BRPI0716614A2 - Uso de peptídeos do tipo bnp para a estratificação de terapia com agentes de estimulação eritropoiética - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE PEPTÍDEOS DO TIPO BNP PARA A ESTRATIFICAÇÃO DE TERAPIA COM AGENTES DE ESTIMULAÇÃO ERITROPOIÉTICA".

A presente invenção refere-se ao diagnóstico do risco de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de medicação com agentes de estimulação eritropoiética. A presente invenção refere-se ainda à otimização da dosagem dos agentes de estimulação eritropoiética (ESAs) em relação ao risco de sofrer uma complicação cardiovascular.

Uma meta da medicina moderna é fornecer regimes de trata- mento personalizados ou individualizados. Estes são regimes de tratamento que levam em consideração as necessidades ou os riscos individuais do pa- ciente, por exemplo, através da escolha de uma medicação particular ou de uma dosagem particular de uma medicação produzida sob encomenda para a necessidade do paciente individual. Os agentes de estimulação eritropoiética (ESAs) são administra-

dos para tratar distúrbios distintos, particularmente para tratar anemia. A a- nemia é um distúrbio comum, em que o número de eritrócitos (as células sangüíneas vermelhas que carregam oxigênio) é reduzido. De forma notável, a anemia é uma co-morbidade freqüente no câncer e na doença renal (tal como, por exemplo, em pacientes com diabetes). Pacientes anêmicos so- frem freqüentemente complicações cardiovasculares. Estas complicações ocorrem provavelmente porque o sangue nos pacientes anêmicos pode car- regar apenas uma quantidade reduzida de oxigênio, que por sua vez faz com que o coração bombeie o sangue mais rapidamente com a finalidade de satisfazer a demanda de oxigênio do corpo. Isto pode levar ao crescimento do ventrículo esquerdo e à hipertrofia do ventrículo esquerdo. Assim, pacien- tes anêmicos freqüentemente sofrem complicações cardiovasculares.

Foi percebido, que o tratamento com eritropoietina (EPO) pode ser utilizado para tratar anemia em pacientes com falência cardíaca crônica e leva a uma melhora significativa na função cardíaca e dos sintomas (van der Meer, P., Voors, A.A., Lipsic, E. e outros (2004). Erythropoietin in cardio- vascular diseases. European Heart Journal, vol. 25, pp. 285-291). O benefí- cio do tratamento com a EPO é provavelmente causado por um aumento do número de eritrócitos, que aumenta a concentração de hemoglobina no san- gue e assim permite que o sangue carregue mais oxigênio. Consequente- mente, o esforço no coração é reduzido, o que pode levar à regressão da hipertrofia do ventrículo esquerdo e pode ainda prevenir o seu desenvolvi- mento.

É sabido que um aumento do número de eritrócitos até níveis anormais, tal como no caso do uso excessivo da EPO por atletas, pode cau- sar complicações cardiovasculares (Dhar, R,. Stout, C.W., Link, M.S., Ho- moud, M.K. e outros (2005). Cardiovascular toxicities of performance- enhancing substances in sports. Mayo Clinic Proc, vol. 80, pp. 1307-1315, erratum in Mayo Clinic Proc, janeiro de 2006, vol. 81, p. 133). Em contraste a tal uso excessivo da EPO, foi considerado anteriormente como sendo seguro administrar ESAs em uma dosagem requerida para corrigir a anemia até ní- veis normais ou quase normais de hemoglobina. Tais dosagens ou níveis- alvo de hemoglobina são atualmente considerados como sendo benéficos.

Entretanto, muito embora a medicação com EPO tenha se tor- nado um tratamento rotineiro eficiente da anemia, muitos pacientes anêmi- cos ainda morrem de complicações cardiovasculares. Por outro lado, muitos pacientes com doenças cardiovasculares são anêmicos.

Os peptídeos do tipo BNP (por exemplo, o peptídeo natriurético cerebral (BNP) e/ou seu fragmento pró-peptídico N-terminal (NT-proBNP)) e o uso dos mesmos como marcadores moleculares ou bioquímicos para o diagnóstico de certas complicações cardiovasculares são conhecidos. Na WO 02/089657, foi sugerido medir o peptídeo natriurético cerebral (BNP) para diagnosticar infato do miocárdio. Na WO 02/083913 foi sugerido utilizar o BNP para prever a morbidade ou a mortalidade em médio prazo em paci- entes com falência cardíaca congestiva, infato do miocárdio, infato do mio- cárdio com ST elevado ou síndromes coronarianas agudas sem ST elevado. Entretanto, tal uso não se direciona ao problema de complicações cardio- vasculares em pacientes que sofrem de anemia.

Portanto, ainda há uma necessidade de se dirigir ao problema das complicações cardiovasculares em pacientes que sofrem de anemia e de melhorar o tratamento da anemia.

O objetivo da invenção é atingido através de um método para o diagnóstico do risco de um paciente de sofrer uma complicação cardiovascu- lar como uma conseqüência de medicação, particularmente medicação futu- ra, com um agente de estimulação da eritropoiese (ESA), que compreende as etapas de:

a) medida do nível de um peptídeo do tipo BNP ou uma variante do mesmo em uma amostra do paciente, b) diagnóstico do dito risco através da comparação do nível me-

dido do peptídeo do tipo BNP ou de uma variante do mesmo a pelo menos um nível de referência.

O método pode também compreender a etapa de obtenção de um fluido corporal ou de uma amostra de tecido do paciente. Preferencial- mente, o nível é determinado em uma amostra de fluido corporal ou de teci- do do paciente.

A invenção fornece métodos e meios, particularmente marcado- res, que permitem diagnosticar o risco de sofrer uma complicação cardio- vascular como uma conseqüência de medicação com ESAs. Mais particu- larmente, foi descoberto no contexto da invenção que o nível medido de um peptídeo do tipo BNP é capaz de indicar o grau do risco de sofrer uma com- plicação cardiovascular como uma conseqüência de medicação com ESAs. Assim, a invenção fornece métodos e meios para identificar pacientes em risco antes de receberem a medicação com ESAs. Particularmente, a inven- ção permite identificar pacientes que possuem um maior risco cardiovascular se receberem uma dosagem de ESA suficiente para aumentar o nível de hemoglobina até valores normais ou próximos aos normais. A invenção pode ser vantajosamente utilizada particularmente para pacientes que não possu- em histórico conhecido de uma complicação cardiovascular. Os métodos e os meios são simples, fáceis, baratos e adequados para o uso por médicos gerais e/ou que não são cardiologistas. A invenção fornece ainda os usos correspondentes de qualquer um dos marcadores, os meios e os métodos de acordo com a invenção.

A invenção fornece ainda métodos e meios que permitem otimi- zar a dosagem (que é definida como o nível-alvo de Hb, ver a definição da dosagem adicionalmente a seguir) de ESAs em relação ao risco cardiovas- cular. A invenção fornece métodos e meios para determinar um nível-alvo de hemoglobina (e assim uma dosagem de ESA) que é farmaceuticamente efi- ciente e ao mesmo tempo evita efeitos colaterais indesejados, em particular, complicações cardiovasculares. Assim, para cada indivíduo, pode ser deter- minado um nível-alvo mais benéfico de hemoglobina ou dosagem de ESA. No curso da invenção foram feitas várias descobertas: Foi ob-

servado que o tratamento com ESA pode estar associado com a causa das complicações cardiovasculares em dosagens ou níveis-alvo de hemoglobina que foram previamente considerados como sendo terapeuticamente benéfi- cos. Assim, há complicações cardiovasculares que ocorrem como uma con- seqüência da medicação com ESA. Esta observação era inesperada, uma vez que o tratamento com ESAs em pacientes anêmicos foi previamente considerado ao invés de reduzir complicações cardiovasculares através da redução do esforço sobre o coração.

Além disso, foi observado no curso da invenção que as compli- cações cardiovasculares como uma conseqüência de medicação com ESA ocorrem principalmente em um pequeno subconjunto de pacientes. Além disso, foi também observado que este subconjunto de pacientes pode ser identificado de acordo com o nível de um peptídeo do tipo BNP no paciente. Tais pacientes podem ser considerados como sendo pacientes em risco. Assim, a presente invenção não somente chama atenção aos riscos associ- ados com dosagens particulares de ESAs1 mas fornece ainda instruções em relação a quais pacientes estão em risco particular. Consequentemente, a presente invenção possibilita o tratamento com dosagens maiores de ESAs (ou níveis-alvo mais altos de hemoglobina) em pacientes regulares enquanto permite identificar pacientes em risco. Tais pacientes em risco podem ser preferencialmente tratados com dosagens mais baixas de ESA (ou níveis- alvo mais baixos de hemoglobina) ou sem ESA com a finalidade de reduzir ou evitar seu risco de sofrer uma complicação cardiovascular. Entretanto, tal decisão está a critério do médico responsável como que incluirá a relação risco/benefício para o paciente particular em sua consideração.

Uma vez que a presente invenção permite o diagnóstico do risco antes que a medicação com ESA seja iniciada ou antes de uma dosagem de ESA ser aumentada, a dosagem da medicação pode ser otimizada, particu- larmente aumentada, para maximizar o benefício terapêutico em cada paci- ente enquanto evita a complicação cardiovascular.

