BRPI0807192A2 - Planta e semente transgênicas, vetor de expressão de resistência a nematódeo, método para produzir uma planta transgênica resistente a nematódeo, e, molécula de dsrna - Google Patents

Description

“PLANTA E SEMENTE TRANSGÊNICAS, VETOR DE EXPRESSÃO DE RESISTÊNCIA A NEMATÓDEO, MÉTODO PARA PRODUZIR UMA PLANTA TRANSGÊNICA RESISTENTE A NEMATÓDEO, E, MOLÉCULA DE dsRNA”

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provisório U.S. de número de série 60/900.488 depositado aos 09 de Fevereiro de 2007 e de Pedido Provisório U.S. de número de série 60/940,090 depositado aos 25 de Maio de 2007.

CAMPO DA INVENÇÃO

A invenção refere-se ao controle de patógenos biotróficos e necrotróficos de planta. São aqui revelados métodos de produzir plantas transgênicas com resistência aumentada a patógeno, vetores de expressão compreendendo polinucleotídeos codificadores de proteínas funcionais, e plantas transgênicas e sementes geradas das mesmas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

Um dos maiores objetivos da biotecnologia de planta é a geração de plantas com novas propriedades vantajosas, por exemplo, para aumentar produtividade agrícola, para aumentar a qualidade no caso de gêneros alimentícios, ou para produzir compostos químicos ou farmacêuticos. Os mecanismos de defesa naturais da planta contra patógenos são freqüentemente insuficientes. Apenas doença fungica resulta em perdas de rendimento anuais de muitos milhões de dólares americanos.

Espécies füngicas fitopatogênicas geralmente vivem como saprófitos ou como parasitas. Fungos parasitas dependem - pelo menos durante certas fases de seu ciclo de vida - de um suprimento de substâncias ativas (por exemplo um suprimento de vitaminas, carboidratos e semelhantes) que pode ser apenas fornecido pelas células de planta vivas. Especialistas classificam alguns fungos parasitas como parasitas fungicos necrotróficos quando a infecção resulta em destruição do tecido e portanto na morte da planta. Na maioria dos casos estes fungos são apenas parasitas facultativos, porque são igualmente capazes de crescimento saprofítico sobre material de 5 planta morta ou morrendo. Parasitas fungicos biotróficos são caracterizados por uma relação simbiótica entre o parasita e o hospedeiro, pelo menos durante períodos prolongados. Enquanto o fungo retira nutrientes do hospedeiro, ele não o mata e pode de fato prevenir a morte celular. Os fungos biotróficos são em sua maioria parasitas obrigatórios, parasites. Fungos 10 semibiotróficos vivem temporariamente como biótrofos e matam o hospedeiro em um ponto no tempo mais tardio, i.e., entram em uma fase necrotrófica.

Resistência aos fungos patogênicos de planta é um processo muito complicado e complexo. Em muitos casos as reações de resistência iniciam pelo reconhecimento do fungo por um produto de gene de Resistência 15 (R) de planta. A cascata de sinalização subseqüente ocasiona reação hipersensível (HR), i.e., a expressão de proteínas que são tóxicas para os fungos, produção de espécies de oxigênio reativas e morte celular programada. A indução da HR é dependente da ativação da rota de sinalização de ácido salicílico (SA). A HR dependente de SA é uma reação de 20 defesa poderosa para defender a planta contra o ataque de patógenos biotróficos, mas ela abre a porta para a invasão de muitos patógenos necrotróficos, que dependem do tecido de hospedeiro morto. Para controlar a HR dependente de SA, plantas desenvolveram uma rede complexa de ativadores e inibidores da rota de SA. Os moduladores negativos mais 25 proeminentes da rota SA são ácido jasmônico (JA) e etileno (ET). Em adição, a própria rota de SA também modula a atividade da rota de JA/ET. Pela inibição da HR e pela ativação das fitoalexinas antimicrobianas a rota de JA/ET é uma arma importante contra o ataque de patógenos necrotróficos, que se beneficiariam da morte da célula hospedeira. Esta regulação recíproca de rotas de resistência é responsável por uma defesa equilibrada contra todos os patógenos em plantas de tipo selvagem. Por modificação genética, é possível empurrar este equilíbrio na direção de resistência contra o patógeno mais problemático, seja ele quer 5 necrotrófico quer biotrófico. Por exemplo, a sobre-expressão de um fator de transcrição, WRKY70, ocasiona resistência intensificada contra Erysiphe chicoracearum pela ativação de genes induzidos por SA. Simultaneamente a sobre-expressão de WRKY70 suprime os genes induzidos por JA/ET na planta, tomando a planta mais suscetível ao patógeno necrotrófico Alternaria 10 brassicicola.

Um segundo exemplo dos mecanismos de defesa contrastantes contra patógenos biotróficos e necrotróficos é o gene Mio. Em cevada, o locus Mlo tem sido descrito como um regulador negativo de defesa de planta. A perda, ou a perda de função, do gene Mlo causa uma resistência aumentada e, 15 acima de tudo, não-específica para espécie, por exemplo, contra um número grande de espécies de míldio. O nocaute de Mlo em cevada resulta em uma resistência de penetração profunda ao Blumeria graminis f.sp. hordei biotrófico mas também simultaneamente a planta de cevada toma-se hiper- suscetível a Magnaporthe grisea e Bipolaris sorokiniana. Adicionalmente a 20 sobre-expressão de MLO ocasiona hiper-suscetibilidade a Blumeria graminis f.sp. hordei.

Outro grupo grande de patógenos biotróficos de planta de importância agronômica enorme são os nematódeos. Nematódeos são vermes arredondados microscópicos que se alimentam nas raízes, folhas, e caules de 25 mais do que 2.000 plantações de escala, verduras/hortaliças, frutas, e plantas ornamentais, causando uma perda de plantação mundial estimada de 100 bilhões. Uma variedade de espécies de nematódeo parasita infecta plantas de colheita, incluindo nematódeo das galhas (RKN), nematódeos formadores de cisto e de lesão. Nematódeos das galhas, que são caracterizados por causarem formação de galha de raiz em sítios de alimentação, têm uma variedade de hospedeiros relativamente ampla e são portanto patogênicos em um número grande de espécies de plantas de colheita. As espécies de nematódeos formadores de cisto e de lesão têm uma variedade de hospedeiros mais limitada, mas ainda causam perdas consideráveis em plantações suscetíveis.

Nematódeos patogênicos estão presentes em todos os Estados Unidos, com as concentrações maiores ocorrendo nas regiões quentes, úmidas do Sul e do Oeste e em solos arenosos. Nematódeo de cisto de feijão-soja (Heterodera glycines), a peste mais séria das plantas de feijão-soja, foi primeiro descoberto nos Estados Unidos na Carolina do Norte em 1954. Algumas áreas estão tão intensamente infestadas por nematódeo de cisto de feijão-soja (SCN) que a produção de feijão-soja não é mais economicamente possível sem medidas de controle. Embora feijão-soja seja a plantação econômica principal atacada por SCN, parasitas SCN somam no total cinqüenta hospedeiros, incluindo plantações de campo, verduras/hortaliças, plantas ornamentais, e ervas daninhas.

Sinais de dano de nematódeo incluem atrofiamento e amarelecimento de folhas, e murchamento das plantas durante períodos quentes. Contudo, infestação de nematódeos pode causar perdas de rendimento significativas sem quaisquer sintomas óbvios de doença acima do solo. As causas primárias de redução de rendimento são devido ao dano de raiz abaixo do solo. Raízes infectadas por SCN são ananicadas ou atrofiadas. Infestação de nematódeo também pode diminuir o número de nódulos fixadores de nitrogênio sobre as raízes, e podem tomar as raízes mais suscetíveis aos ataques por outros patógenos de planta provenientes do solo.

O ciclo de vida de nematódeo tem três estágios maiores: ovo, juvenil, e adulto. O ciclo de vida varia entre espécies de nematódeos. Por exemplo, o ciclo de vida de SCN pode costumeiramente ser completado em

24 a 30 dias sob condições ótimas enquanto que outras espécies podem demorar tão longamente quanto um ano, ou mais longo, para completar o ciclo de vida. Quando os níveis de temperatura e de umidade tomam-se favoráveis no verão, nematódeos juvenis vermiformes eclodem de ovos no solo. Apenas nematódeos no estágio desenvolvente juvenil são capazes de 5 infectar raízes de feijão-soja.

O ciclo de vida de SCN tem sido submetido a muitos estudos, e como tal é um exemplo útil para entender um ciclo de vida de nematódeo. Após penetrarem nas raízes de feijão-soja, nematódeos juvenis SCN movem- se através da raiz até contatarem tecido vascular, em cujo momento param de 10 migrar e começam a se alimentar. Com um estilete, o nematódeo injeta secreções que modificam certas células da raiz e as transformam em sítios de alimentação especializados. As células de raiz são morfologicamente transformadas em sincícios multinucleados grandes (ou células gigantes no caso de RKN), que são usadas como uma fonte de nutrientes para os 15 nematódeos. Os nematódeos ativamente se alimentando assim roubam nutrientes essenciais da planta resultando em perda de rendimento. A medida que os nematódeos fêmeas se alimentam, se incham e eventualmente se tomam tão grandes que seus corpos rompem o tecido da raiz e são expostos sobre a superfície da raiz.

Após um período de alimentação, nematódeos SCN machos,

que não estão inchados como adultos, migram para fora da raiz para dentro do solo e fertilizam as fêmeas adultas aumentadas. Os machos então morrem, enquanto que as fêmeas permanecem fixadas no sistema de raiz e continuam a se alimentar. Os ovos nas fêmeas inchadas começam a se desenvolver, 25 inicialmente em uma massa ou saco de ovos fora do corpo, então mais tarde dentro da cavidade corporal do nematódeo. Eventualmente a cavidade corporal inteira da fêmea adulta está cheia de ovos, e o nematódeo fêmea morre. É o corpo cheio de ovos da fêmea morta que é chamado de cisto. Cistos eventualmente se desalojam e são encontrados livres no solo. As paredes do cisto tomam-se muito resistentes, proporcionam excelente proteção para os aproximadamente 200 a 400 ovos contidos dentro das mesmas. Ovos de SCN sobrevivem dentro do cisto até ocorrerem condições apropriadas de eclosão. Embora muitos dos ovos possam eclodir dentro do 5 primeiro ano, muitos também sobreviverão dentro dos cistos por vários anos.

Um nematódeo pode se mover por si mesmo através do solo apenas umas poucas polegadas por ano. Contudo, infestação de nematódeo pode ser espalhada por distâncias substanciais em uma variedade de maneiras. Qualquer coisa que possa mover solo infestado é capaz de espalhar a 10 infestação, incluindo maquinário, veículos e ferramentas de fazenda, vento, água, animais, e trabalhadores de fazenda. Partículas de solo do tamanho de semente freqüentemente contaminam semente colhida. Conseqüentemente, infestação de nematódeo pode ser espalhada quando semente contaminada de campos infestados é plantada em campos não-infestados. Há até mesmo 15 evidência de que certas espécies de nematódeos podem ser espalhadas por aves. Apenas algumas das causas podem ser prevenidas.

Práticas tradicionais para manejar infestação de nematódeo incluem: manutenção de níveis de pH de solo e de nutrientes de solo apropriados em terra infestada com nematódeo; controle de outras doenças de 20 planta, bem como de pestes de ervas daninhas e de insetos; uso de práticas de sanitização tais com aração, plantio, e cultivo de campos infestados com nematódeos apenas após trabalhar campos não-infestados; limpeza cuidadosa de equipamento com vapor de água ou água de pressão alta após trabalho em campos infestados; não uso de semente crescida em terra infestada para 25 plantio de campos não-infestados a não ser que a semente tenha sido apropriadamente limpa; rotação de campos infestados e altemação de plantações hospedeiras com plantações não-hospedeiras; uso de nematicidas; e plantio de variedades de planta resistentes.

Têm sido propostos métodos para a transformação genética de plantas com o objetivo de conceder resistência aumentada aos nematódeos parasitas de plantas. Patentes U.S. Nos. 5.589.622 e 5.824.876 são direcionadas para a identificação de genes de planta expressados especificamente em ou adjacentemente aos sítio de alimentação da planta 5 após fixação pelo nematódeo. Contudo estas patentes não fornecem quaisquer genes específicos para nematódeo que são úteis para conceder resistência à infecção por nematódeo.

