BRPI0718223A2 - Substrato de ensaio biológico poroso, métodos para produzir um substrato de ensaio biológico e para examinar fluidos de analito, e, dispositivo de jato de tinta para produzir um substrato de ensaio biológico - Google Patents

Description

“SUBSTRATO DE ENSAIO BIOLÓGICO POROSO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM SUBSTRATO DE ENSAIO BIOLÓGICO E PARA EXAMINAR FLUIDOS DE ANALITO, E, DISPOSITIVO DE JATO DE TINTA PARA PRODUZIR UM SUBSTRATO DE ENSAIO BIOLÓGICO” CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se ao campo de análise de fluidos de amostra biológica com relação a certos analitos e, particularmente, a um substrato de ensaio biológico poroso adequado para detectar pelo menos um analito em um fluido de amostra biológica. Em particular, a presente invenção permite uma análise precisa e eficiente de fluidos de amostra biológica. A invenção ainda refere-se a um método para produzir um substrato de ensaio biológico, depositando-se uma pluralidade de substâncias sobre o substrato, e a um substrato de ensaio biológico obtenível pelo método. A presente invenção também refere-se a um método para analisar um fluido de amostra com relação a uma ou mais moléculas de analito presentes no fluido de amostra. O analito pode compreender qualquer composto capaz de ligar-se às sondas de captura do substrato, incluindo compostos biológicos alvo, proteínas, DNA e assim por diante. O método pode ser usado em testes de diagnóstico molecular, por exemplo, para medição da presença de patógenos de doença infecciosa e genes de resistência.

FUNDAMENTO DA INVENÇÃO

Sistemas de sondas de captura em um substrato são empregados em ensaios de teste biológico, por exemplo, para examinar fluidos biológicos de analito, tais como sangue humano ou amostras de tecido, quanto à presença e/ou concentração de certas bactérias, vírus e/ou fungos. As sondas de captura têm uma capacidade de ligação seletiva para um fator indicativo predeterminado, tal como uma proteína, seqüência de DNA ou RNA que pertence a uma bactéria, vírus ou fungo específico. Na técnica de microformação, um conjunto de sondas de captura específicas, cada uma das quais sendo escolhida a fim de interagir especificamente (por exemplo, hibridizar no caso de uma microformação de DNA) com um composto biológico alvo particular, é imobilizado em locais específicos de um substrato sólido biossensor, por exemplo, por impressão. Sondas adequadas podem 5 compreender biofluidos contendo o fator indicativo específico, por exemplo, uma solução de uma seqüência de DNA e/ou anticorpo específicos. Após o substrato ser provido com as sondas de captura, o fluido de analito é forçado a fluir através do substrato ou forçado a fluir sobre o substrato. A fim de serem capazes de visualizar a presença de um fator indicativo no fluido de analito, as 10 moléculas do fluido de analito podem, por exemplo, ser fornecidas com rotulagem fluorescente e/ou magnética. No caso de ELISA (ensaio imunossorvente ligado por enzima), uma enzima é ligada ao segundo anticorpo, em vez de um radiorrótulo. Um composto intensamente colorido ou fluorescente é então formado pela ação catalítica desta enzima. As moléculas 15 (rotuladas) do fluido de analito aderem àquelas sondas de captura do substrato que têm capacidade de ligação para a molécula considerada. Isto resulta em uma fluorescência detectável no sítio em que o fator específico adere, pelo menos quando utilizando-se rotulagem fluorescente. As moléculas capturadas são tipicamente lidas por iluminação com uma fonte de luz e o padrão 20 fluorescente registrado com o auxílio de uma câmara de CCD, por exemplo. O padrão registrado é uma característica da presença de uma bactéria ou um conjunto de bactérias. Provendo-se sondas de captura com especificidades diferentes para fatores diferentes, o sistema pode ser usado para ensaio por vários fatores diferentes ao mesmo tempo. A utilização de tais formações 25 possibilita seleção de elevada produção dos fluidos de analito para uma grande quantidade de fatores de uma única execução.

A fim de aumentar a boa qualidade e eficiência da seleção de elevada produção, é desejável ligarem-se tantas moléculas rotuladas do fluido do analito quanto possíveis àquelas sondas de captura do substrato que têm capacidade de ligação para a molécula considerada. Quando a ligação das moléculas é insuficiente (ou hibridização em caso de filamentos de DNA), certos fatores indicativos podem não ser obtidos e/ou o padrão fluorescente pode não ser claramente distinguível e/ou pode ser deficiente em algum outro 5 sentido. Embora o substrato de ensaio biológico conhecido, bem como o método para produzir tal substrato de ensaio biológico, produza uma eficiência de ligação satisfatória, há uma necessidade de um substrato de ensaio biológico, bem como de um método para produzir tal substrato de ensaio biológico com eficiência de ligação melhorada. Além disso, rápida 10 seleção com aumentada velocidade da análise é desejável, especialmente no campo de diagnósticos clínicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

É um objetivo da presente invenção fornecer um substrato de ensaio biológico poroso, incluindo substratos para PCR e/ou eletroforese, com 15 eficiência de ligação melhorada. E um outro objetivo da presente invenção fornecer um método para produzir tal substrato depositando-se uma pluralidade de substâncias sobre dito substrato. É um objetivo adicional da presente invenção fornecer um dispositivo para produzir tal substrato que seja capaz de depositar uma pluralidade de substâncias sobre dito substrato. Outro 20 objetivo da presente invenção é fornecer um método para examinar fluidos de analito, tais como sangue humano ou amostras de tecido, quanto à presença de certas bactérias, vírus e/ou fungos, tendo o método uma eficiência de análise aperfeiçoada.

Os objetivos acima são realizados por um substrato de ensaio 25 biológico poroso compreendendo uma ou mais sondas de captura capazes de ligarem-se especificamente a pelo menos um analito alvo, em que a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho maior do que O50 da distribuição de tamanho de poro do substrato, seja pelo menos igual à concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50. Falando em termos gerais, fomecendo-se um substrato em que, em média, os poros maiores contenham uma concentração mais elevada de sondas de captura, uma eficiência de ligação aumentada do substrato é obtida, em comparação com os substratos de ensaio biológico conhecidos.

5 Outra vantagem da invenção é que a análise pode ser realizada mais rápida, tanto por uma configuração de fluxo atravessante quanto por uma de fluxo sobre. Isto é especialmente assim quando uma pressão externa é empregada.

