BRPI0718225A2 - Antagonistas de ccr2 para tratamento de fibrose - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTAGONIS- TAS DE CCR2 PARA TRATAMENTO DE FIBROSE".

Campo da Invenção

A invenção refere-se a métodos de uso e a antagonista de ligação de CCL2 a CCR2, tal como um anticorpo anti-CCL2, para a prevenção e controle de fibrose pulmonar, particularmente pneumonia intersticial usual.

Descrição da Técnica Relacionada

A pneumonia intersticial usual (UIP) é uma doença de pulmão 10 intersticial de debilitação crônica que é caracterizada e rotineiramente diagnosticada pela presença de alveolação dentro do pulmão. A alveolação ocorre por causa de um aumento na deposição de colágeno, portanto reduzindo a elasticidade dentro do pulmão, e causando retração e, por último, colapso da estrutura alveolar normal. A extensão de alveolação e 15 fibrose é muito heterogênea dentro do pulmão, onde áreas densas de excesso de colágeno frequentemente unem o parênquima de pulmão normal ou tecido intersticial rico em infiltrado monocítico. Muitos pacientes têm doença clínica moderada a avançada na hora do diagnóstico, e deterioram apesar do tratamento.

A família CXC quimocina é uma família pleiotrópica de

citoquinas que são envolvidas na promoção de tráfego de vários leucócitos, na regulação de angiogênese, e remodelagem vascular, e na promoção de mobilização e tráfego de células progenitoras mesenquimais, tais como fibrócitos que são células progenitoras mesenquimais de circulação (também

conhecidas como fibrócitos) na fibrose pulmonar.

Dentro do pulmão normal, uma grande reunião de fibroblastos residentes geram continuamente e quebram colágeno, permitindo, desse modo, que o pulmão remodele em seguida a infecção, inflamação ou outra patofisiologia, e após dano. Os fibroblastos geram colágeno em resposta a 30 vários fatores de crescimento, tais como TGFbI. Além disso, TGFbI induz diferenciação de fibroblasto em miofibroblastos, que são comumente encontrados no tecido de pulmão de UIP. Os miofibroblastos são células diferenciadas capazes de gerar colágeno, bem como tendo actina de músculo alfa-liso e, portanto, propriedades contráteis. Os miofibroblastos podem, portanto, contribuir potencialmente para colapso alveolar. No curso normal de cura de ferimento, os fibroblastos geram colágeno e fatores de 5 crescimento para direcionar o fechamento do ferimento. Uma vez que a arquitetura do tecido é restaurada, a geração de colágeno de fibroblasto diminui, e as células vão através de apoptose, impedindo, desse modo, excesso de formação de escoriação. Aqui é pronunciada a proliferação de fibroblasto encontrada nos pulmões de pacientes de UIP. Portanto, os

fibroblastos de UIP persistem nos locais de fibrose, adicionando-se continuamente a deposição de colágeno excessivo aberrante. Os pacientes de UIP estão entre recipientes comuns de transplantes de pulmão e, nestes pacientes, o transplante pode eventualmente se tornar fibrótico.

Trabalho prévio tem mostrado diferenças fenotípicas em

fibroblastos isolados de locais de fibrose comparados a fibroblastos isolados de tecido não-fibrótico. Por exemplo, fibroblastos isolados dos pulmões de pacientes de UIP têm expressão aumentada de subunidades de receptor de IL-13. CCR2 é expresso nos fibrócitos do pulmão, e CCR2 regula ambos recrutamento e ativação destas células após dano respiratório. A inibição de 20 sinalização de CCR2 in vivo através de, ou camundongos de eliminação de receptor, ou neutralização de ligante, resulta em menos deposição de colágeno em modelos de animal múltiplos de fibrose. CCL2 (CC-quimocina ligante 2, Proteína 1 Quimioatraente de Monócito 1, MCP1) se liga a CCR2. CCR2 é predominantemente expresso nos monócitos, células epiteliais e

células endoteliais. Níveis aumentados de MCP1 foram descritos em pacientes com UIP. Ligantes para o receptor de CCR2 no camundongo incluem CCL2 (também conhecidos como JE, ou proteína quimioatraente de monócito [MCP]-1), CCL7 (MCP-3) e CCL12 (MCP-5); desse modo, suposições baseadas em dados de modelo de murina não podem refletir 30 precisamente o ambiente pulmonar humano com relação à quimocina e distribuições de receptor de quimocina.

A proteína 1 quimioatraente de monócito (MCP-1, CCL2, ligante para CCR2, GenBank NP_002973), em proteína de 8,6 kDa contendo 76 resíduos de aminoácido, é um membro da família quimocina-beta (ou C-C) de citoquinas. MCP-1 é expressa por uma variedade de tipos de célula incluindo monócitos, células endoteliais vasculares, células de músculo liso, célula mesanglial glomerular, células osteoblásticas, e células epiteliais similares a tipo 2 pulmonares humanas. Acredita-se que MCP-1 desempenha um papel ativo na iniciação e progressão de doenças inflamatórias, pela promoção de influxo de monócito e ativação subsequente nos tecidos. MCP-1 é quimiotático para monócitos, mas não para neutrófilos. Ela pode induzir a proliferação e inativação de células matadoras conhecidas como CHAK (CC- matadora ativada por quimocina), que são similares a células ativadas por IL-2. Elas regulam a expressão de antígenos de superfície de célula (CD11c, CD11b), e a expressão de citoquinas IL1 e IL6. MCP-1 é um ativador potente de basófilos humanos, induzindo a desgranulação e a liberação de histaminas.

Desse modo, existe uma necessidade na técnica médica de métodos para monitorar e controlar pacientes que mostram as indicações da patofisiologia que conduz a insuficiência pulmonar conhecida como UIP, e seja capaz de evitar a necessidade de transplante de pulmão e, no mínimo, 20 aumentar a segurança e sobrevivência na utilização de alo-enxerto, e para compreender e remediar as ações patológicas de MCP-1 nestes.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção proporciona um método de prevenir, diminuir ou reverter fibrose no indivíduo, compreendendo contactar ou administrar uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de pelo menos um antagonista de CCR2 isolado que previne as funções biológicas ou bioatividade associadas com CCR2, suas isoformas ou variantes, incluindo CCR2A ou CCR2B, em células que mostram o receptor conforme definido aqui, ou antagonistas que se ligam a MCP-1/CCL2 ou CCR2, ou que previnem a ligação de CCR2 com seu(s) ligante(s) cognato(s) e, desse modo, inibem as funções biológicas de CCR2 na célula, tecido, órgão do indivíduo mamífero. Em um aspecto do método da invenção, o indivíduo é um paciente tendo uma patologia intersticial e fibrose alveolar relacionadas à pneumonia idiopática intersticial, mais especificamente, o paciente é diagnosticado com pneumonia intersticial usual.

O método da invenção pode ser praticado com um antagonista 5 de CCR2 que previne as funções biológicas ou bioatividade associadas com CCR2, suas isoformas ou variantes, incluindo CCR2A ou CCR2B, em células que mostram o receptor conforme aqui definido. Em um aspecto da invenção, os antagonistas de CCR2 incluem anticorpos, peptídeos de seqüência sintética ou nativa, e antagonistas de molécula pequena, que se 10 ligam a MCP-1/CCL2 ou CCR2, ou que previnem a ligação de CCR2 com seu(s) ligante(s) cognato(s) e, desse modo, inibem funções biológicas de CCR2.

Também provido é um método para diagnose de uma patologia intersticial relacionada à MCP-1 e fibrose alveolar relacionada à pneumonia intersticial idiopática em uma célula, tecido, órgão ou animal.

Em uma concretização, a porção de ligação de Iigantes do anticorpo compreende SEQ ID NO: 27 e 28. Em um aspecto, a presente invenção proporciona pelo menos um anticorpo anti-MCP-1 de mamífero isolado, compreendendo pelo menos uma região variável compreendendo SEQ ID NO: 27 ou 28.

Em outro aspecto, a presente invenção proporciona pelo menos um anticorpo anti-MCP-1 de mamífero isolado, compreendendo ou (i) todas as seqüências de aminoácido de regiões de determinação complementar (CDR) de cadeia pesada de SEQ ID NOS: 6, 7 e 9; ou (ii) todas as 25 seqüências de aminoácido de CDR de cadeia leve de SEQ ID NOS: 13, 14, e 16.

A presente invenção adicionalmente proporciona pelo menos um método ou composição de anticorpo anti-MCP-1 anticorpo, para administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz para modular ou tratar pelo menos 30 uma condição relacionada à MCP-1 em uma célula, tecido, órgão, animal ou paciente e/ou, antes de, subsequente a, ou durante uma condição relacionada, conforme conhecido na técnica e/ou conforme aqui descrito. Em outro aspecto, a presente invenção proporciona pelo menos um anticorpo anti-MCP-1 de mamífero isolado, compreendendo ou (i) todas as seqüências de aminoácido de regiões de determinação complementar (CDR) de cadeia pesada de SEQ ID NOS: 6, 7 e 8 ou 9; ou (ii) todas as seqüências de aminoácido de CDR de cadeia leve de SEQ ID NOS: 13, 14 e 15 ou 16.

A presente invenção também proporciona pelo menos uma composição, dispositivo e/ou método de distribuição de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-MCP-1, de acordo com a presente invenção.

A presente invenção adicionalmente proporciona qualquer

invenção aqui descrita.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1 mostra um gráfico de coluna onde cada coluna representa o aumento de vezes na expressão de um gene associado com fibrose em fibroblastos de UIP em comparação a fibroblastos isolados de tecido de pulmão não-fibrótico (normalizados a um valor de 1): aSMA: PCOL1; PCOL3; CTGF; TGFp-1; TGFpRI; TGFpR2; IL13Ra1; IL13Ra2.

Figura 2 é um gráfico de coluna mostrando o efeito de TGFpi, PDGF e CCL2 em uma expressão de aSMA por fibroblastos derivados de tecido de pulmão não-fibrótico e fibrótico.

Figura 3 é dois gráficos de coluna mostrando o efeito de TGFpi, PDGF e CCL2 no gene de expressão de pró-colágeno I (A) e pró-colágeno NI (B) por fibroblastos derivados de tecido de pulmão não-fibrótico e fibrótico.

Figura 4 é um gráfico de coluna mostrando o efeito de TGFpi, PDGF e CCL2 no gene de expressão de TGFbI por fibroblastos derivados de tecido de pulmão não-fibrótico e fibrótico.

Figura 5 é um gráfico de coluna mostrando o efeito de TGFpi, PDGF e CCL2 no gene de expressão de CTGF por fibroblastos derivados de tecido de pulmão não-fibrótico e fibrótico.

Figura 6 é dois gráficos de coluna mostrando o efeito de TGFpi,

PDGF e CCL2 no gene de expressão de TGFpRI(A) e TGFpRII(B) por fibroblastos derivados de tecido de pulmão não-fibrótico e fibrótico. Figura 7 é dois gráficos de coluna mostrando o efeito de TGFbI,

PDGF e CCL2 no gene de expressão de IL13Ra1 (A) e IL13Ra2 (B) por fibroblastos derivados de tecido de pulmão não-fibrótico e fibrótico.

BREVE DESCRIÇÃO DAS LISTAGENS DE SEQÜÊNCIA_

SEQ ID NO: Descricão 1 MCP-1 (CCL2) Humana e variantes usadas para selecionar Iigantes de anti-MCP-1 2 VH1A seqüência variável de cadeia pesada: FR1, CDR1, FR2, CDR2 variantes, FR3, CDR3, FR4 3 VH3 Seqüência variável de cadeia pesada: FR1, CDR1, FR2, CDR2 variantes, FR3, CDR3, FR4 4 Kappa3 seqüência variável de cadeia leve: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 variantes, FR4 Lambda3 seqüência variável de cadeia pesada: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 variantes, FR4 6 VH1A CDR1 Todo MOR03471 7 VH1A CDR2 3781, 3790, CNTO 888 8 VH1ACDR2 3899 9 VH1A CDR3 All MOR03471 VH3 CDR1 All MOR03548 11 VH3 CDR2 3744, 3747 12 VH3 CDR3 All MOR03548 13 capa3 CDR1 Todo MOR03471 14 capa3 CDR2 Todo MOR03471 capa3 CDR3 3781 16 Kappa3 CDR3 3790, CNTO888 17 Kappa3 CDR3 3899 18 Lamda3 CDR1 Todo MOR03548 19 Lamda3 CDR2 Todo MOR03548 Lamda3 CDR3 3744 21 Lamda3 CDR3 3747 22 VH1A CDR2 variantes 23 VH3 CDR2 variantes 24 Lk CDR3 variantes LA CDR3 variantes 26 HC CDR1 variantes 27 CNT0888 Região variável de cadeia pesada 28 CNTO888 Região variável de cadeia leve DESCRIÇÃO DETALHADA PA INVENÇÃO

Abreviações

Abs anticorpos, policlonal ou monoclonal; Ig imunoglobulina; Mab anticorpo monoclonal; V domínio variável de um anticorpo; C domínio 5 constante de um anticorpo; H cadeia pesada de um anticorpo; L cadeia leve de um anticorpo; HRCT tomografia computadorizada de alta definição; PDGF - AB fator de crescimento derivado de plaqueta alfa/beta; CTGF: fator de crescimento de tecido conectivo; CXC quimocina da subclasse CXC; aSMA actina de músculo alfa-liso; PCOL1 pró-colágeno I; PCOL3: pró- 10 colágeno III; TGFpi fator de crescimento beta-1; TGFpRI TGFpreceptor tipo I; TGF3R2: TGFp receptor tipo II; IL13Ra1: subunidade lnterleucina-13 receptor alfa 1; IL13Ra2: subunidade lnterleucina-13 receptor alfa 2. Definições

O termo "anticorpo" aqui é usado no sentido mais amplo. Conforme aqui usado, um "anticorpo" inclui anticorpos totais, e qualquer fragmento de ligação de antígeno, ou uma cadeia simples deste. Desse modo, o anticorpo inclui qualquer proteína ou peptídeo contendo molécula que compreende pelo menos uma porção de uma molécula de imunoglobulina, tal como, mas não limitada a, pelo menos uma região de determinação de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou cadeia leve, ou uma porção de ligação de Iigante desta, uma região variável de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região constante de cadeia pesada ou cadeia leve, uma região estrutural (FR), ou qualquer porção desta, ou pelo menos uma porção de uma proteína de ligação, que pode estar incorporada em um anticorpo da presente invenção. O termo "anticorpo" é adicionalmente pretendido para envolver anticorpos, fragmentos de digestão, porções especificadas, e variantes destas, incluindo anticorpos miméticos, ou compreendendo porções de anticorpos que imitam a estrutura e/ou função de um anticorpo ou fragmento especificado, ou porção deste, incluindo anticorpos de cadeia simples e fragmentos destes. Fragmentos 5 funcionais incluem fragmentos de ligação de antígeno para um alvo pré- selecionado. Exemplos de fragmentos de ligação envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL, VH, CL e CH;

(ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab ligados por uma fonte de dissulfeto na região de articulação;

(iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; e (vi) uma região de determinação de

complementaridade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH serem codificados por genes separados, eles podem estar unidos, usando-se métodos recombinantes, por um Iigador sintético que os capacita a serem produzidos como uma cadeia de proteína simples em que o par de regiões VL e VH forme moléculas monovalentes (conhecido 20 como cadeia simples Fv (scFv); ver, por exemplo, Bird et al. 1988 Science 242:423-426, e Huston et al. 1988 Proc. Natl. Acad Sei. USA 85:5879-5883. Tais anticorpos de cadeia simples são também pretendidos estarem envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Fragmentos de anticorpo são obtidos usando-se técnicas convencionais 25 conhecidas àqueles técnicos no assunto, e os fragmentos são classificados para utilidade na mesma maneira como são anticorpos intactos.

