BRPI0721283A2 - Transportador específico de arabinose da levedura pichi stipitis e as suas aplicações - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRANSPOR- TADOR ESPECÍFICO DE ARABINOSE DA LEVEDURA PICHI STIPITIS E AS SUAS APLICAÇÕES".

Antecedentes da Invenção

A levedura de padeiro, vinho e cerveja denominada Saccha- romyces cerevisiae é utilizada há séculos na produção de pão, vinho e cer- veja, por sua capacidade de fermentar e transformar açúcar em etanol e dió- xido de carbono. Na biotecnologia, a S. cerevisiae, para além da produção de proteínas heterólogas, é utilizada principalmente na produção de etanol para fins industriais. O etanol é utilizado em inúmeros sectores industriais como substrato inicial de sínteses. Com o progressivo escasseamento das reservas de petróleo, a alta dos preços do petróleo e o contínuo aumento da procura de gasolina no mundo inteiro, o etanol ganha cada vez mais impor- tância como alternativa de combustível.

Para conseguir uma produção de bioetanol eficiente e de baixo custo existe a possibilidade de utilizar biomassa contendo Iignocelulose co- mo, por exemplo, palha, resíduos do setor madeireiro e agrícola e o conteú- do orgânico do lixo doméstico comum, como substrato inicial. A biomassa é primeiro muito propícia e depois existe em grande abundância. Os três maio- res componentes da Iignocelulose são lignina, celulose e hemicelulose. A hemicelulose, que é, depois de celulose, o polímero que ocorre com a se- gunda maior frequência, é um heteropolímero muito ramificado. É composta por pentoses (L-arabinose, D-xilose), ácidos urônicos (4-0-metil-D-ácido glucurônico) e hexoses (D-manose, D-galactose, L-ramnose, D-glicose) (vide Figura 1). A hemicelulose se deixa hidrolisar mais facilmente do que a celu- lose, mas possui as pentoses L-arabinose e D-xilose, que a levedura S. ce- revisiae normalmente não consegue transformar.

Para se poder utilizar pentoses nas fermentações, primeiro é preciso que elas entrem na célula através da membrana plasmática. Embora não possa metabolizar D-xilose, a S. cerevisiae é capaz de absorvê-la para dentro da célula. No entanto, S. cerevisiae não possui um transportador es- pecífico. O transporte é feito com a ajuda dos inúmeros transportadores de hexose. A afinidade dos transportadores para D-xilose é, contudo, claramen- te inferior à sua afinidade para D-glicose (Kotter und Ciriacy, 1993). Nas le- veduras, que são capazes de metabolizar D-xilose, como, por exemplo, P. stipitis, C. shehatae ou P. tannophilus (Du Preez et al., 1986), há tanto 5 transportadores não específicos de pouca afinidade que transportam D- glicose como também simportadores de prótons específicos de alta afinidade somente para D-xilose (Hahn-Hagerdal et al, 2001).

Em experimentos anteriores, foi possível achar algumas levedu- ras, como, por exemplo, Candida tropicalis, Pachysolen tannophilus, Pichia 10 stipitis, Candida shehatae, que têm a capacidade natural de fermentar ou pelo menos assimilar L-arabinose. No entanto, essas leveduras carecem totalmente de capacidade para transformar L-arabinose em etanol por fer- mentação ou rendem muito pouco na produção de etanol (Dien et al., 1996). De resto, ainda sabe-se muito pouco sobre a assimilação de L-arabinose. Na 15 levedura C. shehatae supõe-se que ocorra um simporte de prótons (Lucas e Uden, 1986). Na S. cerevisiae sabe-se que a galactose permease Gal2 tam- bém transporta L-arabinose, que é semelhante à D-galactose quanto à sua estrutura (Kou et al., 1970).

A fermentação alcoólica de pentoses em estirpes de leveduras 20 biotecnologicamente modificadas de S. cerevisiae, incluindo, entre outros, diversos genes da estirpe Pichia stipitis para a modificação genética da S. cerevisiae, tem sido descrita em anos recentes principalmente em conexão com a fermentação de xilose. A engenharia genética se concentra, sobretu- do, na introdução dos genes para a assimilação inicial de xilose de Pichia 25 stipitis, uma levedura fermentadora de xilose presente na S. cerevisiae, por- tanto uma levedura, utilizada tradicionalmente na produção de etanol a partir de hexose (Jin et al. 2004). 2004).

Jeppson et al. (2006) descrevem a fermentação de xilose pela S. cerevisiae através de uma via metabólica da xilose que é semelhante ou à via metabólica das leveduras Pichia stipitis e Candida shehatae, que usam a xilose de forma natural, ou à via metabólica bacteriana.

Katahira et al. (2006) descrevem hidrolisados de ácido sulfúrico de biomassa lignocelulósica, como aparas de madeira, como material impor- tante para a produção de bioetanol combustível. Nesse estudo construiu-se uma estirpe de levedura recombinante capaz de fermentar xilose e celo- oligossacarídeos. Para tal, foram integrados nesta estirpe diversos genes 5 para a expressão intercelular de xilose redutase e xilitol-desidrogenase a partir de Pichia stipitis e xiluloquinase a partir de S. cerevisiae, bem como para a apresentação de beta-glucosidase a partir de Aspergillus acleatus na superfície da célula. Durante a fermentação dos hidrolisados de ácido sulfú- rico a partir de aparas de madeira, a estirpe recombinante fermentou xilose e 10 celo-oligossacarídeos completamente após 36 horas.

Pitkanen et al. (2005) descrevem a obtenção e caracterização de agentes quimiostáticos isolados de xilose de uma estirpe de S. cerevisiae que efectua a hiperexpressão dos genes de Pichia stipitis, que codificam xilose redutase e xilitol-desidrogenase, e do gene que codifica xiluloquinase 15 endógena. Os isolados foram obtidos a partir de culturas aeróbias de quimi- ostato em xilose como fonte principal ou única de carbono. Em condições aeróbias em meio mínimo, com 30 g/l de xilose, a taxa de crescimento dos isolados em quimíostato foi 3 vezes maior do que a da estirpe original (0,15 h-1 contra 0,05 h-1). A taxa de assimilação de xilose aumentou quase 2 ve- 20 zes. As actividades das enzimas chave da via metabólica de pentose-fosfato (transquetolase, transaldolase) aumentaram 2 vezes, enquanto as concen- trações dos seus substratos (pentose-5-fosfato, sedoheptulose-7-fosfato) baixaram correspondentemente.

Becker e Boles (2003) descreveram o trabalho de engenharia e 25 a seleção de uma estirpe de laboratório de S. cerevisiae que é capaz de uti- lizar L-arabinose para o crescimento e transformação em etanol por fermen- tação. Isto foi tornado possível graças à superexpressão de uma via metabó- lica bacteriana de L-arabinose, formada por Bacillus subtilis AraA e Escheri- chia coli AraB e AraD, com superexpressão simultânea da permease Ievedu- 30 ra-galactose transportadora de L-arabinose na estirpe da levedura. A análise molecular da estirpe selecionada mostrou que o pré-requisito essencial para o emprego de L-arabinose é uma atividade de L-ribuloquinase mais baixa. Entretanto, relata-se que esta estirpe de levedura apresenta um crescimento muito lento (vide figura 2).

Portanto, no estado da técnica há necessidade de transportado- res específicos de pentose, especialmente transportadores de L-arabinose que permitam assimilar as pentoses, especialmente L-arabinose, em células como as células de levedura, e assim favorecer o aproveitamento e a fer- mentação de pentoses, nomeadamente L-arabinose.

Isto posto, é objetivo da presente invenção disponibilizar trans- portadores específicos de pentose, como transportadores de L-arabinose.

Este objetivo é alcançado, de acordo com a invenção, pela dis-

ponibilização de polipeptídeos que possuem uma função transportadora de pentose in vitro e/ou in vivo, e variantes e fragmentos deles.

Especialmente seleciona-se o polipeptídeo de acordo com a in- venção do grupo de:

a. um polipeptídeo que seja pelo menos 70%, de preferência

pelo menos 80% idêntico à seqüência de aminoácidos de acordo com o SEQ ID NO:1 e tenha uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo,

b. uma variante de um polipeptídeo que ocorra naturalmente, compreendendo a seqüência de aminoácidos de acordo com o SEQ ID

NO:1, que tenha uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo,

c. um polipeptídeo que seja idêntico à seqüência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:1 e tenha uma função transportadora de pento- se, in vitro e/ou in vivo, e

d. um fragmento do polipeptídeo de a., b., ou c., compreendendo

um fragmento de pelo menos 100 aminoácidos contínuos de acordo com

SEQ ID NO:1.

De preferência, o polipeptídeo de acordo com a invenção com- preende um fragmento de pelo menos 200 ou 300 aminoácidos contínuos de acordo com a SEQ ID NO:1. Tal fragmento se caracteriza pelo fato de pos-

suir uma função transportadora de pentose in vitro e/ou in vivo.

Numa forma de realização preferida, o polipeptídeo de acordo com a invenção compreende um fragmento de 502 aminoácidos correspon- dente aos primeiros 502 aminoácidos de acordo com SEQ ID NO:1.

Tal fragmento se caracteriza pelo fato de possuir uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo.

De preferência, o polipeptídeo de acordo com a invenção com- preende um polipeptídeo que seja pelo menos 90%, com maior preferência 95%, melhor ainda 99% idêntico à seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:1 e tenha uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo.

Variantes dos polipeptídeos de acordo com a invenção podem ser também peptídeos que possuam substituições conservadores de amino- ácidos ou deleções e/ou inserções menores, desde que tais modificações não afetem significativamente a função transportadora de pentose in vitro e/ou in vivo.

Os polipeptídeos de acordo com a invenção podem compreen- der também seqüências de aminoácidos heterólogos. Seqüências de amino- ácidos heterólogos apropriados o perito poderá selecionar por conta própria, de acordo com o uso ou aplicação em vista.

De preferência, a pentose é arabinose, especialmente L- arabinose, de forma que um polipeptídeo de acordo com a invenção tem, de preferência, uma função transportadora de arabinose in vitro e/ou in vivo, especialmente uma função transportadora de L-arabinose.

O polipeptídeo de acordo com a invenção é originado, de prefe- rência, de uma levedura, preferentemente de Pichia, particularmente Pichia stipitis.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção, com a disponibilização de moléculas de ácidos nucleicos que codificam um poli- peptídeo de acordo com a invenção.

Preferentemente, uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção é pelo menos 90%, de preferência 95%, melhor ainda 99% idêntica à seqüência de ácido nucléico de acordo com o SEQ ID NO:2 ou 2.

Uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção compreende ainda seqüências de ácidos nucleicos vetoriais, de preferência seqüências de vetores de expressão. As seqüências de ácidos nucleicos vetoriais são escolhidas preferentemente dentre as seqüências compreendi- das pelos vetores do grupo composto por YEp24, p426HXT7-6HIS, p426Met25, pYES260, pYES263, pVTU260, pVTU263, pVTL260, pVTL263.