Continua a existir uma necessitada para identificar métodos e composições seguras e eficazes para controlar patógenos de planta, e para a produção de plantas tendo resistência aumentada aos patógenos de planta.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Os presentes inventores têm verificado que a sobre-expressão de genes tipo pEARLIl em plantas resulta em resistência aumentada aos nematódeos, e que inibição de expressão de genes tipo pEARLIl em plantas 15 resulta em resistência aumentada aos fungos necrotróficos. Portanto, na primeira modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica resistente a nematódeo transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.

Outra modalidade da invenção fomece uma semente

transgênica que é geração verdadeira para um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.

Outra modalidade da invenção refere-se a um cassete de expressão ou um vetor de expressão compreendendo um elemento regulatório de transcrição operacionalmente ligado em um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.

Outra modalidade da invenção inclui um método para produzir uma planta transgênica resistente a nematódeo, o método compreendendo as etapas de transformar uma célula com um vetor de expressão compreendendo um elemento regulatório de transcrição operacionalmente ligado em um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos, e regenerar uma planta transgênica a partir da célula transformada.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado que inibe a expressão de genes tipo pEARLIl na planta, e que toma a planta transgênica resistente aos fungos necrotróficos, em comparação com plantas de tipo selvagem de mesma variedade.

Outra modalidade da invenção fornece uma semente transgênica que é geração verdadeira para um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo isolado que inibe a expressão de genes tipo pEARLIl, e que toma a planta transgênica produzida a partir da semente 15 resistente aos fungos necrotróficos, em comparação com plantas de tipo selvagem de mesma variedade. Outra modalidade da invenção refere-se a um cassete de expressão ou um vetor de expressão compreendendo um elemento regulatório de transcrição operacionalmente ligado a um polinucleotídeo isolado que inibe a expressão de genes tipo pEARLIl na planta, e que toma a 20 planta transgênica resistente aos fungos necrotróficos.

A invenção adicionalmente inclui um dsRNA ou polinucleotídeo de anti-senso capaz de inibir a expressão de um gene tipo pEARLIl em uma planta e concedendo deste modo à planta resistência a fungos necrotróficos.

DESCRIÇÃO BREVE DOS DESENHOS

Figura 1 mostra a tabela de SEQ ID NOs atribuída às correspondentes seqüências de gene, proteína e promotor.

Figuras 2a-2d mostram as seqüências de DNA e proteína para genes tipo pEARLIl exemplares. Figura 3 mostra um alinhamento de aminoácido dos genes tipo pEARLIl At4gl2500 (SEQ ID NO:2), Atlg62510 (SEQ ID NO: 18), At4g12490 (SEQ ID NO: 10), At4gl2520 (SEQ ID NO: 12), At4gl2530 (SEQ ID N0:20), At4g22460 (SEQ ID NO: 14), e At5g46900 (SEQ ID NO: 16) de 5 Arabidopsis, e GM47093397 (SEQ ID NO:6), GM50292847 (SEQ ID NO:4), e GM50857725 (SEQ ID NO:8) de Glycine. O alinhamento é realizado em conjunto de programas de computador Vector NTI (penalidade de abertura de lacuna = 10, penalidade de extensão de lacuna = 0,05, penalidade de separação de lacuna = 8).

Figuras 4a-4d mostram vários 21-meros possíveis para genes

tipo pEARLIl exemplares de SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19 por posições de nucleotídeo. Por exemplo, o 2 Imer poderia compreende nucleotídeos em posições 1 a 21, nucleotídeos em posições 2 a 22, nucleotídeos em posições 3 a 23, etc. Estas tabelas também podem ser usadas 15 para calcular os 19, 20, 22, 23, ou 24-meros por adição ou subtração do número apropriado de nucleotídeos de cada 21mer.

Figura 5 mostra a identidade percentual de aminoácido global entre genes tipo pEARLIl: At4gl2500 (SEQ ID NO:2), Atlg62510 (SEQ ID NO: 18), At4g 12490 (SEQ ID NO: 10), At4gl2520 (SEQ ID NO: 12), 20 At4gl2530 (SEQ ID N0:20), At4g22460 (SEQ ID NO: 14), At5g46900 (SEQ ID NO: 16), GM47093397 (SEQ ID NO:6), GM50292847 (SEQ ID NO:4), e GM50857725 (SEQ ID NO:8). Alinhamentos em pares e identidades percentuais foram calculados usando Needle of EMBOSS-4.0.0 (Needleman., S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453).

Figura 6 mostra a identidade percentual de nucleotídeo global

entre genes tipo pEARLIl (PLPCP genes): At4gl2500 (SEQ ID NO: I), Atlg62510 (SEQ ID NO: 17), At4gl2490 (SEQ ID NO:9), At4gl2520 (SEQ ID NO: 11), At4g 12530 (SEQ ID NO: 19), At4g22460 (SEQ ID NO: 13), At5g46900 (SEQ ID NO: 15), GM47093397 (SEQ ID NO:5), GM50292847 (SEQ ID NO:3), e GM50857725 (SEQ ID NO:7). Alinhamentos em pares e identidades percentuais foram calculados usando Needle of EMBOSS-4.0.0 (Needleman, S. B. e Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. BioL 48, 443-453).

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES

PREFERIDAS

A presente invenção pode ser entendida mais prontamente com referência à seguinte descrição detalhada das modalidade da invenção e dos exemplos aqui incluídos. A não ser que indicado de outro modo, os termos aqui usados são para serem entendidos de acordo com o uso convencional por aquelas pessoas experientes na arte relevante.

Em todo este pedido, são feitas referências a várias publicações científicas e de patente. As revelações de todas estas publicações e daquelas referências citadas dentro daquelas publicações em suas totalidades são por meio deste incorporadas como referências neste pedido 15 com o propósito de descrever mais completamente o estado da técnica ao qual este invenção pertence. Abreviações e nomenclatura, onde utilizadas, são consideradas padrão no campo e comumente usadas em periódicos profissionais tais como aqueles aqui citados. Como aqui usada e nas reivindicações anexadas, a forma no singular "um", "uma", "o" e "a" inclui a 20 sua referência no plural a não ser que o contexto dite claramente o contrário. Como aqui usada, a palavra "ou" significa qualquer um membro de uma lista particular e também inclui qualquer combinação de membros daquela lista.

O termo "cerca de" é aqui usado para significar aproximadamente, em tomo de, ao redor de, ou nas regiões de. Quando o 25 termo "cerca de" é usado conjuntamente com uma faixa numérica, ele modifica aquela faixa pela extensão dos limites acima e abaixo dos valores numéricos mostrados. Em geral, o termo "cerca de" é aqui usado para modificar um valor numérico acima e abaixo do valor indicado por uma variância de 10 por cento, para mais ou para menos (mais alto ou mais baixo). Os polinucleotídeos aqui descritos são designados polinucleotídeos genes ou polinucleotídeos tipo pEARLIl em virtude de sua similaridade com o gene de Arabidopsis do mesmo nome induzido prematuramente em resposta ao estresse de alumínio.Embora não seja 5 conhecida a função deste e de genes relacionados, acredita-se que são induzidos por uma variedade de estresses abióticos e bióticos. Como aqui usados, os termos "gene tipo pEARLIl" e "polinucleotídeos tipo pEARLIl" referem-se a um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com qualquer um dos polinucleotídeos mostrados em SEQ ID 10 NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; ou a um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com qualquer um dos polipeptídeos mostrados em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. Também estão incluídos na definição de gene tipo pEARLIl os homólogos, ortólogos, parólogos, e as variantes alélicas dos 15 polinucleotídeos mostrados em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; ou do polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com qualquer um dos polipeptídeos mostrados em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

Como aqui usada, a palavra "ácido nucleico", "nucleotídeo", 20 ou "polinucleotídeo" é intencionada para incluir moléculas de DNA (e.g., cDNA ou DNA genômico), moléculas de RNA (e.g., mRNA), moléculas de DNA ou de RNA de ocorrência natural, mutadas, sintéticas, e análogos de DNA ou RNA gerados usando análogos de nucleotídeo. Pode ser de fita dupla ou de fita única. Tais ácidos nucleicos ou polinucleotídeos incluem, mas não 25 são limitados a, seqüências codificadoras de genes estruturais, seqüências de anti-senso, e seqüências regulatórias não-codificadoras que não codificam mRNAs ou produtos de proteína.

Como aqui usado, um polinucleotídeo "isolado" está substancialmente livre de outros materiais celulares ou do meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente livre de precursores químicos quando quimicamente sintetizado.

O termo "gene" é usado amplamente para se referir a qualquer segmento de ácido nucleico associado com uma função biológica. Assim, 5 genes incluem íntrons e exons como em seqüência genética, ou apenas as seqüências codificadoras como em cDNAs e/ou as seqüências regulatórias exigidas para sua expressão. Por exemplo, gene refere-se a um fragmento de ácido nucleico que expressa mRNA ou RNA funcional, ou codifica uma proteína específica, e que inclui seqüências regulatórias.

Os termos "polipeptídeo" e "proteína" são usados aqui

intercambiavelmente para se referirem a um polímero de resíduos de aminoácido consecutivos. O termo "operacionalmente ligado" ou "funcionalmente ligado" como aqui usado refere-se à associação de seqüências de ácido nucleico em um fragmento único de ácido nucleico de 15 modo que a função de uma é afetada pela outra. Por exemplo, um DNA regulatório é dito em estar "operacionalmente ligado em" um DNA que expressa um RNA ou codifica um polipeptídeo se os dois DNAs estão situados de tal modo que o DNA regulatório afeta a expressão do DNA codificador.

O termo "expressão específica" como aqui usado refere-se à

expressão de produtos de gene que é limitada a um ou a uns poucos tecidos de planta (limitação espacial) e/ou a um ou uns poucos estágios desenvolventes de planta (limitação temporal). É admitido que dificilmente existe uma especificidade verdadeira: promotores parecem ser preferivelmente ligados 25 em alguns tecidos, enquanto que em outros tecidos pode haver nenhuma ou apenas pouca atividade. Este fenômeno é conhecido como expressão subnormal. Contudo, expressão específica significa nesta invenção expressão preferível em um ou uns poucos tecidos de planta ou sítios específicos em uma planta. O termo "promotor" como aqui usado refere-se a uma seqüência de DNA que, quando ligada em uma seqüência de nucleotídeos de interesse, é capaz de controlar a transcrição da seqüência de nucleotídeos de interesse em mRNA. Um promotor está tipicamente, embora não 5 necessariamente, localizado 5' (e.g., a montante) de um nucleotídeo de interesse (e.g., próximo ao sítio de iniciação transcricional de um gene estrutural) cuja transcrição em mRNA ele controla, e fornece um sítio para ligação específica por RNA polimerase e outros fatores de transcrição para iniciação de transcrição.

O termo "elemento regulatório de transcrição" como aqui

usado refere-se a um polinucleotídeo que é capaz de regular a transcrição de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Ele inclui, mas não é limitado a, promotores, intensificadores, íntrons, 5' UTRs, e 3' UTRs.

Como aqui usado, o termo "vetor" refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico no qual tem estado ligado. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. No presente relatório descritivo, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados intercambiavelmente porque o plasmídeo é a forma mais comumente utilizada de vetor. Um vetor pode ser um vetor binário ou um T-DNA que compreende a borda esquerda e a borda direita e pode incluir um gene de interesse entre ambas as bordas. O termo "vetor de expressão" como aqui usado significa um vetor capaz de dirigir a expressão de um nucleotídeo particular em uma célula hospedeira apropriada. A expressão do nucleotídeo pode ser sobre-expressada ou infra-regulada. Um vetor de expressão compreende um elemento de ácido nucleico regulatório ligado em um ácido nucleico de interesse, que está - opcionalmente - operacionalmente ligado em um sinal de terminação e/ou outros sinais regulatórios.