Por "CCR2" é significativo CCR2A (MCP-1 RA, NP_000638) humano e/ou CCR2B (MCP-1 RB, NP_000639) humano, e as proteínas tendo uma seqüência de aminoácido que é a mesma conforme aquela de 30 uma proteína de mamífero que ocorre naturalmente ou correspondente endógena CCR2 (por exemplo, proteínas recombinantes). CCR2A, isoforma A, tem término C e é 14 aminoácidos mais longa do que CCR2B, isoforma B, devido à união alternativa na região de codificação que resulta em uma alteração de estrutura e uso de um códon de parada a jusante (Charo, et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 91 (7): 2752-2756). CCR2, conforme aqui definido, inclui proteína receptora madura, variantes polimórficas ou alélicas, 5 e isoformas de um CCR2 de mamífero (por exemplo, produzido por união alternativa ou outros processes celulares), e formas modificadas ou não- modificadas do precedente (por exemplo, glicosilatadas, não-glicosilatadas). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de uma fonte que produz naturalmente CCR2 de mamífero, por exemplo.

Um "antagonista de CCR2" previne as funções biológicas ou

bioatividade associadas com CCR2A ou CCR2B em células que revelam CCR2A ou CCR2B, ou outras isoformas ou variantes conforme definido aqui. Os antagonistas incluídos dentro do escopo da presente invenção incluem anticorpos, peptídeos de seqüência nativa ou sintética, e antagonistas de 15 molécula pequena, que se ligam a MCP-1/CCL2 ou CCR2, ou que previnem a ligação de CCR2 com seu(s) ligante(s) cognato(s), e, desse modo, inibem as funções biológicas de CCR2. Desse modo, um inibidor refere-se a substâncias incluindo antagonistas que se ligam a receptor (por exemplo, um anticorpo, um mutante de um Iigante natural, moléculas orgânicas de peso 20 molecular pequeno, outros inibidores competitivos de ligação de ligante), e substâncias que inibem a função receptora sem ligação a estas (por exemplo, um anticorpo anti-idiotípico).

Por "pneumonia intersticial usual" ou "UIP" é também conhecida clinicamente e histologicamente como "fibrose pulmonar idiopática" ou "IPF", 25 e "alveolite de fibrose secriptogênica". Ela é o mais comum dos seis subtipos histológicos de pneumonia intersticial idiopática (IIP). Outras IIPs são: pneumonia intersticial não-específica (NSIP), pneumonia de organização de obliteração de bronquiolite (BOOP); doença de pulmão intersticial associada à bronquiolite (ILD); pneumonia intersticial desquamativa; e pneumonia 30 intersticial aguda (AIP).

Por "MCP-1" é significativo a seqüência de aminoácido 76 referenciada no registro NCBI N°. de Acesso NP_002973 e variavelmente conhecida como MCP (proteína quimiotática de monócito), SMC-CF (fator quimiotático de célula de músculo liso), LDCF (fator quimiotático derivado de linfócito), GDCF (fator quimiotático de monócito derivado de glioma), TDCF (fatores quimiotáticos derivados de tumor), HC11 (citoquina humana 11), 5 MCAF (fator quimiotático e de ativação de monócito). O símbolo de gene é SCYA2, o gene JE no cromossomo humano 17, e a nova designação é CCL2 (Zlotnik, Yoshie 2000. Immunity 12:121-127). JE é o homólogo de camundongo de MCP-1/CCL2 humano.

Uma molécula pequena de antagonista de MCP-1 refere-se a qualquer composto químico adequado que inibe atividade de MCP-1, e pode ser usado como um terapêutico potencial. Tais compostos são conhecidos na técnica, tais como derivados de indol, derivados de amina cíclica, derivados de ureido, heterocíclicos, anilidas, e pirróis funcionais com a capacidade de bloquear ligação de CCL2 a CCR2B, e/ou inibição de CCR1 ou próprio CCL2, conforme descrito nas Publicações PCT reveladas WO 9905279 (1999), WO 9916876 (1999), WO 9912968, WO 9934818, WO 9909178, WO 9907351, WO 9907678, WO 9940913, WO 9940914, WO 0046195, WO 0046196, WO 0046197, WO 0046198, WO 0046199, WO 9925686, WO 0069815, WO 0069432, WO 9932468, WO 9806703, WO 9904770, WO 99045791, da qual é totalmente incorporado por referência.

Conforme aqui usado, "tratamento" usado nesta invenção significa ambos tratamentos que compreendem "controle" e "reversão" dos sinais funcionais ou histológicos de rejeição crônica.

Mamíferos que podem ser tratados na presente invenção incluem animais de fazenda, tais como, vacas, cavalos, etc., animais domésticos, tais como cães, gatos, ratos, etc., e humanos, preferivelmente seres humanos.

Citações

Todas as publicações ou patentes aqui citadas são totalmente incorporadas aqui por referência, visto que elas mostram o estado da técnica no momento da presente invenção, e/ou proporcionam descrição e habilidade da presente invenção. As publicações refere-sem a quaisquer publicações científicas ou de patente, ou qualquer outra informação disponível em qualquer formato de mídia, incluindo todos os formatos registrados, eletrônicos ou impressos. As seguintes referências são totalmente incorporadas aqui por referência: Ausubel, et al., ed., Current 5 Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, NY (1987-2006; Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, NY (1989); Harlow e Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989); Colligan, et al., eds., Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., NY (1994-2006; Colligan et al., 10 Current Protocols in Protein Science, John Wiley & Sons, NY, NY, (1997- 2006).

Compostos de Pneumonia Intersticial Usual (UIP) e Fibrose Pulmonar Idiopática da Invenção

MCP-1 é conhecido por se ligar e sinalizar através do receptor quimocina CCR2. CCR2 é um receptor acoplado de proteína-G que envolve sete transmembranas expressas em muitas células, incluindo monócitos, células-T, células-B, e basófilos. Dois receptores específicos de MCP-1, CCR2A e CCR2B, foram clonados, que sinalizam em resposta a concentrações nanomolares (nM) de MCP-1. CCR2A (CC-CKR2A) e CCR2B (CC-CKR2A) representam dois cDNAs que codificam dois receptores específicos de MCP-1 com terminais carboxila alternativamente unidos. MCP-1 que se liga a ambas isoformas com MCP-1 de alta afinidade induz fluxo de cálcio em células que expressam CCR2B, mas não em células que expressam CCR2A. MCP-1 menos 5 vezes induz quimiotaxia em células que expressam CCR2B comparado a células que expressam CCR2A.

Outras proteínas com certa homologia funcional e de seqüência a MCP-1 humano são conhecidas. Especialmente similares a MCP-1 (GenBank NP_002973) são MCP-2 (GenBank NP_005614) e eotaxina (GenBank P_51671); MCP-2 tendo 61,8 por cento e eotaxina-1 tendo 63,2 30 por cento de identidade de seqüência para MCP-1. A faixa de atividades e espectro de envolvimento destas proteínas em mecanismos homeostáticos humanos e patologia não é bem compreendida pelos homólogos de MCP-1. Por exemplo, MCP-2 (redenominado CCL8) está proximamente relacionado à MCP-1 e MCP-3 (redenominado CCL7, Genbank NP_006264), e usa ambos CCR1, bem como CCR2B como seus receptores funcionais. MCP-3 se liga a um receptor designado D6. MCP-3 também se liga a CCR10 e 5 CCR1. A seqüência de proteína MCP-3 (97 aminoácidos) mostra 74 por cento de identidade com MCP-1 e 58 por cento de homologia com MCP-2. MCP-3 secretado difere de MCP-1 em sendo N-glicosilatado. MCP-4 (redenominado CCL13, Genbank NP_005399) compartilha 56-61 por cento de identidade de seqüência com as três proteínas quimiotáticas de monócito 10 conhecidas, e é 60 por cento idêntico à Eotaxina-1. As funções de MCP-4 parecem serem altamente similares àquelas de MCP-3 e Eotaxina. Semelhante a MCP-3, MCP-4 é um quimioatraente potente para monócitos e T-linfócitos. Ele é inativo em neutrófilos. Nos monócitos, MCP-4 se liga a receptores que reconhecem MCP-1, MCP-3, RANTES (CCL5), e eotaxina, 15 os receptores CCR1 e CCR3, e mostram de-sensibilização cruzada total com eotaxina-1. MCP-5 é murina CC-quimocina e mais proximamente relacionado à MCP-1 humano (66 % de identidade de aminoácido). O símbolo de gene para MCP-5 é SCYA12 (redenominado CCL12). Células transfectadas com o receptor quimocina CCR2 foram mostradas 20 responderem a MCP-5. Informação geral de citoquinas e chemokines é disponível na internet mundial e para o sistema de classificação atual, Zlotnik A., Yoshie O. 2000. Chemokines: a new classification system e their role in immunity. Immunity 12:121-127.

A discussão anterior serve para enfatizar que um antagonista pode prevenir a função biológica de ligação de CCR2, ou por ação direta no CCR2, ou um de seus ligantes, CCL2, CCL7, CCL8. Em uma concretização da invenção, o antagonista se liga a MCP-1/CCL2 e neutraliza sua capacidade de se ligar a CCR2.

Anticorpos anti-CCR2 são revelados nas US6084075, US6458353 e US6696550. Em uma concretização do método da invenção, um método de inibição da interação biológica de uma célula suportando CCR2 de mamífero com uma quimocina, compreende contactar referida célula com uma quantidade eficaz de um anticorpo ou fragmento funcional deste que se liga a CCR2, ou uma porção de referido receptor. Em uma concretização, o anticorpo é anticorpo monoclonal (mAb) LS132.1D9 (1D9), ou um anticorpo, que pode competir com 1D9 para ligação a CCR2 humano, 5 ou uma porção de CCR2 humano. Fragmentos funcionais dos anticorpos precedentes são também considerados.

Anticorpos capazes de ligar MCP-1 foram reportados: JP9067399 revela um anticorpo obtido de células de sangue isoladas, e JP05276986 revela um hibridoma que secreta um IgM anti-humano MCP-1. 10 Mais recentemente, anticorpos capazes de se ligarem a uma pluralidade de beta-chemokines, incluindo MCP-1, foram revelados (W003048083), e um anticorpo de ligação de MCP-1 que também se liga a eotaxina (US20040047860). Anticorpos que ligam seletivamente e neutralizam homólogos de camundongo de MCP-1/CCL2 humano ou MCP-1/CCL2 15 humano são revelados nos pedidos de patente co-pendentes dos Estados Unidos Nos. de Série 11/170.453 e 60/682.654, os conteúdos e ensinamentos dos quais sendo incorporados aqui por referência.

Em uma concretização da invenção, o antagonista CCR2 é o anticorpo MCP-1/CCL2 anti-humano designado C775 que pode ser 20 produzido por uma linha de célula designada C1142, conforme revelado no pedido de patente co-pendente dos Estados Unidos N°. de Série 11/170.453, variantes tais como formas humanizadas ou re-moldadas, formas truncadas, ou fragmentos de ligação destes, conforme aqui definido. Em outra concretização, o antagonista CCR2 é o anticorpo MCP-1 /CCL2 anti-humano 25 designado variantes CNT0888, formas truncadas, ou fragmentos de ligação destes, conforme aqui definido, e conforme revelado no pedido de patente co-pendente W02006125202, os conteúdos dos quais sendo aqui incorporados por referência.

Em uma concretização, o anticorpo MCP-1 compreendendo ambas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve compreende SEQ ID NOS: 27 e 28. O anticorpo pode compreender pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, referido anticorpo compreendendo toda a seqüência de aminoácido de região de determinação de complementaridade (CDR) de cadeia pesada e de cadeia leve de SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16. O anticorpo compreende pelo menos uma região variável compreendendo pelo 5 menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, referido anticorpo MCP-1 compreendendo ambas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve compreendendo SEQ ID NOS: 27 e 28. O anticorpo pode compreender pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, referido anticorpo 10 compreendendo toda a seqüência de aminoácido de região de determinação de complementaridade (CDR) de cadeia pesada e de cadeia leve de SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16. O anticorpo pode compreender pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido de pelo menos uma de SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16. O anticorpo pode 15 alternativamente compreender uma região variável de cadeia pesada ou de cadeia leve de pelo menos uma SEQ ID NO: 2-5 adicionalmente compreendendo uma região de determinação de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou cadeia leve, ou uma porção de ligação de Iigante destas selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6-26; e, 20 opcionalmente e funcionalmente associada com uma região estrutural, adicionalmente e opcionalmente compreendendo pelo menos CH1, articulação, CH2, ou CH3 de uma imunoglobulina humana.

Mutilações de MCP-1/CCL2, variantes, proteínas mutantes ou "muteínas" tendo a capacidade de ligar CCR2 e ter atividade antagonística, 25 podem também ser usados para praticar o método da invenção. Variantes de quimiocinas de formação de homodímero, tais como CCL2, tendo uma substituição de aminoácido simples na interface de dimerização que altera o modelo de ligações de hidrogênio, de modo a resultar em um monômero forçado que se liga ao receptor, e tem propriedades agonísticas in vitro, mas 30 que pode antagonizar chemokines naturais e tem atividades anti- inflamatórias in vivo, conforme ensinado no W005037305A1, estão entre as variantes úteis na prática da presente invenção. Um antagonista de peptídeo de MCP 1 é o MCP-1 (9- 76) truncado que foi mostrado ambos para prevenir começo de doença e reduzir sintomas de doença em um modelo de camundongo de artrite (Jiang-Hong Gong1 et al., J. Exp. Med. 1997, 186:131).