Em uma forma de realização preferida do substrato de ensaio biológico poroso de acordo com a invenção, a concentração média das sondas 10 de captura dos poros com um tamanho maior do que O50 é pelo menos duas vezes a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50, mesmo mais preferido pelo menos cinco vezes a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O5o e mais preferido pelo menos dez vezes a concentração média das 15 sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50.

As vantagens da invenção são particularmente notáveis para substratos tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro. O substrato particularmente preferido tem uma distribuição de tamanho de poro de modo que (O90 - 010) > 2 O5o· Um substrato de ensaio biológico ainda mais 20 preferido tem uma distribuição de tamanho de poro de modo que (O90 - Ojo) > 5 O50. Outro substrato de ensaio biológico preferido tem uma distribuição de tamanho de poro de modo que (O90 - O5o) > 2 O5o e (O50 - O10) ^ 2 Oio-

De acordo com a invenção, um método para produzir tal substrato de ensaio biológico é também fornecido. No método, uma 25 pluralidade de soluções de molécula de captura são liberadas sobre o substrato poroso, por exemplo, de uma cabeça de impressão de um dispositivo de impressão de jato de tinta, e o substrato é fornecido com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor e/ou um ponto de ebulição mais elevado do que o solvente das soluções de molécula de captura. Preferivelmente o substrato é fornecido com o meio inativante antes da liberação das soluções de molécula de sonda de captura sobre o substrato. Um método particularmente preferido, além disso, compreende a etapa adicional de tratamento do substrato, de modo que parte do meio inativante é evaporado do substrato antes da liberação das soluções de molécula de captura sobre o substrato. Tratando-se o substrato com um meio inativante com as características indicadas, pelo menos parte dos poros do substrato é (temporariamente) bloqueada. O meio inativante entretanto será mais facilmente evaporado dos furos maiores. Quando a evaporação forçada ou natural do meio inativante ocorrer, os poros menores do substrato permanecerão pelo menos parcialmente bloqueados. Quando aplicando-se as soluções de sonda de captura no e dentro do substrato, os poros menores (bloqueados) estão, em uma menor extensão, disponíveis para absorver a solução da sonda de captura, que portanto penetra e adere preferivelmente na superfície dos furos maiores. Visto que um fluido de analito penetra mais facilmente nos poros maiores do substrato poroso, isto causa a desejada eficiência de ligação aumentada do substrato de ensaio biológico da presente invenção. Esta vantagem é particularmente notável em uma configuração de fluxo atravessante, em que o fluxo é menos influenciado pelas forças capilares do que por queda de pressão.

Qualquer meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor e/ou um ponto de ebulição mais elevado do que o solvente das soluções de molécula de captura pode, em princípio, ser usado no método de acordo com a presente invenção. Preferivelmente o meio inativante 25 compreende um fluido tendo uma taxa de evaporação menor e/ou um ponto de ebulição mais elevado do que o solvente das soluções de molécula de captura. Mesmo mais preferido é um líquido inativante compreendendo üm álcool, éteres e ésteres de alquila derivados dele e/ou uma sua mistura.

Uma vantagem adicional do método e substrato de ensaio de acordo com a invenção é que requerem que menos sondas de captura sejam impressas e/ou necessita-se menos fluido de analito para uma produção similar do que até agora conhecido. Ambas vantagens reduzem o custo de uma análise. Também, mais mistura de fluido e etapas de hibridização podem 5 ser realizadas a fim de melhorar o limite de detecção, aumentando-se desse modo o tempo de análise. Entretanto, de acordo com uma forma de realização preferida da invenção o tempo de análise é significativamente aumentado em comparação com métodos conhecidos da técnica.

A invenção ainda fornece um dispositivo e, em particular, um 10 dispositivo de jato de tinta, para produzir tal substrato de ensaio biológico. O dispositivo de jato de tinta de acordo com a invenção compreende um recipiente para substâncias serem impressas sobre o substrato, o dispositivo compreendendo pelo menos uma cabeça de impressão e meios de montagem da cabeça de impressão e substrato, respectivamente, pelos quais o dispositivo 15 compreende meios para prover o substrato com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor do que a do solvente das soluções de molécula de captura. As formas de realização particularmente preferidas do dispositivo serão descritas em mais detalhes abaixo.

A presente invenção também fornece um método para 20 examinar fluidos de analito, tais como sangue humano ou amostras de tecidos, quanto à presença de certas bactérias, vírus e/ou fungos. No método o fluido de analito é forçado ou escoa através de um substrato de acordo com a presente invenção. O fluxo atravessante é possível desde que o material do substrato seja poroso. A ligação do composto biológico alvo é o resultado do 25 escoamento livre e/ou forçado do fluido de amostra através da superfície do substrato de ensaio biológico, isto é, da superfície inferior à superfície superior ou vice versa, e/ou por um fluxo lateral da posição A até a posição B do substrato. Para aumentar as chances de ligação, o fluxo atravessante pode ser repetido diversas vezes. O substrato da presente invenção tem a vantagem adicional de que o número de tais ciclos de bombeamento pode ser menor para uma eficiência de ligação similar.

Como empregado aqui e exceto se de outro modo citado, o termo « ensaio de microformação » designa um ensaio em que um fluido de amostra, preferivelmente uma amostra de fluido biológico (opcionalmente contendo quantidades menores de partículas sólidas ou coloidais suspensas ali) suspeito de conter compostos biológicos alvo está contatando (isto é, escoando sobre ou escoando através) de um substrato sólido biossensor contendo uma multiplicidade de regiões distintas e isoladas através de uma sua superfície, cada uma de ditas regiões tendo uma ou mais sondas aplicadas nela e cada uma de ditas sondas sendo escolhida por sua capacidade de especificamente ligar-se com um composto biológico alvo. Notavelmente, nem todo fluido depositado no substrato precisa ser uma sonda, isto é, ter a capacidade de ligar-se a um analito específico. O ensaio pode também compreender outros fluidos, tais como fluidos usados para fins de calibração, marcadores de grade e assim por diante. Tais fluidos já podem compreender um rótulo.