Como aqui usado, "RNAi" ou "interferência de RNA" refere- se a um processo de silenciamento de gene pós-transcricional específico para seqüência em plantas, mediado por RNA de fita dupla (dsRNA). Como aqui usado, "dsRNA" refere-se a RNA que é de fita parcial ou completamente dupla. RNA de fita dupla também é chamado de um RNA interferente curto 5 ou pequeno (siRNA), ácido nucleico interferente curto (siRNA), RNA interferente curto, micro-RNA (miRNA), e semelhantes. No processo de RNAi, dsRNA compreendendo uma primeira fita que é substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo e uma segunda fita que é complementar à primeira fita é introduzido em uma planta. Após introdução, 10 o dsRNA específico de gene alvo é processado em fragmentos relativamente pequenos (siRNAs) e pode ser subseqüentemente tomado distribuído em toda a célula hospedeira, causando uma mutação de perda-de-função tendo um fenótipo que, durante um período de regeneração, pode se tomar muito proximamente parecido com o fenótipo decorrente de uma deleção parcial ou 15 completa do gene alvo. Alternativamente, o dsRNA específico de gene alvo é processado em fragmentos relativamente pequenos por uma célula de planta contendo o maquinário de processamento de RNAi. Numerosos modelos têm sido propostos para a ação de RNAi.

Um polinucleotídeo de "anti-senso" compreende uma 20 seqüência de nucleotídeos que é complementar a um ácido nucleico de "senso" codificador de uma proteína, e.g., complementar a uma seqüência de mRNA. Conformemente, um ácido nucleico de anti-senso pode se ligar por hidrogênio em um ácido nucleico de senso. O ácido nucleico de anti-senso pode ser complementar a um gene alvo inteiro, ou a uma sua porção. As 25 moléculas de ácido nucleico de anti-senso são tipicamente administradas a uma célula ou geradas in situ de tal modo que hibridizam com ou se ligam em mRNA celular e/ou DNA genômico.

Como aqui usados, levando-se em consideração a substituição de timina por uracila quando se comparam seqüências de RNA e DNA, o termo "substancialmente idêntica" significa que a seqüência de nucleotídeos de uma fita de dsRNA ou polinucleotídeo de anti-sendo é pelo menos cerca de 80%-90% idêntica a 19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, ou pelo menos cerca de 90-95% idêntica a 19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo, e pelo menos 95-99% idêntica ou absolutamente idêntica a 19 ou mais nucleotídeos contíguos do gene alvo

Como aqui usado, polinucleotídeos "complementares" refere- se àqueles que são capazes de parear bases de acordo com as regras de complementaridade padrão de Watson-Crick. Especificamente, purinas formarão pares de bases com pirimidinas para formar uma combinação de guanina pareada com citosina (G:C) e quer adenina pareada com timina (A:T) no caso de DNA, quer adenina pareada com uracila (A:U) no caso de RNA.

Como aqui usado, o termo "substancialmente complementar" significa que dois nucleotídeos são complementares em pelo menos 80% de seus nucleotídeos, ou pelo menos em 95-90%, 90-95%, ou pelo menos em 96%, 97%, 98%, 99% ou mais ou em 100% idênticos de seus nucleotídeos. Alternativamente, "substancialmente complementar" significa que dois nucleotídeos podem hibridizar sob condições de estringência alta.

O termo "homólogos" como aqui usado refere-se a um gene relacionado a um segundo gene pela descendência de uma seqüência de DNA ancestral comum. O termo "homólogos" pode se aplicar à relação entre genes separados pelo evento de especiação (e.g., ortólogos) ou ao relacionamento entre genes separados pelo evento de duplicação genética (e.g., parólogos).

Como aqui usado, o termo "ortólogos" refere-se aos genes de espécies diferentes, mas que têm sido provenientes de um gene ancestral comum por especiação. Ortólogos retêm a mesma função no curso da evolução. Ortólogos codificam proteínas tendo funções iguais ou similares. Como aqui usado, o termo "parólogos" refere-se aos genes que estão relacionados por duplicação dentro de um genoma. Parólogos costumeiramente têm funções diferentes ou funções novas, mas estas funções podem estar relacionadas.

Como aqui usado, o termo "variante alélica" refere-se a um polinucleotídeo contendo polimorfismos que ocasionam mudanças nas 5 seqüências de aminoácidos de uma proteína codificada pelo nucleotídeo e que existem dentro de uma população natural (e.g., uma espécie ou variedade de planta). Tais variações alélicas naturais podem tipicamente resultar em 1-5% de variância em um polinucleotídeo codificador de uma proteína, ou 1-5% de variância na proteína codificada. Variantes alélicas podem ser identificadas 10 pelo sequenciamento do ácido nucleico de interesse em numerosas plantas diferentes, que pode ser prontamente realizado pelo uso de, por exemplo, sondas de hibridização para identificar o mesmo locus genético de gene naquelas plantas.

Como aqui usado, o termo "hibridiza sob condições estringentes" é intencionado para descrever condições para hibridização e lavagem sob as quais seqüências de nucleotídeos pelo menos 60% similares ou idênticas entre si tipicamente permanecem hibridizadas uma na outra. Em outra modalidade, as condições são tais que seqüências pelo menos cerca de 65%, ou pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75% ou mas similares ou idênticas entre si permanecem hibridizadas uma na outra. Tais condições estringentes são conhecidas por aquelas pessoas experientes na arte e descritas abaixo. Um exemplo não-limitante, preferido, de condições estringentes é hibridização em 6X cloreto de sódio/citrato de sódio (SSC) a cerca de 45°C, seguida por uma ou mais lavagens em 0,2X SSC, 0,1% SDS a 50-65°C.

Como aqui usado, "percentagem de identidade de seqüência" ou "identidade de seqüência percentual" denota um valor determinado primeiro pela anotação em duas seqüências otimamente alinhadas sobre uma janela de comparação, quer global quer localmente, em cada posição constituinte sobre se cada base de ácido nucleico idêntica ou resíduo de aminoácido idêntico ocorrendo em ambas as seqüências, denotou uma combinação, ou se não, denotou uma má combinação. Como dito alinhamento é construído por otimização do número de bases combinando, simultaneamente concorrentemente permitindo tanto as más combinações em qualquer posição quanto a introdução de lacunas arbitrariamente dimensionadas, ou regiões vazias ou nulas onde necessário, aumentando deste modo a significância ou a qualidade do alinhamento, o cálculo determina o número total de posições para as quais existe condição de combinação, e então divide este número pelo número total de posições na janela de comparação, e finalmente multiplica o resultado por 100 para dar a percentagem de identidade de seqüência. "Percentagem de similaridade de seqüência" para seqüências de proteína pode ser calculada usando o mesmo princípio, sendo que a substituição conservativa é calculada como uma má combinação parcial em vez de uma má combinação completa. Assim, por exemplo, onde um aminoácido idêntico recebe um escore de 1 e uma substituição não-conservativa recebe um escore de zero, uma substituição conservativa recebe um escore entre zero e I. O escore de substituições conservativas pode ser obtido das matrizes de aminoácido conhecidas na arte, por exemplo, matrizes Blosum ou PAM.

Métodos de alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na arte. A determinação de identidade percentual ou similaridade percentual (para proteínas) entre duas seqüências pode ser realizada usando um algoritmo matemático. Exemplos preferidos, não- 25 limitantes de tais algoritmos matemáticos são, o algoritmo de Myers e Miller (Bioinformatics, 4(1):11-17, 1988), o algoritmo global de Needleman- Wunsch (J Mol Biol. 48(3):443-53, 1970), o algoritmo local de Smith- Waterman (J. Mol. Biol., 147:195-197, 1981), o método de pesquisa-de- similaridade de Pearson e Lipman (PNAS, 85(8): 2444-2448, 1988), o algoritmo de Karlin e Altschul (J. Mol. Biol., 215(3):403-410, 1990; PNAS, 90:5873-5877,1993). Implementações computacionais destes algoritmos matemáticos podem ser utilizadas para comparação de seqüência para determinar identidade de seqüência ou para identificar homólogos.

O termo "região conservada" ou "domínio conservado" como aqui usado refere-se a uma região em seqüências heterólogas de polinucleotídeo ou de polipeptídeo onde há um grau relativamente alto de identidade de seqüência entre as seqüências distintas. A "região conservada" pode ser identificada, por exemplo, do alinhamento de seqüências múltiplas usando o algoritmo Clustal W.

O termo "célula" ou "célula de planta" como aqui usado refere- se a uma célula individual, e também inclui uma população de células. A população pode ser uma população pura compreendendo um tipo de célula. Igualmente, a população pode compreender mais do que um tipo de célula. Uma célula de planta dentro do significado da invenção pode estar isolada (e.g, em cultura em suspensão), ou compreendida em um tecido de planta, órgão de planta ou planta em qualquer estágio desenvolvente.

O termo "tecido" com respeito a uma planta (ou "tecido de planta") significa arranjo de múltiplas células de planta, incluindo tecidos de plantas diferenciados ou não diferenciados. Tecidos de planta podem constituir parte de um órgão de planta (e.g., a epiderme de uma folha de planta) mas também podem constituir tecidos de tumor (e.g., tecido de calo) e vários tipos de células em cultura (e.g., células individuais, protoplastos, embriões, calos, corpos semelhantes a protocormo, etc.). Tecidos de planta podem estar em planta, em cultura de órgão, cultura de tecido, ou cultura de célula.

O termo "órgão" com respeito a uma planta (ou "órgão de planta") significa partes de uma planta e pode incluir, mas não é limitado a, por exemplo raízes, frutas, brotos, caules, folhas, hipocótilos, cotilédones, anteras, sépalas, pétalas, pólen, sementes, etc.

O termo "planta" como aqui usado pode, dependendo do contexto, ser entendido para se referir a plantas inteiras, células de planta, órgãos de planta, sementes de planta, e progênie dos mesmos. A palavra "planta" também se refere a qualquer planta, particularmente, à planta de semente, e pode incluir, mas não é limitada, plantas de colheita. Partes de planta incluem, mas não são limitadas a, caules, raízes, brotos, frutas, óvulos, estames, folhas, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, gametófitos, esporófitos, pólen, microesporos, hipotócilos, cotilédones, anteras, sépalas, pétalas, pólen, sementes e semelhantes. A classe de plantas que pode ser usada no método da invenção é geralmente tão ampla quanto a classe de plantas inferiores e superiores sensíveis às técnicas de transformação, incluindo angiospermas (plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas), gimnospermas, samambaias, cavalinhas, psilófitos, briófitos, e algas multicelulares.

O termo "transgênica" como aqui usado é intencionado para se referir às células e/ou plantas que contêm um transgene, ou cujo genoma tem sido alterado pela introdução de um transgene, ou que têm incorporado genes ou polinucleotídeos exógenos. Células, tecidos, órgãos e plantas transgênicas 20 podem ser produzidas por vários métodos incluindo a introdução de um "transgene" compreendendo polinucleotídeo (costumeiramente DNA) em uma célula alvo ou integração do transgene em um cromossomo de uma célula alvo por meio de intervenção humana, tal como por métodos aqui descritos.

O termo "geração verdadeira" como aqui usado refere-se a uma variedade de planta para uma feição particular se é geneticamente homozigótica para aquela feição de modo que, quando a variedade de geração verdadeira é auto-polinizada, não é observada uma quantidade significativa de segregação independente da feição dentre a progênie.

O termo "planta de controle " ou "planta de tipo selvagem" como aqui usado refere-se a um célula de planta, um explante, semente, componente de planta, tecido de planta, órgão de planta, ou planta inteira usada(o) para comparar contra planta transgênica ou geneticamente modificada para o propósito de identificar um fenótipo intensificado ou uma 5 feição desejada na planta transgênica ou geneticamente modificada. Uma "planta de controle" pode em alguns casos ser uma linhagem de planta transgênica que compreende um vetor vazio ou gene marcador, mas não contém o polinucleotídeo recombinante polinucleotídeo de interesse que está presente na planta transgênica ou geneticamente modificada sendo avaliada. 10 Uma planta de controle pode ser uma planta de mesma linhagem ou variedade que a da planta transgênica ou geneticamente modificada sendo testada, ou pode ser outra linhagem ou variedade, tal como uma planta conhecida em ter um fenótipo específico, uma característica específica, ou um genótipo conhecido. Uma planta de controle adequada incluiria uma planta 15 geneticamente inalterada ou não-transgênica da linhagem parental usada para gerar aqui uma planta transgênica.

