BRPI0806819A2 - métodos e pelìculas de polipeptìdeo - Google Patents

Abstract

MéTODOS E PELICULAS DE POLIPEPTIDEO A presente invenção refere-se às películas em multicamadas de polipeptídeo em que um agente terapêutico é covalentemente ligado a uma primeira camada de polipeptídeo. Uma vantagem de tal fixação consiste no fato de que o agente terapêutico ligado pode ser liberado de maneira controlável a partir da película em multicamada no ambiente da película mediante a adição de um estímulo adequado. Uma vantagem das películas e métodos descritos é a permissão de liberação ambientalmente estimulada sob condições específicas.

Description

MÉTODOS E PELÍCULAS DE POLIPEPTÍDEO

Fundamentos da Invenção

As películas em multicamadas de polieletrólito são películas finas (por exemplo, alguns nanômetros a milímetros de espessura) compostas de camadas alternadas de polieletrólitos opostamente carregados. Tais películas podem ser formadas através da montagem camada por camada em um substrato adequado. Na automontagem eletrostática camada por camada ("ELBL"), a base física de associação de polieletrólitos é eletrostática. O acúmulo de película é possível devido ao fato de o sinal da densidade de carga de superfície da película inverter na deposição de camadas sucessivas. 0 princípio geral da deposição de ELBL de poliíons opostamente carregados é ilustrado na Figura 1. A generalidade e simplicidade relativa do processo de película de ELBL permitem a deposição de muitos tipos diferentes de polieletrólitos sobre muitos tipos diferentes de superfície. As películas em multicamadas de polipeptídeo consistem em um subconjunto de películas em multicamadas de polieletrólito que compreende pelo menos uma camada que compreende um polipeptídeo carregado. Uma vantagem chave das películas em multicamadas de polipeptídeo é a benignidade ambiental. As películas de ELBL também podem ser usadas para encapsulação. As aplicações de películas de polipeptídeo e microcápsulas incluem, por exemplo, nano- reatores, biossensores, células artificiais e veículos de distribuição de fármaco.

Os princípios de projeto para a incorporação de polipeptídeos nas películas em multicamadas foram elucidados primeiro no pedido de patente U.S. número 20050069950. Em resumo, a adequabilidade de um polipeptídeo para a ELBL é relacionada à carga líquida no polipeptídeo e o comprimento do polipeptídeo. Um polipeptídeo adequado para a ELBL compreende, de preferência, um ou mais motifs de seqüência de aminoácido, ou seja, seqüências de aminoácido contíguas que têm um comprimento de cerca de 5 a cerca de 15 resíduos de aminoácido e que têm uma densidade de carga linear adequada para a deposição eletrostática. Um polipeptídeo para ELBL pode ser projetado de diferentes maneiras, por exemplo, unindo-se uma pluralidade de motifs de seqüência de aminoácido uns aos outros, diretamente ou através de um aglutinante. Os polipeptídeos que têm o comprimento e as propriedades de carga adequadas podem ser prontamente depositados para formar uma ou mais camadas de uma película em multicamada de polipeptídeo.

Embora os princípios de projeto básicos para as películas em multicamadas de polipeptídeo tenham sido elucidados, ainda permanece uma necessidade de projetar películas em multicamadas de polipeptídeo que têm uma funcionalidade desejada, particularmente, funcionalidade biológica.

SUMÁRIO

Em uma modalidade, uma película em multicamada compreende duas ou mais camadas de polieletrólitos, sendo as camadas adjacentes compreendem polieletrólitos opostamente carregados, sendo que uma primeira camada de polieletrólito compreende uma primeira camada de polipeptídeo que compreende um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido, sendo que um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido consistem em 5 a 15 aminoácidos e têm uma carga líquida por resíduo de 0,4. A primeira camada de polipeptídeo tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e tem um equilíbrio de carga a pH 7 maior ou igual a aproximadamente metade do comprimento total da primeira camada de polipeptídeo; sendo que a primeira camada de polipeptídeo compreende um agente terapêutico reversível ligado à primeira camada de polipeptídeo. Uma segunda camada compreende a segunda camada de polieletrólito que compreende um material policatiônico ou um material polianiônico que tem um peso molecular maior que 1.000 e pelo menos 5 cargas por molécula, sendo que a segunda camada não compreende um polipeptídeo.

Um método para liberar de maneira controlável um agente terapêutico de uma película em multicamada de polipeptídeo compreende proporcionar a película em multicamada de polipeptídeo descrita acima e entrar em contato com a película com um estímulo adequado para estimular a liberação do agente terapêutico a partir da ligação reversível.

Em outra modalidade, um método para montagem de uma película em multicamada de polipeptídeo compreende dispor uma segunda camada de polieletrólito sobre um substrato, sendo que a segunda camada de polieletrólito compreende um material policatiônico ou um material polianiônico que tem um peso molecular maior que 1.000 e pelo menos 5 cargas por molécula, sendo que a segunda camada não compreende um polipeptídeo; e dispor uma primeira camada de polipeptídeo na segunda camada de polieletrólito, sendo que a primeira camada de polipeptídeo compreende um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido, sendo que um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido consistem em 5 a 15 aminoácidos e têm uma carga líquida por resíduo de 0,4. A primeira camada de polipeptídeo tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e tem um equilíbrio de carga a pH 7 maior ou igual a aproximadamente metade do comprimento total da primeira camada de polipeptídeo; e a primeira camada de polipeptídeo compreende um agente terapêutico reversível ligado à primeira camada de polipeptídeo.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 mostra uma montagem esquemática de polipeptídeos opostamente carregados.

A Figura 2 mostra a reação de DTNB com cadeias laterais de Cys em NI. Um grupo TNB torna-se ligado a um grupo peptídeo tiol através da formação de uma ligação de aissulfeto.

A Figura 3 mostra o espectro de absorbância de soluções LNl após a diálise extensiva para remover o DTNB não reagido, porém, antes (0 h) e 1,5 h após a adição de DTT. O pico a 412 nm no espectro de 1,5 h ocorre devido aos diânions de TNB, enquanto aquele a 328 nm (0 h) ocorre devido ao dissulfeto misturado com TNB-tiol. 0 aumento agudo na absorbância abaixo de 300 nm ocorre devido ao DTT.

O ombro evidente por volta de 275 nm nos pontos de tempo posteriores (não mostrado) ocorre devido ao DTT oxidado.

A Figura 4 mostra a película em multicamada absorbância (espessura óptica) a 190 nm versus o número de camadas.

A Figura 5 mostra TNB a dissociação do peptídeo LNl na difusão interna de DTT. A Figura 6 mostra o espectro de absorbância do meio líquido circundante de 10 P1/LN1 nano-revestimentos, registrado 0,5, 30 ou 60 minutos após a imersão em solução DTT de 0,1 mM. A absorbância de TNB aumenta com o tempo.

A Figura 7 mostra a absorbância a 412 nm do meio de liberação para 10 P1/LN1 películas versus o tempo de incubação. As películas "terminadas" têm (P1/N1)2 na superfície externa. A cinética de liberação de TNB depende do potencial redox e o comportamento físico apresentada pelas camadas de terminação.

A Figura 8 mostra um diagrama esquemático de liberação estimulada por redox de TNB a partir de nano-revestimentos multicamadas de polipeptídeo. As moléculas de DTT são omitidas por uma questão de simplicidade. ΔΕ significa a alteração no potencial de redução, tempo At.

DESCRIÇÃO DETALHADA

A presente invenção é direcionada às películas em multicamadas de polipeptídeo que compreendem pelo menos uma camada que compreende uma primeira camada de polipeptídeo, sendo que o polipeptídeo compreende um agente terapêutico ligado de maneira reversível, por exemplo, um fármaco. Os revestimentos multicamada de polieletrólito podem ser úteis para a liberação de fármaco, por exemplo, a partir de implantes médicos, tal como, um stent. Em uma abordagem, os agentes terapêuticos são carregados em um revestimento após a preparação de revestimento, e o agente terapêutico é liberado por difusão. Em outra abordagem, os agentes terapêuticos são encapsulados em um revestimento multicamada; novamente, a liberação é administrada por difusão. Uma abordagem alternativa, descrita no presente documento, é formar uma ligação covalente entre o agente terapêutico e a primeira camada de polipeptideo, onde a ligação covalente é reversível sob algumas condições fisiológicas. Por exemplo, moléculas contendo tiol de 5,5'- ditio-bis(2-ácido nitrobenzóico) (DTNB) podem ser "carregadas" em polipeptídeos 32-mer contendo Cys contendo através da ligação de formação de dissulfeto, os peptídeos "carregados" podem ser incorporados em uma película em multicamada através de ELBL, e 2-nitro-5- diânions tiobenzoato (TNB) podem ser liberados da película através de uma alteração no potencial redox do meio líquido circundante. Tal carga e liberação foram experimentalmente demonstradas. 0 DTNB, também conhecido como reagente de Ellman, pode ser usado para quantificar os grupos sulfidrila livres e dissulfetos em peptídeos e proteínas.