Assim, a presente invenção permite uma decisão cuidadosa e informada em relação ao fato de aplicar a medicação com ESA, à dosagem da mesma e/ou à providência de um tratamento de acompanhamento ou um monitoramento adequado.

A presente invenção é particularmente vantajosa para os médi- cos gerais, para os médicos especializados e para as repartições, departa- mentos ou clínicas especializadas, que freqüentemente não possuem aces- so ao exame cardiológico extensivo por cardiologistas. Os exemplos são especialistas em diabetes, oncologistas, nefrologistas. Outros exemplos são clínicas ou departamentos de ambulatório oncológicos, nefrológicos ou de diabetes. A presente invenção fornece meios e métodos para tais não- cardiologistas para a verificação simples e confiável de pacientes que estão em risco de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de medicação com ESA.

Os agentes de estimulação da eritropoiese são geralmente apli- cados no caso de doenças que podem ser tratadas através do aumento do nível de eritropoiese, particularmente no caso de anemia.

A eritropoiese é conhecida pelo perito na técnica. Em particular, o termo refere-se ao desenvolvimento de eritrócitos (as células sangüíneas vermelhas). Devido ao seu tempo de vida relativamente curto de 120 dias, os eritrócitos são continuamente renovados. Esta renovação ou desenvolvi- mento é feita através da proliferação e da diferenciação de células tronco. Atualmente, são conhecidas várias etapas na eritropoiese. As etapas princi- pais são a proliferação e a diferenciação das células BFC-E (células que promovem a erupção de eritrócitos ou BFC-Es (ou unidades que promovem erupção, BFU-E)) através de células CFC-E (célula formadora de colônia de eritrócitos (ou unidade formadora de colônia, CFU-E)) nos eritroblastos con- tendo núcleo, que por sua vez se diferenciam em eritrócitos. A interleucina-3 (IL-3) promove a sobrevivência e a proliferação das células BFC-E.

Os eritroblastos se diferenciam através da expulsão do núcleo para se tornar um eritrócito imaturo (um reticulócito), que então deixa a me- dula óssea e passa para dentro da corrente sangüínea. No próximo dia ou dois, o reticulócito perderá suas mitocôndrias e seus ribossomos para se tornar um eritrócito maduro. Um ESA de acordo com a presente invenção pode exercer sua influência em qualquer estágio deste processo, em particu- lar, na etapa de diferenciação partindo de uma célula progenitora de eritróide para um eritroblasto. Esta etapa é controlada pela sinalização através do receptor de Epo (EpoR). Em particular, um ESA de acordo com a invenção estimula o EpoR, mais particularmente através da ligação com o EpoR. Um ESA de acordo com a presente invenção pode ainda estimular a produção endógena da eritropoetina, por exemplo, através da inibição da prolil hidroxi- Iase do fator que pode ser induzido por hipoxia (HIF-PH).

O termo "anemia" é conhecido pelo perito na técnica. Em parti- cular, a anemia é um distúrbio caracterizado por uma falta de células san- güíneas vermelhas. A anemia pode, por exemplo, ser definida pelo conteúdo de hemoglobina do sangue. O nível de hemoglobina (Hb) normal para ho- mens é de 14 até 18 g/dl (140 até 180 g/L); o nível normal para mulheres é de 12 até 16 g/dl. Se o nível de hemoglobina for menor que estes valores, o paciente tem anemia. A anemia de acordo com a invenção refere-se particu- larmente a níveis de Hb menores que 14 g/dl, mais particularmente menores que 13 g/dl, 11 g/dl, 10 g/dl, 9 g/dl, 8 g/dl, 7,5 g/dl, 6,5 g/dl, 6 g/dl, 5,5 g/dl ou mais particularmente menores que 5 g/dl em um homem e a níveis de Hb menores que 12 g/dl, mais particularmente menores que 11 g/dl, 10 g/dl, 9 g/dl, 8 g/dl, 7,5 g/dl, 6,5 g/dl, 6 g/dl, 5,5 g/dl, mais particularmente menores que 5 g/dl em uma mulher. A anemia moderada pode ser considerada como correspondendo a um nível de Hb de 11,0 até 12,5 g/dl. Se o nível de hemo- globina estiver abaixo de 75 g/L (7,5 g/dl), débito cardíaco em repouso au- menta significativamente com um aumento tanto no batimento cardíaco quanto no volume da contração. O paciente pode queixar-se de palpitação ou de um pulso acelerado. Os sintomas de falência cardíaca podem se de- senvolver se a reserva do miocárdio do paciente for reduzida.

A anemia pode ter causas diferentes, por exemplo, perda de sangue excessiva (por exemplo, anemia por sangramento agudo ou crôni- co), eritropoiese reduzida ou ineficiente ou hemólise (anemia hemolítica, por exemplo, anemia causada por hiperatividade do sistema monócito- macrófago, anemia causada por atividade excessiva do baço ou por esple- nomegalia, anemia hemolítica imunológica (incluindo anemia hemolítica au- toimune, hemoglobinúria), anemia causada pela destruição mecânica de eri- trócitos (por exemplo, anemia hemolítica microangiopática, hemólise causa- da por infecções)).

A presente invenção pode ser aplicada no contexto de qualquer

tipo de anemia em cujo tratamento com ESAs é capaz de reduzir a gravida- de da anemia. Em particular, a invenção pode ser aplicada no contexto da anemia causada por doença renal (particularmente doença renal crônica), anemia relacionada ao câncer e anemia causada por doenças crônicas (por exemplo, infecciosas ou inflamatórias). A anemia relacionada ao câncer po- de ser causada por sangramentos internos e/ou como um efeito colateral do tratamento com agentes citostáticos. A anemia também pode ocorrer como um efeito colateral de terapia para o câncer, particularmente como um efeito colateral de terapia com fármaco citostático. A anemia é amplamente conhe- cida como uma complicação na insuficiência renal, particularmente na nefro- patia diabética.

Os agentes de estimulação da eritropoiese (ESAs) são conheci- dos pelo perito na técnica. O termo ESA compreende qualquer tipo de agen- te capaz de estimular a eritropoiese, particularmente in vivo, mais particu- Iarmente em um paciente. O significado do termo estímulo é conhecido, pre- ferencialmente o termo refere-se ao aumento ou à indução da eritropoiese. No contexto da invenção, o termo ESA refere-se a qualquer tipo de agente de estimulação da eritropoiese que seja capaz de aumentar o nível de he- moglobina total em pelo menos 0,5 g/dl, mais particularmente 1 g/dl, mais particularmente 1,5 g/dl. Preferencialmente, o ESA é capaz de induzir tais aumentos através de uma dosagem geralmente considerada razoavelmente segura em relação aos efeitos colaterais não cardiovasculares.

O mecanismo de como o ESA estimula a eritropoiese não é par- ticularmente importante no contexto da invenção. Por exemplo, um ESA de acordo com a invenção pode ser capaz de estimular a diferenciação de uma célula tronco pluripotente na medula óssea em um eritroblasto e/ou pode ser capaz de estimular a diferenciação de um eritroblasto em um eritrócito. En- tretanto, preferencialmente o ESA atua através do estímulo do EpoR ou do estímulo da via através da qual o EpoR atua.

Os exemplos para ESAs de acordo com a presente invenção incluem "moléculas pequenas" assim como proteínas ou peptídeos. "Moléculas pequenas" são entendidas como moléculas que não

são proteínas, peptídeos, anticorpos ou ácidos nucléicos e que exibem um peso molecular menor que 5000 Da, preferencialmente menor que 2000 Da, mais preferencialmente menor que 1000 Da, mais preferencialmente menor que 500 Da. Tais moléculas pequenas podem ser identificadas em procedi- mentos de alto rendimento/de verificação partindo de bibliotecas. Tais méto- dos são conhecidos na técnica. As moléculas pequenas adequadas também podem ser planejadas ou adicionalmente modificadas através de métodos conhecidos como química combinatória. Um exemplo para uma molécula pequena é FG-2216, um inibidor de prolil hidroxilase de fator que pode ser induzido por hipoxia (HIF-PH) (FibroGen Inc., licenciado para Astellas). O FG-2216 é capaz de aumentar o nível endógeno de eritropoietina e assim estimular a eritropoiese. Um outro exemplo pode ser o análogo de EPO de baixo peso molecular PBI-1402 (ProMetic Biosciences).

Os exemplos para os ESAs de acordo com a invenção podem incluir ESAs que ocorrem naturalmente (tal como a eritropoetina no sangue ou isolada da urina, ver o no. de acesso 133170 em Online Mendelian Inheri- tance in Man (OMIM) no website do National Institutes of Health, http://www.ncbi.nlm.nih.aov/) assim como ESAs produzidos de forma recom- binante, por exemplo, em cultura de células de células humanas ou de ani- mais, particularmente utilizando técnicas recombinantes. O termo "varia- ções" é entendido pelo perito na técnica e foi definido em outro lugar neste relatório descritivo.

As variações de ESAs são conhecidas, por exemplo, a eritropoe- tina em formas glicosiladas diferencialmente, por exemplo, devido ao modo de produção (por exemplo, o tipo celular das células hospedeiras utilizadas para a produção recombinante de um ESA baseado em proteína ou peptí- deo).