Modulação de Expressão de CCR2/CCL2

Um método alternado de antagonizar a interação de CCR2 com seus Iigantes é por eliminação da expressão do CCR2 ou seus ligantes, especialmente MCP-1/CCL2, usando-se, por exemplo, métodos de silenciamento de RNA. Desse modo, em outra concretização, compostos 10 úteis na prática do método da invenção são ácidos nucleicos, incluindo oligonucleotídeos e polinucleotídeos na orientação do senso ou antissenso, moléculas de ácido nucleico de fita simples ou duplo (por exemplo, siRNA), que têm como alvo seqüências de MCP-1, e interferem com expressão de gene de MCP-1, ou que tem como alvo CCR2 e interferem com expressão 15 de gene de CCR2.

A expressão de gene pode ser modulada em vários modos diferentes, incluindo pelo uso de siRNAs, shRNAs, moléculas de antissenso e DNAzimas. SiRNAs e shRNAs ambos operam, via a trajetória de RNAi, e foram usados com sucesso para suprimir a expressão de genes. RNAi foi 20 primeiro descoberto em vermes, e o fenômeno de silenciamento de gene relacionado à dsRNA foi primeiro reportado em plantas por Fire e Mello (Fire et al., 1998. Nature 391: 806), e é considerado ser um modo para células de planta para combater infecção com vírus de RNA. Nesta trajetória, o produto viral de dsRNA longo é processado em fragmentos menores de 21-25 pb em 25 comprimento por uma enzima similar a DICER e, em seguida, a molécula de fita duplo é desenrolada e carregada no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Uma trajetória similar foi identificada em células de mamífero com a diferença notável que as moléculas de dsRNA devem ser menores do que 30 pb em comprimento de modo a evitar a indução da 30 assim denominada resposta de interferon, que não é específica de gene, e conduz a parada global de síntese de proteína na célula.

siRNAs sintéticos podem ser designados para ter como alvo especificamente um gene, e eles podem facilmente ser distribuídos a células in vitro ou in vivo. Os ShRNAs são os equivalentes de DNA de moléculas de siRNA, e têm a vantagem de serem incorporados no genoma da célula e, em seguida, sendo replicados durante todo ciclo mitótico.

DNAzimas foram também usadas para modular expressão de

gene. DNAzimas são moléculas de DNA catalíticas que clivam RNA de fita simples. Elas são altamente seletivas para a seqüência de RNA alvo e, como tal, podem ser usadas para desregular genes específicos através do alvejamento do RNA mensageiro.

A interferência de RNA refere-se ao processo de silenciamento

de gene pós-transcricional de seqüência específica em animais mediado por RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Fire et al., 1998, Nature, 391, 806; Hamilton et al., 1999, Science, 286, 950- 951; Lin et al., 1999, Nature, 402, 128-129; Sharp, 1999, Genes & Dev., 15 13:139-141; e Strauss, 1999, Science, 286, 886). A presença de dsRNA em células dispara a resposta de RNAi através de um mecanismo que tem ainda que ser totalmente caracterizado. Este mecanismo parece ser diferente de outros mecanismos conhecidos envolvendo ribonucleases específicas de RNA de fita duplo, tais como resposta de interferon que resulta de ativação 20 mediada por dsRNA de proteína kinase PKR e 2',5'-oligoadenilato sintase, resultando em clivagem não-específica de mRNA por ribonuclease L (ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.107.094; 5.898.031; Clemens et al., 1997, J. Interferon & Citocina Res., 17, 503-524; Adah et al., 2001, Curr. Med. Chem., 8, 1189).

A presença de dsRNAs longos em células estimula a atividade

de uma enzima ribonuclease Ill referida como dicer (Bass, 2000, Cell, 101, 235; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293). Dicer é envolvido no processamento do dsRNA em peças curtas de dsRNA conhecidas como RNAs de interferência curtos (siRNAs) (Zamore 30 et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Bass, 2000, Cell, 101, 235; Berstein et al., 2001, Nature, 409, 363). RNAs de interferência curtos derivados de atividade de dicer são tipicamente cerca de 21 a cerca de 23 nucleotídeos em comprimento, e compreendem cerca de 19 duplexes de par base (Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashiret al., 2001, Genes Dev., 15, 188). Dicer foi também implicado na excisão de 21- e 22-RNAs temporais pequenos de nucleotídeo (stRNAs) de RNA precursor de estrutura conservada que são 5 implicados em controle translacional (Hutvagner et al., 2001, Science, 293, 834). A resposta de RNAi também caracteriza um complexo de endonuclease, comumente referido como um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), que intermedia clivagem de RNA de fita simples tendo seqüência complementar ao trançado de antissenso do siRNA dúplex. 10 A clivagem do RNA alvo ocorre no meio da região complementar à fita de antissenso do siRNA dúplex (Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15, 188).

siRNAs são RNAs de fita dupla que incluem a sequência-alvo e seu complemento. Dois resíduos de uridina são adicionados à extremidade 3' dos RNAs (Elbashir et al. 2001 Nature 411:494-498).

A interferência de RNA (RNAi) está agora sendo usada

rotineiramente em células de mamífero para estudar as conseqüências funcionais de redução da expressão de genes específicos. RNAi é induzido por transfecção de RNAs de interferência pequenos (siRNAs), compreendendo moléculas de RNA de fita duplo ~21 nt em comprimento 20 com 2 nt de projeções 3' (Elbashir et al. 2001 supra), moléculas 45-50mer de formação em grampo de cabelo (shRNA) (Paddison, PJ1 et al., 2002. Genes

& Development 16:948-958), que são complementares ao gene de interesse. Quando transfectados em células de mamífero, os plasmídeos de expressão de siRNA têm se mostrado reduzirem os níveis de ambos produtos de gene 25 exógenos e endógenos. Embora eles requeiram mais esforço para preparar do que siRNAs quimicamente sintetizados ou transcritos in vitro, os vetores de siRNA podem proporcionar a redução de longo prazo na expressão de gene alvo quando coexpressos com um marcador selecionável (Brummelkamp, TR, et al., 2002. Science 296:550-553).

Antagonistas de Não-proteína, Não-ácido olioqonucléico

Fármacos de molécula pequena e peptidomiméticos podem também serem antagonistas de CCR2. Por exemplo, WQ04069809, W004069810, W005118574, W006015986 ensinam mercaptoimidazoles como antagonistas de receptor de CCR2. Outras moléculas pequenas que exibem as propriedades biológicas desejadas podem ser selecionadas por classificação usando-se métodos tais como aqueles aqui descritos, e terão a 5 propriedade de prevenir rejeição crônica e prolongamento de sobrevivência de enxerto.

Métodos de Produção de Anticorpos

Os anticorpos antagonistas de CCR2 da presente invenção podem ser opcionalmente produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo a técnica de hibridização de célula somática padrão (método de hibridoma) de Kohler e Milstein (1975) Nature 256:495. No método de hibridoma, um camundongo ou outro animal hospedeiro apropriado, tal como um hamster ou um macaco do gênero Macaca, é imunizado, conforme aqui descrito, para induzir linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente à proteína usada para imunização. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos, em seguida, são fundidos com células de mieloma usando-se um agente de fusão adequado, tal como polietileno glicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)).

O anticorpo antagonístico de CCR2 pode também ser opcionalmente gerado por imunização de um animal trangênico (por exemplo, camundongo, rato, hamster, primata não-humano, e similares) capaz de produzir um repertório de anticorpos humanos, conforme aqui 25 descrito, e/ou conforme conhecido na técnica. As células que produzem, por exemplo, um anticorpo anti-MCP-1 humano podem ser isoladas de tais animais, e imortalizadas usando-se métodos adequados, tais como os métodos aqui descritos.

O uso de camundongos transgênicos que conduzem locais de imunoglobulina humana (Ig) em sua configuração de linha de germe proporciona isolamento de anticorpos totalmente humanos de alta afinidade direcionados contra uma variedade de alvos, incluindo autoantígenos humanos para qual o sistema imune normal é tolerante (Lonberg, N. et al., US5569825, US6300129 e 1994, Nature 368:856-9; Green, L. et al., 1994, Nature Genet. 7:13-21; Green, L. & Jakobovits, 1998, Exp. Med. 188:483-95; Lonberg, N e Huszar, D., 1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93; Kucherlapati1 et al. US6713610; Bruggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323- 1326; Fishwild1 D. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-851; Mendez, M. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-156; Green1 L., 1999, J. Immunol. Métodos 231:11-23; Yang, X. et al., 1999, Cancer Res. 59:1236-1243; Bruggemann, M. e Taussig, M J., Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-458, 1997; Tomizuka et al. W002043478). Os locais de imunoglobulina endógena em tais camundongos podem ser rompidos ou anulados para eliminar a capacidade do animal produzir anticorpos codificados por genes endógenos. Em adição, companhias tais como Abgenix, Inc. (Freemont, Calif.) e Medarex (San Jose, Calif.) podem estar engajadas em proporcionar anticorpos humanos contra um antígeno selecionado usando-se tecnologia conforme descrito acima.

A preparação de antígenos imunogênicos e produção de anticorpo monoclonal podem ser realizadas usando-se qualquer técnica adequada, tal como produção de proteína recombinante. Os antígenos imunogênicos podem ser administrados a um animal na forma de proteína 20 purificada, de misturas de proteína incluindo células inteiras ou extratos de célula ou tecido, ou o antígeno pode ser formado de novo no corpo do animal de ácidos nucleicos que codificam o referido antígeno, ou uma porção deste.

A imunização com antígeno pode ser opcionalmente 25 acompanhada pela adição de um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo. A resposta imune pode ser monitorada com o curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangrias retro- orbitais. O plasma pode ser classificado por ELISA (conforme descrito abaixo), e camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina anti- 30 MCP-1 podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser inoculados intravenosamente com antígeno 3 dias antes de sacrifício e remoção do baço. É esperado que 2-3 fusões para cada antígeno possa necessitar ser realizada. Vários camundongos serão imunizados para cada antígeno.

Para gerar anticorpos antagonistas de CCR2 monoclonais de produção de hibridomas, esplenócitos e células de nódulo de Iinfa de 5 camundongos imunizados podem ser isolados e fundidos a uma linha de célula imortalizada apropriada, tal como uma linha de célula de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser classificados para a produção de anticorpos específicos de antígeno.

Uma linha de célula imortal adequada incapaz de produzir 10 cadeias de imunoglobulina é selecionada como um parceiro de fusão, por exemplo, uma linha de célula de mieloma, tal como, mas não limitado a, Sp2/0 e linhas de célula derivada, NS1 e derivados, especialmente linhas de NSO projetadas NOS, tais como GS-NSO, AE-1, L.5, P3X63Ag8.653, U937, MLA 144, ACT IV, MOLT4, DA-1, JURKAT, WEHI, K-562, COS, RAJI, NIH 15 3T3, HL-60, MLA 144, NAMAIWA, NEURO 2A, CHO, PerC.6, YB2/0, ou similares, ou heteromielomas, produtos de fusão destes, ou qualquer célula ou célula de fusão derivada a partir desta, ou qualquer outra linha de célula conforme conhecida na técnica (Birch et al. 1994. Biologics 22:127-133). As células fundidas (hibridomas), ou células recombinantes, podem ser isoladas 20 usando-se condições seletivas de cultura, ou outros métodos conhecidos adequados, e clonadas por diluição Iimitante ou classificação de célula, ou outros métodos conhecidos. Células que produzem anticorpos com a especificidade desejada podem ser detectadas por um ensaio adequado (por exemplo, ELISA), e selecionadas para manipulação.

Outros métodos adequados de geração ou isolamento de

anticorpos da especificidade requisitada podem ser usados, incluindo, mas não limitados a, métodos que selecionam anticorpo recombinante de uma biblioteca de peptídeo ou proteína (por exemplo, mas não limitado a, um bacteriófago, ribossomo, oligonucleotídeo, RNA, cDNA, ou similar, biblioteca 30 de revelação; por exemplo, conforme disponível de Cambridge antibody Technologies, Cambridgeshire, UK; MorphoSys, Martinsreid/Planegg, DE; Biovation, Aberdeen, Scotland, UK; Biolnvent, Lund, Sweden; Dyax Corp., Enzon, Affymax/Biosite; Xoma, Berkeley, CA; Ixsys. Ver, por exemplo, EP 368,684, PCT/GB91/01134; PCT/GB92/01755; PCT/GB92/002240; PCT/GB92/00883; PCT/GB93/00605; US 08/350260(5/12/94); PCT/GB94/01422; PCT/GB94/02662; PCT/GB97/01835; (CAT/MRC);

W090/14443; W090/14424; W090/14430; PCT/US94/1234; W092/18619; W096/07754; (Scripps); EP 614 989 (MorphoSys); W095/16027 (Biolnvent); W088/06630; W090/3809 (Dyax); US 4,704,692 (Enzon); PCT/US91/02989 (Affymax); W089/06283; EP 371 998; EP 550 400; (Xoma); EP 229 046; PCT/US91/07149 (Ixsys); ou peptídeos ou proteínas estocasticamente 10 gerados - US 5723323, 5763192, 5814476, 5817483, 5824514, 5976862, WO 86/05803, EP 590689 (Ixsys, agora Applied Molecular Evolution (AME), cada um totalmente incorporado aqui por referência) que são capazes de produzir um repertório de anticorpos humanos, conforme conhecido na técnica, e/ou conforme aqui descrito. Tais técnicas, incluem, mas não estão 15 limitadas a, revelação de ribossomo (Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 94:4937-4942 (May 1997); Hanes et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 95:14130-14135 (Nov. 1998)); tecnologias de produção de anticorpo de célula simples (por exemplo, método de anticorpo de linfócito selecionado ("SLAM") (Patente dos Estados Unidos N°. 5.627.052, Wen et al., J. 20 Immunol. 17:887-892 (1987); Babcook et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:7843-7848 (1996)); microgotícula de gel e citometria de fluxo (Powell et al., Biotechnol. 8:333-337 (1990); One Cell Systems, Cambridge, MA; Gray et al., J. Imm. Meth. 182:155-163 (1995); Kenny et al., Bio/Technol. 13:787- 790 (1995)); seleção de célula B (Steenbakkers et al., Molec. Biol. Reports 25 19:125-134 (1994); Jonak et al., Progress Biotech, Vol. 5, In Vitro Immunization in Hybridoma Technology, Borrebaeck, ed., Elsevier Science Publishers B.V., Amsterdam, Netherlands (1988)).