Como empregado aqui e exceto se de outro modo citado, o termo «analito» ou «composto biológico alvo» designa um composto 20 molecular biológico fixado como um objetivo ou ponto de análise. Inclui compostos moleculares biológicos, tais como mas não limitado a ácidos nucléicos e compostos relacionados (por exemplo, DNAs, RNAs, oligonucleotídeos ou seus análogos, produtos da PCR, DNA genômico, cromossomas bacterianos artificiais, plasmídeos e similares), proteínas e 25 compostos relacionados (por exemplo, polipeptídeos, peptídeos, anticorpos monoclonais ou policlonais, receptores solúveis ou ligados, fatores de transcrição e similares), antígenos, ligandos, haptenos, carboidratos e compostos relacionados (por exemplo, polissacarídeos, oligossacarídeos e similares), fragmentos celulares, tais como fragmentos de membrana, organelas celulares, células intactas, bactérias, vírus, protozoários e similares.

Como empregado aqui e exceto se de outro modo citado, o termo « sonda de captura » designa um agente biológico sendo capaz de ligar- se especificamente com um «composto biológico alvo» ou «analito», quando colocado na presença de ou reagido com dito composto biológico alvo, e usado a fim de detectar a presença de dito composto biológico alvo. As sondas incluem compostos moleculares biológicos, tais como, mas não limitado a ácidos nucléicos e compostos relacionados (por exemplo, DNAs, RNAs, oligonucleotídeos ou seus análogos, produtos de PCR, DNA genômico, cromossomas bacterianos artificiais, plasmídeos e similares), proteínas e compostos relacionados (por exemplo, polipeptídeos, anticorpos monoclonais, receptores, fatores de transcrição e similares), antígenos, ligandos, haptenos, carboidratos e compostos relacionados (por exemplo, polissacarídeos, oligossacarídeos e similares), organelas celulares, células intactas e similares. As sondas podem também incluir materiais específicos, tais como certos biopolímeros aos quais ligam-se compostos alvo.

Como empregado aqui e exceto se de outro modo citado, o termo « rótulo » designa um agente biológico ou químico tendo pelo menos uma propriedade física (tal como, mas não limitado a, radioatividade, 20 propriedade óptica, propriedade magnética) detectável por meios adequados, a fim de permitir a determinação de sua posição espacial e/ou a intensidade da propriedade física detectável, tal como, mas não limitado a moléculas luminescentes (por exemplo, agentes fluorescentes, agentes fosforescentes, agentes quimioluminescentes, agentes eletroluminescentes, agentes 25 bioluminescentes e similares), moléculas coloridas, moléculas produzindo cores sob reação, enzima, contas magnéticas, radioisótopos, ligandos especificamente ligáveis, microbolhas detectáveis por ressonância sônica e similares.

Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes pela e elucidados com referência à(s) forma(s) de realização descrita(s) aqui, tomadas em combinação com os desenhos acompanhantes que ilustram, por meio de exemplo, os princípios da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Nas figuras:

A Fig. 1 ilustra esquematicamente uma formação de teste biológico obtenível por sondas de captura de impressão sobre um substrato de acordo com a presente invenção;

A Fig. 2 ilustra esquematicamente um dispositivo de ensaio biológico provido com um substrato poroso de acordo com a presente invenção;

A Fig. 3 representa uma fotografia de um substrato poroso de acordo com a presente invenção; e

A Fig. 4 ilustra esquematicamente uma distribuição de tamanho de poro aberto de uma forma de realização do substrato poroso de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO

A presente invenção será descrita com relação às formas de realização particulares e com relação a certos desenhos, porém a invenção não 20 é limitada a eles, mas somente pelas reivindicações. Quaisquer sinais de referência nas reivindicações não devem ser interpretados como limitantes do escopo. Os desenhos descritos são somente esquemáticos e não são limitantes. Nos desenhos, o tamanho de alguns dos elementos pode ser exagerado e não desenhado em escala para fins ilustrativos. Onde o termo “compreendendo” é 25 usado na presente descrição e reivindicações, não exclui outros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou definido é usado quando referindo-se a um nome singular, por exemplo “um” ou “uma”, “o”, “a”, este inclui um plural daquele nome, exceto se alguma outra coisa seja especificamente citada. Além disso, os termos primeiro, segundo e terceiro e similares da descrição e das reivindicações são usados para distinção entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma ordem subsequente ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assim usados são 5 intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as formas de realização da invenção descritas aqui são capazes de operar em outras seqüências que não as descritas ou ilustradas aqui.

