamino-6-piperidinilpirimidina-3-óxido) é o ingrediente ativo de pelo menos dois medicamentos (Loniten e Rogaine) comumente utilizados para o tratamento da hipertensão, assim como para o tratamento e a prevenção de alopecia (calvície masculina e feminina). Composições farmacêuticas de uso tópico podem adquirir uma variedade de formas, como solução, gel, suspensões, dentre outros.

[004] Soluções tópicas de minoxidil tipicamente contêm água e um ou mais solventes adicionais. Estas soluções tópicas não têm sido inteiramente satisfatórias para uso no tratamento do escalpo pois elas tendem a não permanecer no local tempo suficiente para que quantidades satisfatórias da droga sejam absorvidas.

[005] No âmbito patentário, alguns documentos descrevem micropartículas, minoxidil, seu uso e composições compreendendo minoxidil.

[006] O documento US 6,242,099 descreve micropartículas de quitina ou derivadas de quitina compreendendo substâncias hidrofóbicas, especialmente substâncias que auxiliam na proteção solar, como PABA. A presente invenção difere desse documento por não compreender substâncias de proteção solar, mas, sim, minoxidil, que auxilia no tratamento da alopecia.

[007] Os documentos WO 06/087392 e WO 07/002640 descrevem substâncias, composições e métodos para tratar alopecia compreendendo, respectivamente, oligômeros de ácido hialurônico de ultra-baixo peso molecular ou ésteres alquil de ácido nicotínico. A presente invenção difere desse documento por não compreender ácido hialurônico ou nicotínico, mas, sim, quitosana e minoxidil.

[008] O documento US 2006/0171990 descreve um método para a produção de materiais de entrega de fármacos, compreendendo um agente biologicamente ativo encapsulado, uma combinação deste com uma solução para formar uma segunda composição e converter a segunda composição em pelo menos um material de entrega de fármacos sólido ou semi-sólido. A presente invenção difere deste documento por não necessitar de uma segunda composição para a formação de micropartículas e por compreender quitosana e minoxidil, substâncias não citadas no referido documento.

[009] O documento GB 2 194 887 descreve partículas micronizadas compreendendo espessantes como polímeros derivados de celulose ou ácidos

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3/24 poliacrílicos ligados de forma cruzada com um agente polifuncional, solvente e minoxidil. A presente invenção difere desse documento pelas partículas micronizadas não compreenderem polímeros derivados de celulose ou ligados a agentes funcionais, mas, sim, somente quitosana.

[010] Em vista dos documentos apontados do estado da técnica, concluímos que a presente invenção não é antecipada nem sequer sugerida pelos ensinamentos existentes.

Sumário da Invenção [011] Em um aspecto, a presente invenção proporciona micropartículas compreendendo minoxidil, de forma a retardar a liberação desta substância, quando aplicada por via tópica.

[012] É, portanto, um objeto da presente invenção micropartículas compreendendo:

a) de 25 a 50% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidinopirimidina e/ou seus sais e derivados;

b) de 50 a 75% de quitosana.

[013] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção composições compreendendo:

a) de 0,5% a 5% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidinopirimidina e/ou seus sais e derivados;

b) de 0,5% a 15% de quitosana;

c) veículo farmaceuticamente aceitável.

[014] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona o processo de produção destas micropartículas.

[015] É, portanto, um objeto adicional da presente invenção o processo de produção de micropartículas compreendendo a etapa de contactar de 25 a 50% de 6-amino-1,2-dihidro-1 -hidroxi-2-imino-4-piperidino-pirimidina e/ou seus sais e derivados com 50 a 75% de quitosana.

[016] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Descrição das Figuras

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4/24 [017] A figura 1 mostra fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV Philipps XL 30 FEG) em aumentos de 2000 a 20000 vezes para as micropartículas MP01 (A e B), MP02 (C e D) e MP03 (E e F).

[018] A figura 2 mostra fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV Philipps XL 30 FEG) em aumentos de 2000 a 20000 vezes para as micropartículas MP04 (A e B), MP05 (C e D) e MP06 (E e F).

[019] A figura 3 mostra fotomicrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura (MEV Philipps XL 30 FEG) em aumentos de 2000 a 20000 vezes para as micropartículas MP07 (A e B), MP08 (C e D) e MP09 (E e F).

[020] A figura 4 mostra a quantidade permeada de MXS após 6 h (preto) e 24 h (cinza) de permeação passiva a partir da suspensão das micropartículas de quitosana em solução hidroalcoólica contendo o equivalente a 2,0% de MXS,

89,5 mM de NaCl, pH 5,5 em comparação a uma formulação semelhante contendo o MXS livre.

[021] A figura 5 mostra a quantidade de MXS retido na pele após 6 h (preto) e 24 h (cinza) de permeação passiva a partir da suspensão das micropartículas de quitosana em solução hidroalcoólica contendo o equivalente a 2,0% de MXS, 89,5 mM de NaCl, pH 5,5 em comparação a uma formulação semelhante contendo o MXS livre.

Descrição Detalhada da Invenção [022] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Minoxidil [023] Na presente invenção, o termo minoxidil e minoxidil sulfato (MXS) são utilizados de forma intercambiável com 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2imino-4-piperidino-pirimidina e/ou seus sais e derivados. Em especial, a presente invenção compreende micropartículas compreendendo 25% a 50% de minoxidil em seu interior.

Quitosana [024] A quitosana da presente invenção pode ser escolhida do grupo que compreende polissacarídeos catiônicos produzidos a partir da quitina, um

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5/24 polissacarídeo encontrado no exoesqueleto de crustáceos. Em especial, na presente invenção, de 50 a 75% de quitosana são utilizadas para o microencapsulamento do minoxidil.

Processo de produção de micropartículas [025] O processo de produção de micropartículas da presente invenção compreende a etapa de contactar de 25 a 50% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi2-imino-4-piperidino-pirimidina e/ou seus sais e derivados com 50 a 75% de quitosana.