Anticorpos de classificação para ligação específica a proteínas similares ou fragmentos podem também serem convenientemente alcançados usando-se bibliotecas de revelação de peptídeo. Este método envolve a classificação de grandes coleções de peptídeos para membros individuais tendo a função ou estrutura desejadas. A classificação de anticorpo usando-se bibliotecas de revelação de peptídeo é bem conhecida na técnica. As seqüências de peptídeo reveladas podem ser de 3 a 5000 ou mais aminoácidos em comprimento, frequentemente de 5-100 aminoácidos de comprimento, e, frequentemente, de cerca de 8 a 25 aminoácidos de 5 comprimento. Bibliotecas de revelação de peptídeo, vetor, e kits de classificação são comercialmente disponíveis de fornecedores como Invitrogen (Carlsbad, CA), e Cambridge antibody Technologies (Cambridgeshire, UK). Ver, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4704692, 4939666, 4946778, 5260203, 5455030, 5518889, 5534621, 10 5656730, 5763733, 5767260, 5856456, transferidas para Enzon; 5223409, 5403484, 5571698, 5837500, transferidas para Dyax, 5427908, 5580717, transferidas para Affymax; 5885793, transferidas para Cambridge antibody Technologies; 5750373, transferida para Genentech, 5618920, 5595898, 5576195, 5698435, 5693493, 5698417, transferidas para Xoma, Colligan, 15 supra; Ausubel, supra; ou Sambrook, supra, cada uma das patentes acima e publicações totalmente incorporadas aqui por referência.

Fragmentos de Anticorpo

Os fragmentos de anticorpo podem ser derivados, via digestão proteolítica de anticorpos intactos (ver, por exemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical e Biophysical Methods 24:107-117 (1992); e Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Contudo, estes fragmentos podem agora ser produzidos diretamente por células hospedeiras recombinantes. Fragmentos de anticorpo F(ab’)2, Fab, Fv e ScFv podem todos ser expressos em, e secretados de células hospedeiras de mamífero, ou de E. coli, permitindo, desse modo, a fácil produção de grandes quantidades destes fragmentos. Os fragmentos de anticorpo podem ser isolados a partir das bibliotecas de fago de anticorpo discutidas acima. Alternativamente, os fragmentos Fab1-SH podem ser diretamente recuperados de E. coli, e quimicamente acoplados para formar fragmentos F(ab')2 (Carter et al., Bio/Technology 10:163- 167 (1992)).

Em outras concretizações, o anticorpo é um fragmento Fv de cadeia simples (scFv). Ver WO 93/16185; Patente dos Estados Unidos N°. 5.571.894; e Patente dos Estados Unidos N0. 5.587. 458. Fv e sFv são espécies com locais de combinação intactos, que é um domínio de VH e VL1 que são desprovidos de regiões constantes. Tipicamente, os domínios VH e VL são clonados e reprojetados para estarem dentro de um polipeptídeo 5 simples e ligados por um Iigante flexível longo bastante para permitir interação dos dois domínios dentro do polipeptídeo simples. Alternativamente, proteínas de fusão podem ser construídas para produzir fusão de uma proteína efetuadora em ou no terminal amino ou no terminal carboxi de um sFv. VerAntibody Engineering, 1995. ed. Borrebaeck.

Métodos de Identificação de Antagonistas

Antagonistas de atividade biológica de CCR2 podem ser identificados usando-se ensaios in vitro e modelos in vivo adequados conforme exemplificados aqui abaixo.

Ensaios de inibição de ligação podem ser usados para identificar anticorpos ou fragmentos destes que se ligam a CCR2, e inibem ligação de outro composto, tal como Iigante (por exemplo, MCP-1, MCP-2, MCP-3 e/ou MCP-4) a CCR2, ou uma variante funcional. Por exemplo, um ensaio de ligação pode ser conduzido, em que uma redução na ligação de um Iigante de CCR2 (na presença de um anticorpo), conforme comparada a ligação do Iigante na ausência do anticorpo, é detectado ou medido. Uma composição compreendendo um CCR2 de mamífero isolado e/ou recombinante, ou variante funcional desta, pode ser contactada com o Iigante e anticorpo simultaneamente, ou um após o outro, em qualquer ordem. Uma redução na extensão de ligação do Iigante na presença do anticorpo é indicativa de inibição de ligação pelo anticorpo. Por exemplo, a ligação do Iigante pode ser diminuída ou abolida.

Em uma concretização, inibição direta da ligação de um Iigante (por exemplo, uma quimocina, tal como MCP-1/CCL2) a um CCR2 de mamífero, ou variante deste, por um anticorpo ou fragmento, é monitorada. 30 Por exemplo, a capacidade de um anticorpo inibir a ligação de 125l-rotulado MCP-1, 125l-rotulado MCP-2, 125l-rotulado MCP-3 ou 125l-rotulado MCP-4 a CCR2 de mamífero pode ser monitorada. Tal ensaio pode ser conduzido usando-se células adequadas suportando CCR2, ou uma variante funcional destas, tais como células de sangue isoladas (por exemplo, células T, PBMC), ou uma linha de célula adequada que expressa naturalmente CCR2, ou uma linha de célula contendo ácido nucleico que codifica um CCR2 de mamífero, ou uma fração de membrana de referidas células, por exemplo.

Outros métodos de identificação da presença de um anticorpo que se liga a CCR2 são disponíveis, tais como outros ensaios de ligação adequados, ou métodos que monitoram eventos que são disparados por ligação de receptor, incluindo sinalização de função e/ou estimulação de uma resposta celular (por exemplo, tráfego de leucócito).

Será compreendido que o efeito inibitório dos anticorpos da presente invenção pode ser avaliado em um ensaio de inibição de ligação. A competição entre anticorpos para ligação de receptor pode também ser avaliada no método. Anticorpos que são identificados dessa maneira podem 15 ser adicionalmente avaliados para determinar e se, subsequentes a ligação, eles agem para inibir outras funções de CCR2, e/ou para avaliar sua utilidade terapêutica.

Ensaios de Sinalização

A ligação de um Iigante ou promotor, tal como um agonístico, a 20 CCR2, pode resultar na sinalização por este receptor acoplado à proteína G, e a atividade de proteínas G, bem como outras moléculas de sinalização, é estimulada. A indução de função de sinalização por um composto (por exemplo, um anticorpo, ou fragmento deste) pode ser monitorada usando-se qualquer método adequado. Tal ensaio pode ser usado para identificar 25 agonísticos de anticorpo de CCR2. A atividade inibitória de um anticorpo ou fragmento funcional deste, ou outro composto candidato de antagonista de CCR2, pode ser determinada usando-se um Iigante ou promotor no ensaio, e avaliando-se a capacidade do anticorpo inibir a atividade induzida pelo Iigante ou promotor.

A atividade de proteína G, tal como hidrólise de GTP a GDP, ou

eventos de sinalização anteriores disparados por ligação de receptor, tais como indução de aumento rápido e transiente na concentração de cálcio livre intracelular (citosólico) [Ca2+]l, podem ser avaliados por métodos conhecidos na técnica, ou outros métodos adequados (ver, por exemplo, Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425 1993); Van Riper et al., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993); Dahinden, C. A. et al., J. Exp. Med., 179: 751-756 (1994)).

Por exemplo, o ensaio funcional de Sledziewski et al. usando

receptores acoplados à proteína G híbrida pode ser usado para monitorar a capacidade de um Iigante ou promotor a ligar-se a receptor e ativar uma proteína G (Sledziewski et al., Patente dos Estados Unidos N°. 5.284.746, os ensinamentos da qual sendo aqui incorporados por referência).

Tais ensaios podem ser realizados na presença do anticorpo ou

fragmento deste a ser avaliado, e a capacidade do anticorpo ou fragmento inibir a atividade induzida pelo Iigante ou promotor é determinada usando-se métodos conhecidos e/ou métodos aqui descritos.

Quimiotaxia e Ensaios de Estimulação Celular Ensaios de quimiotaxia podem também serem usados para

avaliar a capacidade de um anticorpo ou fragmento funcional deste agir como um antagonista de CCR2. A atividade inibitória de um anticorpo, ou fragmento funcional deste, ou outro composto candidato de antagonista de CCR2, e para bloquear inibição de um Iigante a CCR2 de mamífero, ou 20 variante funcional deste, e inibir quimiotaxia como uma função associada com ligação do Iigante ao receptor é útil neste particular. Estes ensaios são baseados na migração funcional de células in vitro ou in vivo induzidas por um composto, neste caso, ou CCL2, ou outro Iigante capaz de ativar CCR2. A quimiotaxia pode ser avaliada, por exemplo, em um ensaio utilizando uma 25 placa de quimiotaxia de 96 cavidades, ou usando outros métodos reconhecidos na técnica para avaliar quimiotaxia. Por exemplo, o uso de um ensaio de quimiotaxia transendotelial in vitro é descrito por Springer et al. (Springer et al., WO 94/20142, publicado em 15 de setembro de 1994, os ensinamentos do qual são incorporados aqui por referência; ver também 30 Berman et al., Immunol. Invest. 17: 625-677 (1988)). A migração através do endotélio em géis de colágeno foi também descrita (Kavanaugh et al., J. Immunol., 146: 4149-4156 (1991)). Transfectantes estáveis de L1-2 pré- células B de camundongo, ou de outras células hospedeiras adequadas capazes de quimiotaxia, podem ser usados em ensaios de quimiotaxia.

Geralmente, ensaios de quimiotaxia monitoram o movimento direcional ou migração de uma célula adequada (tal como um leucócito (por 5 exemplo, linfócito, eosinófilo, basófilo)) em ou através de uma barreira (por exemplo, endotélio, um filtro), para níveis aumentados de um composto, de uma primeira superfície da barreira em uma segunda superfície oposta. Membranas ou filtros proporcionam barreiras convenientes, tal que o movimento direcional ou migração de uma célula adequada em ou através 10 de um filtro, para níveis aumentados de um composto, de uma primeira superfície do filtro em uma segunda superfície oposta do filtro, é monitorado. Em alguns ensaios, a membrana é revestida com uma substância para facilitar adesão, tal como ICAM-1, fibronectina ou colágeno. Tais ensaios proporcionam uma aproximação in vitro de leucócito "autodirecional".

Por exemplo, pode-se detectar ou medir a inibição da migração

de células em um recipiente adequado (um meio de contenção), de uma primeira câmara em ou através de uma membrana de microporo em uma segunda câmara que contém um anticorpo a ser testado, e que é dividido a partir da primeira câmara pela membrana. Uma membrana adequada, tendo 20 um tamanho de poro adequado para monitoramento de migração específica em resposta ao composto, incluindo, por exemplo, nitrocelulose, policarbonato, é selecionada. Por exemplo, tamanhos de poro de cerca de 3- 8 mícrons, e, preferivelmente, cerca de 5-8 mícrons, pode ser usada. O tamanho de poro pode ser uniforme em um filtro, ou dentro de uma faixa de 25 tamanhos de poro adequada.

Para avaliar a migração e inibição de migração, a distância de migração no filtro, o número de células que cruzam o filtro que permanece aderente à segunda superfície do filtro, e/ou o número de células que se acumula na segunda câmara podem ser determinados usando-se técnicas 30 padrão (por exemplo, microscopia). Em uma concretização, as células são rotuladas com um rótulo detectável (por exemplo, radioisótopo, rótulo fluorescente, rótulo de antígeno ou de epítopo), e migração pode ser avaliada na presença e ausência do anticorpo ou fragmento pela determinação da presença do aderente de rótulo à membrana, e/ou presente na segunda câmara usando um método apropriado (por exemplo, por detecção da radioatividade, fluorescência, imunoensaio). A extensão de 5 migração induzida por um agonístico de anticorpo pode ser determinada em relação a um controle adequado (por exemplo, comparado a migração antecedente determinada na ausência do anticorpo, comparada a extensão de migração induzida por um segundo composto (isto é, um padrão), comparado com migração de células não-transfectadas induzidas pelo 10 anticorpo).

Em uma concretização, particularmente para células T, monócitos ou células que expressam um CCR2 de mamífero, migração transendotelial pode ser monitorada. Nesta concretização, transmigração através de uma camada de célula endotelial é avaliada. Para preparar a 15 camada de célula, células endoteliais podem ser cultivadas em um filtro microporoso ou membrana, opcionalmente revestido com uma substância, tal como colágeno, fibronectina, ou outras proteínas de matriz extracelular, para facilitar a fixação de células endoteliais. Preferivelmente, células endoteliais são cultivadas até que uma monocamada confluente é formada. 20 Uma variedade de células endoteliais de mamífero pode estar disponível para formação de monocamada, incluindo, por exemplo, veia, artéria, ou endotélio microvascular, tais como células endoteliais de veia umbilical humana (Clonetics Corp, San Diego, Calif.). Para ensaiar quimiotaxia em resposta a um receptor de mamífero particular, células endoteliais do 25 mamífero são preferidas; contudo, células endoteliais de uma espécie de mamífero heteróloga ou gênero podem também serem usadas.

Geralmente, o ensaio é realizado pela detecção da migração direcional de células em ou através de uma membrana ou filtro, em uma direção a níveis aumentados de um composto, de uma primeira superfície do 30 filtro para uma segunda superfície oposta do filtro, no qual o filtro contém uma camada de célula endotelial em uma primeira superfície. A migração direcional ocorre a partir da área adjacente à primeira superfície, em ou através da membrana, para um composto situado no lado oposto do filtro. A concentração de composto presente na área adjacente à segunda superfície é maior do que aquela na área adjacente à primeira superfície.

Em uma concretização usada para testar um inibidor de anticorpo, uma composição compreendendo células capazes de migração e expressão de um receptor de CCR2 de mamífero pode ser colocada na primeira câmara. Uma composição compreendendo um ou mais Iigantes ou promotores capazes de induzir quimiotaxia das células na primeira câmara (tendo função quimioatraente) é colocada na segunda câmara. Preferivelmente e brevemente antes, as células são colocadas na primeira câmara, ou simultaneamente com as células, uma composição compreendendo o anticorpo a ser testado é colocada, preferivelmente, na primeira câmara. Anticorpos ou fragmentos funcionais destes que podem se ligar a receptor e inibir a indução de quimiotaxia, por um Iigante ou promotor das células que expressam um CCR2 de mamífero neste ensaio são inibidores de função de receptor (por exemplo, inibidores de função estimulatória). Uma redução na extensão de migração induzida pelo Iigante ou promotor na presença do anticorpo ou fragmento é indicativa de atividade inibitória. Estudos de ligação separados (ver acima) podem ser realizados para determinar se a inibição é um resultado de ligação do anticorpo a receptor, ou ocorre via um mecanismo diferente.

