BRPI0718768A2 - Terapia genética renal intravascular com plasmídeo codificando o polipeptídeo bmp-7 - Google Patents

Description

Relatório descritivo da patente de invenção para: "TERAPIA GENÉTICA RENAL INTRAVASCULAR COM PLASMÍDEO CODIFICANDO O POLIPEPTÍDEO BMP-7".

PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido é uma continuação em parte do Pedido Americano No. de Série 11/803.991, depositado em 16 de maio de 2007; do Pedido Americano No. de Série 11/801.798, depositado em 11 de maio de 2007, o qual é uma continuação em parte do Pedido Americano No. de Série 11/599.026, depositado em 14 de novembro de 2006, e o qual reivindica prioridade ao Pedido Provisório Americano 60/736.452, depositado em 14 de novembro de 2005.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

Todos os documentos citados ou referenciados aqui ("documentos aqui citados"), e todos os documentos citados ou referenciados nos documentos aqui citados, juntamente co quaisquer instruções do fabricante, descrições, especificações de produto e folhetos de produtos para quaisquer produtos aqui mencionados ou em qualquer documento incorporado aqui por referência são, por meio dieste, incorporados por referência e podem ser empregados na prática da invenção.

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção se refere aos vetores de tais vetores recombinantes e aos métodos para prevenção e/ou tratamento de falência aguda e/ou crônica em mamíferos. A invenção também se refere aos vetores capazes de expressar, em um hospedeiro, um polipeptídeo bioativo 5 pertencendo à família de proteínas da proteína osteogênica l/proteína morfogenética óssea 7 (0P-1/BMP-7). A invenção também se refere à terapia gênica intravenosa do rim com tais vetores.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 0 sistema renal mamífero serve a funções primárias

tanto na remoção de produtos de resíduos catabólicos da corrente sanguínea quanto na manutenção de fluidos e equilíbrio de eletrólitos no corpo. A insuficiência renal é, deste modo, uma condição que ameaça a vida na qual o 15 acúmulo de catabólitos e outras toxinas, e/ou o desenvolvimento de desequilíbrios significativos nos eletrólitos ou fluidos pode levar à falência de outros sistemas de órgãos principais e à morte. De modo geral, insuficiência renal é classificada como "aguda" ou 20 "crônica". Conforme é detalhado abaixo, insuficiência renal aguda e crônica são doenças debilitantes e que ameaçam a vida para as quais nenhum tratamento adequado existe para retardar, e/ou reverter alterações estruturais renais associadas com a doença. Insuficiência renal aguda (IRA) é geralmente causada por um injúria isquêmico ou tóxico que resulte em um declínio abrupto nas funções renais. Os rins são altamente suscetíveis à isquemia e toxinas devido às suas 5 características anatômicas e fisiológicas únicas. 0 grande fluxo de sangue renal (aproximadamente 25% do débito cardíaco) resulta em uma distribuição aumentada de toxinas originadas no sangue para os rins em comparação com outros órgãos. 0 córtex renal é especialmente suscetível à 10 exposição a toxinas porque ele recebe 90% do fluxo de sangue renal e tem uma grande área superficial endotelial devido aos numerosos capilares glomerulares. No córtex renal, o túbulo proximal (o segmento S3 ou "pars recta") e as células epiteliais do ramo ascendente espesso da alça de 15 Henle, são mais frequentemente afetados por injúria isquêmica e tóxica, devido às suas funções de transporte de soluto e altas taxas metabólicas. Uma vez que água e eletrólitos são reabsorvidos do filtrado glomerular, as células epiteliais tubulares podem ser expostas a 20 concentrações crescentemente altas de toxinas. Semelhantemente na medula, o sistema multiplicador de contracorrente pode concentrar toxinas. Toxinas que são secretadas ou reabsorvidas pelas células epiteliais tubulares (tais como gentamicina) podem ser acumuladas em altas concentrações nessas células. Finalmente, os rins também desempenham um papel na biotransformação de muitos fármacos e toxinas. A biotransformação geralmente resulta na formação de metabólitos que são menos tóxicos do que o 5 composto de origem; entretanto em alguns casos (tal como oxidação de etilenoglicol em glicolato e oxalato) os metabólitos são mais tóxicos.

IRA tem três fases distintas, as quais são classificadas como iniciação, manutenção e recuperação. 10 Durante a fase de iniciação, as medições terapêuticas que reduzem a injúria renal (por exemplo, terapia fluida) podem prevenir o desenvolvimento da IRA estabelecida. A fase de manutenção é caracterizada por lesões tubulares e disfunção nefrótica estabelecida. A fase de recuperação de IRA ocorre 15 quando a função renal melhora subsequentemente ao reparo dos néfrons e à hipertrofia compensatória. As lesões tubulares podem ser reparadas se a membrana de base tubular estiver intacta e células viáveis estiverem presentes. Além disso, a hipertrofia funcional e morfológica dos néfrons 20 sobreviventes pode, em alguns casos, compensar adequadamente a quantidade de néfrons reduzida. Mesmo se a recuperação funcional renal for incompleta, a função adequada pode ser restabelecida em alguns casos. Mais comumente, entretanto, o dano tubular é severo e irreversível e uma grande porcentagem de animais morre ou são eutanasiados na fase de manutenção da IRA.

Apesar dos grandes esforços para decifrar a patogênese celular e molecular de IRA durante as últimas décadas, 5 nenhum tratamento eficaz é atualmente disponível e a incidência de mortalidade permanece muito alta na medicina veterinária. Pelo menos dois estudos retrospectivos documentaram o fraco prognóstico associado com IRA em cachorros. Em um estudo de IRA adquirida em hospital, a 10 taxa de sobrevivência foi de 38%, enquanto que em outro estudo de todos os tipos de IRA, a taxa de sobrevivência foi de 24%. Deste modo, existe uma necessidade médica não- atendida para a prevenção e/ou tratamento melhorado da IRA.

A insuficiência renal crônica (IRC) pode ser definida 15 como uma redução progressiva, permanente e significativa da taxa de filtração glomerular (TFG) devido à perda significativa e contínua de néfrons. IRC tipicamente começa de um ponto no qual uma insuficiência renal crônica (isto é, um decréscimo permanente na função renal de pelo menos 20 50 - 60%) resultou de certa injúria aos tecidos renais, o que causou uma perda significativa das unidades funcionais néfron. A injúria inicial pode não ter sido associada com um episódio de insuficiência renal aguda. Independentemente da natureza da injúria inicial, IRC se manifesta como uma "via final comum" dos sinais e sintomas conforme os néfrons são progressivamente perdidos e a TFG progressivamente declina. Essa deterioração progressiva na função renal é lenta e aparentemente inevitável, tipicamente durando de 5 vários meses até anos em indivíduos caninos e felinos e muitas décadas em pacientes humanos.

0 estágio inicial da IRC tipicamente começa quando TFG foi reduzido até aproximadamente um terço do nível normal (por exemplo, 30 - 40 mL/min para um adulto humano médio). Como resultado da perda de néfrons significativa, e em uma "tentativa" aparente de manter a TFG global com menos néfrons, a TFG de néfron individual média (TFGNM) é aumentada pela adaptação dos néfrons restantes tanto a níveis estruturais quanto funcionais. Uma manifestação estrutural dessa adaptação que é prontamente detectável por exame microscópico de amostras de biópsia é uma "hipertrofia compensatória" tanto dos glomérulos quanto dos túbulos renais, um processo que de fato aumenta o volume do filtrado o qual pode ser produzido por cada néfron remanescente pelo alargamento literal dos glomérulos e dos túbulos.

Como resultado da hipertrofia ou dilatação dos duetos coletores, a urina dos indivíduos com IRC geralmente contém túbulos os quais são de 2 a 6 vezes o diâmetro normal (referido aqui como "túbulos largos" ou "túbulos de insuficiência renal". A presença de tais túbulos largos ajuda no diagnóstico da IRC. Ao mesmo tempo, existem alterações funcionais nos néfrons remanescentes, tais como 5 absorção reduzida ou secreção aumentada de soluto normalmente excretado, as quais podem ser respostas às alterações hormonais ou parácrinas de outros locais no corpo (por exemplo, níveis crescentes do hormônio paratireóide (PTH) em resposta às alterações nos níveis do 10 soro de cálcio e fosfato).

Essas adaptações no estágio inicial da IRC não são bem sucedidas na completa restauração da TFG ou outros parâmetros de função renal e, de fato, submetem os néfrons remanescentes ao um maior risco de perda. Por exemplo, a 15 TFGNM está associada com o estresse mecânico nos glomérulos devido à hipertensão e hiperperfusão. A perda de integridade das junturas de podócitos leva a uma permeabilidade aumentada dos glomérulos ás macromoléculas ou "vazamento" da cápsula glomerular. Efeitos 20 proliferativos também são observados nas células mesangiais, epiteliais e endoteliais, assim como aumentam na deposição do colágeno e outras proteínas de matriz. A esclerose tanto dos glomérulos quanto dos túbulos é outro sintoma comum dos néfrons hipertrofiados e o risco de coagulação nos glomérulos é aumentado. Particularmente, essas adaptações dos néfrons remanescentes, através da redução de TFGNM bem abaixo de seus níveis normais, de fato reduzem a capacidade dos néfrons remanescentes a responder 5 às alterações agudas em água, soluto ou cargas ácidas, e deste modo de fato aumentam a probabilidade de perda adicional de néfrons.

Conforme a IRC progride, e a TFG continua a declinar até menos de 10% do normal (isto é, de cerca de 5 a 10 mL 10 em humanos), o indivíduo entra em uma doença renal terminal (DRT). Durante essa fase, a incapacidade dos néfrons remanescentes de remover adequadamente os produtos residuais e manter o equilíbrio de fluido e eletrólitos leva a um rápido declínio no qual muitos sistemas de 15 órgãos, e particularmente o sistema vascular, podem começar a falhar. Neste ponto, a insuficiência renal irá rapidamente progredir a não ser que o paciente receba terapia de substituição renal (isto é, hemodiálise crônica, diálise peritoneal contínua ou transplante de rim).

O gerenciamento da IRC deve ser efetuado para melhorar

todas as conseqüências clínicas, metabólicas, endócrinas e bioquímicas identificáveis induzidas pela insuficiência renal incluindo, porém sem se limitar, a azotemia, inadequações nutricionais, anemia hipoproliferativa, metabolismo mineral desordenado, distúrbios de eletrólitos, acidose metabólica, proteinúria, metabolismo da água desordenado, hipertensão sistêmica e a progressão da injúria renal pela fibrose intersticial que é considerada 5 como sendo o efeito comumente convergente da IRC independentemente da etiologia especifica.

Enquanto um grande progresso foi feito na última década para atribuir várias conseqüências clinicas, metabólicas, endócrinas e bioquímicas da IRC, a terapia da 10 fibrose crônica permanece extremamente desafiadora e, consequentemente, o controle médico de longo prazo da doença renal permanece como uma importante necessidade terapêutica não-atendida. Atualmente, a terapia mais avançada alvejando a redução da fibrose associada com a 15 doença renal está focada na redução da atividade do sistema renina-angiotensina (RAS). Embora essa estratégia tenha apresentado uma redução na evolução da doença, sua eficácia permanece parcial e ela não interrompe completamente a progressão da fibrose crônica em condições experimentais e 20 clínicas. Isto ocorre provavelmente porque muitos fatores diferentes de RAS contribuem para a patogênese da fibrose associada com IRC.

A prevalência da IRC em gatos e cachorros está aumentando. Para cada 100 gatos avaliados em 1980 nos Estados Unidos, quatro apresentavam insuficiência renal independentemente da idade. Em 1990, a quantidade de casos reportados de insuficiência renal quadruplicou com 16 casos identificados para cada 1000 gatos examinados. Para gatos 5 com mais de 15 anos de idade, 152 casos de insuficiência renal foram diagnosticados em 1990 para cada 1000 exames. O aumento na prevalência da insuficiência renal em gatos envelhecidos pode refletir um aumento nos cuidados veterinários procurados pelos donos, assim como um maior 10 esforço pelos veterinários para detectar a doença. Qualquer que seja a razão, essas revelaçãos enfatizam a atenção e importância de IRC em animais mais velhos. As etiologias mais freqüentes da IRC em animais de companhia incluem, porém não estão limitadas, à nefrite intersticial crônica 15 idiopática, IRA irreversível, aplasia ou displasia renal familial, doença renal policísitica congênita, amiloidose, glomerulonefrite, hipercalcemia, hidronefrose bilateral, leptospirose, pielonefrite, nefrolitíase bilateral, síndrome tipo Falcon, hipertensão, Iinfossarcoma renal.

Na medicina humana, aproximadamente 600 pacientes por

milhão recebem diálise crônica a cada ano nos Estados Unidos, em um custo médio aproximado de $ 60.000 a $ 80.000 por paciente por ano. Dos novos casos de doenças renais terminais anuais, aproximadamente de 28 a 33% são devido à nefropatia diabética (ou glomerulopatia diabética ou hipertrofia renal diabética), de 24 a 29% são devido à nefrosclerose hipertensiva (ou glomerulosclerose

hipertensiva), e de 15 a 22% são devido à glomerulonefrite.

5 A taxa de sobrevivência de 5 anos para todos os pacientes com diálise humana crônica é de aproximadamente 40%, porém para pacientes com mais de 65, a taxa cai até aproximadamente 20%. Consequentemente, ainda existe uma necessidade para tratamentos para prevenir a perda 10 progressiva de função renal, a qual fez com que quase 200.000 pacientes humanos somente nos Estados Unidos se tornassem dependentes na diálise crônica, e o que resulta na morte prematura de dezenas de milhares anualmente.

À luz do fato de que morfógenos específicos e/ou 15 fatores de crescimento que exibem propriedades renotrópicas e promovem o reparo tubular e recuperação da função renal foram recentemente identificados, é concebível que algumas dessas moléculas poderiam ter o potencial a ser usado como agentes terapêuticos para a prevenção e/ou tratamento da 20 IRA e/ou IRC. Tal agente é a proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7, ou proteína osteogênica 1, OP-1), a qual é um membro da superfamília do Fator de Crescimento Transformante-β (TGF-β) . A BMP-7 se liga aos receptores de activina tipos I e II, porém não aos receptores de TGF-β tipo I, II e III. 0 BMP-monomérico tem um peso molecular de 17 a 19 KDa e foi originalmente identificado por sua capacidade de induzir a formação óssea ectópica. 0 5 polipeptídeo BMP-7 é secretado como um homodímero com um peso molecular aparente de aproximadamente 35 a 36 KDa. Recentemente, BMP-7 foi demonstrado como sendo um morfógeno chave durante a nefrogênese. A expressão renal de BMP-7 continua nos rins maduros, especialmente nos duetos de 10 coleta medulares. Os túbulos renais também expressam os receptores de BMP-7. Em modelos animais de IRA e IRC, a expressão renal de BMP-7 é significativamente infrarregulada e a administração de proteína BMP-7 recombinante foi reportada como aceleradora da recuperação 15 renal, um efeito que foi associado com uma menor inflamação intersticial e morte celular programada.

Entretanto, devido à BMP-7 ter uma curta meia vida in vivo (de aproximadamente 30 min), a manutenção de um nível sustentado de proteína exógena na circulação após a injeção 20 da proteína purificada requer várias administrações em um curto intervalo, criando um desafio prático muito significativo. 0 custo de tal terapia com múltiplas injeções é muito alto para ser aplicável na medicina veterinária. Embora a distribuição gênica tenha sido promovida com sucesso como uma alternativa à terapia proteica para vários tratamentos de doenças, sua aplicabilidade para a prevenção da IRA e/ou IRC e/ou tratamento através da expressão do polipeptídeo BMP-7 in vivo não foi proposta anteriormente, e sua eficácia potencial permanece incerta. De fato, o peso molecular baixo do homodímero BMP-7 (isto é, de aproximadamente 35 KDa) poderia permitir teoricamente uma rápida filtração glomerular. Se os níveis de BMP-7 expressos in vivo podem ou não alcançar concentrações plasmáticas terapeuticamente eficazes não pode ser previsto ou determinado a partir da literatura existente. Para complicar ainda mais a avaliação das proteínas BMP expressas in vivo, os resultados podem ser variáveis dependendo do status imune do animal tratato, com diferenças significativas entre os animais imunocompetentes e incompetentes. Deste modo, quando considerada coletivamente como um todo, a literatura não ensina que níveis de BMP-7 expressos in vivo poderiam alcançar concentrações plasmáticas que poderiam ser terapeuticamente úteis.

A citação ou identificação de qualquer documento nesse pedido não constitui uma admissão de que tal documento seja disponível como técnica anterior a presente invenção.

RESUMO DA INVENÇÃO A presente invenção é direcionada para os métodos de prevenção e tratamento de indivíduos mamíferos os quais estejam sofrendo de, ou estejam em risco de sofrer insuficiência renal aguda ou crônica, e aos vetores 5 recombinantes e composições farmacêuticas para uso em tais métodos. Os métodos, vetores e composições da invenção são úteis para reduzir as taxas de mortalidade e/ou morbidez, e para prevenir, inibir, retardar ou aliviar a perda progressiva da função renal, o que caracteriza a 10 insuficiência renal. Indivíduos para os quais os métodos, vetores recombinantes e composições da presente invenção são úteis incluem, porém não estão limitados, aos indivíduos que já são afligidos pela insuficiência renal ou cônica, os quais já receberam terapia de substituição 15 renal, assim como qualquer indivíduo que possa sofrer de uma perda aguda ou progressiva de função renal associada com a perda progressiva das unidades funcionais de néfrons. Se um indivíduo particular está em risco de sofrer doença renal, e/ou se um indivíduo pode se beneficiar dos métodos 20 e/ou composições da presente invenção, é uma determinação que pode ser rotineiramente feita por uma pessoa normalmente versada na técnica médica ou veterinária relevante.

Em uma modalidade, a presente invenção se refere a um vetor contendo e expressando em um hospedeiro um gene pré- pró BMP-7, um gene pro-BMP-7 ou um gene BMP-7 maduro. 0 gene BMP-7 codificando o polipeptídeo pré-pró-BMP-7, o polipeptídeo pró-BMP-7 ou o polipeptídeo BMP-7 maduro pode 5 se originar de um mamífero. Em uma modalidade preferida, o vetor de expressão pode compreender um polinucleotídeo que codifica um pré-pró-BMP-7 canino, um pró-BMP-7 canino ou um polipeptídeo BMP-7 maduro canino. Em outra modalidade preferida, o vetor de expressão pode compreender um 10 polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 felino, um pró-BMP-7 felino ou um BMP-7 maduro felino. Em outra modalidade preferida, o vetor de expressão pode compreender um polinucleotídeo que codifique um polipeptídeo pré-pró-BMP-7, um pró-BMP-7 humano ou um BMP-7 15 maduro humano. O polinucleotídeo codificando o polipeptídeo BMP-7 pode ser operativamente ligado a um promotor e opcionalmente a um intensificador.

Em uma modalidade vantajosa, a invenção se refere a um vetor contendo e expressando o polipeptídeo pré-BMP-7 20 canino, em que o polipeptídeo pró-BMP-7 canino é anulado do peptídeo "pré" no N-terminal, e em que uma seqüência de sinal peptídica de uma origem diferente e fundida ao polipeptídeo pró-BMP-7 canino. Em outra modalidade vantajosa, a invenção se refere a um vetor contendo e expressando o polipeptídeo pró-BMP-7 felino, em que o polipeptídeo pró-BMP-7 felino é anulado do peptídeo "pré" no N-terminal, e em que uma seqüência de sinal peptídica de uma origem diferente é fundida com o polipeptídeo pró-BMP-7 5 felino. Em outra modalidade vantajosa, a invenção se refere a um vetor contendo e expressando o polipeptídeo pré-BMP-7 humano, em que o polipeptídeo pró-BMP-7 humano é anulado do peptídeo "pré" na porção N-terminal, e em que uma seqüência de peptídeo de sinal de uma origem diferente está fundida 10 ao polipeptídeo pró-BMP-7 humano. Vantajosamente, a seqüência de peptídeo de sinal pode ser o fator de crescimento tipo insulina I (IGF-I) ou a seqüência de sinal do peptídeo ativador de plasminogênio tecidual (tPA). Em outra modalidade, o vetor de expressão pode compreender um 15 polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo BMP-7 maduro canino em que o referido polipeptídeo está fundido com uma seqüência de sinal peptídica de BMP-7, IGF-I ou tPA. Em outra modalidade, o vetor de expressão pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo BMP-7 maduro 20 felino em que o referido polipeptídeo está fundido com uma seqüência de sinal peptídica de BMP-7, IGF-I ou tPA. Em outra modalidade, o vetor de expressão pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo BMP-7 maduro humano, em que o referido polipeptídeo está fundido com uma seqüência de peptídeo de sinal de BMP-7, IGF-I ou tPA.