O termo "sítio de alimentação" como aqui usado refere-se à estrutura de alimentação formada em raízes de planta após infestação por nematódeo. O sítio é utilizado como uma fonte de nutrientes para os 20 nematódeos. Um sítio de alimentação compreende um sincício para nematódeos de cisto e células gigantes estão compreendidas nos sítios de alimentação de nematódeos das galhas.

O termo "resistência à infecção por nematódeo" ou "uma planta tendo resistência ao nematódeo" como aqui usado refere-se à 25 capacidade de uma planta para evitar infecção por nematódeos, para matar nematódeos ou para impedir, reduzir ou parar o desenvolvimento, o crescimento ou a multiplicação de nematódeos. Isto pode ser realizado por um processo ativo, e.g. pela produção de uma substância prejudicial ao nematódeo, ou por um processo passivo, como tendo um valor nutricional reduzido para o nematódeo ou estruturas não-desenvolventes induzidas pelo sítio de alimentação de nematódeo como células sinciciais ou células gigantes. O nível de resistência a nematódeo de uma planta pode ser determinado em várias maneiras, e.g. por contagem de nematódeos sendo 5 capazes de estabelecer parasitismo sobre aquela planta, ou medição de tempos de desenvolvimento de nematódeos, proporção de nematódeos machos e fêmeas ou o número de cistos ou ovos de nematódeo produzidos. Uma planta com resistência aumentada à infecção por nematódeo é uma planta, que é mais resistente à infecção por nematódeo em comparação com outra planta 10 tendo um genótipo similar ou preferivelmente idêntico enquanto que é faltante de gene ou genes que concedem resistência aumentada a nematódeos, e.g., uma planta de controle ou de tipo selvagem.

O termo "resistente a fungos necrotróficos" ou "uma planta tendo resistência fungica necrotrófica" como aqui usado refere-se à capacidade de uma planta para evitar infecção por fungos necrotróficos, para matar fungos necrotróficos ou para impedir, reduzir ou parar o desenvolvimento, o crescimento ou a multiplicação de fungos necrotróficos. Isto pode ser realizado por um processo ativo, e.g. pela produção de uma substância prejudicial ao fungo necrotrófico, ou por um processo passivo, como tendo um valor nutricional reduzido para o fungo necrotrófico. O nível de resistência a fungo necrotrófico de uma planta pode ser determinado, por exemplo, tal como por aqueles revelados em Exemplo 7 abaixo. Uma planta com resistência aumentada à infecção por fungo necrotrófico é uma planta que é mais resistente à infecção por fungo necrotrófico em comparação com outra planta tendo um genótipo similar ou preferivelmente idêntico embora faltante dos polinucleotídeos concedentes de resistência aumentada a fungos necrotróficos, e.g., uma planta de controle ou de tipo selvagem.

Em uma primeira modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica resistente a nematódeo transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos. De acordo com esta modalidade, a planta transgênica resistente a nematódeo da invenção pode compreender qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl definidos em SEQ ID 5 NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Alternativamente, a planta transgênica resistente a nematódeo da invenção pode compreender qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl que codificam qualquer um dos polipeptídeos definidos em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. Ademais, a planta transgênica resistente a nematódeo da invenção pode compreender 10 qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que é pelo menos cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-80%), 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar aos polinucleotídeos definidos em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Além disso, a planta transgênica resistente a 15 nematódeo da invenção pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar a qualquer um dos polipeptídeos definidos em SEQ 20 ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. De acordo com a invenção, a planta transgênica resistente a nematódeo da invenção pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que hibridiza sob condições estringentes com qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl definidos em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Alternativamente, a planta 25 transgênica resistente a nematódeo da invenção pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que hibridiza sob condições estringentes com qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl que codifica qualquer um polipeptídeo definido em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

Em outra modalidade, a invenção fornece uma semente transgênica que é geração verdadeira para um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos. De acordo com esta modalidade, a semente transgênica desta modalidade pode ser geração verdadeira para 5 qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl definidos em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Alternativamente, a semente transgênica desta modalidade pode ser geração verdadeira para qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl que codificam qualquer um dos polipeptídeos definidos em SEQID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. 10 Ademais, a semente transgênica desta modalidade pode ser geração verdadeira para qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que é pelo menos cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar aos polinucleotídeos definidos em SEQ 15 ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Além disso, a semente transgênica desta modalidade pode ser geração verdadeira para qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que codifica um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 50- 60%, ou pelo menos cerca de 60-70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80- 85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 20 ou mais idêntico ou similar a qualquer um dos polipeptídeos definidos em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. De acordo com a invenção, a semente transgênica desta modalidade pode ser geração verdadeira para qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que hibridiza sob condições estringentes com qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl definidos 25 em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Alternativamente, a semente transgênica desta modalidade pode ser geração verdadeira para qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que hibridiza sob condições estringentes com qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl que codifica qualquer um polipeptídeo definido em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

A semente ou planta transgênica pode ser qualquer semente ou planta, tal como, mas não limitada a árvores, flores cortadas, plantas ornamentais, verduras/hortaliças ou plantas de colheita. A planta pode ser de 5 um gênero selecionado do grupo consistindo de Medicago, Lycopersicon, Brassica, Cucumis, Solanum, Juglans, Gossypium, Malus, Vitis, Antirrhinum, Populus, Fragaria, Arabidopsis, Picea, Capsicum, Chenopodium, Dendranthema, Pharbitis, Pinus, Pisum, Oryza, Zea, Triticum, Triticale, Secale, Lolium, Hordeum, Glycine, Pseudotsuga, Kalanchoe, Beta, 10 Helianthus, Nicotiana, Cucurbita, Rosa, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Raphanus, Sinapis, Atropa, Datura, Hyoscyamus, Nicotiana, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, 15 Senecio, Salpiglossis, Browaalia, Phaseolus, Avena, e Allium, ou a planta pode ser selecionada do grupo consistindo de cereais incluindo trigo, cevada, sorgo, centeio, triticale, milho, arroz, cana-de-açúcar, e árvores incluindo macieira, pereira, marmeleiro, ameixeira, cerejeira, pessegueiro, nectarina, albricoqueiro, mamão papaia, mangueira, álamo, pinheiro, sequóia, cedro, e 20 carvalho. O termo "planta" como aqui usado pode ser plantas de colheita monocotiledôneas, tais como ervilha, alfafa, feijão-soja, cenoura, aipo, tomateiro, batateira, algodoeiro, tabaco, pimenteira, colza, beterraba, repolho, couve-flor, brócolis, alface e Arabidopsis thaliana. Em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea ou uma planta dicotiledônea.

Preferivelmente a planta ou semente transgênica da invenção é

uma planta ou semente de colheita. Plantas de colheita são todas as plantas, usadas em agricultura. Conformemente em uma modalidade a planta é uma planta monocotiledônea, preferivelmente uma planta da família Poaceae, Musaceae, Liliaceae ou Bromeliaceae, preferivelmente da família Poaceae. Conformemente, em ainda outra modalidade a planta é uma planta Poaceae do gênero Zea, Triticum, Oryza, Hordeum, Secale, Avena, Saccharum, Sorghum, Pennisetum, Setaria, Panicum, Eleusine, Miscanthus, Brachypodium, Festuca ou Lolium. Quando a planta é do gênero Zea, a espécie preferida é Z. mays. Quando a planta é do gênero Triticum, a espécie preferida é T. aestivum, T. speltae ou T. duram. Quando a planta é do gênero Oryza, a espécie preferida é

O. sativa. Quando a planta é do gênero Hordeum, a espécie preferida é H. vulgare. Quando a planta é do gênero Secale, a espécie preferida é S. cereale. Quando a planta é do gênero Avena, a espécie preferida é A. sativa. Quando a planta é do gênero Saccaram, a espécie preferida é S. officinarum. Quando a planta é do gênero Sorghum, a espécie preferida é S. vulgare, S. bicolor ou S. sudanense. Quando a planta é do gênero Pennisetum, a espécie preferida é P. glaucum. Quando a planta é do gênero Setaria, a espécie preferida é S. italica. Quando a planta é do gênero Panicum, a espécie preferida é P. miliaceum ou P. virgatum. Quando a planta é do gênero Eleusine, a espécie preferida é E. coracana. Quando a planta é do gênero Miscanthus, a espécie preferida é M. sinensis. Quando a planta é uma planta do gênero Festuca, a espécie preferida é F. arundinaria, F. rubra ou F. pratensis. Quando a planta é do gênero Lolium, a espécie preferida é L. perenne ou L. multifloram. Alternativamente, a planta pode ser Triticosecale.

Alternativamente, a planta ou semente transgênica da invenção é uma planta dicotiledônea, preferivelmente uma planta ou semente da família Fabaceae, Solanaceae, Brassicaceae, Chenopodiaceae, Asteraceae, Malvaceae, Linacea, Euphorbiaceae, Convolvulaceae Rosaceae, Cucurbitaceae, Theaceae, Rubiaceae, Sterculiaceae ou Citrus. Em uma modalidade a planta é uma planta da família Fabaceae, Solanaceae ou Brassicaceae. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Fabaceae, preferivelmente do gênero Glycine, Pisum, Arachis, Cicer, Vicia, Phaseolus, Lupinus, Medicago ou Lens. Espécies preferidas da família Fabaceae são M. truncatula, M, sativa, G. max, P. sativum, A. hypogea, C. arietinum, V. faba, P. vulgaris, Lupinus albus, Lupinus luteus, Lupinus angustifolius ou Lens culinaris. Mais preferidas são as espécies G. max A. hypogea e M. sativa. Mais preferida é a espécie G. max. Quando a planta é da família Solanaceae, o gênero preferido é Solanum, Lycopersicon, Nicotiana ou Capsicum. Espécies preferidas da família Solanaceae são S. tuberosum, L. esculentum, N. tabaccum ou C. chinense. Mais preferida é S. tuberosum. Conformemente, em uma modalidade a planta é da família Brassicaceae, preferivelmente do gênero Brassica ou Raphanus. Espécies preferidas da família Brassicaceae são as espécies B. napus, B. oleracea, B. juncea ou B. rapa. Mais preferida é a espécie B. napus. Quando a planta é da família Chenopodiaceae, o gênero preferido é Beta e a espécie preferida é a B. vulgaris. Quando a planta é da família Asteraceae, o gênero preferido é Helianthus e a espécie preferida é H. annuus. Quando a planta é da família Malvaceae, o gênero preferido é Gossypium ou Abelmoschus. Quando o gênero é Gossypium, a espécie preferida é G. hirsutum ou G. barbadense e a espécie mais preferida é G. hirsutum. Uma espécie preferida do gênero Abelmoschus é a espécie A. esculentus. Quando a planta é da família Linacea, o gênero preferido é Linum e a espécie preferida é L. usitatissimum. Quando a planta é da família Euphorbiaceae, o gênero preferido é Manihot, Jatropa ou Rhizinus e as espécies preferidas são M. esculenta, J. curcas ou R. comunis. Quando a planta é da família Convolvulaceae, o gênero preferido é Ipomea e a espécie preferida é I. batatas. Quando a planta é da família Rosaceae, o gênero preferido é Rosa, Malus, Pyrus, Prunus, Rubus, Ribes, Vaccinium ou Fragaria e a espécie preferida é o híbrido Fragaria x ananassa. Quando a planta é da família Cucurbitaceae, o gênero preferido é Cucumis, Citrullus ou Cucurbita e a espécie preferida é Cucumis sativus, Citrullus lanatus ou Cucurbita pepo. Quando a planta é da família Theaceae, o gênero preferido é Camellia e a espécie preferida é C. sinensis. Quando a planta é da família Rubiaceae, o gênero preferido é Coffea e a espécie preferida é C. arabica ou C. canephora. Quando a planta é da família Sterculiaceae, o gênero preferido é Theobroma e a espécie preferida é T. cacao. Quando a planta é do gênero Citrus, a espécie preferida é C. sinensis, C. limon, C. reticulata, C. maxima e híbridos de espécie Citrus, ou semelhantes. Em uma modalidade preferida da invenção, a planta ou semente transgênica é uma planta de feijão-soja, uma planta de batateira ou uma planta de milho. Em uma modalidade mais preferida, a planta ou semente transgênica é um feijão-soja.