[026] Em especial, a microencapsulação do MXS utilizando a quitosana foi realizada pela técnica de spray-drying. Assim, soluções contendo determinadas quantidades de quitosana (médio peso molecular, 85% de desacetilação, Sigma-Aldrich, Alemanha) e MXS foram obtidas dissolvendo-se ambos os componentes em uma solução aquosa de ácido acético 1% (p/p) (Synth, Brasil). 200 mL de cada uma das soluções foram levados ao mini spray dryer (Labmaq, modelo MSD 0.5), utilizando-se um atomizador pressurizado de 1,0 mm a um fluxo de passagem de 6 mL/min. O fluxo de ar de secagem foi utilizado numa taxa de 300 nL/h. A temperatura de saída do ar foi de 85^oC. Composição farmacêutica [027] Para efeitos desta invenção, por “composição farmacêutica” entende-se toda e qualquer composição que contenha um princípio ativo, com fins profiláticos, paliativos e/ou curativos, atuando de forma a manter e/ou restaurar a homeostase, podendo ser administrada de forma tópica, parenteral, enteral e/ou intratecal.

[028] A expressão “farmaceuticamente aceitável” é empregada aqui para se referir a compostos, materiais, composições, e/ou forma de dosagem que são, dentro do âmbito da medicina, apropriados para uso em contato com os tecidos de humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica, ou outro problema ou complicação, proporcional com uma relação razoável de benefício/risco.

[029] A composição farmacêutica da presente invenção é uma composição que compreende:

a) de 0,5% a 5% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidinopirimidina e/ou seus sais e derivados;

b) de 0,5% a 15% de quitosana;

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c) veículo farmaceuticamente aceitável.

Veículo farmaceuticamente aceitável [030] O veículo farmaceuticamente aceitável é um veículo escolhido do grupo que compreende os veículos aceitáveis para composições orais, endovenosas, dentre outros possíveis e podem compreender excipientes como o amido, açúcar, talco, manteiga de cacau, glicerina, óleos vegetais, dentre outros possíveis bem como a mistura dos mesmos e soluções aquosas tais como água pra injeção, solução salina (NaCl 0,9%), solução de glicose 5%, solução glicofisiológica (glicose 5% e NaCl 0,9%) dentre outras possíveis bem como a mistura das mesmas.

[031] A composição da presente invenção pode ser administrada em forma de dosagem oral, como tabletes, cápsulas (cada qual inclui a liberação sustentada ou formulações com tempo de liberação) pílulas, pós, granulados, elixires, tinturas, suspensões, xaropes, e/ou emulsões. Eles podem também ser administrados em intravenosos (infusão), intraperitoneal, subcutânea, ou em formas intramusculares, todas utilizando dosagens conhecidas para aqueles com habilidade ordinária que praticam a arte farmacêutica. Eles podem ser administrados sozinhos, mas geralmente serão administrados com um veiculo farmacêutico selecionado na base de rota de administração escolhida e da prática farmacêutica padrão.

[032] Em uma realização preferencial, a presente composição é aplicada por via tópica. Em uma realização opcional, é utilizada a técnica de iontoforese para direcionamento da composição (a iontoforese pode direcionar a penetração cutânea da partícula para o folículo piloso).

Exemplo 1. Realização Preferencial

Obtenção de micropartículas de quitosana contendo o MXS [033] A microencapsulação do MXS utilizando a quitosana foi realizada pela técnica de spray-drying. Assim, soluções contendo determinadas quantidades de quitosana (médio peso molecular, 85% de desacetilação, SigmaAldrich, Alemanha) e MXS foram obtidas dissolvendo-se ambos os componentes em uma solução aquosa de ácido acético 1% (p/p) (Synth, Brasil). 200 mL de cada uma das soluções foram levados ao mini spray dryer (Labmaq, modelo

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MSD 0.5), utilizando-se um atomizador pressurizado de 1,0 mm a um fluxo de passagem de 6 mL/min. O fluxo de ar de secagem foi utilizado numa taxa de 300 nL/h. A temperatura de saída do ar foi de 85^oC. As quantidades de quitosana e MXS em cada uma das soluções que passaram pelo processo de secagem estão descritas na Tabela 1.

[034] Sistemas de liberação microparticulados são bastante estudados como veículos para aplicação tópica de fármacos por serem capazes de proteger o ativo, sustentar sua liberação e até restringir sua permeação transdérmica (DE JALON et al., 2001). Como vários trabalhos indicam que a principal via de penetração cutânea das micropartículas é a transfolicular (MEIDAN et al., 2005; MUNSTER et al., 2005; SHIM et al., 2004; TOLL et al., 2004), neste trabalho desenvolveu-se também micropartículas poliméricas contendo MXS na tentativa de direcionar sua liberação para o folículo piloso, que é o alvo de ação deste fármaco.

Tabela 1. Quantidade de fármaco (MXS) e polímero (quitosana) presente em cada uma das soluções secas por spray drying.

Sistema	Quantidade de quitosana (g)	Quantidade de MXS (g)	Proporção fármaco/polímero
MP01	1,00	1,00	1:1
MP02	1,00	0,50	1:2
MP03	1,00	0,33	1:3
MP04	1,50	1,50	1:1
MP05	1,50	0,75	1:2
MP06	1,50	0,50	1:3
MP07	2,00	2,00	1:1
MP08	2,00	1,00	1:2
MP09	2,00	0,67	1:3

[035] As partículas obtidas conforme a metodologia descrita foram caracterizadas quanto ao rendimento e eficiência de encapsulação do processo, bem como distribuição de tamanho e morfologia. A partir daí selecionou-se o melhor sistema para proceder outros estudos de caracterização, como intumescimento da partícula (“swelling”) e potencial zeta.

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Rendimento do processo [036] As micropartículas obtidas por spray dryíng foram pesadas e o rendimento do processo foi calculado como porcentagem em função da quantidade de sólidos adicionados durante o processo de preparação (PARIKH et al., 2003), segundo a Equação I:

R%

(Equação I) [037] Onde: R% é o rendimento do processo; Q_z é a quantidade de sólidos adicionados durante o processo de preparação; e Qf é a quantidade de micropartículas obtidas no final do processo.