Em outra modalidade, a invenção se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um vetor expressando um polipeptídeo pré-pró-BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 ou 5 um polipeptídeo BMP-7 maduro e um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma modalidade particular, a composição farmacêutica pode compreender uma substância para melhorar a eficácia da transfecção ou transdução do vetor nas células hospedeiras. 10 Ainda em outra modalidade, a invenção se refere a um

método para distribuir o polipeptídeo BMP-7 a um mamífero o qual pode compreender a injeção de um vetor capaz de expressar, in vivo, um polipeptídeo pré-pró-BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 ou um polipeptídeo BMP-7 maduro. Em 15 uma modalidade vantajosa, o hospedeiro animal pode ser um cachorro ou um gato. A invenção se refere ao uso de tal vetor para prevenir e/ou tratar um mamífero para insuficiência renal aguda ou crônica. As composições farmacêuticas da invenção podem ser administradas por 20 qualquer via adequada de administração incluindo, porém sem se limitar, à via intramuscular, subcutânea ou via intravenosa. Em uma modalidade particular, o vetor pode ser administrado ao hospedeiro usando um injetor sem agulhas ou usando eletrotransferência. Ainda em outra modalidade, a invenção se refere a um método para administrar o polipeptídeo BMP-7 a um mamífero, o qual pode compreender a injeção na veia renal de um plasmídeo capaz de expressar, in vivo, um polipeptídeo pré- 5 pró-BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 ou um polipeptídeo BMP-7 maduro. Em uma modalidade vantajosa, o hospedeiro mamífero pode ser um humano, um animal canino ou um animal felino, notoriamente homem, mulher, criança, cachorro, cadela, filhote de cachorro ou gato. A invenção se refere 10 ao uso de tal plasmídeo para prevenir e/ou tratar um mamífero para a insuficiência renal aguda ou crônica. Em uma modalidade particular, o vetor pode ser administrado ao hospedeiro mamífero usando injeção inversa hemodinâmica na veia renal, notoriamente usando um cateter intervencionista 15 invasivo. Por definição, hemodinâmico significa uma injeção rápida de um grande volume.

Em outra modalidade, a invenção se refere ao uso de composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção para tratar mamíferos exibindo um aumento na concentração 20 de creatinina e/ou um aumento na concentração de nitrogênio da uréia do soro. Vantajosamente, um gato pode ser tratado quando a concentração de creatinina plasmática é superior a 1,9 mg/dL e/ou quando a concentração de nitrogênio de uréia plasmática é superior a 35 mg/dL. Vantajosamente, um cachorro pode ser tratado quando a concentração de creatinina plasmática é superior a 1,6 mg/dL, e/ou quando a concentração de nitrogênio de uréia plasmática é maior do que 30 mg/dL. Vantajosamente, um humano pode ser tratado 5 quando a presença de uma anormalidade renal funcional ou estrutural que tenha evoluído por mais de três meses (esta pode ser uma anormalidade causada desde que seja clinicamente significativa ou uma anormalidade histológica ou uma modificação da composição de sangue e/ou urina 10 secundária a uma injúria renal) e/ou quando a Taxa de Filtração Glomerular (TFG) for menor do que 60 mL/min/1,73 m2 por mais de três meses.

Verifica-se que nesta revelação e particularmente nas reivindicações e/ou parágrafos, termos tais como 15 "compreende", "compreendido", "compreendendo" e semelhantes podem ter o significado atribuído a eles na Lei de Patentes Americana; por exemplo, eles podem incluir "inclui", "incluído", "incluindo" e semelhantes; que termos tais como "consistindo essencialmente de" e "consiste essencialmente 20 de" têm o significado atribuído a eles na Lei de Patentes Americana, por exemplo, eles permitem os elementos não explicitamente citados, porém excluem elementos que são encontrados na técnica anterior ou que afetam uma característica básica ou nova da invenção. Estas e outras modalidades são descritas em, ou são obvias de e englobadas pela seguinte descrição detalhada.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A descrição detalhada a seguir, dada a título de exemplo, porém não tencionada a limitar a invenção somente às modalidades específicas descritas, pode ser mais bem entendida juntamente com os desenhos associados, nos quais:

FIG. 1 demonstra o mapa de plasmídeo 050876pPCR-Script e a fase aberta de leitura codificada ("ORF") do BMP-7 canino. A seqüência de nucleotídeos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de aminoácidos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 3.

FIG. 2 demonstra o mapa de plasmídeo pNB2 92 e a ORF codificada do BMP-7 canino. A seqüência de nucleotídeos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 2 e a seqüência de aminoácidos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 3.

Fig. 3 fornece um histograma ilustrando a frequência das lesões de rim com certos graus nos ratos de controle tratados com um plasmídeo expressando BMP-7.

Fig. 4 fornece um histograma ilustrando a frequência

de lesões graves nos ratos de controle e em ratos tratados com um plasmídeo expressando BMP-7.

FIG. 5 demonstra o mapa de plasmídeo pMEB038 e a ORF codificada do BMP-7 humano. A seqüência de nucleotídeos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 14 e a seqüência de aminoácidos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 15.

FIG. 6 demonstra o mapa de plasmídeo pMEB039 e a ORF codificada do BMP-7 felino. A seqüência de nucleotídeos da 5 ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 18 e a seqüência de aminoácidos da ORF codificada é aquela da SEQ ID NO: 19.

FIG. 7 fornece histogramas das variações do peso corporal relativo médio dos animais de cada grupo entre DO e D4, expressos em porcentagem.

FIG. 8 fornece histogramas da creatinemia média dos

animais de cada grupo em D4, expressos em miligramas por decilitro.

Também é incluída como parte do presente pedido uma listagem de seqüências na qual: SEQ ID NO: 1 é a seqüência 15 de nucleotídeos do polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, SEQ ID NO: 2 é a seqüência de nucleotídeos códon-otimizada do polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, SEQ ID NO: 3 é a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, SEQ ID NO: 4 é a seqüência de nucleotídeos do 20 peptídeo de sinal curto de tPA (23 aminoácidos), SEQ ID NO: 5 é a seqüência de aminoácidos do peptídeo de sinal curto da tPA (23 aminoácidos) , SEQ ID NO: 6 é a seqüência de nucleotídeos do peptídeo de sinal longo de tPA (28 aminoácidos) , SEQ ID NO: 7 é a seqüência de aminoácidos do peptídeo de sinal longo de tPA (28 aminoácidos, SEQ ID NO: 8 é a seqüência de nucleotídeos do peptídeo de sinal IGF-I equino, SEQ ID NO: 9 é a seqüência de aminoácidos do peptídeo de sinal IGF-I equino, SEQ ID NO: 10 é a seqüência 5 de nucleotídeos do plasmídeo pNB292, SEQ ID NO: 11 é a seqüência de nucleotídeos do peptídeo de sinal IGF-I canino, SEQ ID NO: 12 é a seqüência de aminoácidos do peptídeo de sinal IGF-I canino, SEQ ID NO: 13 é a seqüência de nucleotídeos do polipetídeo pré-pró-BMP-7 humano, SEQ ID 10 NO: 14 é a seqüência de nucleotídeos códon-otimizada do polipeptídeo pré-pró-BMP-7 humano, SEQ ID NO: 16 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pMEB038, SEQ ID NO: 17 é a seqüência de nucleotídeos do polipeptídeo pré-pró- BMP-7 felino, SEQ ID NO: 18 é a seqüência de nucleotídeos 15 códon-otimizada do polipeptídeo pré-pró-BMP-7 felino, SEQ ID NO: 19 é a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo pré- pró-BMP-7 felino, e a SEQ ID NO: 20 é a seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pMEB039.

DESCRIÇÃO DETALHADA Os métodos e composições da presente invenção podem

ser usados para o tratamento preventivo de insuficiência renal. Os termos "prevenção", "profilaxia", "tratamento preventivo" e "tratamento profilático", como se referem à insuficiência renal, e conforme eles são utilizados aqui e no campo da medicina humana e veterinária, se referem ao tratamento de seus animais saudáveis ou animais sofrendo de uma doença não relacionada, porém são considerados como estando em risco de insuficiência renal aguda. Os 5 principais fatores de risco para a insuficiência renal aguda em gatos e cachorros incluem, porém não estão limitados, a choque e/ou hipovolemia (por exemplo hemorragia, choque hipotensivo, choque séptico, anestesia prolongada ou profunda, hipovolemia, insolação, trauma, 10 queimaduras ou abuso diurético), doenças sistêmicas (por exemplo pancreatite, peritonite, falência hepática, coagulação intravenosa disseminada, vasculite ou insuficiência adrenal), isquemia (conforme causada, por exemplo, por oclusão tromboembólica ou hipertensão 15 maligna), infecções (por exemplo leptospirose, pielonefrite, peritonite infecciosa felina, borreliose, leishmaniose, babesiose, septicemia ou embolia séptica), doença renal sistêmica (por exemplo, falência de órgãos múltipla, glomerulonefrite, lúpus eritematoso sistêmico, 20 trombose da veia renal, obstrução de fluxo urinário, sindrome urêmica hemolitica, síndrome do eAMLgamento hemepigmentúria ou policitemia), idade avançada, doenças renais congênitas e/ou genéticas e outros variados fatores tais como exposição às nefrotoxinas (por exemplo aminoglicosídeos, anfotericina B, cisplatina, adriamicina, fármacos antiinflamatórios não-esteroidais, diuréticos, IL- 2 ou alopurinol), neoplasia (por exemplo linfoma), hipercalcemia, trauma (por exemplo, avulsões), hipertensão 5 maligna, oxalato nefrose e semelhantes.

O tratamento com propósitos preventivos é geralmente efetuado em alguns dias (idealmente de 6 a 8 dias) antes da exposição de animais saudáveis a um ou mais dos fatores de risco anteriormente mencionados para a insuficiência renal 10 aguda. Alternativamente, em animais doentes para os quais um fator de risco associado para insuficiência renal aguda tenha sido identificado, o tratamento pode ser efetuado o mais rapidamente possível para limitar qualquer impacto negativo da doença primária do fator de risco no 15 metabolismo renal e/ou na estrutura e organização do tecido renal.

Além dos tratamentos preventivos, os métodos e composições da presente invenção também podem ser usados para o tratamento terapêutico da insuficiência renal. Os 20 termos "terapia" ou "tratamento terapêutico", conforme se relacionam à insuficiência renal, e conforme eles são aqui usados e no campo da medicina veterinária, se referem ao tratamento ou suporte e/ou aceleração do tratamento de animais que já estão sofrendo suficientemente de ou estão se recuperando (isto é, estão na fase de recuperação) da insuficiência renal aguda ou tratamentos que almejam a redução e/ou regressão da evolução da lesão em animais diagnosticados como tendo, ou estando em risco de apresentar insuficiência renal crônica. Um objetivo critico da terapia é reduzir o risco de uma evolução para a IRC subsequentemente a um evento de IRA. Conforme aqui utilizado, um indivíduo é dito como sofrendo de IRC, ou estando em risco de desenvolver IRC se for razoavelmente esperado que o indivíduo sofra de uma perda progressiva da função renal associada com a perda progressiva das unidades de néfron funcionantes. Pode-se prontamente determinar se um indivíduo particular sofre de IRC, ou está sob o risco de desenvolver IRC através de uma pessoa normalmente versada na técnica médica ou veterinária relevante.

Os principais fatores de risco para a insuficiência renal crônica em cachorros incluem, porém não estão limitados a nefrite intersticial crônica idiopática, IRA irreversível, aplasia ou displasia renal familiar (crias 20 com elevado risco incluem o cão de caça norueguês, Lhasa apso, Samoyed, Cocker spaniel, Doberman, pinsher, poodle padrão e Golden retriever), doença renal policística congênita (por exemplo, em Cairn terriers), amiloidose, gomerulonefrite, hipercalcemia, hidronefrose bilateral, leptospirose, pielonefrite, nefrolitiase bilateral, síndrome tipo Falcon e hipertensão.

Os principais fatores de risco para a insuficiência renal crônica em gatos incluem, porém não estão limitados, 5 à nefrite intersticial crônica idiopática, IRA irreversível, linfossarcoma renal, doença renal policística (por exemplo, em gatos persas familiais), glomerulonefrite, hidronefrose bilateral, amiloidose, pielonefrite,

hipercalcemia e nefrolitiase bilateral.

Indivíduos humanos sofrendo de IRC, ou os quais

estejam em risco de desenvolver IRC, ou os quais podem estar necessitados de terapia de reposição renal incluem, porém não estão limitados, aos indivíduos com doença renal em estágio terminal, nefropatia de diabetes crônica, 15 nefroesclerose hipertensiva, glomerulonefrite crônica, nefrite hereditária e/ou displasia renal, indivíduos os quais tenham tido uma biópsia indicando hipertrofia glomerular, hipertrofia tubular, glomerulosclerose crônica e/ou esclerose túbulo-intersticial crônica, indivíduos os 20 quais tenham passado por uma varredura de ultra-som, MRI, CAT ou outro exame não-invasivo indicando a presença de fibrose renal, indivíduos com uma quantidade incomum de túbulos largos presentes nos seus sedimentos urinários, indivíduos com uma taxa de filtração glomerular ("TFG") a qual seja cronicamente menor do que 50%, e mais particularmente menor do que cerca de 40%, 30% ou 20% da TFG esperada para o indivíduo, indivíduos possuindo um número de unidades funcionais de néfron o qual é menor do 5 que cerca de 50%, e mais particularmente menor do que cerca de 40%, 30% ou 20% da quantidade de unidades funcionais de néfron possuídas por um indivíduo saudável, porém semelhante a indivíduos com somente um único rim e indivíduos que são receptores de transplante de rim.

A "taxa de filtração glomerular" ou "TFG" é

proporcional à taxa de depuração na urina da substância "marcadora" a qual é uma substância de origem plasmática a qual não é ligada pelas proteínas do soro, é livremente filtrada pelos glomérulos e não é nem secretada e nem 15 reabsorvida pelos túbulos renais. Deste modo, conforme aqui utilizado, TFG preferivelmente é definida pela seguinte equação:

TFG = Uconc X V

P cone

Onde Ueone é a concentração na urina da substância marcadora, PCOnc é a concentração plasmática da substância marcadora e V é a taxa de fluxo da urina em mL/min. Opcionalmente, a TFG pode ser corrigida para a área da superfície corporal. Deste modo, os valores de TFG podem ser considerados como estando em unidades de mL/min/1,73 m2". A substância marcadora preferida para as medições da TFG é a inulina, entretanto, devido às dificuldades na medição da concentração dessa substância, creatinina é 5 tipicamente usada como o marcador para as medições da TFG nos ajustes clínicos.

Uma estimativa da "TFG esperada" ou "TFGeSp" pode ser fornecida baseando-se nas considerações da idade de um indivíduo, peso, sexo, área de superfície corporal e grau 10 de musculatura, e na concentração plasmática de algum composto marcador (por exemplo, creatinina) conforme determinado por um teste sanguíneo. Deste modo, como exemplo, uma TFG esperada pode ser estimada como:

TFG = (140 - idade) x [peso (Kg)]

72 x Pconc (mg/dL)

Esta estimativa não leva em consideração fatores como a área superficial, grau de musculatura ou porcentagem de peso corporal. Entretanto, usando os níveis de creatinina plasmática como o marcador, essa fórmula foi empregada para 20 machos humanos como uma forma barata de estimar a TFG. Devido ao fato da creatinina ser produzida pelos músculos estriados, a TFG esperada dos indivíduos fêmeas humanas é estimada pela meAML equação multiplicada por 0,85 para contabilizar pela diferença esperada na massa muscular (ver Lemann et al, 1990 Am. J. Kidney Dis. 16(3); 236-243).

O exame microscópico do sedimento urinário para a presença dos elementos formados é um procedimento padrão na análise de urina. Dentre os elementos formados os quais 5 podem estar presentes na urina estão as massas cilíndricas dos materiais aglutinados que representam tipicamente um modelo ou "túbulo" do lúmen de um tubo coletor ou túbulo contorcido distai. Em indivíduos humanos saudáveis, tais túbulos tipicamente têm um diâmetro de 15 a 25 μτη. Em 10 indivíduos com IRC, entretanto, a hipertrofia dos túbulos pode resultar na presença de túbulos os quais são de 2 a 6 vezes o diâmetro dos túbulos normais e geralmente têm uma aparência cerosa homogênea. Estes são referidos como "túbulos alargados" ou "túbulos de insuficiência renal". 15 Conforme aqui utilizado o termo "túbulo alargado" é usado para se referir aos túbulos de sedimento urinário com um diâmetro de 2 a 6 vezes o normal de um indivíduo, ou de cerca de 30 a 150 μπι para túbulos humanos.

Conforme aqui utilizado em relação às indicações clínicas, o termo "agudo" é usado para se referir às patologias renais para as quais o início ocorre rapidamente, tipicamente dentro de horas ou dias de exposição a uma injúria ou fator de risco. Conforme aqui utilizado em relação às indicações clínicas, o termo "crônico" significa persistir por um período de pelo menos três, e mais preferivelmente, pelo menos seis meses. Deste modo, por exemplo, um indivíduo com 5 uma TFG medida cronicamente abaixo de 50% da TFGexp é um indivíduo no qual a TFG tenha sido medida e considerada como sendo menor do que 50% a TFGexp em pelo menos duas medições separadas por pelo menos três, e mais preferivelmente por pelo menos seis meses, e para a qual 10 não existe razão medicamente confiável para acreditar que a TFG foi substancialmente maior (por exemplo, 10%) durante o período interveniente. Outros indicadores da função renal anormal, tais como a presença de túbulos largos, poderiam ser semelhantemente descritos como crônicos se a presença 15 de tais indicadores persistisse em pelo menos duas medições separadas por pelo menos três, e mais preferivelmente, por pelo menos seis meses.

A Tabela 1 lista alguns, porém não todos os parâmetros que podem ser úteis na diferenciação entre IRA e IRC.

Tabela 1. Parâmetros Úteis para Diferenciar entre IRA

e IRC

Insuficiência Insuficiência renal renal Aguda (IRA) Crônica (IRC) Histórico Isquemia ou Doença renal prévia exposição a toxina ou insuficiência renal Polidipsia/poliúria de longa duração Perda de peso crônica, vômito, diarréia Exame físico Boa condição Fraca condição corporal, rins corporal doloridos, Rins pequenos e inchados e lisos irregulares Sinais clínicos Sinais clínicos relativamente relativamente severos para o brandos para o nível de disfunção nível de disfunção (azotemia) (azotemia) Revelaçãos Hematócrito normal Anemia não- clinicopatológicas ou aumentado regenerativa Sedimento de urina Sedimento na urina ativo inativo Potássio no soro Potássio no soro de de normal a normal a baixo aumentado Acidose metabólica Acidose metabólica menos severa mais severa A presente invenção fornece terapias e tratamentos

preventivos para a insuficiência renal que utilizam composições farmacêuticas compreendendo vetores capazes de expressar o polipeptídeo BMP-7 in vivo e métodos e 5 composição para induzir um aumento sustentado na concentração de BMP-7 plasmática e deste modo reduzir a ativação da via TGF-β nas células epiteliais. A ativação da TGF-β desencadeia, dentre outras coisas, a fosforilação dos fatores AMLd2 e AMLd3 e suas conseqüências nucleares, 10 levando à promoção da transição epitelial-mesenquimal e à repressão da transição mesenquimal-epitelial, e agindo como um gatilho chave para a fibrose. Embora BMP-7 seja expressa em rins adultos, sua expressão é frequentemente infrarregulada frente à insuficiência renal.