Os ESAs preferidos de acordo com a invenção são eritropoietina e variações da mesma. A eritropoietina é uma glicoproteína de peso molecu- lar de 30-40 kDa (Lee-Huang, S. (1984) Cloning and expression of human erythropoietin cDNA in Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sei. vol. 81, pp. 2708-2712; Romanowski, R.R., Sytkowski, A.J. (1994). The molecular struc- ture of human erythropoietin. Hemat. Oncol. Clin. North Am., vol. 8, pp. 885- 894, 1994). As variações de eritropoietina incluem formas de EPO glicosila- das diferencialmente e/ou os assim chamados biossimilares. Os exemplos de variações incluem epoetina alfa (Amgen), epoetina beta (por exemplo, NeoRecormon™, (Roche)), epoetina delta, epoetina-omega, darbepoetina alfa (Amgen) e Cera (Çontinous Erythropoiesis Receptor Activator1 Hoffman- LaRoche).

O nível de eritropoiese pode ser medido através de qualquer mé- todo considerado apropriado pelo versado na técnica. Em pacientes, o nível de eritropoiese pode ser convenientemente medido, por exemplo, através da contagem do número de reticulócitos e/ou de eritrócitos ou através da medi- da do nível total de hemoglobina. O nível também pode ser determinado a- través da medida do nível do volume total de células compactadas, porque o volume total de células compactadas é enormemente determinado pelo nú- mero de eritrócitos e pode ser facilmente medido. Tais métodos para a me- dida do nível de eritropoiese são bem conhecidos pelo perito na técnica. Se o nível de eritropoiese foi determinado, o grau de estímulo pode ser determi- nado, por exemplo, através da comparação do nível de eritropoiese antes e durante a medicação do ESA.

O significado do termo "medicação" é conhecido pelo perito na técnica. No contexto da invenção, o termo deve ser entendido em um senti- do amplo que compreende qualquer tipo de administração de um ESA a um paciente, por exemplo, através da administração oral, da injeção intraveno- sa, da injeção subcutânea ou da injeção intramuscular. Preferencialmente, o termo medicação refere-se à administração durante um longo período do respectivo fármaco, por exemplo, uma administração que causa um aumento do número de eritrócitos durante pelo menos 2 meses, preferencialmente pelo menos 3 meses, mais preferencialmente pelo menos 6 meses, mais preferencialmente pelo menos 12 meses, mais preferencialmente pelo me- nos 2 anos, mais preferencialmente pelo menos 3 anos. Partindo dos Exem- plos, pode ser observado que a diferença relativa no risco pode permanecer similar durante um período de tempo estendido, mas que o número total de complicações cardiovasculares pode aumentar continuamente ao longo do tempo de administração. Portanto, considerando uma indicação clínica parti- cular, pode ser aceitável administrar um ESA durante um período de tempo curto (por exemplo, durante até 1 semana, 4 semanas, 2 meses ou 4 meses) em um paciente de risco identificado de acordo com a invenção, enquanto uma decisão em relação à administração durante um longo período de tem- po em tal paciente de risco deve preferencialmente ser baseada em uma avaliação mais cuidadosa de risco e benefício. Consequentemente, a inven- ção refere-se ainda ao diagnóstico do risco de sofrer uma complicação car- diovascular como uma conseqüência da medicação durante um curto perío- do de tempo e/ou um longo período de tempo com um ESA.

A invenção tira vantagem de certos marcadores bioquímicos ou moleculares. Os termos "marcador bioquímico" e "marcador molecular" são conhecidos pelo perito na técnica. Em particular, os marcadores bioquímicos ou moleculares são produtos da expressão gênica que são expressos de forma diferencial (isto é, regulados para mais ou regulados para menos) na presença ou na ausência de um certo estado de saúde, doença ou compli- cação. Geralmente, um marcador molecular é definido como um ácido nu- cléico (tal como um mRNA), enquanto que um marcador bioquímico é uma proteína, um polipeptídeo ou um peptídeo. O nível de um marcador bioquí- mico ou molecular adequado pode indicar a presença ou a ausência do es- tado de saúde, da doença ou da complicação e permitir assim o diagnóstico.

A presente invenção particularmente tira vantagem de peptídeos do tipo BNP como marcadores bioquímicos. Ainda o uso de quaisquer com- binações de peptídeos do tipo BNP como marcadores bioquímicos é consi- derado no contexto da presente invenção. Os peptídeos do tipo BNP compreendem pré-pró-BNP, pró-BNP,

NT-pró-BNP e BNP.

O pré-pró-peptídeo (134 aminoácidos no caso do pré-pró-BNP) compreende um peptídeo sinal curto, que sofre clivagem enzimática para liberar o pró-peptídeo (108 aminoácidos no caso do pró-BNP). O pró- peptídeo é adicionalmente clivado em um pró-peptídeo N-terminal (NT-pró- peptídeo, 76 aminoácidos no caso do NT-pró-BNP) e o hormônio ativo (32 aminoácidos no caso do BNP).

Os peptídeos do tipo BNP preferidos de acordo com a presente invenção são pró-BNP, NT-pró-BNP, BNP e variações dos mesmos. O BNP é o hormônio ativo e possui uma meia-vida mais curta in vivo que o NT-pró- BNP inativo.

Os Preanalytics são mais fortes com o NT-pró-BNP permitindo o fácil transporte da amostra para o laboratório central (Mueller T, Gegenhuber A, Dieplinger B, Poelz W, Haltmayer M. Long-term stability of endogenous B- type natriuretic peptide (BNP) and amino terminal proBNP (NT-proBNP) in frozen plasma samples. Clin Chem Lab Med 2004; 42: 942-4.). As amostras de sangue podem ser armazenadas à temperatura ambiente durante vários dias ou podem ser enviadas por correio ou transportadas sem perda de re- cuperação. Em contraste, o armazenamento do BNP durante 48 horas à temperatura ambiente ou a 4o Celsius leva a uma perda de concentração de pelo menos 20 % (Mueller T, Gegenhuber A e outros, Clin Chem Lab Med 2004; 42: 942-4, supra; Wu AH, Packer M, Smith A, Bijou R, Fink D, Mair J, Wallentin L, Johnston Ν, Feldcamp CS1 Haverstick DM1 Ahnadi CE1 Grant Α, Despres Ν, Bluestein Β, Ghani F. Analytical and clinicai evaluation of the Ba- yer ADVIA Centaur automated B-type natriuretic peptide assay in patients with heart failure: a multisite study. Clin Chem 2004; 50: 867-73.).

A medida da forma ativa ou da forma inativa pode ser vantajosa,

dependendo do curso de tempo de interesse de interesse e do equipamento analítico ou das condições de armazenamento disponíveis. Os peptídeos do tipo BNP mais preferidos de acordo com a presente invenção são NT-pró- BNP e variações dos mesmos. O termo "variações" neste contexto refere-se a peptídeos subs-

tancialmente similares aos ditos peptídeos. O termo "substancialmente simi- lar" é bem entendido pelo perito na técnica. Em particular, uma variante po- de ser uma isoforma ou um alelo que exibe trocas de aminoácidos compara- das com a seqüência de aminoácidos da isoforma do peptídeo mais preva- lente na população humana. Preferencialmente, tal peptídeo substancial- mente similar possui uma similaridade de seqüência com a isoforma mais prevalente do peptídeo de pelo menos 80%, preferencialmente de pelo me- nos 85%, mais preferencialmente de pelo menos 90%, mais preferencial- mente de pelo menos 95%. São também substancialmente similares os pro- dutos de degradação, por exemplo, os produtos da degradação proteolítica, que são também reconhecidos pelos meios de diagnóstico ou por Iigantes direcionados contra o respectivo peptídeo de comprimento completo. Enten- de-se também que o termo "variações" se refere às variações de processa- mento.

O termo "variante" refere-se ainda a um peptídeo modificado

pós-tradução tal como um peptídeo glicosilado. Uma "variante" é também um peptídeo que foi modificado após a coleta da amostra, por exemplo, a- través da ligação covalente ou não-covalente de uma marcação, particular- mente uma marcação radioativa ou fluorescente, ao peptídeo. Os exemplos de variações e métodos particulares para a sua

medida são conhecidos (ver, por exemplo, Ala-Kopsala, M., Magga, J., Peuhkurinen, K. e outros (2004): Molecular heterogeneity has a major impact on the measurement of circulating N-terminal fragments of A-type and B-type natriuretic peptides. Clinicai Chemistry, vol. 50(9), 1576-1588).

Outras modalidades da invenção incluem a medida de marcado- res diferentes em combinação, simultaneamente ou não-simultaneamente.

Um exemplo é a medida do NT-pró-BNP em combinação com o BNP.

O diagnóstico de acordo com a presente invenção inclui a de- terminação, o monitoramento, a confirmação, a subclassificação e a previsão da doença, do distúrbio, da complicação ou do risco relevante. A determina- ção refere-se ao fato de tomar-se ciente de uma doença, um distúrbio, uma complicação ou um risco. O monitoramento refere-se ao fato de ficar atento a uma doença, a um distúrbio, a uma complicação ou a um risco já diagnos- ticado, por exemplo, analisar a progressão da doença ou da influência de um tratamento particular sobre a progressão da doença ou do distúrbio. A con- firmação refere-se ao reforço ou à verificação de um diagnóstico já realizado utilizando outros indicadores ou marcadores. A subclassificação refere-se à definição adicional de um diagnóstico de acordo com subclasses diferentes da doença, do distúrbio, da complicação ou do risco diagnosticado, por e- xemplo, à definição de acordo com formas suaves e graves da doença. A previsão refere-se ao prognóstico de uma doença, um distúrbio ou uma complicação antes que outros sintomas ou marcadores tenham se tornado evidentes ou que tenham se tornado significativamente alterados.