Um aumento no potencial de redução do meio líquido circundante modela a passagem de uma partícula revestida a partir da parte externa de uma célula biológica viva, onde o ambiente é oxidado no interior, onde o mesmo reduz. A abordagem descrita no presente documento permite a liberação ambientalmente estimulada de um agente terapêutico que é ligado de maneira covalente a uma película em multicamada por meio de uma ligação de dissulfeto, que é sensível ao potencial redox local.

Em uma modalidade, uma película em multicamada compreende duas ou mais camadas de polieletrólitos, sendo que as camadas adjacentes compreendem polieletrólitos opostamente carregados, sendo que uma primeira camada de polieletrólito compreende uma primeira camada de polipeptideo que compreende um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido, sendo que um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido consistem em 5 a 15 aminoácidos e têm uma carga líquida por resíduo de 0,4, sendo que a primeira camada de polipeptídeo não é um homopolímero, tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e tem um equilíbrio de carga a pH 7 maior ou igual a aproximadamente metade do comprimento total da primeira camada de polipeptídeo. Uma segunda camada compreende uma segunda camada de polieletrólito que compreende um material policatiônico ou um material polianiônico que tem um peso molecular maior que 1.000 e pelo menos 5 cargas por molécula, sendo que a segunda camada não compreende um polipeptídeo. Em uma modalidade em que a película compreende um substrato, a primeira camada de polipeptídeo é a mais externa, ou camada exposta ao solvente, ou seja, a camada mais distante do substrato.

Os métodos de liberação de um agente terapêutico a partir de uma película em multicamada de polipeptídeo também são descritos no presente documento.

Conforme usado no presente documento, "camada" significa um incremento de espessura, por exemplo, em um substrato para formação de película, que segue uma etapa de adsorção. "Multicamada" significa múltiplos (isto é, dois ou mais) incrementos de espessura. Uma "película em multicamada de polieletrólito" consiste em uma película que compreende um ou mais incrementos de espessura de polieletrólitos. Após a deposição, as camadas de uma película em multicamada podem não permanecer como camadas distintas. Na verdade, é possível que exista a mistura significativa de espécies, particularmente, nas interfaces dos incrementos de espessura.

O termo "polieletrólito" inclui materiais policatiônicos e polianiônicos que têm um peso molecular maior que 1.000 e pelo menos 5 cargas por molécula. Os materiais policatiônicos incluem, por exemplo, poliaminas.

As poliaminas incluem, por exemplo, um polipeptídeo, polivinilamina, poli(aminoestireno), poli(aminoacrilato), poli(N-metil aminoacrilato), poli(N-etilaminoacrilato), poli(N,N-dimetil aminoacrilato), poli(N,N-dietil aminoacrilato), poli(aminometacrilato), poli(N-metil amino- metacrilato), poli(N-etil aminometacrilato), poli(N,N- dimetil aminometacrilato), poli(N,N-dietil aminometacrilato), poli(etilenoimina), poli(cloreto de dialil dimetil amônio), poli(Ν,N,N-cloreto trimetilaminoacrilato), poli(cloreto de metilacriiamidopropiitrimetil amônio), quitosana e combinações que compreendem um ou mais dos materiais policatiônicos precedentes. Os materiais polianiônicos adequados incluem, por exemplo, um polipeptídeo, um ácido nucléico, alginato, carragenina, furcelarano, pectina, xantana, ácido hialurônico, heparina, sulfato de heparana, sulfato de condroitina, sulfato, sulfato de dextrano, ácido poli(met)acrílico, celulose oxidada, carboximetil celulose, polissacarídeos ácidos e croscarmelose, polímeros e copolímeros sintéticos que contêm grupos carboxila pendentes, e combinações que compreendem um ou mais dos materiais polianiônicos precedentes.

"Aminoácido" significa um bloco de construção de um polipeptídeo. Conforme usado no presente documento, o "aminoácido" inclui os 20 L-aminoácidos de ocorrência naturalmente comum, todos os outros aminoácidos naturais, todos os aminoácidos não naturais e todas as imitações de aminoácido, por exemplo, peptóides.

"Aminoácidos de ocorrência natural" significam os 20 L-aminoácidos de ocorrência naturalmente comum, ou seja, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, treonina, cisteína, metionina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, arginina, lisina, histidina, fenilalanina, triosina, triptofano e prolina.

"Aminoácido não natural" significa um aminoácido diferente de qualquer um dos 20 L-aminoácidos de ocorrência naturalmente comum. Um aminoácido não natural pode ter estereoquímica L ou D.

"Peptóide" ou glicina N-substituida significa uma analogia do monômero aminoácido correspondente, com a mesma cadeia lateral que o arriinoácido correspondente, porém, com a cadeia lateral anexada ao átomo de nitrogênio do grupo amino, em vez dos α-carbonos do resíduo. Consequentemente, as ligações químicas entre os monômeros em um polipeptõide não são ligações de peptídeo, que podem ser úteis para limitar a digestão proteolítica.

"Seqüência de aminoácido" e "seqüência" significam um comprimento contíguo de cadeia de polipeptídeo que tem pelo menos dois resíduos de aminoácido de comprimento.

"Resíduo" significa um aminoácido em um polímero ou oligômero; é o resíduo do monômero aminoácido a partir do qual o polímero foi formado. A síntese de polipeptídeo envolve a desidratação, ou seja, uma única molécula de água é "perdida" além do aminoácido em uma cadeia de polipeptídeo. "Motif de seqüência de aminoácido" significa uma seqüência de aminoácido contígua que compreende η resíduos, sendo que η é 5 a 15. Em uma modalidade, a magnitude da carga líquida por resíduo de um motif de seqüência de aminoácido é maior ou igual a 0,4. Em outra modalidade, a magnitude da carga líquida por resíduo de um motif de seqüência de aminoácido é maior ou igual a 0,5. Conforme usado no presente documento, a magnitude da carga líquida refere-se ao valor absoluto da carga líquida, ou seja, a carga líquida pode ser positiva ou negativa.

"Polipeptídeo projetado" significa um polipeptídeo que compreende um ou mais motifs de seqüência de aminoácido, sendo que o polipeptídeo tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento e a razão do número de resíduos carregados da mesma polaridade menos o número de resíduos da polaridade oposta ao número de resíduos total no polipeptídeo é maior ou igual a 0,4 a pH 7,0. Em outras palavras, a magnitude da carga líquida por resíduo do polipeptídeo é maior ou igual a 0,4. Em uma modalidade, a razão do número de resíduos carregados da mesma polaridade menos o número de resíduos da polaridade oposta ao número de resíduos total no polipeptídeo é maior ou igual a 0,5 a pH 7,0. Em outras palavras, a magnitude da carga líquida por resíduo do polipeptídeo é maior ou igual a 0,5. Embora não exista limite superior absoluto no comprimento do polipeptídeo, em geral, os polipeptídeos projetados adequados para a deposição de ELBL têm um limite de comprimento superior prático de 1.000 resíduos.

"Estrutura primária" significa uma seqüência linear contígua de aminoácidos em uma cadeia de polipeptídeo, e "estrutura secundária" significa os tipos mais ou menos regulares de estrutura em uma cadeia de polipeptídeo estabilizada por interações não covalentes, geralmente, ligações de hidrogênio. Os exemplos de estrutura secundária incluem a-hélice, β-folha, e β-volta.

"Película em multicamada de polipeptídeo" significa uma película que compreende um ou mais polipeptídeos, tais como, os polipeptídeos projetados definidos acima. Por exemplo, uma película em multicamada de polipeptídeo compreende uma primeira camada que compreende um polipeptídeo projetado e uma segunda camada que compreende um polieletrólito tem uma carga líquida de polaridade oposta ao polipeptídeo projetado. Por exemplo, se a primeira camada tem uma carga positiva líquida, a segunda camada tem uma carga negativa líquida; e se a primeira camada tem uma carga negativa líquida, a segunda camada tem uma carga positiva líquida. A segunda camada compreende outro polipeptídeo projetado ou outro polieletrólito.

"Substrato" significa um material sólido com uma superfície adequada para a adsorção de polieletrólitos partir da solução aquosa. A superfície de um substrato pode ter basicamente qualquer formato, por exemplo, planar, esférico, em formato de haste, e similares. A superfície de substrato é regular ou irregular. Um substrato pode ser um cristal. Um substrato inclui opcionalmente moléculas bioativas. A faixa de substratos no tamanho a partir da nanoescala até a macro-escala. Além disso, um substrato compreende opcionalmente diversas pequenas subpartículas. Um substrato pode ser feito de material orgânico, material inorgânico, material bioativo ou uma combinação destes. Os exemplos não limitativos de substratos incluem tabletes de silício; partículas coloidais carregadas, por exemplo, micropartícuias de CaCO3 ou de melamina formaldeído; cristais de proteína; cristais de ácido nucléico; células biológicos, tais como, eritrócitos, hepatócitos, células bacterianas ou células de levedura; retícuias de polímero orgânico, por exemplo, retículas de poliestireno ou copolímero de estireno; lipossomas; organelas; e vírus. Em uma modalidade, um substrato é um dispositivo médico, tal como, um marca-passo artificial, um implante coclear ou um stent.