Consequentemente, o BMP-7 produzida in vivo exógena pode ajudar a restaurar os níveis de BMP-7 até os níveis fisiológicos normais, levando ao controle e à regressão da fibrose associada co a nefrite túbulo-intersticial e IRC.

Conforme aqui utilizada, uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é considerada como tendo "eficácia terapêutica" ou como sendo "terapeuticamente eficaz" caso a administração daquela quantidade da composição seja suficiente para causar uma melhoria significativa dos sinais clínicos ou marcadores mensuráveis da doença em um 5 indivíduo mamífero sofrendo de IRA ou IRC. Conforme aqui utilizado, uma composição farmacêutica de acordo com a invenção é considerada como tendo "eficácia profilática" ou como sendo "uma eficaz", se a administração daquela quantidade da composição for suficiente para prevenir o 10 desenvolvimento de IRA em um indivíduo. O termo "terapeuticamente eficaz" também pode ser aqui utilizado, em um sentido mais amplo, para se referir a uma quantidade de uma composição que é ou suficiente para causar uma melhoria significativa dos sinais clínicos ou marcadores 15 mensuráveis da doença em um indivíduo mamífero sofrendo de IRA ou IRC, ou que seja suficiente para prevenir o desenvolvimento de IRA em um indivíduo.

Marcadores mensuráveis da função renal, os quais também são úteis na avaliação do status de IRA ou IRC de um 20 indivíduo são bem conhecidos na literatura médica e veterinária e por as pessoas versadas na técnica, e incluem, porém não estão limitados, ao nitrogênio da uréia sanguínea ou níveis "BUN" (ambas medições estáticas e medições das taxas de aumento ou redução nos níveis BUN) , níveis de creatinina no soro (ambas medições estáticas e medições das taxas de aumento ou redução nos níveis de creatinina no soro), medições da proporção de BUN/creatinina (medições estáticas das medições da taxa de 5 alteração da proporção BUN/creatinina) , proporções de urina/plaAML para a creatinina, proporções de urina/plaAML para uréia, taxas de filtração glomerular (TFG), concentrações de sódio no soro (Na+), osmolaridade da urina, produção de urina diária e semelhantes (ver, por 10 exemplo, Brenner e Lazarus (1994), em Harrison1s principies of internai medicine, 13a edição, Isselbacher et al. eds, McGraw Hill Text, NY; Luke e Strom (1994), em Internai Medicine, 4a Edição, J. H. Stein, ed. , Mosby-Year Book, Inc. St Louis). Das acima, as medições das concentrações 15 plasmáticas de creatinina e/ou uréia ou BUN são particularmente importantes como leituras úteis da função renal.

Valores normais para as concentrações de creatinina no soro variam de cerca de 0,5 até cerca de 1,6 mg/decilitro 20 ("dL") em cachorros e de cerca de 0,5 até cerca de 1,9 mg/dL em gatos. 0 limite superior da faixa fisiológica normal dos níveis de creatinina no soro é levemente maior em gatos do que em cachorros. Com exceção da dieta, os fatores influenciando os valores fisiológicos da concentração de creatinina no soro são pouco entendidos. Sabe-se que uma dieta rica em proteínas pode causar hipercreatinemia transitória. Por exemplo, um aumento de cerca de 25% na concentração de creatinina no soro pode 5 ocorrer a cada período de 6-9 horas quando cachorros saudáveis são alimentados com alimento comercial. A relevância de variações menores de creatinemia pode ser difícil de interpretar, entretanto, a menor variação relevante entre duas medições sucessivas dos níveis de 10 creatinina é considerada como sendo uma alteração na concentração de 35 μπιοΙ/L dos valores normais.

0 limite superior da fixa fisiológica normal para os níveis BUN em cachorros e gatos de jejum varia de cerca de 8,8 até cerca de 25,9 mg/dL nos cachorros, e de cerca de 15 15,4 até cerca de 31,2 mg/dL em gatos - os limites superiores da faixa normal são levemente maiores em gatos do que em cachorros. Os níveis BUN, como os níveis de creatinina, são influenciados pela dieta. Outros fatores que podem levar à variação nos níveis BUN incluem 20 tratamento com glicocorticóides de longa duração e/ou insuficiência hepatocelular.

Qualquer aumento significativo dos níveis de creatinina do soro e/ou níveis BUN acima de suas faixas fisiológicas normais é um sinal de uma capacidade reduzida dos rins de eliminar resíduos e catabólitos (isto é, insuficiência excretória).

A demonstração experimental da eficácia dos métodos e composições da presente invenção (por exemplo, os métodos e composições úteis para a terapia gênica com BMP-7 ou equivalentes funcionais do BMP-7) pode ser efetuada de várias formas, por exemplo, pela demonstração de que os animais tratados usando os métodos e composições da presente invenção exibem uma elevação significativamente reduzida de creatinina plasmática e/ou BUN, em comparação com animais tratados com placebo, quando expostos a um desencadeador ou fator de risco tal como, por exemplo, um toxígeno (por exemplo, glicerol, HgCl2) ou um procedimento que inclui isquemia renal (por exemplo, oclusão das artérias renais bilaterais.

Semelhantemente, as leituras dos tecidos podem ser usadas para demonstrar a eficácia dos métodos e composições da presente invenção. Exemplos de leituras teciduais adequadas incluem a quantificação das lesões nefríticas túbulo-intersticiais (lesões "NTI") no parênquima cortical do rim, e em uma menor extensão, no parênquima medular do rim. É bem documentado que a fibrose intersticial renal associada com a nefrite túbulo-inersticial (NTI) é uma via final comum de distúrbios renais com um amplo espectro de diversas etiologias. A deterioração da função renal é amplamente determinada pela extensão das lesões túbulo- intersticiais em muitas formas ou doenças renais, e também em vários modelos de animais experimentais. Concordantemente, os métodos ou composições que são capazes de reduzir ou reverter a evolução da fibrose NTI têm o potencial de beneficiar todos os distúrbios de rim através de um mecanismo modificador de doenças (isto é, pela limitação da degradação e desorganização dos elementos estruturais dos tecidos renais). A demonstração experimental da eficácia das composições e métodos de terapia do gene BMP-7 da presente invenção pode ser demonstrada a partir da observação de que os animais tratados com BMP-7 têm lesões túbulo-intersticiais significativamente reduzidas nos rins em relação aos controles, conforme avaliado usando a obstrução ureteral unilateral ou modelo "OUU".

0 modelo OUU é um modelo animal bem estabelecido de progressão crônica de fibrose renal associada com a atrofia tubular progressiva e com o acúmulo de colágeno intersticial. 0 modelo OUU é bem conhecido na técnica (ver, por exemplo, R. Chevalier et al., Kidney Int. 2000, 57, 882-890, os conteúdos do qual são por meio deste incorporados por referência nas suas totalidades), e o procedimento de obstrução ureteral unilateral pode ser prontamente efetuado pelas pessoas normalmente versadas na técnica. 0 modelo OUU está tipicamente associado com uma patologia túbulo-intersticial muito significativa e com minimas lesões glomerulares, e este é um modelo experimental relevante e útil para demonstrar a eficácia dos métodos e composições da presente invenção, por exemplo, a demonstração da eficácia da estratégia de terapia gênica aqui revelada, a qual é baseada na expressão in vivo de BMP-7 ou de equivalentes funcionais de BMP-7. Ao usar este modelo, a avaliação de NTI no córtex renal pode ser determinada usando marcação com hematoxilina e eosina convencional (ou h&e) e/ou marcação com Masson Trichrome colágeno especifico de tecidos fixos. A caracterização das lesões é baseada na extensão da dilatação tubular, atrofia epitelial e expansão intersticial com ativação do

J

miofiibroblasto e deposição de matriz. Investigações adicionais podem ser baseadas em técnicas de imunoistoquimica e histomorfometria usando, por exemplo, anticorpos específicos de α-actina de músculo liso ("a- AML) para caracterizar e quantificar o nível de transição epitelial para mesenquimal (ou "TEM") no tecido. A análise imunoistoquimica complementar também pode ser efetuada com anticorpos específicos para o colágeno I ou para a fibronectina. A quantificação da infiltração celular é uma leitura adicional que pode ser usada para caracterizar as lesões. A análise imunoistoquimica da última pode ser efetuada usando, por exemplo, anticorpos anti ED-I ou anti Mac-I que são específicos para os macrófagos. Coletivamente, os resultados das leituras acima podem ser usados para fornecer uma grau para a lesão.

Além do dito acima, quaisquer outros métodos adequados ou leituras para estudar a doença renal e/u a função renal, incluindo quaisquer outros modelos animais adequados, podem também ser usados para demonstrar a eficácia dos métodos e composições da presente invenção e para determinar que quantidade de tais composições, ou que modo de administração será uma quantidade ou terapia eficaz.

Em um aspecto, a presente invenção se refere a um vetor capaz de expressar, in vivo em um hospedeiro, um polipeptídeo da proteína morfogenética óssea 7 (BMP-7) ou uma variante ou fragmento seu. Conforme aqui utilizado, "polipetídeo BMP-7" pode ser usado para se referir aos polipeptídeos BMP-7 pré-pró-, pró- ou maduros, em que os polipeptídeos BMP-7 pró e maduros podem se fundir a um peptídeo de sinal BMP-7, IGF-I ou tPA. Os polipeptídeos BMP-7 da presente invenção são preferivelmente de origem canina, felina ou humana. Em uma modalidade, o vetor pode conter e expressar no hospedeiro uma seqüência de nucleotídeo ou gene pré-pró-BMP-7, pró-BMP-7 ou BMP-7 madura. A seqüência de nucleotídeo ou gene codificando o polipeptídeo pré-pró-BMP-7, o polipeptídeo pré-BMP-7 ou o polipeptídeo BMP-7 maduro pode se originar de um mamífero, por exemplo, de um humano, um gato ou um cachorro. Em uma modalidade preferida, a seqüência de nucleotídeos ou gene BMP-7 pode se originar de um cachorro. Em outra modalidade preferida, a seqüência de nucleotídeos ou gene BMP-7 pode se originar de um gato. Em outra modalidade preferida, a seqüência de nucleotídeos ou gene BMP-7 pode se originar de um humano.

BMP-7 também é conhecida como proteína osteogênica-1 ou "OP-1" e é um membro do fator de crescimento transformante-β ou da superfamília "TGF-β". Ela é uma proteína secretada que é processada a partir da pró- proteína para produzir a proteína madura carboxiterminal. Na proteína madura existe um padrão conservado de sete resíduos de cisteína definindo um domínio que se estende do aminoácido 330 até o aminoácido 430 da SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15 e SEQ ID NO: 19. A forma ativa da proteína é um homodímero ligado por dissulfeto. Na sua forma madura e natural, o BMP-7 de ocorrência natural é um dímero glicosilado com um peso molecular aparente de cerca de 30 a 36 KDa, conforme determinado por eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS ("SDS-PAGE"). Quando reduzida, a proteína de 30 KDa gera duas subunidades polipeptídicas glicosiladas com pesos moleculares aparentes de cerca de 16 KDa e 18 KDa. A proteína não-glicosilada tem um peso molecular aparente de cerca de 27 KDa. Quando reduzida, a proteína não-glicosilada de 27 KDa gera duas cadeias polipeptídicas não-glicosiladas, com pesos moleculares de cerca de 14 KDa e 16 KDa.

Tipicamente, a proteína BMP-7 de ocorrência natural é traduzida como um precursor, com uma seqüência de peptídeo de sinal N-terminal, um domínio "pro" e um domínio de proteína "madura". O peptídeo de sinal possui 29 resíduos de comprimento e removido por clivagem rapidamente na tradução em um sítio de clivagem que pode ser previsto usando o método de Von Heijne (1986), Nucleic Acid Research, 14; 4683-4691. 0 domínio "pro" tem 264 resíduos no BMP-7 humano, canina, felina, suína e bovina, e 263 resíduos no BMP-7 de camundongo. 0 domínio pró é clivado para produzir o domínio C-terminal "maduro" de 139 resíduos, o qual inclui o domínio C-terminal com sete cisteínas conservado de 102 resíduos. Conforme aqui referido, a "forma pró" do polipeptídeo BMP-7 se refere a uma proteína compreendendo um par de polipeptídeos, cada um compreendendo um domínio pró em qualquer associação covalente ou não-covalente com o domínio maduro do polipeptídeo BMP-7. A "forma madura" da proteína se refere ao domínio C-terminal maduro o qual não está associado, seja covalentemente ou não-covalentemente, com o domínio pró.

Conforme aqui utilizados, os termos "pré-pró BMP-7", "pró-BMP-7", "BMP-7 maduro" e "BMP-7" se referem não somente aos polipeptídeos específicos e às seqüências ilustradas no relatório descritivo como também na listagem de seqüências associada, mas também se referem a toda e qualquer variante de ocorrência natural conhecida dessas proteínas incluindo, porém sem se limitar, aos derivados, mutantes, homólogos, ortólogos, variantes alélicas, polimorfos alélicos, variantes polimórficas, correlativos filogenéticos e também a toda e qualquer variante de ocorrência não-natural dessas proteínas incluindo, porém sem se limitar, aos derivados, mutantes, fragmentos, proteínas de fusão e semelhantes. Conforme aqui utilizado, o termo "variante" engloba todas as tais variantes de ocorrência natural e não-natural. Particularmente, a presente invenção engloba todas as tais variantes que retêm a característica de ser útil para o tratamento terapêutico ou profilático das doenças renais incluindo IRA e IRC, e/ou que retêm a atividade BMP-7. Essas variantes, derivados e fragmentos funcionalmente equivalentes e semelhantes exibem a capacidade de reter a atividade BMP-7. Um equivalente funcional, conforme aqui utilizado, se refere a quaisquer variantes, derivados, fragmentos e semelhantes de BMP-7 que atendam a qualquer um dos dois critérios (a) que eles têm um nível significativo de homologia de seqüências de aminoácidos com a seqüência de proteína de BMP-7, conforme aqui descrito, ou é codificado por um nucleotídeo que tem um nível significativo da homologia da seqüência de nucleotídeo com a seqüência de proteína de BMP-7 conforme aqui descrito; ou (b) eles têm a capacidade de fornecer uma resposta estatisticamente diferente no grupo tratado em comparação com um grupo tratado com placebo em pelo menos um dos seguintes modelos experimentais de insuficiência renal em roedores: (i) um modelo de insuficiência renal induzida por toxina ou induzida por isquemia, onde a elevação reduzida da creatinina plasmática ou BUN é esperada no tratado em comparação com o grupo controle/placebo; (ii) um modelo OUU de insuficiência renal, onde uma classificação de lesão reduzida é esperada no grupo tratado em comparação com o grupo controle/placebo.

A título de ilustração das variantes, derivados e semelhantes que podem ser englobados pela presente invenção incluem, porém não estão limitados, às variantes de BMP-7, derivados e semelhantes que são codificados por seqüências de nucleotídeos que não exatamente as meAMLs que as seqüências de nucleotídeos aqui reveladas, porém em que essas alterações nas seqüências de nucleotídeos não alteram a seqüência de aminoácido codificada, ou resultam em substituições conservativas dos resíduos de aminoácidos, anulação ou adição de um ou de alguns aminoácidos, substituição dos resíduos de aminoácidos pelos análogos dos aminoácidos que não afetam significativamente as propriedades dos polipeptídeos codificados, e semelhantes. Exemplos de substituições de aminoácidos conservativas incluem substituições de glicina/alanina; substituições de valina/isoleucina/leucina; substituições de

asparagina/glutamina; substituições de ácido

aspártico/ácido glutâmico; substituições de

serina/treonina/metionina; substiutições e lisina/arginina; e substituições de fenilalanina/tirosina/triptofano. Outros tipos de substituições, variações, adições, anulações e derivados que resultam em derivados de BMP-7 funcionais, conforme descrito acima, também são englobados pela presente invenção, e uma pessoa versada na técnica poderia prontamente saber como fazer, identificar ou selecionar tais variantes ou derivados, e como testar a atividade de BMP-7 daqueles variantes ou derivados. Uma pessoa versada na técnica pode otimizar a expressão dos polipeptídeos BMP- 7 da invenção pela remoção dos sítios de união escondidos, 5 pela adaptação do uso do códon pela introdução de uma seqüência de consenso Kozak antes do códon de início, pela alteração do uso do códon ou combinação desses para melhorar a expressão.

Em outra modalidade, a presente invenção pode 10 compreender uma variante de polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino co pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com os resíduos de 1 a 431 da SEQ 15 ID NO: 3.

Em outra modalidade, a presente invenção pode compreender uma variante de polipeptídeo pré-pró-BMP-7 humano com pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 20 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com os resíduos de 1 a 431 da SEQ ID NO: 15.

Em outra modalidade, a presente invenção pode compreender uma variante de polipeptídeo pré-pró-BMP-7 felino com pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com os resíduos de 1 a 431 da SEQ ID NO: 19.

Em outra modalidade a invenção pode compreender uma variante de polipeptídeo BMP-7 maduro canino com pelo menos 97%, pelo menos 97,5%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com os resíduos 293 a 431 da SEQ ID NO: 3.

Em outra modalidade a invenção pode compreender uma variante de polipeptídeo BMP-7 maduro humano com pelo menos 97%, pelo menos 97,5%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com os resíduos 293 a 431 da SEQ ID NO: 15.

Em outra modalidade a invenção pode compreender uma variante de polipeptídeo BMP-7 maduro felino com pelo menos 97%, pelo menos 97,5%, pelo menos 98%, pelo menos 98,5% ou pelo menos 99% de homologia ou identidade com os resíduos 293 a 431 da SEQ ID NO: 19.

Para os propósitos da presente invenção, a homologia ou identidade de seqüência pode ser determinada pela comparação das seqüências quando alinhadas de modo a maximizar a sobreposição e identidade enquanto se minimizam os intervalos de seqüência. Particularmente, a identidade de seqüência pode ser determinada usando qualquer um dentre vários algoritmos matemáticos. Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático usado para a comparação de duas seqüências é o algoritmo de Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1990, 87, 2264-2268, modificado como em Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1993, 90, 5873-5877.

Outro exemplo de algoritmo matemático usado para a comparação das seqüências é o algoritmo de Myers & Miller, CABIOS 1988, 4, 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) o qual é parte do pacote de software de alinhamento de seqüência. Ao utilizar o programa ALIGN para comparar as seqüências de aminoácidos, uma mesa de resíduos de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4 podem ser usadas. Ainda outro algoritmo útil para identificar regiões de similaridade e alinhamento de seqüência local é o algoritmo FASTA conforme descrito em Pearson & Lipman, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1988, 85, 2444-2448.

Vantajoso para uso de acordo com a presente invenção é o software WU-BLAST (Washington University BLAST) versão 2.0. Programas executáveis WU-BLAST versão 2.0 para várias plataformas UNIX podem ser baixados de:

ftp://blast.wust1.edu/blast/executables. Esse programa é baseado em WU-BLAST versão 1.4, o qual por sua vez é baseado no domínio público NCBI-BLAST versão 1.4 (Altschul 5 & Gish, 1996, Local alignment statistics, Doolittle ed. , Methods in Enzymology 266, 460-480; Altschul et al, Journal of Molecular Biology 1990, 215, 403-410; Gish & States, Nature Genetics, 1993, 3: 266-272; Karlin & Altschul, 1993,Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 5873-5877; todos os 10 quais sendo aqui incorporados por referência).