A Figura 1 mostra uma formação de teste biológico (1) obtida depositando-se, preferivelmente por impressão de jato de tinta, uma 10 pluralidade de sítios de sonda de captura (2) em um substrato poroso (102), tal como uma membrana. De acordo com o método da invenção, o substrato (102) foi tratado com um meio inativante e neste exemplo particular com etileno glicol, antes da impressão dos sítios de captura (2). Nos exemplos mostrados, a formação do teste (1) é coberta por uma configuração de 128 15 sítios (2) compreendendo 43 biofluidos diferentes, impressos em um padrão predefmido. Os sítios (2) são numerados e cada número representa uma única seqüência genética ou contém material de referência. Observa-se que as seqüências genéticas ocorrem em múltiplas duplicatas na formação (1) em locais múltiplos mutuamente distantes. O substrato poroso (102) é ajustado 20 em uma estrutura de suporte (4). O substrato poroso (102) com a estrutura de suporte ou suporte (4) é colocado em um cartucho (5). Uma instalação típica é mostrada na figura 2. Em um alojamento (10), um fluido de amostra (16) para ser analito é provido em uma câmara (15) e pressão é empregada na entrada (3). Esta pressão força o fluido de amostra (16) para baixo através do 25 substrato sólido poroso (102). Uma placa de vidro (7) permite uma análise óptica do substrato sólido (102), se desejado. Os meios de analisar são fornecidos para analisar o substrato sólido (102) quanto à presença de um ou mais compostos biológicos alvo. Ditos meios de analisar (25) podem compreender uma fonte de luz e um trajeto de detecção óptica, uma lente, um filtro, uma câmara digital, etc, a fim de medir o padrão de fluorescência óptica. Outros meios (26) podem estar presentes, por exemplo, para analisar a temperatura dos substratos sólidos, volume do poro preenchido e outros parâmetros monitorados desejáveis. As linhas tracejadas indicam que os 5 meios (25) e (26) podem eventualmente ser combinados em uma única aparelho (por exemplo, um meio de detecção óptica, tal como uma câmara de CCD ou qualquer outro tipo de dispositivo de detecção óptica, câmara esta sendo somente uma possibilidade. Outras possibilidades incluem fotodetectores ou um microscópio). Pode ser feita provisão para ciciar o 10 fluido de amostra (16) numerosas vezes através da câmara (15) e substrato (102). Preferivelmente, o substrato (102) é contínua ou intermitente, porém regularmente umedecido com o fluido de amostra (16). O fluido de analito é analito quanto à presença de certas bactérias, vírus e/ou fungos, forçando-o através do substrato poroso. O escoamento livre e/ou forçado do fluido de 15 amostra através da superfície do substrato de ensaio biológico, isto é, da superfície inferior para superfície superior ou vice versa traz o fluido de analito em contato com as sondas de captura, o que permite ligação do composto biológico alvo a estas sondas de captura capazes de ligarem-se com elas. Mais particularmente, o fluido de amostra (tal como um produto da 20 PCR) contendo as diferentes seqüências genéticas características para o DNA de diferentes bactérias, é trazido em contato com o substrato poroso (102) compreendendo a formação de sítios (2). Diferentes tipos de DNA (seqüências de DNA) aderem às diferentes sondas de captura impressas. Na forma de realização apresentada na figura 1, diferentes sítios são visualisados. 25 Os números 1 a 18 representam 9 diferentes patógenos e 9 resistências. Para confiabilidade da medição, o mesmo material de captura biosseletivo pode ser impresso em quatro diferentes quadrantes (11, 12, 13, 14) de membrana (102). Em cada um dos quadrantes (11, 12, 13, 14), sítios do mesmo número têm diferentes sítios vizinhos, evitando-se que sítios menos intensos (2) não sejam detectados por causa da superexposição de sítios adjacentes (2). Os sítios de calibração de intensidade (Rl A RIO) podem ser impressos na membrana (102), bem como quatro sítios (D) nos cantos da membrana para distribuição de calibração de intensidade sobre a membrana (102). Os sítios 5 de controle da PCR (Pl, P2) também são impressos para validar a própria amplificação de DNA por meio da PCR.

Uma formação de teste biológico de acordo com a invenção, preferivelmente compreende uma quantidade total de cerca de 130 sítios, como mostrado na figura 1, porém pode compreender muitos mais sítios, por exemplo, mais do que 1000. Os diâmetros típicos dos sítios são abaixo de 100

- 300 μηι, porém podem ser até menores, e eles são posicionados em um padrão com um passo de tipicamente menos do que 400 μηι, preferivelmente menos do que 300 μηι. Ditos sítios são preferivelmente impressos em um padrão periódico, por exemplo, na configuração quadrada, retangular ou 15 hexagonal. Também uma grande quantidade de diferentes biofluidos (preferivelmente 100 ou mais) é tipicamente impressa na membrana (102).

De acordo com a invenção um substrato de ensaio biológico poroso é fornecido compreendendo uma ou mais sondas de captura capazes de ligarem-se especificamente a um analito alvo, em que a concentração 20 média das sondas de captura dos poros com um tamanho maior do que O50 da distribuição de tamanho de poro do substrato é pelo menos igual à concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50. Falando em termos gerais, fomecendo-se um substrato em que, em média, os poros maiores contenham uma concentração mais elevada de 25 sondas de captura, uma eficiência de ligação aumentada do substrato é obtida, em comparação com os substratos de ensaio biológico conhecidos. Os substratos de ensaio biológico são geralmente produzidos de material poroso, tendo poros internos com uma distribuição de tamanho de poro. A figura 3 mostra um micrografia de um substrato de ensaio biológico adequado, tendo uma ampla distribuição de tamanho de poro preferida. Pela figura 3 é facilmente deduzido que um substrato poroso típico compreende tamanhos de poro aberto variando de alguns nanômetros (nm) a micrômetros (μπι). Quando provendo-se a membrana conhecida com sondas de captura, ditas 5 sondas preferivelmente ligam-se às superfícies internas dos poros menores, devido à forças capilares, evaporação do solvente e devido aos efeitos de tensão da superfície a.o. O transporte do escoamento do fluido de analito, especialmente no caso de uma membrana úmida, entretanto, ocorre mais facilmente através dos poros maiores, uma vez que a resistência para escoar 10 através destes poros é menor. Uma vez que, em média, os poros maiores do substrato conhecido compreendem menos moléculas de sonda de captura, a probabilidade para ligação específica de moléculas de sonda de captura com o fluido de analito será menor do que a esperada e, portanto, uma eficiência de ligação diminuída ocorrerá. Os inventores planejaram um método para 15 produzir, pela primeira vez, um substrato em que, em média, os poros maiores compreendem mais moléculas de sonda de captura do que os poros menores e, portanto, uma eficiência de ligação aumentada e método de triagem são obtidos.

No contexto da presente invenção e com referência a figura 4, 20 as dimensões Oio, O50 e O90 são tamanhos característicos da distribuição de tamanho de poro. Como indicado na figura 4, a distribuição de tamanho de poro é representada por um gráfico de alguma medida 30, representada no eixo-y, e representativa da quantidade ou da superfície relativa ou fração de volume dos poros de um certo tamanho, em relação ao tamanho do poro 25 aberto 31, representado no eixo-x. A medida 30 naturalmente depende da técnica de medição particular empregada para avaliar a distribuição de tamanho de poro. As dimensões características Oi0, O50 e 0% são definidas de modo que 10 % em volume dos poros sejam menores do que ou igual a Ojo, 50 % em volume dos poros sejam menores do que ou igual a O50 e 90 % em volume dos poros sejam menores do que ou igual a O90. Os diferentes métodos por si conhecidos podem ser usados na avaliação da porosidade e distribuição de tamanho de poro dos substratos porosos. Métodos bem conhecidos para medir e/ou quantificar o tamanho do poro e a distribuição de tamanho de 5 poro, incluem técnicas de análise de formação de imagem, adsorção gasosa, bem como métodos de intrusão, tais como métodos de intrusão de mercúrio. O método apropriado para uso depende da média do tamanho do poro juntamente com outros fatores, intrusão de mercúrio, por exemplo, sendo o método mais apropriado para medir poros grandes. Estes métodos são bem 10 conhecidos e uma pessoa hábil na técnica será capaz de selecionar, sem quaisquer dificuldades, o método de medição apropriado. A concentração de sondas de captura dos poros pode também ser avaliada por métodos bem conhecidos na técnica. Um método adequado inclui o uso combinado de técnicas de formação de imagem (microscopia óptica e/ou eletrônica) com 15 métodos de rotulagem padrão. Usando-se tipicamente rótulos fluorescentes ou radioativos ou rótulos compreendendo nanopartículas metálicas, permite-se detectar as sondas de captura e sua concentração média por um microscópio de fluorescência (confocal), por uma placa de imagem de raio-X, e/ou sob um microscópio eletrônico, respectivamente.

