BRPI0901254B1 - Processo de produção de etanol com leveduras saccharomyces geneticamente modificadas - Google Patents

Abstract

processo para modificar geneticamente leveduras saccharomyces, e seu uso em processos fermentativos de produção de metabólitos. a presente invenção refere-se a um processo de modificação genética de leveduras saccharomyces através da técnica de engenharia genômica, de forma a modificar os genes suo dos cromossomas da levedura, genes estes que codificam para a enzima invertase responsável pela hidrólise da sacarose. o processo pode levar à deleção do gene suc, produzindo leveduras sem atividade invertase, ou pode ainda modificar a região promotora do gene suc de forma a sobre-expressar apenas a forma intracelular da invertase. as leveduras modificadas assim obtidas podem ser utilizadas em processos fermentativos de produção de metabólitos, incluindo etanol e álcool combustivel, a partir de mostos contendo sacarose, permitindo a eficiente fermentação do açúcar, com menores teores de glicose e frutose liberados no meio, graças à captação direta da sacarose para o interior das células.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção Processo de produção de etanol com leveduras Saccharomyces GENETICAMENTE MODIFICADAS

Campo da Invenção A presente invenção encontra-se no campo da engenharia genética e biotecnologia, mais precisamente na produção de metabólitos, como o etanol, utilizando-se leveduras Saccharomyces geneticamente modificadas na forma de metabolizar a sacarose. Nas leveduras modificadas geneticamente este açúcar não é hidrolisado extracelularmente, mas é transportado diretamente para o interior da célula e hidrolisado pela invertase intracelular, permitindo a eficiente produção de metabólitos, como o etanol, a partir da fermentação da sacarose pelas leveduras.

Antecedentes da Invenção O Brasil é o maior produtor do mundo de etanol obtido a partir da cana-de-açúcar, sendo a sacarose o principal açúcar presente no caldo de cana, mel e/ou melaços a serem fermentado pelas leveduras do gênero Saccharomyces normalmente utilizadas no processo industrial. A sacarose é um dissacarídeo formado por uma molécula de glicose ligada a uma de frutose, através de uma ligação osídica de conformação Gli α1-β2 Fru. As leveduras Saccharomyces produzem a enzima invertase (β-D-frutosidase, EC 3.2.1.2.6) que hidrolisa o dissacarídeo, produzindo glicose e frutose que podem ser prontamente fermentadas até etanol.

Nas leveduras Saccharomyces a invertase é codificada pelos genes SUC. O gene SUC2 esta presente em todas as leveduras do gênero Saccharomyces (na espécie S. cerevisiae esta localizado na região sub-telomérica do cromossomo IX), sendo que algumas leveduras S. cerevisiae podem ainda apresentar outros genes SUC encontrado nos telômeros de diferentes cromossomos: SUC1 no cromossomo VII, SUC3 no cromossomo II, SUC4 no cromossomo XIII, SUC5 no cromossomo IV e SUC7 no cromossomo VIII (NAUMOV G.I., NAUMOVA E.S., SANCHO E.D., KORHOLA, M.P. Polymeric SUC genes in natural populations of Saccharomyces cerevisiae. FEMS Microbiol. Lett. 135:31-35, 1996; KORSHUNOVA, I.V.; NAUMOVA, E.S.; NAUMOV, G.l. Comparative molecular-genetic analysis of the β-fructosidases in yeast Saccharomyces. Mol. Biol.. 39:413-419, 2005).

Estes genes SUC, que apresentam ampla homologia na seqüência de DNA, possuem 1599 nucleotídeos que codificam para uma proteína de 532 aminoácidos. Estes genes podem sintetizar duas formas da invertase: uma forma extracelular (ou periplasmática), e outra intracelular. Esta característica é conseqüência dos dois tipos de RNA mensageiros que são transcritos a partir dos genes SUC, sendo um transcrito maior (aproximadamente 1900 nucleotídeos) que contém uma seqüência responsável por codificar um peptídeo sinal (20 aminoácidos) responsável por direcionar a secreção da proteína para fora da célula (no espaço periplasmático), e um outro transcrito menor (aproximadamente 1800 nucleotídeos) sem essa seqüência sinalizadora, que portanto permite a síntese da enzima intracelular. Esta forma intracelular é constantemente produzida pelas células, mas geralmente constitui menos de 5-10% da atividade invertase total nas leveduras. Cabe salientar que ambas enzimas (intra- e extracelular) possuem as mesmas propriedades enzimáticas, incluindo pH e temperatura ótima de funcionamento (GROSSMANN M.K., ZIMMERMANN F.K. The structural genes of internai invertases on Saccharomyces cerevisiae. Mol. Gen. Genet. 175:223-229, 1979; CARLSON M., BOTSTEIN D. Two differentially regulated mRNAs with different 5' ends encode secreted and intracellular forms of yeast invertase. Cell 28:145-154, 1982; WILLIAMS R.S., TRUMBLY R.J., MACCOLL R„ TRIMBLE R.B., MALEY F. Comparative properties of amplified externai and internai invertase from the yeast SUC2 gene. J. Biol. Chem. 260:13334-13341, 1985).