[038] Os valores de rendimento do processo de obtenção das micropartículas de quitosana a partir das 9 formulações estudadas (Tabela 1) estão apresentados na Tabela 2.

Tabela 2. Caracterização das micropartículas de quitosana (QUI) contendo o MXS.

Sistema	Proporção MXS:QUI	Quantidade de pó (g)	Rendimento (%)	Eficiência de Encapsulação (%)	Diâmetro médio de partícula (pm)
MP01	1:1	2,00	24,75	86,06	4,20 (±1,61)
MP02	1:2	1,50	25,90	67,23	2,58 (±1,31)
MP03	1:3	1,33	35,73	54,40	2,51 (±1,21)
MP04	1:1	3,00	33,66	81,84	4,20 (±1,75)
MP05	1:2	2,25	38,15	81,73	3,05 (±1,55)
MP06	1:3	2,00	45,44	44,69	2,88 (±1,50)
MP07	1:1	4,00	27,57	92,20	4,34 (±1,71)
MP08	1:2	3,00	42,03	77,81	3,17 (±1,81)
MP09	1:3	2,67	41,62	48,63	2,71 (±1,67)

[039] De maneira geral, o processo de obtenção das micropartículas de quitosana por spray dryíng resultou em bons valores de rendimento, que variou de 24,75 a 45,44%. Este rendimento parece ter sido aumentado à medida que

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9/24 se aumentou a quantidade de pó total adicionado na formulação, bem como quando a proporção de polímero em relação ao fármaco foi aumentada. Como se trabalhou em uma escala laboratorial, com quantidades relativamente pequenas de pó na formulação (de 1,33 a 4,00 g), acredita-se que a perda de material seco ao longo do aparelho foi mais significativa no rendimento final do processo do que seria caso se trabalhasse numa escala maior. De qualquer forma, Gavini et al. (2008) prepararam micropartículas de quitosana em escala laboratorial para encapsulação de metoclopramida por spray drying e obtiveram valores de rendimento na faixa de 30 a 50%, próximos aos obtidos neste trabalho. As micropartículas de quitosana preparadas por Cevher et al. (2006) para encapsular a vancomicina pelo mesmo processo também apresentou rendimentos próximos a 50%, e os autores também jutificaram que estes valores de rendimento não foram ainda maiores devido à adsorção de algumas gotas do produto sobre as paredes do aparelho durante o processo de secagem.

Eficiência de microencapsulação [040] A eficiência de encapsulação foi determinada avaliando-se a quantidade de MXS encapsulada nas micropartículas de quitosana. Desta forma, 10 mg de cada uma das micropartículas obtidas (Tabela 1) foram dispersos em 10 mL de solução aquosa de ácido acético 1,0% (p/p) sob agitação a 500 rpm durante 24 h. A dispersão foi deixada então por 30 min em banho de ultra-som, filtrada e a solução obtida foi então quantificada por CLAE, obtendo-se a quantidade encapsulada de MXS calculada a partir da Equação II:

(Qobtida). A eficiência de encapsulação foi

EE% / Q z^obtida I | qq \ ^Qteórica J (Equação II) [041] Onde: EE% é a eficiência de encapsulação de MXS na micropartícula; Qobtida é a quantidade de MXS extraído das micropartículas de quitosana; e Qteórica é a quantidade de MXS que teoricamente estaria presente em 10 mg das micropartículas.

[042] A eficiência de encapsulação representa a porcentagem de fármaco que a micropartícula é capaz de encapsular. Neste trabalho, tal parâmetro foi

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10/24 obtido pela razão entre a quantidade de MXS extraído de 10 mg da micropartícula polimérica e a quantidade de MXS teoricamente presente na mesma quantidade de micropartícula, levando-se em consideração a proporção fármaco:polímero da formulação. A Tabela 2 apresenta os valores encontrados de eficiência de encapsulação do MXS para cada uma das micropartículas de quitosana obtidas. Esses valores variaram de 44,69 a 92,20%. Os maiores valores de eficiência de encapsulação foram obtidos quando se trabalhou com maiores proporções de fármaco em relação ao polímero (1:1) e (1:2), enquanto menores proporções de fármaco (1:3) resultaram em valores mais baixos de eficiência. Zhang et al. (2008) também obtiveram altas eficiências de encapsulação (entre 85 e 91 %) quando prepararam micropartículas de quitosana para encapsular a teofilina, independente da proporção fármaco:polímero utilizada. Em nossos estudos, no entanto, parece que proporções de MXS inferiores a 33% não garantiram uma encapsulação tão alta do fármaco pelo polímero utilizando o processo de spray drying.

Distribuição de tamanho das micropartículas [043] A distribuição de tamanho de partículas foi determinada por difração a laser em um Beckman Coulter LS 13 320. Para tanto 1 mg das micropartículas obtidas foram suspensas em 2 mL de metanol (JTBaker, USA) e estas suspensões foram levadas ao aparelho para análise (OLIVEIRA et al., 2006).

[044] A Tabela 2 mostra o diâmetro médio das partículas obtidas. Quando se trabalhou com uma proporção MXS:quitosana igual (1:1), o diâmetro médio das partículas obtidas foi maior (4,40 pm) em comparação ao de partículas obtidas com maiores proporções de polímero (1:2 e 1:3), as quais tiveram uma distribuição de tamanho semelhante entre si. Este padrão foi mantido para as partículas, sendo que as micropartículas denominadas MP09 tiveram diâmetros médios um pouco menores que as MP08. Cevher et al. (2006) prepararam micropartículas de quitosana por spray drying para encapsular a vancomicina e também observaram uma diminuição no diâmetro médio das partículas com o aumento da quantidade de polímero na formulação.