Como será entendido pelos peritos na técnica, geralmente não é pretendido que tal diagnóstico esteja correto para 100% dos indivíduos que serão diagnosticados. O termo, entretanto, requer que uma parte estatisti- camente significativa de indivíduos possa ser diagnosticada em relação à doença, ao distúrbio, à complicação ou ao risco relevante. O fato de uma parte ser estatisticamente significativa pode ser determinado sem atividade adicional do perito na técnica utilizando várias ferramentas de avaliação es- tatística bem conhecidas, por exemplo, a determinação de intervalos de con- fiança, a determinação do valor de ρ, o teste t de Student, o teste de Mann- Whitney etc. Os detalhes são encontrados em Dowdy e Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, Nova York 1983. Os intervalos de confian- ça preferidos são pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99%. Os valores de ρ são, preferencialmente, 0,1, 0,05, 0,01, 0,005 ou 0,0001.

As complicações cardiovasculares de acordo com a presente invenção compreendem quaisquer disfunções que afetam o sistema cardio- vascular, particularmente quaisquer complicações associadas com a forma- ção de placas ou de coágulos sangüíneos.

As complicações associadas com a formação de placas ou de coágulos sangüíneos do sistema cardiovascular são amplamente conheci- das. Uma placa ou um coágulo sangüíneo pode causar um estreitamento ou um fechamento de um vaso sangüíneo e reduzir assim o fluxo sangüíneo e o fornecimento de oxigênio. Freqüentemente, a complicação clinicamente re- levante é causada por uma placa rompida ou por um coágulo sangüíneo que é carregado ao longo da corrente sangüínea até ficar preso em um vaso sangüíneo, tal como uma artéria coronária ou pulmonar.

A complicação cardiovascular pode ser uma complicação cardí- aca ou uma não-cardíaca.

As complicações não-cardíacas podem ocorrer na periferia (do- ença vascular periférica), tal como trombose de veia profunda e podem re- sultar, por exemplo, em gangrena, microangiopatia ou embolia pulmonar. Um exemplo é a doença vascular periférica que leva à necrose e possivel- mente à amputação. Outros exemplos para complicações não-cardíacas as- sociadas com a formação de placas ou de coágulos sangüíneos incluem tais complicações que afetam o cérebro, por exemplo, ataque isquêmico cerebral transitório (TIA, um evento isquêmico transitório no cérebro) ou derrame. Os exemplos adicionais para complicações cardiovasculares não-cardíacas in- cluem hipertensão, hipotensão.

No sistema cardíaco (coração e artérias coronárias), as compli- cações associadas com a formação de placas ou de coágulos sangüíneos podem incluir angina pectoris estável (SAP) e síndromes coronarianas agu- das (ACS). A angina pectoris é caracterizada por isquemia do miocárdio, isto é, fornecimento insuficiente de oxigênio, particularmente sob condições de maior demanda de oxigênio, por exemplo, no caso de exercício físico. Os pacientes com ACS podem exibir angina pectoris instável (UAP) ou estes indivíduos já sofreram um infato do miocárdio (Ml). O infato do miocárdio é caracterizado por eventos necróticos menores ou maiores (isto é, destruição do tecido devido à falta de fornecimento de oxigênio). De acordo com a apa- rência no eletrocardiograma, o Ml pode ser um Ml elevado por ST ou um Ml não-elevado por ST. A ocorrência de um Ml pode ser seguida por uma dis- função do ventrículo esquerdo (LVD). Os pacientes com LVD sofrem falência cardíaca congestiva (CHF) com uma taxa de mortalidade de aproximada- mente 15 %. Entretanto, a falência cardíaca também pode ser aguda (falên- cia cardíaca aguda, AHF).

Uma complicação cardíaca complicação cardíaca de acordo com a invenção pode ser também arritmia, bradicardia e taquicardia.

Uma complicação cardíaca pode ser sistólica ou diastólica (isto é, que afeta primariamente a fase de expulsão (sístole) ou a fase de abaste- cimento (diástole) do ventrículo afetado).

No contexto da presente invenção, "complicação cardiovascular" refere-se particularmente a doença cardíaca coronariana, SAP, ACS, UAP1 Ml (incluindo Ml elevado por ST e Ml não-elevado por ST), LVD, CHF, morte cardiovascular, TIA ou derrame. Mais particularmente, "complicação cardio- vascular" refere-se a ACS, UAP1 Ml (incluindo Ml elevado por ST e Ml não- elevado por ST), LVD, CHF, morte cardiovascular, TIA ou derrame.

As complicações cardiovasculares podem causar sintomas, que foram classificados em um sistema de classificação funcional de acordo com a New York Heart Association (NYHA). Os pacientes da Classe I não possu- em sintomas óbvios de doença cardiovascular. A atividade física não é limi- tada e a atividade física comum não causa fadiga desnecessária, palpitação ou dispnéia (falta de ar). Os pacientes da classe Il possuem uma ligeira limi- tação da atividade física. Ficam confortáveis em repouso, mas a atividade física comum resulta em fadiga, palpitação ou dispnéia. Os pacientes da classe Ill exibem uma limitação notável de atividade física. Ficam confortá- veis em repouso, mas uma atividade menos que o comum causa fadiga, palpitação ou dispnéia. Os pacientes da classe IV são incapazes de realizar qualquer atividade física sem desconforto. Exibem sintomas de insuficiência cardíaca em repouso. Se qualquer atividade física for realizada, o desconfor- to é aumentado.

Consequentemente, os pacientes que sofrem de complicações

cardiovasculares podem ser divididos em indivíduos que não exibem sinto- mas clínicos e aqueles com sintomas (por exemplo, dispnéia).

Uma outra característica das doenças cardiovasculares pode ser a "fração de expulsão do ventrículo esquerdo" (LVEF) que é também conhe- cida como "fração de expulsão". Pessoas com um coração saudável geral- mente possuem uma LVEF inalterada, que é geralmente descrita como aci- ma de 50 %. A maioria das pessoas com uma doença cardíaca sistólica que é sintomática geralmente possui uma LVEF de 40 % ou menor.

No caso de uma doença cardíaca diastólica, a LVEF pode ser normal (refletindo uma diástole normal), enquanto que o abastecimento é insuficiente. A doença cardíaca diastólica pode, entretanto, ser caracterizada pela maior espessura da parede ventricular.

Uma complicação cardiovascular de acordo com a invenção po- de causar sintomas, particularmente sintomas de acordo com as classes Il- IV da NYHA, mais particularmente de acordo com as classes III-IV da NYHA.

Uma complicação cardiovascular de acordo com a invenção po- de estar associada com uma LVEF de 40% ou menor.

Uma complicação cardiovascular de acordo com a invenção po- de ser "compensada" ou "descompensada". Compensada significa que a necessidade regular do corpo de oxigênio pode ainda ser satisfeita, enquan- to que descompensada significa que a necessidade regular do corpo de oxi- gênio não é mais satisfeita.

"Sofrer uma complicação cardiovascular" de acordo com a in- venção inclui ainda a deterioração de uma complicação cardiovascular pré- existente.

O termo "paciente" de acordo com a presente invenção refere-se a um indivíduo saudável, um indivíduo aparentemente saudável ou, particu- larmente, um indivíduo que está sofrendo de uma doença. Particularmente, o paciente está sofrendo de ou é tratado em relação à anemia, por exemplo, causada por câncer ou doença renal (particularmente doença renal crônica, por exemplo, devida à nefropatia diabética). Assim, o paciente também pode ser um paciente que sofre de câncer, doença renal ou diabetes. Ainda mais particularmente, no momento da medida ou do diagnóstico, o paciente não possui histórico conhecido de complicação cardiovascular e/ou nenhum ou poucos sintomas (classe I ou Il da NYHA) de uma complicação cardiovascu- lar e/ou não está sendo tratado em relação a uma complicação cardiovascu- lar.

Particularmente, o paciente é um candidato para receber uma medicação com ESA. Mais particularmente, no momento da medida ou do diagnóstico, qualquer medicação anterior do paciente com um ESA, mais particularmente eritropoietina ou uma variante da mesma, ocorreu pelo me- nos um mês, particularmente pelo menos 2 meses, mais particularmente pelo menos 6 meses, mais particularmente pelo menos 1 ano antes. Ainda mais particularmente, no momento da medida ou do diagnóstico o paciente não tinha tomado qualquer medicação anterior com um ESA.