Nas condições industriais, a forma e velocidade de alimentação do mosto, associadas à rápida hidrólise da sacarose pela invertase extracelular, podem resultar em altas concentrações de glicose e frutose no meio de fermentação. Isso produz um severo estresse osmótico e causa alterações significativas na expressão de genes, no gasto energético, na produção de glicerol e succinato, diminuindo o rendimento da fermentação (TAKESHIGE K., OUCHI K. Effects of yeast invertase on ethanol production in molasses. J. Ferment. Bioeng. 79:513-515, 1995; MYERS D.K., LAWLOR D.T.M., ATTFIELD P.V. Influence of invertase activity and glycerol synthesis and retention on fermentation of media with a high sugar concentration by Saccharomyces cerevisiae. Appl. Environ. Microbiol. 63:145-150, 1997; ERASMUS D.J., VAN DER MERWE G.K., VAN VUUREN H.J.J. Genome-wide expression analyses: metabolic adaptation of Saccharomyces cerevisiae to high sugar stress. FEMS Yeast Res. 3:375-399, 2003). Além disso, algumas linhagens de Saccharomyces não conseguem captar eficientemente a frutose do meio, o que muitas vezes leva à fermentação incompleta deste açúcar e perdas na produção de álcool (BERTHELS N.J., OTERO R.R.C., BAUER F.F., THEVELEIN J.M., PRETORIUS I.S. Discrepancy in glucose and fructose utilization during fermentation by Saccharomyces cerevisiae wine yeast. FEMS Yeast Res. 4:683-689, 2004). Por outro lado, bactérias e leveduras contaminantes (não-Saccharomyces) se beneficiam utilizando preferencialmente o excesso de glicose e frutose acumulado no meio de fermentação. Por estas razões, é desejável a obtenção de cepas de leveduras capazes de fermentar sacarose sem que ocorra a hidrólise extracelular em glicose e frutose.