[045] Todos os sistemas obtidos tiveram suas dimensões na ordem de micrômetros sendo, portanto, micropartículas, e apresentaram uma distribuição de tamanho monomodal. A polidispersividade das micropartículas obtidas foi

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11/24 semelhante à da maioria das micropartículas descritas na literatura obtidas por spray drying. A aplicação tópica de sistemas microparticulados vem sendo bastante discutida atualmente. Parece que esses sistemas são mais eficazes para a ação tópica local do que os nanoparticulados. Rolland et al. (1993), por exemplo, prepararem microsferas de PLGA com diâmetro médio de 5,0 pm contendo adapaleno como fármaco antiacneico e verificaram aumento do efeito comedolítico.

Morfologia das micropartículas [046] A morfologia das micropartículas obtidas foi verificada por análise delas em microscópio eletrônico de varredura (MEV). Desta forma, amostras de cada um dos sistemas microparticulados obtidos foram metalizadas com ouro e analisadas em um MEV Philipps XL 30 FEG num aumento de 2000 a 20000 vezes. As Figuras 1, 2 e 3 mostram fotomicrografias das micropartículas de quitosana contendo o MXS obtidas por spray drying. Pela observação das fotos pode-se notar que todas as micropartículas apresentaram uma forma bastante esférica, com superfície pouco porosa, sem ranhuras ou falhas, e com um aspecto um pouco escamado. Estas características morfológicas se mostraram independentes da proporção fármaco:polímero de cada micropartícula.

[047] Cevher et al. (2006) também obtiveram por spray drying micropartículas de quitosana bastante esféricas, independente da proporção fármaco:polímero utilizado para obter cada uma delas. No entanto, a superfície daquelas micropartículas apresentaram-se bastante porosas, diferento das obtidas neste trabalho.

[048] Baseado no fato de que todos os sistemas obtidos foram micropartículas morfologicamente muito semelhantes - todas esféricas e pouco porosas -, selecionou-se um dos 9 sistemas obtidos para se dar continuidade aos estudos de caracterização e proceder os estudos de liberação e permeação cutânea baseado nos parâmetros de rendimento do processo, eficiência de encapsulação e diâmetro médio das partículas. Assim, as micropartículas MP05, com 1,50:0,75 de quitosana:minoxidil, foram selecionadas para tais estudos, por apresentarem uma alta eficiência de encapsulação (81,73%) e um diâmetro médio de partícula satisfatório (3,05 ± 1,55 μ), com baixa polidispesibilidade e

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12/24 distribuição de tamanho monomodal, além de seu rendimento de obtenção ser próximo a 40%.

Propriedades de intumescimento (“swelling”) das micropartículas [049] A entrada de água nas micropartículas de quitosana contendo o MXS (MP05) também foi determinada por difração a laser em um Beckman Coulter LS 13 320, segundo metodologia proposta por Gavini et al. (2008). Para isto, 4 mg das micropartículas denominadas MP05 (Tabela 1) foram suspensas em 8 mL de uma solução hidroalcoólica (60% de etanol absoluto - Synth, Brasil - em água deionizada) e mantidas sob agitação a 500 rpm. Após 5, 30 e 60 min, foram retiradas amostras dessas micropartículas, as quais foram analizadas quanto à distribuição de tamanho. Os resultados foram expressos como índice de intumescimento (II), calculado segundo a Equação III:

II % D - D,

D, x 100 (Equação III) [050] Onde: II% é o índice de intumescimento da micropartícula de quitosana MP05 contendo o MXS; Di é o diâmetro médio das micropartículas antes do contato com a solução hidroalcoólica; e D2 é o diâmetro médio das micropartículas após contato com a solução hidroalcoólica.

[051] A quitosana é um polímero hidrofílico que apresenta diversos grupamentos amina, os quais conferem a ela um residual de cargas positivas (OLIVEIRA et al., 2006). Estes grupamentos fazem com que o polímero realize ligações do tipo ponte de hidrogênio quando na presença de água. Desta forma, nessas condições, o polímero tende a sofrer intumescimento, o que aumenta o diâmetro das partículas positivas (GAVINI et al., 2008; OLIVEIRA et al., 2006). Este intumescimento pode influenciar o mecanismo de liberação do fármaco, já que para ser liberado, o MXS deverá se solubilizar na água e atravessar esta camada de gel formada em torno da partícula.

[052] Para se verificar o intumescimento das micropartículas MP05 de quitosana contendo MXS, estas partículas foram deixadas por tempos diferentes (5, 30 e 60 min) suspensas em uma solução hidroalcoólica (60% de etanol em água). Em cada um destes tempos uma amostra da suspensão foi retirada e sua

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13/24 distribuição de tamanho foi determinada com o auxílio de um Beckman Coulter LS 13 320.

[053] A Tabela 3 mostra o índice de intumescimento, expresso em porcentagem de diâmetro, calculado para as micropartículas MP05 em função do tempo. Já a distribuição de diâmetro das micropartículas em função do tempo que permaneceram em contato com uma solução hidroalcoólica.

Tabela 3. índice de intumescimento (ll%) das micropartículas de quitosana MP05 contendo o MXS em função do tempo.

Tempo (min)	Diâmetro médio das partículas (pm)	II (%)
0	3,05 (±1,55)	-
5	5,82 (±4,81)	90,50
30	7,29 (± 8,84)	138,88
60	7,61 (±8,61)	149,47

[054] Após 5 min em contato com a água, as micropartículas de quitosana intumesceram e tiveram seu diâmetro médio aumentado de 3,05 ± 1,55 pm para 5,82 ± 4,81 pm. Foi observado também o aparecimento de um pequeno pico em torno de 25 pm que representa uma pequena aglomeração destas partículas. Após 30 e 60 min o tamanho médio das micropartículas ainda sofreu aumento assim como o número de aglomerados de micropartículas cresceu.

[055] Gavini et al. (2008) obtiveram valor de IE para suas micropartículas de quitosana contendo metoclopramida igual a 91,0% após 5 min de contato com a água, resultado bastante semelhante ao obtido neste trabalho para as micropartículas de quitosana contendo o MXS (90,5%).

