BRPI0901254A2 - processo para modificar geneticamente leveduras saccharomyces, e seu uso em processos fermentativos de produção de metabólitos - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTE LEVEDURAS SACCHAROMYCES, E SEU USO EM PROCESSOS FERMENTATIVOS DE PRODUçãO DE METABóLITOS. A presente invenção refere-se a um processo de modificação genética de leveduras Saccharomyces através da técnica de engenharia genómica, de forma a modificar os genes SUO dos cromossomas da levedura, genes estes que codificam para a enzima invertase responsável pela hidrólise da sacarose. O processo pode levar à deleção do gene SUC, produzindo leveduras sem atividade invertase, ou pode ainda modificar a região promotora do gene SUC de forma a sobre-expressar apenas a forma intracelular da invertase. As leveduras modificadas assim obtidas podem ser utilizadas em processos fermentativos de produção de metabólitos, incluindo etanol e álcool combustivel, a partir de mostos contendo sacarose, permitindo a eficiente fermentação do açúcar, com menores teores de glicose e frutose liberados no meio, graças à captação direta da sacarose para o interior das células.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

Processo para modificar geneticamente leveduras Saccharomyces, ε seuuso em processos fermentativos de produção de metabólitos

Campo da Invenção

A presente invenção encontra-se no campo da engenharia genética ebiotecnologia, mais precisamente na produção de metabólitos, como fármacose/ou etanol, utilizando-se leveduras Saccharomyces geneticamentemodificadas na forma de metabolizar a sacarose. Nas leveduras modificadasgeneticamente este açúcar não é hidrolisado extracelularmente, mas étransportado diretamente para o interior da célula e hidrolisado pela invertaseintracelular, permitindo a eficiente produção de metabólitos, como o etanol, apartir da fermentação da sacarose pelas leveduras.

Antecedentes da Invenção

O Brasil é o maior produtor do mundo de etanol obtido a partir da cana-de-açúcar, sendo a sacarose o principal açúcar presente no caldo de cana, mele/ou melaços a serem fermentado pelas leveduras do gênero Saccharomycesnormalmente utilizadas no processo industrial. A sacarose é um dissacarídeoformado por uma molécula de glicose ligada a uma de frutose, através de umaligação osídica de conformação Gli α1-β2 Fru. As leveduras Saccharomycesproduzem a enzima invertase (β-D-frutosidase, EC 3.2.1.2.6) que hidrolisa odissacarídeo, produzindo glicose e frutose que podem ser prontamentefermentadas até etanol.

Nas leveduras Saccharomyces a invertase é codificada pelos genesSUC. O gene SUC2 esta presente em todas as leveduras do gêneroSaccharomyces (na espécie S. cerevisiae esta localizado na região sub-telomérica do cromossomo IX), sendo que algumas leveduras S. cerevisiaepodem ainda apresentar outros genes SUC encontrado nos telômeros dediferentes cromossomos: SUC1 no cromossomo VII, SUC3 no cromossomo II,SUC4 no cromossomo XIII, SUC5 no cromossomo IV e SUC7 no cromossomoVlll (NAUMOV G.I., NAUMOVA E.S., SANCHO E.D., KORHOLA, M.P.Polymeric SUC genes in natural populations of Saccharomyces cerevisiae.FEMS Microbiol. Lett. 135:31-35, 1996; KORSHUNOVA, I.V.; NAUMOVA, E.S.;NAUMOV, G.l. Comparative molecular-genetic analysis of the β-fructosidasesin yeast Saccharomyces. Mol. Biol.. 39:413-419, 2005).

Estes genes SUC, que apresentam ampla homologia na seqüência deDNA1 possuem 1599 nucleotídeos que codificam para uma proteína de 532aminoácidos. Estes genes podem sintetizar duas formas da invertase: umaforma extracelular (ou periplasmática), e outra intracelular. Esta característica éconseqüência dos dois tipos de RNA mensageiros que são transcritos a partirdos genes SUC, sendo um transcrito maior (aproximadamente 1900nucleotídeos) que contém uma seqüência responsável por codificar umpeptídeo sinal (20 aminoácidos) responsável por direcionar a secreção daproteína para fora da célula (no espaço periplasmático), e um outro transcritomenor (aproximadamente 1800 nucleotídeos) sem essa seqüênciasinalizadora, que portanto permite a síntese da enzima intracelular. Esta formaintracelular é constantemente produzida pelas células, mas geralmenteconstitui menos de 5-10% da atividade invertase total nas leveduras. Cabesalientar que ambas enzimas (intra- e extracelular) possuem as mesmaspropriedades enzimáticas, incluindo pH e temperatura ótima de funcionamento(GROSSMANN M.K., ZIMMERMANN F.K. The structural genes of internaiinvertases on Saceharomyces cerevisiae. Mol. Gen. Genet. 175:223-229, 1979;CARLSON M., BOTSTEIN D. Two differentially regulated mRNAs with different5' ends encode seçreted and intracellular forms of yeast invertase. Ce//28:145-154, 1982; WILLIAMS R.S., TRUMBLY R.J., MACCOLL R., TRIMBLE R.B.,MALEY F. Comparative properties of amplified externai and internai invertasefrom the yeast SUC2 gene. J. Biol. Chem. 260:13334-13341, 1985).