É sabido pelo perito na técnica, sob quais circunstâncias uma complicação cardiovascular pode ser considerada como ocorrendo "como uma conseqüência" de uma medicação com ESA. Em estudos clínicos, uma comparação de grupos de pacientes que receberam uma medicação com ESA com grupos de pacientes que não receberam uma medicação com ESA pode revelar se os pacientes sob uma medicação com ESA irão sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medicação com ESAs: Se os pacientes que receberam ESA sofrerem complicações cardiovasculares mais freqüentemente, então isto indica que o maior número de complicações cardiovasculares ocorre como uma conseqüência da medi- cação com ESA particular. Similarmente, pode ser comparado se dosagens de medicação com ESA diferentes causam um maior número de complica- ções cardiovasculares. Os exemplos de tais análises são fornecidos na se- ção de Exemplos. O termo "como uma conseqüência" de uma medicação com ESA não deve ser interpretado como uma descoberta de que os ESAs geralmen- te causam complicações cardiovasculares. Na verdade, como mostrado an- teriormente, é geralmente considerado que uma medicação com ESA pode reduzir o risco de complicações cardiovasculares por causa da redução do esforço sobre o coração. É atualmente desconhecido qual mecanismo bioló- gico sustenta a observação de que os ESAs (particularmente em altas dosa- gens ou em altos níveis-alvo de hemoglobina, respectivamente) podem au- mentar o risco de complicações cardiovasculares em certos pacientes. En- tretanto, como já mencionado, foi descoberto no contexto da invenção que os marcadores descritos neste relatório descritivo são adequados para de- tectar pacientes em risco de sofrer uma complicação cardiovascular se um ESA, particularmente em dosagem alta (ou alto nível-alvo de hemoglobina), for administrado a tal paciente. O diagnóstico de acordo com a presente invenção é preferenci-

almente realizado através do uso de um meio de diagnóstico. Um meio de diagnóstico é qualquer meio que permita medir o nível, a quantidade ou a concentração de uma substância de interesse, particularmente um peptídeo ou um polipeptídeo de interesse, mais particularmente um peptídeo do tipo BNP.

Os métodos e os meios de diagnóstico que podem ser utilizados para medir os níveis dos respectivos peptídeos são conhecidos pelo perito na técnica. Estes métodos incluem métodos baseados em ELISA em micro- placas, ensaios imunológicos completamente automatizados ou robóticos (disponíveis, por exemplo, em Elecsys® ou Cobas® analyzers), CBA (um Çobalt Binding Assay enzimático, disponível, por exemplo, em Roche- Hitachi® analyzers) e ensaios de aglutinação em látex (disponíveis, por e- xemplo, em Roche-Hitachi® analyzers). Os métodos e os meios para medida incluem ainda dispositivos Point-of-care, tal como o Cardiac Reader® (dispo- nível na Roche Diagnostics).

Os dispositivos Point-of-care são geralmente entendidos como dispositivos que possibilitam a medida à beira da cama do paciente. Um e- xemplo é o Cardiac Reader® (disponível na Roche Diagnostics), em combi- nação, por exemplo, com tiras de teste para NT-pró-BNP (disponíveis como "Cardiac proBNP" da Roche Diagnostics). Tal teste pode empregar dois anti- corpos (preferencialmente monoclonais) direcionados contra o peptídeo de interesse (por exemplo, um peptídeo do tipo BNP). Os anticorpos podem ser idênticos aos anticorpos utilizados, por exemplo, nos ensaios Elecsys® ou Cobas®. Por exemplo, o primeiro anticorpo é marcado com biotina enquanto que o segundo anticorpo é marcado com partículas de ouro. O teste pode ser iniciado através da adição de uma pequena quantidade (por exemplo, 150 μΙ_) de amostra de sangue sobre a tira de teste (por exemplo, em uma cavidade de amostra da tira de teste). Os eritrócitos na amostra podem ser separados do plasma remanescente antes ou depois da adição à tira de tes- te, por exemplo, se a amostra escoar ao longo de uma lã adequada (por e- xemplo, uma lã de fibra de vidro). O dito meio de separação (por exemplo, lã) é preferencialmente parte da tira de teste. Os anticorpos (preferencial- mente já presentes na tira de teste) são dissolvidos no plasma remanescen- te. Os anticorpos são capazes de se ligar ao peptídeo ou ao polipeptídeo de interesse, formando um complexo em sanduíche de três membros. Os anti- corpos (ligados ou não-ligados) escoam ao longo da tira para uma zona de detecção. A zona de detecção compreende meios para a detecção do com- plexo ligado, por exemplo, pode compreender estreptavidina. Isto imobiliza o complexo e visualiza o complexo imobilizado na forma de uma linha violeta através do anticorpo marcado com ouro. Preferencialmente, o anticorpo livre marcado com ouro remanescente pode então se mover adicionalmente para baixo da tira onde é capturado em uma zona que compreende um peptídeo ou um polipeptídeo sintético que compreende o epítopo do peptídeo do tipo BNP que será detectado, visualizado na forma de uma linha violeta separa- da. A presença de tal segunda linha pode servir como um controle porque indica que a amostra escoou como tendo funcionado corretamente e o anti- corpo está intacto. A tira de teste pode compreender uma marcação indican- do qual peptídeo ou polipeptídeo de interesse pode ser detectado com a tira. Pode também compreender um código de barras ou outro código que pode ser lido por um dispositivo para a medida óptica da quantidade de marcação detectável na zona de detecção. Tal código de barras pode incluir informa- ção indicando qual peptídeo ou polipeptídeo de interesse pode ser detectado com a tira. O código de barras também pode incluir informação específica ao lote em relação à tira de teste.

O próprio Cardiac Reader compreende uma câmera (por exem- plo, um dispositivo acoplado à carga, CCD) que registra opticamente a zona de detecção da tira de teste. As linhas de sinal e de controle podem ser iden- tificadas através de um algoritmo de reconhecimento de padrões. A intensi- dade da marcação na linha de sinal é tipicamente proporcional à quantidade do peptídeo ou do polipeptídeo de interesse. O sinal óptico pode ser conver- tido em uma concentração através de uma curva de calibração específica ao lote que pode ser armazenada em um chip de código. A concordância do código de calibração e o lote de teste pode ser verificada por um código de barras na tira de teste.

Além disso, o perito na técnica está familiarizado com métodos diferentes de medida do nível de um peptídeo ou de um polipeptídeo. O ter- mo "nível" refere-se à quantidade ou à concentração de um peptídeo ou de um polipeptídeo em um paciente ou uma amostra tirada de um paciente. O termo "medida" de acordo com a presente invenção refere-se

à determinação da quantidade ou da concentração, preferencialmente de forma semiquantitativa ou quantitativa, do ácido nucléico, do peptídeo, do polipeptídeo ou de substância de interesse. A medida pode ser realizada diretamente ou indiretamente. A medida indireta inclui a medida de respos- tas celulares, Iigantes ligados, marcações ou produtos de reações enzimáti- cas. Preferencialmente, a medida é realizada in vitro.

No contexto da presente invenção, a quantidade refere-se ainda à concentração. É evidente, que partindo da quantidade total de uma subs- tância de interesse em uma amostra de tamanho conhecido, a concentração da substância pode ser calculada e vice-versa.

A medida pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido na técnica. Os métodos preferidos são descritos a seguir. Em uma modalidade preferida, o método para a medida do nível de um peptídeo ou de um polipeptídeo de interesse, particularmente um pep- tídeo do tipo BNP, compreende as etapas de (a) colocar em contato uma célula capaz de ter uma resposta celular para o peptídeo ou para o polipep- tídeo com o peptídeo ou o polipeptídeo durante um período de tempo ade- quado, (b) medida da resposta celular.

Em uma outra modalidade preferida, o método para a medida do nível de um peptídeo ou de um polipeptídeo de interesse, particularmente um peptídeo do tipo BNP, compreende as etapas de (a) colocar em contato um peptídeo ou um polipeptídeo com um substrato adequado durante um período de tempo adequado, (b) medida da quantidade do produto.

Em uma outra modalidade preferida, o método para a medida do nível de um peptídeo ou de um polipeptídeo de interesse, particularmente um peptídeo do tipo BNP, compreende as etapas de (a) colocar em contato um peptídeo ou um polipeptídeo com um ligação de ligação específica, (b) (opcionalmente) remoção do Iigante não-ligado, (c) medida da quantidade do Iigante ligado.

Preferencialmente, o peptídeo ou o polipeptídeo está contido em uma amostra, particularmente uma amostra de fluido corporal ou de tecido e a quantidade do peptídeo ou do polipeptídeo na amostra é medida.

Os peptídeos e os polipeptídeos (proteínas) podem ser medidos em amostras de tecido, células e fluido corporal, isto é, preferencialmente in vitro. Preferencialmente, o peptídeo ou o polipeptídeo de interesse é medido em uma amostra de fluido corporal. Uma amostra de tecido de acordo com a presente invenção refe-

re-se a qualquer tipo de tecido obtido do ser humano morto ou vivo ou do corpo de um animal. As amostras de tecido podem ser obtidas através de qualquer método conhecido pelo perito na técnica, por exemplo, através de biópsia ou curetagem. Os fluidos corporais de acordo com a presente invenção podem

incluir sangue (incluindo derivados do mesmo, por exemplo, soro sangüíneo ou plasma sangüíneo), linfa, líquor cerebral, saliva e urina. Particularmente, os fluidos corporais incluem sangue, (incluindo derivados do mesmo, por exemplo, soro sangüíneo ou plasma sangüíneo) e urina. As amostras de fluidos corporais podem ser obtidas através de qualquer método conhecido na técnica.