5 Para outras variantes, vide as figuras 8A-E e o exemplo 3.

As moléculas de ácidos nucleicos de acordo com a invenção podem compreender ainda as seqüências de ácidos nucleicos que codificam outros polipeptídeos heterólogos. Seqüências de ácido nucléico apropriadas que codificam outros polipeptídeos heterólogos, o perito poderá selecionar 10 por conta própria, de acordo com a aplicação ou uso em vista. Entre tais se- qüências estão, por exemplo, as seqüências de marcadores de resistência a antibióticos.

As moléculas de ácido nucléico de acordo com a invenção com- preendem dsDNA, ssDNA, PNA, CNA, RNA ou mRNA ou combinações des- tas.

O objetivo é alcançado, também, de acordo com a invenção, com a disponibilização de células hospedeiras contendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção. As células hospedei- ras de acordo com a invenção expressam esta molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção, em número de pelo menos uma.

Uma célula hospedeira de acordo com a invenção é uma célula de fungo e, de preferência, uma célula de levedura, como Saccharomyces species, p. ex. S. cerevisiae, Kluyveromyces sp., p. ex. K. Iactis, Hansenula sp., p. ex. H. polymorpha, Pichia sp., p. ex. P. pastoris, Yarrowia sp., p. ex. Y. lipolytica.

De preferência, as células hospedeiras de acordo com a inven- ção contêm ainda moléculas de ácido nucléico que codificam proteínas da via metabólica de arabinose, especialmente L-ribuloquinase, L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase, L-arabinose-isomerase.

Proteínas da via metabólica bacteriana de arabinose preferidas

são especialmente E. Coii araB L-ribuloquinase, E. Coii araD L-ribulose-5-Ρ 4-epimerase e B. subtilis araA L-arabinose-isomerase. Vide também a figura 2.

As células hospedeiras particularmente preferidas desta inven- ção são as células da estirpe MKY06-4P, depositada junto à Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares em 23 de Agosto de 2006, sob o 5 número de depósito DSM 18544. Vide também a figura 3.

Uma célula hospedeira preferida de acordo com esta invenção é uma célula de levedura que tenha sido modificada pela introdução e expres- são dos genes araA (L-arabinose-isomerase), araB (L-ribuloquinase) e araD (L-ribulose-5-P-4-epimerase) e superexpresse, além disso, um gene de 10 TAL1 (transaldolase) como, por exemplo, o descrito pelos inventores no do- cumento EP 1 499 708 B1, e, adicionalmente, pelo menos uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção, com a disponibilização de anticorpos ou de fragmentos de anticorpos, compreen- dendo uma parte imunologicamente ativa que se liga seletivamente a um polipeptídeo de acordo com a invenção. Os processos de geração de anti- corpos ou fragmentos de anticorpos são conhecidos no estado da técnica.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção, com processos para a produção de um polipeptídeo de acordo com a invenção. 20 Tal processo compreende o cultivo de uma célula hospedeira de acordo com a invenção sob condições nas quais se expressa uma molécula de ácido nucléico de acordo com a invenção. Processos gerais para a geração de polipeptídeos por meio de cultura de células são conhecidos no estado da técnica.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção com

um kit, compreendendo um composto que se liga seletivamente a um poli- peptídeo de acordo com a invenção, se necessário com outras substâncias auxiliares e instruções de uso.

O composto é, de preferência, uma pentose como, por exemplo, arabinose e especialmente L-arabinose ou um derivado de tal pentose.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção, com processos para a identificação de um composto que se liga a um polipeptí- deo de acordo com a invenção e/ou modula a sua atividade. Tal processo compreende as seguintes etapas:

pôr em contato um polipeptídeo ou uma célula que expresse um polipeptídeo de acordo com a invenção com um composto de ensaio, e determinar se o polipeptídeo se liga ao composto de ensaio e, se

necessário, determinar se o composto de ensaio modula a atividade do poli- peptídeo.

O composto é, de preferência, uma pentose como, por exemplo, arabinose e especialmente L-arabinose ou um derivado de tal pentose.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção, com

processos para a modulação da atividade de um polipeptídeo de acordo com a invenção. Tal processo compreende a colocação em contato de um poli- peptídeo ou uma célula que expressa um polipeptídeo de acordo com a in- venção, com um composto que se liga ao polipeptídeo em concentração su- ficiente para modular a atividade do polipeptídeo.

O composto é, de preferência, uma pentose como, por exemplo, arabinose e especialmente L-arabinose ou um derivado de tal pentose.

O objetivo é alcançado também, de acordo com a invenção com processos para a produção de bioetanol. Tal processo de acordo com a in- venção compreende a expressão de uma molécula de ácido nucléico de a- cordo com a invenção numa célula hospedeira de acordo com a invenção.

Os polipeptídeos, moléculas de ácido nucléico e células hospe- deiras de acordo com a invenção são utilizados de preferência especialmen- te para a produção de bioetanol. Para formas de realização preferidas repor- ta-se à figura 8 e ao exemplo 4.

Os polipeptídeos, moléculas de ácido nucléico e células hospe- deiras de acordo com a invenção são utilizados de preferência especialmen- te para a fermentação recombinante de biomaterial contendo pentose.

Genes específicos de Pichia stipitis que melhoram especifica- mente a assimilação da pentose L-arabinose em S. cerevisiae foram isola- dos com a utilização de um banco de genes e integrados na estirpe de leve- dura MKY06-3P, que se tornou assim capaz de fermentar L-arabinose e transformá-la em etanol. A triagem dos genes relevantes resultou num novo transportador específico de L-arabinose cuja seqüência de nucleotídica e protéica está disponível (vide SEQ ID NOs: 1-4). A este respeito, reporta-se também aos exemplos e figuras.

5 Graças à especificidade deste novo transportador é possível me-

lhorar a taxa de assimilação para L-arabinose, após a expressão em siste- mas existentes de produção de etanol, já que, por um lado, nas grandes concentrações de L-arabinose, melhora a situação de concorrência face à glicose e, por outro lado, nas baixas concentrações de L-arabinose devido a 10 uma alta afinidade, o transporte de L-arabinose se torna mais eficiente. Assimilação de L-arabinose

Para poder metabolizar a pentose L-arabinose de S. cerevisiae é preciso, primeiro, que esta seja assimilada pela célula. Sabe-se pouco a respeito desta assimilação. Não se conhece, até agora, nos eucariontes, nenhum gene que codifique transportadores específicos de L-arabinose. To- dos os transportadores de hexose testados para a pentose D-xilose possu- em uma afinidade muito mais alta para D-glicose do que para D-xilose. Su- põe-se que ocorra algo semelhante com L-arabinose. De todas as estirpes já construídas capazes de aproveitar as pentoses (D-xilose ou L-arabinose) relata-se um crescimento relativamente lento. Como causa disto mencio- nam-se, sobretudo, a lentidão e a má qualidade da assimilação das pento- ses (Becker und Boles, 2003; Richard et al., 2002). Nas fermentações de mistura de açúcar, composta por D-glicose e D-xilose ou por D-glicose e L- arabinose, os açúcares não são transformados simultaneamente. Dada a grande afinidade dos transportadores para D-glicose, esta é metabolizada primeiro. Ocorre uma mudança denominada diáuxica. Só depois de acabar a D-glicose é que a pentose se transforma, numa segunda fase de crescimen- to, claramente mais lenta (Kuyper et al., 2005a; Kuyper et al., 2005b). Uma explicação que se apresenta é a ausência de transportadores específicos para as pentoses.

Novo transportador específico de L-arabinose de P. stipitis Para as utilizações industriais seria ideal se o microorganismo empregado pudesse transformar, tanto quanto possível em simultâneo, to- dos os açúcares presentes no meio. Para conseguir isto, foram muito úteis os transportadores específicos para cada tipo de açúcar. Especialmente pa- ra L-arabinose não se conhecia, até o momento, nenhum transportador.

5 Nesta invenção, com um sistema de ensaios (vide exemplos),

conseguiu-se achar um gene transportador específico de L-arabinose a partir do genoma de P. stipitis. Nos plasmídeos pAraTI e pAraT7 foram localiza- dos os fragmentos do genoma de P. stipitis que são responsáveis por um crescimento específico em L-arabinose, mas não em D-glicose, D-manose ou D-galactose. O pequeno crescimento observado em D-galactose não foi causado pelos plasmídeos pAraTI ou pAraT7. Tratava-se apenas do fraco crescimento de EBY.VW4000, a estirpe inicial de MKY06, já relatado por Wieczorke et al. (1999). Foi possível excluir a hipótese de o crescimento ob- tido ter sido causado por uma mutação genômica em MKY06. Depois de uma seleção para a perda do plasmídeo do banco de genes de P. stipitis mediante duas inoculações por estrias em meio FOA, seguida de reinocula- ção em meio de L-arabinose, não se observou mais crescimento. Portanto, o crescimento deveu-se aos plasmídeos do banco de genes de P. stipitis (vide exemplos). Foi possível mostrar que os plasmídeos encontrados codificam um transportador.

Numa pesquisa BLAST com o genoma recém-publicado de Pi- chia stipitis (vide http://genome.jgi-psf.org/euk_home.html) revelou-se uma concordância de 100% com HGT2. HGT2 foi anotado como provável trans- portador de glicose de alta afinidade por sua grande homologia com o trans- 25 portador de glicose HGT1 de alta afinidade originado de Candida albicans. Ao analisar a seqüência quanto aos possíveis domínios transmembranares, obtêm-se 12 domínios transmembranares, o que é típico dos transportado- res. Por isso, é surpreendente que se trate de um transportador de pentose (transportador de arabinose) e não de um transportador de hexose.

De resto, foi necessário superar inúmeros obstáculos e dificul-

dades experimentais para achar e disponibilizar o transportador de acordo com a invenção, como se pode observar detalhadamente nos exemplos e nas figuras.

- Na estirpe inicial EBY.VW4000 foi necessário eliminar um total de 21 genes transportadores de monossacarídeos.

- Além disso, nesta estirpe foi necessário superexpressar TAL1 por modificação genômica.

- O trabalho para estabelecer as condições de crescimento ópti- mas para a realização da triagem foi muito difícil e demorado.

- O transportador de acordo com a invenção é o primeiro trans- portador específico de arabinose a partir de eucariontes descrito.

- Trata-se de um transportador expresso heteróloga e, ao mes-

mo tempo, funcionalmente, integrado na membrana plasmática de S. cerevi- siae, o que não é necessariamente de esperar.

Há alguns relatos sobre as dificuldades relacionadas com os transportadores de expressão heteróloga; vide a este respeito o capítulo 2 do livro "Transmembrane Transporters" (Boles, 2002) e o artigo de Wieczor- ke et al., 2002.