Quando um substrato é desintegrado ou, de outro modo, removido durante ou após a s formação de película, o mesmo é chamado de "um modelo" (para a formação de película). As partículas modelo podem ser dissolvidas em solventes adequados ou removidas através de tratamento térmico. Se, por exemplo, as partículas modelo de melamina formaldeído parcialmente reticuladas forem usadas, o modelo pode ser desintegrado por métodos químicos moderados, por exemplo, em DMSO ou através de uma alteração no valor de pH. Após a dissolução das partículas modelo, os envoltórios multicamadas ocos que permanecem são compostos por camadas de polieletrólito alternadas.

Uma "microcápsula" é uma película de polieletrólito sob a forma de um envoltório oco ou um revestimento que circunda um núcleo. 0 núcleo compreende uma variedade de encapsulantes diferentes, tal como, uma proteína, um fármaco, ou uma combinação destes, sob a forma líquida ou cristalina, por exemplo.

"Molécula bioativa" significa uma molécula, macromolécula, ou montagem macromolecular que tem um efeito biológico. 0 efeito biológico específico pode ser medido em um ensaio adequado e que normaliza o peso por unidade ou por molécula da molécula bioativa. Uma molécula bioativa pode ser encapsulada, retida atrás ou encapsulada em uma película de polieletrólito. Os exemplos não limitativos de uma molécula bioativa consistem em um fármaco, um cristal de um fármaco, uma proteína, um fragmento funcional de uma proteína, um complexo de proteínas, uma lipoproteína, um oligopeptídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucléico, um ribossomo, um agente terapêutico ativo, um fosfolipídeo, um polissacarídeo, a lipopolissacarídeo. Conforme usado no presente documento, "molécula bioativa" abrange adicionalmente as estruturas biologicamente ativas, tais como, por exemplo, um fragmento de membrana funcional, uma estrutura de membrana, um vírus, um patógeno, uma célula, um agregado de células e uma organela. Os exemplos de uma proteína que pode ser encapsulada ou retida atrás de uma película de polipeptídeo consistem em hemoglobina; enzimas, tais como, por exemplo, glicose oxidase, urease, lisozima, e similares; proteínas de matriz extracelular, por exemplo, fibronectina, laminina, vitronectina e colágeno; e um anticorpo. Os exemplos de uma célula que pode ser encapsulada ou retida atrás de uma película de polieletrólito consistem em uma célula de ilhota transplantada, uma célula eucariótica, uma célula bacteriana, uma célula vegetal e uma célula de levedura.

Os agentes terapêuticos são um subconjunto de moléculas bioativas. "Agente terapêutico" significa um composto, elemento ou mistura, que quando administrado em um paciente, sozinho ou em combinação com outro composto, elemento ou mistura confere, direta ou indiretamente, um efeito fisiológico no paciente. O efeito fisiológico indireto pode ocorrer através de um metabólito ou outro mecanismo indireto. Quando o agente ativo é um composto, então, sais, solvatos (incluindo hidratos) do composto ou sal livre, formas cristalinas, formas não cristalinas e quaisquer polimorfos do composto são contemplados no presente documento.

Os agentes terapêuticos adequados são substâncias antiinflamatórias, vasodilatadores coronários, vasodilatores cerebrais, vasodilatores periféricos, antiinfecciosos, psicotrópicos, antimaniacos, estimulantes, anti-histaminas, sedativos gastro-intestinais, preparações anti-diarréia, fármacos anti-anginais, vasodilatadores, antiarrítmicos, fármacos anti-hipertensivos, vasoconstritores, fármacos úteis para tratar enxaquecas, anticoagulantes e fármacos antitrombóticos, analgésicos, antipiréticos, hipnóticos, sedativos, anti-eméticos, anti- nauseantes, anticonvulsivantes, fármacos neuromusculares, agentes hiper- e hipoglicêmicos, preparações de tireóide e antitireóide, diuréticos, antipasmodicos, relaxantes uterinos, aditivos minerais e nutricionais, fármacos anti- obesidade, fármacos anabólicos, fármacos eritropoiéticos, antiasmáticos, expectorantes, supressores de tosse, mucolíticos, fármacos antiuricêmicos, outros fármacos, e combinações que compreendem um ou mais dos agentes terapêuticos precedentes.

"Biocompatível" significa causar nenhum efeito de saúde substancialmente adverso mediante a ingestão oral, aplicação tópica, aplicação transdérmica, injeção subcutânea, injeção intramuscular, inalação, implante ou injeção intravenosa. Por exemplo, as películas biocompatíveis incluem aquelas que não causam uma resposta imune substancial quando em contato com o sistema imune, por exemplo, de um ser humano.

"Resposta imune" significa a resposta do sistema imune celular ou humoral à presença de uma substância em qualquer lugar do corpo. Uma resposta imune pode ser caracterizada de inúmeras maneiras, por exemplo, por um aumento na corrente sangüínea de inúmeros anticorpos que reconhecem um certo antígeno. Os anticorpos são proteínas secretadas por células B, e um antígeno é uma entidade que obtém uma resposta imune. 0 corpo humano combate a infecção e inibe sua reinfecção ao aumentar o número de anticorpos na corrente sangüínea e era outro lugar. A resposta imune específica depende um pouco do indivíduo, apesar de os padrões gerais de resposta serem normais.

"Epítope" significa a estrutura ou seqüência de uma proteína que é reconhecida por um anticorpo. Geralmente, um epítope ficará na superfície de uma proteína. Um epítope contínuo" é aquele que envolve diversos resíduos de aminoácido contíguos, não aquele que envolve os resíduos de aminoácido que ficam em contato ou na região limitada de espaço em uma proteína dobrada.

A presente invenção é direcionada às películas em multicamadas de polipeptídeo que compreendem uma primeira camada de polipeptídeo, sendo que a primeira camada de polipeptídeo compreende uma molécula bioativa ligada de maneira reversível. Outras camadas compreendem polipeptídeos projetados ou outros policátions ou poliânions.

Os princípios de projeto para polipeptídeos adequados para a deposição eletrostática camada por camada são elucidados no pedido de patente U.S. número 2005/0069950, incorporado no presente documento a título de referência. Resumidamente, o projeto primário se refere ao comprimento e à carga do polipeptídeo. A eletrostática é a preocupação de projeto mais importante porque é a base da ELBL. Sem propriedades de carga adequadas, um polipeptídeo não será substancialmente solúvel em solução aquosa a pH 4 a 10 e não pode ser prontamente usado para a fabricação de uma película em multicamada por ELBL. Outras preocupações de projeto se referem à estrutura física dos polipeptídeos, à estabilidade física das películas formadas a partir dos polipeptídeos, e a biocompatibiiidaae e bioatividade das películas e dos polipeptídeos constituintes.

Conforme definido acima, um polipeptídeo projetado significa um polipeptídeo que compreende um ou mais motifs de seqüência de aminoácido, sendo que o polipeptídeo tem pelo menos 15 resíduos de aminoácido de comprimento e a magnitude da carga líquida por resíduo do polipeptídeo é maior ou igual a 0,4 a pH 7,0. nMotif de seqüência de aminoácido" significa uma seqüência de aminoácido contígua que compreende η resíduos de aminoácido, sendo que η é 5 a 15. Os aminoácidos de ocorrência natural positivamente carregados (básicos) a pH 7,0 consistem em Arg, His e Lys. Os resíduos de aminoácido de ocorrência natural negativamente carregados (ácidos) a pH 7,0 consistem em Glu e Asp. Um motif de aminoácido que compreende uma mistura de resíduos de aminoácido de carga oposta pode ser empregado contanto que a razão total de carga atenda os critérios especificados. Em uma modalidade, um polipeptídeo projetado não é um homopolímero.

Em uma modalidade exemplificativa, o motif de seqüência de aminoácido compreende 7 resíduos de aminoácido. Quatro aminoácidos carregados representam um mínimo adequado para um tamanho de motif 7, porque menor que 4 cargas rede solubilidade de peptídeo reduzida e controle reduzido sobre a ELBL. Ademais, com referência à biocompatibilidade, cada motif de seqüência de aminoácido identificado nos dados genômicos é grande o bastante em 7 resíduos de aminoácido que constituem um epítope contínuo, porém, não tão grande quanto os resíduos substancialmente correspondentes, ambos na superfície de uma proteína e em seu interior. Deste modo, a carga e o comprimento do motif de seqüência de aminoácido ajudam a assegurar que um motif de seqüência de aminoácido identificado nos dados genômicos provavelmente ocorra na superfície da proteína dobrada a partir da qual o motif de seqüência é derivado. Em contraste, um motif muito curto pode parecer ser uma seqüência aleatória ou uma não especificamente "auto" e, portanto, obtém uma resposta imune.