Potencial zeta [056] Aproximadamente 1 mg das micropartículas MP05 foi suspenso em uma solução hidroalcoólica contendo 60% de etanol em água e 10 mM de NaCI. O potencial zeta das micropartículas suspensas foi determinado por dispersão de luz com o auxílio de um Zetasizer Nano ZS. O valor de potencial zeta obtido para as micropartículas foi de + 5,87 (± 5,26) mV. Este residual de cargas

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14/24 positivas em torno da partícula deve ser conferido principalmente pela quitosana, um polímero catiônico (FELT et al., 2001). Este potencial pode ser vantajoso à medida que evita a aglomeração das micropartículas formadas, o que poderia dificultar sua penetração da pele. Além disso, tentar-se-á tirar vantagem desta característica para promover a iontoforese das micropartículas obtidas, de modo a aumentar seu transporte para dentro do folículo piloso, controlando e otimizando ainda mais a terapia tópica da alopécia utilizando o MXS.

Exemplo 1.1 - Estudo in vitro de liberação do MXS a partir das micropartículas de quitosana obtidas [057] A capacidade do sistema microparticulado obtido em sustentar a liberação do MXS foi verificada in vitro através de um ensaio de liberação, já que é sabido que sistemas nano e microparticulados geralmente são capazes de retardar a liberação das substâncias que eles encapsulam. No caso de micropartículas de quitosana, como a quitosana é um polímero hidrofílico, quando as micropartículas entram em contato com a água, elas tendem a sofrer intumescimento (swelling), formando uma camada de gel ao seu redor, conforme discutido anteriormente. Espera-se, desta forma, que o MXS encapsulado por este sistema seja liberado mais lentamente, visto que para deixar a micropartícula tenha que se solubilizar na água e se difundir por esta camada de gel em torno da partícula.

[058] O ensaio in vitro de liberação foi realizado com o auxílio de uma célula de difusão vertical tipo “Franz” e uma membrana sintética hidrofílica de acetato de celulose colocada entre os compartimentos doador e receptor desta célula. A membrana hidrofílica separava as micropartículas do contato direto com o meio receptor aquoso servindo apenas de suporte para a formulação, não devendo interferir na difusão do fármaco. Sobre essa membrana hidrofílica foram colocados 20 mg das micropartículas MP05 de quitosana, o que corresponde a uma massa total de 6 mg de MXS (considerando-se que apenas 1/3 da massa de micropartículas corresponde ao fármaco, e que este sistema encapsulou aproximadamente 81,73% do fármaco). Assim, à medida que o MXS foi sendo liberado pelas micropartículas, ele atravessou a membrana de celulose e atingiu o compartimento receptor contendo solução tampão HEPES, pH 7,4, de onde foi

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15/24 sendo coletado de tempos em tempos para quantificação. Como o fármaco liberado precisou partilhar-se através da membrana hidrofílica e porosa para alcançar a solução receptora, dois controles contendo o fármaco livre na mesma quantidade que nas micropartículas, dispersos em géis hidrofílicos não-iônicos, os quais permitem a livre difusão do fármaco, também foram submetidos ao mesmo tipo de experimento.

[059] As micropartículas de quitosana conseguiram sustentar a liberação do MXS por pelo menos 12 h, quando comparada à liberação do fármaco livre a partir dos géis, em que 2 h 30 min foi o tempo necessário para que mais de 60% de todo o fármaco fosse liberado da formulação.

[060] O coeficiente de difusão (D) do fármaco a partir da micropartícula de quitosana, em condições de sink, foi calculado a partir da equação descrita a seguir:

í DxTf²

Q = 2xC₀x\---- (Equação IV) \ π J

Onde: Q corresponde à quantidade de MXS liberado por unidade de área (pg/cm²); Co é a concentração inicial de fármaco no gel (pg/cm³); D é o coeficiente de difusão do fármaco no gel (cm²/s); e Té o tempo decorrido desde o início do experimento (s) (MERCLIN et al., 2004).

[061] Os coeficientes de difusão do MXS a partir dos géis e da micropartícula de quitosana, calculados considerando-se as duas primeiras horas e trinta minutos de experimento, quando os perfis eram todos lineares (r > 0,98), estão apresentados na Tabela 4.

Tabela 4. Coeficientes de difusão do MXS a partir da micropartícula de quitosana (MP05) e dos géis hidrofílicos de HEC e do copolímero tribloco de polioxietilenopolioxipropileno-polioxietileno.

Sistema	Coeficiente de Difusão (cm2/s)	Coeficiente de correlação linear (r)
Gel de HEC	0,82 x 10’6	0,98
Gel do copolímero tribloco	0,56 x 10’6	0,99
Micropartículas (MP05)	0,11 x 10-6	0,99

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16/24 [062] Pela análise dos dados contidos na Tabela, fica evidente que a micropartícula retardou a velocidade de difusão do MXS através da membrana hidrofílica em 5 vezes se comparado ao gel do copolímero tribloco, e 7,5 vezes se comparado ao gel de HEC. Estes resultados mostram que as micropartículas obtidas têm potencial para sustentar a liberação do MXS após sua aplicação. Desta forma, o sistema obtido parece promissor para, controlando a velocidade de liberação do fármaco, diminuir o número de aplicações da formulação de MXS na terapia tópica do MXS, que é uma das metas deste estudo.

Formulações para incorporação das micropartículas de MXS [063] As micropartículas de quitosana contendo o MXS precisaram ser incorporadas em um veículo para então serem administradas topicamente. Buscou-se então um veículo que mantivesse-as totalmente suspensas por um período de tempo, de forma a tornar sua administração sobre a superfície da pele mais homogênea. Portanto, dois veículos foram pré selecionados para sua incorporação: o gel do copolímero tribloco de polioxietileno-polioxipropilenopolioxietileno a 15%, por se tratar do mesmo veículo empregado na administração do MXS livre passivamente e por iontoforese anódica; e uma solução hidroalcoólica contendo 60% de etanol em água, visto se tratar do veículo utilizado comercialmente nas soluções tópicas de MXS.