Embora a principal e predominante via de utilização da sacarose por Saccharomyces seja via hidrólise extracelular mediada pela invertase periplasmática, recentemente foi também descrita nestas leveduras um transportador ativo de sacarose codificado pelo gene AGT1 presente no telômero do cromossoma VII (STAMBUK B.U., BATISTA A.S., DE ARAÚJO P.S. Kinetics of active sucrose transport in Saccharomyces cerevisiae. J. Biosci. Bioeng. 89:212-214, 2000). Trabalhos subseqüentes mostraram que quando este transportador é expresso de forma constitutiva nas células, por exemplo pelo uso de uma linhagem de levedura MAL constitutiva, a sacarose é captada diretamente para o interior da célula, onde a seguir pode ser hidrolisada pela invertase intracelular, ou inclusive pela maltase (a-D-glicosidase, E.C. 3.2.1.20), permitindo assim sua fermentação (BATISTA A.S., MILETTI L.C., STAMBUK, B.U. Sucrose fermentation by Saccharomyces cerevisae lacking hexose transport. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 8:26-33, 2004; BADOTTI F., BATISTA A.S., STAMBUK B.U. Sucrose active transport and fermentation by Saccharomyces cerevisiae. Braz. Arch. Biol. Technol. 48:119-127, 2006; BADOTTI F„ DÁRIO M.G., ALVES-JR S.L., CORDIOLI M.L.A., MILETTI L.C., DE ARAÚJO P.S., STAMBUK B.U. Switching the mode of sucrose utilization by Saccharomyces cerevisiae. Microb. Cell Fact. 7:4, 2008). Cabe salientar que esta via de utilização da sacarose só é operante se o açúcar não for hidrolisado extracelularmente, pois é conhecido que a glicose e frutose gerada no exterior da célula reprimem a expressão dos genes SUC e MAL (incluindo o gene AGT1), além do transportador ser rapidamente removido da membrana plasmática e degradado. Pelo descrito acima, fica evidente que as leveduras Saccharomyces normalmente utilizam apenas a invertase extracelular para fermentar a sacarose. A literatura patentária descreve alguns documentos voltados para problemas semelhantes ao exposto na presente invenção. O documento US 7,470,831 descreve um processo para aumentar o rendimento de plantas através da expressão de proteínas relacionadas ao transporte, metabolismo e captação de sacarose. A presente invenção difere deste documento por não ser um processo voltado para aumentar o rendimento de uma planta, mas sim de ser um processo voltado a leveduras, direcionado para promover a hidrolise intracelular da sacarose e a fermentação da glicose e frutose produzidas por tais leveduras, sem que haja os inconvenientes do estado da técnica. O documento US 4,356,262 descreve um processo para produzir etanol a partir da fermentação de sacarose por leveduras, compreendendo a adição da enzima frutosil transferase. A presente invenção difere deste documento por permitir a fermentação da sacarose pela superexpressão de enzimas que captem e hidrolisem a sacarose intracelular ou pela repressão de enzimas que facilitem a hidrólise da sacarose extracelularmente. O documento WO 2008/051348 descreve um processo para a produção de etanol a partir de bactérias geneticamente modificadas, onde a modificação permite a utilização de xilose como matéria prima para produção do etanol. A presente invenção difere deste documento por utilizar leveduras geneticamente modificadas, e não bactérias e pelo processo de modificação não inserir uma proteína não pertencente ao genoma original, mas sim por superexpressar ou reprimir determinados genes já presentes no genoma da levedura. O documento US 2004/146975 descreve variantes de promotores úteis para serem utilizados em células fúngicas, com o intuito de amplificar ou reprimir a expressão de determinada proteína. Tal documento é focado principalmente na utilização do fungo Fusarium venenatum. A presente invenção difere deste documento por ser voltada principalmente para uso em Saccharomyces cerevisiae e por revelar um novo processo para a produção de etanol.

Portanto, pode-se ver pelos documentos do estado da técnica citados acima, que não há nenhuma anterioridade que descreve ou sequer sugira a utilização de mecanismos genéticos para favorecer a hidrólise de sacarose intracelular em leveduras, bem como a produção de metabólitos como o etanol a partir da fermentação de sacarose hidrolisada intracelularmente, de forma que a presente invenção possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

Objeto da Invenção A presente invenção tem como objetivo modificar geneticamente leveduras Saccharomyces na sua forma de utilização da sacarose, modificação realizada pela técnica denominada engenharia genômica, o que torna as alterações estáveis no genoma das leveduras (um pré-requisito para uso das leveduras em meios industriais). As leveduras modificadas apresentaram rendimentos em metabólitos comercialmente desejados, como o etanol, a partir da sacarose maiores do que os obtidos com leveduras não modificadas, com alta produtividade, além de ter a vantagem de não produzirem glicose ou frutose no caldo de fermentação. É, portanto um objeto da presente invenção um processo de modificação das leveduras compreendendo as etapas de: a) silenciar genes responsáveis pela expressão de invertase extracelular e/ou superexpressar genes responsáveis pela expressão de invertase intracelular; e b) cultivar as leveduras modificadas.

Em uma realização preferencial, o silenciamento é alcançado através da substituição da sequência do gene da invertase extracelular por qualquer outra seqüência que codifique uma proteína com atividade diferente de invertase extracelular.

Em uma realização preferencial, a superexpressão da invertase intracelular é alcançada com a remoção da seqüência do peptídeo sinal. É um adicional objeto da presente invenção um processo de produção de metabólitos compreendendo as etapas de: a) cultivar uma levedura modificada na presença de sacarose; e b) extrair o metabólito obtido; onde a levedura modificada é uma levedura capaz de realizar a hidrólise de sacarose intracelularmente.

Preferencialmente, a levedura modificada possui elevados níveis de invertase intracelular.

Breve Descrição das Figuras Para completar a descrição da idéia inventiva e com o objetivo de facilitar a compreensão de suas características é apresentada uma série de figuras com caráter ilustrativo e não limitativo: Figura 1. Esquema mostrando a estrutura geral dos genes SUC, incluindo os elementos genéticos da região promotora e ativadora da transcrição (UAS), bem como a seqüência de DNA na região do início do gene, e correspondentes aminoácidos presentes na proteína. A invertase extracelular é sintetizada a partir da primeira metionina presente no gene (os códons para metionina estão destacados em negrito). No caso da invertase intracelular a síntese da proteína começa na segunda metionina presente no gene, portanto sem a seqüência do peptídeo sinal (primeiros 20 aminoácidos, sublinhados) que normalmente promove a secreção da enzima.