Em alguns casos, uma preocupação de projeto que se refere aos motifs de seqüência de aminoácido e polipeptídeos projetados é a sua propensão para formar estruturas secundárias, de maneira notável α-hélice ou β- folha. Em algumas modalidades, é desejável ser capaz de controlar, por exemplo, minimizar a formação de estrutura secundária através dos polipeptídeos projetados em um meio aquoso, a fim de maximizar o controle através da formação de camada de película fina. Primeiro, prefere-se que os motifs de seqüência sejam relativamente curtos, ou seja, cerca de 5 a cerca 15 resíduos de aminoácido, devido ao fato de os motifs longos sejam mais prováveis a adotar uma estrutura tridimensional estável na solução. Segundo, um aglutinante, tal como, um resíduo de glicina ou prolina covalentemente unidas entre sucessivos motifs de seqüência de aminoácido em um polipeptídeo projetado irá reduzir a propensão de o polipeptídeo adotar a estrutura secundária na solução. A glicina, por exemplo, tem uma propensão de a- hélice muito baixa e uma propensão de β-folha muito alta, tornando-a energeticamente muito desfavorável para uma glicina e seus aminoácidos vizinhos para formar a estrutura secundária regular na solução aquosa. Terceiro, a propensão de α-hélice e β-folha dos próprios polipeptídeos projetados pode ser minimizada ao selecionar os motifs de seqüência de aminoácido para os quais a propensão α-hélice somada é menor que 7,5 e a propensão β-folha somada é menor que 8. Propensão "somada" significa a soma das propensões α-hélice ou β-folha de todos os aminoácidos em um motif. Os motifs de seqüência de aminoácido que têm uma propensão α-hélice somada um pouco mais alta e/ou propensão β-folha somada são adequadas para a ELBL, particularmente quando unidos por aglutinantes, tais como, Gly ou Pro. Em certas aplicações, a propensão de um polipeptídeo formar a estrutura secundária pode ser relativamente alta, como um recurso de projeto específico da fabricação de película delgada. As propensões de estrutura secundária para todos os 20 aminoácidos de ocorrência natural podem ser calculadas usando o método de Chou e Fasman (vide P. Chou and G. Fasman, Biochemistry, 13:211 (1974), que encontra-se incorporado a título de referência no presente documento em sua totalidade).

Outra preocupação de projeto é o controle da estabilidade de películas de ELBL de polipeptídeo. As ligações iônicas, ligações de hidrogênio, interações de van der Waals e interações hidrofóbicas contribuem com a estabilidade das películas em multicamadas. Além disso, as ligações de dissulfeto covalentes formadas entre os aminoácidos contendo sulfidrila nos polipeptídeos na mesma camada ou em camadas adjacentes pode aumentar a força estrutural. Os aminoácidos contendo sulfidrila incluem cisteína e homocisteína. Além disso, uma sulfidrila pode ser adicionada aos β-aminoácidos, tal como, D,L-p-amino-£- ácido cilohexil propiônico; ácido D, L-3 -aminobutanóico,· ou ácido 5-(metiltio)-3-aminopentanóico. Aminoácidos contendo sulfidrila podem ser usados para "travar" (ligar entre si) e "destravar" as camadas de uma película de polipeptídeo multicamada através de uma alteração no potencial de oxidação. Também, a incorporação de um aminoácido contendo sulfidrila em um motif de seqüência de um polipeptídeo projetado permite o uso de peptídeos relativamente curtos na fabricação de película delgada, devido à ligação de formação de dissulfeto intermolecular. Os motifs de seqüência de aminoácido que contêm aminoácidos contendo sulfidrila podem ser selecionados a partir de uma biblioteca de motifs identificados usando os métodos descritos abaixo, ou projetados de novo.

Em uma modalidade, os polipeptídeos contendo sulfidrila projetados, se quimicamente sintetizados ou produzidos em um organismo hospedeiro, são montados através da ELBL na presença de um agente de redução para evitar a ligação de formação de dissulfeto prematura. Seguindo a montagem de película, o agente de redução é removido e um agente de oxidação é adicionado. Na presença dos agentes de oxidação ligação de dissulfeto formam entre os grupos sulfidrila "travando" em conjunto, deste modo, os polipeptídeos dentro das camadas e entre as camadas onde os grupos tiol estão presentes. Os agentes de redução adequados incluem ditiotreitol ("DTT"), 2-mercaptoetanol (2-ME), glutationa reduzida, tris(2-carboxyetil)cloridrato de fosfina (TCEP), e combinações de mais de uma destas substâncias químicas. Os agentes de oxidação adequados incluem glutationa oxidada, terc-butilhidroperóxido (t- BHP), timerosal, diamida, 5,5'-ditio-bis-(2-ácido nitro- benzóico) (DTNB), 4,4'-ditiodipiridina, bromato de sódio, peróxido de hidrogênio, tetrationato de sódio, porfirindin, ortoiodosobenzoato de sódio, e combinações de mais de uma destas substâncias químicas.

Biocompatibilidade é uma preocupação de projeto nas aplicações biomédicas. Em tais aplicações, a informação genômica ou proteômica é usada como uma base para o projeto de polímero produzir, de maneira ideal, polipeptídeos "imunes inertes". A abordagem será particularmente útil se o objeto fabricado ou revestido fizer contato com o sangue circulante. Devido ao fato de os motifs de seqüência de aminoácido serem altamente polares, eles ocorrem tipicamente na superfície da forma dobrada nativa da proteína a partir da qual eles são derivados. A "superfície" é aquela parte de uma proteína dobrada que fica em contato com o solvente ou inacessível ao solvente somente por causa da natureza granular da água. Os motifs de seqüência de aminoácido identificados em proteínas do sangue ficam efetivamente sempre em contato com as células e moléculas do sistema imune enquanto a proteína se encontram ano sangue. Portanto, os polipeptídeos derivados da superfície ou proteínas de sangue dobradas são menos prováveis a ser imunogênicas que as seqüências selecionadas aleatoriamente. Os polipeptídeos projetados serão geralmente biocompatíveis, porém, a extensão de resposta imune ou qualquer outro tipo de resposta biológica pode depender dos detalhes específicos de um motif de seqüência.

A bioatividade pode ser incorporada em uma película, revestimento ou microcápsula através de inúmeros métodos. Por exemplo, um polipeptíaeo projetado que compreende a película pode compreender um domínio funcional. De maneira alternativa, a bioatividade pode ser associada à outra molécula bioativa encapsulada ou revestida pela película de polipeptídeo delgada. Em uma modalidade, o modelo compreende uma molécula bioativa, tal como um cristal de proteína.

Um domínio funcional, neste contexto, é uma região independentemente termoestável de uma proteína que tem biofuncionalidade específica (por exemplo, ligação de fosfotirosina). Em uma proteína com múltiplos domínios, múltiplos domínios funcionais podem existir como, por exemplo, na proteína tensina, que abrange um domínio de ligação de fosfotirosina e um domínio de fosfatase de proteína tirosina. A inclusão de um domínio funcional em um polipeptídeo projetado incorporado em uma película em multicamada pode proporcionar a película com a funcionalidade desejada que inclui, por exemplo, ligação de ligante específico, alvo in vivo, biocaptação e biocatálise.

A molécula bioativa pode ser uma proteína, um fragmento funcional de uma proteína, um fragmento funcional de uma proteína que não é parte de um polipeptídeo projetado, um complexo de proteínas, um oligopeptídeo, um oligonucleotídeo, um ácido nucléico, um ribossomo, um agente terapêutico ativo, um fosfolipídeo, um polissacarídeo, um lipopolissacarídeo, um fragmento de membrana funcional, uma estrutura de membrana, um vírus, um patógeno, uma célula, um agregado de células, uma organela, um lipídeo, um carboidrato, um agente farmacêutico ou um antimicrobiano. A molécula bioativa pode ter a forma de um cristal bem ordenado ou amorfo. A proteína pode ser uma enzima ou um anticorpo. 0 substrato pode compreender a molécula bioativa. Em uma modalidade, o substrato tem uma molécula bioativa disposta em sua superfície antes da deposição de camadas de polipeptídeos opostamente carregados. Em outra modalidade, o substrato é um cristal que compreende a molécula bioativa.

Em uma modalidade, os motifs de seqüência de aminoácido são novamente projetados. Em outras modalidades, os motifs de seqüência de aminoácido são selecionados a partir da informação genômica ou proteômica de um organismo específico, tal como, o genoma humano. Por exemplo, a estrutura primária do complemento C3 (gi|68766) ou lactotransferrina (gi|4505043) pode ser usada para procurar por motifs de seqüência de aminoácido em uma proteína de sangue humano.

Um método para identificar um primeiro motif de seqüência de aminoácido em um polipeptídeo compreende selecionar um resíduo de aminoácido iniciador no polipeptídeo; examinar uma seqüência de aminoácido que compreende o resíduo de aminoácido iniciador e os seguintes resíduos de aminoácido n-1 no polipeptídeo para as ocorrências de cargas positivas e negativas, sendo que η ê 5a 15; determinar os 5 a 15 resíduos de aminoácido como um motif de seqüência de aminoácido se a carga líquida das cadeias laterais dos 5 a 15 resíduos de aminoácido a pH 7 for maior ou igual a 0,4*n; ou descartar a seqüência se a carga líquida das cadeias laterais do 5 a 15 resíduos de aminoácido a pH 7 for menor que 0,4*n.

Em uma modalidade, o processo de procurar os dados de seqüência de proteína para um motif de seqüência de aminoácido negativamente carregado de comprimento η que compreende apenas aminoácidos que são neutros ou negativamente carregados é descrito da seguinte maneira.