Nas condições industriais, a forma e velocidade de alimentação domosto, associadas á rápida hidrólise da sacarose pela invertase extracelular,podem resultar em altas concentrações de glicose e frutose no meio defermentação. Isso produz um severo estresse osmótico e causa alteraçõessignificativas na expressão de genes, no gasto energético, na produção deglicerol e succinato, diminuindo o rendimento da fermentação (TAKESHIGE K.,OUCHI K. Effects of yeast invertase on ethanol production in molasses. J.Ferment. Bioeng. 79:513-515, 1995; MYERS D.K., LAWLOR D.T.M.,ATTFIELD P.V. Influence of invertase activity and glycerol synthesis andretention on fermentation of media with a high sugar concentration bySãccharomyees cerevisiae. Appi. Environ. Microbiol. 63:145-150, 1997;ERASMUS D.J., VAN DER MERWE G.K., VAN VUUREN H.J.J. Genome-wideexpression analyses: metabolic adaptation of Saccharomyces cerevisiae to highsugar stress. FEMS Yeast Res. 3:375-399, 2003). Além disso, algumaslinhagens de Saccharomyces não conseguem captar eficientemente a frutosedo meio, o que muitas vezes leva à fermentação incompleta deste açúcar eperdas na produção de álcool (BERTHELS N.J., OTERO R.R.C., BAUER F.F.,THEVELEIN J.M., PRETORIUS I.S. Discrepancy in glucose and fructoseutilization during fermentation by Saccharomyees cerevisiae wine yeast. FEMSYeast Res. 4:683-689, 2004). Por outro lado, bactérias e levedurascontaminantes (não-Saccharomyces) se beneficiam utilizandopreferencialmente o excesso de glicose e frutose acumulado no meio defermentação. Por estas razões, é desejável a obtenção de cepas de levedurascapazes de fermentar sacarose sem que ocorra a hidrólise extracelular emglicose e frutose.

Embora a principal e predominante via de utilização da sacarose porSaccharOmyces seja via hidrólise extracelular mediada pela invertaseperiplasmática, recentemente foi também descrita nestas leveduras umtransportador ativo de sacarose codificado pelo gene AGT1 presente notelômero do cromossoma Vll (STAMBUK B.U., BATISTA A.S., DE ARAÚJOP.S Kinetics of active sucrose transport in Saccharomyces cerevisiae. J.Biosci. Bioeng. 89:212-214, 2000). Trabalhos subseqüentes mostraram quequando este transportador é expresso de forma constitutiva nas células, porexemplo pelo uso de uma linhagem de levedura MAL constitutiva, a sacarose écaptada diretamente para o interior da célula, onde a seguir pode serhidrolisada pela invertase intracelular, ou inclusive pela maltase (a-D-glicosidase, E.C. 3.2.1.20), permitindo assim sua fermentação (BATISTA A.S.,

MILETTI L.C., STAMBUK, B.U. Sucrose fermentation by Saccharomycescerevisae Iacking hexose transpor! J. Moi Microbiol. Biotechnoi 8:26-33, 2004;

BADOTTI F., BATISTA A.S., STAMBUK B.U. Sucrose active transport andfermentation by Saccharomyees eerevisiae. Braz. Areh. Biol. Teehnol. 48:119-127, 2006; BADOTTI F., DÁRIO M.G., ALVES-JR S.L., CORDIOLI M.L.A.,

MILETTI L.C., DE ARAÚJO P.S., STAMBUK B.U. Switching the mode ofsucrose utilization by Saecharomyces eerevisiae. Mierob. Cell Faet. 7:4, 2008).Cabe salientar que esta via de utilização da sacarose só é operante se oaçúcar não for hidrolisado extracelularmente, pois é conhecido que a glicose efrutose gerada no exterior da célula reprimem a expressão dos genes SUC eMAL (incluindo o gene AGT1), além do transportador ser rapidamente removidoda membrana plasmática e degradado. Pelo descrito acima, fica evidente queas leveduras Saccharomyees normalmente utilizam apenas a invertaseextracelular para fermentar a sacarose.

A literatura patentária descreve alguns documentos voltados paraproblemas semelhantes ao exposto na presente invenção.

O documento US 7,470,831 descreve um processo para aumentar orendimento de plantas através da expressão de proteínas relacionadas aotransporte, metabolismo e captação de sacarose. A presente invenção diferedeste documento por não ser um processo voltado para aumentar o rendimentode uma planta, mas sim de ser um processo voltado a leveduras, direcionadopara promover a hidrolise intracelular da sacarose e a fermentação da glicose efrutose produzidas por tais leveduras, sem que haja os inconvenientes doestado da técnica.