A planta transgênica da invenção pode ser uma planta híbrida ou uma planta endogâmica. As planta e semente transgênicas da invenção também podem ser usadas para geração de planta, para preparar uma planta transgênica fértil cruzada. Métodos de geração adequados são bem conhecidos em agricultura, por exemplo, uma planta transgênica fértil compreendendo um vetor de expressão particular da invenção pode ser cruzada com uma planta transgênica similar ou com uma segunda planta, e.g., uma faltante do vetor de expressão particular, para preparar a semente de uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo o vetor de expressão particular. A segunda planta pode ser uma planta endogâmica. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o vetor de expressão particular herdado através de uma planta feminina parental ou através de uma planta masculina parental. A planta transgênica fértil cruzada pode ser um híbrido. Também estão incluídas dentro da presente invenção as sementes de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis cruzadas.

Ademais, a planta transgênica da presente invenção pode compreender, e/ou ser cruzada com outra planta transgênica que compreende um ou mais ácidos nucleicos, criando assim uma "pilha" de transgenes na planta e/ou sua progênie. A semente é então plantada para obter uma planta transgênica fértil cruzada compreendendo o ácido nucleico da invenção. A planta pode ser uma monocotiledônea ou uma dicotiledônea. A planta transgênica fértil cruzada pode ter o cassete de expressão particular herdado através de uma planta parental feminina ou através de uma planta parental masculina. Também estão incluídas dentro da presente invenção as sementes 5 de qualquer uma destas plantas transgênicas férteis cruzadas. As sementes desta invenção podem ser colhidas das plantas transgênicas férteis e usadas para crescer gerações de progênie de plantas transformadas desta invenção incluindo linhagens de planta híbridas compreendendo o construto de DNA.

"Empilhamento de gene" também pode ser realizado por 10 transferência de dois ou mais genes para dentro do núcleo de célula por transformação de planta. Genes múltiplos podem ser introduzidos no núcleo de célula durante transformação quer seqüencialmente quer simultaneamente. Genes múltiplos em plantas ou espécies de patógeno alvo podem ser infra- regulados por mecanismos de silenciamento de gene, especialmente RNAi, 15 pelo uso de um único transgene selecionando múltiplas seqüências parciais ligadas de interesse. Múltiplos genes, empilhados, sob o controle de promotores individuais também podem ser sobre-expressados para alcançar um fenótipo único ou múltiplo desejado. Construtos contendo pilhas de gene de ambos os genes sobre-expressados e os alvos silenciados também podem 20 ser introduzidos em plantas dando fenótipos único ou múltiplos agronomicamente importantes. Em certas modalidades as seqüências de ácido nucleico da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de seqüências de polinucleotídeo de interesse para criar fenótipos desejados. As combinações podem produzir plantas com uma variedade de 25 combinações de feições incluindo mas não limitadas a resistência à doença, tolerância a herbicida, intensificação de rendimento, tolerância ao frio e à estiagem. Estas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método incluindo mas não limitado à geração cruzada de plantas por métodos convencionais ou por transformação genética. Se as feições são empilhadas por transformação genética, as seqüências de polinucleotídeo de interesse podem ser seqüencial ou simultaneamente combinadas em qualquer ordem. Por exemplo se dois genes são para serem introduzidos, as duas seqüências podem estar contidas em cassetes de transformação separados ou no mesmo 5 cassete de transformação. A expressão das seqüências pode ser conduzida por promotores iguais ou diferentes.

A invenção também é representada por modalidade como um cassete de expressão ou um vetor de expressão compreendendo um elemento regulatório de transcrição operacionalmente ligado em um polinucleotídeo 10 tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos. De acordo com esta modalidade, o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção pode compreender qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl definidos em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7,9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Alternativamente, o vetor de expressão de resistência a nematódeo da 15 invenção pode compreender qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl que codificam qualquer um dos polipeptídeos definidos em SEQ ID NOs:2, 4,

6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. Ademais, o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que é pelo menos cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60- 20 70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar aos polinucleotídeos definidos em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19. Além disso, o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que codifica um 25 polipeptídeo que é pelo menos cerca de 50-60%, ou pelo menos cerca de 60- 70%, ou pelo menos cerca de 70-80%, 80-85%, 85-90%, 90-95%, ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais idêntico ou similar a qualquer um dos polipeptídeos definidos em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12,

14, 16, 18, ou 20. De acordo com a invenção, o vetor de expressão de resistência a nematódeo pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que hibridiza sob condições estringentes com qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl definidos em SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11,

13, 15, 17, ou 19. Alternativamente, o vetor de expressão de resistência a 5 nematódeo da invenção pode compreender qualquer polinucleotídeo tipo pEARLIl que hibridiza sob condições estringentes com qualquer um dos polinucleotídeos tipo pEARLIl que codifica qualquer um polipeptídeo definido em SEQ ID NOs:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

O vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção 10 compreende um ou mais elementos regulatórios de transcrição operacionalmente ligados em um polinucleotídeo tipo pEARLIl capaz de conceder a uma planta resistência a nematódeo. Qualquer elemento regulatório de transcrição pode ser utilizado nos vetores de expressão da invenção. Preferivelmente, o elemento regulatório de transcrição é um 15 promotor capaz de regular a expressão constitutiva de um polinucleotídeo operacionalmente ligado. Um "promotor constitutivo"refere-se a um promotor que é capaz de expressar a matriz de leitura aberta ou o elemento regulatório que ele controla em todos ou quase todos os tecidos de planta durante todos ou quase todos os estágios desenvolventes da planta. Promotores constitutivos 20 incluem, mas não são limitados a, o promotor 35S CaMV de vírus de planta (Franck et al., Cell 21:285-294, 1980), o promotor Nos (An G. et al., The Plant Cell 3:225-233, 1990), o promotor de ubiquitina (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632, 1992 e 18:581-8,1991), o promotor MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-30, 1984), o promotor de histona H3 de milho 25 (Lepetit et al., Mol Gen. Genet 231:276-85, 1992), o promotor ALS (W096/30530), o promotor 19S CaMV (US 5.352.605), o super-promotor (US 5.955.646), o promotor do vírus do mosaico de escrofulária (US 6.051.753), o promotor de actina de arroz (US 5.641.876), e o promotor de subunidade pequena de Rubisco (US 4.962,028). Preferivelmente, quando o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção compreende um polinucleotídeo tipo pEARLIl derivado de G. max, o promotor é um promotor constitutivo. Mais preferivelmente, quando o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção compreende um polinucleotídeo tipo 5 pEARLIl derivado de G. max, o promotor é o promotor de ubiquitina.

Alternativamente, o promotor no vetor de expressão da invenção é um promotor regulado. Um "promotor regulado" refere-se a um promotor que dirige a expressão de gene não constitutivamente, mas em uma maneira temporal e/ou espacial, e inclui ambos promotores específicos para 10 tecido e promotores induzíveis. Promotores diferentes podem dirigir a expressão de um gene ou elemento regulatório em tecidos ou tipos de célula diferentes, ou em estágios de desenvolvimento diferentes, ou em resposta às condições ambientais diferentes.

Um "promotor específico para tecido" ou "promotor preferido 15 para tecido" refere-se a um promotor regulado que não é expressado em todas as células de planta mas apenas em um ou mais tipos de célula em órgãos específicos (tais como folhas ou sementes), tecidos específicos (tais como embriões ou cotilédone), ou tipos de célula específicos (tais como parênquima foliar ou células de armazenagem de semente). Estes também incluem 20 promotores que são temporariamente regulados, tais como em embriogênese inicial ou tardia, durante amadurecimento de fruta em fruta ou sementes desenvolventes, em folha totalmente diferenciada, ou no início da seqüência. Promotores adequados incluem o promotor de gene de napina de colza (US 5.608.152), o promotor USP de Vicia faba (Baeumlein et al., Mol Gen Genet. 25 225(3):459-67, 1991), o promotor de oleosina de Arabidopsis (WO 98/45461), o promotor de faseolina de Phaseolus vulgaris (US 5.504.200), o promotor Bce4 de Brassica (WO 91/13980) ou o promotor de legumina B4 (LeB4; Baeumlein et al., Plant Journal, 2(2):233-9, 1992) bem como promotores concedentes de expressão específica em semente em plantas monocotiledôneas tais como milho, cevada, trigo, centeio, arroz, etc. Promotores adequados para serem anotados são os promotores de gene Ipt2 ou Iptl de cevada (WO 95/15389 e WO 95/23230) ou aqueles descritos em WO 99/16890 ***(promotores do gene de hordeína de cevada, gene de glutelina de arroz, gene de orizina de arroz, gene de prolamina de arroz, gene de gliadina de trigo, gene de glutelina de trigo, gene de zeína de milho, gene de glutelina de aveia, gene de casirina de sorgo e gene de secalina de centeio). Promotores adequados para expressão preferencial em tecidos de raiz de planta incluem, por exemplo, o promotor derivado de gene de nicotianamina sintase de milho (US 20030131377) e promotor RCC3 de arroz (US 11/075.113). Promotores adequados para expressão preferencial em tecidos verdes de planta incluem os promotores dos genes tais como gene FDA de aldolase de milho (US 20040216189), aldolase e piruvato orto-fosfato diquinase (PPDK) (Taniguchi et. al., Plant Cell Physiol. 41(l):42-48, 2000).

"Promotores induzíveis" referem-se àqueles promotores regulados que podem ser ligados em um ou mais tipos de célula por um estímulo externo, por exemplo, um agente químico, luz, hormônio, estresse, ou um patógeno tal como nematódeos. Promotores quimicamente induzíveis são especialmente adequados se é desejada ocorrência de expressão de gene em uma maneira específica em tempo. Exemplos de tais promotores são um promotor induzível por ácido salicílico (WO 95/19443), um promotor induzível por tetraciclina (Gatz et al., Plant J. 2:397-404, 1992), o promotor induzível por luz de uma subunidade pequena de Ribulose-1,5-bis-fosfato carboxilase (ssRUBISCO), e um promotor induzível por etanol (WO 93/21334). Também, promotores adequados responsivos às condições de estresse biótico ou abiótico são aqueles tais como o promotor de gene - PRPl induzível por patógeno (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22:361-366, 1993), o promotor hsp-80 induzível por calor do tomateiro (US 5187267), promotor de alfa-amilase induzível por frio da batateira (WO 96/12814), o promotor induzível por estiagem do milho (Busk et. al., Plant J. 11:1285-1295, 1997), o promotor induzível por frio, estiagem, e concentração salina alta da batateira (Kirch, Plant Mol. Biol. 33:897-909, 1997) ou o promotor RD29A de Arabidopsis (Yamaguchi-Shinozalei et. al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993), muitos promotores induzíveis por frio tais como o promotor cor 15a de Arabidopsis (Número de Acesso no Genbank de UO1377), bltl 01 e blt4.8 de cevada (Números de Acesso no Genbank de AJ310994 e U63993), wcsl20 de trigo (Número de Acesso no Genbank de AF031235), mlipl5 de milho (Número de Acesso no Genbank de D26563), bnll5 de Brassica (Número de Acesso no Genbank de UO1377), e promotor pinll induzível por ferimento (Patente Européia de No. 375091).

Em uma modalidade, o promotor utilizado no vetor de expressão da invenção é um promotor específico para raiz, específico para sítio de alimentação, induzível por patógeno ou induzível por nematódeo. Preferivelmente, quando o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção compreende um polinucleotídeo tipo pEARLIl derivado de A. thaliana, o promotor é um promotor específico para sítio de alimentação. Mais preferivelmente, quando o vetor de expressão de resistência a nematódeo da invenção compreende um polinucleotídeo tipo pEARLIl derivado de A. thaliana, o promotor é um promotor TPP tendo a seqüência mostrada em SEQ ID NO:21.