Em uma forma de realização preferida do substrato de ensaio

biológico poroso, a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho maior do que O5o é de pelo menos duas vezes a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50. Uma forma de realização até mais preferida do substrato de ensaio biológico 25 poroso é caracterizada pelo fato de que a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho maior do que O50 é de pelo menos cinco vezes a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50. Como se tomará evidente aqui abaixo, a concentração média das sondas de captura dos poros maiores pode ser influenciada pela porcentagem volumétrica dos poros menores que não são acessíveis (temporariamente) quando provendo o substrato com a solução de sonda de captura.

A melhoria observada na eficiência de ligação do substrato da 5 invenção quando comparada ao estado do substrato da técnica é maior quando o substrato por si tem uma relativamente ampla distribuição de tamanho de poro. Um particularmente preferido substrato de ensaio biológico poroso, portanto, tem uma distribuição de tamanho de poro de modo que (O90 - Oi0) > 2 O50, e ainda mais preferido de modo que (O9o - Oio) ^ 5 O50. o outro 10 substrato de ensaio biológico preferido tem uma distribuição de tamanho de poro de modo que (O90 - O50) > 2 O50 e (O50 - O)0) > 2 Oi0.

Os substratos porosos adequados podem incluir uma rede tendo uma pluralidade de poros, aberturas e/ou canais de várias geometrias e dimensões. Os substratos porosos podem ser nanoporosos ou microporosos, 15 isto é, o tamanho médio dos poros, aberturas e/ou canais (caracterizados pelo valor de O50) podem adequadamente ser compreendidos entre cerca de 0,05 μηι e cerca de 10,0 μηι. Em uma forma de realização este tamanho de poro médio pode ser entre 0,1 μηι e 3,0 μηι. Em outra forma de realização, o tamanho de poro médio pode ser entre cerca de 0,2 e 1 μιη. O termo 20 “porosidade” geralmente significa ou inclui a relação de volume de todos os poros ou vazios em um material com relação ao volume do material todo. Em outras palavras, porosidade é geralmente a proporção do volume não-sólido para o volume total de material. No sentido da presente invenção, o termo “porosidade aberta” (também chamada porosidade eficaz) especialmente 25 significa ou inclui a fração do volume total em que o escoamento de fluido está efetivamente ocorrendo. Visto que a porosidade aberta sozinha é de importância no contexto do presente pedido (poros fechados não são acessíveis às sondas de captura e fluidos de amostra), os termos “porosidade” e “porosidade aberta” são usados intercambiavelmente no presente pedido, exceto se explicitamente citado de outra maneira. No sentido da presente invenção, porosidade é especialmente uma fração entre 0% em volume e 100 % em volume. De acordo com uma forma de realização preferida, dita porosidade está variando de 20 % em volume a 98 % em volume, mais 5 preferivelmente de 30 % em volume a 80 % em volume e mais preferivelmente de 40 % em volume a 70 % em volume.

De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o material de substrato poroso é escolhido do grupo compreendendo

- polímeros amorfos, preferivelmente do grupo

compreendendo PC (policarbonato), PS (poliestireno), PMMA (polimetilmetacrilato), poliacrilatos, poliéteres, éster de celulose, nitrato de celulose, acetato de celulose, celulose ou suas misturas,

- polímeros semicristalinos, preferivelmente do grupo compreendendo PA (poliamida = materiais de náilon), PTFE

(politetrafluoroetileno), politrifluoroetileno, PE (polietileno), PP (polipropileno), ou suas misturas,

- borrachas, preferivelmente do grupo compreendendo PU (poliuretano), poliacrilatos, polímeros baseados em silano, tais como PDMS

(polidimetilsiloxano) ou suas misturas,

- géis (= redes de polímero com matriz de solvente de fluido), preferivelmente do grupo compreendendo gel de agarose, gel de poliacrilamida ou suas misturas

- metais (tais como alumínio, tantálio, titânio), ligas de dois ou mais metais, metais dopados ou ligados, óxidos metálicos, óxidos de liga

metálica ou suas misturas

ou suas misturas. Estes materiais mostram ser materiais adequados dentro da presente invenção.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, a área de superfície interna do material de substrato poroso sólido é, por um fator X, maior do que o tamanho desta área, por meio do que o fator X é > 100. De acordo com outra forma de realização, o fator X é > 1000, de acordo com uma forma de realização alternativa X é > 10000 e de acordo com ainda outra forma de realização X é 100000.

A espessura do substrato não é um aspecto limitante desta invenção e pode variar de cerca de 50 nm até cerca de 3 μηι ou mais elevada, por exemplo, até 1 mm. Se a membrana for de posicionamento livre, por exemplo, no caso de um dispositivo de fluxo atravessante (como descrito 10 acima), a espessura do substrato pode variar de 1 μηι a centenas de μηι, por exemplo, de 20 μηι a 400 μιη, ou de 50 μηι a 200 μηι.

A forma e ou tamanho do substrato, por exemplo, a membrana, não são considerados serem aspectos limitantes da presente invenção. Podem ser circulares, por exemplo, com um diâmetro variando entre cerca de 3 e 15 mm, porém qualquer outra forma de substrato (retangular, quadrada, oval, ...) e/ou tamanho pode também ser adequada.

As sondas usadas na presente invenção devem ser adequadamente escolhidas quanto a sua afinidade para com os compostos biológicos alvo ou pelas modificações pertinentes de ditos compostos 20 biológicos alvo, suspeitos de estarem presentes na amostra a ser analisada. Por exemplo, se os compostos biológicos alvo forem DNA, as sondas podem ser, mas não são limitadas a, oligonucleotídeos sintéticos, seus análogos ou anticorpos específicos. Um exemplo não limitante de uma modificação adequada de um composto biológico alvo é um composto biológico alvo 25 substituído por biotina, em cujo caso a sonda pode conter uma funcionalidade avidina.