Em geral, a comparação das seqüências de aminoácidos pode ser conseguida pelo alinhamento de uma seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo de uma estrutura conhecida com a seqüência de aminoácidos de um polipeptídeo de uma 15 estrutura desconhecida. Aminoácidos nas seqüências são a seguir comparados e os grupos dos aminoácidos que são homólogos são agrupados juntos. Estemétodo detecta as regiões conservadas dos polipeptídeos e considera as inserções e anulações dos aminoácidos. A homologia entre as 20 seqüências de aminoácidos pode ser determinada pelo uso de algoritmos comercialmente disponíveis (ver também a descrição da homologia acima). Além daqueles mencionados de outra maneira aqui, também é feita menção aos programas BLAST, BLAST intervalado, BLASTIN, BLASTP e PSI-BLAST, fornecidos pelo Centro Nacional para Informação de Biotecnologia (National Center for Biotechnology Information) . Esses programas são amplamente usados na técnica com este propósito e podem alinhar regiões homólogas de duas seqüências de aminoácidos.

Em todos os programas de busca no pacote, as rotinas de alinhamento intervalado são integrantes ao próprio banco de dados de busca. Os intervalos podem ser desligados, caso seja desejado. A penalidade padrão (Q) para um intervalo de comprimento um é Q = 9 para proteínas e BLASTP, e Q = 10 para BLASTN, porém podem ser alterados para qualquer número inteiro. A penalidade por resíduo padrão para estender um intervalo (R) é R = 2 para proteínas e BLASTP, e R = 10 para BLASTN, porém pode ser alterada por um número inteiro. Qualquer combinação de valores para QeR pode ser usada para alinhar as seqüências de modo a maximizar a sobreposição e a identidade, enquanto se minimizam os intervalos da seqüência. A matriz de comparação dos aminoácidos padrão é BLOSUM62, porém outras matrizes de comparação de aminoácidos, tais como PAM, podem ser utilizadas.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece um vetor que contém e expressa um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, e mais preferivelmente que contenha e expresse os nucleotideos de 1 a 1296 da SEQ ID NO: 1. Preferivelmente, este vetor expressa um polipeptídeo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 3.

Em outra modalidade preferida, a presente invenção fornece um vetor que contém e expressa um polinucleotideo codificando um polipeptideo pré-pró-BMP-7 humano, e mais preferivelmente que contenha e expresse os nucleotideos 1 a 1296 da SEQ ID NO: 3. Preferivelmente, esse vetor expressa um polipeptideo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 15.

Em outra modalidade preferida, a presente invenção fornece um vetor que contém e expressa um polinucleotideo codificando um polipeptideo pré-pró-BMP-7 felino, e mais preferivelmente que contenha e expresse os nucleotideos 1 a 1296 da SEQ ID NO: 17. Preferivelmente, esse vetor expressa um polipeptideo com a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 19.

Em uma modalidade, a seqüência de sinal peptidica (pré-peptideo) se estende do resíduo Met na posição (1) até o resíduo Ala na posição (29), com a numeração dos resíduos de aminoácidos sendo aquelas da seqüência pré-pró-BMP-7 identificadas como SEQ ID NO: 3, 15 ou 19. A clivagem do peptídeo de sinal pode ocorrer depois do resíduo Ala(29). Depois da clivagem do peptídeo pré-BMP-7, o polipeptídeo pró-BMP-7 é secundariamente clivado depois da seqüência Arg-X-X-Arg(292) para produzir o polipeptídeo maduro BMP-7.

Os termos "proteína", "polipeptídeo" e "fragmento de polipeptídeo" são usados intercambiavelmente aqui para se referir aos polímeros dos resíduos de aminoácidos de qualquer comprimento.

Em certas modalidades, o vetor de expressão pode compreender um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo BMP-7 maduro, em que o polipetídeo está fundido com uma seqüência de sinal peptídica que é, que compreende ou é derivada do peptídeo de sinal BMP-7. Em outras modalidades, a seqüência de peptídeo de sinal pode ser, compreender ou ser derivada de outros peptídeos de sinal.

A presente invenção ainda se refere aos vetores contendo e expressando um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo pró-BMP-7, em que o peptídeo de sinal pré-BMP- 7 é anulado e em que uma seqüência de sinal peptídica de uma origem diferente é fundida ao polipeptídeo pró-BMP-7. Por exemplo, em certas modalidades, a seqüência de peptídeo de sinal pode ser o fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF-I) ou a seqüência de sinal peptídica do ativador de plasminogênio tecidual (tPA). Em uma modalidade preferida, o pró-BMP-7 codificado pelo polinucleotídeo é um polipeptídeo pró-BMP-7 canino. Vantajosamente, o pró-BMP-7 é codificado por um nucleotideo polinucleotideo que é, ou compreende, ou é derivado dos nucleotideos 88 a 1296 da SEQ ID NO: 1, e que codifica ou compreende uma seqüência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 30 a 431 da SEQ ID NO: 3. Em uma modalidade preferida, a seqüência de nucleotideos caninos códon-otimizada correspondendo à SEQ ID NO: 2 é usada.

Em outra modalidade preferida, o pró-BMP-7 codificado pelo polinucleotideo é um polipeptídeo pró-BMP-7 humano. Vantajosamente, o pró-BMP-7 é codificado por um nucleotideo polinucleotideo que é, ou compreende, ou é derivado dos nucleotideos 88 a 1296 da SEQ ID NO: 13, e que codifica ou compreende uma seqüência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 30 a 431 da SEQ ID NO: 15. Em uma modalidade preferida, a seqüência de nucleotideos humanos códon-otimizada correspondendo à SEQ ID NO: 14 é usada.

Em outra modalidade preferida, o pró-BMP-7 codificado pelo polinucleotideo é um polipeptídeo pró-BMP-7 felino. Vantajosamente, o pró-BMP-7 é codificado por um polinucleotideo que é, ou compreende, ou é derivado dos nucleotideos 88 a 1296 da SEQ ID NO: 17, e que codifica ou compreende uma seqüência de aminoácidos correspondendo aos resíduos de aminoácidos 30 a 431 da SEQ ID NO: 19. Em outra modalidade preferida, a seqüência de nucleotideos felina códon-otimizada correspondendo à SEQ ID NO: 18 é usada.

Em modalidades onde o peptídeo de sinal é derivado dos peptideos de sinal IGF-1, é preferível que o peptídeo de sinal possa ser, compreender, derivar do sinal de peptídeo IGF-I de cavalo, e preferivelmente aquele definido pelos resíduos de aminoácidos 1 a 25 da SEQ ID NO: 9, e codificado pelos nucleotideos 1 a 75 da SEQ ID NO: 8. Em modalidades alternativas, o sinal de peptídeo IGF-I pode ser, pode compreender ou pode ser derivado do sinal de peptídeo IGF-I canino, e preferivelmente é ou compreende ou é derivado do sinal de peptídeo IGF-I canino pelos resíduos de aminoácidos 1 a 25 da SEQ ID NO: 12, e que é codificado pelos nucleotideos 1 a 75 da SEQ ID NO: 11.

Em outras modalidades, o sinal de peptídeo pode ser, pode compreender ou pode ser derivado do sinal de peptídeo tPA, tal como do peptídeo de sinal tPA humano. Em uma modalidade preferida, o peptídeo de sinal tPA usado é, ou compreende, ou é derivado dos resíduos de aminoácidos 1 a 23 da seqüência de peptídeo de sinal tPA humano da SEQ ID NO: 5, e é codificado pelos nucleotideos 1 a 69 da SEQ ID NO: 4. Em uma modalidade alternativa, um peptídeo de sinal tPA humano pode ser, pode compreender ou pode ser derivado dos resíduos de aminoácidos 1 a 28 da SEQ ID NO: 7 e é codificado elos nucleotídeos 1 a 84 da SEQ ID NO: 6 pode ser usado.

De acordo com uma modalidade vantajosa da invenção, o vetor de expressão pode compreender os polinucleotideos codificando o peptideo de sinal de IGFl ou tPA de acordo com as SEQ ID Nos: 5, 7, 9 ou 12 fundido com o polipeptideo pré-pró-BMP-7 anulado do peptideo de sinal (correspondendo do resíduo 30 ao resíduo 431). De acordo com outra modalidade da invenção, o vetor de expressão compreende os polinucleotideos codificando o peptideo de sinal de IGFl ou tPA fundido com o BMP-7 maduro (correspondendo do resíduo 293 ao resíduo 431) . Polinucleotideos compreendendo uma seqüência desejada podem ser inseridos em um vetor de expressão adequado e o vetor, por sua vez, pode ser introduzido em uma célula hospedeira adequada, por exemplo, E. coli para replicação e amplificação.

Em algumas modalidades, a presente invenção engloba um vetor capaz de expressar pré-pró-BMP-7 canino, pró-BMP-7 canino, BMP-7 maduro canino, pré-pró-BMP-7 humano, pró-BMP- 7 humano, BMP-7 maduro humano, pré-pró-BMP-7 felino, pró- BMP-7 felino, BMP-7 maduro felino ou uma variante ou fragmento seu. Para o BMP-7 maduro ou o pró-BMP-7, é preferível que a seqüência de nucleotídeos codificando o peptideo seja precedida imediatamente por uma seqüência de nucleotideos na estrutura codificando um sinal peptidico para facilitar a secreção de BMP-7 no meio extracelular. A seqüência de sinal pode ser a seqüência natural do pré-pró- BMP-7 ou um sinal peptidico de uma proteína secretada, por exemplo, o peptídeo de sinal da proteína ativadora de plasminogênio tecidual (tPA), particularmente da tPA humana (S. Friezner Degen et al J. Biol. Chem. 1996, 261, 6972- 6985; R. Rickles et al J. Biol. Chem. 1988, 263, 1563-1569; D. Berg, et al Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991, 179, 1289-1296), ou o peptídeo de sinal do fator de crescimento tipo insulina 1 (IGF 1), particularmente do IGFl eqüino (K. Otte et al. Gen. Comp. Endocrinol. 1996, 102(1), 11-15), do IGFl canino (P. Delafontaine et al. Gene 1993, 130, 305- 306), do IGFl felino (W0-A-03/022886) , do IGFl bovino S. Lien et al. Mamm. Genome 2000, 11(10), 877-882), do IGFl suíno (M. Muller et al. Nucleic Acids Res. 1990, 18(2), 364), do IGFl de galinha (Y. Kajimoto et al. Mol. Endocrinol. 1989, 3(12), 1907-1913), do IGFl de peru (número de acesso GenBank AF074980). 0 peptídeo de sinal de IGFl pode ser natural ou otimizado, particularmente otimizado pela remoção dos sítios de união escondidos e/ou pela adaptação do uso do códon.

Conforme aqui utilizado, o termo "polinucleotídeo" é usado para se referir a uma forma polimérica dos nucleotideos de qualquer comprimento, a qual contém desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos.

A presente invenção ainda engloba um vetor contendo e expressando um polinucleotideo codificando um polipeptideo BMP-7 operativamente ligado a um elemento promotor e opcionalmente também ligado a um intensificador. Em uma modalidade vantajosa, o promotor é o promotor do gene inicial imediato de citomegalovirus (CMV), preferivelmente de CMV humano ou derivado de murino. Em outras modalidades, os intensificadores e/ou promotores podem ser selecionados dentre aqueles promotores que são conhecidos na técnica, e que são adequados para a expressão de BMP-7 nos vetores da presente invenção. Muitos tais promotores são conhecidos na técnica, e promotores adequados podem ser prontamente selecionados pelas pessoas versadas na técnica. Por exemplo, existem vários promotores específicos de células e/ou tecidos (por exemplo, promotores de músculo, de célula endotelial, de fígado, de células somáticas e de células tronco) e vários promotores e intensificadores virais, e promotores BMP-7, tais como aqueles isogenicamente específicos para cada espécie animal. Por exemplo, em uma modalidade, se o BMP-7 canino deve ser expresso em uma célula muscular canina, os intensificadores e/ou promotores específicos para as células musculares caninas podem ser usados para otimizar a expressão do BMP-7 canino para a aplicação desejada. Exemplos de promotores e intensificadores específicos de músculo que foram descritos são conhecidos por uma pessoa versada na técnica (ver, por exemplo, Li et al., Gene Ther. Dezembro de 1999, 6(12), 2005-11; Li et al., Nat Biotechnol. Março de 1999, 17(3), 241-5 e Loirat et al., Virology. 20 de julho de 1999, 260(1), 74-83; as revelaçãos dos quais sendo incorporadas por referência nas suas totalidades).

Promotores e intensificadores que podem ser empregados na presente invenção incluem, porém não são limitados, aos promotores e intensificadores de LTR do vírus de sarcoma Rous, o gene TK de HSV-1, os promotores iniciais ou tardios de SV40, o promotor tardio principal de adenovírus (MLP), os genes da fosfoglicerato quinase, os genes da metalotioneína, os genes da a-1 antitripsina, os genes da albumina, os genes da colagenase, os genes da elastase I, os genes da β-actina, os genes da β-globulina, os genes da γ-globulina os genes da α-fetoproteína e os genes da creatina quinase muscular.

Em geral, é vantajoso empregar um promotor forte funcional nas células eucarióticas. 0 promotor forte preferido é o promotor do citomegalovírus inicial imediato (CMV-IE) de origem humana ou de murino, ou opcionalmente de outra origem, tal como de rato ou porco-da-india. 0 promotor CMV-IE pode compreender a parte do promotor efetiva, a qual pode ou não estar associada com a parte intensificadora. Pode ser feita referência ao EP-A-260 148, EP-A-323 597, às Patentes Americanas Nos. 5.168.062, 5.385.839 e 4.968.615, assim como ao pedido PCT No. VlOSl / 03905. O promotor CMV-IE é vantajosamente um CMV-IE humano (Boshart M. et al, Cell, 1985, 41, 521- 530) ou CMV- IE de murino.

Em termos mais gerais, o promotor tem ou uma origem viral ou celular. Um promotor viral forte diferente de CMV- IE que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor inicial/tardio do virus SV40 ou o promotor LTR do virus de sarcoma Rous. Um promotor celular forte que pode ser utilmente empregado na prática da invenção é o promotor de um gene do citoesqueleto, tal como, por exemplo, o promotor desmina (Kwissa M. et al., Vaccine, 2000, 18, 2337-2344), ou o promotor de actina (Miyazaki J. et al., Gene, 1989, 79, 269- 277).

Subfragmentos funcionais desses promotores, isto é, porções desses promotores que mantêm uma atividade promotora adequada, são induzidas na presente invenção, por exemplo, promotores CMV-IE truncados de acordo com o Pedido PCT No. W098/00166 ou a Patente Americana No. 6.156.567 podem ser usados na prática da invenção. Um promotor na prática da invenção consequentemente inclui derivados e subfragmentos de um promotor completo que mantêm uma atividade promotora adequada e deste modo funcionam como um promotor, preferivelmente atividade promotora

substancialmente semelhante àquela do promotor efetivo ou de comprimento total a partir do qual o derivado ou subfragmento é derivado, por exemplo, semelhante à atividade dos promotores CMV-IE truncados da Patente Americana No. 6.156.567 à atividade dos promotores CMV-IE de comprimento total. Deste modo, um promotor CMV-IE na prática da invenção pode compreender, consistir essencialmente e ou consistir em porção promotora do promotor de comprimento total e/ou da porção intensificadora do promotor de comprimento total, assim como de derivados e subfragmentos.

Preferivelmente, os plasmideos compreendem outros elementos de controle de expressão. É particularmente vantajoso incorporar seqüência(s) estabilizadora(s), por exemplo, seqüência(s) de íntron(s), preferivelmente o primeiro intron de hCMV-IE (Pedido PCT No. W089/01036), o intron II do gene da β-globulina de coelho (van Ooyen et al, Science, 1979, 206, 337-344). Como ao sinal de poliadenilação (poliA) para os plasmideos e vetores virais diferentes de poxvirus, o uso pode mais ser feito do sinal poli (A) do gene do hormônio de crescimento bovino (bGH) (ver a Patente Americana No. 5.122.458), ou o sinal poli (A) do gene da β-globulina de coelho ou o sinal poli (A) do virus SV40.

O termo "vetor", conforme aqui utilizado, se refere a um plasmideo de DNA ou RNA recombinante ou virus que compreende um polinucleotideo heterólogo a ser distribuído a uma célula alvo, tal como in vivo. O polinucleotideo heterólogo pode compreender uma seqüência de interesse para fins terapêuticos, e pode estar opcionalmente na forma de um cassete de expressão. Conforme aqui utilizado, um "vetor" não precisa ser capaz de replicar na célula ou indivíduo alvo final.

O termo "recombinante", conforme aqui utilizado, significa um polinucleotideo semi-sintético, ou de origem sintética, o qual ou não ocorre na natureza ou está ligado a outro polinucleotideo em um arranjo não encontrado na natureza.

O termo "heterólogo", conforme aqui utilizado, derivado de uma entidade geneticamente distinta do resto da entidade à qual ele está sendo comparado. Por exemplo, um polinucleotideo pode ser colocado por técnicas de engenharia genética em um plasmideo ou vetor derivado de uma fonte diferente, e é deste modo um polinucleotídeo heterólogo. Um promotor removido de sua seqüência codificadora natural e operativamente ligado a uma seqüência codificadora diferente da seqüência natural é concordantemente um promotor heterólogo.

Os polinucleotideos da invenção podem compreender seqüências adicionais, tais como seqüências codificadoras adicionais na meAML unidade de transcrição, elementos de controle tais como promotores, sitios de ligação a ribossoma, terminadores de transcrição, sitios de poliadenilação, unidades de transcrição adicionais sob o controle dos mesmos ou de diferentes promotores, seqüências que permitem a clonagem, expressão, recombinação homóloga e transformação de uma célula hospedeira e qualquer tal constructo conforme pode ser desejável para fornecer modalidades dessa invenção.

Elementos para a expressão de BMP-7 canino ou BMP-7 felino ou BMP-7 humano estão vantajosamente presentes em um vetor da invenção. De modo mínimo, eles podem compreender, podem consistir essencialmente de ou podem consistir de um códon de iniciação (ATG), um códon de parada e um promotor, e opcionalmente também uma seqüência de poliadenilação para certos vetores, tais como plasmideo e certos vetores 10

15

20

virais, por exemplo, vetores virais diferentes de poxvirus. Quando o polinucleotideo codifica um fragmento de polipeptideo, por exemplo, BMP-7 canino, vantajosamente no vetor um ATG pode ser colocado na 5' da estrutura de leitura e um códon de parada pode ser substituído em 3' . Outros elementos para controlar a expressão podem estar presentes, tais como seqüências intensificadoras, seqüências estabilizadoras, tais como seqüências de íntron e de sinal que permitam a secreção da proteína.