Figura 2. Esquema resumido mostrando a estratégia utilizada para modificar as leveduras através da técnica de engenharia genômica, permitindo a deleção do gene da invertase pela troca com a seqüência de um gene marcador, ou a inserção no genoma de uma seqüência promotora forte e constitutiva à frente do gene da invertase, modificando a expressão desta enzima. Estão também mostradas as possíveis localizações das seqüências iniciadoras utilizadas na confirmação das modificações no genoma da levedura por PCR.

Figura 3. A) Níveis de atividade invertase extracelular e B) atividade invertase intracelular em leveduras pré crescidas em meio rico YP contendo 2% sacarose como fonte de carbono da linhagem selvagem CEN.PK2-1C não modificada (barras brancas), da levedura geneticamente modificada MGD-01 sem invertase (barras cinzas), ou na levedura geneticamente modificada BSY21-34B que sobre-expressam a forma intracelular da invertase (barras pretas).

Figura 4. Perfil de consumo de 20 g de sacarose por litro, e conseqüente produção de glicose, frutose e etanol, durante a fermentação em batelada utilizando 10 g por litro de leveduras pré crescidas em meio rico YP contendo 2% sacarose como fonte de carbono, por leveduras da linhagem CEN.PK2-1C selvagem não modificada (quadrados), por leveduras geneticamente modificadas MGD-01 sem invertase (círculos), e por leveduras geneticamente modificadas BSY21-34B que sobre-expressam a forma intracelular da invertase (triângulos).

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Descrição Detalhada da Invenção Os exemplos aqui descritos tem o intuito apenas de exemplificar as realizações preferenciais da invenção, e portanto não devem ser encarados de forma restritiva, mas sim meramente ilustrativa.