Em uma forma de realização particular da presente invenção, várias diferentes sondas são depositadas dentro e/ou sobre o substrato. Em uma forma de realização mais específica, múltiplas diferentes sondas são localizadas em um modo de formação em locais fisicamente distintos ao longo de uma superfície de dito substrato sólido, a fim de permitir medição de diferentes compostos biológicos alvo em paralelo. Esta forma de realização é geralmente chamada de microformação.

5 A fim de mais facilmente suportar a detecção e identificação

subsequentes, um ou mais sítios adicionais (por exemplo, para calibração de intensidade e/ou detecção de posição), podem ser localizados igualmente sobre a superfície do material de substrato. A localização pode ser adequadamente realizada por quaisquer métodos conhecidos na técnica, tais 10 como mas não limitados a impressão de jato de tinta, localização piezolétrica, impressão de contato robótico, micropipetagem e similares. Seguindo-se a localização, as sondas tomam-se imobilizadas sobre a superfície do material de substrato espontaneamente, devido às propriedades (por exemplo, via ativação) inerentes ou adquiridas do substrato (por exemplo, membrana) ou 15 através de uma etapa de tratamento físico adicional (tal como, mas não limitado a reticulação, por exemplo, através de secagem, aquecimento, uma etapa de tratamento de temperatura, ou através de exposição por uma fonte de luz).

De acordo com a invenção, é fornecido um método para 20 produzir um substrato de ensaio biológico, em que uma pluralidade de soluções de molécula de captura é liberada de pelo menos uma cabeça de impressão sobre o substrato poroso, o método compreendendo a etapa de prover o substrato com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação mais baixa e/ou um ponto de ebulição mais elevado do que o do solvente das 25 soluções de molécula de captura. Tratando-se o substrato com um meio inativante com as características indicadas, uma eficiência de ligação melhorada e, consequentemente, um método de triagem aperfeiçoado são obtidos.

Embora os inventores ignorem exata razão para a melhoria, a seguinte tentativa de explicação é oferecida. Os substratos de ensaio biológico são geralmente produzidos de material poroso, tendo poros internos com uma distribuição de tamanho de poro. Quando provendo-se a membrana conhecida com soluções de molécula de captura, é plausível que as sondas de captura 5 preferivelmente liguem-se às superfícies internas dos poros menores. De fato, pensa-se que o solvente da molécula de captura evapore primeiro dos poros maiores, aumentando localmente desse modo a concentração das sondas de captura nos poros menores. Em particular, quando o a membrana é de carga neutra, uma força motriz, que faria com que as sondas de captura aderissem à 10 superfície da membrana, está ausente. Durante a evaporação do solvente da solução da molécula de captura, as moléculas de captura dissolvidas aglomeram-se de modo crescente no fluido remanescente, até formarem um gel. Além disso, devido às forças capilares e tensão de superfície, o fluido remanescente tem uma preferência pelos poros menores. Geleificação, 15 sedimentação (das moléculas nas paredes dos poros) e finalmente cristalização e/ou imobilização, portanto, ocorrem preferivelmente nos poros menores. O transporte de fluxo do fluido de analito ocorre, entretanto, preferivelmente através dos poros maiores. Uma vez que, em média, os poros maiores compreendem menos moléculas de sonda de captura, resultará em 20 uma probabilidade diminuída para ligação específica de moléculas de sonda de captura com o fluido de analito durante o fluxo atravessante e, portanto, em uma eficiência de ligação diminuída. De acordo com a invenção, tratando- se o substrato com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor do que aquela do solvente da solução de molécula de captura, acredita-se que 25 os poros menores do substrato sejam efetivamente (pelo menos parcialmente e/ou temporariamente) carregados ou bloqueados pelo meio inativante e permaneçam assim por um tempo prolongado e, preferivelmente, pelo menos até proverem o substrato com a solução de molécula de captura e/ou forçarem

o fluido de analito através da membrana. Em um método preferido de acordo com a invenção, o substrato é provido com o meio inativante antes de liberar as soluções de molécula de captura sobre o substrato. Embora não essencial para o método de acordo com a invenção, o pré-tratamento do substrato com o meio 5 inativante geralmente produz uma eficiência de ligação mais elevada do que o tratamento do substrato com o meio inativante durante ou após liberar as soluções de molécula de captura sobre o substrato.

Em outro método preferido de acordo com a invenção, o substrato é provido com o meio inativante dentro de um quadro de tempo entre 5 segundos a 90 minutos, antes de liberar as soluções de molécula de captura sobre o substrato. Mesmo mais preferido é um quadro de tempo entre segundos a 60 minutos. Muitíssimo preferido é um quadro de tempo entre

1 minuto a 30 minutos.

De acordo com a invenção, qualquer meio que evapore mais 15 devagar ou ferva em uma temperatura mais elevada do que o solvente da solução de molécula de captura pode ser usado no método de acordo com a invenção. O meio pode ser gasoso ou fluido. Em uma forma de realização preferida do método, o meio inativante compreende um fluido. Tal fluido pode facilmente ser aplicado ao substrato por qualquer método adequado, tal 20 como por técnicas de impressão ou por revestimento por imersão. Particularmente, líquidos inativantes adequados compreendem um composto de alquil álcool, éteres e/ou derivados deles, ou suas misturas. Os exemplos adequados incluem, por exemplo, etileno glicol, dietileno glicol, trietileno glicol, tetraetileno glicol e polietileno glicol em geral, e/ou quaisquer suas 25 misturas com água. Também (poli)propileno glicol, propileno glicol, dipropileno glicol, etc. podem vantajosamente ser usados, os últimos sendo o solventes menos polares em comparação ao polietileno glicol, por exemplo, que é polar. Outros exemplos adequados incluem dibutiltereftalato ou dioctilftalato. Alguns líquidos inativantes podem requerer uma etapa de lavagem adicional.