Primeiro, um primeiro resíduo de aminoácido é selecionado na seqüência de proteína. Segundo, este resíduo de aminoácido e os seguintes resíduos de aminoácido n-1 são examinados para as ocorrências de arginina (Arg), histidina (His) ou lisina (Lys) (os três aminoácidos de ocorrência natural que podem ser positivamente carregados em pH neutro), onde η é 5 a 15. Terceiro, se um ou mais resíduos de Arg, His ou Lys forem encontrados nestes resíduos de aminoácido η, o processo é novamente iniciado em um segundo resíduo de aminoácido. Se, entretanto, nenhuma Arg, His, ou Lys for encontrada nestes resíduos n, os resíduos η são examinados para determinar o número de ocorrências de glutamato (Glu) e/ou aspartato (Asp) (os dois aminoácidos negativamente carregados em pH neutro). Quarto, se existirem pelo menos 0,4*n ocorrências de Glu e/ou Asp nos resíduos n, a seqüência é catalogada como um motif de seqüência de aminoácido negativamente carregado. Se, entretanto, menos que 0,4*η ocorrências de resíduos de aminoácido negativamente carregados forem encontradas, a seqüência que começa com o primeiro resíduo de aminoácido é descartada e o processo é novamente iniciado, por exemplo, no segundo resíduo de aminoácido imediatamente adjacente ao primeiro resíduo de aminoácido. Após catalogar um motif, o processo pode começar novamente no segundo resíduo de aminoácido.

O processo para identificar um motif de seqüência positivamente carregado é análogo para procurar os dados de seqüência de proteína para uma seqüência de aminoácido de resíduo η longa que compreende apenas os resíduos de aminoácido que são neutros ou positivamente carregados, e para os quais a magnitude da carga líquida das cadeias laterais de resíduo de aminoácido em pH neutro é maior ou igual a 0,4*n.

O processo para identificar um motif de seqüência de aminoácido negativamente carregado ou um motif de seqüência de aminoácido positivamente carregado com comprimento n, que permite que tanto os resíduos de aminoácido positivamente carregados, como negativamente carregados no motif também são análogos. Por exemplo, o procedimento para identificar um motif de seqüência de aminoácido positivamente carregado com comprimento η pode ser selecionar um primeiro resíduo de aminoácido em um polipeptídeo. A seguir, examinar este resíduo de aminoácido e os seguintes resíduos de aminoácido n-1 para as ocorrências de resíduos que são positiva ou negativamente carregados a pH 7. Determinar a carga líquida das cadeias laterais de resíduo de aminoácido n. Se o valor absoluto da carga líquida for menor que 0,4*n, então, a seqüência é descartada e uma nova busca é iniciada em outro aminoácido, enquanto se o valor absoluto da carga líquida for maior ou igual a 0,4*n, então, a seqüência é um motif de seqüência de aminoácido. 0 motif será positivo se a carga líquida for maior que zero e negativa se a carga líquida for menor que zero.

Novamente o projeto de motifs de seqüência de aminoácido conforme presentemente definido segue as regras essencialmente similares, exceto pelo fato de que as seqüências não são limitadas àquelas encontradas na natureza. Um comprimento do motif η e um sinal e magnitude desejados de carga líquida são escolhidos. Então, os aminoácidos η são selecionados para o motif de seqüência de aminoácido que resulta no sinal e magnitude desejados de carga, de modo que o valor absoluto da carga líquida dos aminoácidos η seja maior ou igual a 0,4*n. Uma vantagem potencial do projeto de novo de um motif de seqüência de aminoácido é que o profissional pode selecionar entre todos os aminoácidos (os 20 de ocorrência natural e todos os aminoácidos não naturais) para obter a carga líquida desejada, em vez de ser limitado aos aminoácidos encontrados em uma seqüência de proteína particular conhecida. Um pool maior de aminoácidos aumenta a faixa potencial de características físicas, químicas e/ou biológicas que podem ser selecionadas no projeto da seqüência do motif comparado para a identificação de um motif de seqüência de aminoácido em uma seqüência genômica.

Novamente, o projeto de motifs de seqüência de aminoácido conforme presentemente definido segue regras essencialmente similares, exceto pelo fato de que as seqüências não são limitadas àquelas encontradas na natureza. Um comprimento do motif η e um sinal e magnitude desejados de carga líquida são escolhidos. Então, os aminoácidos η são selecionados para o motif de seqüência de aminoácido que resulta no sinal e magnitude desejados de carga, de modo que o valor absoluto da carga líquida dos aminoácidos η seja maior ou igual a 0,4*n. Uma vantagem potencial do novo projeto de um motif de seqüência de aminoácido é o fato de que o profissional pode selecionar entre todos os aminoácidos (os 20 de ocorrência natural e todos os aminoácidos não naturais) para obter a carga líquida desejada, em vez de ser limitados aos aminoácidos encontrados em uma seqüência de proteína particular conhecida. O pool maior de aminoácidos aumenta a faixa potencial de características físicas, químicas e/ou biológicas que podem ser selecionadas no projeto da seqüência do motif comparado com a identificação de um motif de seqüência de aminoácido em uma seqüência genômica.

Um polipeptídeo projetado conforme presentemente definido irá compreender um ou mais motifs de seqüência de aminoácido. O mesmo motif pode ser repetido ou diferentes motifs podem ser unidos ao projeto de um polipeptídeo para ELBL. Em uma modalidade, os motifs de seqüência de aminoácido são covalentemente unidos sem intervir na seqüência. Em outra modalidade, um polipeptídeo projetado compreende dois ou mais motifs de seqüência de aminoácido covalentemente unidos por um aglutinante. 0 aglutinante pode ser à base de aminoácido, por exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido, tal como, glicina ou prolina, ou podem ser quaisquer outros compostos adequados para ligar de maneira covalente dois motifs de seqüência de aminoácido. Em uma modalidade, um aglutinante compreende 1 a 4 resíduos de aminoácido, por exemplo, 1 a 4 resíduos glicina e/ou prolina. 0 aglutinante compreende um comprimento ou composição adequada, de modo que o polipeptídeo projetado seja mantido em uma magnitude de carga líquida por resíduo que é maior ou igual a 0,4.

Em uma modalidade, um polipeptídeo projetado é maior ou igual a 15 resíduos de aminoácido de comprimento. Em outras modalidades, um polipeptídeo projetado é maior que 18, 20, 25, 30, 32 ou 35 aminoácidos de comprimento. 1.000 resíduos são um limite superior prático no comprimento de polipeptídeo.

Uma vez que os motifs de seqüência de aminoácido foram selecionados ou projetados de novo, um polipeptídeo projetado com aglutinantes à base de aminoácido é sintetizado usando os métodos bem conhecido na técnica, tais como, a síntese de fase sólida e química Fmoc ou expressão heteróloga na bactéria que segue a clonagem e transformação de gene. Os polipeptídeos projetados podem ser sintetizados por uma empresa de síntese de peptídeo, por exemplo, Global Peptide (Ft Collins, Colorado), produzidos no laboratório usando um sintetizador de peptídeo, ou produzidos por métodos de DNA recombinante. Qualquer desenvolvimento de novos métodos de síntese de peptídeo pode aumentar a produção de peptídeos, porém, não altera fundamentalmente o projeto de peptídeo, conforme descrito no presente documento.

Após a síntese, a primeira camada de polipeptídeo é reversivelmente ligado a um agente terapêutico. A ligação reversível inclui tanto ligação covalente, como não covalente, enquanto o agente terapêutico é liberado da primeira camada de polipeptídeo mediante a exposição a um estímulo adequado. 0 agente terapêutico pode ser ligado ao N-terminal, C-terminal, ou à cadeia lateral do polipeptídeo, encontrado na natureza ou quimicamente modificado para facilitar a fixação e a liberação. As ligações covalentes reversíveis podem ser formadas, por exemplo, entre um fármaco e grupos sulfidrila, grupos amino livres e grupos carboxila livres na primeira camada de polipeptídeo. As ligações reversíveis não covalentes incluem, por exemplo, ligações iônicas e interações hidrofóbicas.

Em uma modalidade, um grupo álcool, amina ou ácido carboxílico do agente terapêutico é covalentemente fixado ao N-terminal, ao C-terminal ou à cadeia lateral do peptídeo. A localização da fixação depende da escolha do grupo funcional. Por exemplo, se o agente terapêutico for um ácido carboxílico (por exemplo, aspirina), então, o N- terminal do peptídeo é um ponto adequado de fixação. Se o agente terapêutico for uma amina (por exemplo, ampicilina), então, o C-terminal é um ponto adequado de fixação, a fim de obter um agente ativo ligado por peptídeo. Tanto nos exemplos C-terminal, como N-terminal, uma unidade monomérica que forma uma nova ligação de peptídeo, em essência, adiciona uma molécula à extremidade do peptídeo.