Para efeitos da presente invenção entende-se por “silenciamento” o processo capaz de reduzir a níveis indetectáveis a expressão de determinada proteína por uma célula. Particularmente, a presente invenção silencia o gene da invertase através da recombinação homóloga, substituindo o referido gene por um gene diferente, como por exemplo, um gene marcador que confere resistência a um antibiótico, ou um gene que restaura um requerimento nutricional na levedura.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por “superexpressão” o processo capaz de aumentar a expressão de determinada proteína de forma que a concentração final de tal proteína seja maior do que a concentração normalmente encontrada. A superexpressão da presente invenção é alcançada pela alteração do peptídeo sinal e/ou modificação do promotor. O termo “promotor” é definido como uma seqüência de DNA capaz de se ligar à RNA polimerase e direcioná-la corretamente para o local inicial da transcrição de uma seqüência de DNA codificante. Um exemplo de promotor particularmente útil na presente invenção é a região promotora do gene ADH1 de S. cerevisiae.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por “peptídeo sinal” a seqüência de aminoácidos capaz de direcionar a invertase traduzida para fora da célula. Em especial, tal seqüência possui 20 aminoácidos. Um exemplo preferencial de peptídeo sinal está descrito na Seq. N° 1. Entende-se por “remoção do peptídeo sinal” a alteração da seqüência inicial de aminoácidos da proteína de forma que a proteína permaneça no ambiente intracelular.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por metabólitos os produtos da fermentação da levedura. Exemplos de metabólitos incluem, sem limitações, etanol, proteínas heterólogas, fármacos (como por exemplo insulina, taxol, artemisina), biocombustíveis, e biomassa. A expressão etanol, ao longo do texto deve ser entendida como metabólito e pode ser trocada por qualquer outro metabólito adequado de acordo com a presente invenção. O presente pedido de patente de invenção refere-se a um processo de modificação genética dos genes SUC presentes no genoma das leveduras Saccharomyces (Figura 1), visando à melhor produção de etanol a partir da sacarose. O referido processo de modificação deve ser obtido pela técnica denominada de engenharia genômica, onde através de PCR (reação em cadeia da polimerase) utilizando iniciadores específicos e DNA de um plasmídeo contendo a seqüência de um gene marcador (p.ex. gene de resistência a um antibiótico, ou gene que permita crescer a levedura mesmo na ausência de úm nutriente da qual ela depende para sobreviver), e/ou o gene marcador seguido de uma região promotora forte e constitutiva (p.ex. região promotora do gene ADH1 de S. cerevisiae), é produzido um fragmento de DNA linear contendo regiões de homologia ao início e termino da região do cromossoma da levedura que se deseja modificar (Figura 2), mas especificamente em regiões do gene SUC presente no cromossoma da levedura. Este fragmento de DNA é inserido nas leveduras de interesse através de técnicas convencionais de transformação de leveduras, onde deverá inserir-se no cromossoma e/ou seqüência alvo do genoma, eventualmente levando à substituição das seqüências no genoma, através do processo natural de recombinação homologa. Esta modificação direta no cromossoma da levedura apresenta as vantagens de estabilidade genética através das gerações como conseqüência da multiplicação celular, não sendo necessário inclusive o uso de meios de cultivo seletivos para garantir a permanência da modificação na população de leveduras. O dito processo de modificação de leveduras, quando se deseja remover totalmente o gene da invertase, compreende primeiramente a obtenção por PCR de um fragmento de DNA linear contendo regiões de homologia à seqüência 5’ acima do gene SUC, seguido de um gene marcador, seguido de uma região de homologia à seqüência 3’ após o gene SUC (Figura 2). Nesta estratégia o Primer Iniciador 1 é complementar à seqüência de DNA anterior ao gene SUC, e o Primer Iniciador 2 é complementar à seqüência de DNA posterior ao gene SUC. Ao transformar as leveduras com este fragmento de DNA linear obtido por PCR, o gene marcador poderá substituir completamente o gene SUC através de recombinação homologa entre o fragmento de DNA e o cromossoma da levedura (Figura 2). A confirmação da inserção correta no genoma da levedura da seqüência de DNA utilizado na transformação pode ser realizada também através de PCR utilizando iniciadores complementares ao gene marcador (Primer Verificador R), e complementares a uma região no cromossoma da levedura numa seqüência acima do local da inserção (Primer Verificador F), como mostrado na Figura 2. O presente pedido também se refere a uma outra estratégia do processo de engenharia genômica visando modificar a região promotora do gene SUC de forma a sobre-expressar a invertase intracelular. Nesta outra estratégia primeiramente é obtido por PCR um fragmento de DNA linear contendo regiões de homologia à seqüência da região logo acima da segunda metionina do gene SUC, podendo incluir a região promotora do gene SUC, seguido de um gene marcador, seguido da região promotora de um gene constitutivo de leveduras, seguido finalmente de uma região de homologia à seqüência que se inicia na segunda metionina da seqüência do gene SUC (Figura 1 e 2). Ao transformar as leveduras com este fragmento de DNA linear obtido por PCR, e ocorrer recombinação homologa ente o fragmento de DNA e o cromossoma da levedura, a região promotora do gene SUC é modificada com a seqüência do gene marcador seguida de uma seqüência promotora forte e constitutiva (Figura 2). Esta nova seqüência promotora ira regular e promover a síntese de um RNA mensageiro contendo a informações para a síntese da invertase sem o peptídeo sinal (sem os 20 primeiros aminoácidos, vide a Seq. N° 1), mas com uma seqüência de aminoácidos que começa na segunda metionina prevista na seqüência dos genes SUC, portanto levando à produção de apenas a forma intracelular da enzima. A confirmação da inserção correta no genoma da levedura da seqüência de DNA utilizado na transformação pode ser realizada através de PCR utilizando iniciadores complementares ao gene marcador e a ■ ■'/ uma região no cromossoma da levedura na região 5’ acima do local da ' inserção como descrito acima; e/ou também com iniciadores complementares à seqüência do gene SUC após o local da inserção do fragmento de DNA linear (Primer Verificador R), e um outro iniciador correspondente à seqüência do promotor e/ou gene marcador utilizado na transformação das leveduras (Primer Verificador F), como mostrado na Figura 2.

Em uma primeira realização, o processo de modificação da levedura visando à deleção do gene SUC permitiu obter uma linhagem sem atividade invertase, mas capaz de crescer em meios contendo sacarose como fonte de carbono, fermentando o açúcar com elevado rendimento quando comparado com leveduras sem a modificação do gene SUC, leveduras portanto com atividade invertase extracelular normal.