Quando realizando-se o método preferido de acordo com a invenção, os poros menores do substrato são pelo menos parcialmente carregados com um meio inativante (temporariamente) diretamente antes da 5 etapa de impressão real das moléculas de captura. O meio inativante é escolhido de modo que evapore mais devagar e preferível significativamente mais devagar do que o solvente usado para impressão das moléculas de captura, ou evapore em uma temperatura mais elevada (ponto de ebulição mais elevado). A solução das moléculas de captura portanto preferivelmente 10 emprega um solvente tendo uma solubilidade melhor do que a do meio inativante. Dentro do contexto da presente invenção, uma primeira taxa de evaporação é considerada significativamente mais baixa do que uma segunda taxa de evaporação quando a primeira taxa de evaporação é pelo menos 10 % menor do que a segunda taxa de evaporação, preferivelmente pelo menos 30 15 % menor e mais preferivelmente pelo menos 50 % menor. Embora o método de acordo com a invenção não seja limitado a elas, mais soluções de molécula de captura usadas atualmente são soluções aquosas. Isto significa que o meio inativante adequado neste caso evapora em um ritmo mais lento do que a água, nas mesmas condições de temperatura e pressão. De acordo com os 20 princípios físicos gerais, as forças capilares são inversamente proporcionais ao raio do poro e, portanto, são maiores nos poros menores. A resistência ao fluxo, entretanto, é inversamente proporcional ao raio do poro à quarta potência e, portanto, eleva-se muito mais rápido com a diminuição do diâmetro do poro do que as forças capilares. Portanto, levará mais tempo 25 preencher os poros do substrato com meio inativante e especialmente os poros menores. Um compromisso, portanto, existe entre o tempo de tratamento do substrato com o meio inativante e a porcentagem volumétrica (% em volume) dos poros que foram carregados com o meio inativante. Quanto mais tempo o líquido inativante permanecer no ou entrar em contato com o substrato poroso, mais poros eventualmente tomar-se-ão carregados com o líquido inativante.

Um método preferido de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato de que o substrato é provido com o meio inativante de modo que cerca de 50 % em volume dos poros do substrato são carregados com o meio inativante. Preferivelmente mais do que 80 % em volume dos poros são carregados com o meio inativante. Em uma forma de realização mesmo mais preferida do método, o substrato é provido com o meio inativante, de modo que substancialmente todos os poros abertos do substrato são preenchidos com o meio inativante.

A fim de acelerar o mesmo processo ainda, um tratamento adicional (opcional) é realizado de acordo com a invenção, tal como lavagem, uma etapa de tratamento de temperatura, exposição à luz ou uma exposição a um fluxo de gás.

Preferivelmente, após pelo menos parte dos poros do substrato poroso ter sido preenchida com o meio inativante, o substrato é provido com uma formação de sondas de captura de biofluidos adequados. De acordo com a invenção, uma pluralidade de soluções de molécula de captura são liberadas de pelo menos uma cabeça de impressão sobre o substrato poroso, usando-se um dispositivo de jato de tinta adequado para este fim. Quando o gotícuias das soluções de molécula de captura atingem a superfície do substrato, pelo menos parte do material das gotículas é absorvida pela estrutura porosa do substrato, isto é, entra pelo menos um pouco nos poros do substrato.

Um método particularmente preferido de acordo com a invenção compreende uma outra etapa de submeter o substrato a um tratamento, de modo que parte do meio inativante seja evaporado do substrato antes da liberação das soluções de molécula de captura sobre o substrato. O tratamento pode, por exemplo, compreender a aplicação de uma corrente de ar e/ou outro meio gasoso sob pressão. A aplicação de tal corrente faz com que os poros maiores abram-se primeiro, isto é, liberem qualquer substância - tal como meio inativante - presente aqui. De fato, as forças capilares são menores para estes poros (maiores). Após pelo menos um pouco do líquido inativante ser evaporado, as sondas de captura são impressas sobre o 5 substrato. Devido às diferenças na taxa de evaporação entre o solvente da solução de molécula de captura e meio inativante, as moléculas de captura preferivelmente aderem e/ou tomam-se aderidas à superfície interna dos poros maiores. Visto que o analito, também preferivelmente atravessa os poros maiores quando é bombeado através/ao longo do substrato, esta medida 10 melhora a eficiência da hibridização. O método da presente invenção provê controle aperfeiçoado sobre a distribuição do fluido de analito sobre e/ou dentro do substrato poroso. O método, além disso, aumenta a probabilidade de captura do fluxo de biofluido igualando-se os poros (com base em uma seleção de tamanho) onde as sondas de captura são preferivelmente 15 localizadas com os poros, em que o fluido de analito está preferivelmente fluindo.

No método de acordo com a invenção, qualquer substrato tendo qualquer grau de porosidade pode, em princípio, ser usado. Os substratos preferidos incluem substratos porosos com uma ampla distribuição 20 de tamanho de poro. Os substratos mesmo mais preferidos incluem aqueles tendo morfologias de porosidade compreendendo poros interconectados e/ou multidirecionais. Tais substratos preferidos geralmente exibem diferenças no fluxo de um certo meio através deles, dependendo de se o substrato e o meio são seco-úmido, úmido-úmido ou úmido-seco, respectivamente. Uma espécie 25 preferida de um substrato compreende uma membrana de um polímero adequado. As membranas porosas multi e unidirecionais são conhecidas na técnica, porém não em relação ao método de acordo com a invenção, e são comercialmente disponíveis. Além disso, as membranas carregadas e supercarregadas, e/ou quimicamente funcionalizadas são preferivelmente empregadas de acordo com a invenção. A invenção também refere-se a um dispositivo de jato de tinta para produzir tal substrato de ensaio biológico e a um substrato de ensaio biológico obtenível pelo método. O dispositivo de jato de tinta de acordo com a invenção compreende meios de montagem para cabeça de impressão e substrato, respectivamente, por meio do que o dispositivo compreende meios para prover o substrato com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor do que aquela do solvente das soluções de molécula de captura. Em uma forma de realização preferida, os meios para prover o substrato com um meio inativante compreendem uma cabeça de impressão. Um dispositivo de jato de tinta ainda mais preferido compreende outros meios para medir a quantidade de meio inativante presente no substrato, muitíssimo preferido a % em volume dos poros no substrato, carregado com meio inativante. Além disso, dito dispositivo compreende, de acordo com uma forma de realização preferida, meios de controlar a taxa de evaporação de ditos fluidos impressos, especialmente de dito fluido inativante e dito solvente de impressão do fluido de sonda de captura, controlando-se a temperatura local, fluxo e geometria do gás sobre o topo de dito substrato.