O documento US 4,356,262 descreve um processo para produzir etanola partir da fermentação de sacarose por leveduras, compreendendo a adiçãoda enzima frutosil transferase. A presente invenção difere deste documento porpermitir a fermentação da sacarose pela superexpressão de enzimas quecaptem e hidrolisem a sacarose intracelular ou pela repressão de enzimas quefacilitem a hidrólise da sacarose extracelularmente.

O documento WO 2008/051348 descreve um processo para a produçãode etanol a partir de bactérias geneticamente modificadas, onde a modificaçãopermite a utilização de xilose como matéria prima para produção do etanol. Apresente invenção difere deste documento por utilizar leveduras geneticamentemodificadas, e não bactérias e pelo processo de modificação não inserir umaproteína não pertencente ao genoma original, mas sim por superexpressar oureprimir determinados genes já presentes no genoma da levedura.

O documento US 2004/146975 descreve variantes de promotores úteispara serem utilizados em células fúngicas, com o intuito de amplificar oureprimir a expressão de determinada proteína. Tal documento é focadoprincipalmente na utilização do fungo Fusarium venenatum. A presenteinvenção difere deste documento por ser voltada principalmente para uso emSaccharomyces cerevisiae e por revelar um novo processo para a produção deetanol.

Portanto, pode-se ver pelos documentos do estado da técnica citadosacima, que não há nenhuma anterioridade que descreve ou sequer sugira autilização de mecanismos genéticos para favorecer a hidrólise de sacaroseintracelular em leveduras, bem como a produção de metabólitos como o etanola partir da fermentação de sacarose hidrolisada intracelularmente, de formaque a presente invenção possui novidade e atividade inventiva frente ao estadoda técnica.

Objeto da Invenção

A presente invenção tem como objetivo modificar geneticamenteleveduras Saccharomyces na sua forma de utilização da sacarose, modificaçãorealizada pela técnica denominada engenharia genômica, o que torna asalterações estáveis no genoma das leveduras (um pré-requisito para uso dasleveduras em meios industriais). As leveduras modificadas apresentaramrendimentos em metabólitos comercialmente desejados, como o etanol, a partirda sacarose maiores do que os obtidos com leveduras não modificadas, comalta produtividade, além de ter a vantagem de não produzirem glicose oufrutose no caldo de fermentação.

É, portanto um objeto da presente invenção um processo de modificaçãodas leveduras compreendendo as etapas de:

a) silenciar genes responsáveis pela expressão de invertase extracelulare/ou superexpressar genes responsáveis pela expressão de invertaseintracelular; e

b) cultivar as leveduras modificadas.

Em uma realização preferencial, o silenciamento é alcançado através dasubstituição da seqüência do gene da invertase extracelular por qualquer outraseqüência que codifique uma proteína com atividade diferente de invertaseextracelular.

Em uma realização preferencial, a superexpressão da invertaseintracelular é alcançada Com a remoção da seqüência do peptídeo sinal.

É um adicional objeto da presente invenção um processo de produçãode metabólitos compreendendo as etapas de:

a) cultivar uma levedura modificada na presença de sacarose; e

b) extrair o metabólito obtido;

onde a levedura modificada é uma levedura capaz de realizar a hidrólisede sacarose intracelularmente.

Preferencialmente, a levedura modificada possui elevados níveis deinvertase intracelular.

Breve Descrição das Figuras

Para completar a descrição da idéia inventiva e com o objetivo defacilitar a compreensão de suas características é apresentada uma série defiguras com caráter ilustrativo e não limitativo:

Figura 1. Esquema mostrando a estrutura geral dos genes SUC,incluindo os elementos genéticos da região promotora e ativadora datranscrição (UAS)1 bem como a seqüência de DNA na região do início do gene,e correspondentes aminoácidos presentes na proteína. A invertase extracelularé sintetizada a partir da primeira metionina presente no gene (os códons parametionina estão destacados em negrito). No caso da invertase intracelular asíntese da proteína começa na segunda metionina presente no gene, portantosem a seqüência do peptídeo sinal (primeiros 20 aminoácidos, sublinhados)que normalmente promove a secreção da enzima.

Figura 2. Esquema resumido mostrando a estratégia utilizada paramodificar as leveduras através da técnica de engenharia genômica, permitindoa deleção do gene da invertase pela troca com a seqüência de um genemarcador, ou a inserção no genoma de uma seqüência promotora forte econstitutiva à frente do gene da invertase, modificando a expressão destaenzima. Estão também mostradas as possíveis localizações das seqüênciasiniciadoras utilizadas na confirmação das modificações no genoma da leveduraporPCR.