Métodos para fazer e/ou administrar um vetor ou recombinantes ou plasmídeo para a expressão dos produtos de gene dos genes da invenção in vivo podem ser qualquer método desejado, por exemplo, um método o qual seja por ou análogo aos métodos revelados em, ou revelados nos

documentos citados nas Patentes Americanas Nos. 4. 603. 112 4 . 769. 330; 4 . 394. 448; 4 . 722 . 848; 4. 745. 051; 4 . 769. 331 4. 945. 050; 5. 494 . 807; 5. 514 . 37 5; 5. 744 . 140; 5. 744 . 141 5. 756. 103; 5. 762. 938; 5. 766. 599; 5. 990. 0 91; 5. 174 . 993 5. 505. 941; 5. 338. 683; 5. 494 . 807; 5. 591. 639; 5. 589. 466 5. 677. 17 8; 5. 591. 439; 5. 552. 143; 5. 580. 859; 6. 130. 066 6. 004. 777; 6. 130. 066; 6. 497 . 883; 6. 464 . 98 4; 6. 451. 770 6. 391. 314; 6. 387 . 37 6; 6. 376. 473; 6. 368. 603; 6. 348 . 196 6. 306. 400; 6. 228. 846; 6. 221. 362; 6. 217. 883; 6. 207. 166 6. 207. 165; 6. 159. 477; 6. 153. 199; 6. 090. 393; 6. 074. 649 6.045.803; 6.033.670; 6.485.729; 6.103.526; 6.224.882; 6.312.682; 6.348.450 e 6.312.683; Pedido de Patente Americana No. de Série 920.197, depositado em 16 de outubro de 1986; WO 90/01543; WO 91/11525; WO 94/16716; WO 96/39491; WO 98/33510; EP 265785; EP 0 370 573; Andreansky et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996. 93: 11313-11318; Ballay et al.. EMBO J. 1993; 4: 3861-65; Feigner et al., J. Biol. Chem. 1994; 269, 2550-2561; Frolov et al.. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93, 11371-11377; Graham. Tibtech 1990. 8. 85-87; Grunhaus et al., Sem. Virol. 1992. 3. 237- 52; Ju et al., Diabetologia 1998. 41, 736-739; Kitson et al., J. Virol. 1991, 65, 3068-3075; McClements et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 1996, 93, 11414-11420; Moss. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93, 11341-11348; Paoletti. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93, 11349-11353; Pennock et al., Mol. Cell. Biol. 1984, 4, 399-406; Richardson (Ed). Methods in Molecular Biology 1995, 39, "Baculovirus Expression Protocols." Humana Press Inc.; Smith et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 1983, 3, 2156-2165; Robertson et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93, 11334-11340; Robinson et al., Sem. Immunol. 1997, 9, 271; e Roizman. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 1996, 93, 11307-11312. Deste modo, o vetor na invenção pode ser qualquer virus recombinante adequado ou vetor viral, tal como poxvírus (por exemplo, vírus vaccinia, vírus avipox, vírus canarypox, vírus fowlppox, vírus raccoonpox, vírus pox suíno, etc.), adenovírus (por exemplo, adenovírus humano, aenovírus canino), herpesvírus (por exemplo, herpesvírus canino), baculovírus, retrovírus, etc. (como nos documentos aqui incorporados por referência) ; ou o vetor pode ser um plasmídeo. Os citados e incorporados aqui pelos documentos de referência, além do fornecimento de exemplos dos vetores úteis na prática da invenção.

De acordo com uma modalidade da invenção, o vetor de expressão pode ser um vetor viral, particularmente um vetor de expressão in vivo. Em uma modalidade vantajosa, o vetor de expressão pode ser um vetor de adenovírus. Vantajosamente, o adenovírus pode ser um vetor de adenovírus humano tipo 5 (hAd5), um adenovírus anulado em El ou E3.

Em uma modalidade particular, o vetor viral pode ser um poxvírus, por exemplo, um vírus vaccinia ou um vírus vaccinia atenuado (por exemplo, MVA, uma cepa Ankara modificada obtida depois de 570 passagens da cepa da vacina Ankara em fibroblastos de embriões de galinha; ver Stickl & Hochstein-Mintzel, Munch. Med. Wschr., 1971, 113, 1149- 1153; Sutter et al, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 1992, 89, 10847-10851; disponível como ATCC VR-1508; ou NYVAC, ver a Patente Americana No. 5.494.807, por exemplo, os Exemplos 1 a 6 e et seq da Patente Americana No. 5.494.807, a qual discute a construção de NYVAC, assim como variações de NYVAC com ORFs adicionais anulados do genoma do virus vaccinia da cepa Copenhagen, assim como a inserção das moléculas de ácido nucleico codificadoras heterólogas nos sítios desse recombinante, e também o uso dos promotores emparelhados; ver também W096/40241), um vírus avipox ou um vírus avipox atenuado (por exemplo, canarypox, fowlpox, dovepox, pigeonpox, quai Ipoxr ALVAC ou TROVAC; ver, por exemplo, as Patentes Americanas Nos. 5.505.941, 5.494.807), vírus swinepox, raccoonpox, camelpox ou da mixomastose.

De acordo com outra modalidade da invenção, o vetor poxvírus pode ser um vetor de vírus canarypox ou de vírus fowlpox, vantajosamente um vírus canarypox ou um vírus fowlpox atenuado. Sob esse aspecto, é feita referência ao canarypox disponível do ATCC sob número de acesso VR-Ill. Os vírus canarypox atenuados estão descritos na Patente Americana No. 5.756.103 (ALVAC) e no pedido PCT No. W001/05934. Várias cepas de vacinação de vírus fowlpox também são disponíveis, por exemplo, a cepa DIFTOSEC CT comercializada por MERIAL e a vacina NOBILIS VARIOLE comercializada por INTERVET; e também é feita referência à Patente Americana No. 5.766.599, a qual pertence à cepa fowlpox atenuada TROVAC. Para informações acerca do método para gerar seus recombinantes e como administrar suas recombinações, o técnico habilitado pode se referir aos documentos aqui citados e ao pedido PCT No. W090/12882, por exemplo, como virus vaccinia menção é feita das Patentes Americanas Nos. 4.769.330, 4.722.848, 4.603.112, 5.110.587, 5.494.807 e 5.762.938 inter alia; como fowlpox, menção é feita das Patentes Americanas Nos. 5.174.993; 5.505.941 e US- 5.766.599 inter alia; como canarypox, menção é feita da Patente TVmericana No. 5.756.103 inter alia; como para swinepox menção é feita da Patente Americana No. 5.382.425 inter alia; e, como para raccoonpox, menção é feita do Pedido PCT No. W000/03030 inter alia.

Quando o vetor de expressão pode ser um virus vaccinia, o sitio ou sitios de inserção para o polinucleotideo ou polinucleotideos a serem expressos pode ser vantajosamente no gene da timidina quinase (TK) ou no sitio de inserção, o gene hemaglutinina (HÁ) ou sitio de inserção, a região codificando o corpo de inclusão do tipo A (ATI); ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencentes ao virus vaccinia. No caso de canarypox, vantajosamente o sitio ou sitios de inserção são ORF(s) C3, C5 e/ou C6; ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencendo ao virus canarypox. No caso de fowlpox, vantajosamente o sitio ou sítios de inserção são os ORFs F7 e F8; ver também os documentos aqui citados, especialmente aqueles pertencendo ao vírus fowlpox. O sítio ou sítios de inserção para o vírus MVA podem ser vantajosamente como em várias publicações incluindo, porém sem se limitar, a Carroll M. W. et al, Vaccine, 1997, 15 (4), 387-394; Stittelaar K. J. et al., J. Virol. 2000, 74 (9), 4236-4243; Sutter G. et al., 1994, Vaccine, 12 (11), 1032-1040; e, sob esse aspecto, também é verificado que o genoma MVA completo é descrito em Antoine G., Virology, 1998, 244, 365-396, o qual permite que o profissional versado use outros sítios ou promotores de inserção. Vantajosamente, o polinucleotídeo a ser expresso pode ser inserido sob o controle de um promotor poxvirus epsecífico, por exemplo, o promotor vaccinia de 7,5 KDa (Cochran et al., J. Virology, 1985, 54, 30-35), o promotor de vaccinia I3L (Riviere et al., J. Virology, 1992, 66, 3424-3434), o promotor vaccinia HA (Shida, Virology, 1986, 150, 451-457), o promotor cowpox ATI (Funahashi et al., J. Gen. Virol., 1988, 69, 35-47), o promotor vaccinia H6 (Taylor J. et al., Vaccine, 1988, 6, 504-508; Guo P. et al. J. Virol, 1989, 63, 4189-4198; Perkus M. et al. , J. Virol, 1989, 63, 3829-3836), inter alia.

Em uma modalidade particular, o vetor viral pode ser um adenovirus, tal como um adenovirus humano (HAV) ou um adenovirus canino (CAV).

Em uma modalidade o vetor viral pode ser um adenovirus humano, particularmente um adenovirus de sorotipo 5, tornado incompetente para replicação pela anulação na região El do genoma viral, particularmente aproximadamente do nucleotideo 459 até o nucleotideo 3510 por referência à seqüência de hAd5 revelada em Genbank sob o número de acesso M73260, e na publicação referenciada J. Chroboczek et al Virol. 1992, 186, 280-285. 0 adenovirus anulado é propagado em El-expressando 293 (F. Graham et al J. Gen. Virol. 1977, 36, 59-72) ou nas células PER, particularmente em PER.C6 (F. Falloux et al Human Gene Therapy 1998, 9, 1909-1917). 0 adenovirus humano pode ser anulado na região E3, particularmente aproximadamente do nucleotideo 28592 até aproximadamente o nucleotideo 30470. A anulação da região El pode ser feita juntamente com uma anulação na região E3 (ver, por exemplo, J. Shriver et al. Nature, 2002, 415, 331-335, F. Graham et al Methods in Molecular Biology Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols editado por E. Murray, The Human Press Inc, 1991, ρ 109- 128; Y. Ilan et al Proc. Natl. Acad. Sei. 1997, 94, 2587- 2592; US 6.133.028; US 6.692.956; S. Tripathy et al Proc. Natl. Acad. Sei. 1994, 91, 11557-11561; B. Tapnell Adv. Drug Deliv. Rev. 1993, 12, 185-199; X. Danthinne et al Gene Therapy 2000, 7, 1707- 1714; K. Berkner Bio Techniques 1988, 6, 616-629; K. Berkner et al Nucl. Aeid Res. 1983, 11, 6003-6020; C. Chavier et al J. Virol. 1996, 70, 4805- 4810). Os sítios de inserção podem ser os locais El e/ou E3 (regiões) eventualmente depois de uma anulação parcial ou completa das regiões El e/ou E3. Vantajosamente, quando o vetor de expressão é um adenovírus, o polinucleotídeo a ser expresso é inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, tal como um promotor forte, preferivelmente um promotor do gene inicial imediato ao citomegalovírus (promotor CMV-IE), particularmente da região intensificadora/promotora aproximadamente do nucleotídeo -734 até aproximadamente o nucleotídeo +7 em M. Boshart et al Cell 1985, 41, 521-530 ou a região intensificadora/promotora do vetor pCI de PROMEGA Corp. O promotor CMV-IE é vantajosamente de origem murina ou humana. 0 promotor do fator de alongamento Ia também pode ser usado. Em uma modalidade particular, um promotor específico de músculo pode ser usado (X. Li et al Nat. Biotechnol. 1999, 17, 241-245). Promotores fortes também são aqui discutidos em relação aos vetores de plasmídeo. Em uma modalidade, uma seqüência de união pode estar localizada à jusante da região intensificadora/promotora. Por exemplo, o intron 1 isolado do gene CMV-IE (R. Stenberg et al J. Virol. 1984, 49, 190), o intron isolado do gene da β-globulina de coelho ou humana, particularmente o intron 2 do gene β-globulina, o intron isolado do gene da imunoglobulina, uma seqüência de união do gene inicial SV40 ou a seqüência de intron quimérica isolada do vetor pCI da Promega Corp. compreendendo a seqüência doadora da β- globulina humana fundida com a seqüência aceptora da imunoglobulina de camundongo (aproximadamente do nucleotideo 8 90 até aproximadamente o nucleotideo 1022 no Genbank sob o número de acesso CVU47120) . Uma seqüência poli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotideo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino, particularmente aproximadamente do nucleotideo 2339 até aproximadamente o nucleotideo 2550 no Genbank sob o número de acesso BOVBMP- 7, um gene da β-globulina de coelho ou um sinal de poliadenilação do gene tardio SV40.

Em outra modalidade, o vetor viral pode ser um adenovirus canino, particularmente CAV-2 (ver, por exemplo, L. Fischer et al. Vaccine. 2002. 20, 3485-3497; Patente Americana No. 5.529.780; Patente Americana No. 5.688.920; Pedido PCT No. W095/14102). Para CAV, os sítios de inserção podem estar na região E3 e/ou na região localizada entre a região E4 e a região ITR direita (ver a Patente Americana No. 6.090.393; a Patente Americana No. 6.156.567). Em uma modalidade, a inserção pode estar sob o controle de um promotor, tal como um promotor do gene inicial imediato do citomegalovírus (promotor CMV-IE) ou um promotor já descrito para um vetor do adenovírus humano. Uma seqüência poli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotídeo a ser expresso, por exemplo, um gene do hormônio de crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene da β-globulina de coelho.

Em outra modalidade particular, o vetor viral pode ser um herpesvírus, tal como um herpesvírus canino (CHV) ou um herpesvírus felino (FHV). Para CHV, os sítios de inserção podem estar particularmente no gene da timidina quinase, na ORF3 ou na ORF UL43 (ver Patente Americana No. 6.159.477). Em uma modalidade, o polinucleotídeo a ser expresso pode ser inserido sob o controle de um promotor funcional em células eucarióticas, vantajosamente um promotor CMV-IE (murino ou humano). Em uma modalidade particular, um promotor regulado por hipóxia, por exemplo, o promotor HRE descrito em K. Boast et al Human Gene Therapy 1999, 13, 2197-2208), pode ser usado. Uma seqüência poli (A) e uma seqüência terminadora podem ser inseridas à jusante do polinucleotideo a ser expresso, por exemplo, hormônio de crescimento bovino ou um sinal de poliadenilação do gene β- globulina de coelho.

Ainda de acordo com outra modalidade da invenção, o vetor de expressão pode ser um vetor de plasmideo ou um vetor de plasmideo de DNA, particularmente um vetor de expressão in vivo. Em um exemplo especifico e não limitativo, o plasmideo pVRl020 ou 1012 (VICAL Inc.; Luke C. et al., Journal of Infectious Diseases, 1997, 175, 91- 97; Hartikka J. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, 1205- 1217) pode ser utilizado como um vetor para a inserção de uma seqüência polinucleotidica. O plasmideo pVR1020 é derivado de pVR1012 e contém a seqüência de sinal tPA humana. Em uma modalidade, o sinal tPA humano compreende do aminoácido Met(I) até o aminoácido Ser(23) ou Ala(28) no Genbank sob o número de acesso HUMTPA14. Em outro exemplo especifico não limitativo, o plasmideo utilizado como um vetor para a inserção de uma seqüência polinucleotidica pode conter a seqüência de peptideo de sinal de IGFl eqüina do aminoácido Met(24) ao aminoácido Ala(48) no Genbank sob o número de acesso U28070.

O termo plasmideo cobre qualquer unidade de transcrição de DNA compreendendo um polinucleotideo de acordo com a invenção e os elementos necessários para essa expressão in vivo em uma célula ou em células do hospedeiro ou alvo desejado; e, sob esse aspecto, é verificado que um plasmideo circular superenovelado ou não superenovelado, assim como uma forma linear, são tencionados a estarem dentro do escopo da invenção.

Cada plasmideo pode compreender, conter ou consistir essencialmente, além do polinucleotideo codificando o polipeptideo pré-pró-BMP-7, em pró-BMP-7 ou BMP-7 maduro, o polipeptideo BMP-7 maduro sendo preferivelmente de origem canina, de origem felina, de origem humana, variante, análogo ou fragmento, operativamente ligado a um promotor ou sob o controle de um promotor ou dependente de um promotor.

A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo um vetor expressando in vivo sob condições apropriadas ou adequadas ou em uma célula hospedeira adequada. As composições farmacêuticas podem compreender, consistir essencialmente de ou consistir em um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão, tais como vetores de expressão in vivo, compreendendo, consistindo essencialmente ou consistindo e expressando um ou mais polinucleotideos codificando um polipeptideo BMP-7, opcionalmente fundido com um peptideo de sinal BMP-7, IGF-I ou tPA em um carreador, excipiente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Vantajosamente, o vetor pode compreender, pode consistir essencialmente de ou pode consistir de e expressar pelo menos um polinucleotideo codificando um polipeptideo BMP-7 canino ou um polipeptideo BMP-7 felino ou um polipeptideo BMP-7 humano opcionalmente fundido com um peptideo de sinal BMP-7, IGF-I ou tPA em um carreador, excipiente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Vantajosamente, de acordo com uma modalidade da invenção, o outro vetor ou vetores na composição pode(m) compreender um polinucleotideo que codifica, e sob circunstâncias apropriadas expressa uma ou mais outras proteínas, polipeptídeos ou peptídeos do que o polipeptideo BMP-7 canino ou um polipeptideo BMP-7 felino ou um polipeptideo BMP-7 humano.

Composições contendo um ou mais vetores, podem compreender, consistir essencialmente ou podem consistir em polinucleotídeos codificando, e vantajosamente expressando in vivo um polipeptideo BMP-7 canino ou um polipeptideo BMP-7 felino ou um polipeptideo BMP-7 humano ou uma proteína de fusão sua.

Em uma modalidade vantajosa, a invenção pode fornecer para a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma formulação para a distribuição e expressão de um polipeptideo BMP-7 em uma célula alvo. A determinação da quantidade terapeuticamente eficaz é experimentação rotineira para uma pessoa normalmente versada na técnica. Em uma modalidade, a formulação compreende um vetor de expressão compreendendo um polinucleotideo que expressa o polipeptideo BMP-7 e um carreador, excipiente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável. Em uma modalidade vantajosa, o carreador, excipiente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode facilitar a transfecção e/ou melhorar a conservação do vetor.

Os carreadores ou veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis são bem conhecidos por uma pessoa versada na técnica. Por exemplo, um carreador ou veículo ou excipiente farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável pode ser água ou uma solução de NaCl 0,9% (por exemplo, salina) ou um tampão fosfato. Outros carreadores ou veículos ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis que podem ser usados para os métodos dessa invenção incluem, porém não estão limitados, ao (poli)-L-glutamato ou polivinilpirrolidona. 0 carreador ou veículo ou excipientes farmaceuticamente ou veterinariamente aceitáveis pode ser qualquer composto ou combinação dos compostos facilitando a administração do vetor, o aumento do nível de expressão ou o aumento da duração da expressão. Doses e volumes de doses são aqui discutidos na descrição geral e também podem ser determinados pelo profissional habilitado a partir desta revelação lida juntamente co o conhecimento da técnica, sem qualquer experimentação demasiada.

Os lipideos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário os quais são vantajosamente, porém não exclusivamente adequados para plasmídeos são vantajosamente aqueles com a fórmula a seguir:

CH,

U3

R-O-CH5-CH-CH5-N-R-X

2I 2I

OR CH,

1 3

Na qual Ri é um radical alifático de cadeia linear saturado ou insaturado com de 12 a 18 átomos de carbono, R2 é outro radical alifático contendo 2 ou 3 átomos de carbono e X é um grupo amina ou hidroxila, por exemplo, DMRIE. Em outra modalidade, o lipideo catiônico pode estar associado com um lipideo neutro, por exemplo, DOPE.

Dentre esses lipideos catiônicos é dada preferência ao DMRIE (N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3- bis(tetradecilóxi)-1-propanoamônio; Publicação PCT No. W096/34109), em que o lipideo catiônico pode estar vantajosamente associado com um lipideo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanolamina; Behr J. P., 1994, Bioconjugate Chemistry, 5, 382-389), para formar DMRIE-DOPE.

Vantajosamente, a mistura do plasmideo com o excipiente pode ser formada extemporaneamente e vantajosamente contemporaneamente à administração da preparação ou pouco antes da administração da preparação. A mistura plasmideo-excipiente é formada vantajosamente de modo a proporcionar tempo suficiente antes da administração para a mistura formar um complexo, por exemplo, entre cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como aproximadamente 30 minutos antes da administração. Quando DOPE está presente, a proporção molar de DMRIE:DOPE é vantajosamente de cerca de 95: cerca de 5 até cerca de 5: cerca de 95, mais vantajosamente de cerca de 1: até cerca de 1, por exemplo, 1:1.

A proporção em peso do adjuvante DMRIE ou DMRIE- DOPE : plasmideo pode estar entre cerca de 50 para cerca de 1 e cerca de 1 para cerca de 10, tal como cerca de 10 para cerca de 1 e cerca de 1 para cerca de 5, e vantajosamente cerca de 1 para cerca de 1 e cerca de 1 para cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.

Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica pode ser diretamente administrada in vivo, e o produto codificado é expresso pelo vetor o hospedeiro. Os métodos para distribuir in vivo um vetor codificando um polipeptídeo BMP-7, vantajosamente o polipeptídeo BMP-7 canino (ver, por exemplo, a Patente Americana No. 6.423.693; EP-A-I 052 286, EP-A-I 205 551, o Pedido de Patente Americana 2004/0057941, ρ Pedido PCT No. W09905300 e Draghia-Akli et al, Mol Ther. Dezembro de 2002, 6(6), 830-6; as revelaçãos dos quais sendo incorporadas por referência em suas totalidades) ou o polipeptídeo BMP-7 felino ou o polipeptídeo BMP-7 humano podem ser modificados para distribuir o polipeptídeo BMP-7 da presente invenção a um humano, um animal canino ou um animal felino, notoriamente homem, mulher, criança, cachorro, cadela, filhote de cachorro ou gato. A distribuição in vivo de um vetor codificando e expressando o BMP-7 aqui descrito pode ser conseguida por uma pessoa normalmente versada na técnica dados os ensinamentos das referências acima mencionadas.

Vantajosamente, as composições e/ou formulações farmacêuticas de acordo com a invenção compreendem ou consistem essencialmente de uma quantidade eficaz de um ou mais vetores de expressão para eliciar uma resposta terapêutica conforme aqui discutido; e, uma quantidade eficaz pode ser determinada a partir dessa revelação, incluindo os documentos aqui incorporados, e o conhecimento da técnica, sem experimentação demasiada.

No caso de composições terapêuticas e/ou farmacêuticas baseadas em um vetor de plasmídeo, uma dose pode compreender, pode consistir essencialmente de ou pode consistir, em termos gerais, de cerca de 1 μg até cerca de 2000 μg, vantajosamente de cerca de 50 μg até cerca de 1000 μg e mais vantajosamente de cerca de 100 μg até cerca de 800 μg de plasmideo expressando o polipeptideo BMP-7. Quando as composições farmacêuticas baseadas em um vetor de plasmideo são administradas co eletrotransferência, a dose do plasmideo é geralmente entre cerca de 0,1 μg e 1 mg, vantajosamente entre cerca de 1 μg e 100 μg, vantajosamente entre cerca de 2 μg e 50 μg.

Em uma modalidade vantajosa, a composição farmacêutica compreendendo vetor(es) de plasmideo de acordo com a invenção pode ser administrada preferivelmente por via intramuscular com eletrotransferência para melhorar a absorção do vetor pelas células hospedeiras. As características da eletrotransferência alternativamente ou em combinação podem ser: (1) campos elétricos mono ou bipolares, preferivelmente unipolares; (2) um campo elétrico variando de 10 a 250 V/cm, preferivelmente de 50 a 200 V/cm; e uma duração de pulso elétrico de 10 a 50 mseg, preferivelmente de 15 a 25 mseg; (4) um pulso interintervalo variando de 10 a 990 mseg, preferivelmente de 50 a 250 mseg; (5) uma freqüência variando de 1 a 50 Hz, preferivelmente de 4 a 20 Hz, mais preferivelmente de 6 a Hz; (6) uma quantidade de pulsos variando de 1 a 15, preferivelmente de 4 a 10; (7) a duração do tratamento irá variar entre 0,1 e 5 seg, preferivelmente entre 0,5 e 2,5 seg, mais preferivelmente entre 0,75 e 1,5 seg; (8) os eletrodos podem ser ou invasivos ou não-invasivos; (9) a quantidade de eletrotransferência por tratamento estará compreendida entre 1 e 10, preferivelmente entre 1 e 5 e mais preferivelmente entre 1 e 2, a freqüência dos tratamentos será estabelecida baseando-se nas concentrações plasmáticas induzidas do polipeptideo BMP-7; (10) a eletrotransferência pode ser aplicada com ou sem anestesia ou sedação. A eletrotransferência pode também ser efetuada diretamente nos rins.

A composição farmacêutica compreendendo vetor(es) de plasmideo ou vetor(es) de adenovirus pode ser alternativamente administrada por sonoporação: (1) as condições são definidas para evitar o cisalhamento induzido pela exposição ao ultra-som; o(s) plasmídeo(s) pode(m) ser protegido(s) pelos polímeros, preferivelmente por polímeros catiônicos; (2) agentes de contraste comerciais usados em ecocardiografia (por exemplo, PESDA perfluorcarbono ou Optison) pode ser usado para melhorar a eficácia, baseando- se nos mecanismos de cavitação acústicos (ou outros); (3) a via de administração é preferivelmente intramuscular ou intravenosa que é de interesse para alvejar um órgão interno como os pulmões; (4) o US pulsado diagnóstico é melhor do que o sistema de onda contínua; (5) a eficácia é intensificada quando o(s) plasmídeo(s) é/são complexados com gelatina cationizada.

Alternativamente para intensificar a distribuição do gene in vivo com dano tecidual mínimo, a composição farmacêutica pode ser administrada usando um laser infravermelho de femtosegundo (tecnologia LBGT).

A composição farmacêutica pode ser vantajosamente administrada por distribuição intravenosa no rim. O método de distribuição de gene de DNA de plasmídeo baseado em hemodinâmica pode ser baseado na alteração da hemodinâmica da circulação sangüínea nos animais receptores após a injeção de um grande volume de solução de DN dentro de um curto período de tempo. Foi demonstrado que a distribuição do DNA nu através da injeção da veia intraportal ou intraepática resulta em altos níveis de expressão gênica. A expressão específica no rim mamífero pode ser conseguida após a injeção por retrogressão direta nas veias renais. Preferivelmente a expressão específica no rim mamífero pode ser conseguida seguindo a injeção por retrogressão direta na veia renal esquerda. Os animais são pré-tratados com um anticoagulante (por exemplo, com ácido acetilsalicílico (por exemplo, Aspegic)) para evitar os efeitos colaterais da trombose. Os animais são anestesiados geralmente usando uma técnica de anestesia clássica baseada em isoflurano. Um cateter de balão de oclusão (por exemplo, cateter de Dilatação de Balão de Diamante Ultrafino (Boston Scientific, Boston, MA, EUA)) pode ser inserido, notoriamente a partir da veia femural ou jugular (por exemplo, com revestimento angiocateter) na veia renal, notoriamente sob navegação por fluoroscopia. Opcionalmente mL (isto é, 1 mL/Kg do peso animal para um cachorro de Kg) de tampão salina normal podem ser injetados para remoção por lavagem do sangue renal em uma taxa de fluxo de cerca de 0,1 até cerca de 0,5 mL/seg. A veia renal pode ser subseqüentemente obstruída pela inflação do balão. Uma dose típica do DNA de plasmídeo é de cerca de 0, 0005 até cerca de 0,5 mg/Kg de peso animal, preferivelmente de cerca de 0, 005 até cerca de 0,05 mg/Kg de peso animal, e mais preferivelmente de cerca de 0,2 mg/Kg de peso animal. O DNA de plasmideo pode ser rapidamente injetado na veia renal com de cerca de 5 até cerca de 25 mL de tampão salina normal, preferivelmente de cerca de 10 até cerca de 20 mL, mais pref erivelmente de cerca de 12,5 até cerca de 175 e mais preferivelmente de cerca de 15 mL. O DNA de plasmideo pode ser rapidamente injetado na veia renal, potencialmente usando um injetor elétrico, para assegurar um fluxo de cerca de 0,5 até cerca de 3 mL/seg, pref erivelmente de cerca de 0,5 até cerca de 2 mL/seg, mais preferivelmente de cerca de 0,75 até cerca de 1,5 mL/seg e mais preferivelmente de cerca de 1 mL/seg.

A oclusão do balão pode ser continuada durante a rápida injeção e interrompida de cerca de 10 seg até cerca de 3 min depois da injeção. Preferivelmente, essa oclusão pode ser interrompia aproximadamente 1 min depois da injeção. Depois disso, o balão de oclusão pode ser removido.

Para um cachorro típico, de 15 Kg, 15 mL de tampão salina normal podem ser injetados para remover por lavagem o sangue renal em uma taxa de fluxo de 0,5 mL/seg. Para um cachorro típico de 15 Kg, uma dose típica de 0,2 mg/Kg de DNA de plasmideo é rapidamente injetada na veia renal com mL de tampão salina normal usando um injetor elétrico para assegurar um fluxo de 1 mL/s.

Para a eletrotransferência, sonoporação ou administração de laser infravermelho de femtosegundo, os volumes de dose podem variar entre cerca de 0,1 e cerca de 2 mL, vantajosamente entre cerca de 0,2 e cerca de 1 mL. Essas doses e volumes de dose são adequados para o tratamento de caninos e outras espécies alvo, mamíferos tais como humanos, eqüinos e felinos.

Ao usar um sistema de vetor viral, a composição terapêutica e/ou farmacêutica contém por dose de cerca de IO4 até cerca de IO11, vantajosamente de cerca de IO5 até cerca de IO10 e mais vantajosamente de cerca de IO6 até cerca de IO9 particulas virais do adenovírus recombinante expressando o polipeptídeo BMP-7. No caso das composições terapêuticas e/ou farmacêuticas baseadas em um poxvírus, uma dose pode estar entre cerca de IO2 pfu e cerca de IO9 pfu. A composição farmacêutica contém por dose de cerca de IO3 até IOy, vantajosamente de cerca de IO6 até IO8 pfu de poxvírus ou herpesvírus recombinante expressando o polipeptídeo BMP-7. 0 volume de dose das composições para as espécies alvo que são mamíferos, por exemplo, o volume de dose das composições caninas, baseando-se nos vetores virais, por exemplo, composições baseadas em vetor viral não-poxvirus, podem estar geralmente entre cerca de 0,1 até cerca de 2,0 mL, pref erivelmente entre cerca de 0,1 até cerca de 1,0 mL, e mais preferivelmente entre cerca de 0,5 mL até cerca de 1,0 mL. Essa administração pode ser, porém não está limitada, à injeção intramuscular (IM), subcutânea (SC), intravenosa (IV) ou intra-renal. Vias alternativas para alcançar os rins são: artéria renal, injeção no espaço subcapsular renal, injeção por retrogressão a partir da injeção pelo ureter.

A presente invenção pode contemplar pelo menos uma administração a um animal de uma quantidade eficiente da composição terapêutica feita de acordo com a invenção. O animal pode ser macho, fêmea, fêmea grávida ou recém- nascido. Em uma modalidade vantajosa, o animal pode ser um mamífero. Em uma modalidade mais vantajosa, o mamífero pode ser um humano, um animal canino ou um animal felino, notoriamente homem, mulher, criança, cachorro, cadela, filhote de cachorro, gato, gata reprodutora ou folhote de gato.

A composição terapêutica de acordo com a invenção também pode ser administrada por um aparelho sem agulha (como, por exemplo, com um aparelho Pigjet, Biojector ou Vitajet (BIOJECT, Oregon, EUA) . Outra abordagem para administrar as composições de plasmídeo podem ser para usar eletrotransferência (ver, por exemplo, S. Tollefsen et al. Vaccine, 2002, 20, 3370-3378; S. Tollefsen et al. Scand. J. Immunol, 2003, 57, 229-238; S. Babiuk et al., Vaccine, 2002, 20, 3399-3408; Pedido PCT No. W099/01158).

Deve ser entendido por uma pessoa versada na técnica que a revelação, aqui considerando a administração das composições da invenção, é fornecida a titulo de exemplo, e que a presente invenção não está limitada aos exemplos específicos descritos. A partir da revelação deste e do conhecimento da técnica, o profissional habilitado pode determinar a quantidade de administrações, a via de administração e as doses a serem usadas para cada administração das composições da presente invenção sem qualquer experimentação demasiada.

Em uma modalidade preferida, a presente invenção se refere ao uso e às composições compreendendo um vetor viral ou um vetor de plasmídeo codificando e sendo capazes de expressar um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, um pró-BMP- 7 canino, um BMP-7 maduro canino, um pré-pró-BMP-7 humano, um pró-BMP-7 humano, um BMP-7 maduro humano, um pré-pró- BMP-7 felino, um pró-BMP-7 felino, um BMP-7 maduro felino ou uma variante, derivado ou fragmento seu, para o tratamento e/ou prevenção de IRA ou IRC por injeção intrarrenal. Entretanto, em outras modalidades da invenção, os métodos e composições aqui revelados podem ser usados para tratar e/ou prevenir outras doenças e condições incluindo, porém sem se limitar, a outras condições renais, distúrbios e doenças, anorexia, perda de peso, desidratação, depressão, vômito, poliúria e/ou polidipsia.

Em uma modalidade preferida, a invenção se refere ao uso das composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção para tratar mamíferos apresentando um aumento nas suas concentrações de creatinina no soro e/ou um aumento nas suas concentrações de BUN, ou um aumento nas suas densidades específicas da urina.

Vantajosamente um gato pode ser tratado quando a concentração de creatinina plasmática é maior do que 1,9 mg/dL e/ou quando a concentração de nitrogênio da uréia plasmática é maior do que 35 mg/dL. Vantajosamente um cachorro pode ser tratado quando a concentração de creatinina plasmática é maior do que 1,6 mg/dL e/ou quando a concentração de nitrogênio da uréia plasmática é maior do que 30 mg/dL.

Vantajosamente um humano pode ser tratado quando a presença de uma anormalidade renal funcional ou estrutural que evoluiu por mais de 3 meses (esta pode ser uma anormalidade morfológica com a condição de ser clinicamente significativa ou uma anormalidade histológica ou uma modificação da composição do sangue e/ou urina secundária a um injúria renal) e/ou quando uma Taxa de Filtração Glomerular (TFG) for menor do que 60 mL/min/1,73 m2 durante mais de 3 meses.

A TFG pode ser estimada em humanos baseando-se na fórmula de Cockcroft e Gault: TFG (em mL/min) = k χ [140 - idade (em anos)) χ Peso corporal (em Kg) ]/creatinemia (em μιηοΙ/L) com k = 1,23 para machos e 1,04 para fêmeas.

0 resultado pode ser reportado à superfície corporal para normalização por 1,73 m2 (superfície corporal = V peso corporal (Kg) χ altura (m)/3600).

Baseando-se na estimativa de TFG (em mL/min/1,73 m2) , o grau IRC pode ser especificado:

Grau 1: IRC com funcionalidade normal: TFG ^ 90

Grau 2: IRC limitado: TFG 60-90

Grau 3: IRC moderado: TFG 30-59

Grau 4: IRC severo: TFG 15-29

Grau 5: IRC terminal: TFG < 15

A invenção .será agora ainda descrita através dos seguintes exemplos não limitativos.

Exemplo 1: Construção do plasmídeo pNB2 92 A fase aberta de leitura (open reading frame, "ORF") do BMP-7 canino códon-otimizado consiste em 1296 pb e codifica um polipeptideo de 431 aminoácidos (SEQ ID NO: 2). 0 DNAc códon-otimizado, codificando a seqüência de polipeptideos da SEQ ID NO: 3, e flanqueado pelos sitios de restrição SalI e XbaI únicos, foi sintetizado a partir dos oligonucleotideos sobreponiveis, montados pela hibridização e clonagem no vetor PCR-Script (Invitrogen) para gerar o plasmideo pPCR-Script050876 (Figura 1) .

O fragmento de DNA correspondendo ao ORF de interesse foi cortado usando as digestões SalI e XbaI e ainda clonado no plasmideo pVR1012 (J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217) para gerar o plasmideo pNB292 (Figura 2), na qual a expressão do BMP-7 canino de códon otimizado é direcionada pelo promotor/intensificador inicial imediato de citomegalovirus (CMV ΙΕ). A seqüência de nucleotideos do plasmideo pNB292 é aquela da SEQ ID NO: 10. O plasmideo pNB292 foi transformado na bactéria E. coli DH5oc e subseqüentemente purificada usando um kit comercial conforme recomendado pelo fabricante (QIAGEN). As concentrações de plasmideo finais foram de 2 mg/mL em tampão TE.

A expressão in vivo transitória do polipeptideo codificado pelo plasmideo pNB292 foi confirmada e observada após a transfecção das células CHO-Kl usando Lipofectamin 2000 (INVITROGEN) . As células CHO-Kl a 90% de confluência em placas de 6 cm de diâmetro foram transfectadas com 5 μς de plasmídeo e 10 μΐ; de lipofectamina cada, de acordo com as instruções do fabricante. Depois da transfecção, as células foram cultivadas em meio MEM-glutamax contendo 1% de soro de bezerro fetal por 24 horas. As células crescendo em capas de vidro foram lavadas com PBS, incubadas por 10 min em acetona gelada para fixação e permeabilização adicionais e novamente lavadas em PBS. A produção de proteína recombinante foi analisada por imunofluorescência indireta usando um soro policlonal BMP7 anti-humano (ABCAM, Cambridge, Reino Unido). O método imunoquímico confirmou que o polipeptídeo pré-pró-BMP-7 codificado por pNB292 foi expresso em células CHO-Kl.

Exemplo 2. Efeito terapêutico da terapia gênica baseada em plasmídeo BMP-7

Um estudo foi efetuado em ratos para demonstrar a capacidade da terapia gênica de BMP-7 reduzir a intensidade das lesões túbulo-intestinais associadas com a evolução de um modelo de obstrução ureteral unilateral (OUU) de insuficiência renal crônica.

ratos Sprague-Dawley machos pesando aproximadamente 200 g na iniciação do estudo foram comprados da IFFACREDO (L'Arbresle, França). 0 máximo e mínimo tanto da temperatura quanto da higrometria da sala foram registrados diariamente. A temperatura alvo e a faixa de higrometria foram de 20 a 24 0C e de 20 a 70%, respectivamente. Luz foi fornecida usando um temporizador automático em ciclos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Somente ratos saudáveis foram incluídos no estudo. Os ratos foram alocados aleatoriamente em 4 grupos de 5 animais cada (Grupos de 1 a 4).

A obstrução ureteral unilateral (OUU) foi efetuada em ratos a partir dos grupos 2, 3 e 4 usando um procedimento estabelecido (R. Chevalier et al, Kidney Int. 2000, 57, 882-890). Resumidamente, os ratos foram anestesiados por injeção intramuscular de tiletamina-zolazepam (ZOLETIL® 100 - 20 a 50 mg/Kg - VIRBAC, França). 0 abdômen foi depilado e a pele ventral foi lavada com iodeto de povidona. Uma incisão mediai da pele e do revestimento abdominal foi efetuada. O ureter esquerdo foi exposto e ocluso pelo apertamento do tubo com duas suturas de seda 5,0 a aproximadamente 5 mm de distância uma da outra. A sutura do revestimento abdominal e da pele foi efetuada usando um fio de seda (Silk dec. 0, ETHICON, França). Os ratos no grupo 2 foram falsamente operados, isto é, esses animais tiveram seus ureteres cirurgicamente expostos e manipulados, porém não ligados. Os ratos no grupo 1 foram mantidos como controle, sem cirurgia efetuada.

0 plasmideo Gwiz-seap® expressando o transgene de controle SEAP foi comprado de GTS Inc. (São Diego, EUA) e usado como placebo. 0 plasmideo pNB292 foi construído de acordo com o exemplo 1. As concentrações de plasmideo finais foram de 2 mg/mL em tampão TE.

Os animais individuais foram tratados em dois dias antes da cirurgia (D-2) e cinco dias depois da cirurgia (D+5), DO sendo o dia da cirurgia. Um pré-tratamento intramuscular com 100 μΐί de hialuronidase a 30 U/100 μ]^ foi efetuado em cada músculo alvejado duas horas antes da injeção dos plasmídeos. Os ratos foram subseqüentemente anestesiados (por injeção intramuscular de tiletamina- zolazepam: ZOLETIL® 100 - 20 a 50 mg/Kg - VIRBAC, França) e metade de uma dose da solução de plasmideo (isto é, 200 μΙΟ foi administrada por injeção intramuscular (IM) em cada região muscular tibialis cranialis em D-2 em cada região muscular semi-membranous em D+5. Cada injeção de 200 μΐ^ corresponde à metade da dose de um plasmideo, isto é, 400 μς. Cada rato injetado com plasmideo recebeu uma quantidade total de 800 μg de DNA por dia de tratamento. A tabela a seguir recapitula os volumes e massas de plasmideo inj etado. O -S

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Tabela 3. Composições de plasmideo administradas.