Plantas de colheita e nematódeos patogênicos correspondentes são listados em Index of Plant Diseases in the United States (U.S. Dept. of Agriculture Handbook No. 165, 1960); Distribution of Plant-Parasitic Nematode Species in North America (Society of Nematologists, 1985); e Fungi on Plants e Plant Products in the United States (American Phytopathological Society, 1989). O nematódeo selecionado pela presente invenção pode ser qualquer nematódeo parasita de planta, como os nematódeos das famílias Longidoridae, Trichodoridae, Aphelenchoidida, Anguinidae, Belonolaimidae, Criconematidae, Heterodidae, Hoplolaimidae, Meloidogynidae, Paratylenchidae, Pratylenchidae, Tylenchulidae, Tylenchidae, ou semelhantes. Preferivelmente, os nematódeos parasitas pertencendo à famílias de nematódeos induzindo células gigante ou sinciciais. Nematódeos induzindo células gigantes ou sinciciais são encontrados nas famílias Longidoridae, Trichodoridae, Heterodidae, Meloidogynidae, Pratylenchidae ou Tylenchulidae. Em particular nas famílias Heterodidae e Meloidogynidae.

Conformemente, nematódeos parasitas selecionados pela presente invenção pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera, Longidorus ou Meloidogyne. Em uma modalidade preferida os nematódeos preferidos pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Naccobus, Cactodera, Dolichodera, Globodera, Heterodera, Punctodera ou Meloidogyne. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos preferidos pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera, Heterodera, ou Meloidogyne. Em uma modalidade ainda mais preferida os nematódeos parasitas pertencem a um ou mais gêneros selecionados do grupo de Globodera ou Heterodera. Em outra modalidade os nematódeos parasitas pertencem ao gênero Meloidogyne.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Globodera, as espécies são preferivelmente do grupo consistindo de G. achilleae, G. artemisiae, G. hypolysi, G. mexicana, G. millefolii, G. mali, G. pallida, G. rostochiensis, G. tabacum, e G. virginiae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Globodera incluem pelo menos uma das espécies G. pallida, G. tabacum, ou G. rostochiensis. Quando os nematódeos parasitas são do gênero Heterodera, as espécies podem ser preferivelmente do grupo consistindo de H. avenae, H. carotae, H. ciceri, H. cruciferae, H. delvii, H. elachista, H. filipjevi, H. gambiensis, H. glycines, H. goettingiana, H. graduni, H. humuli, Η. hordecalis, Η. Iatipons, Η. major, Η. medicaginis, Η. oryzicola, Η. pakistanensis, Η. rosii, Η. sacchari, Η. schachtii, Η. sorghi, Η. trifolii, Η. urticae, Η. vigni e Η. zeae. Em outra modalidade preferida os nematódeos parasitas Heterodera incluem pelo menos uma das espécies H. glycines, H. avenae, H. cajani, H. gottingiana, H. trifolii, H. zeae ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos uma das espécies H. glycines ou H. schachtii. Em uma modalidade mais preferida o nematódeo parasita é a espécie H. glycines.

Quando os nematódeos parasitas são do gênero Meloidogyne, os nematódeos parasitas podem ser selecionados do grupo consistindo de M. acronea, M. arabica, M. arenaria, M. artiellia, M. brevicauda, M. camelliae, M. chitwoodi, M. cofeicola, M. esigua, M. graminicola, M. hapla, M. incógnita, M. indica, M. inomata, M. javanica, M. lini, M. mali, M. microcephala, M. microtyla, M. naasi, M. salasi e M. thamesi. Em uma modalidade preferida os nematódeos parasitas incluem pelo menos uma das espécies M. javanica, M. incógnita, M. hapla, M. arenaria ou M. chitwoodi.

A invenção também é representada por modalidade como um dsRNA ou polinucleotídeo de anti-senso antifungico que inibe a expressão de um polinucleotídeo tipo pEARLIl, sendo que o anti-fungico compreende uma primeira fita compreendendo uma seqüência substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo tipo pEARLIl. Quando o polinucleotídeo antifungico é um dsRNA, o polinucleotídeo adicionalmente compreende uma segunda fita que é substancialmente idêntica à primeira fita. De acordo com a invenção, a porção do gene alvo tipo pEARLIl é de 19 a 500 nucleotídeos de uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: a) uma seqüência de polinucleotídeo como definida em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; b) uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de um polipeptídeo como definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; c) uma seqüência de polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de polinucleotídeo definida em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; d) uma seqüência de polinucleotídeo codificadora de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com a seqüência de polipeptídeo definida em SEQ ID NO:2, 4, 6,

8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; e) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NOs:l,3,

5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; e f) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20. É sabido que fragmentos de dsRNA maiores do que 19-24 nucleotídeos em comprimento são clivados intracelularmente dentro de células eucarióticas para siRNAs de 19-24 nucleotídeos em comprimento, e estes siRNAs são os mediadores reais do fenômeno de RNAi. Assim o dsRNA da presente invenção pode variar em comprimento de 19 nucleotídeos até o comprimento do gene alvo de comprimento total. Preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de 21 nucleotídeos a 600 nucleotídeos. Mais preferivelmente, o dsRNA da invenção tem um comprimento de cerca de 21 nucleotídeos a 500 nucleotídeos, ou de cerca de 21 nucleotídeos a 400 nucleotídeos. Figuras 4a a 4d mostram 21-meros exemplares derivados de SEQ ID NOs:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, e 19.

A clivagem de um dsRNA mais longo dará uma coleção de cerca de 21-mero dsRNAs (variando de 19mers a 24mers), derivados do dsRNA mais longo. Esta coleção de cerca de 2Imer dsRNAs também está incluída dentro do escopo da presente invenção, gerada quer intracelularmente dentro da planta ou do nematódeo quer sinteticamente usando métodos conhecidos de síntese de oligonucleotídeo.

Em outra modalidade, a invenção fornece um vetor de expressão de resistência a fungo que compreende um promotor operacionalmente ligado em um oligonucleotídeo de anti-senso ou dsRNA antifungico isolado que é capaz de tomar uma planta resistente a um fungo, preferivelmente um fungo necrotrófico. Promotores, dsRNAs, e polinucleotídeos de anti-senso adequados que podem ser utilizados no vetor de expressão antifungico são descritos acima.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece uma planta transgênica compreendendo o vetor de expressão de resistência a fungo, e sementes derivadas de tais plantas. As sementes e plantas transgênicas resistentes a fungo desta modalidade podem ser qualquer uma das espécies descritas acima.

As plantas transgênicas resistentes a fungo da invenção podem demonstrar resistência contra qualquer um dos seguintes patógenos oomicetos e fungicos. Feijões-soja: Phytophthora megasperma f. sp. glycinea, Phytophthora sojae, Macrophomina phaseolina, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Fusarium oxysporum, Diaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae), Diaporthe phaseolorum var. caulivora, Sclerotium rolfsii, Cercospora kikuchii, Cercospora sojina, Peronospora manshurica, Colletotrichum dematium (Colletotichum truncatum), Corynespora cassuicola, Septoria glycines, Phyllosticta sojicola, Alternaria altemata, Microsphaera diffusa, Fusarium semitectum, Phialophora gregata, Glomerella glycines, Phakopsora pachyrhizi, Pythium aphanidermatum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, Fusarium solani f. sp. Glycines; Alfalfa: Clavibater michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trifoliorum, Phoma medicaginis var. medicaginis, Cercospora medicaginis, Pseudopeziza medicaginis, Leptotrochila medicaginis, Fusarium solani, Aphanomyces euteiches, Stemphylium herbarum, Stemphylium alfalfae; Canola: Albugo Candida, Alternaria brassicae, Leptosphaeria maculans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotiorum, Mycosphaerella brassiccola, Pythium ultimum, Peronospora parasitica, Fusarium roseum, Fusarium oxysporum, Alternaria altemate; Sunflower: Plasmophora halstedii, Selerotinia sclerotiorum, Aster Yellows, Septoria helianthi, Phomopsis helianthi, Alternaria helianthi, Alternaria zinniae, Botrytis cinerea, Phoma macdonaldii, Macrophomina phaseolina, Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonifer, Pueeinia helianthi, Vertieillium dahliae, Erwinia carotovorum pv. carotovora, Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea, Albugo tragopogonis; Wheat: Uroeystis agropyri, Alternaria altemata, Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium culmorum, Ustilago tritici, Ascochyta tritici, Cephalosporium gramineum, Collotetrichum graminicola, Erysiphe graminis f.sp. tritici, Puccinia graminis f.sp. tritici, Puccinia recôndita f.sp. tritici, Puccinia striiformis, Pyrenophora tritici-repentis, Septoria nodorum, Septoria tritici, Septoria avenae, Pseudocercosporella herpotrichoides, Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis, Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium aphanidermatum, Pythium arrhenomanes, Pythium ultimum, Bipolaris sorokiniana, Claviceps purpurea, Tilletia tritici, Tilletia laevis, Ustilago tritici, Tilletia indica, Rhizoctonia solani, Pythium arrhenomannes, Pythium gramicola, Pythium aphanidermatum; Com: Fusarium moniliforme var. subglutinans, Fusarium moniliforme, Gibberella zeae (Fusarium graminearum), Stenocarpella maydi (Diplodia maydis), Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythium graminicola, Pythium splendens, Pythium ultimum, Pythium aphanidermatum, Aspergillusflavus, Bipolaris maydis O, T (Cochliobolus heterostrophus), Helminthosporium carbonum I, II & III (Cochliobolus carbonum), Exserohilum turcicum I, II & III, Helminthosporium pedicellatum, Physoderma maydis, Phyllosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora, Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata, Curvularia inaequalis, Curvulariapallescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Triehoderma viride, Clavieeps sorghi, Com stunt spiroplasma, Diplodia maerospora, Selerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheea reiliana, Physopella zeae, Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium; Sorghum: Exserohilum turcicum, Colletotrichum graminicola (Glomerella graminicola), Cercospora sorghi, Gloeocercospora sorghi, Ascochyta sorghina, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Perconia circinata, Fusarium moniliforme, Alternaria altemata, Bipolaris sorghicola, Helminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Ramulispora sorghi, Ramulispora sorghicola, Phyllachara sacchari, Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana), Sphacelotheca cruenta, Sporisorium sorghi, Rhizoctonia solani, Acremonium strictum, Sclerophthona macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Sclerospora graminicola, Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola, etc. (US 6.630.618). O patógeno oomiceto ou fungico pode ser um fungo oomiceto ou fungico necrotrófico ou pelo menos parcialmente necrotrófico. Preferivelmente patógeno oomiceto ou fungico é um patógeno oomiceto ou fungico necrotrófico.

Outra modalidade da invenção inclui um método para produzir uma planta transgênica resistente a nematódeo, o método compreendendo as etapas de transformar uma célula com um vetor de expressão de resistência a nematódeo compreendendo um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos, regenerar uma planta transgênica a partir da célula transformada, e selecionar plantas transgênicas regeneradas para resistência aumentada a nematódeo.

Outra modalidade da invenção inclui um método para produzir uma planta transgênica resistente a fungo, o método compreendendo as etapas de transformar uma célula com um vetor de expressão de resistência fungica compreendendo um promotor operacionalmente ligado a um dsRNA ou oligonucleotídeo de anti-senso que seleciona um gene tipo pEARLIl, sendo que o dsRNA ou polinucleotídeo de anti-senso é capaz de tomar uma planta resistente a fungo, regenerar uma planta transgênica a partir da célula transformada, e selecionar plantas transgênicas regeneradas para resistência fungica aumentada.

E conhecida uma variedade de métodos para a introdução de polinucleotídeos no genoma de plantas e para a regeneração de plantas a partir de tecidos de planta ou células de planta, em, por exemplo, Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), capítulo 6/7, pp. 71-119 (1993); White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; Transgenic Plants, vol. I, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e Wu R, Academic Press, 15-38; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer; Transgenic Plants, vol. I, Engineering and Utilization, Ed.: Kung e R. Wu, Academic Press, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42:205-225; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56(l):62-73.