Para o médico geral, não são mais necessárias ferramentas pa-

ra diagnóstico caras para fazer um diagnóstico cardíaco. Vantajosamente, a utilização de urina como amostra evita qualquer etapa invasiva realizada no indivíduo. Surpreendentemente, foi descoberto em estudos que fundamen- tam a invenção que a quantidade de peptídeo do tipo BNP1 particularmente de NT-pró-BNP na urina é similarmente valiosa e confiável para o diagnósti- co como a quantidade no sangue. Geralmente, seria esperado que níveis meramente menores de peptídeo do tipo BNP estivessem presentes na urina uma vez que se acredita que a eliminação principal para os peptídeos do tipo BNP ocorra nos rins através da filtração glomerular. Consequentemente, não seria esperado que (i) quantidades suficientes do peptídeo do tipo BNP, particularmente de NT-pró-BNP estivessem toda presente na urina. Prefe- rencialmente, as medidas na urina são realizadas em pacientes sem compli- cações renais importantes, mais preferencialmente em pacientes com filtra- ção glomerular normal ou quase normal. O termo "urina" de acordo com a presente invenção compreende

urina total ou frações da mesma. As frações são frações da urina que con- têm peptídeos ou polipeptídeos. As amostras de urina podem ser obtidas através de qualquer método conhecido na técnica. As amostras podem ser submetidas a vários pré-tratamentos conhecidos antes da aplicação do mé- todo da presente invenção (isto é, amostras processadas de urina).

Os métodos para a obtenção de amostras de células incluem a preparação direta de células isoladas ou de pequenos grupos de células, dissociando o tecido (por exemplo, utilizando tripsina) e separando as célu- las dos fluidos corporais, por exemplo, através de filtração ou centrifugação. As células de acordo com a presente invenção compreendem também pla- quetas e outras células não-nucleadas, por exemplo, eritrócitos.

Se necessário, as amostras podem ser adicionalmente proces- sadas. Particularmente, os ácidos nucléicos, os peptídeos ou os polipeptí- deos podem ser purificados da amostra de acordo com métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de filtração, centrifugação ou extração tal co- mo a extração com clorofórmio/fenol.

Para medir as respostas celulares, a amostra ou a amostra pro-

cessada é adicionada em uma cultura de células e uma resposta celular in- terna ou externa é medida. A resposta celular pode incluir a expressão de um gene repórter ou a secreção de uma substância, por exemplo, um peptí- deo, um polipeptídeo ou uma molécula pequena. Outros métodos preferidos para medida podem incluir a medida

da quantidade de ligação de um Iigante ao peptídeo ou ao polipeptídeo de interesse. A ligação de acordo com a presente invenção inclui tanto ligação covalente quanto não-covalente.

Um Iigante de acordo com a presente invenção pode ser qual- quer peptídeo, polipeptídeo, ácido nucléico ou outra substância que se liga ao peptídeo ou ao polipeptídeo de interesse. É bem sabido que os peptídeos ou os polipeptídeos, se obtidos ou purificados de células humanas ou de animais, podem ser modificados, por exemplo, por glicosilação. Um Iigante adequado de acordo com a presente invenção pode se ligar ao peptídeo ou ao polipeptídeo também através de tais sítios.

Preferencialmente, o Iigante deve se ligar especificamente ao peptídeo ou ao polipeptídeo que será medido. "Ligação específica" de acor- do com a presente invenção significa que o Iigante não deve se ligar subs- tancialmente ("reagir de forma cruzada" com) um outro peptídeo, polipeptí- deo ou substância presente na amostra investigada. Preferencialmente, a proteína ou a isoforma ligada especificamente deve estar ligada com pelo menos 3 vezes mais, mais preferencialmente pelo menos 10 vezes mais e ainda mais preferencialmente pelo menos 50 vezes mais afinidade que qual- quer outro peptídeo ou polipeptídeo relevante. No presente contexto, tais outros peptídeos ou polipeptídeos relevantes podem ser outros peptídeos ou polipeptídeos relacionados estruturalmente ou homólogos.

A ligação inespecífica pode ser tolerável, particularmente se o peptídeo ou o polipeptídeo investigado ainda puder ser distinguido e medido de forma não-equivocada, por exemplo, de acordo com seu tamanho em um Western Blot ou através de sua abundância relativamente maior na amostra.

A ligação do Iigante pode ser medida através de qualquer méto- do conhecido na técnica. Preferencialmente, o método é semiquantitativo ou quantitativo. Os métodos adequados são descritos a seguir.

Em primeiro lugar, a ligação de um Iigante pode ser medida dire- tamente, por exemplo, através de RMN ou ressonância de plasmon de su- perfície.

Em segundo lugar, se o Iigante também servir como um substra-

to de uma atividade enzimática do peptídeo ou do polipeptídeo de interesse, pode ser medido um produto da reação enzimática (por exemplo, a quanti- dade de uma protease pode ser medida através da medida da quantidade do substrato clivado, por exemplo, em um Western Blot). Para a medida dos produtos da reação enzimática, preferenci-

almente a quantidade de substrato é saturante. O substrato pode também ser marcado com um marcador detectável antes da reação. Preferencial- mente, a amostra é colocada em contato com o substrato durante um perío- do de tempo adequado. Um período de tempo adequado refere-se ao tempo necessário para que uma quantidade detectável, preferencialmente mensu- rável de produto seja gerada. Ao invés de medir a quantidade de produto, pode ser medido o tempo necessário para o aparecimento de uma certa quantidade de produto (por exemplo, detectável).

Em terceiro lugar, o Iigante pode ser acoplado de forma covalen- te ou não-covalente a uma marcação permitindo a detecção e a medida do ligante.

A marcação pode ser realizada através de métodos diretos ou indiretos. A marcação direta envolve o acoplamento da marcação diretamen- te (de forma covalente ou não-covalente) ao ligante. A marcação indireta envolve a ligação (de forma covalente ou não-covalente) de um ligante se- cundário como primeiro ligante. O ligante secundário deve especificamente se ligar ao primeiro ligante. O dito ligante secundário pode ser acoplado a uma marcação adequada e/ou ser o alvo (receptor) de ligação do Iigante terciário ao Iigante secundário. O uso de Iigantes secundários, terciários ou ainda de ordens superiores é freqüentemente feito para aumentar o sinal. Os Iigantes secundários e de ordem superior adequados podem incluir anticor- pos, anticorpos secundários e o sistema estreptavidina-biotina bem conheci- do (Vector Laboratories, Inc.).

O Iigante ou o substrato pode também ser "marcado" com uma ou mais marcações como é conhecido na técnica. Tais marcações podem então ser alvos para Iigantes de ordem superior. As marcações adequadas incluem biotina, digoxigenina, His-Tag, Glutationa-S-Transferase, FLAG, GFP, myc-tag, hemaglutinina do vírus influenza A (HA), proteína de ligação com a maltose e similares. No caso de um peptídeo ou de um polipeptídeo, a marcação fica preferencialmente no terminal N e/ou no terminal C.

As marcações adequadas são quaisquer marcações detectáveis através de qualquer método de detecção apropriado. As marcações típicas incluem partículas de ouro, contas de látex, éster de acridana, Iuminol1 rutê- nio, marcações enzimaticamente ativas, marcações radioativas, marcações magnéticas (por exemplo, "contas magnéticas", incluindo marcações para- magnéticas e superparamagnéticas) e marcações fluorescentes. As marcações enzimaticamente ativas incluem, por exemplo,

peroxidase de rábano-silvestre, fosfatase alcalina, beta-Galactosidase, Luci- ferase e derivados das mesmas. Os substratos adequados para detecção incluem di-amino-benzidina (DAB), 3,3'-5,5'-tetrametilbenzidina, NBT-BCIP (cloreto de 4-nitro azul tetrazólio e 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato, disponí- veis na forma de solução estoque pronta para uso na Roche Diagnostics), CDP-Star®(Amersham Biosciences), ECF®(Amersham Biosciences). Uma combinação de enzima-substrato adequada pode resultar em um produto de reação colorido, fluorescência ou quimioluminescência, que pode ser medido de acordo com métodos conhecidos na técnica (por exemplo, utilizando um filme sensível à luz ou um sistema de câmera adequado). Como para a me- dida da reação enzimática, os critérios fornecidos anteriormente se aplicam analogamente. As marcações fluorescentes típicas incluem proteínas fluores- centes (tais como GFP1 YFP1 RFP e derivados das mesmas), Cy3, Cy5, Te- xas Red, Fluoresceína, os corantes Alexa (por exemplo, Alexa 568) e quan- tum dots. Marcações fluorescentes adicionais estão disponíveis, por exem- pio, na Molecular Probes (Oregon).