Se o agente terapêutico for uma amina, um método alternativo de fixar a amina ao C-terminal do peptídeo é permitir que a amina inicie a fixação. Se o agente terapêutico for um álcool, então, o C-terminal ou o N- terminal consiste em um ponto adequado de fixação, a fim de obter uma composição estável. Por exemplo, quando o agente terapêutico for um álcool, o álcool pode ser convertido em um alquilcloroformato com fosgene ou trifosgene. Este intermediário é, então, reagido com o N-terminal do peptídeo para produzir uma composição de peptídeo de agente terapêutico ligada através de um carbamato. O agente terapêutico de carbamato, então, ser liberado do peptídeo por peptidases, amidases ou esterases intestinais.

De modo alternativo, um agente terapêutico de álcool pode ser seletivamente ligado ao gama carboxilato de ácido glutâmico e, então, este conjugado covalentemente fixado ao C-terminal do peptídeo. Devido ao conjugado de ácido glutâmico-agente terapêutico pode ser considerado um dímero, este produto adiciona duas unidades monoméricas ao C-terminal do peptídeo, onde a porção do ácido glutâmico serve como um espaçador entre o peptídeo e o agente terapêutico. A hidrólise enzimática intestinal da ligação de peptídeo chave libera a porção de ácido glutâmico- fármaco a partir do catalisador de peptídeo. A amina livre recentemente formada do resíduo de ácido glutâmico, então, irá passar por uma reação transaminação intramolecular que libera, deste modo, o agente terapêutico com a formação coincidente de ácido prioglutâmico.

Se o agente terapêutico for uma cetona ou um aldeído, então, um cetal é formado com um aglutinante que tem um grupo pendente adequado para a fixação no N-terminal, C- terminal ou cadeia lateral do peptídeo. Por exemplo, um cetal pode ser formado através da reação de metiltribofuranosida ou glicose com metilnaltrexona, conforme mostrado no exemplo da glicose que reage com metilnaltrexona. A hidroxila livre restante da porção de açúcar pode, então, ser tratada como um álcool para a fixação no C-terminal ou uma cadeia lateral do peptídeo adequada.

Em uma modalidade, o agente terapêutico é fixado ao N- terminal do peptídeo. Os aminoácidos adequados para a fixação incluem ácido glutâmico, ácido aspártico, serina e lisina, por exemplo. Os fármacos adequados para a fixação N-terminal proporcionam, de maneira típica, um ácido carboxílico ou um grupo funcional inorgânico para a conjugação, tais como, por exemplo, ibuprofeno, furosemida, gemfibrozila e naproxeno.

Em uma modalidade, o agente terapêutico é fixado ao C- terminal do peptídeo. A fixação C-terminal de um agente terapêutico a um peptídeo pode ser formada através de uma pluralidade de grupos funcionais de agentes ativos. Os grupos funcionais de agentes ativos incluem aminas e seus equivalentes e alcoóis e seus equivalentes. Embora qualquer aminoácido possa ser usado para conectar o agente ativo ao C-terminal, ácido glutâmico, ácido aspártico, serina e lisina são aminoácidos particularmente adequados. Os agentes ativos adequados para a fixação C-terminal são os agentes ativos com grupos funcionais álcool e amina, tais como, por exemplo, atenolol, metropolol, propanolol, metilfenidato e sertralina.

Em uma modalidade, o agente terapêutico é covalentemente fixado às cadeias laterais do polipeptideo. Um agente ativo contendo ácido carboxílico pode ser fixado ao grupa amina e ou álcool do peptideo cadeia lateral para formar uma amida ou éster, respectivamente. Um agente ativo contendo amina pode ser fixado ao grupo carboxilato, carbamida ou guanina da cadeia lateral para formar uma amida ou um novo grupo guanina. Além disso, o aglutinantes pode ser selecionado a partir do grupo de todas as classes químicas de compostos, de modo que qualquer cadeia lateral do peptideo possa ser virtualmente fixada.

Em outra modalidade, a fixação do agente terapêutico ao peptideo é feita através da incorporação de um aglutinante entre o agente ativo e o peptideo. 0 aglutinante deve ter um grupo funcional pendente, tal como, um carboxilato, um grupo álcool, tiol, oxima, hidraxona, hidrazida ou amina, para se fixar de maneira covalente ao peptideo. Em uma modalidade, o agente terapêutico é um álcool e o grupo álcool é fixado de maneira covalente ao N- terminal do peptideo através de um aglutinante. Em outra modalidade, o agente terapêutico é uma cetona ou um aldeído, que é fixado a um aglutinante através da formação de um cetal ou acetal, respectivamente, e o aglutinante tem um grupo pendente que é fixado ao peptideo. Ainda em outra modalidade, o agente terapêutico é uma amida, uma imida, um imidazol ou uma uréia, onde o nitrogênio é fixado ao aglutinante e o grupo pendente do aglutinante é fixado ao peptídeo.

Em uma modalidade, a primeira camada de polipeptídeo e cada agente terapêutico compreende um grupo sulfidrila livre. Os agentes terapêuticos adequados que compreendem naturalmente grupos sulfidrila livres incluem, por exemplo, cisteamina, dimercaprol, 2-mercaptoetano sulfonato de sódio, acetilcisteína, omapatrilat, captopril, e similares. Além disso, um agente terapêutico conhecido no qual nenhum grupo sulfidrila livre está presente pode ser modificado pelos métodos químicos que contêm um grupo sulfidrila livre.

Um método para produzir uma película em multicamada de polieletrólito compreende depositar uma pluralidade de camadas de polieletrólitos opostamente carregados em um substrato. Os polieletrólitos depositados de maneira sucessiva têm cargas líquidas opostas. No presente caso, pelo menos uma primeira camada de polieletrólito que compreende um agente terapêutico ligado de maneira reversível é depositada. A Figura 1 é uma vista esquemática que ilustra a deposição ELBL. Em uma modalidade, a deposição de um polieletrólito, tal como, um polipeptídeo projetado compreende expor o substrato a uma solução aquosa que compreende um polipeptídeo projetado (ou outro polieletrólito) a um pH no qual o mesmo tem uma carga líquida adequada para ELBL. Em outras modalidades, a deposição de um polipeptídeo projetado ou outro polieletrólito no substrato é obtida através da aspersão seqüencial de soluções de polieletrólitos opostamente carregados. Ainda em outras modalidades, a deposição no substrato ocorre através da aspersão simultânea de soluções de polieletrólitos opostamente carregados.

No método ELBL para formar uma película em multicamada, as cargas opostas das camadas adjacentes proporcionam a força de acionamento para a montagem. Não é crítico que os polieletrólitos nas camadas opostas tenham a mesma densidade de carga linear líquida, apenas que as camadas opostas tenham cargas opostas. Um procedimento de montagem de película padrão para a deposição inclui a formação de soluções aquosas dos polieletrólitos a um pH no qual elas são ionizadas (isto é, pH 4 a 10), proporcionar um substrato contendo uma carga de superfície, e a imersão alternada do substrato nas soluções de polieletrólito carregadas. O substrato é opcionalmente lavado entre a deposição de camadas alternadas.

A concentração de polieletrólito adequada para a deposição do polieletrólito pode ser prontamente determinada por alguém versado na técnica. Uma concentração exemplificativa tem 0,1 a 10 mg/mL. De maneira típica, a espessura da camada produzida é substancialmente independente da concentração de solução do poliíon durante a deposição na faixa estabelecida. Para os polieletrólitos não polipeptídeos típicos, tais como, poli(ácido acrílico) e poli(cloridrato de alilamina), as espessuras de camada têm cerca de 3 a cerca de 5 Ã, dependendo da força iônica da solução. Os polieletrólitos curtos muitas vezes formam camadas mais delgadas que os polieletrólitos longos. Em relação à espessura de película, a espessura de película de polieletrólito depende da umidade, assim como do número de camadas e da composição da película. Por exemplo, as películas PLL/PLGA de 50 nm encolhem até 1,6 nm mediante a secagem com nitrogênio. Em geral, as películas de 1 nm a 100 nm ou mais de espessura podem ser formadas dependendo do estado de hidratação da película e do peso molecular dos polieletrólitos empregados na montagem.

Além disso, o número de camadas requerido para formar uma película em multicamada de polieletrólito estável irá depender dos polieletrólitos na película. Para as películas que compreendem apenas camadas de polipeptídeo de baixo peso molecular, uma película terá tipicamente 4 ou mais bicamadas de polipeptídeos opostamente carregados. Para as películas que compreendem polieletrólitos de alto peso molecular, tais como, poli(ácido acrílico) e poli(cloridrato de alilamina), películas que compreendem uma única bicamada de polieletrólito opostamente carregado podem ser estáveis.

Em outra modalidade, um método para liberar um agente terapêutico de uma película em multicamada de polipeptídeo compreende proporcionar uma película em multicamada de polipeptídeo, conforme descrito no presente documento, que compreende uma primeira camada de polipeptídeo que tem ligada a esta de maneira reversível um agente terapêutico, e que entra em contato com a película com um estímulo adequado para estimular a liberação do agente terapêutico da ligação reversível e, deste modo, da película.

Em uma modalidade, a distribuição de agente terapêutico é almejada na circulação sistêmica geral. 0 ambiente de pH da corrente sangüínea e/ou trato alimentar pode proporcionar um estímulo adequado para a liberação do agente terapêutico. Em outra modalidade, o estímulo a liberação do agente terapêutico do peptideo ocorre através da ação enzimática sobre o conjugado peptídeo-agente terapêutico na corrente sangüínea ou através da ação enzimática sobre o conjugado peptídeo-agente terapêutico no trato alimentar seguido pela absorção através dos intestinos ou estômago pela rota regular de entrada.