Outras fontes de biomassa com teores significativos de arabino- se (fonte dos dados: U.S. Department of Energy http://www.eere.energy.gov/biomass/progs/search1.cgi):

Tipo de biomassa L-Arabinose [%]

Panicum virgatum 3,66

Grosses Bartgras 3,55

Festucagigante 3,19

Robinia 3

Palha de cereais 2,69

Palha de trigo 2,35

Bagaço de cana de açúcar 2,06

Lespedezacuneata 1,75

Sorgo 1 -65

O transportador de arabinose de acordo com a invenção é de

grande importância também para o aproveitamento destas fontes de bio- massa. As possibilidades de utilização de um transportador funcional e, ao mesmo tempo, específico de Arabinose levedura S. cerevisiae incluem, por um lado, a produção de bioetanol e de produtos preliminares de alta qua- lidade para posterior síntese química.

A lista abaixo foi tirada do estudo "Top Value Added Chemicals

From Biomass" (vide www1.eere.energy.gov/biomass/pdfs/35523.pdf). Trinta substâncias químicas foram classificadas com especialmente valiosas como fonte de produção de biomassa.

Número de Os 30 candidatos principais átomos de C 1 Hidrogênio, monóxido de carbono 2 3 Glicerol, ácido 3-hidroxipropanoico, ácido láctico, áci¬ do malônico, ácido propiônico, serina 4 Acetoína, ácido aspártico, ácido fumárico, 3- hidroxibutirolactona, ácido málico, ácido succínico, treonina Arabitol, furfural, ácido glutâmico, ácido itacónico, ácido levulínico, prolina, xilitol, ácido xilónico 6 Ácido aconítico, citrato, ácido 2,5-furanodicarboxílico, ácido glucárico, lisina, levoglucosan, sorbitol Assim que estas substâncias de Iignocelulose são produzidas,

mediante bioconversão (por exemplo, fermentações com leveduras), é im- portante dispor de um transportador específico para a hemicelulose arabino- se.

A presente invenção será explicada mais detalhadamente, com as figuras, seqüências e exemplos que se seguem, sem se limitar a estes. As referências citadas passam a fazer parte integrante deste documento por referência. Mostra-se nas seqüências e figuras:

SEQ ID N0:1 a seqüência protéica de AraT-ORF1S,

SEQ ID N0:2 a seqüência da grelha de leitura aberta (ORF) de AraT,

SEQ ID N0:3 a seqüência da grelha de leitura aberta (ORF) de AraT sob uma forma optimizada com codon,

SEQ ID N0:4 a seqüência da grelha de leitura aberta (ORF) de AraT com 500 promotores, ORF e 300 terminadores.

Figura 1: Composição da biomassa.

A hemicelulose com a segunda maior frequência de ocorrência é um polímero fortemente ramificado composto por pentoses, ácidos urônicos 5 e hexoses. Uma grande parte da hemicelulose consiste nas pentoses xilose e arabinose.

Figura 2: Esquema de utilização de L-arabinose em S. cerevisiae recombi- nante por integração de uma via metabólica bacteriana de L-arabinose. Figura 3: Construção de MKY06-4P, a estirpe de levedura de acordo com a invenção.

A estirpe inicial para a construção de MKY06-4P foi a estirpe de levedura EBY.VW4000, da qual foram eliminados todos os genes transpor- tadores de hexose (HXTs). Nesta estirpe, a transaldolase endógena TAL1 foi superexpressa mediante substituição do promotor nativo pelo promotor 15 HXTl truncado (HXH-Prom). Daí resultou a estirpe MKY06. Nesta estirpe foram transformados e integrados os plasmídeos p423H7araABsre (araA), p424H7araBre (araB) e p425H7araDre (araD) para o metabolismo de arabi- nose (= MKY06-3P). Obteve-se adicionalmente o plasmídeo p426H7-araT (araT), que transforma o transportador de arabinose de acordo com a inven- 20 ção, obtido a partir de Pichia stipitis, e, desta forma, a estirpe MKY06-4P. O transportador é expresso e integrado funcionalmente na membrana plasmá- tica (AraT).

Figura 4: Inoculação de MKY06 por estrias com os plasmídeos para o meta- bolismo de L-arabinose e os transportadores de L-arabinose encontrados em diferentes fontes de carbono.

Em cada uma das inoculações por estrias vê-se a estirpe MKY06-3P mais um plasmídeo do banco de genes YEpTW. Como controle negativo (-) transformou-se, ao invés de um plasmídeo do banco de genes, o p426HXT7-6HIS e, como controle positivo (+) o pHL125re.

1: pAraT 1,6: pAraT6, 7: pAraT7, 8: pAraT8, 11: pAraT 11,

-: Controle negativo, +: Controle positivo A: Meio 2% L-arabinose B: Meio 2% de D-galactose. D-glicose ou D-manose

Todas as placas com meio de cultura SC foram incubadas a 30°C. A placa de L-arabinose (A) mostra o crescimento após 9 dias e todas as outras placas (B)1 após 2 dias. As colônias 1 e 7 cresceram em L- 5 arabinose, mas não em D-glicose, D-manose, e com crescimento fraco em D-galactose.

Figura 5: Sequenciação do transportador de arabinose.

A grelha de leitura aberta completa do transportador de acordo com a invenção foi sequenciada em cadeia dupla, com domínios superpos- tos. O domínio do promotor e do terminador foi sequenciado em cadeia sim- ples. As setas apontam para os domínios das sequenciações individuais. Figura 6: Os vetores utilizados e a sua estrutura.

O plasmídeo inicial para produzir o banco de genes de P. stipitis foi o plasmídeo YEp24 (A). O plasmídeo pAraTI (B), assim como o plasmí- 15 deo pAraT7, se baseiam no YEp24, distinguindo-se apenas pelo tamanho do inserto. A grelha de leitura aberta (ORF) do transportador de arabinose de acordo com a invenção foi amplificado do pAraTI e clonado atrás do forte promotor de HXT7 truncado do plasmídeo p426HXT7-6HIS (C). Deste pro- cesso resultou o plasmídeo p426H7-AraT (D), que possui uma uracila mar- 20 cadora. Outro plasmídeo de expressão possível é p426Met25 (E).

Figura 7: Crescimento em arabinose, utilizando um transportador específico de arabinose.

Crescimento de MKY06-3P, que contém adicionalmente o plas- mídeo pHL125re ou o plasmídeo p426H7-AraT (MKY06-4P), em meio SM 25 com A) 0,5%, B) 1% e C) 2% de L-arabinose em condições aeróbias. As es- tirpes com os diferentes plasmídeos foram cultivadas em meio SM com 1% de L-arabinose e vacinadas com uma OD600nm = 0,2 em 30 de meio SM com A) 0,5%, B) 1 e C) 2% de L-arabinose. A incubação foi feita em balões de Erlenmeyer de 300 ml em condições aeróbias a 0°C. Foram colhidas a- 30 mostras várias vezes ao dia para determinação da densidade óptica.

Figura 8: Formação de etanol, utilizando um transportador específico de ara- binose. A figura mostra os resultados das análises HPLC da estirpe BWY1 com os plasmídeos p423H7araABsre, p424H7araBre, p425H7araDre e p426H7-AraT em meio SFM com 1,7% de L-arabinose em condições semia- naeróbias.

Exemplos Métodos

1. Estirpes e meios de cultura

- Bactérias

E. Coli SURE (Stratagene)

Meio completo LB 1% triptona, 0,5% extrato de levedura, 0,5%

NaCI, pH 7,5 (vide Maniatis, 1982)

Para a seleção para a resistência a antibióticos codificada por plasmídeo acrescentou-se ao meio, após a autoclavagem, 40 pg/ml de am- picilina. Os meios nutrientes sólidos receberam adicionalmente 1,9% ágar. O cultivo foi feito a 37°C.

-Levedura

Estirpe EBY.VW4000

EBY.VW4000 (Genótipo: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-A1 MAL2-8c SUC2 Ahxtl-17 AgaI2 stl1A::loxP agt1A::loxP mph2A::loxP mph3A::loxP) (Wieczorke et al., 1999)

Estirpe MKY06

MKY06 (Genótipo: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-1 MAL2-8c SUC2 hxt1-17 gal2 stl1::loxP agt1::loxP mph2::loxP mph3::loxP PromTALI::loxP-Prom-vkHXT7, Descrição: EBYVW4000 PromTALI :loxP- Prom-vkHXTT)

Estirpe MKY06-3P

MKY06-3P (Genótipo: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-1 MAL2-8c SUC2 hxt1-17 gal2 stl1::loxP agt1::loxP mph2::loxP mph3::loxP PromTALI::loxP-Prom-vkHXT7, Descrição: EBY.VW4000 PromTALI ::loxP- Prom-vkHXT7); contém os plasmídeos p423H7araABsre, p424H7araBre und p425H7araDre

Estirpe com o Número de Depósito DSM 18544 ΜΚΥ06-4Ρ (Genótipo: MATa \eu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-1 MAL2-8c SUC2 hxt1-17 gal2 stl1::loxP agt1::loxP mph2::loxP mph3::loxP PromTALI::loxP-Prom-vkHXT7, Descrição: EBY.VW4000 PromTALI::loxP- Prom-vkHXT7)\ contém os plasmídeos p423H7araABsre, p424H7araBre, p425H7araDre und p426H7-AraT.

Stamm BWY1:

BWY1 baseia-se na estirpe JBY25 (Genótipo: MATa Ieu2-3,112 ura3-52 trp1-289 his3-A1 MAL2-8c SUC2 + mutações desconhecidas para melhor crescimento em L-arabinose) (Becker e Boles, 2003); a estirpe 10 JBY25 foi reselecionada e possui mais outras mutações para crescimento melhor em L-arabinose em condições de limitação de oxigênio (Wiedemann, 2005).