Figura 3. A) Níveis de atividade invertase extracelular e B) atividadeinvertase intracelular em leveduras pré crescidas em meio rico YP contendo2% sacarose como fonte de carbono da linhagem selvagem CEN.PK2-1C nãomodificada (barras brancas), da levedura geneticamente modificada MGD-01sem invertase (barras cinzas), ou na levedura geneticamente modificadaBSY21-34B que sobre-expressam a forma intracelular da invertase (barraspretas).

Figura 4. Perfil de consumo de 20 g de sacarose por litro, econseqüente produção de glicose, frutose e etanol, durante a fermentação embatelada utilizando 10 g por litro de leveduras pré crescidas em meio rico YPcontendo 2% sacarose como fonte de carbono, por leveduras da linhagemCEN.PK2-1C selvagem não modificada (quadrados), por levedurasgeneticamente modificadas MGD-01 sem invertase (círculos), e por levedurasgeneticamente modificadas BSY21-34B que sobre-expressam a formaintracelular da invertase (triângulos).Descrição Detalhada da Invenção

Os exemplos aqui descritos tem o intuito apenas de exemplificar asrealizações preferenciais da invenção, e portanto não devem ser encarados deforma restritiva, mas sim meramente ilustrativa.

Para efeitos da presente invenção entende-se por "silenciamento" oprocesso capaz de reduzir a níveis indetectáveis a expressão de determinadaproteína por uma célula. Particularmente, a presente invenção silencia o geneda invertase através da recombinação homóloga, substituindo o referido genepor um gene diferente, como por exemplo, um gene marcador que confereresistência a um antibiótico, ou um gene que restaura um requerimentonutricional na levedura.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por "superexpressão" oprocesso capaz de aumentar a expressão de determinada proteína de formaque a concentração final de tal proteína seja maior do que a concentraçãonormalmente encontrada. A superexpressão da presente invenção é alcançadapela alteração do peptídeo sinal e/ou modificação do promotor.

O termo "promotor" é definido como uma seqüência de DNA capaz de seligar à RNA polimerase e direcioná-la corretamente para o local inicial datranscrição de uma seqüência de DNA codificante. Um exemplo de promotorparticularmente útil na presente invenção é a região promotora do gene ADH1de S. cerevisiae.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por "peptídeo sinal" aseqüência de aminoácidos capaz de direcionar a invertase traduzida para forada célula. Em especial, tal seqüência possui 20 aminoácidos. Um exemplopreferencial de peptídeo sinal está descrito na Seq. N0 1. Entende-se por"remoção do peptídeo sinal" a alteração da seqüência inicial de aminoácidos daproteína de forma que a proteína permaneça no ambiente intracelular.

Para efeitos da presente invenção, entende-se por metabólitos osprodutos da fermentação da levedura. Exemplos de metabólitos incluem, semlimitações, etanol, proteínas heterólogas, fármacos (como por exemplo insulina,taxòl, artemisina), biocombustíveis, e biomassa. A expressão etanol, ao longodo texto deve ser entendida como metabólito e pode ser trocada por qualqueroutro metabólito adequado de acordo com a presente invenção.

O presente pedido de patente de invenção refere-se a um processo demodificação genética dos genes SUC presentes no genoma das levedurasSaccharomyces (Figura 1), visando à melhor produção de etanol a partir dasacarose. O referido processo de modificação deve ser obtido pela técnicadenominada de engenharia genõmica, onde através de PCR (reação emcadeia da polimerase) utilizando iniciadores específicos e DNA de umplasmídeo contendo a seqüência de um gene marcador (p.ex. gene deresistência a um antibiótico, ou gene que permita crescer a levedura mesmo naausência de úm nutriente da qual ela depende para sobreviver), e/ou o genemarcador seguido de uma região promotora forte e constitutiva (p.ex. regiãopromotora do gene ADH1 de S. cerevisiae), é produzido um fragmento de DNAlinear contendo regiões de homologia ao início e termino da região docromossoma da levedura que se deseja modificar (Figura 2), masespecificamente em regiões do gene SUC presente no cromossoma dalevedura. Este fragmento de DNA é inserido nas leveduras de interesse atravésde técnicas convencionais de transformação de leveduras, onde deverá inserir-se no cromossoma e/ou seqüência alvo do genoma, eventualmente levando àsubstituição das seqüências no genoma, através do processo natural derecombinação homologa. Esta modificação direta no cromossoma da leveduraapresenta as vantagens de estabilidade genética através das gerações comoconseqüência da multiplicação celular, não sendo necessário inclusive o uso demeios de cultivo seletivos para garantir a permanência da modificação napopulação de leveduras.