[064] Sendo assim, 3,63 g das micropartículas de quitosana (MP05) (que equivale a 1,00 g de MXS) foram pesadas e incorporadas em quantidade suficiente dos dois veículos descritos acima para se obter 50 g da formulação. Os dois veículos sozinhos, contendo as micropartículas ou o fármaco livre a 2,0% foram analisados segundo parâmetros físico-químicos de pH e condutividade, bem como por sua capacidade em suspender as micropartículas sem que houvesse formação de aglomerados. Testes de irritação ocular in vitro também foram conduzidos com as formulações obtidas.

pH e condutividade [065] Na Tabela 5 estão apresentados valores de pH e condutividade a 25^oC para as duas formulações selecionadas para incorporação do MXS livre e encapsulado.

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Tabela 5. Condutividade elétrica e pH das formulações contendo 2,0% de MXS livre e encapsulado.

Fomulação	PH	Condutância (S.cnr2)
MXS livre	MXS encapsulado	MXS livre	MXS encapsulado
Solução	3,61	5,47 (±0,01)	1035,00	665,47 (±8,13)
hidroalcoólica	(±0,01)	(± 3,61)
Gel do	3,38	5,35 (±0,01)	6,29	4,70 (± 0,02)
copolímero	(± 0,04)	(± 0,04)

*As formulações apresentaram pH neutro na ausência do ativo (6,77 ± 0,07). Condutância da solução hidroalcoólica = 344,27 ± 2,80 S.crrr²; Condutância do gel = 4,34 ± 0,08 S.crrr² [066] A adição de 2,0% de MXS livre a ambas as formulações fez com que o pH neutro das mesmas diminuísse para aproximadamente 3,50 (Tabela 5). Essa diminuição de pH se deve à acidez dos grupos sulfônicos presentes na molécula de MXS. Já com a adição das micropartículas de quitosana contendo a mesma quantidade de MXS, o pH das formulações apresentou apenas uma pequena queda, permanecendo próximo a 5,50. Esta diminuição da queda de pH é resultado da proteção que a micropartícula confere ao fármaco, que se encontra encapsulado no interior dela.

[067] Quanto ao aspecto visual, ambas as formulações são sistemas transparentes e translúcidos. Quando o fármaco livre foi incoporado a elas, os sistemas permaneceram com estas características, visto que o MXS é um fármaco solúvel em água e as formulações são aquosas. Já com a incorporação das micropartículas de quitosana (MP05), a solução hidroalcoólica adquiriu aspecto opaco e coloração branca e homogênea. Isto porque o sistema formado foi uma suspensão em que as micropartículas permaneceram homogeneamente distribuídas pelo veículo após agitação. No entanto, quando incorporadas em gel de Poloxamer, as micropartículas não foram capazes de se dispersarem homogeneamente, mesmo após agitação constante, havendo formação de aglomerados de partículas. Diferente do esperado, o copolímero tribloco, com suas propriedades tensoativas, não foi capaz de evitar a aglomeração das

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18/24 micropartículas de quitosana em meio aquoso. Desta forma, a formulação hidroalcoólica foi selecionada para veiculação das micropartículas de quitosana. Esta formulação foi então utilizada nos experimentos de permeação cutânea passiva e iontoforética.

[068] A condutividade das formulações contendo o MXS encapsulado ou não foi avaliada para verificar se estas formulações permitem ou não a passagem da corrente elétrica. O gel do copolímero tribloco possui uma condutividade baixa. Isto ocorre porque este sistema viscoso dificulta a passagem da corrente elétrica. A incorporação do MXS em pHs baixos aumentou essa condutividade por serem entidades carregadas. Já as micropartículas de quitosana, quando suspensas nesta formulação, não alteraram a sua condutividade, já que a densidade de cargas das partículas são menores que a do fármaco livre. A solução hidroalcoólica possui uma condutividade 100 vezes maior que o gel, de 344,27 ± 2,80 S.cm^-2. As micropartículas suspensas nesta solução duplicaram o valor de condutividade da mesma e o fármaco livre promoveu um aumento ainda maior pelo aumento de entidades condutoras no sistema.

Ensaio de irritação in vitro - modelo organotípico HET-CAM [069] A irritação promovida pelas duas formulações estudadas (gel do copolímero tribloco de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno e solução hidroalcoólica) foi avaliada in vitro utilizando a membrana corioalantóide (CAM) do ovo de galinha como modelo experimental. Este método foi baseado no proposto por Luepke (1985).

[070] Os ovos de galinha embrionados foram cuidadosamente colocados na posição vertical sobre um suporte, de forma que a parte mais larga e plana ficasse voltada para cima. Com o auxílio de uma tesoura plana foi realizado um pequeno furo no centro da parte superior da casca de modo a expor a CAM, a qual é caracterizada por sua transparência e pela presença de vasos sanguíneos.

[071] Em seguida, 300 pL das formulações a serem testadas (gel do copolímero tribloco de polioxietileno-polioxipropileno-polioxietileno - contendo ou não 2,0% de MXS, pH 5,5; e solução hidroalcoólica a 60% contendo ou não 7,26% da micropartícula MP05) foram aplicadas diretamente sobre a CAM. Após

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19/24 s da aplicação, as CAM foram lavadas com solução tampão fosfato isotônico, pH 7,4, para retirada da formulação, e foram analisadas visualmente durante 5 min.

[072] Durante os 5 min de observação da membrana, foram analisados sinais de irritação, como hiperemia, hemorragia e coagulação sanguínea, com base no seguintes critérios:

- Hiperemia: relacionada com o aparecimento de capilares que não eram visíveis anteriormente, ou com o aumento da intensidade de cor daqueles que já eram visíveis;

- Herrorragia: relacionada com o claro extravazamento de sangue no meio;

- Coagulação sanguínea: é detectada pela agregação de plaquetas que formam uma espécie de mancha rosada sob a membrana, ou pela agregação de proteínas que confere à amostra um aspecto esbranquiçado.