- Meio completo YEP

1% extrato de levedura, 2% peptona bacteriológica, fonte de carbono nas respectivas concentrações indicadas

- Meio Seletivo Sintético Completo SC

0,67% levedura nitrogênio base sem aminoácidos e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 20 dihidrogênio fosfato de potássio, pH 6,3, solução aminoácido/base nitrogenada sem os aminoácidos correspondentes para os marcadores de auxotrofia dos plasmídeos utilizados, fonte de carbo- no nas respectivas concentrações indicadas

- Meio seletivo sintético mínimo SM: 0,67% levedura nitrogênio base sem aminoácidos e sulfato de amônio, 0,5% sulfato de amônio, 20 di- hidrogênio fosfato de potássio, pH 6,3, fonte de carbono nas respectivas concentrações indicadas-

- Meio de fermentação sintético (meio mineral) SFM (Verduynetal., 1992), pH 5,0

Sais: (NH4)2SCH 5 g/l; KH2PO4, 3 g/l; MgS04-7H20, 0,5 g/l Traços Metálicos: EDTA, 15 mg/l; ZnS04-7H20, 4,5 mg/l; MnCI2-4H20, 0,1 mg/l; CoCI2-6H20, 0,3 mg/l; CuS04,

0,192 mg/l; Na2Mo04-2H20, 0,4 mg/l; CaCI2-2H20, 4,5 mg/l; FeS04-7H20, 3 mg/l; H3BO3, 1 mg/l; Kl, 0,1 mg/l Vitaminas: Biotina, 0,05 mg/l; ácido p-aminobenzóico 0,2 mg/l; ácido nicotíni- co, 1 mg/l; pantotenato de cálcio, 1 mg/l; Pirodoxina-HCI mg/l; tiamina-HCI, 1 mg/l; minositol, 25 mg/l

Concentração dos aminoácidos e base nitrogenada no meio sintético com- 5 pleto (Zimmermann, 0068): adenina (1975 mM), arginina (0,08 mM), histidina (0,22 mM), isoleucina (0,25 mM), Ieucina (0,44 mM), Iisina (0,44 mM), metio- nina (0,35 mM), felilanina (0,26 mM), treonina (0,29 mM), triptófano (0,48 mM), tirosina (0,19 mM), uracila (0,34 mM) e valina (0,44 mM). Como fontes de carbono foram utilizadas L-arabinose, D-glicose, D-galactose, D-manose 10 e maltose. Para a seleção para a perda de um plasmídeo com gene marca- dor de seleção de URA3 foram utilizadas placas de meio completo contendo, além de uracila, 1 mg/ml de 5-FOA, adicionado após a autoclavagem (Boeke et al., 1984).

Os meios seletivos e completos sólidos continham adicionalmen- te 0069 de ágar. O cultivo das células de levedura foi feito a 30°C. O meio mineral sintético utilizado para as fermentações continha sais, traços metáli- cos e vitaminas nas concentrações acima relacionadas e a fonte de carbono indicada. Dos traços metálicos e das vitaminas foi preparada uma solução matriz. A solução de traços metálicos foi autoclavada (20 min, 121 °C) e a solução vitamínica foi esterilizada por filtração. Ambas foram armazenadas a 4°C. Na preparação da solução de traços metálicos, o valor de pH foi de im- portância crucial, impedindo a precipitação dos componentes individuais. Foi necessário dissolver em água por completo, sucessivamente, os diferentes traços metálicos, na ordem acima indicada. Após cada adição foi preciso ajustar o pH com KOH para 6,0 antes de poder adicionar o traço metálico seguinte. No fim, o pH foi ajustado a 4,0 com HCI. Para evitar a formação de espuma, adicionaram-se ao meio 50 μΙ/Ι de antiespumante (anfifoam 204, Sigma). Nos ensaios anaeróbios adicionaram-se ao meio ainda 2,5 de uma solução Tween80-ergosterol após a autoclavagem. Esta solução consiste em 16,8 Tween80 e 0,4 de ergosterol, completada com etanol para 50 ml e dissolvida nele. A solução foi esterilizada por filtração. Os sais, as corres- pondentes quantidades de solução de traços metálicos e o antiespumante foram autoclavados juntamente com o fermentador completo. A fonte de carbono foi autoclavada separadamente do meio restante. Antes da autocla- vagem o pH foi ajustado em 5,0 para todos. Após esfriar, a solução vitamíni- ca estéril foi adicionada ao meio.

2. Plasmídeos

Plasmídeo Fonte/referência Descrição p423H7araABsre Becker und Boles, 2003 B. subtilis araA em p423HXT7-His, reisolado a partir de JBY25-4M p424H7araBre Becker und Boles, 2003 E. Coli araD em p423HXT7- His; reisolado a partir de JBY25-4M, mutação em a- raB p425H7araDre Becker und Boles, 2003 E. Coli araD em p425HXT7- His; reisolado a partir de JBY25-4M p426HXT7-6HIS Becker und Boles, 2003 2 μ plasmídeo para a super¬ expressão de genes e para a produção de proteínas de fusão com epítopo 6xhis; gene marcador URA3, pro¬ motor truncado HXT7 e ter- minador CYC pHL125re Guldener et al., 1996 2 μ plasmídeo expresso com o gene GAL2 atrás do pro¬ motor ADH1, gene marcador URA3, reisolado a partir de JBY25-4M p426H7-araT 2 μ plasmídeo expresso com Pichia stipitis ARAT atrás do promotor HXT7 truncado, gene marcador URA3 3. Banco de genes de Pichia stipitis

YEpTW Pichia stipitis: Banco de genes com fragmentos cromossômicos de Piehia stipitis no plasmídeo de superexpressão YEp24, gene marcador U- RA3 (Weierstall et al., 1999)

4. Transformação

- Transformação de S. cerevisiae

A transformação de S. cerevisiae foi efetuada com o método de acetato de Iitio (Gietz und Woods, 2002). Para a seleção quanto à resistên- cia à geneticina, as células foram incubadas, após a transformação, durante

4 a 30°C em meio completo e, em seguida, colocadas plaqueadas em meio contendo G418.

- Transformação de E. Coli

A transformação das células E. Coli foi feita com o método de

eletroporação (Dower et al, 1988; Wirth, 1993) com a ajuda de um aparelho Easyject Prima da empresa EQUIBO.

5. Preparação de DNA

Isolamento de DNA plasmídico a partir de S. cerevisiae As células de uma cultura estacionária de levedura (5 ml) foram

colhidas, lavadas e ressuspensas em 100 μΙ tampão 1 (retirado do "Mini Kit de Plasmídeo"). Após adição de 200 μΙ tampão 2 e 2/3 de volume de contas de vidro (0 = 0,45 mm), as células foram abertas durante 8 min num apare- lho Vibrax (Janke und Kunkel, Vibrax-VXR) a 4°C. O excedente foi misturado 20 com 150 μΙ tampão 3 e incubado durante 10 min em gelo. Após 15 minutos de centrifugação a 10000 rpm, o excesso foi utilizado e o DNA plasmídico foi precipitado com 400 μΙ isopropanol (-20°C, 10 min). O DNA peletizado por centrifugação (30 min, 13000 rpm) foi lavado com etanol frio a 70% e colo- cado em 20 μΙ de água. Em seguida, o DNA foi utilizado para uma transfor- 25 mação em E. Coli ou uma amplificação de DNA através de PCR.

- Isolamento de DNA plasmídico a partir de E. Coli

O isolamento de DNA plasmídico a partir de E. Coli foi realizado com o "Plasmid Mini Kit" da empresa Qiagen, de acordo com as instruções do fabricante.

- Determinação da concentração de DNA

A concentração de DNA é medida espectrofotometricamente numa gama de comprimento de onda de 240-300 nm. Se a pureza do DNA, determinada pela razão entre as leituras E260 nm/E280 nm, a extinção nm E260 = 1,0 corresponde a uma concentração de DNA de 50 pg dsDNA/ml (Maniatis, 1982).

6. Amplificação do DNA por meio de PRC - Utilização do sistema Expand

High Fidelity,

A reação em cadeia de polimerase (PCR) foi efetuada com o "Expand High Fidelity" PCR System da empresa Roche, de acordo com as especificações do fabricante. Ao DNA plasmídico ou genômico amplificado foram adicionados 0,2 mM dNTP - Mix, tampão 1 (contém 1,5 mM MgCI2), 1 10 U polimerase e 100 pmol de cada um dos respectivos iniciadores oligonucle- otídicos. A reação PCR foi feita num termociclador Techne ou Mastercycler Eppendorf.

Para a amplificação do DNA seleccionou-se o seguinte ciclo de temperaturas.

1. 1 x 95°C, 4 min desnaturação do DNA

2. 18-35, 95°C 45-60 s desnaturação do DNA

55-60°C, 45-60 seg ligação dos iniciadores ao DNA (annealing)

72°C, 1-3 min síntese de DNA (elongação)

3. 1 x 72°C, 4 min síntese de DNA (elongação)

11/34

Após a primeira etapa adicionaram-se a polimerase ("hot start PCR"). O número de etapas da síntese, a temperatura do annealing e o tempo de elongação foram adaptados às temperaturas de fusão específicas dos oligonucleótidos ou ao tamanho do produto esperado. Os produtos de 25 PCR foram verificados por uma subsequente electroforese em gel de agaro- se e em seguida purificados.

- Purificação do DNA de produtos PCR

A purificação dos produtos PCR foi realizada com um "QIAquick PCR Purification Kit" da empresa Qiagen de acordo com as instruções do fabricante.

- Separação de fragmentos de DNA por electroferese em gel.

A separação dos fragmentos de DNA entre 0,15-20 kb foi efetu- ada em géis de agarose de l-4%. Como tampão gel e de corrida utilizou-se um tampão I x TAE buffer (40 mM Tris1 40 mM de ácido acético, 2 mM ED- TA) (Maniatis, 1982). Como padrão de grandeza serviu ou um DNA do Fago Lambda seccionado com as endonucleases de restrição EcoRI e Hindlll ou o 5 DNA Ladder 1982 (NEB). Antes da aplicação, as amostras de DNA foram misturadas com um marcador azul a 1/10 por volume (1 x tampão TAE1 10% de glicerina, 0,004% azul de bromofenol). Após a separação os géis foram incubados em banho de brometo de etídio, tornando visíveis os fragmentos de DNA mediante exposição à Iuz UV (254 nm).

- Isolamento de fragmentos de DNA a partir de géis de agarose

O fragmento de DNA desejado foi cortado do gel de agarose TAE sob Iuz UV de ondas longas (366 nm) e isolado com o "QIAex Il Gel Extraction Kit" ou o "QIAquick Gel Extraction Kit", fabricado pelo empresa Qiagen, de acordo com as indicações do fabricante.

7. Modificação Enzimática de DNA

- Restrição do DNA

Realizaram-se quebras do DNA em seqüências específicas com endonucleases de restrição, em condições de incubação recomendadas pelo fabricante, durante 2-3 horas com 2-5U enzima por pg de DNA.

8. Análises HPLC

As amostras colhidas nos ensaios foram centrifugadas durante 10 min e 3000 rpm para peletizar as células de levedura. O excedente foi retirado e imediatamente congelado a -20°C. Para a precipitação da proteína adicionaram-se posteriormente ácido sulfossalicílico a 50%, misturou-se e 25 centrifugou-se durante 30 min a 13000 rpm e 4°C. O excesso foi retirado, fazendo-se dele uma diluição de 1/10 com água para a análise HPLC. Servi- ram como padrão para as medições amostras com D-glicose, L-arabinose e etanol, utilizadas nas concentrações de 0,l% p/p, 0,5% p/p e 1,0 p/p. A con- centração de açúcar e de etanol foi medida com o equipamento BioLC (Dio- 30 nex). Na medição foram utilizados os seguintes equipamentos: auto amos- trador "AS50", forno de colunas "TCC-100", bomba de gradiente "GS50" (to- dos Dionex) e o detector de Rl "RI-101" (Shodex). Como coluna utilizou-se VA 300/7.7 Nucleogel Sugar 81OH (Macherey-NageI) com ácido sulfúrico a 20% como eluente (0,6).