Ensaios in vivo que monitoram infiltração de leucócito de um tecido, em resposta a injeção de um composto (por exemplo, quimocina ou anticorpo) no tecido, são modelos de retorno à origem in vivo, e medem a 25 capacidade das células responderem a um Iigante ou promotor por migração e quimiotaxia a um local de inflamação, e para avaliar a capacidade de um anticorpo ou fragmento deste bloquear esta migração.

Em adição aos métodos descritos, os efeitos de um anticorpo ou fragmento na função estimulatória de CCR2 podem ser avaliados pelo monitoramento de respostas celulares induzidas por receptor ativo, usando células hospedeiras adequadas contendo receptor.

Identificação de Liqantes Adicionais e Inibidores de Função de CCR2 de Mamífero

Os ensaios acima descritos, que podem ser usados para avaliar ligação e função dos anticorpos e fragmentos da presente invenção, podem ser adaptados para identificar Iigantes adicionais ou outras substâncias que 5 se ligam a um CCR2 de mamífero ou variante funcional deste, bem como inibidores e/ou promotores de função de CCR2 de mamífero. Por exemplo, agentes tendo a mesma ou uma especificidade de ligação similar conforme aquela de um anticorpo da presente invenção, ou porção funcional deste, pode ser identificada por um ensaio de competição com referido anticorpo ou 10 porção deste. Desse modo, a presente invenção também envolve métodos de identificação de Iigantes do receptor ou outras substâncias que se ligam a uma proteína de CCR2 de mamífero, bem como inibidores (por exemplo, antagonistas) ou promotores (por exemplo, agonísticos) de função de receptor. Em uma concretização, células suportando uma proteína de CCR2 15 de mamífero ou variante funcional desta (por exemplo, leucócitos, linhas de célula ou células hospedeiras adequadas que foram projetados para expressarem uma proteína de CCR2 de mamífero ou variante funcional codificada por um ácido nucleico introduzido em referidas células), são usadas em um ensaio para identificar e avaliar a eficácia de Iigantes ou 20 outras substâncias que se ligam a receptor, incluindo inibidores ou promotores de função de receptor. Tais células são também úteis na avaliação da função da proteína receptora expressa ou polipeptídeo.

De acordo com a presente invenção, Iigantes e outras substâncias que se ligam a receptor, inibidores e promotores de função de 25 receptor podem ser identificados em um modo adequado, e adicionalmente avaliados para efeito terapêutico. Inibidores de função de receptor podem ser usados para inibir (reduzir ou prevenir) atividade de receptor, e Iigantes e/ou promotores podem ser usados para induzir (disparar ou aumentar) função de receptor normal onde indicado. Desse modo, a presente invenção 30 proporciona um método de tratar rejeição de enxerto, compreendendo administrar um inibidor de função de receptor a um indivíduo (por exemplo, um mamífero). Composições Farmacêuticas Compreendendo Antagonistas de CCR2

A invenção inclui métodos para preparar composições farmacêuticas para modulação da transcrição, expressão, ou atividade de um CCR2. Tais métodos compreendem formulação de um veículo 5 farmaceuticamente aceitável com um agente que modula expressão ou atividade de um CCR2. Tais composições podem adicionalmente incluir agentes ativos adicionais. Desse modo, a invenção adicionalmente inclui métodos para preparar uma composição farmacêutica por formulação de um veículo farmaceuticamente aceitável com um agente que modula expressão 10 ou atividade de um CCR2, e um ou mais compostos ativos adicionais.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores que são não-tóxicos à célula ou mamífero sendo expostos a estes nas dosagens e concentrações empregadas. Frequentemente o veículo fisiologicamente aceitável é uma solução tamponada de pH aquoso. Exemplos de veículos fisiologicamente aceitáveis incluem tampões, tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico; polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolídona; aminoácidos, tais como glicina, glutamina, histadina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos, incluindo glicose, manose, ou dextrins; agentes de quelatação, tal como EDTA; álcoois de açúcar, tais como manitol ou sorbitol; contra-íons de formação de sal, tal como sódio; e/ou surfactantes não-iônicos, tais como TWEEN®, polietileno glicol (PEG), PLURONICS® e ácido hialurônico (HA).

Formulações podem ser designadas para otimizar a estabilidade do antagonista de CCR2 ou, adicionalmente, permitir a liberação sustentada ou prolongada do ativo na corrente sanguínea. Formulações adequadas para cada tipo de antagonista de CCR2 e via de administração podem ser 30 encontradas em, por exemplo, "Remington: The Science e Practice of Pharmacy", A. Gennaro, ed., 20th edition, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2000. De modo que as formulações sejam usadas para administração in vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril por filtração através de membranas de filtração estéreis, antes de ou em seguida à liofilização e reconstituição. As composições terapêuticas aqui geralmente 5 são colocadas em um recipiente tendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco de solução intravenosa ou frasco tendo um obturador perfurável por uma agulha hipodérmica. As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Métodos de Tratamento 10 O método da invenção para tratamento de fibrose em um

indivíduo inclui fibrose específica de órgão, ou fibrose sistêmica. A fibrose específica de órgão pode estar associada com pelo menos uma de fibrose de pulmão, fibrose de fígado, fibrose de rim, fibrose de coração, fibrose vascular, fibrose de pele, fibrose de olho, fibrose de tutano de osso, ou outra 15 fibrose. A fibrose de pulmão pode estar associada com pelo menos uma de uma fibrose pulmonar idiopática, fibrose pulmonar induzida por fármaco, asma, sarcoidose, ou doença pulmonar obstrutiva crônica. A fibrose de fígado pode estar associada com pelo menos uma de cirrose, esquistomasomiasis ou colangite. A cirrose pode ser selecionada de cirrose 20 alcoólica, cirrose pós-hepatite C, cirrose biliar primária. A colangite é colangite de esclerose. A fibrose de rim pode estar associada com pelo menos uma de nefropatia diabética, ou Iupos glomeruloesquelerose. A fibrose de coração pode estar associada com pelo menos um tipo de infarto miocardial. A fibrose vascular pode estar associada com pelo menos uma de 25 restenose arterial de pós-angioplastia, ou aterosclerose. A fibrose de pele pode estar associada com pelo menos uma de cicatrização de queimadura, cicatrização hipertrófica, quelóide, ou dermatologia de fibrose nefrogênica. A fibrose de olho pode estar associada com pelo menos uma de fibrose retro- orbital, cirurgia pós-catarata, ou vitreorretinopatia proliferativa. A fibrose de 30 tutano de osso pode estar associada com pelo menos uma de mielofibrose idiopática, ou mielofibrose induzida por fármaco. A outra fibrose pode ser selecionada de doença de Peyronie, contratura de Dupuytren, ou dermatomiosite. A fibrose sistêmica pode ser selecionada de esclerose sistêmica e doença de enxerto versus hospedeiro.

Avaliação do Paciente

A doença de pulmão intersticial (ILD) envolve uma faixa diversa 5 de enfermidades fibróticas que são agrupadas juntas devido a manifestações clínicas, radiológicas, fisiológicas ou patológicas similares. Um termo mais correto, doenças de pulmão parenquimal difuso, é menos ilusório, visto que muitas destas enfermidades afetam bronquíolos terminais, interstício e alvéolos.

Embora IPF seja denominada uma "pneumonia", a inflamação

parece desempenhar um papel relativamente menor. Fatores ambientais, genéticos, ou outros fatores desconhecidos considerados disparar inicialmente dano da célula epitelial alveolar, mas autoperpetuação e fibroblasto intersticial aberrante e proliferação de célula mesenquimal (com 15 deposição de colágeno e fibrose), são considerados contar para o desenvolvimento de doença clínica. As descobertas histológicas-chaves são fibrose subpleural com locais de proliferação de fibroblasto (fibroblasto "foci") e cicatrização densa, alternando com áreas de tecido de pulmão normal (heterogeneidade). A inflamação intersticial cicatrizada ocorre com linfócito, 20 célula de plasma, e infiltração histiócita. Dilatação cística de alvéolos periféricos (alveolização) é encontrada em todos os pacientes, e aumenta com doença avançada. Ver Merck Manual of Diagnosis e Therapy (18th ed.), Section: Pulmonary Disorders, Subject: Interstitial Lung Diseases, Topic: Idiopathic Interstitial Pneumonias. 2006.

Doenças de pulmão difuso, tais como doença pulmonar

obstrutiva crônica e hipertensão pulmonar, são excluídas da classificação de ILD. Pacientes com ILD avançada sofrem de dispnéia profunda e finalmente sucumbem a falha respiratória. A doença de pulmão intersticial inclui um grupo heterogêneo de enfermidades que conduzem a insuficiência 30 respiratória e morte em um número significante de pacientes. Transplante de pulmão é uma opção terapêutica em candidatos selecionados. A incidência exata e predomínio de ILD na população geral permanecem desconhecidos. Acredita-se que ILD é muito mais prevalecente do que anteriormente reportado (5 casos por população de 100 000). Um estudo baseado na população de Bernalillo County1 New Mexico1 reportou um predomínio de 80,9 casos por 100 000 em homens, e 67,2 casos por 100 000 em mulheres.

A fibrose pulmonar idiopática (IPF) é a forma mais comum de ILD, perfazendo cerca de 45% de todos os casos neste estudo. Outras doenças de pulmão difuso que podem resultar em falha respiratória incluem sarcoidose, limfangioleiomiomatose, histiocitose de célula de Langerhan ou granuloma eosinofílico, pneumonite intersticial desquamativa (DIP)1 10 pneumonite intersticial não-específica (NSIP)1 e fibrose pulmonar associada com doença de tecido conectivo.

A avaliação de um paciente de fibrose de pulmão idiopática intersticial (UIP/IPF, ou paciente de NSIP) para a necessidade de terapia de anti-CCR2 pode ser realizada a qualquer momento antes, concorrente com, 15 ou subsequente a apresentação sintomática da doença usando-se métodos conhecidos àqueles técnicos no assunto. Geralmente, métodos usados para diagnosticar doença pulmonar incluem severidade, por exemplo, necessária para ventilação mecânica; sintomas, por exemplo, tosse, dispnéia, febre, hemoptise; o tipo de começo, gradual, agudo, ou subagudo; doença básica, 20 imunodeficiência, doença vascular de colágeno, vasculite; exposições ambientais, asbestos, antígenos de pássaro, fumaças tóxicas; história de medicação, corticosteróides, agentes citotóxicos, antibióticos; anormalidades laboratoriais, anemia, contagens de eosinófilo de soro elevada, anticorpos citoplasmáticos de antineutrofil, precipitins de soro contra Aspergillus, fator 25 de reumatóide; descobertas radiográficas, opacidades localizadas ou difusas normais, consolidação nodular ou irregular, espaço de ar ou intersticial, predominância de lóbulo superior ou inferior; e efusão pleural que se pode descobrir por radiografia (HRCT), opacidades de vidro moído, bronquiectasis, evidência de doença das vias aéreas, lóbulo inferior, 30 subpleural, microcística, ou mudança de alvéolo, cistos e nódulos de lóbulo superior bilateral, mudanças císticas difusas bilateralmente. Finalmente, o paciente é submetido a testes de função pulmonar de modo a determinar se a patofisiologia é obstructiva, restritiva, misturada, obstrutiva ou restritiva, ou normal.

As descobertas histológicas no paciente de IPF (UIP) incluem opacidades lineares irregulares (modelo reticular). Contudo, esta observação 5 pode ocorrer em doença vascular de colágeno, asbestose, e pneumonite de hipersensibilidade crônica. O parênquima de pulmão distai terá fibrose com um modelo de alveolação em UIP. Outras formas de fibrose intersticial podem ocorrer como um resultado de: pneumonia intersticial linfocítica, doenças vasculares de colágeno, reações á fármaco, pneumoconioses 10 (asbestose, beriliose, silicose, pneumoconiose de metal duro, outras), sarcoidose, histiocitose de célula de Langerhans (granuloma eosinofílico), infecções granulomatose crônica, aspiração crônica, pneumonia de hipersensibilidade crônica, pneumonia eosinofílica crônica organizada, dano alveolar organizado e de organização difusa, edema pulmonar intersticial 15 crônico/congestão passiva, radiação (crônica), pneumonias infecciosas curadas. O modelo de HRCT típico de UIP inclui reticulação periférica bibasilar com alveolação e bronquiectasis de tração. A opacificação de vidro moído não é uma característica da doença, e se presente, é usualmente muito pouco, alguns dos quais podem atualmente serem devido a fibrose. 20 Duas características que foram mostradas serem mais características para IPF são alveolação de lóbulo inferior, que tem proporção ímpar de 5,36 para a diagnose de IPF, e as assim denominadas "linhas irregulares de lóbulo superior," com uma proporção ímpar de 6,28 para IPF (Hunninghake 2003. Chest. 124:1215-1223).

Os miofibroblastos são relativamente ausentes de tecido não-

fibrótico. Os miofibroblastos contêm fibras actina de músculo liso que dão a estas células um fenótipo contráctil, que serve para fechar ferimentos. Actina de músculo alfa-liso (aSMA) é um marcador para miofibroblastos. TGFbI é um fator de crescimento profibrótico prototípico que foi anteriormente 30 mostrado induzir expressão de aSMA (Desmouliere et al. 1995 Exp Nephrol 3(2): 134-9). Usando-se fibroblastos cultivados de pacientes de UIP e fibroblastos de pulmões não-fibróticos, os requerentes descobriram que TGFbI induz aSMA em ambos fibroblastos não-fibróticos e fibroblastos fibróticos; contudo, a grandeza de indução é maior nos fibroblastos fibróticos. O estímulo dos fibroblastos com PDGF induz um aumento modesto (menos do que 10 vezes) em expressão de aSMA, mas somente 5 nos fibroblastos fibróticos. Entre estes três, os dados dos requerentes mostraram que somente CCL2 induz um aumento na expressão de aSMA em fibroblastos fibróticos por mais do que 10 vezes.