O dito processo de modificação de leveduras, quando se deseja removertotalmente o gene da invertase, compreende primeiramente a obtenção porPCR de um fragmento de DNA linear contendo regiões de homologia àseqüência 5' acima do gene SUC, seguido de um gene marcador, seguido deuma região de homologia à seqüência 3' após o gene SUC (Figura 2). Nestaestratégia o Primer Iniciador 1 é complementar à seqüência de DNA anterior aogene SUC, e o Primer Iniciador 2 é complementar à seqüência de DNAposterior ao gene SUC. Ao transformar as leveduras com este fragmento deDNA linear obtido por PCR1 o gene marcador poderá substituir completamenteo gene SUC através de recombinação homologa entre o fragmento de DNA e ocromossoma da levedura (Figura 2). A confirmação da inserção correta nogenoma da levedura da seqüência de DNA utilizado na transformação pode serrealizada também através de PCR utilizando iniciadores complementares aogene marcador (Primer Verificador R), e complementares a uma região nocromossoma da levedura numa seqüência acima do local da inserção (PrimerVerificador F), como mostrado na Figura 2.

O presente pedido também se refere a uma outra estratégia do processode engenharia genômica visando modificar a região promotora do gene SUCde forma a sobre-expréssar a invertase intracelular. Nesta outra estratégiaprimeiramente é obtido por PCR um fragmento de DNA linear contendo regiõesde homologia à seqüência da região logo acima da segunda metionina do geneSUC, podendo incluir a região promotora do gene SUC, seguido de um genemarcador, seguido da região promotora de um gene constitutivo de leveduras,seguido finalmente de uma região de homologia à seqüência que se inicia nasegunda metionina da seqüência do gene SUC (Figura 1 e 2). Ao transformaras leveduras com este fragmento de DNA linear obtido por PCR1 e ocorrerrecombinação homologa ente o fragmento de DNA e o cromossoma dalevedura, a região promotora do gene SUC é modificada com a seqüência dogene marcador seguida de uma seqüência promotora forte e constitutiva(Figura 2). Esta nova seqüência promotora ira regular e promover a síntese deum RNA mensageiro contendo a informações para a síntese da invertase semo peptídeo sinal (sem os 20 primeiros aminoácidos, vide a Seq. N01), mas comuma seqüência de aminoácidos que começa na segunda metionina prevista naseqüência dos genes SUC, portanto levando à produção de apenas a formaintracelular da enzima. A confirmação da inserção correta no genoma dalevedura da seqüência de DNA utilizado na transformação pode ser realizadaatravés de PCR utilizando iniciadores complementares ao gene marcador e auma região no cromossoma da levedura na região 5' acima do local dainserção como descrito acima; e/ou também com iniciadores complementares àseqüência do gene SUC após o local da inserção do fragmento de DNA linear(Primer Verificador R), e um outro iniciador correspondente à seqüência dopromotor e/ou gene marcador utilizado na transformação das leveduras (PrimerVerificador F), como mostrado na Figura 2.

Em uma primeira realização, o processo de modificação da leveduravisando à deleção do gene SUC permitiu obter uma linhagem sem atividadeinvertase, mas capaz de crescer em meios contendo sacarose como fonte decarbono, fermentando o açúcar com elevado rendimento quando comparadocom leveduras sem a modificação do gene SUC, leveduras portanto comatividade invertase extracelular normal.

Em uma segunda realização, a região promotora do gene SUC foimodificada permitindo a obtenção de uma linhagem de levedura que sobre-expressa apenas a forma intracelular da invertase, linhagem esta capaz decrescer em meios contendo sacarose como fonte de carbono e fermentandoaltas concentrações do açúcar com elevado rendimento quando comparadocom leveduras sem a modificação do gene SUC, leveduras, portanto comatividade invertase extracelular normal, ou inclusive quando comparado comlinhagens sem atividade invertase pela deleção do gene SUC do genoma comodescrito acima.

O presente pedido de patente também se refere à obtenção delinhagens de levedura diplóides (com conjunto de cromossomas nuclearesduplicados) contendo as modificações nos genes SUC descritos acima. Outroobjeto do presente pedido trata do uso das diferentes linhagens de levedurageneticamente modificadas em processos de produção de etanol a partir demostos contendo sacarose, podendo ser utilizados caldo de cana, mel de cana,rnelaço (e misturas destes), além de outros. Os exemplos descritos a seguir,ilustram os objetos contidos no presente pedido de patente de forma nãolimitativa.Exemplo 1:

Para a obtenção de uma linhagem de levedura geneticamentemodificada sem atividade invertase foi obtido um fragmento de DNA por PCRutilizando-se um Primer Iniciador 1 específico (Seq. N0 2) contendo parte (40nucleotídeos) da seqüência de DNA anterior ao gene SUC, e um PrimerIniciador 2 específico (Seq. N0 3) contendo parte (40 nucleotídeos) daseqüência de DNA complementar à seqüência após o final do gene SUC. Estesiniciadores incluem uma seqüência de 20 nucleotídeos (em itálico nas Seq. N02 e 3) que permitirão amplificar um gene marcador, por exemplo, o gene Karíde Escherichia coli que confere resistência ao antibiótico geneticina, genepresente no plasmídeo pFA6a-kanMX6 (PETRACEK M.E., LONGTINE M.S.PCR-based engineering of yeast genome. Meth. Enzymol. 350: 445-469, 2002).