Para a avaliação dos dados das análises utilizou-se o programa Chromeleon (versão6.50,Dionex).

5 Exemplo 1: Configuração de um sistema de testes para o estudo de trans- portadores de L-arabinose

A) Construção da estirpe MKY06

Na estirpe de levedura EBY.VW4000 foram eliminados todos os genes da família de transportadores de hexose e mais três genes da família 10 de transportadores de maltose. Esta estirpe continuou a crescer em maltose como meio de cultura, mas deixou de crescer em glicose, fructose e mano- se, com crescimento inexpressivo em galactose (Wieczorke et al, 1999). Como todos os transportadores de hexose foram eliminados, é de supor que esta estirpe não é mais capaz de assimilar L-arabinose, servindo, portanto, 15 para estudos sobre o transporte de L-arabinose.

Em ensaios anteriores (vide Becker e Boles, 2003) tinha ficado claro que, além de uma via metabólica funcional de L-arabinose, havia ne- cessidade também de um aumento da atividade de transaldolase para o a- proveitamento de L-arabinose. Foi por isso que se realizou a superexpres- 20 são de TAL1 pela substituição do promotor endógeno TAL1 na estirpe TAL1 pelo promotor truncado HXT7. Esta estirpe foi denominada MKY06 e está prevista para crescer com os plasmídeos para o metabolismo de L-arabinose e um transportador que seja capaz de transportar L-arabinose, nesta fonte de carbono.

B) Introdução da via metabólica de L-arabinose

A estirpe MKY06 foi transformada com os plasmídeos p423H7araABsre, p424H7araBre e p425H7araDre (MKY06-3P) para que adquirisse a capacidade de aproveitar a L-arabinose. A transformação com os três plasmídeos foi realizada em simultâneo. Os agentes transformadores 30 foram colocados em meio de cultura SC em placas com 2% de maltose. Numa transformação ulterior foram transformados ainda, como controle posi- tivo, o transportador Gal2, conhecido como L-arabinose, e como controle negativo, o plasmideo vazio p426HXT7-6HIS e depois novamente colocados sobre placas contendo maltose. O controle positivo, que contém um trans- portador de L-arabinose e os três plasmídeos para o aproveitamento de L- arabinose e superespressa a transaldolase, deve crescer em L-arabinose. O 5 controle negativo, dada a ausência do transportador, não deve apresentar crescimento. Isto foi investigado.

C) Verificação do Sistema de Teste

Para a continuidade da utilização do sistema de teste construído foi necessário, primeiro, examinar os controles positivo e negativo quanto ao 10 seu crescimento. Várias colônias dos agentes transformadores obtidos nas placas SC com 2% de maltose, foram recolhidas com uma ansa de inocula- ção e colocadas em placas SC com 2% de L-arabinose, e incubadas durante dez dias a 30°C. Passado este tempo, o controle positivo apresentou um crescimento sensível e o controle negativo, tal como esperado, não cresceu. 15 O compostamento de crescimento foi examinado igualmente em

meio líquido com 2% de maltose ou 2% L-arabinose. Para tal, foram realiza- das culturas preliminares com as fontes de carbono correspondente (maltose ou L-arabinose) em condições aeróbias a 30°C. Uma vez atingida a fase ex- ponencial tardia, estas culturas preliminares foram utilizadas para inocular 20 30ml do mesmo meio com uma densidade óptica inicial de OD6oonm=0,2. Como o controle negativo não cresceu em placas contendo L-arabinose, i- nocularam-se 30 ml de neui SC com a cultura preliminar com 2% de maltose com 2% de L-arabinose. Acompanhou-se o comportamento de crescimento durante vários dias, com medições da densidade óptica a 600nm. No meio 25 de cultura com maltose, os controles positivo e negativo apresentaram, tal como esperado, crescimento idêntico, com uma taxa de crescimento de

0,197h'1. No crescimento com L-arabinose observou-se crescimento, exata- mente como nos ensaios anteriores com as placas de cultura de L-

A

arabinose, apenas no controle positivo (μ = 0,01 h' ) que, diferentemente do controle negativo, ainda possuía o transportador Gal2. O pequeno cresci- mento inicial no caso do controle negativo pode ser explicado pelo fato de as células não terem sido lavadas antes da reinoculação do meio de cultura de maltose para L-arabinose. Além disso, as reservas de glicogénio da levedura ainda possibilitam um pequeno crescimento.

Assim, pois, este sistema de teste mostrou-se funcional e pôde ser utilizado para o exame de transportadores de L-arabinose. Serviram de comparação, novamente, os mencionados controles positivo e negativo.

Exemplo 2: Triagem com um banco de genes de Pichia stipitis

O sistema de teste foi utilizado para a pesquisa de possíveis ge- nes transportadores de L-arabinose, num banco de genes de Pichia stipitis, uma das leveduras capazes de aproveitar L-arabinose.

A) Realização da Rriaaem

O banco de genes YepTW utilizado aqui foi criado a partir da estirpe CBS5774 de Pichia stipitis. DNA cromossómica foi parcialmente dige- rida com a endonuclease de restrição Sau3A e ligada ao vetor YEp24 Iinea- rizado com BamHI (Weierstall et al, 1999).

O banco de genes possuía, exatamente como o plasmídeo p-

HL125re, um marcador de auxotrofia para uracila. O banco de genes YepTW foi transformado na estirpe MKY06-3P e semeado com 2% de maltose em meio de cultura sintético. As colônias obtidas após três dias a 30°C foram replaqueadas em placas de cultura SC com 2% de L-arabinose. Após 10 20 dias foram procuradas colônias que apresentasse crescimento em L- arabinose. O crescimento só foi possível quando o plasmídeo do banco de genes codificava um transportador capaz de transportar L-arabinose.

Para excluir as mutações genônicas que pudessem ser respon- sáveis pelo crescimento, as colônias achadas foram semeadas em meio de 25 cultura completo com 5-FOA. Desta forma efetuou-se uma seleção para de- tectar a perde do plasmídeo do banco de genes. Estas colônias da placa 5- FOA não puderam mais crescer após a ressemeadura em meio com L- arabinose. Assim foi possível excluir uma mutação genômica como causa do crescimento. As colônias achadas foram semeadas também em outras fon- 30 tes de carbono para testar o espectro de substratos.

B) Comportamento de Crescimento

Onze das colônias achadas que apresentavam pequeno cresci- mento, dentre as mais de 30000 colônias replicadas em placa réplica, foram novamente semeadas em placas de L-arabinose. Destas, apenas cinco co- lônias apresentaram crescimento em L-arabinose novamente.

Trata-se, neste caso, da estirpe MKY06-3P, que adquiriu adicio- nalmente o plasmídeo pAral, pAraT7, pAraT8, ou pAraTI 4 do banco de genes YEpTW (vide figura 4). O crescimento mais pronunciado foi o da es- tirpe MKY06-3P, com o pAraTI. As demais cresceram pouco em compara- ção com o controle positivo. No entanto, deve-se lembrar que o GAL2 no controle positivo foi superexpresso por um promotor forte e que os genes nos plasmídeos do banco de genes tinham o seu promotor nativo. De espe- cial interesse são os plasmídeos pAraTI und pAraT7, porque mediaram crescimento apenas em meio de L-arabinose. Em D-glicose e em M-manose não mostraram nenhum crescimento. Em D-galactose apenas o pAraT 1 deu um pequeno crescimento. O crescimento de pAraT7 em D-galactose corres- pondeu ao fraco crescimento do controle negativo (vide figura 4). Isto já foi relatado anteriormente em relação à estirpe inicial de MKY06, a EBY.VW4000 (Wieczorke et al„ 1999).

As colônias com o pAraT7, 2% e -70°C foram cultivadas em meio sintético líquido com de L-arabinose, dando origem a culturas de glice- 20 rina que são guardadas a para exames ulteriores. Os trabalhos com os plasmídeos pAraT7 e foram aprofundados com estudos sobre o comporta- mento de crescimento das estirpes em meio líquido. Em meio SC com 2% de maltose a estirpe MKY06-3P, contendo adicionalmente pAraTI ou pA- raT7, comportou-se de maneira idêntica aos controles positivo (incluindo a- 25 inda pHL125re) e negativo (incluindo ainda p426HXT7-6HIS). As taxas de crescimento foram de 0,197h'1.

Em meio sintético com 2% de L-arabinose apresentaram-se dife- renças. O controle negativo (p426HXT7-6HIS) não apresentou crescimento neste meio. Um pequeno crescimento inicial resultou do fato de não se ter 30 efectuado o passo de lavagem aquando da reinoculação da pré-cultura em meio de maltose para a cultura principal em meio de L-arabinose. Os dois transportador de L-arabinose comportaram-se de forma semelhante. No que se refere à taxa de crescimento (μ = 0,087h'1) e à densidade óptica máxima OD6OOnm não houve diferenças entre ο MKY06-3P com o plasmídeo pAraT7 ou o pHL125re. Comparando o comportamento de crescimento dos novo transportador com o controle positivo (μ = 0,1h'1) observou-se uma taxa de 5 crescimento um pouco inferior e uma OD6OOnm máxima menor.

C) Isolamento do transportador de L-arabinose

Para poder analisar os transportador achados a nível genômico foi necessário primeiro isolar novamente os plasmídeos do banco de genes da levedura. Teve-se o cuidado de observar que a estirpe MKY06 contém 10 não apenas o plasmídeo do banco de genes YepTW que codifica o transpor- tador procurado, mas ainda, ao mesmo tempo, os três plasmídeos para o metabolismo de L-arabinose (p423H7araABsre, p42H7araBre, p425H7araDre) e que o plasmídeo p423H7araABsre está presente está presente nas células em número maior do que os três outros plasmídeos. Como os plasmídeos do 15 banco de genes YepTW tinham um marcador de auxotrofia para uracila, as células das placas com L-arabinose foram inoculadas em meio líquido de maltose sem uracila (ura-). Uma vez atingida a fase estacionária, essas célu- las foram reinoculadas e recultivadas neste novo meio maltose-ura. Neste processo, as células com os quatro plasmídeos foram cultivadas cinco vezes 20 em meio líquido maltose-ura, até atingir a fase estacionária. O objetivo era obter um enriquecimento do plasmídeo pAraTI e do pAraT7. Com estas du- as culturas foram realizadas semeaduras de isolamento em placas com meio maltose-ura. As colônias resultantes foram replicadas em outras placas com maltose e incubadas durante dois dias a 30°C. Estas placas não continham 25 o aminoácido correspondente para o marcador de auxotrofia de um dos três outros plasmídeos (histidina para p423H7araABsre, triptófano para p424H7araBre ou Ieucina para p425H7araDre). Estas placas réplica foram comparadas com as placas maltose-ura. Foram selecionadas as colônias que cresceram apenas na placa maltose-ura. Estas culturas tinham apenas 30 o plasmídeo pAraT7, respectivamente. Os plasmídeos foram isolados da levedura. Depois disto, os plasmídeos foram amplificados em E. Coli e, após o isolamento a partir de E. Colil caracterizados com a ajuda de uma análise de restrição. Como enzimas de restrição foram utilizadas Ncol e Nhel. Ncol corta apenas nos genes marcadores URA3. Na presença do plasmídeo pro- curado do banco de genes, forma-se um fragmento de 934pb.