A substância compreendendo moléculas biologicamente ativas é preferivelmente dissolvida em uma solução. Esta solução é tipicamente um fluido, semelhante a água ou diferentes tipos de álcool, e pode também conter quantidades pequenas de aditivos, por exemplo, para ajustar-se à tensão de superfície, viscosidade ou ponto de ebulição, a fim de otimizar as características de impressão, formação de sítios, vida em prateleira dos biofluidos e assim por diante.

Embora a presente invenção tenha sido ilustrada e descrita com relação às formas de realização particulares e com referência a certos desenhos e descrição precedentes, tal ilustração e descrição são para ser consideradas ilustrativas ou exemplares e não restritivas. A invenção não é limitada às formas de realização descritas. Em vez disso, a impressora de jato de tinta de acordo com a presente invenção pode ser usada para qualquer colocação de precisão das gotículas sobre as membranas. É particularmente adequada para a produção de biossensores para diagnósticos moleculares. Os 5 diagnósticos incluem detecção rápida e sensível de proteínas e ácidos nucléicos em misturas biológicas complexas, tais como sangue ou saliva, para teste on-site e para diagnósticos em laboratórios centralizados. Outras aplicações são em diagnósticos médico (diagnóstico de DNA/ proteína para cardiologia, doença infecciosa e oncologia), alimentar e ambiental.

Claims (20)

1. Substrato de ensaio biológico poroso adequado para detectar pelo menos um analito em pelo menos um fluido de amostra, caracterizado pelo fato de compreender uma ou mais sondas de captura capazes de ligarem- se especificamente a pelo menos um analito alvo, em que a concentração média das sondas de captura dos poros, com um tamanho maior do que O5o da distribuição de tamanho de poro do substrato, é pelo menos igual à concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O5o·

2. Substrato de ensaio biológico poroso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato da concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho maior do que O5o ser de pelo menos duas vezes a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50, preferivelmente pelo menos cinco vezes a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que O50.

3. Substrato de ensaio biológico poroso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato da distribuição de tamanho de poro ser de modo que (O90 - O10) ^ 2 O5o, preferivelmente de modo que (O90 - O!0) > 5 O50.

4. Substrato de ensaio biológico poroso de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato das faixas de porosidade serem de 20 % em volume a 98 % em volume, preferivelmente de 30 % em volume a 80 % em volume, mais preferivelmente de 40 % em volume a 70 % em volume.

5. Método para produzir um substrato de ensaio biológico, em que uma pluralidade de soluções de molécula de sonda de captura são liberadas de pelo menos uma cabeça de impressão sobre o substrato poroso, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de prover o substrato com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor do que a do solvente das soluções de molécula de sonda de captura, em que o substrato é provido com o meio inativante antes de liberação das soluções de molécula de sonda de captura sobre o substrato.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo de tempo entre 5 segundos a 90 minutos, antes de liberação das soluções de molécula de captura sobre o substrato.

7. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de dito quadro de tempo ser entre 30 segundos e 60 minutos, preferivelmente entre 1 minuto e 30 minutos.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo fato do substrato ser provido com o meio inativante de modo que cerca de 50 % em volume dos poros abertos do substrato serem preenchidos com o meio inativante, preferivelmente de modo que cerca de 80% em volume dos poros abertos do substrato são preenchidos com o meio inativante, mais preferivelmente de modo que substancialmente todos os poros abertos do substrato são preenchidos com o meio inativante.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 - 8, caracterizado pelo fato de compreender a etapa adicional de submeter o substrato a um tratamento, de modo que parte do meio inativante seja evaporada do substrato antes de liberação das soluções de molécula de captura sobre o substrato.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 - 9, caracterizado pelo fato do meio inativante compreender um líquido.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato do líquido inativante compreender um alquil álcool ou uma sua mistura.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 - 11, caracterizado pelo fato das soluções de molécula de captura compreenderem um reagente bioquímico e/ou um oligonucleotídeo, e/ou um polipeptídeo e/ou uma proteína, e/ou uma célula e/ou (partes de) RNA/PNA/LNA.

13. Substrato de ensaio biológico poroso, caracterizado pelo fato de ser obtenível pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 5-12, dito substrato compreendendo uma ou mais sondas de captura capazes de ligarem-se especificamente a um analito alvo, em que a concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho maior do que O50 da distribuição de tamanho de poro de substrato é pelo menos igual à concentração média das sondas de captura dos poros com um tamanho menor do que o d50.

14. Método para examinar fluidos de analito, tais como sangue humano ou amostras de tecido, quanto a presença de certas bactérias, vírus e/ou fungos, caracterizado pelo fato do fluido de analito ser forçado através ou sobre um substrato como definido em qualquer uma das reivindicações 1-4.

15. Método para examinar fluidos de analito, tais como sangue humano ou amostras de tecido, quanto a presença de certas bactérias, vírus e/ou fungos, caracterizado pelo fato do fluido de analito ser forçado através ou sobre um substrato, obtido por um método como definido em qualquer uma das reivindicações 5-12.

16. Dispositivo de jato de tinta para produzir um substrato de ensaio biológico liberando-se uma pluralidade de substâncias sobre o substrato, caracterizado pelo fato de compreender pelo menos uma cabeça de impressão e meios de montagem para cabeça de impressão e substrato, respectivamente, por meio do que o dispositivo compreende meios para prover o substrato com um meio inativante tendo uma taxa de evaporação menor do que aquela do solvente das soluções de molécula de captura, em que o dispositivo adicionalmente compreende meio para medir a quantidade de meio inativante presente no substrato.

17. Dispositivo de jato de tinta de acordo com a reivindicação .16, caracterizado pelo fato do meio para prover o substrato com um meio inativante compreender uma cabeça de impressão.

18. Dispositivo de jato de tinta de acordo com a reivindicação 16 - 17, caracterizado pelo fato de ainda compreender meios para medir a quantidade de meio inativante presente no substrato.

19. Dispositivo de jato de tinta de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 - 18, caracterizado pelo fato de ainda compreender meios para medir a % em volume de poros no substrato carregado com meio inativante.

20. Dispositivo de jato de tinta de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato do dispositivo ainda compreender meios para controlar a taxa de evaporação do meio inativante e/ou o solvente de sonda de captura.