Os fragmentos de DNA linear obtidos através de técnicas convencionaisde PCR, e apresentando o tamanho esperado (1623 nucleotídeos), foramutilizados para transformar células da linhagem de S. cerevisiae CEN.PK2-1C(genótipo: MATa MAL2-8F AGT1 SUC2 ura3-52 his3A1 Ieu2-3,112 trp1-289)utilizando técnicas convencionais de transformação de leveduras com cloretode lítio. Após o passo acima, a seleção das leveduras modificadasgeneticamente foi feita inoculando-se as leveduras em meio rico YP contendo2% glicose como fonte de carbono e 100 a 1000 mg de Geneticina por litro.

Linhagens que apresentaram crescimento nos meios contendogeneticina tiveram seu DNA extraído, e a confirmação por PCR da substituiçãodo gene SUC2 presente no genoma da linhagem CEN.PK2-1C pelo gene Karífoi realizada utilizando o Primer Verificador R1 (Seq. N0 4), complementar àseqüência de 845 a 828 nucleotídeos no gene Karí, e o Primer Verificador F1(Seq. N0 5) correspondente à região de -447 a -428 nucleotídeos anteriores aocódon de início da tradução do gene SUC2 no genoma da levedura. Umfragmento de 1292 nucleotídeos, assim obtido, corresponde ao produtoesperado para uma levedura geneticamente modificada, enquanto que a partirdo DNA da linhagem CEN.PK2-1C não foi possível obter nenhum fragmento deDNA por PCR usando estes iniciadores.Numa outra abordagem para confirmar a modificação genética dalevedura, o DNA extraído das células é utilizado para uma reação de PCRusando o mesmo Primer Verificador F1 descrito acima, em conjunto com oPrimer Verificador R2 (Seq. N0 6) para o gene SUC2, complementar àseqüência de 942 a 925 nucleotídeos do gene SUC2 no genoma da levedura.

Neste caso a obtenção de um fragmento de 1392 nucleotídeos com o DNA dalinhagem selvagem CEN.PK2-1C, e não a partir do DNA da levedurageneticamente modificada, confirma a substituição o gene SUC2 pelo geneKarí no cromossoma da levedura modificada.

Exemplo 2:

Para a obtenção de uma linhagem de levedura geneticamentemodificada que sobre-expresse apenas a forma intracelular da invertase foiobtido um fragmento de DNA por PCR utilizando-se um Primer Iniciador 3específico (Seq. N0 7) contendo parte (40 nucleotídeos) da seqüência de DNAdo gene SUC (nucleotídeos 21 a 60) na região anterior ao códon que codificapara a segunda metionina da seqüência de aminoácidos da invertase (Figura1), e um Primer Iniciador 4 específico (Seq. N0 8) contendo parte (40nucleotídeos) da seqüência de DNA complementar à seqüência que se iniciacom o códon que codifica para a segunda metionina da seqüência deaminoácidos da invertase codificada pelos genes SUC (nucleotídeos 100 a 61da seqüência do gene SUC, vide Figura 1). Estes iniciadores incluem umaseqüência de 20 nucleotídeos (em itálico nas Seq. N0 7 e 8) que permitirãoamplificar um gene marcador, por exemplo, o gene TRP1 de S. cerevisiae quepermite às leveduras CEN.PK2-1C crescerem em meios sem triptofano,seguido da região promotora do gene ADH1 de S. cerevisiae, amboselementos presentes no plasmídeo pFA6a-TRP1-PADH1 (PETRACEK M.E.,LONGTINE M.S. PCR-based engineering of yeast genome. Meth. Enzymoí.350: 445-469, 2002).

Os fragmentos de DNA linear obtidos através de técnicas convencionaisde PCR, e apresentando o tamanho esperado (1725 nucleotídeos), foramutilizados para transformar células da linhagem de S. cerevisiae CEN.PK2-1Cdescrita acima utilizando técnicas convencionais de transformação deleveduras com cloreto de lítio. Após o passo acima, a seleção das levedurasmodificadas geneticamente é feita inoculando-se as leveduras em meiosintético YNB contendo todos os aminoácidos e bases nitrogenadasnecessárias para o crescimento da levedura, mas sem triptofano.

Linhagens que apresentaram crescimento nos meios sem triptofanotiveram seu DNA extraído, e a confirmação da substituição do promotor eseqüência sinal do gene SUC2 presente no genoma da linhagem CEN.PK2-1Cpelo promotor forte e constitutivo do gene ADH1, promovendo a síntese deapenas a invertase intracelular, foi realizado utilizando-se PCR e o PrimerVerificador R2 para o gene SUC2 (Seq. N0 6) descrito acima no Exemplo 1, emconjunto com o Primer Verificador F2 (Seq. N0 9) complementar à seqüência dopromotor ADH1 correspondente à região de -360 a -379 nucleotídeos do códonde início da tradução do gene ADH1 de S. cerevisiae. Um fragmento de 1264nucleotídeos, assim obtido, corresponde ao produto esperado para umalevedura geneticamente modificada, enquanto que a partir do DNA da linhagemCEN.PK2-1C não é possível obter nenhum fragmento de DNA por PCR usandoestes iniciadores.