Exemplo 3: Caracterização do novo transportador de arabinose (araT)

A) Sequenciacão

Os fragmentos cromossômicos de P. stipitis localizados nos plasmídeos pAraT7 e achados nos exemplo 2 foram sequenciados.

A ORF completa do transportador achado foi sequenciado em cadeia dupla com domínios superpostos. O domínio do promotor e do termi- nador foi sequenciado em cadeia simples (vide figura 5). As setas apontam para os domínios dos sequenciamentos individuais.

A sequenciação mostrou que os dois plasmídeos pAraT7 e con- têm fragmentos superpostos do mesmo gene. Trata-se do mesmo transpor- tador e não de dois genes transportadores distintos. O plasmídeo 5kb possui 15 um inserto de aproximadamente 1629 contendo a grelha de leitura aberta (ORF) completo do AraT, que consiste em 542 bases e, consequentemente, aminoácidos (mais o codon de terminação). Adicionalmente, seqüências de promotor e terminador. O plasmídeo pAraT7 possui um inserto de aproxima- damente 3kb que não contém o ORF comopleto de AraT, mas apenas as 20 primeiras 1507 bases. Mesmo assim, este fragmento era funcional.

Numa pesquisa BLAST com o genoma recém-publicado de Pi- chia stipitis (vide http://genome.jgi-psf.org/euk_home.html) revelou-se uma concordância de 100 com HGT2. HGT2 foi anotado, por sua grande homolo- gia com o transportador de glicose HGT1, de alta afininidade, de Candida 25 albicans como suposto transportador de glucoese de alta afinidade. Ao ana- lisar a seqüência quanto aos possíveis domínios transmembranares, obtêm- se 12 domínios transmembranares, o que é típico dos transportadores.

B) Exemplos de vetores de AraT

O plasmídeo inicial para a produção do banco de genes foi o plasmídeo YEp24. O plasmídeo pAraT 1, como também o plasmídeo pAraT7, se baseiam no YEp24, distinguindo-se apenas pelo tamanho do inserto. O vetor YEp24 é um plasmídeo epissomal. A grelha de leitura aberta (ORF) do transportador de arabinose encontrado foi amplificada pelo promotor HXT7 e clonado atrás do forte promotor truncado do plasmídeo p426HXT7-6HIS (C). Deste processo resul- tou o plasmídeo p426H7-AraT, que possui um marcador para uracila.

5 Outro plasmídeo de expressão é p426Met25. Para os tipos de

vetores, vide figuras 6A-6E.

Outros possíveis vetores de expressão são pYES260, pYES263, pVTU260, pVTU263, pVTL260 e pVTL263. Maiores detalhes sobre estes vetores se encontram em http://web.uni-

frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/km_expr.html.

C) Crescimento em função da concentração de L-arabinose no meio de cul- tura

O crescimento da estirpe MKY06-4P foi estudado em condições aeróbias em função da concentração de L-arabinose no meio. Como compa- ração utilizou-se a estirpe MKY06-3P contendo, adicionalmente, o plasmídeo pHL125re ou p426HXT7-6HIS.

As estirpes com os diferentes plasmídeos foram cultivadas em meio SM com 1% de L-arabinose e inoculadas com L-arabinose a uma Οϋβοοοηιη = 0,2 em 30ml em meio SM com 0,5%, 1% e 2% de L-arabinose. 20 A incubação foi feita em balões de Erlenmeyer de 300ml em condições ae- róbias a 30°C. Colheram-se amostras várias vezes ao dia para determinação da densidade óptica.

Os resultados são mostrados nas figuras 7A-7C. A estirpe MKY06-4P cresce, em qualquer das três condições, mais rapidamente do 25 que a estirpe de controle MKY06-3P, a qual contém adicionalmente o plas- mídeo pHL125re. No caso da L-arabinose a 0,5% (Figura 7A) há uma clara vantagem de p426H7-AraT sobre pHL125re. A estirpe cresce claramente mais rápido e proporciona uma densidade óptica maior. Também com a L- arabinose a 1% (figura 7B) a estirpe com o p426H7-AraT cresce mais rápido 30 do que a estirpe de controlo. No entanto, não há diferença quanto à densi- dade óptica atingida ao final do crescimento. Mesmo com uma concentração de L-arabinose a 2% (figura 7C) a estirpe com o p426H7-AraT cresce mais rapidamente do que a estirpe de controlo com o pHL125re, que, nesta con- centração, no entanto, atinge uma densidade óptica maior ao final do cres- cimento.

Mostra-se, assim, que o sistema de assimilação de L-arabinose 5 de acordo com a invenção permite que as células recombinantes de S. cere- visiae aproveitem a L-arabinose de maneira consideravelmente mais eficien- te.

Exemplo 4

Utilização do novo transportador de arabinose (araT) para a formação de etanol

A figura 8 mostra os resultados das análises HPLC da estirpe BWY1 com os plasmídeos BWY1, p424H7araBre, p423H7araABsre e p425H7araDre e, adicionalmente, o p426H7-AraT ou, como comparação, o pHL125re, em meio SFM com L-arabinose a 1,7% em condições semianae- róbias.

As estirpes foram cultivadas em condições aeróbias no mesmo meio para obter uma grande densidade óptica. As células foram centrifuga- das e utilizadas para inoculação nos ensaios de fermentação semiaeróbios. Já após 25 horas iniciou-se, com ambas as estirpes, a produção de etanol. 20 Na estirpe contendo o plasmídeo p426H7-AraT observa-se uma produção inicial de etanol maior. Por outro lado, a concentração de arabinose ao final do ensaio com as células contendo o p426H7-AraT diminui mais do que com o pHL125re, o que indica que, neste caso, uma afinidade maior do AraT per- mite uma fermentação melhorada das concentrações menores de arabinose. 25 Referências

Becker, J. und Boles, E. (2003) A modified Saccharomyces cerevisiae strain that consumes L-Arabinose and produces ethanol. Appl Environ Microbiol 69(7), 4144-50.

Boeke, J.D., LaCroute, F. und Fink, G.R. (1984) A positive selection for mu- tants Iacking orotidine-5'-phosphate decarboxylase activity in yeast: 5- fluoroorotic acid resistance. Mol Gen Genet 197(2), 345-6.

Boles E. (2002) in "Transmembrane Transporters", Editor Michael W. Quick, WILEY-LISS, 19-36. Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. (2000) Methods in Yeast Genetics. A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual. Cold Spring Harbor Labo- ratory Press.

Dien, B.S., Kurtzman, C.P., Saha, B.C. und Bothast, R.J. (1996) Screening for L-arabinose fermenting yeasts. Appl Bioehem Bioteehnol 57-58, 233- 42.

Dower, W.J., Miller, J.F. und Ragsdale, C.W. (1988) High efficiency trans- formation of E. coli by high voltage electroporation. Nueleie Aeids Res 16(13), 6127-45.

Du Preez, J.C., Bosch, M. und Prior, B.A. (1986) Xylose fermentation by Candida shehatae and Piehia stipitis - effects pf pH, temperature and substrate concentration. Enzyme Mierob Teehnol 8(360-364).

Gietz, R.D. und Woods, R.A. (2002) Transformation of yeast by Iithium aceta- te/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods Enzy- mol 350, 87-96.

Hahn-Hagerdal, 13., Wahlbom, C.F., Gardonyi, M., van Zyl, W.H., Cordero Otero, R.R. und Jonsson, L.J. (2001) Metabolie engineering of Saccha- romyces cerevisiae for xylose utilization. Adv Bioehem Eng Bioteehnol 73, 53-84.

Jeppsson M, Bengtsson O, Franke K, Lee H, Hahn-Hagerdal B, Gorwa- Grauslund MF. (2006) The expression of a Piehia stipitis xylose reductase mutant with higher K(M) for NADPH increases ethanol production from x- ylose in recombinant Saccharomyees cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 93(4): 665-73.

Jin YS, Jeffries TW. (2004) Stoichiometric network constraints on xylose me- tabolism by recombinant Saccharomyces cerevisiae. Metab Eng. 6(3): 229-38.

Katahira S, Mizuike A, Fukuda H, Kondo A. (2006) Ethanol fermentation from Iignocellulosic hydrolysate by a recombinant xylose- and cellooligosaccha- ride-assimilating yeast strain. Appl Microbiol Biotechnol. 72(6): 1136-43.

Kotter, P. und Ciriacy, M. (1993) Xylose fermentation by Sacharomyces ce- revisiae. Appl Microbiol Biotechnol 38, 776-783.

Kou, S.C., Christensen, M.S. und Cirillo, V.P. (1970) Galaetose transport in Saccharomyees cerevisiae. II. Charaeteristies of galactose uptake and ex- change in galactokinaseless cells. J Baeteriol 103(3), 671-8.

Kuyper, M., Toirkens, M.J., Diderich, J.A., Winkler, A.A., van Dijken, J.P. und Pronk, J.T. (2005b) Evolutionary engineering of mixed-sugar utilization by a xylose-fermenting Saccharomyees cerevisiae strain. FEMS Yeast Res 5(10), 925-34.

Kuyper, M., Winkler, A.A., van Dijken, J.P. und Pronk, J.T. (2004) Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principie. FEMS Yeast Res 4(6), 655-64.

Lucas, C. und Uden, N.v. (1986) Transport of hemicellulose monomers in the xylosefermenting yeast Candida shehatae. Appl Microbiol Biotechnol 23, 491-495.

Maniatis, T., E.F. Fritsch und J. Sambrook (1982) Molecular cloning. A Iabo- ratory manual. New York: Cold Spring Harbor.

Pitkanen JP, Rintala F, Aristidou A, Ruohonen L1 Penttila M. (2005) Xylose chemostat isolates of Saccharomyces cerevisiae show altered metabolite and enzyme leveis compared with xylose, glicose, and ethanol metabolism of the original strain. Appl Microbiol Biotechnol. 67(6): 827-37.

Richard, P., Putkonen, M., Vaananen, R., Londesborough, J. und Penttila, M. (2002) The missing link in the fungai L-arabinose catabolic pathway, Iden- tification of the L-xylulose reductase gene. Biochemistry 41(20), 6432-7.

Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, W.A. und Van Dijken, J.P. (1992) Effect of benzoic acid on metabolic fluxes in yeasts: a continuous-culture study on the regulation of respiration and alcoholic fermentation. Yeast 8(7), 501-17.

Weierstall1 T., Hollenberg, C.P. und Boles, E. (1999) Cloning and characteri- zation of three genes (SUT1-3) encoding glicose transporters of the yeast Pichia stipitis. Mol Microbiol 31(3), 871-83.

Wieczorke, R., Krampe, S., Weierstall, T., Freidel1 K., Hollenberg, C.P. und Boles, E. (1999) Concurrent knock-out of at Ieast 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae. FERS Lett 464(3), 123-8.

Wiedemann, B. (2005) Molekulargenetische und physiologische Charakteri- sierung eines rekombinanten Pentose-vergárenden Hefestammes. Diplo- marbeit. Johann Wolfgang Goethe-Universitãt, Frankfurt am Main.

Wirth, R. (1993) Elektroporation: Eine alternative Methode zur Transformati- on von Bakterien mit PIasmid-DNA.. Forum Mikrobiologie 11(507-515). Zaldivar, J., Nielsen, J. und Olsson1 L. (2001) Fuel ethanol production from lignocellulose: a challenge for metabolic engineering and process integra- tion. Appl Microbiol Biotechnol 56(1-2), 17-34.

Zimmermann, F.K. (1975) Procedures used in the induction of mitotic recom- bination and mutation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mutat Res 31(2), 71-86.

LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> Johann Wolfgang Goethe-Universitat

<120> TRANSPORTADOR ESPECÍFICO DE ARABINOSE DA LEVEDURA PICHI STIPITIS E AS SUAS APLICAÇÕES <130> U30161BR <160> 4

<170> Patente em vesão 3.2 <210> 1 <211> 542 <212> PRT

<213> Pichia stipitis

<400> 1

Met Ser Tyr Glu Asp Lys Leu Val Gln Pro Ala Leu Lys Phe Arg 15 10 15

Phe Leu Asp Arg Leu Pro Asn He Tyr Asn Val Tyr He He Ala 20 25 30

He Ser Cys He Ser Gly Met Met Phe Gly Phe Asp He Ser Ser 35 40 45

Ser Ala Phe He Gly Glu Asp Asp Tyr Lys Asn Phe Phe Asn Asn

Thr

Ser

Met

Pro 50 55 60

Gly Ser Asp Ile Gln Gly Phe Ile Thr Ser Cys Met Ala Leu Gly Ser 65 70 75 80

Phe Phe Gly Ser Ile Val Ser Ser Phe Ile Ser Glu Pro Phe Gly Arg 85 90 95

Arg Ala Ser Leu Leu Leu Cys Ser Phe Phe Trp Met Val Gly Ala Ala 100 105 110

Val Gln Ser Ser Ser Gln Asn Arg Ala Gln Leu Met Ile Gly Arg Ile 115 120 125

Ile Ala Gly Phe Gly Val Gly Phe Gly Ser Ser Val Ala Pro Val Tyr 130 135 140

Gly Ser Glu Leu Ala Pro Arg Lys Ile Arg Gly Phe Val Gly Gly Ile 145 150 155 160

Phe Gln Phe Cys Val Thr Leu Gly Ile Leu Ile Met Phe Tyr Ile Cys 165 170 175

Tyr Gly Leu His Phe Ile Asn Gly Val Gly Ser Phe Arg Ile Ala Trp 180 185 190

Gly Leu Gln Ile Val Pro Gly Leu Val Leu Phe Val Gly Cys Phe Phe 195 200 205

Ile Pro Glu Ser Pro Arg Trp Leu Ala Lys His Gly Tyr Trp Asp Glu 210 215 220

Ala Glu Phe Ile Val Ala Gln Ile Gln Ala Lys Gly Asn Arg Glu Asp 225 230 235 240

Pro Asp Val Leu Ile Glu Ile Ser Glu Ile Lys Asp Gln Ile Leu Ile 245 250 255

Glu Glu Asn Leu Lys Ser Phe Gly Tyr Val Asp Leu Phe Thr Lys Lys 260 265 270

Tyr Ile Arg Arg Thr Leu Thr Ala Ile Phe Ala Gln Ile Trp Gln Gln 275 280 285

Leu Thr Gly Met Asn Val Met Met Tyr Tyr Ile Val Tyr Ile Phe Asn 290 295 300

Met Ala Gly Tyr Ser Asn Asn Ala Asn Leu Val Ala Ser Ser Ile Gln 305 310 315

Tyr Val Leu Asn Thr Ala Ala Thr Val Pro Ala Leu Phe Leu Met 325 330 335

Tyr Ile Gly Arg Arg Arg Leu Leu Ile Gly Gly Ala Ile Met Met 340 345 350

Ile Phe Gln Phe Gly Val Ala Gly Ile Leu Gly Lys Tyr Ser Val 355 360 365

Val Pro Gly Gly Leu Pro Gly Asn Pro Thr Val Thr Ile Gln Ile 370 375 380

Glu Asp Asn Lys Ser Ala Ala Arg Gly Val Ile Ala Cys Cys Tyr 385 390 395

Phe Val Val Ser Phe Ala Leu Ser Trp Gly Val Gly Ile Trp Val 405 410 415

Cys Ser Glu Val Trp Gly Asp Ser Ala Ser Arg Gln Arg Gly Ala 420 425 430

Val Ser Thr Ala Ala Asn Trp Ile Leu Asn Phe Ala Ile Ala Met 435 440 445

Thr Pro Ser Ser Phe Lys Asn Ile Thr Trp Lys Thr Tyr Ile Ile 450 455 460

Ala Val Phe Cys Leu Val Met Ala Ile His Val Tyr Phe Gly Phe 465 470 475

Glu Thr Lys Gly Lys Arg Leu Glu Glu Val Gly Gln Met Trp Asp 485 490 495

Asn Val Pro Ala Trp Arg Ser Ser Ser Trp Gln Pro Thr Val Pro 500 505 510

Leu Ser Asp Ala Asp Leu Ala His Lys Met Asp Val Ser His Lys 515 520 525

Glu Gln Ser Pro Asp Ala Glu Ser Ser Ser Glu Glu Lys Pro 530 535 540

<210> 2

<211> 1629 <212> DNA

320

Asp

Met

Pro

Pro

Leu

400

Tyr

Ala

Tyr

Tyr

Pro

480

Glu

Leu

Glu <213> Pichia stipitis <4 00> I

atgagctacg aagataaact cgttcaacct gccttgaagt tcaggacctt cttggacaga 60 cttccaaaca tttacaatgt gtacattatt gcatctattt cctgtatttc aggtatgatg 120 ttcggttttg atatttcatc tatgtctgct tttataggtg aagatgacta caagaacttt 180 ttcaataatc caggctcaga catccaaggt tttatcactt cctgtatggc tttaggttct 240 ttcttcggtt ccatagtctc ttccttcatt tccgaaccat ttggtagaag agcatccttg 300 ttgttgtgtt cattcttctg gatggtcggt gctgctgtac aatcatcttc tcaaaacaga 360 gcccaattga tgatcggacg tatcatcgct ggtttcggtg ttggttttgg ttcttctgtt 420 gctccagttt acggttccga attggctcca agaaagatta gaggttttgt tggtggtatt 480 ttccaattct gtgttacctt gggtatcttg attatgttct acatttgtta cggtttgcat 540 ttcattaacg gtgttggctc tttcagaatt gcttggggtt tacaaattgt cccaggtttg 600 gttttatttg tcggttgttt ctttattcca gaatctccaa gatggttagc caaacatggt 660 tactgggatg aagcagaatt catcgttgcc caaattcaag ctaagggtaa tagagaagac 720 ccagacgtgt tgattgaaat ctccgaaatc aaggaccaaa ttttgattga agaaaacctc 780 aagagtttcg gttacgtcga cttattcacc aagaagtata tcagaagaac tttaactgcc 840 atatttgctc aaatctggca acaattgacc ggtatgaatg ttatgatgta ctatattgtc 900 tacattttca acatggccgg ttactctaac aacgcaaact tggttgcctc ttccatccaa 960 tacgtcttga acactgctgc aactgttcca gctttgtttt taatggatta cattggcaga 1020 agaagattgt tgattggagg tgccatcatg atgatgattt tccaatttgg tgttgctggt 1080 atcttaggta aatactccgt ccccgttcca ggcggtcttc caggtaaccc aactgttacc 1140 atccaaatcc cagaagacaa caagtcagct gctagaggtg ttattgcttg ttgttactta 1200 ttcgttgtat cattcgctct gagttggggt gtcggtatct gggtctactg ttcagaagtt 1260 tggggtgact ctgcttccag acagagaggt gctgctgttt caactgctgc caactggatt 1320 cttaactttg ctattgccat gtacactcca tcttccttca agaatatcac ctggaagact 1380 tacatcatct acgccgtctt ctgtcttgtt atggcaatcc atgtctactt tggattccca 1440 gaaaccaagg gcaagcgttt ggaagaagtc ggacaaatgt gggacgaaaa tgttcccgca 1500 tggagatctt ccagctggca accaactgtt ccattgttgt cagatgccga cttggcacac 1560 aagatggatg tttcccacaa ggaagagcaa tctccagatg ccgagtcaag ttctgaggaa 1620 aagccttaa 1629 <210> 3 <211> 1629 <212> DNA