A deposição de colágeno é uma indicação chave que fibrose e dois genes, pró-colágeno I e pró-colágeno Ill foram anteriormente mostrados 10 estarem associados com UIP. Proteínas de pró-colágeno I e Ill se mostraram ser elevadas em amostras de UIP, ambas no pulmão e sistemicamente (Low et al. 1992 Am Rev Respir Dis 146(3):701-6; Strieter et al. 2004 Am J Respir Crit Care Med 170(2): 133-40; Bensadoun et al. 1996. Am J Respir Crit Care Med 154(6 Pt 1):1819-28.). Os requerentes demonstraram que CCL2 induz 15 ambos pró-colágeno I e pró-colágeno Ill em fibroblastos de UIP. Além disso, a grandeza de indução de gene por CCL2 é comparável àquela produzida por ambas citoquinas profibróticas, TGFpi e PDGF-AB.

O papel profibrótico de TGFpi foi bem descrito em uma variedade de tecidos e órgãos. Os efeitos de TGFpi são adicionalmente amplificados através de um mecanismo de autocrina. Os requerentes observaram este mecanismo de amplificação em ambos fibroblastos de pulmão não-fibrótico e fibrótico estimulados com TGFpI, tanto como ambos tipos de célula exibiram TGFpI aumento na presença of TGFpi. CCL2 foi também verificado aumentar expressão de gene de TGFpi, e, como com TGFpi, a extensão de indução de gene de TGFpi por CCL2 foi maior nos fibroblastos fibróticos. Receptores de TGFp foram anteriormente verificados serem elevados em fibroblastos dermais de pacientes de escleroderma (Kubo et al. 2002J Rheumatol 29(12):2558-64; Kawakami 1998. J Invest DermatoIH0(1 ):47-51). Enquanto os fibroblastos de UIP incubados com TGFpi, PDGF e CCL2 tiveram aumento em ambas das subunidades de receptor de TGFp analisadas sobre aquela nos fibroblastos não-fibróticos, TGFpi aumentou principalmente TGFpRI, e CCL2 induziu ambas subunidades, indicando que o efeito não pode ser somente devido a indução de TGFpi por CCL2.

O fator de crescimento de tecido conectivo (CTGF) foi mostrado mediar muitos dos efeitos de TGFpi, incluindo produção de colágeno.

TGFbI induziu um aumento na expressão de CTGF em ambos fibroblastos fibrótico e não-fibróticos. Além disso, PDGF e CCL2 induziram um aumento na expressão de gene de CTGF em fibroblastos de UIP.

Os dados da requerente mostraram que TGFpi, PDGF e CCL2 elevaram expressão de IL13Ra1 em fibroblastos de UIP. IL-13 é uma citoquina tipo Th2 que é encontrada em níveis elevados nos pulmões de pacientes de UIP. IL-13 é profibrótico in vitro e em modelos in vivo. IL-13 induz geração de colágeno e proliferação de fibroblastos (Saito 2003. Int Arch Allergy Immunol 2003;132(2):168-76; Ingram2004 Faseb J 18(10):1132-4). Uma variedade de dados de modelos de fibrose pulmonar de murina indica que IL13 e sinalização através de IL13Ra2 para ser profibrótica, e pode também agir através de indução de TGFpi (Fichtner- Feigl 2006. Nat Med 12(1):99-106). Desse modo, os dados da requerente mostrando que TGFpi, PDGF-AB, e CCL2 todos regulados em expressão de IL13Ra2, indicam que CCL2 pode tornar-se diretamente ou indiretamente fibroblastos mais sensíveis a respostas mediadas por IL-13.

In toto, os requerentes demonstraram à primeira vista as indicações de resposta profibrótica por fibroblastos de UIP para CCL2, e distinguiram a resposta de fibroblastos de UIP daquela de pulmões não- fibróticos. Estudos anteriores indicaram que CCR2 é expresso em células 25 similares a miofibroblasto na pele de pacientes de escleroderma (Carulli 2005 Arthritis Rheum 52(12):3772-82) e modelos de animal de fibrose de pulmão têm mostrado uma regulação superior de CCR2 em fibroblastos isolados de um fibrótico, funcionalidade aumentada e ambiental tipo Th2 destas células para Iigantes de CCR2 (Hogaboam 1999. J Immunol 30 1999;163(4):2193-201.). Contudo, este é o primeiro estudo conhecido indicando um papel funcional profibrótico para CCL2 em fibroblastos de pulmão adoentados. A inibição de CCR2-CCL2 foi mostrada ser benéfica em modelos in vivo de fibrose. Mecanisticamente, a inibição de fibrose em modelos de animal foi atribuída a recrutamento de fibrócito reduzido e inflamação atenuada, que pode ou não pode se traduzir em doença humana. A presente 5 invenção é baseada no uso das requerentes de fibroblastos humanos de demonstrar que CCL2 de Iigante de CCR2 podem acionar respostas profibróticas, e os fibroblastos de UIP são hiper-responsivos a CCL2. Desse modo, os dados indicam que um método de bloqueio, inibição, regulação inferior, ou antagonização de bioatividade de CCR2, especialmente pelo 10 antagonismo de ligação de CCL2 a CCR2, será efetivo no melhoramento rápido e no dano irreversível presente em tecidos de pulmão intersticial que resultam em perda de função pulmonar conforme à medida que as requerentes estabelecem um efeito profibrótico direto de CCL2 em fibroblastos pulmonares humanos adoentados.

Nos métodos da invenção, um antagonista de CCR2 pode ser

administrado no momento do começo de UIP de marcadores detectáveis conforme revelado aqui, incluindo mas não limitado a, CXCL5, IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL-8 e G-CSF.

O conhecimento atual no campo relacionado à diagnose e controle de IIDs, particularmente IPF, indica que as causas e efeitos de iniciação que conduzem a fibrose são variadas conforme é a patologia celular (Chapman 2004 J Clin Invest 113(2): 148-157). Para determinar qual subconjunto de pacientes diagnosticados pode ser ajudado pela terapia de anti-CCL2, identificação de biomarcadores associados com doença mediada por CCL2 seria de valor. Estudos de tecido de IPF têm revelado regulação diferencial de uma regulação superior de MMP-7 no nível de expressão de gene, e várias proteínas se mostraram reguladas superiormente em fluido de lavagem bronquial e/ou soro, incluindo KL-6, ENA-78, IP-10, CCL7, IL-2, IL- 8, IL-10 e IL-12 (p40). Contudo, não tem havido até aqui correlação entre estas proteínas e atenuação de CCL2. Várias citoquinas além de CCL2, tais como IL- 1, PDGF, Osteopontina, TNF, TGF, CCL3, CXCL8, CXCL5, CXCL12, CXCL9, CXCL10, CXCL11, se mostraram estarem envolvidas na patogênese de IPF. Contudo, o relacionamento com CCL2 permanece não- claro, e a análise de expressão de gene de fibroblastos de pacientes de IPF tem, desse modo, produzido resultados diferentes de laboratórios diferentes (Ver Studer et al. 2007. Proc Amer Thoracic Soc. 4(1): p. 85-9 para uma revisão).

Os fibroblastos cultivados têm níveis basais detectáveis de CCL2 e CCL2 exogenamente adicionado recentemente se mostraram modular produção de IL-6 (Liu, X., et al.207 Amer J Respir Célula Molec Biol. 37(1): 121-8). Portanto, CCL2 se comporta como um mediador central e 10 neutralização de CCL2 no ambiente dos fibroblastos de IPF modularão expressão de outros genes e/ou proteínas.

Os requerentes determinaram, usando fibroblastos residentes isolados de pacientes fibróticos, que fibroblastos de pulmão de pacientes de IPF expressam níveis mais altos de CXCL5, IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL- 15 8 e G-CSF do que fibroblastos não-fibróticos. Os requerentes determinaram também que CNTO 888, um anticorpo de CCL2 de neutralização, foi capaz de bloquear a produção destas proteínas em células que expressam os níveis mais altos.

Uma diagnose precisa de IPF envolve biópsia de tecido de pulmão e análise histológica para pneumonia intersticial não usual. Devido à invasividade deste procedimento, não seria prático monitorar a progressão da doença rotineiramente após diagnose inicial. Outras diagnoses não- invasivas são disponíveis, mas são submetidas à variabilidade. Portanto, uma ferramenta diagnostica quantitativa relativamente não-invasiva é necessária. Fluidos de tecido, tais como soro ou fluido de lavagem broncoalveolar, podem ser amostrados menos invasivamente do que biópsias cirúrgicas. Proteínas solúveis e marcadores de superfície de célula ou expressão de gene de células coletadas podem todos ser quantificados com tecnologias de saída para diagnosticar e monitorar progressão de doença. O tecido de monitoramento para estes genes e/ou proteínas pode ser usado para determinar extensão de neutralização de CCL2 por CNTO 888. Portanto, determinação de gene e/ou proteína para CXCL5, IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL-8 e G-CSF de tecido periférico acessível proporcionará um biomarcador novo e relativamente não-invasivo de doença e neutralização alvo.

Em uma concretização para avaliar um paciente, 5 ou mais ml de sangue de paciente pode ser retirado em tubos designados para análise de ácido nucleico, tal como tubos PAXgene Blood RNA (SystemPreAnaIytiX), e RNA total pode ser isolado e analisado para expressão de gene como por qualquer método conhecido na técnica que inclui as sondas específicas para pelo menos um de CXCL5, IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL-8 e G-CSF. Os pacientes podem ser selecionados para terapia se qualquer ou todo dos genes tem níveis de expressão maiores do que 2 vezes à idade e espécimes equiparadas de gênero de pacientes ou indivíduos normais não demonstrando sintomas de pacientes com uma pneumonia intersticial idiopática. Em outra concretização, a seleção de dose para pacientes selecionados para terapia pode ser ajustada baseada em mudanças de duas vezes ou maior de expressão em qualquer ou todo dos genes comparados à idade e voluntários normais equiparados de gênero. Em outra concretização do método da invenção, a resposta à terapia pode ser monitorada baseada nas mudanças de duas vezes ou maior de expressão em qualquer ou todo dos genes comparado à idade e voluntários normais equiparados de gênero.

Em outra concretização, 5 ou ml de sangue pode ser coletado de pacientes revelando sintomas de pneumonia instersticial idiopática em tubos de coleta de soro. O soro pode ser testado para qualquer ou todo de CXCL5, 25 IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL-8 e G-CSF usando-se kits ELISA ou multiplex comercialmente disponíveis. Os pacientes podem ser selecionados para terapia se qualquer ou toda das proteínas tem níveis de expressão maiores do que duas vezes à idade e voluntários normais equiparados de gênero. Em outro aspecto, a seleção de dose para pacientes selecionados 30 para terapia pode ser ajustada baseada nas mudanças de duas vezes ou maior de expressão em qualquer ou todo do CXCL5, IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL-8 e G-CSF comparado à idade e voluntários normais equiparados de gênero. Em um aspecto adicional, a resposta à terapia pode ser monitorada baseada nas mudanças de duas vezes ou maior de expressão em qualquer ou todo de CXCL5, IL-6, CCL2, IL13RA2, VEGF, IL-8 e G-CSF comparado à idade e voluntários normais equiparados de gênero.

Vias de Administração

A via de administração é de acordo com métodos conhecidos e aceitos, por exemplo, injeção ou infusão por administração intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, intra-arterial, via a veia portal; administração tópica, por meio de liberação sustentada ou liberação prolongada; injeção 10 subcutânea, por distribuição transmucosal ou transdermal, através de aplicações tópicas, pulverização nasal, supositório e similares, ou podem ser administradas oralmente.

Em outro aspecto do método, a administração pode ser por pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutânea, intramuscular, 15 intravenosa, intra-articular, intrabronquial, intra-abdominal, intracapsular, intracartilagenosa, intracavitária, intracelial, intracelebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocardial, intraosteal, intrapélvica, intrapericardíaca, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, 20 intraespinhal, intrassinovial, intratorácica, intrauterina, intravesical, intralesional, bôlus, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdermal.

Dosaqens

A dose de antagonista de anti-CCR2 que é apropriada para 25 prevenir, melhorar, reverter, ou parar a progressão de rejeição crônica em um paciente em necessidade deste será encontrada empiricamente, e será dependente da potência do agente ativo, da resistência da formulação, e da duração do nível efetivo do agente em seguida a administração no corpo do recipiente.

O curso de tratamento pode ser administração crônica ou

contínua em um modo contínuo conforme oposto a um modo agudo, de modo a manter o efeito terapêutico inicial (atividade) por um período prolongado de tempo. Alternativamente, o tratamento pode ser intermitente ou cíclico na natureza de modo a proporcionar períodos de atividade antagonista aguda, seguida por períodos de atividade antagonista inferior, ou não antagonista no corpo do paciente. Desse modo, a tabela de dosagem

pode ser variada, tal que o anticorpo é administrado uma vez, duas vezes, três ou mais vezes por semana para qualquer número de semanas, o anticorpo é administrado mais do que uma vez (por exemplo, duas, três, quatro, cinco, seis, sete vezes), com a administração ocorrendo uma vez em uma semana, de duas em duas semanas, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, 10 nove dez semanas.

No caso de antagonista de anticorpo monoclonal de bioatividade de CCR2, o agente geralmente será administrado em uma quantidade que é baseada no peso corpóreo do recipiente, por exemplo, entre 0,1 e 100 mg/kg por curso de terapia. Uma faixa exemplar, mas não limitativa, para uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um anticorpo administrado de acordo com os métodos da invenção é 0,1-20 mg/kg, mais preferivelmente 1-10 mg/kg. Em uma concretização, o anticorpo anti-CCR2 ou anti-CCL2 pode ser administrado por infusão intravenosa a uma taxa de menos do que 10 mg/min, preferivelmente menos do que ou igual a 5 mg/min, para alcançar uma dose de cerca de 1 a 500 mg/m2, preferivelmente cerca de 10 a 400 mg/m2, cerca de 18 a 350 mg/m2, e, mais preferivelmente, cerca de 250-280 mg/m2. O anticorpo anti-CCR2 ou anti- CCL2 pode ser administrado em uma dose simples, ou em doses múltiplas. Terapia de Combinação T ratamento

Nenhum tratamento específico tem se comprovado efetivo para IPF. à terapia de suporte consiste em 02 para hipoxemia e antibióticos para pneumonias. Doença de estágio final pode qualificar pacientes selecionados para transplante de pulmão. Corticosteróides e fármacos citotóxicos, tais 30 como ciclofosfamida (CYTOXAN), azatioprina (IMURAN) têm tradicionalmente sido dados a pacientes de IPF empiricamente em uma tentativa de parar a progressão de inflamação, mas dados limitados suportam sua eficácia. Não obstante, é prática comum tentar tratamento com prednisona (por exemplo, DELTASONE) (0,5 a 1,0 mg/kg po uma vez/dia por 3 meses, diminuído para 0,25 mg/kg uma vez/dia sobre os próximos 3 a

6 meses), combinado com ciclofosfamida ou azatioprina (1 a 2 mg/kg po uma vez/dia). De 3 meses a 1 ano, as respostas clínicas, radiográficas, e fisiológicas são avaliadas, e as doses de fármacos são aumentadas ou diminuídas consequentemente, à terapia é cessada se não existe resposta objetiva.