As marcações radioativas típicas incluem 35S, 125I, 32P, 33P e si- milares. Uma marcação radioativa pode ser detectada através de qualquer método conhecido e apropriado, por exemplo, um filme sensível à luz ou um dispositivo de formação de imagens com fósforo. Os métodos de medida adequados de acordo com a presente

invenção também incluem precipitação (particularmente imunoprecipitação), eletroquimioluminescência (quimioluminescência gerada por eletricidade), RIA (radioimunoensaio), ELISA (ensaio imunoabsorvente ligado à enzima), testes imunológicos com enzimas em sanduíche, imunoensaios em sanduí- che com eletroquimioluminescência (ECLIA), ensaio imunológico com fluoro lantanídeo intensificado por dissociação (DELFIA), ensaio de proximidade de cintilação (SPA), turbidimetria, nefelometria, turbidimetria ou nefelometria intensificada por látex, testes imunológicos em fase sólida e espectrometria de massa tal como SELDI-TOF, MALDI-TOF ou espectrometria de massa com eletroforese por capilaridade (CE-MS). Os métodos adicionais conheci- dos na técnica (tais como a eletroforese em gel, a eletroforese em gel em 2D, a eletroforese em gel de SDS poliacrilamida (SDS-PAGE), Western Blot- ting), podem ser utilizados isoladamente ou em combinação com marcação ou outros métodos de detecção como descrito anteriormente. Os Iigantes preferidos incluem anticorpos, ácidos nucléicos, pep-

tídeos ou polipeptídeos e aptâmeros, por exemplo, aptâmeros de ácidos nu- cléicos ou de peptídeos (por exemplo, spiegelmers ou anticalins). Os méto- dos para a obtenção de tais Iigantes são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, a identificação e a produção de anticorpos ou aptâmeros adequa- dos são também oferecidas por fornecedores comerciais. O perito na técnica está familiarizado com os métodos para o desenvolvimento de derivados de tais Iigantes com maior afinidade ou especificidade. Por exemplo, mutações aleatórias podem ser introduzidas nos ácidos nucléicos, nos peptídeos ou nos polipeptídeos. Estes derivados podem então ser testados em relação à ligação de acordo com os procedimentos de verificação conhecidos na téc- nica, por exemplo, exibição em fagos.

O termo "anticorpo" como utilizado aqui inclui tanto anticorpos

policlonais quanto monoclonais, assim como variações ou fragmentos dos mesmos, tais como fragmentos Fv1 Fab e F(ab)2 que são capazes de se ligar ao antígeno ou ao hapteno. O termo "anticorpo" inclui ainda anticorpos de cadeia isolada.

Em uma outra modalidade preferida, o ligante, preferencialmente

escolhido do grupo que consiste em ácidos nucléicos, peptídeos, polipeptí- deos ou aptâmeros, está presente em um arranjo.

O dito arranjo contém pelo menos um ligante adicional, que pode ser direcionado contra um peptídeo, um polipeptídeo ou um ácido nucléico de interesse. O dito ligante adicional pode também ser direcionado contra um peptídeo, um polipeptídeo ou um ácido nucléico sem ser de interesse particular no contexto da presente invenção. Preferencialmente, os Iigantes para pelo menos três, preferencialmente pelo menos cinco, mais preferenci- almente pelo menos oito peptídeos ou polipeptídeos de interesse no contex- to da presente invenção estão contidos no arranjo.

De acordo com a presente invenção, o termo "arranjo" refere-se a um veículo em fase sólida ou similar a um gel sobre o qual pelo menos dois compostos estão aderidos ou ligados em um arranjo em uma, duas ou três dimensões. Tais arranjos (incluindo "chips gênicos", "chips de proteí- nas", arranjos de anticorpos e similares) são geralmente conhecidos pelo perito na técnica e são tipicamente gerados sobre lâminas de vidro para mi- croscópio, especialmente lâminas de vidro revestidas tais como lâminas re- vestidas com policátion, nitrocelulose ou biotina, lamínulas e membranas tais como, por exemplo, membranas à base de nitrocelulose ou náilon. O arranjo pode incluir um ligante ligado ou pelo menos duas cé-

lulas que expressam cada pelo menos um ligante.

Em uma outra modalidade preferida, o ligante, preferencialmente escolhido do grupo que consiste em ácidos nucléicos, peptídeos, polipeptí- deos, anticorpos e aptâmeros, está presente sobre um suporte sólido, prefe- rencialmente um arranjo. De acordo com a presente invenção, o termo "ar- ranjo" (incluindo "chips gênicos", "chips de proteínas", arranjos de anticorpos e similares) refere-se a um veículo em fase sólida ou similar a um gel sobre o qual pelo menos dois compostos estão aderidos ou ligados em um arranjo em uma, duas ou três dimensões. Os suportes sólidos ou arranjos que com- preendem um Iigante ou um agente de ligação para um peptídeo do tipo BNP são bem conhecidos na técnica e incluem, inter alia, materiais de colu- na, contas de poliestireno, contas de látex, contas magnéticas, partículas metálicas coloidais, chips e superfícies de vidro e/ou de silício, tiras de nitro- celulose, membranas, lâminas, "duracytes", cavidades e paredes de bande- jas de reação, tubos de plástico etc. disponíveis comercialmente. O Iigante ou o agente pode ser ligado a muitos veículos diferentes. Os exemplos de veículos bem conhecidos incluem vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextran, náilon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para as finalidades da invenção. Os métodos adequados para a fixação/imobilização do dito Iigante ou agente são bem conhecidos e incluem, mas não estão limitados a interações iôni- cas, hidrofóbicas, covalentes e similares.

É também considerada a utilização de "arranjos em suspensão" como arranjos de acordo com a presente invenção (Nolan JP, Sklar LA. (2002). Suspension array technology: evolution of the flat-array paradigm. Trends Biotechnol. 20(1):9-12). Em tais arranjos em suspensão, o veículo, por exemplo, uma microconta ou uma microesfera, está presente em sus- pensão. O arranjo consiste em microcontas ou microesferas diferentes, pos- sivelmente marcadas, carregando Iigantes diferentes.

A invenção refere-se ainda a um método de produção de arran- jos como definido anteriormente, em que pelo menos um Iigante é ligado ao material veículo em adição a outros ligantes.

Os métodos de produção de tais arranjos, por exemplo, basea- dos na química em fase sólida e em grupos protetores fotolábeis, são geral- mente conhecidos (US 5.744.305). Tais arranjos também podem ser coloca- dos em contato com substâncias ou bibliotecas de substâncias e testados em relação à interação, por exemplo, em relação à ligação ou à alteração da conformação. Portanto, os arranjos que compreendem um peptídeo ou um polipeptídeo como definido anteriormente podem ser utilizados para a identi- ficação de Iigantes que se ligam especificamente aos ditos peptídeos ou po- lipeptídeos.

Assim, a invenção refere-se ainda ao uso de um meio para diag- nóstico capaz de medir, preferencialmente in vitro, o nível de um paciente de um peptídeo do tipo BNP, particularmente de NT-pró-BNP, para o diagnósti- co do risco do paciente de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medicação futura com um ESA.

A invenção refere-se ainda ao uso de um kit que compreende um meio capaz de medir, preferencialmente in vitro, o nível de um paciente de um peptídeo do tipo BNP, particularmente de NT-pró-BNP, para o diag- nóstico do risco do paciente de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medicação futura com um ESA.

A invenção refere-se ainda a um kit que compreende um meio ou um agente para a medida de um peptídeo do tipo BNP. Tal meio ou agen- te pode ser qualquer meio ou agente adequado conhecido pelo perito na técnica. Os exemplos para tais meios ou agentes assim como para os méto- dos para o uso dos mesmos foram fornecidos neste relatório descritivo. Por exemplo, um agente adequado pode ser qualquer tipo de Iigante ou anticor- po capaz de se ligar especificamente a um peptídeo do tipo BNP. O kit tam- bém pode compreender quaisquer outros componentes considerados apro- priados no contexto da medida do(s) nível(is) dos respectivos biomarcado- res, tais como tampões, filtros etc. adequados.

Opcionalmente, o kit pode compreender adicionalmente um ma- nual do usuário para a interpretação dos resultados de qualquer(quaisquer) medida(s) em relação ao diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da medicação com ESA1 particularmente uma medicação futura com ESA. Particularmente, tal manual pode incluir informação em relação a qual nível medido corresponde a que grau de risco. Isto é descrito em detalhes em outra parte neste relató- rio descritivo. Adicionalmente, tal manual do usuário pode fornecer instru- ções em relação à utilização correta dos componentes do kit para a medida do(s) nível(is) do respectivo biomarcador.

A invenção refere-se ainda ao uso do dito kit para o diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da medicação, particularmente de uma medicação futura, com um ESA. A presente invenção refere-se ainda ao uso do dito kit em qualquer um dos métodos de acordo com a presente invenção para o diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma con- seqüência da medicação com ESA, particularmente de uma medicação futu- ra com ESA.

Além disso, a presente invenção abrange um dispositivo para o

diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medicação futura com um ESA, que com- preende

a) meios para medir a quantidade de um peptídeo do tipo BNP em uma amostra do paciente; e

b) maios para diagnosticar o dito risco através da comparação do nível medido a pelo menos um nível de referência.

A presente invenção refere-se ainda ao uso de tal dispositivo para o diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardio- vascular como uma conseqüência de uma medicação futura com um ESA.