<213> Pichia stipitis <4 00> 3

atgtcttacg aagacaagtt ggttcaacca gctttgaagt tcagaacctt cttggacaga 60 ttgccaaaca tttacaacgt ttacattatt gcttctattt cttgtatttc tggtatgatg 120 ttcggtttcg acatttcttc tatgtctgct ttcattggtg aagacgacta caagaacttc 180 ttcaacaacc caggttctga cattcaaggt ttcattacct cttgtatggc tttgggttct 240 ttcttcggtt ctattgtttc ttctttcatt tctgaaccat tcggtagaag agcttctttg 300 ttgttgtgtt ctttcttctg gatggttggt gctgctgttc aatcttcttc tcaaaacaga 360 gctcaattga tgattggtag aattattgct ggtttcggtg ttggtttcgg ttcttctgtt 420 gctccagttt acggttctga attggctcca agaaagatta gaggtttcgt tggtggtatt 480 ttccaattct gtgttacctt gggtattttg attatgttct acatttgtta cggtttgcac 540 ttcattaacg gtgttggttc tttcagaatt gcttggggtt tgcaaattgt tccaggtttg 600 gttttgttcg ttggttgttt cttcattcca gaatctccaa gatggttggc taagcacggt 660 tactgggacg aagctgaatt cattgttgct caaattcaag ctaagggtaa cagagaagac 720 ccagacgttt tgattgaaat ttctgaaatt aaggaccaaa ttttgattga agaaaacttg 780 aagtctttcg gttacgttga cttgttcacc aagaagtaca ttagaagaac cttgaccgct 840 attttcgctc aaatttggca acaattgacc ggtatgaacg ttatgatgta ctacattgtt 900 tacattttca acatggctgg ttactctaac aacgctaact tggttgcttc ttctattcaa 960 tacgttttga acaccgctgc taccgttcca gctttgttct tgatggacta cattggtaga 1020 agaagattgt tgattggtgg tgctattatg atgatgattt tccaattcgg tgttgctggt 1080 attttgggta agtactctgt tccagttcca ggtggtttgc caggtaaccc aaccgttacc 1140 attcaaattc cagaagacaa caagtctgct gctagaggtg ttattgcttg ttgttacttg 1200 ttcgttgttt ctttcgcttt gtcttggggt gttggtattt gggtttactg ttctgaagtt 1260 tggggtgact ctgcttctag acaaagaggt gctgctgttt ctaccgctgc taactggatt 1320 ttgaacttcg ctattgctat gtacacccca tcttctttca agaacattac ctggaagacc 1380 tacattattt acgctgtttt ctgtttggtt atggctattc acgtttactt cggtttccca 1440 gaaaccaagg gtaagagatt ggaagaagtt ggtcaaatgt gggacgaaaa cgttccagct 1500 tggagatctt cttcttggca accaaccgtt ccattgttgt ctgacgctga cttggctcac 1560 aagatggacg tttctcacaa ggaagaacaa tctccagacg ctgaatcttc ttctgaagaa 1620 aagccataa 1629 <210> 4 <211> 2430 <212> DNA <213> Pichia stipitis <400> 4 ggaataatcc cccaccttga acaattttgt atgtgcgggg cacgtcagga aacttaacct atacgatgga actccaaact tttatagtac gaccatgggt caggaatttt gccgaaaaag cctgtgtata gacgatcaac ttgtattaat ccgcatcaaa aaataattct atctgacatc cttgctgcca actcttcgcc tttttactca agtaagatga aattcctctt attttacaat atcgtattta atattatatc atgagctacg tcaggacctt cttggacaga cttccaaaca cctgtatttc aggtatgatg ttcggttttg aagatgacta caagaacttt ttcaataatc cctgtatggc tttaggttct ttcttcggtt ttggtagaag agcatccttg ttgttgtgtt aatcatcttc tcaaaacaga gcccaattga ttggttttgg ttcttctgtt gctccagttt gaggttttgt tggtggtatt ttccaattct acatttgtta cggtttgcat ttcattaacg tacaaattgt cccaggtttg gttttatttg gatggttagc caaacatggt tactgggatg ctaagggtaa tagagaagac ccagacgtgt ttttgattga agaaaacctc aagagtttcg tcagaagaac tttaactgcc atatttgctc ttatgatgta ctatattgtc tacattttca tggttgcctc ttccatccaa tacgtcttga taatggatta cattggcaga agaagattgt tccaatttgg tgttgctggt atcttaggta caggtaaccc aactgttacc atccaaatcc taatccttct taggaacaat aaccggcgag 60 tgtcgcccta aattgccgtg aaggagagcc 120 atatagagtg gagtttgttt ggggaagtgg 180 ggcggttttg ttcactccta gtgcataatg 240 gtctgcatac cccaaatatt cacaattgac 300 acgtatgcaa atacagtgag gaaatccatt 360 tccttgaaga aggaatcttt gcaatataaa 420 gttttgtcaa gtctttaaga aatttactct 480 aagataaact cgttcaacct gccttgaagt 540 tttacaatgt gtacattatt gcatctattt 600 atatttcatc tatgtctgct tttataggtg 660 caggctcaga catccaaggt tttatcactt 720 ccatagtctc ttccttcatt tccgaaccat 780 cattcttctg gatggtcggt gctgctgtac 840 tgatcggacg tatcatcgct ggtttcggtg 900 acggttccga attggctcca agaaagatta 960 gtgttacctt gggtatcttg attatgttct 1020 gtgttggctc tttcagaatt gcttggggtt 1080 tcggttgttt ctttattcca gaatctccaa 1140 aagcagaatt catcgttgcc caaattcaag 1200 tgattgaaat ctccgaaatc aaggaccaaa 1260 gttacgtcga cttattcacc aagaagtata 1320 aaatctggca acaattgacc ggtatgaatg 1380 acatggccgg ttactctaac aacgcaaact 1440 acactgctgc aactgttcca gctttgtttt 1500 tgattggagg tgccatcatg atgatgattt 1560 aatactccgt ccccgttcca ggcggtcttc 1620 cagaagacaa caagtcagct gctagaggtg 1680 ttattgcttg ttgttactta ttcgttgtat cattcgctct gagttggggt gtcggtatct 1740 gggtctactg ttcagaagtt tggggtgact ctgcttccag acagagaggt gctgctgttt 1800 caactgctgc caactggatt cttaactttg ctattgccat gtacactcca tcttccttca 1860 agaatatcac ctggaagact tacatcatct acgccgtctt ctgtcttgtt atggcaatcc 1920 atgtctactt tggattccca gaaaccaagg gcaagcgttt ggaagaagtc ggacaaatgt 1980 gggacgaaaa tgttcccgca tggagatctt ccagctggca accaactgtt ccattgttgt 2040 cagatgccga cttggcacac aagatggatg tttcccacaa ggaagagcaa tctccagatg 2100 ccgagtcaag ttctgaggaa aagccttaaa ctaaattgat atgaataaac ctgttgcaac 2160 agttgtgtga agtcaattgt tcacgtctta caataatgtc tttatgaaat gctttaaaca 2220 atgtgctata ttaatttatc tgtttactat cttctgtagt acttcatata catccattat 2280 cgaagatact cttcgtagac caatacccta atctcgcctg tacttcactg attgctgctc 2340 tgctttaggt cccttcgaca cttacttttt gttctcgaat atatgacttg ttcatcgccc 2400 taccaccaac tgaatcattg gtccgctatt 2430

Claims (26)

1. Polipeptídeo, selecionado do grupo de: a. um polipeptídeo que seja pelo menos 70%, de preferência pelo menos 80% idêntico à seqüência de aminoácidos de acordo com o SEQ ID NO:1 e tenha uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo, e b. um polipeptídeo que seja idêntico à seqüência de aminoáci- dos de acordo com o SEQ ID NO:1 e tenha uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo.

2. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1, compreenden- do um fragmento de pelo menos 200 ou 300 aminoácidos contínuos de a- cordo com o SEQ ID NO: 1.

3. Polipeptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, compre- endendo um fragmento de 502 aminoácidos que corresponda aos primeiros502 aminoácidos de acordo com o SEQ ID NO:1.

4. Polipeptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, compreendendo um polipeptídeo que seja pelo menos 90%, de preferência 95% idêntico à seqüência de aminoácidos de acordo com o SEQ ID NO:1 e tenha uma função transportadora de pentose, in vitro e/ou in vivo.

5. Polipeptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo, ademais, seqüências de aminoácidos heterólogos.

6. Polipeptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, sendo a pentose arabinose, especialmente L-arabinose.

7. Polipeptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, o polipeptídeo tendo sido originado de uma levedura, de preferência Pichia, especialmente Pichia stipitis.

8. Molécula de ácido nucleico isolada que codifica para um poli- peptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7.

9. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8, sendo o ácido nucleico pelo menos 90%, de preferência 95%, melhor ainda99% idêntico à seqüência de ácido nucleico de acordo com o SEQ ID NO:2 ou 3.

10. Molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 8 ou 9, compreendendo ainda seqüências de ácido nucleico de vetores, de preferência seqüências de vetores de expressão.

11. Molécula de ácido nucleico de acordo com uma das reivindi- cações 8 a 10, compreendendo, ademais, seqüências de aminoácidos que codificam para outros polipeptídeos heterólogos.

12. Molécula de ácido nucleico de acordo com uma das reivindi- cações 8 a 11, a molécula de ácido nucleico compreendendo dsDNA, ssD- NA, PNA, CNA, RNA oder mRNA ou combinações destas.

13. Célula hospedeira que contém uma molécula de ácido nucle- ico de acordo com uma das reivindicações 8 a 12 e, de preferência, a ex- pressa.

14. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13, sendo uma célula de fungo e, de preferência, uma célula de levedura, como Sac- charomyces species, Kluyveromyces sp., Hansenula sp., Pichia sp. ou Yar- rowia sp.

15. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 13 ou 14, contendo, ademais, moléculas de ácido nucleico que codificam para proteí- nas da via metabólica de arabinose.

16. Célula hospedeira de acordo com a reivindicação 15, con- tendo, ademais, moléculas de ácido nucleico que codificam para proteínas da via metabólica de arabinose.

17. Célula hospedeira da cepa MKY06-4P, depositada em 23 de agosto de 2006 junto à Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas Celu- lares sob o número de depósito DSM 18544.

18. Anticorpo ou fragmento de anticorpo, compreendendo uma parte imunologicamente ativa que liga seletivamente a um polipeptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7.

19. Método para a produção de um polipeptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo o cultivo da célula hospe- deira como definida em uma das reivindicações 13 a 17 sob condições nas quais se expressa a molécula de ácido nucleico como definido em uma das reivindicações 8 a 12.

20. Kit compreendendo um composto que se liga seletivamente a um polipeptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, se necessá- rio, com outras substâncias auxiliares e instruções de uso.

21. Método para a identificação de um composto que se liga a um polipeptídeo de acordo com uma das reivindicações 1 a 7 e/ou modula a sua atividade, compreendendo os passos de: pôr em contacto um polipeptídeo ou uma célula que expresse um polipeptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7 com um composto de ensaio, e determinar se o polipeptídeo se liga a um composto de ensaio e, se for preciso, determinar se o composto de ensaio modula a atividade do poli- peptídeo.

22. Método para a modulação da atividade de um polipeptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo a coloca- ção em contacto de um polipeptídeo ou uma célula que expressa um poli- peptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7 com um composto que se liga ao polipeptídeo em concentração suficiente para modular a ativi- dade do polipeptídeo.

23. Método de acordo com a reivindicação 21 ou 22, sendo o composto uma pentose como, por exemplo, arabinose, e especialmente L- arabinose ou um derivado de tal pentose.

24. Método para a produção de bioetanol, compreendendo a expressão de uma molécula de ácido nucleico como definido em uma das reivindicações 8 a 12 numa célula hospedeira como definido em uma das reivindicações 13 a 17.

25. Utilização de um polipeptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7, de uma molécula de ácido nucleico como definido em uma das reivindicações 8 a 12 ou uma célula hospedeira como definida em uma das reivindicações 13 a 17, para a produção de bioetanol.

26. Utilização de um polipeptídeo como definido em uma das reivindicações 1 a 7, de uma molécula de ácido nucleico como definido em uma das reivindicações 8 a 12 ou de uma célula hospedeira como definido em uma das reivindicações 13 a 17, para a fermentação recombinante de biomaterial contendo pentose.