Exemplo 3:

As leveduras modificadas geneticamente como descrito acima nosExemplos 1 e 2 podem eventualmente ser cruzadas com outras leveduras, aslinhagens diplóides assim obtidas esporuladas em meios de esporulação paraleveduras, e os esporos haplóides resultantes analisados quanto à presença ounão das modificações genéticas introduzidas no genoma das leveduras comodescrito acima. Estes esporos haplóides contendo as modificações genéticasdesejadas podem eventualmente serem cruzados novamente, no intuito deobter linhagens de levedura diplóides contendo as modificações desejadas emambos os cromossomas do genoma.

Exemplo 4:

Dentre as colônias de leveduras transformadas e geneticamentemodificadas nos Exemplos 1 a 2 acima descritos, foram selecionadas alinhagens MGD-01 (isogênica à CEN.PK2-1C, mas suc2\.Karí) deletada nogene SUC2, e a linhagem BSY21-34B (isogênica à CEN.PK2-1C, mas LEU2,HIS3 e TRP1-PADH1::iSUC2) modificada na região promotora no gene SUC2de forma a sobre-expressar apenas a invertase intracelular. As colôniasinoculadas em meio rico YP contendo 2% sacarose eram crescidas a 160 rpmpor 12-18 horas a 28-30°C. Após o crescimento, as leveduras eramcentrifugadas para deposição das células, e lavadas duas vezes com águagelada. A determinação da atividade invertase extracelular e invertaseintracelular nas células das linhagens confirmaram os fenótipos esperados paracada modificação genética introduzida no genoma das leveduras (Figura 3),isto é, presença de invertase extracelular na linhagem CEN.PK2-1C nãomodificada, ausência de atividade invertase na linhagem MGD-01, e sobre-expressão da invertase intracelular na linhagem BSY21-34B. Cabe salientarque a linhagem MGD-01, apesar de não apresentar atividade invertase,consegue crescer em sacarose graças ao transporte ativo do açúcar e hidroliseda sacarose pela maltase intracelular, enzima que apresenta uma atividade dehidrolise de sacarose de 43 nmol mg"1 min"1 nesta linhagem.

Exemplo 5:

As leveduras descritas no exemplo 4, inoculadas em meio rico YPcontendo 2% sacarose, eram crescidas a 160 rpm por 12-18 horas a 28-30°C.

Após o crescimento, as leveduras eram centrifugadas para deposição dascélulas, e lavadas duas vezes com água gelada. A seguir estas levedurasforam utilizadas em fermentações de meios de cultivo contendo sacarose emprocesso de batelada utilizando altas densidades celulares (5-30 g por litro).

Resultados da fermentação de 20 g de sacarose por litro, utilizando-se 10 g delevedura por litro, mostram que a levedura não modificada (linhagem CEN.PK2-1C) produz significativas quantidades de glicose e frutose no meio durante ahidrolise extracelular da sacarose, consumido todos os açúcares emaproximadamente 2 horas (Figura 4). As linhagens geneticamente modificadasMGD-01 e BSY21-34B consumiram também todo o açúcar presente no meioem aproximadamente 2 horas, com a vantagem de não produziremquantidades significativas de glicose ou frutose no meio por que a sacaroseestava sendo ativamente transportada e hidrolisada intracelularmente (Figura4). Estas linhagens também produziram mais etanol a partir da fermentação dasacarose, quando comparado com a linhagem CEN.PK2-1C com atividadeinvertase não modificada.

Na Tabela 1 esta um resumo de alguns resultados médios obtidos comestas linhagens tanto durante a fermentação de relativamente baixas (20-25g/L) concentrações de sacarose, como durante a fermentação de altasconcentrações (200-250 g de sacarose por litro) do açúcar. A levedurasmodificadas geneticamente consistentemente produziram mais etanol a partirda sacarose, em particular a linhagem que sobre-expressa apenas a formaintracelular da invertase em meios contendo altas concentrações de sacarose.No caso da linhagem MGD-01 sem invertase, a fermentação de altasconcentrações de sacarose foi incompleta, indicando que a hidroliseintracelular medidado pela maltase não é eficiente para metabolizar altasconcentrações de sacarose.