Métodos de transformação podem incluir métodos diretos e indiretos de transformação. Métodos diretos adequados incluem absorção de DNA induzida por poli(etileno-glicol), transformação mediada por lipossomo (US 4.536.475), métodos biolísticos usando pistola de gene (Fromm ME et al., (1990) Bio/Technology 8(9):833-9; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603), eletroporação, incubação de embriões secos em solução compreendendo DNA, e microinjeção. No caso destes métodos diretos de transformação, os plasmídeos usados não necessitam atender às exigências particulares. Plasmídeos simples, tais como aqueles da série pUC, pBR322, da série M13mp, pACYC184 e semelhantes podem ser usados. Se plantas intactas são para serem regeneradas a partir das células transformadas, um gene marcador selecionável adicional é preferivelmente localizado no plasmídeo. As técnicas de transformação diretas são igualmente adequadas para plantas dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Transformação também pode ser realizada por infecção bacteriana por meio de Agrobacterium (por exemplo EP 0.116.718), infecção viral por intermédio de vetores virais (EP 0.067.553; US 4.407.956; WO 95/34668; WO 93/03161) ou por meio de pólen (EP 0.270.356; WO 85/01856; US 4.684.611). Técnicas de transformação baseadas em Agrobacterium (especialmente para plantas dicotiledôneas) são bem conhecidas na arte. A cepa de Agrobacterium (e.g., Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhizogenes) compreende um plasmídeo (plasmídeo Ti ou Ri) e um elemento T-DNA que é transferido para a planta após infecção com Agrobacterium. O T-DNA (DNA transferido) é integrado no genoma da célula de planta. O T-DNA pode estar localizado no plasmídeo- Ri ou -Ti ou pode estar separadamente compreendido em um denominado vetor binário. Métodos para a transformação mediada por Agrobacterium são descritos, por exemplo, em Horsch RB et al. (1985) Science 225:1229f. A transformação mediada por Agrobacterium está melhor adaptada para plantas dicotiledôneas mas também tem sido adaptada para plantas monocotiledôneas. A transformação de plantas por Agrobacteria é descrita em, por exemplo, White FF, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 15 - 38; Jenes B et al. Techniques for Gene Transfer, Transgenic Plants, Vol. I, Engineering and Utilization, editado por S.D. Kung e R. Wu, Academic Press, 1993, pp. 128-143; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol. Biol 42:205- 225.

Transformação pode resultar em expressão e transformação estáveis ou transientes. Embora uma seqüência de nucleotídeos possa ser inserida em qualquer planta ou célula de planta caindo dentro destas classes amplas , é particularmente útil em células de planta de colheita. Os nucleotídeos da presente invenção da presente invenção podem ser diretamente transformados no genoma da plastídeo. Expressão em plastídeo, no qual genes são inseridos por recombinação homóloga em várias milhares de cópias de genoma de plastídeo circular presentes em cada célula de planta, se beneficia do número enorme de cópias sobre os genes expressados no núcleo para permitir níveis altos de expressão. Em uma modalidade, os nucleotídeos são inseridos em um vetor selecionador de plastídeo e transformados no genoma de plastídeo de uma planta hospedeira desejada. Plantas homoplásmicas para genomas de plastídeo contendo as seqüências de nucleotídeos são obtidas, e são preferencialmente capazes de expressão alta dos nucleotídeos.

Tecnologia de transformação de plastídeo é por exemplo extensivamente descrita em Pat. U.S. Nos. 5.451.513, 5.545.817, 5.545.818, e 5.877.462 em WO 95/16783 e WO 97/32977, e em McBride et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91, 7301-7305, todas aqui incorporadas em suas totalidades como referências. A técnica básica para transformação de plastídeo envolve introdução de regiões de DNA plastídeo clonado flanqueando um marcador selecionável junto com a seqüência de nucleotídeos em um tecido alvo adequado, e.g., usando transformação biolística ou de protoplasto (e.g., transformação mediada por cloreto de cálcio ou PEG). As regiões flanqueadoras de 1 a 1,5 kb, chamadas seqüências selecionadoras, facilitam recombinação homóloga com o genoma de plastídeo e assim permitem a substituição ou modificação de regiões específicas do plastoma. Inicialmente, mutações pontuais nos genes de cloroplasto 16S rRNA e rpsl2 concedentes de resistência à espectinomicina e/ou estreptomicina são utilizadas como marcadores selecionáveis para transformação (Svab et al., PNAS 87, 8526-8530, 1990; Staub et al., Plant Cell 4, 39-45, 1992). A presença de sítios de clonagem entre estes marcadores permite criação de um vetor selecionador de plastídeo para introdução de genes estranhos (Staub et al., EMBO J. 12, 601-606, 1993). Aumentos substanciais em freqüência de transformação são obtidos por substituição de genes de resistência a antibiótico de proteína-r ou rRNA recessivos por um marcador selecionável dominante, o gene aadA bacteriano codificador da enzima espectinomicina- destoxificadora amino-glicosídeo-3'-adeniltransferase (Svab et al., PNAS 90, 913-917, 1993). Outros marcadores selecionáveis úteis para transformação de plastídeo são conhecidos na arte e estão incluídos dentro do escopo da invenção.

As plantas transgênicas da invenção podem ser usadas em um método de controle de infestação de uma plantação por um patógeno de planta, que compreende a etapa de crescer dita plantação a partir de sementes compreendendo um vetor de expressão compreendendo um ou mais elementos regulatórios de transcrição operacionalmente ligados em um ou mais polinucleotídeos que codificam um agente tóxico para dito patógeno de planta, sendo que o vetor de expressão é estavelmente integrado nos genomas das sementes.

Embora as composições e os métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de certas modalidades, será evidente para aquelas pessoas experientes na arte que variações podem ser aplicadas na composição, nos métodos e nas etapas ou na seqüência de etapas do método aqui descritos sem se desviarem do conceito, do espírito e do escopo da invenção. Todos tais substituintes e modificações similares evidentes para aquelas pessoas experientes na arte são considerados em estarem dentro do espírito, do escopo e do conceito da invenção como definidos pelas reivindicações anexadas. EXEMPLOS

Exemplo 1: Identificação de genes tipo pEARLIl em raízes infectadas com SCN

Análise em microarranjo de células sinciciais excitadas por 10

laser de raízes de feijão-soja inoculadas com nematódeos juvenis de segundo estágio (J2) de H. glycines race3 levou à identificação de genes expressados especificamente ou diferencialmente em sincícios. Três tais genes de feijão- soja (correspondendo aos clones GM50292847, GM47093397, e GM50857725 de cDNA) foram infra-regulados nos sincícios comparados com tecido de raiz não infectado em Tabela 1, que resumo os dados de expressão medidos por análise em microarranjo de cDNA através de três amostras de tecido/célula: sincícios, não-sincícios infectados com SCN e tecidos de raiz de controle não tratados. Níveis relativos de expressão de gene são expressados como intensidades de sinal normalizadas (± desvio padrão) como descrito acima.

Tabela 1. Expressão de genes tipo pEARLIl de feijão-soja

Nome do Gene Sincícios# I (N) Sincícios#2 (N) Não-Sincícios Raízes de Controle GM50292847 ND** 90±37 92±39 410±278 GM47093397 63±18 133±97 222±58 2122±1798 GM50857725 ND ND 146±98 728±443 **Não detectáve sob condições experimentais descritas neste estudo. 15

20

25

Exemplo 2: Clonagem de gene tipo pEARLIl At4gl2500 O gene tipo pEARLIl de Arabidopsis codificado por At4g 12500 foi selecionado baseado em sua similaridade com as seqüências de cDNA de feijão-soja indicadas em Exemplo I. Com o propósito de expressar esta proteína a seqüência codificadora foi amplificada por PCR a partir do DNA genômico, que é faltante de íntrons, usando as técnicas de biologia molecular padrão. O produto amplificado foi ligado em um vetor de entrada TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Exemplo 3: Construção de vetor para transformação e geração de raízes transgênicas

A região codificadora clonada do gene tipo pEARLIl At4g 12500 gerado no Exemplo 2 foi seqüenciada e subclonada em um vetor de expressão de planta contendo um promotor preferido para sincícios (induzido por nematódeo) usando o sistema Gateway™. O promotor tipo-TPP preferido para sincícios (SEQ ID NO: 21, USSN 60/874,375) foi usado no construto como mostrado em Tabela 2. O marcador de seleção para transformação foi BAR, um gene que concedeu resistência ao herbicida LIBERTY (glufosinato, Bayer Crop Science, Kansas City, MO, US).

Tabela 2. Vetor de expressão compreendendo SEQ ID NO:l

vetor Composição do vetor de sobre-expressão (promotor::polinucleotídeo tipo pEARLIl) RLM565 promotor tipo-TPP::At4g!2500 Exemplo 4: Uso de sistema de ensaio de planta feijão-soja para detectar resistência à infecção por SCN

O ensaio de explante enraizado patenteado foi utilizado para

demonstrar sobre-expressão de genes tipo pEARLIl e a resistência a nematódeo resultante. Este ensaio pode ser encontrado em pedido de patente copendente comumente cedido de propriedade comum USSN 12,001,234.

Sementes de feijão-soja limpas de cultivar de feijão-soja foram esterilizadas e germinadas. Três dias antes da inoculação, foi iniciada uma cultura líquida noturna da cultura de Agrobacterium desarmada, por exemplo, a cepa K599 de A. rhizogenes desarmada contendo o vetor binário RLM565. No dia seguinte a cultura foi espalhada sobre uma placa de ágar LB contendo canamicina como um agente de seleção. As placas foram incubadas a 28°C por dois dias. Uma placa foi preparada para cada um dos 50 explantes a serem inoculados. Cotilédones contendo a extremidade proximal de sua conexão com as plantas jovens foram usados como o explante para transformação. Após remoção dos cotilédones a superfície foi raspada com um escalpelo ao redor do sítio de corte. O cotilédone cortado e raspado foi o alvo para a inoculação de Agrobacterium. Os explantes preparados foram imersos em colônias de A. rhizogenes espessas desarmadas preparadas acima de modo que as colônias ficassem visíveis sobre a superfície cortada e raspada. Os explantes foram então postos sobre ágar 1% em placas de Petri para co- cultivo sob luz por 6-8 dias. Após a transformação e a co-cultura os explantes de feijão-soja foram transferidos para meio de indução de enraizamento com um agente de seleção, por exemplo S-B5-708 para o gene de aceto-hidróxi-ácido-sintase (AHAS) mutado (Sathasivan et al., Plant Phys. 97:1044-50, 1991). Culturas 5 foram mantidas na mesma condição como na etapa de co-cultura. O meio S- B5-708 compreende: 0,5X sais B5, MES 3mM, sacarose 2%, IX vitaminas B5, Timentina 400 μ§/ηι1, ágar Noble 0,8%, e Imazapir 1 μΜ (agente de seleção para gene AHAS) (BASF Corporation, Florham Park, NJ) em pH 5,8.

Duas a três semanas após a seleção e a indução de raiz, raízes 10 transformadas foram formadas sobre as extremidades cortadas dos explantes. Explantes foram transferidos para o mesmo meio de seleção (meio S-B5-708) para seleção adicional. Raízes transgênicas proliferaram bem dentro de uma semana no meio e estavam prontas para serem subcultivadas. Raízes de feijão-soja brancas e fortes foram excisadas dos explantes enraizados e 15 cultivadas em meio de crescimento de raiz suplementado com 200 mg/l de Timentina (meio S-MS-606) em placas de seis cavidades. Culturas foram mantidas na temperatura ambiente sob a condição escura. O meio S-MS-606 compreende: 0,2X sais MS e vitaminas B5, sacarose 2%, e Timentina 200 mg/l em pH 5,8.

Um a cinco dias após sub-cultura, as raízes foram inoculadas

com nematódeos juvenis esterilizados em superfície em placas de multicavidades para ensaio quer de gene de interesse quer de construto de promotor. Raízes de vetor de controle de feijão-soja de cultivar Williams 82 e de vetor de controle de feijão-soja de cultivar Jack foram usadas como 25 controles suscetíveis e resistentes, respectivamente. As culturas de raiz transformada de cada linhagem foram inoculadas com race 3 de superfície descontaminada de nematódeos de cisto de feijão-soja (SCN) juvenis de segundo estágio (J2) no nível de 500 J2/cavidade. As placas foram então seladas e postas de volta na incubadora a 25°C no escuro. Várias linhagens de raiz independentes foram geradas de cada transformação de vetor binário e as linhagens foram usadas para bioensaio.