[073] Cada formulação foi testada em triplicata. Uma solução de dodecil sulfato de sódio a 10% foi utilizada como controle positivo de irritação e a própria solução tampão fosfato isotônica, pH 7,4, foi utilizada como controle negativo.

[074] Uma pontuação em função do tempo de aparecimento de cada um dos sinais de irritação foi estabelecida (Tabela 6). A partir dessa pontuação, se determinou a categoria em que se insere cada uma das formulações, segundo a classificação indicada na Tabela 7.

Tabela 6. Pontuação atribuída para o aparecimento de cada sinal indicativo de irritação em função do tempo no teste de irritação in vitro em modelo organotípico HET-CAM (LUEPKE,1985).

Fenômeno _	Tempo (t)
t < 30 s	30 s < t < 2 min	2 min < t < 5 min
Hipermemia	5	3	1
Hemorragia	7	5	3
Coagulação	9	7	5

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Tabela 7. Classificação das formulações quanto ao grau de irritação de acordo com a pontuação atribuída (P) para os sinais de irritação segundo o teste de irritação in vitro em modelo organotípico HET-CAM (LUEPKE,1985).

Pontuação atribuída à amostra Classificação quanto ao grau de irritação

P < 1 Praticamente não irritante < P < 5 Ligeiramente irritante < P < 9 Moderadamente irritante

P > 9 Irritante [075] O método proposto por Luepke (1985) é aceito hoje pela legislação européia e indicado pela ANVISA (Agência de Vigilância Sanitária, Brasil) para avaliação de segurança de produtos farmacêuticos e cosméticos (VINARDELL; MITJANS, 2006). Apesar de se tratar de um método apenas qualitativo para medir o poder irritante de formulações e com baixa sensibilidade para classificar produtos moderadamente irritantes (DEBBASH et al., 2005), este tipo de ensaio vem sendo bastante utilizado por ser de simples execução e uma alternativa para ensaios de irritação ocular in vivo utilizando coelhos, bastante condenado atualmente pela comunidade científica.

[076] A Tabela 8 mostra os resultados de irritação para as formulações avaliadas segundo o ensaio de irritação in vitro em membrana corioalantóide.

Tabela 8. Classificação das formulações avaliadas segundo o ensaio de irritação in vitro em membrana corioalantóide.

Formulação

Classificação

Solução hidroalcoólica

Solução hidroalcoólica + 7,26% de micropartícula com 2,00% de MXS Gel de copolímero tribloco

Gel de copolímero tribloco + 2,00% de

MXS

Ligeiramente irritante

Ligeiramente irritante

Ligeiramente irritante

Ligeiramente irritante

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21/24 [077] Todos as formulações testadas, na presença ou ausência de MXS livre e microparticulado apresentaram-se como sistemas ligeiramente irritantes segundo a metodologia proposta, por não causarem nenhum tipo de hemorragia ou coagulação após 5 min de contato com a CAM. A única alteração que se observou após aplicação de todas elas foi uma hiperemia após 30 s de contato com a CAM.

Estudos in vitro de permeação cutânea passiva e iontoforética do MXS partir de uma suspensão contendo a micropartícula de quitosana [078] Os estudos de permeação passiva e iontoforética do MXS a partir das micropartículas de quitosana obtidas foram procedidos utilizando-se células de difusão iontoforéticas verticais (LG-1088-IC- Laboratory Glass Apparatus INC, USA). No caso dos estudos envolvendo a iontoforese, utilizou-se os eletrodos de Ag/AgCl, aplicando-se a densidade de corrente igual a 0,5 mA/cm² [079] A célula de difusão foi montada com a pele da orelha de porco dermatomizada separando os compartimentos superior do inferior. Aos compartimentos dos eletrodos, na metade superior da célula, foram adicionados 1 g de uma suspensão hidroalcoólica (60% de etanol em água) contendo 7,26% das micropartículas MP05 de MXS e 89,5 mM de NaCl, pH 5,5, no ânodo (compartimento do eletrodo positivo) e 1 mL de uma solução tampão HEPES isotonizado, pH 7,4, no cátodo (compartimento do eletrodo negativo). A permeação passiva do MXS a partir da micropartícula foi realizada sem que houvesse a passagem da corrente elétrica.

[080] A solução receptora foi mantida a 37°C e agitada a 350 rpm por 6 h. As portas de perfusão das células de difusão foram obstruídas, já que não se realizou coleta nestes experimentos. As quantidades de fármaco presente na solução receptora ao final do experimento e a extraída da pele foram quantificadas por CLAE.

[081] Para fins de controle, também foram realizados experimentos de permeação passiva e iontoforética anódica de uma solução de MXS a 2,0%, pH 5,5, em solução hidroalcoólica, da mesma forma que os citados anteriormente.

[082] Conforme já foi discutido, com a obtenção de micropartículas contendo o MXS, espera-se obter um sistema que além de proteger o fármaco, por sua uniformidade de tamanho na ordem de micrômetros, atinja as camadas mais profundas da pele pela via transfolicular, o que garante uma terapia mais

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22/24 efetiva ao passo que o fármaco será liberado diretamente no local de ação. Além disso, é esperado que este sistema microparticulado consiga sustentar a liberação do MXS de modo a torná-la mais constante e diminuir, assim, o número de aplicação da formulação pelo paciente bem como efeitos sistêmicos que este fármaco pode causar.

[083] A permeação e retenção cutânea do MXS a partir da micropartícula de quitosana (MP05) suspensa em uma solução hidroalcoólica contendo 60% de etanol absoluto, pH 5,5, foram desta forma verificadas com o intuito de analisar se este sistema é mesmo capaz de controlar a liberação do fármaco, restringindo seu fluxo através da pele e aumentando sua retenção.