Pirfenidona, um agente antifibrótico, pode estabilizar função pulmonar e reduzir exacerbações. Antifibróticos que inibem síntese de colágeno (relaxin), fatores de crescimento profibrótico (suramin), e endothelin-1 (um bloqueador de receptor de angiotensin) têm somente se demonstrados efetivos in vitro.

Interferon-Y-Ib tem se mostrado promissor quando combinado 15 com prednisona em um grupo pequeno de pacientes, mas um ensaio randomizado multinacional inibido duplo verificou-se não afetar o tempo de sobrevivência livre de progressão, função pulmonar, ou qualidade de vida. Conquanto tendo-se descrito a invenção em termos gerais, as concretizações da invenção serão adicionalmente reveladas nos exemplos 20 seguintes.

EXEMPLO 1: FIBROBLASTOS FIBRÓTICOS E NÃO-FIBRÓTICOS

De modo a caracterizar as propriedades inerentes de fibroblastos de pacientes de UIP conforme comparado àquelas de tecido de pulmão histopatologicamente não-fibrótico, fibroblastos primários de um ou o 25 outro tipo de tecido são avaliados para marcadores no estado não- estimulado, e em resposta a mediadores conhecidos de patologia fibrótica, por exemplo, TGFbeta, PDGF-AB, e CCL2.

Isolamento e Purificação de Fibroblasto

Linhas de célula foram providas por Dr Cory Hogaboam na Universidade de Michigan. Todas as linhas de fibroblasto primárias foram isoladas conforme anteriormente descrito (Hogaboam et al. 1999 J Immunol 163(4):2193-201). Fibroblastos pulmonares foram isolados de biópsia de pulmão tomada de pacientes de UIP (n=4), e estas são referidas como "fibroblastos fibróticos". Os fibroblastos foram também isolados de tecido de pulmão tomados durante resecção de tumor de pulmão (n=5), e estas amostras foram confirmadas serem não-fibróticas por análise histológica.

Este tecido não-fibrótico derivado de fibroblastos são referidos como "fibroblastos não-fibróticos".

Expressão de gene de fibroblasto

Fibroblastos de pulmão humano foram colocados em 24 placas de cavidade (Costar, Corning, NY) em 100.000 células/cavidade, e permitidos aderir por 8 horas. As células foram então lavadas com PBS e cultivadas durante toda noite em meio livre de soro (DMEM com l-Glutamina, Pen/Strep). As células foram então estimuladas por 24 horas na presença ou ausência de TGFb-1 (1 ou 10 ng/mL), PDGF-AB (20 ou 200 ng/mL) ou CCL2 (1 ou 10ng/mL). TGFbI, PDGF-AB e CCL2 foram comprados de R&D Systems. Subrenadantes foram removidos, e RNA foi subsequentemente isolado usando-se RNeasy Plus Mini-Kits (QIAGEN, Valencia, CA) como por instruções do fabricante, e o RNA foi transcrito reverso em cDNA usando Reagentes de Transcrição Reversa TaqManâ (Applied Biosystems, Foster City, CA). A expressão de gene profibrótica foi determinada por PCR de tempo real usando-se a Taqmanâ Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), e Ensaios de Expressão de Gene Taqmanâ pré-desenvolvidos (Applied Biosystems) como por instruções do fabricante.

A expressão de gene quantitativa foi calculada usando-se o método de CT comparativo, onde os valores de CT são determinados como 25 o número de ciclo limite para qual expressão de gene é primeiro detectada. As mudanças de vezes na expressão de gene para os genes de interesse foram primeiro normalizadas ao gene de manutenção 18S, dando valores de ACT. As mudanças de vezes na expressão entre fibroblastos fibróticos e não-fibróticos foram calculadas como: ACT (não-fibrótico) - ACT (fibrótico) = 30 AACT, onde a expressão de gene não-fibrótico serviu como o calibrador. As mudanças de vezes na expressão de gene devido a estimulação in vitro foram calculadas por AACT = ACT (não-estimulado) - ACT (estimulado), onde a amostra não-estimulada serviu como calibrador. O cálculo 2-ΔΔΟΤ então deu um valor relativo para mudança de vezes final quando comparada ao calibrador.

Para determinar se a expressão de linha de base na expressão 5 de gene fibrótico foi diferente nos fibroblastos de UIP (n=3), comparada a fibroblastos não-fibróticos (n=4), a expressão de gene foi comparada entre as células não-estimuladas de ambos grupos de pacientes. Conforme mostrado na Figura 1, os fibroblastos derivados de pacientes de UIP têm expressão de gene fibrótico de linha de base maior em todos dos genes 10 analisados.

TGFbI induz aSMA em fibroblastos não-fibróticos e fibróticos; contudo, a grandeza de indução foi maior em fibroblastos fibróticos (Figura 2). PDGF induz um aumento modesto em expressão de aSMA, e somente nos fibroblastos fibróticos. CCL2 também induz somente um aumento na expressão de aSMA em fibroblastos fibróticos.

Para determinar se a revelação de fibroblasto de UIP aumentou os níveis de expressão de gene de colágeno, as células foram estimuladas com CCL2. As figuras 3A e B mostram que CCL2 induz ambos pró-colágeno

I e pró-colágeno Ill em fibroblastos de UIP. Além disso, a extensão de indução de gene por CCL2 é comparável àquela produzida por ou TGFbI e PDGF-AB.

O papel profibrótico de TGFbI foi bem descrito. A expressão de gene de TGFbI induziu TGFbI, PDGF e CCL2 (Figura 4). A indução de TGFbI por um circuito fechado de autocrina é conhecida, e é suportada 25 pelos dados presentes com ambos os fibroblastos não-fibróticos e fibróticos. Este experimento adicionalmente demonstra que CCL2 também aumenta expressão de gene de TGFbI. Como com TGFbI, a extensão de indução de gene de TGFbI por CCL2 foi maior nos fibroblastos fibróticos.

A expressão de gene de CTGF induziu TGFbI, PDGF e CCL2 (Figura 5). TGFbI induz um aumento no gene de expressão de CTGF em ambos fibroblastos fibróticos e não-fibróticos. Além disso, PDGF e CCL2 de dose baixa induzem um aumento na expressão de gene de CTGF em fibroblastos de UIP.

Expressão de gene de subunidade ambos de TGFbRI e TGFbRII que induz XZTGFbI, PDGF e CCL2 é mostrada nas figuras 6A e B. TGFbI tem um efeito maior no TGFbRI, enquanto CCL2 induz ambos com um algum tanto maior aumento no TGFbRII.

A expressão de gene IL13Ra1 e IL13Ra2 induzida por TGFbI, PDGF e CCL2 é mostrada nas figuras 7A e B. TGFbI, PDGF e CCL2 regulam na expressão de IL13Ra1 nos fibroblastos de UIP. A sinalização através de IL13Ra2 foi recentemente demonstrada para ser profibrótica 10 através da indução de TGFbI. Todos os três mediadores induziram uma regulação superior na expressão de IL13Ra2, tornando, desse modo, potencialmente estas células mais sensíveis a respostas mediadas por IL- 13.

EXEMPLO 2:

Tecido de pulmão de IPF e pacientes não-fibróticos foram

picados e postos em um frasco de cultura de tecido de T75cm com 20ml de meio (DMEM peso/15% de FCS, 1% de PSA, & L-Glutamina). O meio foi mudado duas vezes em uma semana até que colônias de célula se formaram. As células foram destacadas e passadas. Experimentos foram realizados após passagem número cinco.

Isolamento de RNA

Os fibroblastos foram cultivados durante a noite em DMEM 15% de FCS 1% de Glutamax, 1% de penicilina streptomicina em 1x105 células em 500 ul/cavidade de uma placa de 24 cavidades. As células foram 25 cultivadas por 24 horas em DMEM sem soro. O meio foi mudado para DMEM suplementado com albumina de soro humano, e culturas foram incubadas por 24 e/ou 48 horas. O RNA colhido, as células cultivadas foram Iisadas usando-se minikit RNeasy (Qiagen, Inc. Valencia, CA) como por instruções do fabricante. A qualidade e quantidade do RNA foi determinada 30 com o 2100 BioAnaIyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA).

RT-PCR

A reação de transcrição reversa foi realizada como por protocolo usando-se reagentes TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) a 25°C por 10 minutos, 48°C por 30 minutes, 95°C por 5 minutos. PCR de Tempo Real foi realizada usando-se séries de baixa densidade ABI de costume (duplicate Assays-on-Demand primers e probes) com o sistema de 5 detecção de seqüência ABI Prism® 7900. Na presença de AmpIiTaq Gold DNA polimerase (Applied Biosystems, Foster City, CA), a reação foi incubada por 2 minutos a 500C, seguida por 10 minutos a 95°C. Em seguida, a reação foi permitida por 40 ciclos a 15 segundos, 950C e 1 minuto, 600C por ciclo. O GAPDH de controle endógeno foi usado para 10 normalizar as amostras usando o método de DCT para quantificação relativa.

Imunodeteccão

Os fibroblastos foram cultivados durante a noite conforme descrito acima. Os sobrenadantes foram aliquotados para teste usando LINCOpIex Human citocina/quimocina 30plex panei (Millipore), kit ENA-78 Quantikine, e kit IL-13RA2 ELISA (R&D systems)

Resultados:

cDNA de 7 linhas de fibroblasto pulmonar de IPF e 5 linhas de fibroblasto pulmonar não-fibrótico foram avaliados a 24 horas por RT-PCR para expressão relativa de CXCL5, CCL2, IL13ra2 e IL-6. A Tabela 1 mostra a expressão de vezes relativa para cada linha de IPF sobre o dCt médio (alvotCt - GAPDHCt) para as linhas não-fibróticas.

A linha de célula de IPF 126 tinha a expressão mais alta para CXCL5, IL13ra2 e IL-6. A expressão de CCL2 foi maior do que ou igual a 25 duas vezes mais alta do que em células não-fibróticas por 6 de 7 linhas de célula. Os níveis de expressão de CXCL5 e IL6 foram maiores do que ou iguais a duas vezes mais altas do que em células não-fibróticas para 5 linhas de célula, e expressão de IL13ra2 foi maior do que ou igual a duas vezes mais alta do que para células não-fibróticas para 4 linhas de célula. Tabela 1.

N0

Linha/Gene

de 116 122 123 126

138 148 201 Aumento de Vezes Médio

CXCL5 1 2 6 2752 5 22 1 5,18 CCL2 2 2 4 3 4 3 0 3 IL13Ra2 1 1 3 14 4 8 1 IL6 2 2 2 683 0 8 1 2 Análise de Proteína

Os sobrenadantes de 5 linhas de UIP e 5 linhas não-fibróticas foram testados para expressão de proteína de IL-6, IL-8, CCL2, CXCL5, G- 5 CSF e VEGF por ELISA ou multiplex. As Tabelas 2 e 3 mostram os níveis de proteína em pg/ml para todas as linhas de célula testadas. A linha de célula fibrótica 148 tinha os níveis de expressão mais altos para IL-6, IL-8, G-CSF, CCL2, e VEGF. A linha de célula 126 foi mais alta para CXCL5 (16430 pg/ml.). A expressão de IL-8 foi maior do que ou igual a 2 vezes a expressão 10 não-fibrótica média para todas as 5 linhas de célula. A expressão de CCL2 e IL-6 foi maior do que ou igual a duas vezes a expressão não-fibrótica média para 4 de 5 linhas de célula. A expressão de G-CSF foi maior ou igual a duas vezes a expressão não-fibrótica média para 2 linhas de célula. A expressão de VEGF foi maior do que ou igual a duas vezes a expressão 15 não-fibrótica média para 3 linhas de célula. A expressão de CXCL5 foi maior ou igual a duas vezes a expressão não-fibrótica média (para valores acima de 0) para 2 linhas de célula. A comparação dos valores médios para linhas de célula fibrótica e não-fibrótica indica que IL8 > IL6 > CCL2 >

VEGF em grandeza relativa de diferença no meio entre as células fibróticas e não-fibróticas.

Tabela 2.

131 134 135 139 Média

N0 de Linha/Proteína

130

IL6 10 4 18 63 25 18 IL8 3 4 4 5 37 4 G-CSF 0 0 0 0 0 0 10

CCL2 265 186 501 914 1506 501 VEGF 2 12 17 8 17 12 CXCL5 0 0 84 0 5 0 Tabela 3. N0 de Linha/ 116 117 123 126 148 Médio Fibrótico/ Proteína Não- Fibrótico IL6 70 43 15 117 5086 70 3,9 IL8 20 25 26 560 3143 26 6,0 G-CSF 0 0 0 71 1457 0 - CCL2 1675 2050 847 1572 2651 1675 3,3 VEGF 17 26 8 94 712 26 2,2 CXCL5 3 3 77 16430 470 77 _ De modo a examinar adicionalmente o relacionamento entre estes mediadores, a linha de célula fibrótica 126 foi tratada com anticorpo de neutralização de CCL2 CNTO888 que é compreendido das regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve dadas por SEQ ID N°. 27 e 28, respectivamente, ou um anticorpo equiparado de isotipo irrelevante e o gene e níveis de expressão de proteína comparados à mesma linha de célula com nenhum anticorpo presente. Os resultados para a expressão genética são mostrados na Tabela 4, e para expressão de proteína na Tabela 5.

Tabela 4.