Em uma segunda realização, a região promotora do gene SUC foi modificada permitindo a obtenção de uma linhagem de levedura que sobre-expressa apenas a forma intracelular da invertase, linhagem esta capaz de crescer em meios contendo sacarose como fonte de carbono e fermentando altas concentrações do açúcar com elevado rendimento quando comparado com leveduras sem a modificação do gene SUC, leveduras, portanto com atividade invertase extracelular normal, ou inclusive quando comparado com linhagens sem atividade invertase pela deleção do gene SUC do genoma como descrito acima. O presente pedido de patente também se refere à obtenção de linhagens de levedura diplóides (com conjunto de cromossomas nucleares duplicados) contendo as modificações nos genes SUC descritos acima. Outro objeto do presente pedido trata do uso das diferentes linhagens de levedura geneticamente modificadas em processos de produção de etanol a partir de mostos contendo sacarose, podendo ser utilizados caldo de cana, mel de cana, melaço (e misturas destes), além de outros. Os exemplos descritos a seguir, ilustram os objetos contidos no presente pedido de patente de forma não limitativa.

Exemplo 1: Para a obtenção de uma linhagem de levedura geneticamente modificada sem atividade invertase foi obtido um fragmento de DNA por PCR utilizando-se um Primer Iniciador 1 específico (Seq. N° 2) contendo parte (40 nucleotídeos) da seqüência de DNA anterior ao gene SUC, e um Primer Iniciador 2 específico (Seq. N° 3) contendo parte (40 nucleotídeos) da seqüência de DNA complementar à seqüência após o final do gene SUC. Estes iniciadores incluem uma seqüência de 20 nucleotídeos (em itálico nas Seq. N° 2 e 3) que permitirão amplificar um gene marcador, por exemplo, o gene Karí de Escherichia coli que confere resistência ao antibiótico geneticina, gene presente no plasmídeo pFA6a-kanMX6 (PETRACEK M.E., LONGTINE M.S. PCR-based engineering of yeast genome. Meth. Enzymol. 350: 445-469, 2002).

Os fragmentos de DNA linear obtidos através de técnicas convencionais de PCR, e apresentando o tamanho esperado (1623 nucleotídeos), foram utilizados para transformar células da linhagem de S. cerevisiae CEN.PK2-1C (genótipo: MATa MAL2-8C AGT1 SUC2 ura3-52 his3A1 Ieu2-3,112 trp1-289) utilizando técnicas convencionais de transformação de leveduras com cloreto de lítio. Após o passo acima, a seleção das leveduras modificadas geneticamente foi feita inoculando-se as leveduras em meio rico YP contendo 2% glicose como fonte de carbono e 100 a 1000 mg de Geneticina por litro.

Linhagens que apresentaram crescimento nos meios contendo geneticina tiveram seu DNA extraído, e a confirmação por PCR da substituição do gene SUC2 presente no genoma da linhagem CEN.PK2-1C pelo gene Karí foi realizada utilizando o Primer Verificador R1 (Seq. N° 4), complementar à seqüência de 845 a 828 nucleotídeos no gene Karí, e o Primer Verificador F1 (Seq. N° 5) correspondente à região de -447 a -428 nucleotídeos anteriores ao códon de início da tradução do gene SUC2 no genoma da levedura. Um fragmento de 1292 nucleotídeos, assim obtido, corresponde ao produto esperado para uma levedura geneticamente modificada, enquanto que a partir do DNA da linhagem CEN.PK2-1C não foi possível obter nenhum fragmento de DNA por PCR usando estes iniciadores.

Numa outra abordagem para confirmar a modificação genética da levedura, o DNA extraído das células é utilizado para uma reação de PCR usando o mesmo Primer Verificador F1 descrito acima, em conjunto com o Primer Verificador R2 (Seq. N° 6) para o gene SUC2, complementar à seqüência de 942 a 925 nucleotídeos do gene SUC2 no genoma da levedura. Neste caso a obtenção de um fragmento de 1392 nucleotídeos com o DNA da linhagem selvagem CEN.PK2-1C, e não a partir do DNA da levedura geneticamente modificada, confirma a substituição o gene SUC2 pelo gene Karí no cromossoma da levedura modificada.