Composição de plasmideo por dose (400 μΙΟ Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 pNB292 — 400 μg Gwiz-SEAP 400 μg 800 μg

Nos cinco minutos após a distribuição intramuscular de

plasmideo, a eletrotransferência (ET) foi aplicada a cada músculo injetado usando eletrodos de placa não-invasivos (aproximadamente 0,8 cm2 cada) na presença de gel condutor entre a pele e os eletrodos. A distância inter-eletrodo foi medida como sendo de aproximadamente 0,8 cm. Uma série de 8 pulsos elétricos de 20 mseg foi aplicada em uma freqüência de 8 Hz durante 1,3 seg. A voltagem aplicada foi de 140 V almejando um campo de 175 V/cm.

Todos os ratos foram eutanasiados 13 dias depois da cirurgia (D+13). Metade de cada rim esquerdo foi fixado com 10% de formalina tamponada para análise histopatológica. Depois da fixação, cada amostra foi desidratada em soluções de álcool de concentração crescente, limpas em isoparafina H e embebidas em parafina. As amostras embebidas foram cortadas em seções de 5 μπι usando um micrótomo (MICROM®, França). Quatro seções por sitio foram preparadas e marcadas com Hematoxilina-Eosina-Safranina ("HES") e Masson Trichrome. Seções histológicas foram observadas usando um microscópio (ECLIPSE E600) ajustado com objetivas de 2x, 4x, IOx, 25x e 40x. A injúria morfológica renal, conforme caracterizada por dilatação tubular com atrofia epitelial e expansão intersticial com deposição de matriz, foi classificada de modo cego baseando-se em uma escala de O (ausente), 1 (brando) , 2 (moderado) , 3 (limitado) e 4 (severo). As pontuações médias totais e a freqüência de cada classificação foram calculadas baseando-se em valores individuais, os quais foram determinados em 10 campos por rato, 6 ratos por grupo. Foi descoberto que o BMP-7 expresso em plasmideo

atenuou a fibrose intersticial renal 13 dias depois da obstrução ureteral unilateral (OUU).

A Figura 3 fornece histogramas da freqüência dos graus de lesão no controle versus os grupos tratados. Nenhuma alteração do tecido renal pôde ser observada em qualquer um dos 5 ratos do grupo de controle não-obstruido 1, todos os ratos mantendo a estrutura do rim totalmente normal classificada como "0". Ao contrário, 4 de 5 ratos do grupo de controle 2, não-tratado, porém obstruído, apresentaram lesões severas em grau 4. Um rato único neste grupo classificado em um grau de 3 demonstrou a severidade do modelo experimental. Todos os 4 de 4 ratos no grupo tratado com SEAP (grupo 4) também apresentaram lesões severas classificadas em grau 4, confirmando deste modo a gravidade do desafio neste grupo tratado com um transgene não- relevante. Ao contrário, 4 de 5 ratos no grupo 3 tratado com BMP-7 (grupo 3) apresentaram uma classificação de lesão de 3 com somente um rato neste grupo com lesões severas classificadas com 4. Consequentemente, a proporção de lesões severas (grau 4) no grupo tratado com BMP-7 foi de 20% em comparação com 80% no grupo de controle não-tratado (grupo 2) e 100% no grupo tratado com placebo (grupo 4) (Fig. 4) .

Esses dados demonstram claramente o efeito terapêutico

da terapia gênica baseada no plasmideo BMP-7 em um modelo experimental muito severo de nefrite túbulo-intersticial. Exemplo 3: Construção do plasmideo pMEB038 A fase aberta de leitura (vvORF") do BMP7 humano códon- otimizado consiste de 1296 pb e codifica um polipeptideo com 4 31 aminoácidos (SEQ ID NO: 15). O DNAc códon- otimizado, codificando a seqüência de polipeptideos da SEQ ID NO: 14, e flanqueada por sítios de restrição EcoRV e XbaI únicos, foi sintetizada a partir de nucleotideos sobrepostos, montados pela hibridização e clonagem no plasmídeo pVR1012 (J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217) para gerar o plasmídeo pMEB038 (Figura 5) no qual a expressão do BMOP-7 humano códon-otimizado é direcionada pelo promotor/intensificador inicial imediato de citomegalovírus (CMV-IE). A seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pMEB038 é aquela da SEQ ID NO: 16. O plasmídeo pMEB038 foi transformado na bactéria E. coli DH5a e subseqüentemente purificado usando um kit comercial conforme recomendado pelo fabricante (Pure Yield™ Plasmid Midiprep, Promega). As concentrações de plasmídeo finais foram de 2 mg/mL no tampão TE.

A expressão in vivo transiente do polipeptídeo codificado pelo plasmídeo pMEB038 foi confirmada e observada depois da transfecção de células CHO-Kl, usando Lipofectamin 2000 (INVITROGEN). As células CHO-Kl em 90% de confluência em placas de 6 cm de diâmetro foram transf ectadas com 5 μg de plasmídeo e 10 μΐ; de lipofectamina cada, de acordo com as instruções do fabricante. Depois da transfecção, as células foram cultivadas em meio MEM-glutamax contendo 1% de soro de bezerro fetal por 24 horas. As células crescendo em capas de vidro foram lavadas com PBS, incubadas por 10 min em acetona gelada para fixação e permeabilização adicionais e novamente lavadas era PBS. A produção de proteína recombinante foi analisada por iraunofluorescência indireta usando um soro policlonal BMP7 anti-humano e anticorpos monoclonais (MAB3542, BAM354 e AF354 de R&D Systems, e SC- 9305 e SC-6899 de Santa Cruz). O método imunoquímico confirmou que o polipeptídeo pré-pró-BMP-7 codificado por pMEB038 foi expresso nas células CHO-Kl.

Exemplo 4: Construção do plasmídeo pMEB039 A fase aberta de leitura BMP7 felino códon-otimizado

("ORF") consiste em 1296 pb e codifica um polipeptídeo com 431 aminoácidos (SEQ ID NO: 19) . O DNAc códon-otimizado, codificando a seqüência de polipeptídeos da SEQ ID NO: 18, e flanqueada por sítios de restrição EcoRV e XbaI únicos, foi sintetizada a partir de nucleotídeos sobrepostos, montados pela hibridização e clonagem no plasmídeo pVR1012 (J. Hartikka et al. Human Gene Therapy 1996, 7, 1205-1217) para gerar o plasmídeo pMEB039 (Figura 6) no qual a expressão do BMP-7 humano códon-otimizado é direcionada pelo promotor/intensificador inicial imediato de citomegalovírus (CMV-IE). A seqüência de nucleotídeos do plasmídeo pMEB039 é aquela da SEQ ID NO: 20. 0 plasmídeo pMEB039 foi transformado na bactéria E. coli DH5a e subseqüentemente purificado usando um kit comercial conforme recomendado pelo fabricante (Pure Yield™ Plasmid Midiprep, Promega). As concentrações de plasmideo finais foram de 2 mg/mL no tampão TE.

A expressão in vivo transiente do polipeptideo codificado pelo plasmideo pMEB039 foi confirmada e observada depois da transfecção de células CH0-K1, usando Lipofectamin 2000 (INVITROGEN). As células CHO-Kl em 90% de confluência em placas de 6 cm de diâmetro foram transf ectadas com 5 μg de plasmideo e 10 μΙ. de lipofectamina cada, de acordo com as instruções do fabricante. Depois da transfecção, as células foram cultivadas em meio MEM-glutamax contendo 1% de soro de bezerro fetal por 24 horas. As células crescendo em capas de vidro foram lavadas com PBS, incubadas por 10 min em acetona gelada para fixação e permeabilização adicionais e novamente lavadas em PBS. A produção de proteína recombinante foi analisada por imunofluorescência indireta usando um soro policlonal BMP7 anti-humano e anticorpos monoclonais (MAB3542, BAM354 e AF354 de R&D Systems, e SC- 9305 e SC-6899 de Santa Cruz). 0 método imunoquímico confirmou que o polipeptideo pré-pró-BMP-7 codificado por pMEB039 foi expresso nas células CHO-Kl.

Exemplo 5: Efeito terapêutico da terapia gênica

baseada em plasmideo BMP-7 depois da distribuição de plasmideo renal intravenosa

Dez ratos Sprague-Dawley machos pesando

aproximadamente de 300 a 350 g no inicio do estudo foram comprados de IFFACREDO (L'Arbresle, França). 0 máximo e mínimo tanto da temperatura quanto da higrometria da sala foram registrados diariamente. A temperatura alvo e a faixa de higrometria foram de 20 a 24 0C e de 20 a 70%, respectivamente. Luz foi fornecida usando um temporizador automático em ciclos de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Somente ratos saudáveis foram incluídos no estudo. Os ratos foram alocados aleatoriamente em 4 grupos de 5 animais cada (Grupos de 1 a 4) e tratados conforme descrito na Tabela 4.

Tabela 4: Design de estudo

Grupos Plasmi Dose Data da Data de Data de Termina de o (πΛ/μς) cirur inj eção injeção ção gia* do de glice bupre rol norfina 1 gWIZ- 1/200 D-3 DO DO, Dl, D4 S ΕΑΡ® D2 2 pMEB038 1/200 D-3 DO DO, Dl, D4 D2 *Dados da injeção renal intravenosa

0 plasmídeo gWIZ-SEAP® expressando o SEAP transgênico de controle foi comprado da GTS Inc. (São Diego, EUA) e usado como placebo. O plasmídeo pMEB038 foi construído de acordo com o Exemplo 3.

Os ratos foram anestesiados por uma mistura de isoflurano (AERANE®, França, 0 a 5%) e inalação de oxigênio. Antes da cirurgia, uma injeção subcutânea de buprenorfina (TEMFESIC®, Pfizer, França, 0,1 mg/Kg) foi administrada para analgesia.

A pele na área cirúrgica foi lavada com iodeto de povidona. Uma laparotomia mediai foi efetuada. Os órgãos abdominais foram cuidadosamente movidos para o lado direito. A veia renal esquerda foi obstruída com grampos bulldog Diethrich tipo ongled. A veia adrenal não foi oclusa. Usando um catéter intravenoso SURFLO® de escala 24, 1 mL da composição apropriada (ver Tabela 4) foi rapidamente injetado na veia renal esquerda (a duração total da injeção deve ser menor do que 2 segundos). 0 fluxo de sangue foi restabelecido imediatamente após a injeção. Para evitar a possibilidade de estreitamento do diâmetro interno da veia renal, não houve tração no rim conforme a agulha é inserida. A homeostase foi efetuada pela aplicação de uma leve pressão no sítio injetado por 10 segundos. A parede abdominal e a pele foram suturadas em camadas com suturas degradáveis. Um curativo foi aplicado à ferida e os animais foram monitorados de perto até estarem completamente recuperados da anestesia.

Os animais receberam uma injeção de glicerol (50%) em

uma dose de 7 mL/Kg através da via intramuscular. 0 volume total de glicerol foi distribuído em ambos os músculos firmados. Uma injeção subcutânea de buprenorfina foi administrada em Dl e D2. Em D4, os animais de todos os grupos foram pesados e

anestesiados por injeção intramuscular de tiletamina- zolazepam (ZOLETIL® 100 - 20 a 50 mg/Kg, Vibrac, França). Amostras de sangue foram efetuadas e usadas para a dosagem de creatinina no soro (Laboratoire VETFRANCE, Evry, França) e coleta de plaAML. 0 plaAML foi preparado o mais rapidamente possível e imediatamente armazenado a -20 °C. Os animais foram a seguir eutanasiados por injeção intravenosa de fenobarbital (DOLETHAL®, Vetoquinol, França). Os rins foram coletados e examinados macroscopicamente.

A Figura 7 fornece histogramas das variações do peso corporal relativo médio dos animais de cada grupo entre DO e D4, expresso em porcentagem. A proteção parcial contra a perda de peso corporal foi conseguida em ratos tratados com o plasmideo ΒΜΡ7 pela técnica de injeção na veia intrarrenal hemodinâmica por retrogressão.

A Figura 7 fornece histogramas da creatinemia média dos animais de cada grupo em D4, expresso em miligramas por decilitro. A proteção parcial contra o aumento de creatinemia é conseguida em ratos tratados com o plasmideo BMP7 pela técnica de injeção na veia intrarrenal hemodinâmica por retrogressão.

Esses dados claramente demonstram o efeito clinico da terapia gênica baseada no plasmideo BMP-7 administrado usando uma técnica de injeção na veia intrarrenal hemodinâmica por retrogressão em um modelo relevante de patologia renal.

A invenção é ainda descrita pelos seguintes parágrafos numerados:

1. Um método de tratamento de um indivíduo mamífero sofrendo de, ou em risco de desenvolver insuficiência renal, compreendendo a administração ao referido indivíduo mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um

plasmideo contendo uma seqüência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o polipeptídeo BMP-7 é expresso in vivo no indivíduo mamífero.

2. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero é selecionado do grupo consistindo de humano, animal canino e animal felino.

3. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero é um cachorro, uma cadela ou um filhote

de cachorro.

4. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero é um gato ou um filhote de gato.

5. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero está sofrendo de, ou está em risco de

desenvolver insuficiência renal aguda.

6. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que os indivíduos mamíferos estão sofrendo de, ou estão em risco de desenvolver insuficiência renal crônica.

7. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o

polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um

polipeptídeo pré-pró-BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 e um polipeptídeo BMP-7 maduro.

8. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um

polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, um polipeptídeo pró-BMP- 7 canino e um polipeptídeo BMP-7 maduro canino, um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 felino, um polipeptídeo pró-BMP- 7 felino, um polipeptídeo BMP-7 maduro felino, um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 humano, um polipeptídeo pró-BMP- 7 humano e um polipeptideo BMP-7 maduro humano.

9. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptideo BMP-7 é selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1,

SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e de fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam polipeptideos com atividade BMP-7.

10. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o polipeptideo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos

selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7.

11. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o polipeptideo BMP-7 compreende um peptideo de sinal.

12. O método, de acordo com o parágrafo 11, em que o peptideo de sinal é selecionado do grupo consistindo da seqüência de sinal BMP-7, da seqüência de sinal IGF-I e da seqüência de sinal tPA.

13. O método, de acordo com o parágrafo 11, em que o

peptideo de sinal é codificado por uma seqüência de nucleotideo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11, e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptideos com atividade de peptideo de sinal.

14. O método, de acordo com o parágrafo 11, em que o peptideo de sinal tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID

NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptideo de sinal.

15. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o promotor é selecionado do gruo consistindo de um promotor

CMV IE, um promotor RSV, um promotor HSV-I TK, um promotor inicial SV40, um promotor tardio SV40, um promotor tardio principal de adenovirus, um promotor do gene da fosfoglicerato quinase, um promotor do gene da metalotienina e um promotor do gene da a-1 antitripsina, um promotor do gene da albumina, um promotor do gene da colagenase, um promotor do gene da elastase I, um promotor do gene da β-actina, um promotor do gene da β-globulina, um promotor do gene da γ-globulina, um promotor do gene da a- fetoproteína e um promotor do gene da creatina quinase muscular.

16. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o plasmideo é pNB292 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 10. 17. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o plasmídeo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 16.

18. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotideos da

SEQ ID NO: 20.

19. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que o plasmídeo compreende a seqüência de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo BMP-7 inserido no plasmídeo

VR1012.

20. Um método de tratamento de um canino sofrendo de, ou em risco de desenvolver insuficiência renal, compreendendo a administração ao referido canino de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmídeo contendo

uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor.

21. Um método de tratamento de um felino sofrendo de, ou em risco de desenvolver insuficiência renal, compreendendo a administração ao referido felino de uma

quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmídeo contendo uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor.

22. Um método de tratamento de um humano sofrendo de, ou em risco de desenvolver insuficiência renal, compreendendo a administração ao referido humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmideo contendo uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptideo BMP-7 operativamente ligado a um promotor. 23. O método, de acordo com qualquer um dos parágrafos

a 22, em que o polipeptideo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um polipeptideo pré-pró-BMP-7, um polipeptideo pró-BMP-7 e um polipeptideo BMP-7.

24. O método, de acordo com o parágrafo 20, em que a seqüência de ácidos nucleicos codificando o polipeptideo

BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam os polipeptideos com atividade BMP-7.

25. O método, de acordo com o parágrafo 20, em que o polipeptideo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos

selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 3 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7.

26. O método, de acordo com o parágrafo 21, em que a seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptideo BMP-

7 é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam os polipeptideos com atividade BMP-7.

27. 0 método, de acordo com o parágrafo 21, em que o polipeptideo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7.

28. O método, de acordo com o parágrafo 22, em que a

seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptideo BMP- 7 é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam polipeptideos com atividade BMP-7.

29. O método, de acordo com o parágrafo 22, em que o

polipeptideo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do gruo consistindo de SEQ ID NO: 15 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7.

30. O método, de acordo com o parágrafo 23, em que o

polipeptideo BMP-7 compreende um peptideo de sinal.

31. O método, de acordo com o parágrafo 30, em que o peptideo de sinal é selecionado do grupo consistindo da seqüência de sinal de BMP-7, a seqüência de sinal IGF-I e a

seqüência de sinal tPA.

32. O método, de acordo com o parágrafo 30, em que o peptideo de sinal é codificado por uma seqüência de nucleotideos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptideos com atividade de peptideo de sinal.

33. O método, de acordo com o parágrafo 30, em que o peptideo de sinal tem uma seqüência de aminoácidos

selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptideo de sinal.

34. O método, de acordo com o parágrafo 20, em que o promotor é selecionado do grupo consistindo de um promotor

CMV IE, um promotor RSV, um promotor HSV-I TK, um promotor inicial SV40, um promotor tardio SV40, um promotor tardio principal de adenovirus, um promotor do gene da fosfoglicerato quinase, um promotor do gene da metalotioneina, um promotor do gene da a-1 antitripsina, um promotor do gene da albumina, um promotor do gene da β- globulina, um promotor do gene da γ-globulina, um promotor do gene da α-fetoproteina e um promotor do gene da creatina quinase muscular. 35. 0 método, de acordo com o parágrafo 20, em que o

plasmideo é pNB292 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 10.

36. 0 método, de acordo com o parágrafo 20, em que o plasmídeo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 16.

37. 0 método, de acordo com o parágrafo 20, em que o plasmídeo é Pmeb039 e tem a seqüência de nucleotídeos da

SEQ ID NO: 20.

38. O método, de acordo com o parágrafo 20, em que o plasmídeo compreende a seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptídeo BMP-7 inserido no plasmídeo VR1012.

39. Um método de prevenção do desenvolvimento de

insuficiência renal em um indivíduo mamífero em risco disso, compreendendo a administração ao referido indivíduo mamífero de uma quantidade eficaz de um vetor de plasmídeo contendo uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor.

40. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o indivíduo mamífero está em risco de desenvolver de insuficiência renal aguda.

41. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o indivíduo mamífero está em risco de desenvolver

insuficiência renal crônica.

42. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 e um polipeptídeo BMP-7 maduro.

43. 0 método, de acordo com o parágrafo 39, em que a seqüência do ácido nucleico codificando o polipeptídeo BMP- 7 é selecionado do gruo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID

NO: -2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam os polipeptídeos com atividade BMP-7.

44. 0 método, de acordo com o parágrafo 39, em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos

selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 e fragmentos, vairantes, derivados e homólogos seus co atividade BMP-7.

45. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o polipeptídeo BMP-7 compreende um peptídeo de sinal.

46. 0 método, de acordo com o parágrafo 39, em que o

peptídeo de sinal consistindo da seqüência de sinal BMP-7, a seqüência de sinal IGF-I e a seqüência de sinal tPA.

47. O método, de acordo com o parágrafo 4 6, em que o peptídeo de sinal é codificado por uma seqüência de

nucleotídeos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptídeos com atividade de peptídeo de sinal.