Em uma modalidade, o agente terapêutico é fixado através de um resíduo de ácido glutâmico no peptideo. 0 complexo é liberado do peptideo mediante a hidrólise do peptideo e então, o agente terapêutico é liberado do ácido glutâmico através da transaminação intramolecular coincidente. Em outra modalidade, o ácido glutâmico é substituído por ácido aspártico, arginina, asparagina, cisteína, lisina, treonina e serina, e sendo que o agente terapêutico é fixado à cadeia lateral do aminoácido para formar uma amida, um tioéster, um és ter, um éter, um tioéter, um carbonato, um anidrido, um ortoéster, um ácido hidroxâmico, uma hidrazona, sulfonamida, ésteres sulfônicos, outros derivados de enxofre ou um carbamato.

Ainda em outra modalidade, o ácido glutâmico é substituído por um aminoácido sintético com um grupo pendente que compreende uma amina, um álcool, uma sulfidrila, uma amida, uma uréia ou uma funcionalidade de ácido, por exemplo.

Quando a ligação reversível compreende uma ligação iônica, um estímulo adequado é uma solução de sal concentrada, por exemplo, 1 M de NaCl. Quando a ligação reversível compreende uma interação hidrofóbica, um estímulo adequado é uma solução de tensoativo, por exemplo, 2% SDS. Quando a ligação reversível compreende uma ligação de dissulfeto, os agentes de redução adequados para atuar como um estímulo para a liberação de agente terapêutico incluem ditiotreitol ("DTT"), 2-mercaptoetanol (2-ME), glutationa reduzida, tris(2-carboxietil)cloridrato de fosfina (TCEP), e combinações de mais de uma destas substâncias químicas.

A invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos não limitativos.

EXEMPLOS

Materiais e Métodos

Materiais: Peptídeos (KVKGKCKV) 3KVKGKCKY ("PI") e (EVEGECEV)3EVEGECEY ("NI") (Genscript, Inc., USA) são opostamente carregados em pH neutro devido à protonação de lisina (K) e desprotonação de ácido glutâmico (E). Os outros resíduos de aminoácido são valina (V), glicina (G), e Cys (C). 4 a 15 kDa poli (L-lisina) ("PLL"), 13 kDa poli(L-ácido glutâmico) ("PLGA") e DTNB eram de Sigma (USA). DL-ditiotreitol (DTT), um agente de redução, era de Gold Biotechnology, Inc. (USA). Todos os outros reagentes era de Sigma. PI, NI, PLL e PLGA foram dissolvidos em tampão TA (10 mM tris (hidroximetil) aminometano, 10 mM de acetato de sódio, 20 mM de NaCl, 0,1% de NaN3, pH 7,4) em uma concentração de 1 mg/mL.

Rotulagem de Nl com DTNB: Os peptídeos Pl e Nl contêm resíduos de Cys. Um grupo tiol livre em um peptídeo irá reagir com uma molécula DTNB sob condições de oxidação (Figura 2). No processo, uma molécula de TNB forma um dissulfeto misturado com uma cadeia lateral de Cys e uma molécula de TNB é liberada nos arredores. Uma solução aquosa de TNB livre é amarela e tem um pico de absorbância a 412 nm em pH moderadamente básico. 0 coeficiente de extinção de faixa de TNB de 11.400 a 14.150 M"1 cm"1 dependendo das condições.

Nl liofilizado foi preparado para carregar por dissolução de peptídeo no "tampão TA de redução" (tampão TA, 10 mM de DTT, pH 8,1) e incubação a temperatura ambiente durante 24 horas. A solução de 2 mL de Nl foi introduzida no tubo de diálise 1.000 MWGO (SpectroPor® 7, Spectrum Laboratories, Inc., USA) e dialisada contra 200 mL de "solução de DTNB" (tampão TA, 10 mM de DTNB, pH 8,1) com agitação contínua. A solução de DTNB foi alterada após 1, 2, 4 e 17 horas. O saco de diálise que contém o Nl (LNl) rotulado foi, então, imerso em tampão TA a pH 7,4 para remover o excesso de DTNB e mudar o pH de 8,1 para 7,4. 0 tampão TA foi alterado após 1, 2, 4 e 17 horas. A concentração final de LNl foi ajustada em 1 mg/mL com tampão TA a pH 7,4. O espectro de absorbância UV de LNl antes e após o tratamento com DTT é mostrado na Figura 6.

Montagem de nano-revestimentos multicamadas de polipeptídeo: Revestimentos multicamadas de polipeptídeo foram montadas em lâminas para microscópio de quartzo (Electron Microscopy Sciences, USA) após os substratos foram limpos. Um substrato foi repetitivamente imerso em uma solução de polipeptídeo positivamente carregado (PI ou PLL) e em uma solução de polipeptídeo negativamente carregado (NI, LNl ou PLGA) durante 15 minutos por etapa de adsorção peptídeo. Cada etapa de deposição de peptídeo foi seguida pelo enxágue da lâmina revestida em banhos de água deionizada separados durante 2 minutos, 1 minuto e 1 minuto. 30 camadas de polipeptídeo foram montadas deste modo. Em alguns casos, conforme indicado abaixo, duas bicamadas de "terminação" de Pl e Nl simbolizadas como (P1/N1)2, foram montadas no topo de revestimentos de camada 30 P1/LN1.

Liberação de TNB dos nano-revestimentos multicamadas de polipeptídeo: a solução de LNl a pH 7,4 foi diluída 4 vezes com água deionizada, e DTT foi adicionado em uma concentração final de 2 mM (Figura 3) . A mistura foi gentilmente agitada em uma plataforma dotada de agitação ao longo do processo de liberação de TNB. O espectro de absorbância de solução foi registrado com um espectrômetro Shimadzu UV mini 124 0 UV-Vis (Japão). O revestimento cobriu cerca de 2 cm2 de substrato em cada caso. 0 pico de absorbância TNB foi colocado na faixa detectável ao imergir revestimentos P1/LN1 em 10 placas de quartzo separadas em 3 mL de meio de liberação (tampão TA a pH 7,4 diluído 4 vezes com água deionizada; 0, 0,1, ou 1 mM de DTT). A absorbância do meio de liberação foi registrada através de espectrofotometria por varredura em pontos de tempo. Cada revestimento foi imerso durante 5 minutos durante a primeira medição de absorbância e 15 minutos para medições subsequentes. O béquer que contém a amostra película e o meio de liberação foi gentilmente agitado ao longo do processo de liberação.

Exemplo 1: Carga de TNB sobre Nl.

O DTT pode manter os monotióis completamente no estado reduzido e reduzir os dissulfetos de maneira quantitativa. O polipeptídeo Nl foi tratado com DTT para romper possíveis ligações de dissulfeto inter- e intramoleculares e para proteger os grupos tiol livres de cadeias laterais de resíduo de Cys. As moléculas Nl resultantes, que têm diversos grupos tiol livres cada uma, foram usadas para carga de TNB em solução moderadamente básica (Figura 2). O pico de absorbância em 328 nm na Figura 2, que ocorre devido aos dissulfetos misturados com TNB e tiol, mostram que as moléculas Nl foram carregadas com sucesso com TNB. A absorbância de tirosina a 275 nm é mais de 10 vezes menor que àquela de TNB no UV próximo.

Exemplo 2: Montagem multicamada de polipeptídeo.

Revestimentos P1/N1, P1/LN1, P1/PLGA, PLL/N1, e PLL/PLGA de camada 30 foram montados em lâminas de quartzo por LBL. A Figura 3 apresenta o acúmulo na espessura de película com inúmeras etapas de absorção. Pl/Nl mostrou a maior quantidade de material depositado. A diferença na massa óptica entre P1/N1 e PLL/PLGA sugere a importância da densidade de carga linear, seqüência de aminoácido e grau de polimerização acúmulo de película em multicamada coerente com o trabalho anterior. As forças Coulômbicas Fortes irão atrair as espécies opostamente carregadas e repelir às do tipo carregadas, limitando o incremento de espessura de película. A montagem de P1/LN1 se parece com a de PLL/N1 e Pl/PLGA. Cada molécula TNB carregada aumentou a hidrofobicidade de peptídeo e adicionou uma única carga negativa nestes experimentos. Ambas as interações eletrostáticas e interações hidrofóbicas influenciam o comportamento de montagem de peptídeo e estabilidade de película. A diferença no comportamento de montagem entre P1/LN1 e P1/N1 é a evidencia indireta de carga de Nl com TNB, coerente com os dados na Figura 3.