[084] Desta forma, a permeação e retenção cutânea passiva do MXS foi investigada após 6 e 24 h de contato da formulação (solução hidroalcoólica contendo 60% de etanol) contendo as micropartículas com 2,0% de MXS com a pele, e comparada à permeação e retenção cutânea do MXS livre incorporado na mesma formulação. Fica evidente que as micropartículas de quitosana conseguiram retardar a liberação do MXS através da pele, já que diminiu em 20 vezes a quantidade do fármaco que atravessou a pele após 6 h de experimento e, mesmo após 24 h, a quantidade permeada do fármaco a partir das micropartículas foi 2,3 vezes menor que a quantidade permeada em 6 h a partir da solução contendo o fármaco livre (figuras 4 e 5).

[085] O sistema microparticulado foi capaz de reter quantidades 66% maiores do fármaco na pele após 6 h de experimento, e que após 24 h esta quantidade de MXS na pele foi triplicada. A partir destes experimentos é possível afirmar que as micropartículas de quitosana de fato conseguem sustentar a liberação do MXS, diminuindo o fluxo de fármaco através da pele, e fazendo inclusive com que este fármaco fique retido em maiores quantidades na pele, que é o seu sítio de ação, o que deve melhorar a terapia tópica da alopécia androgênica.

[086] As micropartículas de quitosana contendo o MXS contém um residual de cargas positivas ao seu redor. Baseado nisto, e no fato de que em pH 5,5 a aplicação de uma corrente elétrica fraca sobre a pele gera um fluxo convectivo de solvente para o seu interior, a iontoforese anódica das micropartículas a partir de sua suspensão em solução hidroalcoólica, pH 5,5,

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23/24 também foi verificada na tentativa de aumentar ainda mais o seu transporte para dentro do folículo piloso.

[087] Com a aplicação da iontoforese, a quantidade de MXS que atravessou a pele a partir das micropartículas foi aumentada, se comparado à permeação passiva das mesmas partículas. No entanto, esta quantidade de fármaco que atravessa a pele é ainda maior quando o fármaco é administrado em sua forma livre, não encapsulada, tanto passivamente quanto por iontoforese anódica. Assim, a iontoforese anódica das micropartículas ainda consegue restringir o fluxo de MXS que atravessa a pele. Parece, no entanto, que esta restrição está mais relacionada com a velocidade de liberação do ativo da partícula do que com a transposição da pele pela mesma. Ou seja, pode-se observar que metade do conteúdo de MXS é liberado da micropartícula em 6 h e a quantidade de MXS que atravessa a pele por iontoforese a partir da micropartícula corresponde a 50% da quantidade de MXS livre permeado.

[088] A iontoforese das micropartículas conseguiu duplicar a quantidade de MXS que ficou retido na pele quando comparado ao estudo de retenção das micropartículas administradas passivamente. Esses resultados indicam que a iontoforese facilita a entrada das partículas dentro da pele, facilitando a liberação do MXS encapsulado nelas neste tecido. A iontoforese do ativo livre leva ainda a uma maior retenção do fármaco relacionada com o grande fluxo dele através da pele, o qual pode levar a efeitos colaterais sistêmicos.

[089] A partir desses resultados obtidos, temos resumidamente que:

- As micropartículas de quitosana contendo o MXS obtidas por spray drying a partir de uma formulação contendo 1,50 g de quitosana e 0,75 g de MXS apresentaram bom rendimento de obtenção (aproximadamente 40%), alta eficiência de encapsulação (~82%), diâmetro médio satisfatório (3,05 pm) e morfologia esférica e sem porosidades. Além disso, apresentaram um potencial zeta de 5,87 mV;

- Após uma hora de contato com a água, as micropartículas de quitosana contendo o MXS intumesceram, aumentando o seu tamanho aproximadamente

1,5 vezes;

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- As micropartículas de quitosana foram capazes de sustentar a liberação do fármaco em aproximadamente 5 vezes;

- As micropartículas de quitosana contendo o MXS foram homogeneamente suspensas em solução hidroalcoólica, pH 5,5, e este sistema apresentou um valor condutividade elétrica alta, possibilitando a passagem da corrente elétrica durante a iontoforese;

- As micropartículas de quitosana retiveram grandes quantidades do MXS na pele passivamente, o qual foi liberado muito lentamente para a solução receptora. A iontoforese anódica foi capaz de reter quantidades 2 vezes maiores de fármaco na pele.

[090] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outros variantes, abrangidos no escopo das reivindicações anexas.

Claims (5)

1. MICROPARTÍCULAS caracterizadas por compreender:

a) de 25 a 50% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidinopirimidina e/ou seus sais e derivados;

b) de 50 a 75% de quitosana.

2. MICROPARTÍCULAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidino-pirimidina e/ou seus sais e derivados estarem localizados no interior das micropartículas.

3. PROCESSO DE PRODUÇÃO DE MICROPARTÍCULAS, conforme definidas nas reivindicações 1 a 2, pela técnica de spray drying, caracterizado por consistir na encapsulação de minoxidil e ou seus sais e derivados (MXS) utilizando quitosana, conforme as seguintes etapas:

a. Dissolver em uma solução aquosa de ácido acético 1 % (p/p) de 25 a 50% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidinopirimidina (minoxidil) e/ou seus sais (minoxidil sulfato -MXS) e derivados com quitosana com 50 a 75% de quitosana (médio peso molecular, 85% de desacetilação);

b. Submeter a solução obtida na etapa a. ao equipamento de spray dryer, sendo utilizado um atomizador pressurizado de 1,0 mm a um fluxo de passagem de 6 mL/min;

c. Submeter o produto obtido na etapa b. ao fluxo de ar de secagem numa taxa de 300nL/h, com temperatura de saída do ar de 85^oC.

4. COMPOSIÇÃO COMPREENDENDO MICROPARTÍCULAS, obtidas conforme processo definido na reivindicação 3, caracterizada por compreender:

a) de 0,5% a 5% de 6-amino-1,2-dihidro-1-hidroxi-2-imino-4-piperidinopirimidina e/ou seus sais e derivados;

b) de 0,5% a 15% de quitosana;

c) veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela composição ser para uso tópico.