48. O método, de acordo com o parágrafo 46, em que o peptídeo de sinal tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptideo de sinal.

49. 0 método, de acordo com o parágrafo 39, em que o promotor é selecionado do grupo consistindo de um promotor CMV IE, um promotor RSV, um promotor HSV-I TK, um promotor inicial SV4 0, um promotor tardio SV4 0, um promotor tardio

principal de adenovirus, um promotor do gene da fosfoglicerato quinase, um promotor do gene da metalotienina e um promotor do gene da a-1 antitripsina, um promotor do gene da albumina, um promotor do gene da colagenase, um promotor do gene da elastase I, um promotor do gene da β-actina, um promotor do gene da β-globulina, um promotor do gene da γ-globulina, um promotor do gene da a- fetoproteína e um promotor do gene da creatina quinase muscular.

50. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o plasmideo é pNB292 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ

ID NO: 10.

51. 0 método, de acordo com o parágrafo 39, em que o plasmideo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 16.

52. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o plasmideo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO: 20.

53. O método, de acordo com o parágrafo 39, em que o

plasmideo compreende a seqüência de ácidos nucleicos codificando o polipeptideo BMP-7 inserido no plasmideo VR1012.

54. Um vetor de plasmideo recombinante compreendendo

uma seqüência de ácidos nucleicos codificando um

polipeptideo BMP-7 operativamente ligado a um promotor.

55. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o polipeptideo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um polipeptideo pré-pró-BMP-7, um

polipeptideo pró-BMP-7 e um polipeptideo BMP-7 maduro.

56. 0 vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que a seqüência de ácido nucleico codificando o polipeptideo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13,

SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e fragmentos, variantes, derivados e análogos seus que codificam polipeptideos com atividade BMP-7.

57. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o polipeptideo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7.

58. 0 vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o polipeptideo BMP-7 compreende um

peptideo de sinal.

59. 0 vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 58, em que o peptideo de sinal é selecionado do grupo consistindo da seqüência de sinal BMP-7, da seqüência

de sinal IGF-I e da seqüência de sinal tPA.

60. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 58, em que o peptideo de sinal é codificado por uma seqüência de nucleotideos selecionada do gruo consistindo da SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8,

SEQ ID NO: 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam os peptideos com atividade de peptideo de sinal.

61. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 58, em que o peptideo de sinal tem uma seqüência

de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptideo de sinal.

62. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o promotor é selecionado do grupo consistindo de um promotor CMV IE, um promotor RSV, um promotor HSV-I TK, um promotor inicial SV40, um promotor tardio SV40, um promotor tardio principal de adenovírus, um promotor do gene da fosfoglicerato quinase, um promotor do gene da metalotienina e um promotor do gene da a-1 antitripsina, um promotor do gene da albumina, um promotor do gene da colagenase, um promotor do gene da elastase I, um promotor do gene da β-actina, um promotor do gene da β- globulina, um promotor do gene da γ-globulina, um promotor do gene da α-fetoproteina e um promotor do gene da creatina quinase muscular.

63. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o plasmideo é pNB292 e tem a seqüência

de nucleotideos da SEQ ID NO: 10.

64. 0 vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o plasmideo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 16.

65. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o plasmideo é pMEB039 e tem a

seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 20.

66. O vetor de plasmideo recombinante, de acordo com o parágrafo 54, em que o plasmideo compreende a seqüência de ácidos nucleicos codificando o polipeptideo BMP-7 inserido no plasmideo VR1012.

67. Uma composição farmacêutica compreendendo um vetor de plasmideo recombinante de acordo com qualquer um dos

parágrafos 54 a 66, e pelo menos um carreador, excipiente ou veiculo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

68. Um método de tratamento de um indivíduo mamífero sofrendo de, ou em risco de desenvolver insuficiência renal, compreendendo a administração ao referido indivíduo

humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmideo contendo uma seqüência de ácido nucleico codificando um polipeptideo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o plasmideo é intrarrenalmente ou intravenosamente administrado no rim do referido indivíduo

mamífero e em que o polipeptideo BMP-7 é expresso in vivo no indivíduo mamífero.

69. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero é selecionado a partir do grupo consistindo de humano, animal canino e animal felino.

70. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o

indivíduo mamífero é um cachorro, uma cadela ou um filhote de cachorro.

71. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero é um gato ou um filho te de gato. 72. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero está sofrendo de, ou está em risco de desenvolver insuficiência renal aguda.

73. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que os indivíduos mamíferos estão sofrendo de ou estão em risco de

desenvolver insuficiência renal crônica.

74. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo pré-pró-BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 e um

polipetídeo BMP-7 maduro.

75. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, um polipeptídeo pró-BMP- 7 canino, um polipeptídeo BMP-7 maduro canino, um

polipeptídeo pré-pró-BMP-7 felino, um polipeptídeo pró-BMP- 7 felino, um polipeptídeo BMP-7 maduro felino, um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 humano, um polipeptídeo pró-BMP- 7 humano e um polipeptídeo BMP-7 maduro humano.

76. 0 método, de acordo com o parágrafo 1, em que a

seqüência de ácidos nucleicos codificando o polipeptídeo

BMP-7 é selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam os polipeptídeos com atividade ΒΜΡ-7.

77. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 3, SEQ ID

NO: 15, SEQ ID NO: 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7.

78. 0 método, de acordo com o parágrafo 68, em que o polipeptideo BMP-7 compreende um peptideo de sinal.

79. 0 método, de acordo com o parágrafo 78, em que o peptideo de sinal é selecionado do grupo consistindo da

seqüência de sinal BMP-7, da seqüência de sinal IGF-I e da seqüência de sinal tPA.

80. O método, de acordo com o parágrafo 78, em que o peptideo de sinal é codificado por uma seqüência de

nucleotideo selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptideos com atividade de peptideo de sinal.

81. O método, de acordo com o parágrafo 78, em que o peptideo de sinal tem uma seqüência de aminoácidos

selecionada do grupo consistindo de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptideo de sinal. 82. O método, de acordo com o parágrafo 68, em que o promotor é selecionado do grupo consistindo de um promotor CMV IE, um promotor RSV, um promotor HSV-I TK, um promotor inicial SV40, um promotor tardio SV40, um promotor tardio

principal de adenovirus, um promotor do gene da fosfoglicerato quinase, um promotor do gene da metalotienina e um promotor do gene da a-1 antitripsina, um promotor do gene da albumina, um promotor do gene da colagenase, um promotor do gene da elastase I, um promotor do gene da β-actina, um promotor do gene da β-globulina, um promotor do gene da γ-globulina, um promotor do gene da a- fetoproteína e um promotor do gene da creatina quinase muscular.

83. 0 método, de acordo com o parágrafo 68, em que o plasmideo é pNB292 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ

ID NO: 10.

84. O método, de acordo com o parágrafo 68, em que o plasmideo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 16.

85. O método, de acordo com o parágrafo 68, em que o

plasmideo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotideos da SEQ ID NO: 20.

86. 0 método, de acordo com o parágrafo 68, em que o plasmídeo compreende a seqüência de ácidos nucleicos codificando o polipeptideo BMP-7 inserido no plasmideo VR1012.

87. 0 método de acordo com o parágrafo 68, em que a administração é uma distribuição do gene de DNA de

plasmideo à base de hemodinâmico.

88. 0 método, de acordo com o parágrafo 87, em que a distribuição é a distribuição do plasmideo nu pela injeção pela veia intra-renal.

89. O método, de acordo com o parágrafo 87 ou 88, em

que a administração é feita (i) por um cateter de balão de oclusão que é inserido na veia renal do indivíduo mamífero;

(ii) pela veia renal que é oclusa por inflação do balão;

(iii) por uma dose de cerca de 0, 0005 a 0,5 mg/Kg) do plasmídeo que é rapidamente injetada na veia renal com de

cerca de 5 até cerca de 25 mL, isto é, de cerca de 0,5 até cerca de 2,5 mL/Kg de tampão salina normal para assegurar um fluxo de cerca de 0,5 até cerca de 3 mL/s; (iv) pela oclusão pelo balão continuar durante a rápida injeção e interrompida de cerca de 10 seg até cerca de 3 min depois da injeção; (v) pela remoção da oclusão do balão.

90. O método, de acordo com o parágrafo 89, em que (iii) a dose de cerca de 0,2 mg/Kg do plasmídeo é rapidamente injetada na veia com cerca de 15 mL do tampão de salina normal.

91. O método, de acordo com o parágrafo 89, em que

(iii) o injetor elétrico é usado em um fluxo de cerca de 1 mL/s.

92. 0 método, de acordo com o parágrafo 89, em que

(iv) a oclusão do balão é continuada durante a rápida injeção e interrompida 1 min depois da injeção.

93. 0 método, de acordo com qualquer parágrafo de 87 a 92, em que o indivíduo mamífero é um animal canino. 94. O método, de acordo com o parágrafo 93, em que o

polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um polipeptídeo pré-pró-BMP-7 canino, de um polipeptídeo pró- BMP-7 canino e de um polipeptídeo BMP-7 maduro canino.

95. O método, de acordo com o parágrafo 94, em que o plasmídeo é pNB292 e tem a seqüência de nucleotídeo da SEQ

ID NO: 10.

96. 0 método, de acordo com qualquer parágrafo de 87 a 92, em que o indivíduo mamífero é um animal felino.

97. 0 método, de acordo com o parágrafo 96, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um

polipeptídeo pré-pró-BMP-7 felino, de um polipeptídeo pró- BMP-7 felino e de um polipeptídeo BMP-7 maduro felino.

98. O método, de acordo com o parágrafo 97, em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeo da SEQ ID NO: 20.

99. O método, de acordo com qualquer parágrafo de 87 a 92, em que o indivíduo mamífero é um humano.

100. O método, de acordo com o parágrafo 99, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo consistindo de um

polipeptídeo pré-pró-BMP-7 humano, de um polipeptídeo pró- BMP-7 humano e de um polipeptídeo BMP-7 maduro humano.

101. 0 método, de acordo com o parágrafo 100, em que o plasmídeo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotídeo da SEQ

ID NO: 16.

102. O método, de acordo com o parágrafo 1, em que o indivíduo mamífero é um humano.

Tendo deste modo descrito em detalhes as modalidades preferidas da presente invenção, é para ser entendido que a invenção definida pelos parágrafos acima não é para ser limitada aos detalhes particulares estabelecidos na descrição acima, uma vez que muitas variações aparentes suas são possíveis sem sair do objeto ou escopo da presente invenção.

Claims (20)

1. Vetor de plasmídeo recombinante caracterizado pelo fato de compreender uma seqüência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo compreendendo um polipeptídeo pré-pro-BMP-7 felino, um polipeptídeo pró-BMP-7 felino, um polipeptídeo BMP-7 felino maduro, um polipeptídeo pré-pro-BMP-7 humano, um polipeptídeo pro-BMP-7 humano e um polipeptídeo BMP-7 humano maduro; ou em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo BMP-7 é selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 13, Seqüência identificadora n°14, Seqüência identificadora n° 17, Seqüência identificadora n° 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptídeos com atividade BMP-7; ou em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 15, Seqüência identificadora n° 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7; ou em que o polipeptídeo BMP-7 compreende um peptídeo sinalizador selecionado do grupo compreendendo a seqüência sinalizadora do BMP-7, a seqüência sinalizadora do IGF-I e a seqüência sinalizadora da tPA; ou em que o peptídeo sinalizador é codificado por uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 4, Seqüência identificadora n° 6, Seqüência identificadora n° 8, Seqüência identificadora n° 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptídeos com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o peptídeo sinalizador tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 5, Seqüência identificadora n° 7, Seqüência identificadora n° 9, Seqüência identificadora n°12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o plasmídeo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 16, ou em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 20.

2. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender um vetor de plasmídeo recombinante de acordo com a reivindicação 1 e, opcionalmente, pelo menos um carreador, excipiente ou veículo farmaceuticamente ou veterinariamente aceitável.

3. Método de tratamento de um indivíduo humano sofrendo ou em risco de desenvolver insuficiência renal caracterizado pelo fato de compreender a administração ao referido indivíduo humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmídeo contendo uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora 10 n° 15, Seqüência identificadora n° 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptídeos co atividade de peptídeo sinalizador.

4. Método de prevenção do desenvolvimento de insuficiência renal em um indivíduo mamífero em risco disso caracterizado pelo fato de compreender a administração ao referido indivíduo mamífero de uma quantidade eficaz de um vetor de plasmídeo contendo ma seqüência de ácido nucléico codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 13, Seqüência identificadora n° 14, Seqüência identificadora n° 17, Seqüência identificadora n° 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam polipeptídeos com atividade BMP-7.

5. Método de tratamento de um indivíduo mamífero sofrendo ou em risco de desenvolver insuficiência renal caracterizado pelo fato de compreender a administração a um indivíduo mamífero de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmídeo contendo uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o plasmídeo é administrado intrarrenalmente, intramuscularmente ou intravascularmente no rim do referido indivíduo mamífero; ou em que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo compreendendo um polipeptídeo pré-pró-BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 e um polipeptídeo BMP-7; ou em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 3, Seqüência identificadora n° 15, Seqüência identificadora n° 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7; ou em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo BMP-7 é selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 1, Seqüência identificadora n° 2, Seqüência identificadora n° 13, Seqüência identificadora n° 14, Seqüência identificadora n° 17, Seqüência identificadora n° 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam polipeptídeos com atividade BMP-7; ou em que o polipeptídeo BMP-7 compreende um peptídeo sinalizador, em que o peptídeo sinalizador é selecionado do grupo compreendendo a seqüência sinalizadora BMP-7, a seqüência sinalizadora IGF-I e a seqüência sinalizadora tPA; ou em que o peptídeo sinalizador tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 5, Seqüência identificadora n° 7, Seqüência identificadora n° 9, Seqüência identificadora n° 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o peptídeo sinalizador é codificado por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 4, Seqüência identificadora n° 6, Seqüência identificadora n° 8, Seqüência identificadora n° 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptídeos com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o plasmídeo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 16, ou em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 20; ou em que o plasmídeo é pNB292 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 10.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo BMP-7 é expresso in vivo no indivíduo mamífero.

7. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é selecionado do grupo compreendendo caninos, humanos e felinos.

8. Método de prevenção do desenvolvimento de insuficiência renal em um indivíduo mamífero em risco disso caracterizado pelo fato de compreender a administração ao referido indivíduo mamífero de uma quantidade eficaz de um vetor de plasmídeo contendo uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipetídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o plasmídeo é administrado intrarrenalmente, intramuscularmente ou intravascularmente no rim do referido indivíduo humano.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo compreendendo um polipeptídeo pré-pró BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 e um polipeptídeo BMP-7 maduro; ou em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 3, Seqüência identificadora n° 15, Seqüência identificadora n° 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7; ou em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo BMP-7 é selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 1, Seqüência identificadora n° 2, Seqüência identificadora n° 13, Seqüência identificadora n° 14, Seqüência identificadora n° 17, Seqüência identificadora n° 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam polipeptídeos co atividade BMP-7; ou em que o polipeptídeo BMP-7 compreende um peptídeo sinalizador em que o peptídeo sinalizador é selecionado do grupo compreendendo a seqüência sinalizadora BMP-7, a seqüência sinalizadora IGF-I e a seqüência sinalizadora tPA; ou em que o peptídeo sinalizador é codificado por uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 4, Seqüência identificadora n° 6, Seqüência identificadora n° 8, Seqüência identificadora n° 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam os peptídeos com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o peptídeo sinalizador tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 5, Seqüência identificadora n° 7, Seqüência identificadora n° 9, Seqüência identificadora n° 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o plasmídeo é pMEB038 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 16, ou em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 20; ou em que o plasmídeo é pNB2 92 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 10.

10. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é selecionado do grupo compreendendo caninos, humanos e felinos.

11. Método de tratamento de um indivíduo mamífero sofrendo ou em risco de desenvolver insuficiência renal caracterizado pelo fato de compreender a administração ao referido indivíduo humano de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um plasmídeo contendo uma seqüência de ácidos nucléicos codificando um polipeptídeo BMP-7 operativamente ligado a um promotor, em que o plasmídeo é administrado intrarrenalmente ou intravascularmente no rim do referido indivíduo humano e em que o polipeptídeo BMP-7 é expresso in vivo no indivíduo mamífero.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo compreendendo um polipeptídeo pré-pró BMP-7, um polipeptídeo pró-BMP-7 e um polipeptídeo BMP-7 maduro; ou em que o polipeptídeo BMP-7 tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 3, Seqüência identificadora n° 15, Seqüência identificadora n° 19 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade BMP-7; ou em que a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo BMP-7 é selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 1, Seqüência identificadora n° 2, Seqüência identificadora n° 13, Seqüência identificadora n° 14, Seqüência identificadora n° 17, Seqüência identificadora n° 18 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam polipeptídeos com atividade BMP-7; ou em que o polipeptídeo BMP-7 compreende um peptídeo sinalizador em que o peptídeo sinalizador é selecionado do grupo compreendendo a seqüência sinalizadora BMP-7, a seqüência sinalizadora IGF-I e a seqüência sinalizadora tPA; ou em que o peptídeo sinalizador é codificado por uma seqüência de nucleotídeos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 4, Seqüência identificadora n° 6, Seqüência identificadora n° 8, Seqüência identificadora n° 11 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus que codificam peptídeos com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o peptídeo sinalizador tem uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo compreendendo Seqüência identificadora n° 5, Seqüência identificadora n° 7, Seqüência identificadora n° 9, Seqüência identificadora n° 12 e fragmentos, variantes, derivados e homólogos seus com atividade de peptídeo sinalizador; ou em que o plasmídeo é pMEB038 e em a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 16; ou em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 20; ou em que o plasmídeo é pNB2 92 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 10; ou em que o indivíduo mamífero é selecionado do grupo compreendendo caninos, humanos e felinos; ou em que o plasmídeo compreende a seqüência de ácidos nucléicos codificando o polipeptídeo BMP-7 inserido no plasmídeo VR1012.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a administração é uma distribuição de gene de DNA de plasmídeo baseada na hemodinâmica; ou em que a distribuição é de plasmideos nus através de injeção pela veia intra-real.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a administração é feita (i) um cateter de balão de oclusão é inserido na veia renal do indivíduo mamífero; (ii) a veia renal é fechada pela inflação do balão; (iii) uma dose de cerca de 0,0005 a 0,5 mg/Kg) do plasmídeo é rapidamente injetada na veia renal com de cerca de 5 até cerca de 25 mL, isto é, de cerca de 0,5 até cerca de 2,5 mL/Kg de tampão salina normal para assegurar um fluxo de cerca de 0,5 até cerca de 3 mL/s; (iv) o balão de oclusão continua durante a rápida injeção e é interrompido de cerca de 10 s até cerca de 3 min depois da injeção; (v) o balão de oclusão é removido; ou em que (iii) a dose é de cerca de 0,2 mg/Kg do plasmídeo e é rapidamente injetada na veia com cerca de 15 mL de tampão salina normal; ou em que (iii) um injetor (power injector) é usado em um fluxo de cerca de 1 mL/s; ou em que (iv) o balão de oclusão continua durante a rápida injeção e é interrompido 1 min depois da injeção.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é um animal canino.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo BMP-7 é selecionado do grupo compreendendo um polipeptídeo pré-pró BMP-7 canino, um polipeptídeo pró-BMP-7 canino ou um polipeptídeo BMP-7 maduro canino.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o plasmídeo é pNB2 92 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 10.

18. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo humano é um animal felino.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polipetídeo BMP-7 é selecionado do grupo compreendendo um polipeptídeo pré-pró BMP-7 felino, um polipeptídeo pró-BMP-7 felino ou um polipeptídeo BMP-7 maduro felino; ou em que o plasmídeo é pMEB039 e tem a seqüência de nucleotídeos da Seqüência identificadora n° 20.

20. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo mamífero é um humano.