O projeto de polipeptídeo desempenha um papel importante na carga de fármaco e processo de liberação descrito no presente documento. As moléculas de TNB podem ser carregadas em Pl e em lisozima de ovo branco de galinha (HEWL), e este TNB pode ser liberado das moléculas rotuladas na solução ou adição de DTT (dados não mostrados). Porém, nem Pl rotulado nem HEWL rotulado provou ser útil para a montagem de película em multicamada através de LBL (dados não mostrados). Pl e HEWL são positivamente carregados a pH 7,4, enquanto os grupos TNB são negativamente carregados. A combinação de diferentes sinais de carga em uma única molécula irá diminuir a densidade de carga linear média e a adequabilidade para LBL eletrostático. A distribuição de carga em HEWL é complexa e alguns dos numerosos grupos hidrofóbicos apresentam a forma de um "núcleo hidrofóbico" na enzima nativa intacta. LNl, em contraste, é útil para fabricar as películas em multicamadas através de LBL eletrostático.

Exemplo 3: Liberação de TNB controlada.

Similar ao seu comportamento na solução (Figura 3), o TNB foi liberado do LNl nos revestimentos multicamadas em imersão em um ambiente de redução aquoso (Figura 5). O pico de absorbância a 412 nm (Figura 6) mostra a alteração de concentração TNB como uma função do tempo de incubação de revestimento em solução de DTT de 0,1 mM. A Figura 7 compara a cinética da liberação TNB dos revestimentos com e sem camadas de "terminação" (Ρ1/Ν1)2· A constante de tempo de primeira ordem para 0,1 mM de DTT foi de 8 minutos.

Quanto mais alta a concentração de DTT, mais alta a probabilidade de uma colisão de DTT com TNB no revestimento em uma quantidade de tempo determinada, e mais rápida a liberação de TNB do revestimento. TNB não foi liberado em um nível detectável sob condições oxidação moderadas (0 mM de DTT). A concentração de TNB em solução de DTT de 0,1 mM após 1 hora foi de 2,2 μΜ. A adição de bicamadas de terminação em revestimentos que contêm LNl reduziu a taxa de liberação de TNB. A constante tempo para películas terminadas foi de 19 minutos, cerca de duas vezes tão grande quanto películas não terminadas. As camadas de terminação não continha TNB; elas podem inibir o bloco dentro da difusão de DTT e fora da difusão de TNB, e os grupos tiol livres podem se unir a TNB e DTT (Figura 8).

TNB foi "carregado" sobre os polipeptídeos 32-mer contendo Cys negativamente carregado projetado, os polipeptídeos rotulados foram usados para montar os nanorevestimentos multicamadas através de LBL, e uma alteração no redox potencial foi usada para estimular a liberação de TNB a partir dos revestimentos. A abordagem difere substancialmente da carga de uma pequena molécula em um revestimento após a fabricação de revestimento. A abordagem delineada aqui pode parecer um meio mais eficiente de aprisionar uma pequena molécula do que a carga controlada por difusão, e permite a liberação ambientalmente estimulada sob condições específicas.

O uso dos termos "um" e "o" e referentes similar (especialmente no contexto das seguintes reivindicações) devem ser construídas para cobrir tanto o singular, como o plural, exceto onde especificamente indicado em contrário no presente documento ou claramente contradito através do contexto. Os termos primeiro, segundo, etc., conforme usados no presente documento, não tem intenção de denotar qualquer ordem particular, porém, simplesmente para a conveniência para denotar, por exemplo, uma pluralidade de camadas. Os termos "que compreende", "que tem", "que inclui" e "que contém" não devem ser construídos como termos abertos (isto é, significa "que inclui, porém, não se limita a") exceto onde notado em contrário. A recitação de faixas de valores é meramente projetada para servir como um método abreviado de se referir individualmente a cada valor separado que se encontra na faixa, exceto onde indicado em contrário no presente documento, e cada valor separado é incorporado na especificação como se o mesmo fosse individualmente recitado no presente documento. Os pontos finais de todas as faixas são incluídos na faixa independentemente combináveis. Todos os métodos descritos no presente documento podem ser realizados em uma ordem adequada, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou claramente contradito pelo contexto. 0 uso de qualquer e todos os exemplos, ou a linguagem exemplificativa (por exemplo, "tal como"), é meramente projetada para ilustrar melhor a invenção e não representa uma limitação no escopo da invenção, exceto onde reivindicado em contrário. Nenhuma linguagem na especificação deve ser construída à medida que indica qualquer elemento não reivindicado como essencial para a prática da invenção, conforme usado no presente documento.

Embora a invenção tenha sido descrita com referência a uma modalidade exemplificativa, será entendido por aqueles versados na técnica que diversas alterações podem ser feitas e equivalentes podem ser substituídos por elementos desta sem sair do escopo da invenção. Além disso, muitas modificações podem ser feitas para adaptar uma situação ou material particular aos ensinamentos da invenção sem sair do escopo essencial da mesma. Portanto, pretende-se que a invenção não seja limitada à modalidade particular descrita como o melhor modo contemplado para realizar esta invenção, porém, que a invenção inclua todas as modalidades que se encontram dentro do escopo das reivindicações em anexo. Qualquer combinação dos elementos descritos acima em todas as possíveis variações desta é englobada pela invenção, exceto onde indicado em contrário no presente documento ou claramente contradito pelo contexto.

Claims (20)

1. Película em multicamada caracterizada pelo fato de que a película compreende duas ou mais camadas de polieletrólitos, sendo que as camadas adjacentes compreendem polieletrólitos opostamente carregados, sendo que uma primeira camada de polieletrólito compreende uma primeira camada de polipeptídeo que compreende um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido, sendo que um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido consiste em 5 a 15 aminoácidos e tem uma carga líquida por resíduo de 0,4, sendo que a primeira camada de polipeptídeo tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e tem um equilíbrio de carga a pH 7 maior ou igual a aproximadamente metade do comprimento total da primeira camada de polipeptídeo; Sendo que a primeira camada de polipeptídeo compreende um agente terapêutico reversível ligado à primeira camada de polipeptídeo; e sendo que uma segunda camada compreende uma segunda camada de polieletrólito que compreende um material policatiônico ou um material polianiônico que tem um peso molecular maior que 1.000 e pelo menos 5 cargas por molécula, sendo que a segunda camada does não compreende polipeptídeo.

2. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o agente terapêutico é ligado de maneira reversível ao N-terminal, ao C-terminal, ou à cadeia lateral do polipeptídeo.

3. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptldeo e o agente terapêutico compreendem grupos sulfidrila e a ligação reversível é uma ligação de dissulfeto.

4. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que um grupo álcool, amina ou ácido carboxílico do agente terapêutico é covalentemente fixado ao N-terminal, ao C-terminal ou à cadeia lateral do polipeptídeo.

5. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a fixação do agente terapêutico ao peptídeo é feito através da incorporação de um aglutinante entre o agente ativo e o peptídeo, sendo que o aglutinante compreende um grupo pendente funcional.

6. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o grupo pendente funcional compreende um grupo carboxilato, um álcool, um tiol, uma oxima, uma hidraxona, uma hidrazida ou amina.

7. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a película se encontra sob a forma de uma microcápsula.

8. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a película é formada em um substrato.

9. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o substrato compreende um dispositivo médico.

10. Método para liberar de maneira controlável um agente terapêutico de uma película em multicamada de polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende proporcionar a película em multicamada de polipeptídeo da reivindicação 1, e Colocar a película em contato com um estímulo adequado para estimular a liberação do agente terapêutico da ligação reversível.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a ligação reversível é uma ligação de dissulfeto e o estímulo é um agente de redução.

12. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a ligação reversível é uma amida, um tioéster, um éster, um éter, um tioéter, um carbonato, um anidrido, um ortoéster, um ácido hidroxâmico, uma hidrazona, sulfonamida, ésteres sulfônicos ou um carbamato; e o estímulo é o pK ambiente da corrente sangüínea e/ou trato alimentar.

13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o estímulo é a ação enzimática na ligação de polipeptídeo-agente terapêutico.

14. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a película se encontra sob a forma de uma microcápsula.

15. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a película é formada em um substrato.

16. Película em multicamada, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende a dispositivo médico.

17. Método para montagem de uma película em multicamada de polipeptídeo, caracterizado pelo fato de que compreende dispor uma segunda camada de polieletrólito sobre um substrato, sendo que a segunda camada de polieletrólito compreende um material policatiônico ou um material polianiônico que tem um peso molecular maior que 1.000 e pelo menos 5 cargas por molécula, sendo que a segunda camada não compreende um polipeptídeo; e dispor uma primeira camada de polipeptídeo na segunda camada de polieletrólito, sendo que a primeira camada de polipeptídeo compreende um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido, sendo que um ou mais primeiros motifs de seqüência de aminoácido consistem em 5 a 15 aminoácidos e têm uma carga líquida por resíduo de 0,4, sendo que a primeira camada de polipeptídeo tem pelo menos 15 aminoácidos de comprimento, e tem um equilíbrio de carga a pH 7 maior ou igual a aproximadamente metade do comprimento total da primeira camada de polipeptídeo; e sendo que a primeira camada de polipeptídeo compreende um agente terapêutico reversível ligado à primeira camada de polipeptídeo.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o agente terapêutico é ligado de maneira reversível ao N-terminal, ao C-terminal ou à cadeia lateral do polipeptídeo.

19. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo e o agente terapêutico compreendem grupos sulfidrila e a ligação reversível é uma ligação de dissulfeto.

20. Método, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o substrato compreende um dispositivo médico.