Exemplo 2: Para a obtenção de uma linhagem de levedura geneticamente modificada que sobre-expresse apenas a forma intracelular da invertase foi obtido um fragmento de DNA por PCR utilizando-se um Primer Iniciador 3 específico (Seq. N° 7) contendo parte (40 nucleotídeos) da seqüência de DNA do gene SUC (nucleotídeos 21 a 60) na região anterior ao códon que codifica para a segunda metionina da seqüência de aminoácidos da invertase (Figura 1), e um Primer Iniciador 4 específico (Seq. N° 8) contendo parte (40 nucleotídeos) da seqüência de DNA complementar à seqüência que se inicia com o códon que codifica para a segunda metionina da seqüência de aminoácidos da invertase codificada pelos genes SUC (nucleotídeos 100 a 61 da seqüência do gene SUC, vide Figura 1). Estes iniciadores incluem uma seqüência de 20 nucleotídeos (em itálico nas Seq. N° 7 e 8) que permitirão amplificar um gene marcador, por exemplo, o gene TRP1 de S. cerevisiae que permite às leveduras CEN.PK2-1C crescerem em meios sem triptofano, seguido da região promotora do gene ADH1 de S. cerevisiae, ambos elementos presentes no plasmídeo pFA6a-TRP1-PADH1 (PETRACEK M.E., LONGTINE M.S. PCR-based engineering of yeast genome. Meth. Enzymol. 350: 445-469, 2002).

Os fragmentos de DNA linear obtidos através de técnicas convencionais de PCR, e apresentando o tamanho esperado (1725 nucleotídeos), foram utilizados para transformar células da linhagem de S. cerevisiae CEN.PK2-1C descrita acima utilizando técnicas convencionais de transformação de leveduras com cloreto de lítio. Após o passo acima, a seleção das leveduras modificadas geneticamente é feita inoculando-se as leveduras em meio sintético YNB contendo todos os aminoácidos e bases nitrogenadas necessárias para o crescimento da levedura, mas sem triptofano.

Linhagens que apresentaram crescimento nos meios sem triptofano tiveram seu DNA extraído, e a confirmação da substituição do promotor e seqüência sinal do gene SUC2 presente no genoma da linhagem CEN.PK2-1C pelo promotor forte e constitutivo do gene ADH1, promovendo a síntese de apenas a invertase intracelular, foi realizado utilizando-se PCR e o Primer Verificador R2 para o gene SUC2 (Seq. N° 6) descrito acima no Exemplo 1, em conjunto com o Primer Verificador F2 (Seq. N° 9) complementar à seqüência do promotor ADH1 correspondente à região de -360 a -379 nucleotídeos do códon de início da tradução do gene ADH1 de S. cerevisiae. Um fragmento de 1264 nucleotídeos, assim obtido, corresponde ao produto esperado para uma levedura geneticamente modificada, enquanto que a partir do DNA da linhagem CEN.PK2-1C não é possível obter nenhum fragmento de DNA por PCR usando estes iniciadores.

Exemplo 3: As leveduras modificadas geneticamente como descrito acima nos Exemplos 1 e 2 podem eventualmente ser cruzadas com outras leveduras, as linhagens diplóides assim obtidas esporuladas em meios de esporulação para leveduras, e os esporos haplóides resultantes analisados quanto à presença ou não das modificações genéticas introduzidas no genoma das leveduras como descrito acima. Estes esporos haplóides contendo as modificações genéticas desejadas podem eventualmente serem cruzados novamente, no intuito de obter linhagens de levedura diplóides contendo as modificações desejadas em ambos os cromossomas do genoma.

Exemplo 4: Dentre as colônias de leveduras transformadas e geneticamente modificadas nos Exemplos 1 a 2 acima descritos, foram selecionadas a linhagens MGD-01 (isogênica à CEN.PK2-1C, mas suc2:.Karí) deletada no gene SUC2, e a linhagem BSY21-34B (isogênica à CEN.PK2-1C, mas LEU2, HIS3 e TRP1-PADH1..ÍSUC2) modificada na região promotora no gene SUC2 de forma a sobre-expressar apenas a invertase intracelular. As colônias inoculadas em meio rico YP contendo 2% sacarose eram crescidas a 160 rpm por 12-18 horas a 28-30°C. Após o crescimento, as leveduras eram centrifugadas para deposição das células, e lavadas duas vezes com água gelada. A determinação da atividade invertase extracelular e invertase intracelular nas células das linhagens confirmaram os fenótipos esperados para cada modificação genética introduzida no genoma das leveduras (Figura 3), isto é, presença de invertase extracelular na linhagem CEN.PK2-1C não modificada, ausência de atividade invertase na linhagem MGD-01, e sobre-expressão da invertase intracelular na linhagem BSY21-34B. Cabe salientar que a linhagem MGD-01, apesar de não apresentar atividade invertase, consegue crescer em sacarose graças ao transporte ativo do açúcar e hidrólise da sacarose pela maltase intracelular, enzima que apresenta uma atividade de hidrólise de sacarose de 43 nmol mg'1 min'1 nesta linhagem.