Quatro semanas após inoculação de nematódeo, o número de cistos em cada cavidade foi contado. Para cada linhagem transformada, os valores de o número médio de cistos por linhagem, o índice de fêmeas e o

r

erro padrão foram determinados através de várias cavidades replicadas (índice de fêmeas = número médio de cistos de SCN desenvolvendo sobre raízes transgênicas expressado como percentagem do número médio de cistos desenvolvendo sobre raízes de controle suscetíveis de tipo selvagem W82). Os resultados mostram que a maioria das raízes transformadas com RLM565 teve contagens de cistos reduzidas sobre múltiplas linhagens transgênicas e uma tendência geral de contagem de cistos reduzida na maioria das linhagens transgênicas ensaiadas, relativo às raízes de controle suscetíveis.

Exemplo 5: Identificação de genes tipo pEARLIl adicionais e clonagem em vetores de expressão binários

Genes tipo pEARLIl adicionais foram identificados baseado em similaridade de seqüências de nucleotídeos e de proteína com At4gl2500 (SEQ ID NO: I e SEQ ID NO: 2, respectivamente) pela realização de pesquisas BLAST contra bancos de dados públicos e bancos de dados de cDNA particulares, tais como Genbank, TIGR e TAIR. Alguns dos genes tipo pEARLIl assim identificados são listados em Figura 1.

A região codificadora de comprimento total de feijão-soja GM50292847 (SEQ ID NO: 3) foi amplificada por PCR a partir do clone 50292847 de cDNA patenteado. O produto de PCR foi clonado em um vetor intermediário TOPO-TA (Invitrogen, Carlsbad, CA), seqüenciado e então subclonado em um vetor de expressão binário de planta usando digestão por restrição e reações de ligação padrão. O vetor resultante, daqui em diante chamado de RBM020 ou pBM020, continha a seqüência codificadora GM50292847 expressada sob o controle do promotor de ubiquitina de salsa 10

15

20

(WO 03/102198). O marcador de seleção para transformação foi a forma mutada do gene de seleção AHAS (também chamado de AHAS2) de Arabidopsis thaliana (Sathasivan et al., Plant Phys. 97:1044-50, 1991), concedendo resistência ao herbicida ARSENAL (imazapir, BASF Corporation, Mount Olive, NJ). Expressão do marcador de seleção AHAS2 também foi controlada pelo promotor de ubiquitina de salsa.

Regiões de comprimento total de Arabidopsis At4g22460 (SEQ ID NO: 13), Atlg62510 (SEQ ID NO: 17), At4gl2530 (SEQ ID NO:19), At4g12490 (SEQ ID NO: 9), At4gl2520 (SEQ ID NO: 11) e At5g46900 (SEQ ID NO: 15), todas as quais faltantes de íntrons, foram amplificadas por PCR a partir de DNA genômico Col-O ecótipo de Arabidopsis thaliana. As regiões amplificadas foram clonadas em vetores de expressão binários de planta sob o controle do promotor tipo-TPP (SEQ ID NO:21) com o marcador de seleção AHAS2 descrito acima. Os nomes de vetor correspondendo aos construtos de expressão de tipo pEARLIl específicos são mostrados em Tabela 3 abaixo.

Tabela 3. Vetores de expressão tipo pEARLIl de Arabidopsis e feijão-soja

vetor Composição do vetor de expressão SEQ ID NO para seqüência (promotor: :PLPCP) codificadora RBM020 promotor de ubiquitina: :GM50292847 SEQ ID NO: 3 RCB873 promotor tipo-TPP: :At4g22460 SEQ ID NO: 13 RCB868 promotor tipo-TPP::Atlg62510 SEQ ID NO: 17 RCB872 promotor tipo-TPP::At4g 12530 SEQ ID NO: 19 RCB869 promotor tipo-TPP::At4g 12490 SEQ ID NO: 9 RCB871 promotor tipo-TPP::At4g 12520 SEQ ID NO: 11 RCB874 promotor tipo-TPP: :At5g46900 SEQ ID NO: 15 Exemplo 6: Ensaio em nematódeo para RBM020, RCB873 e

RCB868

Culturas de explante enraizado foram transformadas com vetores de expressão RBM020, RCB873 e RCB868, cultivadas e inoculadas com nematódeos de cisto de feijão-soja (SCN) juvenis de segundo estágio (J2) como descritos em Exemplo 4.

Várias linhagens de raiz independentes foram geradas de cada transformação de vetor binário, e as linhagens foram usadas para bioensaio. Quatro semanas após inoculação de nematódeo, os cistos em cada cavidade foram contados.

Culturas de explante enraizado transformadas com construtos 5 RMB020, RCB873 e RCB868 exibiram uma tendência geral de números de cistos e índice de fêmea reduzidos em comparação com o controle suscetível. Para cada um destes construtos, a maioria das linhagens transformadas teve menos cistos em relação ao número médio de cistos encontrados no controle suscetível Williams82.

Sobre-expressão do gene tipo pEARLIl GM50292847 de

feijão-soja (SEQ ID NO:3) em associação operativa com o promotor TPP (SEQ ID NO:21), o "super-promotor", e um promotor secundário induzível por nematódeo não resultou em uma redução de contagem de cistos. Sobre- expressão de GM4709339 (SEQ ID NO:5), e GM50857725 (SEQ ID NO:7) 15 em associação operativa com o promotor TPP não resultou em uma redução de contagem de cistos.

Exemplo 7: Geração de Arabidopsis transgênica e bioensaios de nematódeo e de fungo

O gene tipo pEARLIl de Arabidopsis codificado por 20 At4g12490 é elevadamente homólogo à seqüência At4g 12500 descrita acima. Um construto de RNAi compreendendo nucleotídeos 1 a 549 de SEQ ID NO:9 (a seqüência de comprimento total de At4g12490) foi baseado no vetor de RNAi, pJawohl8 (Número de Acesso no GenBank: AF408413). Este vetor continha dois cassetes-GATEWAY-(Invitrogen, Carlsbad, Califórnia) 25 arranjados em orientação invertida separados por um intron (Intron 1 de fator 33 de transcrição WRKY de Arabidopsis thaliana, Número de Acesso no GenBank de NM129404). O cassete de RNAi é dirigido por um promotor CaMV-35S e um sinal de poliadenilação 35S (terminador) (Zimmerli et al., 2004 Plant Journal 40, 633-46). Transformação de Arabidopsis foi realizada usando procedimentos padrão conhecidos por aquelas pessoas na arte.

O fungo fitopatogênico Alternaria brassicicola foi mantido

r

sobre Agar 2% contendo 2% de extrato de malte. As placas foram incubadas a 24°C com ciclo de 12 h de luz/escuro. Para inocular as plantas, uma 5 suspensão de esporos foi preparada por enxágüe das placas de cultura fungica de 12 dias de idade com solução de extrato de malte 2% e filtração o meio de esporos-micélio foi filtrado através de gaze. A densidade de esporos foi determinada por contagem em uma câmara Thoma. Uma suspensão de esporos recém-colhida com uma densidade de 1 - 1,5 xlO6 esporos/mL foi 10 usada para inocular as plantas.

As plantas transgênicas Arabidopsis (ecótipo Col-O e o Col- 0penl-pen2 duplamente mutado (Lipka et al., Science 310, 1180, 2005; Collins et al., Nature 425, 973, 2003) contendo o construto At4g12490 RNAi foram crescidas em solo por aproximadamente 26 dias sob condições de luz de 12 h padrão.

As plantas foram inoculadas por borrifo da suspensão de esporos descrita acima. Imediatamente após a inoculação, as plantas foram deixadas no escuro com umidade de 100%. Oitenta e quatro horas após a inoculação as plantas foram retomadas para as condições normais, com 12 horas de luz e 68% de umidade.

Os sintomas de doença foram classificados 4 e 8 dias após a inoculação. Três parâmetros foram usados para classificar as respostas das plantas ao patógeno: aparecimento de micélio sobre/na folha, aparecimento de áreas cloróticas abaixo do micélio, e necrose e/ou maceração do tecido.

Para dsRNA baseado em At4g12490 em plantas Arabidopsis

Col-0, foi verificada uma resistência aumentada à infecção por Alternaria comparada com os controles de tipo selvagem. Todas as plantas testadas (13 das 13 plantas) de 5 linhagens independentes mostraram um nível reduzido de clorose abaixo do micélio. Adicionalmente a área de necrose foi reduzida em comparação com os controles de tipo selvagem. Este resultado demonstra o envolvimento do gene tipo pEARLIl At4g12490 na resistência ao fungo necrotrófico Alternaria brassicicola. Para o dsRNA baseado em At4g12490 em plantas Col-O penl-pen2 duplamente mutadas Arabidopsis, 2 das 14 linhagens de planta mostraram uma clorose forte.

Plantas transgênicas também foram desafiadas com o patógeno biotrófico H. schactii (nematódeo de cisto de beterraba). Neste caso, as plantas foram menos resistentes do que os controles. Isto sugere que a modulação do nível de produto de gene tipo pEARLIl pode influenciar resistência ao patógeno.

Aquelas pessoas experientes na arte reconhecerão, ou serão capazes de averiguar usando experimentação não mais do que rotineira, muitos equivalentes às modalidades específicas da invenção aqui descritas. Tais equivalentes são intencionados para serem incluídos nas seguintes reivindicações.

Claims (14)

1. Planta transgênica resistente a nematódeo, caracterizada pelo fato de estar transformada com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.

2. Planta transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado é selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, ou 19; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2, 4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, ou20; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15,17, ou 19; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polipeptídeo definido em SEQID NO:2, 4, 6,8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; e) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou19; e f) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo definido em SEQ ID25 NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

3. Planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser adicionalmente definida como uma monocotiledônea.

4. Planta de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser adicionalmente definida como uma dicotiledônea.

5. Planta de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a planta é selecionada do grupo consistindo de ervilha, guandu, Lotus, sp., Medicago truncatula, alfafa, feijão-soja, cenoura, aipo, tomateiro, batateira, algodoeiro, tabaco, pimenteira, colza, beterraba, repolho, couve- flor, brócolis, alface e Arabidopsis thaliana.

6. Semente transgênica, caracterizada pelo fato de ser geração verdadeira para um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.

7. Semente transgênica de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado é selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2, 4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, ou20; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; e) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; e f) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

8. Vetor de expressão de resistência a nematódeo, caracterizado pelo fato de compreender um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.

9. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado é selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo definidos em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, ou 19; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência definida em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; e) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO: 1,3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou19; e f) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

10. Método para produzir uma planta transgênica resistente a nematódeo, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: a) introduzir em uma célula de planta um vetor de expressão de resistência a nematódeo compreendendo um promotor operacionalmente ligado em um polinucleotídeo tipo pEARLIl isolado capaz de tomar uma planta resistente aos nematódeos.; e b) gerar, da célula de planta, a planta transgênica expressando o polinucleotídeo tipo pEARLIl.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo tipo pEARLIl é selecionado do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQIDNO:l,3, 5,7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo definidos em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, ou 19; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polipeptídeo tendo a seqüência definida em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; e) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; e f) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com um polinucleotídeo codificador do polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

12. Molécula de dsRNA que concede resistência a fungos necrotróficos a uma planta, caracterizada pelo fato de que a molécula de dsRNA compreende uma primeira fita substancialmente idêntica a uma porção de um gene alvo, tipo pEARLI 1, e uma segunda fita substancialmente complementar à primeira fita.

13. Molécula de dsRNA de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a porção do gene alvo tipo pEARLIl é de 19 a500 nucleotídeos de uma seqüência selecionada do grupo consistindo de: a) um polinucleotídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:I, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; b) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo uma seqüência como definida em SEQ ID NO:2, 4,6,8, 10, 12, 14, 16, 18, ou20; c) um polinucleotídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13,15, 17, ou 19; d) um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo tendo pelo menos 70% de identidade de seqüência com o polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20; e) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo definido em SEQ ID NO:l, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, ou 19; e h) um polinucleotídeo que hibridiza sob condições estringentes com o polinucleotídeo codificador do polipeptídeo definido em SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, ou 20.

14. Planta transgênica compreendendo o dsRNA de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a planta é mais resistente à infestação de fungo necrotrófico do que uma planta de tipo selvagem de mesma variedade.