Percentaqem de Nível de Célula Não-Tratada Gene Outro IqGI Anti-CCL2 CXCL5 59 <1 CCL2 106 2 IL13Ra2 82 5 IL6 98 <1 Tabela 5. Proteína Não- Outro IqGI Anti- Outro Anti-CCL2 Tratada CCL2 IaGI IL6 17442 19435 40 111 <1 IL8 13900 15634 308 112 2 G-CSF 10000 10000 1 100 <1 VEGF 774 711 175 100 23 CXCL5 12055 9083 32 75 <1 CCL2 não pode ser precisamente medido na presença do anticorpo anti-CCL2 (CNT0888), embora a presença de anti-CCL2 possa ser monitorada durante terapia. A redução de vezes mais alta de proteína com CNTO 888 foi G-CSF (6803 vezes) As vezes mais baixas foi com VEGF (4 vezes: G-CSF > IL6 = CXCL5 >IL8 > VEGF

O monitoramento da progressão da doença por biópsia de pulmão em pontos de tempo múltiplos seria não-prático. Um painel de marcadores profibróticos atenuados por CCL2 foi identificado, e pode ser medido ex vivo para avaliar a atividade de CCL2. O uso dos marcadores identificados como substitutos permitiria o monitoramento da atividade de anticorpo durante à terapia para ajudar a determinar as opções de tratamento, tais como quantidade e regulação de dose. Segundo, nós determinamos uma grande grandeza de variabilidade dentro de uma população de fibroblasto pulmonar de IPF para perfis de gene profibróticos/proteína que podem ser indicativos de subconjuntos de pacientes potencialmente responsivos à terapia de anti-CCL2. O uso do painel profibrótico de genes/proteínas como marcadores substitutos de doença, proporciona medição quantitativa e relativamente não-invasiva de progressão de doença. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA

10

15

20

25

30

<110> <120> <130> <140> <141 > <160> <170> <210> <211 > <212> <213> <220> <221 > <222> <223> <220> <221 > <222> <223> <220> <221 > <222> <223> <220> <221 > <222> <223> <220> <221 > <222> <220>

Centocor, Inc., Murray, Lynn; Syed, Farhat; Das, Anuk

CCR2 ANTAGONISTAS PARA TRATAMENTO DE FIBROSE

CEN5158 PCT

US 60/828,253

2006-10-05

28

Patentln versão 3.3

1

76

PRT

Homo sapiens

VARIANTE

(1)..(1)

Xaa may be Gin, Glu, ou ácido piroglutâmico

VARIANTE

(40)..(40)

Xaa may be Ala ou Ser

VARIANTE

(41)..(41)

Xaa may be Val ou Ile

VARIANTE (43)..(43)

Xaa may be Phe ou Tyr

SITE (69)..(69) <221 > SITE <222> (75)..(75)

<223> Posição conjugada, por exemplo, biotina ou PEG-biotin <400> 1 <400> 1

Xaa Pro Asp Ala He Asn Ala Pro Val Thr Cys Cys Tyr Asn Phe Thr 15 10 15

Asn Arg Lys He Ser Val Gln Arg Leu Ala Ser Tyr Arg Arg He Thr 20 25 30

Ser Ser Lys Cys Pro Lys Glu Ala Xaa He Xaa Lys Thr He Val Ala 35 40 45

Lys Glu He Cys Ala Asp Pro Lys Gln Lys Trp Val Gln Asp Ser Met 50 55 60

Asp His Leu Asp Lys Gln Thr Gln Thr Pro Lys Thr 65 70 75

<210> 2 <211> 119 <212> PRT <213> Homosapien <220>

<221 > VARIANT <222> 50, 52, 54, 55, 57, 58, 59 <223> Xaa = Any Aminoácido <400> 2

Gln Val Glu Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly He SerTrp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45

Gly Xaa He Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 10

15

20

25

30

Gln Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg TyrAsp Gly He Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

3

109 PRT

Homo sapien

<210> <211> <212> <213> <220> <221 > <222> <223> <400>

VARIANT

90, 94, 95, 96, 97, 98 Xaa = Any Aminoácido 3

Asp Ne Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala 20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45

He Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ne Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Xaa Gln Tyr He Xaa Xaa Xaa 85 90 95

Xaa Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ne Lys 100 105

<210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> Homosapien <400> 4

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Asn Ile Arg Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Phe Glu Phe Thr Pro Trp Thr Tyr Phe Asp Phe Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120

<210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Homosapien <220>

<221 > VARIANT <222> 89,91,92,93,96,97 <223> Xaa = Any Aminoácido <400> 5

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 10 15

Thr Ala Arg Ile Ser Cys Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val 25 30

Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

40 45

Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Glu 65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa 85 90 95

Xaa Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105

<210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Homosapien <400> 6

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 10

<210> 7 <211> 20 <212> PRT <213> Homosapien <400> 7

Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln 1 5 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 8 <211> 20 <212> PRT

<213> Homosapien <400> 8 Trp Met Gly Ala Ile Asn Pro Leu Ala Gly His Thr His Tyr Ala Gln 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 9 <211> 10 <212> PRT <213> Homosapien <400> 9 TyrAspGIy IIeTyrGIyGIu LeuAsp Phe 1 5 10

<210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Homosapien <400> 10

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10

<210> 11 <211 > 20 <212> PRT <213> Homosapien <400> 11

Trp Val Ser Asn Ile Arg Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp 1 5 10 15

Ser Val Lys Gly 20

<210> 12 <211> 11 <212> PRT

<213> Homosapien <400> 12 Phe Glu Phe Thr Pro Trp Thr Tyr Phe Asp Phe 1 5 10

<210> 13 <211> 12 <212> PRT

<213> Homosapien <400> 13

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Asp Ala Tyr Leu Ala 1 5 10

<210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Homosapien <400> 14 Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr 1 5 10

<210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Homosapien <400> 15

His Gln Tyr Ile Glu Leu Trp Ser Phe 1 5

<210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Homosapien <400> 16

His Gln Tyr Ile Gln Leu His Ser Phe 1 5

<210> 17 <211> 8 <212> PRT

<213> Homosapien

<400> 17

His Gln Tyr Ile Phe Tyr Pro Asn 1 5

<210> 18 <211> 11 <212> PRT <213> Homosapien <400> 18

Ser Gly Asp Asn Leu Gly Lys Lys Tyr Val Tyr 1 5 10

<210> 19 <211> 11 <212> PRT

<213> Homosapien <400> 19

Leu Val Ile Tyr Asp Asp Asp Asn Arg Pro Ser 1 5 10

<210> 20 <211> 10 <212> PRT <213> Homosapien <400> 20 Gln Thr Tyr Asp Arg Phe Ser Ser Thr Ala 1 5 10

<210> 21 <211> 10 ~ <212> PRT <213> Homosapien <400> 21

Gln Ser Tyr Asp Arg Phe Ser Ser Thr Gly 1 5 10

<210> 22 <211> 20 <212> PRT <213> Homosapien <220>

<221> VARIANT <222> 4,6,8,9,11,12,13 <223> Xaa = Any Aminoácido <400> 22

Trp Met Gly Xaa Ile Xaa Pro Xaa Xaa Gly Xaa Xaa Xaa Tyr Ala Gln 10 15

Lys Phe Gln Gly 20

<210> 23 <211> 22 <212> PRT <213> Homosapien <220>

<221 > VARIANT

<222> 10,11,13,15,19 <223> Xaa = Any Aminoácido <400> 23

Trp Val Ser Ser Ile Glu His Lys Trp Xaa Xaa Tyr Xaa Thr Xaa Tyr 1 5 10 15

Ala Ala Xaa Val Lys Gly 20

<210> 24 <211> 8 <212> PRT

<213> Homosapien <220> <221 > VARIANT

<222> 1,5,6,7,8

<223> Xaa = Any Aminoácido

<400> 24 Xaa Gln Tyr Ile Xaa Xaa Xaa Xaa

1 5

<210> 25

<211> 10

<212> PRT

<213> Homosapien <220>

<221 > VARIANT

<222> 2,4,5,6,9,10

<223> Xaa = Any Aminoácido

<400> 25

Gln Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Ser Ser Xaa Xaa

1 5 10

<210> 26

<211> 10

<212> PRT

<213> Homosapien <220>

<221 > VARIANT

<222> 2, 5, 9

<223> Xaa = Any Aminoácido

<400> 26

Gly Xaa Thr Phe Xaa Ser Tyr Gly Xaa Ser

1 5 10

<210> 27

<211> 119

<212> PRT

<213> Homosapien <400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly ThrAIa Asn TyrAIa Gln Lys Phe 50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Asp Gly Ile Tyr Gly Glu Leu Asp Phe Trp Gly Gln Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115

Claims (32)

1. Método para inibição de pelo menos uma proteína-1 quimioatraente de monócito humano (MCP-1) em um paciente tendo pelo menos uma forma de fibrose usando pelo menos um antagonista de MCP-1, compreendendo administrar uma quantidade eficaz de inibição de MCP-1 de pelo menos um antagonista de MCP-1 as.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido antagonista de MCP-1 é selecionado de uma molécula pequena e uma proteína.

3. Método, de acordo com a reivindicação 2, no qual referida molécula pequena é selecionada de derivados de indol, derivados de amina cíclica, derivados de ureido, heterocíclicos, anilidas, ou pirróis funcionais com a capacidade de bloquear ligação de CCL2 a CCR2B, ou inibição de CCR1 ou próprio CCL2.

4. Método, de acordo com a reivindicação 2, no qual referida proteína é selecionada de um receptor solúvel, um anticorpo, um peptídeo, um fragmento destes, ou uma proteína de fusão destes.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referida proteína adicionalmente compreende um composto ou proteína que aumenta a meia vida do soro de referida proteína.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo compreende pelo menos uma região variável compreendendo pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, referido anticorpo de MCP-1 compreendendo ambas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve compreendendo SEQ ID NOS: 27 e 28.

7. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, referido anticorpo compreendendo todas seqüências de aminoácido da região de determinação de complementaridade (CDR) de cadeia pesada e de cadeia leve de SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16.

8. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido an- ticorpo compreende pelo menos uma região variável compreendendo pelo menos uma cadeia pesada e pelo menos uma cadeia leve, referido anticorpo de MCP-1 compreendendo ambas regiões variáveis de cadeia pesada e de cadeia leve compreendendo SEQ ID NOS: 27 e 28.

9. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo compreende pelo menos uma região variável de cadeia pesada e pelo menos uma região variável de cadeia leve, referido anticorpo compreendendo todas as seqüências de aminoácido da região de determinação de complementaridade (CDR) de cadeia pesada e de cadeia leve de SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14, e 16.

10. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo compreende pelo menos uma CDR de cadeia pesada ou de cadeia leve tendo a seqüência de aminoácido de pelo menos uma de SEQ ID NOS:6, 7, 9, 13, 14, e 16.

11. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo compreende uma região variável de cadeia pesada ou região variável de cadeia leve de pelo menos uma de SEQ ID NO: 2-5 adicionalmente compreendendo uma região de determinação de complementaridade (CDR) de uma cadeia pesada ou leve, ou uma porção de ligação de Iigante desta selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NO: 6-26; e, opcionalmente funcionalmente associada com uma região estrutural, adicionalmente opcionalmente compreendendo pelo menos CH1, articulação, CH2, ou CH3 de uma imunoglobulina humana.

12. Método de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo se liga a MCP-1 com uma afinidade de pelo menos uma selecionada de pelo menos 1CT9 M, pelo menos 10"10 M, pelo menos 10"11 M, ou pelo menos 10"12 M.

13. Método, de acordo com a reivindicação 4, no qual referido anticorpo modula substancialmente pelo menos uma atividade de pelo menos um polipeptídeo de MCP-1.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida molécula pequena ou proteína é provida como uma composição adicionalmente compreendendo pelo menos um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referido método adicionalmente compreende administrar pelo menos um pelo menos um composto ou polipeptídeo selecionado de pelo menos um de um reportador ou rótulo detectável, um antagonista de TNF1 um fármaco anti- infeccioso, um fármaco de sistema cardiovascular (CV)1 um fármaco de sistema nervoso central (CNS)1 um fármaco de sistema nervoso autônomo (ANS)1 uma droga de trato respiratório, uma droga de trato gastrintestinal (Gl), um fármaco hormonal, um fármaco para equilíbrio de fluido ou de eletrólito, um fármaco hematológico, um antineoplástico, um fármaco de imunomodulação, um oftálmico, um fármaco ótico ou nasal, um fármaco tópico, um produto nutricional, uma citoquina, ou um antagonista de citoquina.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida quantidade eficaz de inibição é 0,001-50 mg/kilogram of referidas células, tecido, órgão ou animal.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida administração é por pelo menos um modo selecionado de parenteral, subcutâneo, intramuscular, intravenoso, intra-articular, intrabronquial, intra- abdominal, intracapsular, intracartilagenosa, intracavitária, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólica, intracervical, intragástrica, intra-hepática, intramiocardial, intraosteal, intrapélvico, intrapericardíaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarretal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinhal, intrassinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, retal, bucal, sublingual, intranasal, ou transdermal.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual referida fibrose é fibrose específica de órgão, ou fibrose sistêmica.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, no qual referida fibrose específica de órgão é associada com pelo menos uma fibrose de pulmão, fibrose de fígado, fibrose de rim, fibrose de coração, fibrose vascular, fibrose de pele, fibrose de olho, fibrose de tutano de osso, ou outra fibrose.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose de pulmão é associada com pelo menos um de uma fibrose pulmonar induzida por fármaco, asma, doença pulmonar obstrutiva crônica ou sarcoidose.

21. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose de fígado é associada com pelo menos uma de cirrose, esquistomasomiasis ou colangite.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, no qual referida cirrose é selecionada de cirrose pós-hepatite C, cirrose biliar primária.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual referida colangite é colangite de esclerose.

24. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose de rim é associada com Iupos glomerulosclerose.

25. Método, de acordo com a reivindicação 19, onde referida fibrose de coração é associada com pelo menos um tipo de infarto miocardial.

26. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose vascular é associada com pelo menos uma de restenose arterial de pós-angioplastia, ou aterosclerose.

27. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose de pele é associada com pelo menos um de quelóide, ou dermatopatia de fibrose nefrogênica.

28. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose de olho é associada com pelo menos uma de fibrose retro-orbital, vitreorretinopatia de sirurgia pós-catarata, ou proliferativa.

29. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida fibrose de tutano de osso é associada com pelo menos uma de mielofibrose idiopática, ou mielofibrose induzida por fármaco.

30. Método, de acordo com a reivindicação 19, no qual referida outra fibrose é selecionada de doença de Peyronie, contratura de Dupuytren ou dermatomiosite.

31. Método, de acordo com a reivindicação 18, no qual referida fibrose sistêmica é selecionada de esclerose sistêmica e doença de enxerto versus hospedeiro.

32. Qualquer invenção aqui descrita.