Exemplo 5: As leveduras descritas no exemplo 4, inoculadas em meio rico YP contendo 2% sacarose, eram crescidas a 160 rpm por 12-18 horas a 28-30°C. Após o crescimento, as leveduras eram centrifugadas para deposição das células, e lavadas duas vezes com água gelada. A seguir estas leveduras foram utilizadas em fermentações de meios de cultivo contendo sacarose em processo de batelada utilizando altas densidades celulares (5-30 g por litro). Resultados da fermentação de 20 g de sacarose por litro, utilizando-se 10 g de levedura por litro, mostram que a levedura não modificada (linhagem CEN.PK2-1C) produz significativas quantidades de glicose e frutose no meio durante a hidrólise extracelular da sacarose, consumido todos os açúcares em aproximadamente 2 horas (Figura 4). As linhagens geneticamente modificadas MGD-01 e BSY21-34B consumiram também todo o açúcar presente no meio em aproximadamente 2 horas, com a vantagem de não produzirem quantidades significativas de glicose ou frutose no meio por que a sacarose estava sendo ativamente transportada e hidrolisada intracelularmente (Figura 4). Estas linhagens também produziram mais etanol a partir da fermentação da sacarose, quando comparado com a linhagem CEN.PK2-1C com atividade invertase não modificada.

Na Tabela 1 esta um resumo de alguns resultados médios obtidos com estas linhagens tanto durante a fermentação de relativamente baixas (20-25 g/L) concentrações de sacarose, como durante a fermentação de altas concentrações (200-250 g de sacarose por litro) do açúcar. A leveduras modificadas geneticamente consistentemente produziram mais etanol a partir da sacarose, em particular a linhagem que sobre-expressa apenas a forma intracelular da invertase em meios contendo altas concentrações de sacarose. No caso da linhagem MGD-01 sem invertase, a fermentação de altas concentrações de sacarose foi incompleta, indicando que a hidrólise intracelular medidado pela maltase não é eficiente para metabolizar altas concentrações de sacarose.

Os dados apresentados na Tabela 1 confirmam também que as linhagens modificadas geneticamente objeto do presente pedido de patente produzem significativamente menos glicose e frutose no meio durante a fermentação da sacarose pelas células de levedura, quando comparada à linhagem não modificada com invertase extracelular.

Exemplo 6: Com base nas estratégias descritas nos Exemplos 1 a 3 acima, foi desenvolvida a linhagem diplóide HCJ003 (MATa/MATa MAL2-fflMAL2-SF AGT1/AGT1 TRP1-PADH1::iSUC2/TRP1-PADH1:.iSUC2 URA3/ura3-52 HIS3/his3M LEU2ILEU2), linhagem diplóide esta, também isogênica à linhagem CEN.PK2-1C, que sobre-expressa apenas a forma intracelular da invertase. Esta linhagem diplóide modificada foi comparada com a linhagem industrial CAT-1, uma linhagem diplóide utilizada na produção de álcool combustível no Brasil. A linhagem diplóide geneticamente modificada HCJ003 fermentou a sacarose eficientemente, com a vantagem de produzir menos glicose e frutose no meio do que a linhagem industrial CAT-1 (Tabela 1). Esta linhagem HCJ003 produziu mais etanol a partir das altas concentrações de sacarose provavelmente por que as células produzem menos glicerol (~4 g/L) do que a linhagem industrial CAT-1 (~10 g/L) nas mesmas condições, um indicativo de menor estresse osmótico nas células que sobre-expressam apenas a invertase intracelular.

REIVINDICAÇÕES

Claims (3)

1. PROCESSO PARA A PRODUÇÃO DE ETANOL, caracterizado por compreender as etapas de: a) cultivar uma levedura modificada na presença de sacarose; e b) extrair o etanol obtido; onde a levedura modificada é uma cepa de levedura S. cerevisiae modificada geneticamente de forma a se obter o aumento da atividade de invertase intracelular e redução da atividade de invertase extracelular.

2. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo uso das leveduras geneticamente modificadas em processos fermentativos pelo sistema de batelada, batelada alimentada, fermentações semi-contínuas ou contínuas.

3. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE ETANOL, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por adaptações na condução do processo fermentativo visando maior rendimento e produtividade, como uma a vazão de alimentação do mosto nas dornas maior, ou altas concentrações de sacarose.