Os dados apresentados na Tabela 1 confirmam também que aslinhagens modificadas geneticamente objeto do presente pedido de patenteproduzem significativamente menos glicose e frutose no meio durante afermentação da sacarose pelas células de levedura, quando comparada àlinhagem não modificada com invertase extracelular.Tabela 1

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Exemplo 6:

Com base nas estratégias descritas nos Exemplos 1 a 3 acima, foidesenvolvida a linhagem diplóide HCJ003 (MATa/MATa MAL2-&IMAL2-FAGT1ÍAGT1 TRP 1-PADH1:\iSUC2/ TRP 1-PADH1::iSUC2 URA3/ura3-52HIS3/his3Al LEU2ILEU2), linhagem diplóide esta, também isogênica àlinhagem CEN.PK2-1C, que sobre-expressa apenas a forma intracelular dainvertase. Esta linhagem diplóide modificada foi comparada com a linhagemindustrial CAT-1, uma linhagem diplóide utilizada na produção de álcoolcombustível no Brasil. A linhagem diplóide geneticamente modificada HCJ003fermentou a sacarose eficientemente, com a vantagem de produzir menosglicose e frutose no meio do que a linhagem industrial CAT-1 (Tabela 1). Estalinhagem HCJ003 produziu mais etanol a partir das altas concentrações desacarose provavelmente por que as células produzem menos glicerol (~4 g/L)do que a linhagem industrial CAT-1 (~10 g/L) nas mesmas condições, umindicativo de menor estresse osmótico nas células que sobre-expressamapenas a invertase intracelular.

Claims (14)

1. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES caracterizado por compreendendo asetapas dea) silenciar genes responsáveis pela expressão de invertase extracelulare/ou superexpressar genes responsáveis pela expressão de invertaseintracelular; eb) cultivar as leveduras modificadas.

2. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo silenciamento ser alcançado através da substituição dasequencia do gene da invertase extracelular por qualquer outra sequencia quecodifique uma proteína com atividade diferente de invertase extracelular.

3. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a-2, caracterizado pela obtenção de um modulo de modificação de DNA linearcontendo um gene marcador flanqueado por seqüências de homologia ao inícioe ao final do gene SUC.

4. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a-3, caracterizado pelo uso de um modulo de modificação com um genemarcador que confere resistência a um antibiótico e/ou composto tóxico, ouainda pelo uso de um gene marcador que restaura uma auxotrofia nas célulasde levedura.

5. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a-4, caracterizado pelo uso de um modulo de modificação com um genemarcador contendo nas suas extremidades seqüências específicas (porexemplo seqüências repetitivas, transposons, etc ), que permitam sua remoçãodo cromossoma da levedura pelo processo de recombinação homóloga.

6. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pela obtenção de um modulo de modificação de DNA linearcontendo um gene marcador seguido de uma seqüência de um promotor fortee constitutivo, flanqueado por uma seqüência de homologia ao início do geneSUC, anterior à segunda metionina presente na seqüência da invertase, e umaoutra seqüência correspondente à região do gene SUC a partir da segundametionina presente na seqüência da invertase.

7. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 e 6, caracterizado pela obtenção de leveduras que sobre-expressam ainvertase intracelular, pela substituição da região promotora do gene SUC docromossoma da levedura pelo gene marcador e promotor forte e constitutivopresente no modulo de modificação.

8. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 e 6 e 7, caracterizado pelo uso de um modulo de modificação com um genemarcador que confere resistência a um antibiótico e/ou composto tóxico, ouainda pelo uso de um gene marcador que restaura uma auxotrofia nas célulasde levedura.

9. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 e 6 a 8, caracterizado pelo uso de um modulo de modificação com um genemarcador contendo nas suas extremidades seqüências específicas (porexemplo seqüências repetitivas, transposons, etc.), que permitam sua remoçãodo cromossoma da levedura pelo processo de recombinação homóloga.

10. PROCESSO PARA MODIFICAR GENETICAMENTELEVEDURAS SACCHAROMYCES, de acordo com uma das reivindicações 1 a 2 e 6 a 9, caracterizado pelo uso de um modulo de modificação contendo umaregião promotora forte e constitutiva da própria levedura Saccharomyces, ouainda promotores fortes e constitutivos heterólogos obtidos de outrosorganismos.

11. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS,caracterizado por compreender as etapas de:a) cultivar uma levedura modificada na presença de sacarose; eb) extrair o metabólito obtido;onde a levedura modificada é uma levedura capaz de realizar a hidrólisede sacarose intracelularmente.

12. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS, deacordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo uso das levedurasgeneticamente modificadas em processos fermentativos pelo sistema debatelada, batelada alimentada, fermentações semi-contínuas ou contínuas.

13. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS, deacordo com a reivindicação 11, caracterizado por adaptações na condução doprocesso fermentativo visando maior rendimento e produtividade, como uma avazão de alimentação do mosto nas dornas maior, ou altas concentrações desacarose.

14. PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE METABÓLITOS, deacordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo metabólito ser escolhido dogrupo que compreende etanol, proteínas heterólogas, fármacos,biocombustíveis, biomassa e combinações dos mesmos.