O termo "dispositivo" como utilizado aqui se refere a um sistema de meios que compreende pelo menos os meios mencionados anteriormente ligados de forma operacional um a cada outro de forma a permitir o diagnós- tico de falência cardíaca. Os meios preferidos para a medida do nível de um peptídeo do tipo BNP e para o diagnóstico do risco são divulgados em outro lugar neste relatório descritivo em associação com o método da invenção. O fato de como ligar os meios de uma maneira operacional dependerá do tipo de meios incluídos no dispositivo. Por exemplo, quando os meios para a medida de forma automática do nível do peptídeo do tipo BNP forem aplica- dos, os dados obtidos através de tais meios que operam de forma automáti- ca podem ser processados, por exemplo, por um programa de computador com a finalidade de diagnosticar o risco. Preferencialmente, os meios são compreendidos por um dispositivo simples em tal caso. Tal dispositivo pode consequentemente incluir uma unidade de análise para a medida do nível do peptídeo do tipo BNP em uma amostra aplicada e uma unidade de computa- dor para o processamento dos dados resultantes para o diagnóstico. Alterna- tivamente, quando os meios tais como tiras de teste são utilizados para a medida do nível do peptídeo do tipo BNP1 os meios para diagnóstico podem compreender tiras de controle ou tabelas que alocam o nível medido a um nível conhecido que será acompanhado por falência cardíaca ou a um nível conhecido que será indicativo de um indivíduo saudável como discutido an- teriormente. As tiras de teste são, preferencialmente, acopladas a um Iigante ou a um agente que se liga especificamente ao peptídeo do tipo BNP. A tira ou o dispositivo, preferencialmente, compreende meios para a detecção do peptídeo do tipo BNP que se liga ao dito Iigante ou agente. Os meios prefe- ridos para detecção são divulgados em associação com as modalidades que se referem ao método da invenção acima. Em tal caso, os meios estão liga- dos de forma operacional de forma que o usuário do sistema associe o resul- tado da determinação da quantidade e o valor do diagnóstico da mesma com as instruções e as interpretações fornecidas em um manual. Os meios po- dem aparecer na forma de dispositivos separados em tal modalidade e são, preferencialmente, embalados juntos na forma de um kit. O perito na técnica entenderá como ligar os meios sem dificuldade adicional. Os dispositivos preferidos são aqueles que podem ser aplicados sem o conhecimento parti- cular de um médico especializado, por exemplo, as tiras de teste ou os dis- positivos eletrônicos que requerem somente o carregamento com uma a- mostra. Os resultados podem ser fornecidos na forma de um produto de um parâmetro de diagnóstico ou de dados brutos que precisam de interpretação pelo médico. Os dispositivos preferidos adicionais compreendem a análise de unidades/dispositivos (por exemplo, biossensores, arranjos, suportes só- lidos acoplados a Iigantes ou agentes que reconhecem especificamente BNP, dispositivos de ressonância de superfície de Plasmon, espectrômetros de RMN, espectrômetros de massa etc.) ou a avaliação de unida- des/dispositivos referidos anteriormente de acordo com o método da inven- ção.

O método de acordo com a presente invenção compreende a etapa de diagnóstico do risco do paciente através da comparação do nível medido do peptídeo do tipo BNP com pelo menos um nível de referência, por exemplo, com níveis conhecidos associados a graus diferentes de risco em um paciente.

De acordo com a presente invenção, o termo "risco" refere-se à probabilidade de um incidente particular, mais particularmente uma compli- cação cardiovascular, ocorrer. Por exemplo, um risco pode ser tal que o da- do incidente irá ocorrer com uma probabilidade de pelo menos 2%, 5%, 10%, 15% ou 20% em um certo paciente dentro de um período de tempo particular, por exemplo, 500, 750, 1000 ou 1250 dias. Estudos clínicos po- dem fornecer dados que indicam tais riscos. O certo risco pode ser derivado, por exemplo, de uma representação gráfica de Kaplan-Meier adequada du- rante um período de tempo para um certo incidente ver, por exemplo, o E- xemplo 3 e também os riscos particulares e as proporções de risco mencio- nadas aqui.

Embora o risco possa ser expresso em valores absolutos, pode ser freqüentemente mais útil expressar o risco em termos relativos, por e- xemplo, em termos de um risco maior ou enormemente maior em relação a um certo risco particular. O perito na técnica está muito familiarizado com tais termos relativos. Por exemplo, há um certo risco médio de sofrer uma complicação cardiovascular na população geral. Entretanto, pode ser mais relevante saber, se um paciente particular possui um risco adicional de so- frer uma complicação cardiovascular, de forma que o risco total deste paci- ente seja "aumentado". Vantajosamente, a presente invenção também per- mite diagnosticar tal risco relativo. Um risco relativo pode ser expresso em termos de proporções de risco. O termo "proporção de risco" é conhecido pelo perito na técnica. Isto pode expressar a relação do risco entre dois subgrupos, por exemplo, a proporção de risco entre um grupo de dosagem alta e o grupo de dosagem baixa. Um outro exemplo é a proporção de risco entre uma grupo de dosa- gem alta versus um grupo de dosagem baixa para um nível baixo de peptí- deo do tipo BNP versus para um nível alto de peptídeo do tipo BNP. Uma diferença nas proporções de risco é conhecida como a interação que será extraída dos modelos de interação, por exemplo, de grupos de dosagem com certos níveis de BNP. Os termos interação e modelo de interação são conhecidos pelo perito na técnica.

Particularmente, a presente invenção permite identificar pacien- tes em maior risco de sofrer uma complicação cardiovascular se tratados com uma alta dosagem de um ESA (isto é, intencionada para um nível-alvo alto de hemoglobina), respectivamente.

Por exemplo, o risco pode ser aumentado ou altamente aumen- tado. O risco também pode não ser aumentado. O perito na técnica está fa- miliarizado com o significado destes termos. Por exemplo, se um paciente particular tiver um risco maior que um paciente normal, então o perito na técnica geralmente denominará tal risco como "maior". Preferencialmente, o termo "risco maior" é entendido como indicando que o paciente não deve ser tratado com uma alta dosagem de um ESA. Preferencialmente, um paciente que possui um maior risco deve ser monitorado com cuidado adicional em relação ao desenvolvimento de quaisquer complicações cardiovasculares. O perito na técnica entenderá que a decisão final em relação ao tratamento será da responsabilidade do médico que considerará fatores relevantes adi- cionais, tais como a idade do paciente, o histórico familiar da complicação cardiovascular, a disponibilidade de possibilidades de monitoramento etc.

No contexto da invenção, um risco maior de sofrer uma compli- cação cardiovascular como uma conseqüência da administração de um ESA refere-se particularmente a um aumento do risco em pelo menos 1,5 vez, 2 vezes, 3 vezes, 3,5 vezes ou 4 vezes quando comparado com o risco de um paciente normal, preferencialmente de um paciente normal da mesma idade e gênero, mais preferencialmente com um paciente da mesma idade, gênero e distúrbio que causa os sintomas que podem ser tratados com uma medi- cação com ESA (por exemplo, diabetes ou câncer. Distúrbios adicionais que causam sintomas que podem ser tratados com uma medicação com ESA já foram mencionados em outro lugar neste relatório descritivo).

O perito na técnica é capaz de determinar níveis conhecidos de peptídeos do tipo BNP que estão associados com graus diferentes de risco de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da me- dicação com ESA.

De acordo com a invenção, quanto maior o risco medido do pep- tídeo do tipo BNP, maior é o risco de sofrer uma complicação cardiovascular.

Preferencialmente, o risco é determinado através da compara- ção do nível medido do peptídeo do tipo BNP com um nível de referência. O termo "nível de referência" é conhecido pelo perito na técnica. Particular- mente, um nível de referência pode ser associado com um risco particular ou pode ser distinguido entre graus de risco diferentes. Será considerado que o nível de referência também pode ser escolhido de acordo com a sensibilida- de ou a especificidade desejada do diagnóstico. Uma sensibilidade maior significa que uma fração maior de todos os pacientes que possuem um di- agnóstico particular é identificada e/ou que menos pacientes que possuem um diagnóstico particular recebem diagnósticos errados como não possuin- do a doença diagnosticada, a complicação ou o risco. Uma especificidade maior significa que uma fração maior dos pacientes identificados como pos- suindo um diagnóstico particular na verdade tem a doença diagnosticada, a complicação ou o risco. Quanto maior a sensibilidade desejada para um di- agnóstico particular, menor é a especificidade deste diagnóstico e vice- versa. Portanto, o nível de referência pode ser escolhido pelo perito na téc- nica de acordo com a sensibilidade e a especificidade desejadas. No contexto desta discussão, é evidente que um nível de refe-

rência pode não somente ser um valor único, mas também pode incluir uma faixa de valores. Mais particularmente, os níveis de referência podem ser deriva- dos de níveis de peptídeos do tipo BNP determinados, por exemplo, em es- tudos clínicos tais como os apresentados nos exemplos.

Os exemplos para os níveis de referência são fornecidos a se- guir, ou seja, são fornecidos os níveis no plasma de NT-pró-BNP que foram descobertos no curso da invenção como estando associados com ou distin- guindo os graus indicados de risco de sofrer uma complicação cardiovascu- Iar como uma conseqüência da medicação com ESA.

É evidente, que os níveis fornecidos abaixo possam servir ape- nas como uma primeira classificação do risco de um paciente. Por exemplo, o risco também pode ser dependente da capacidade de bombeamento es- parso do coração do paciente particular.

De acordo com a invenção, por exemplo, um nível correspon- dente a um nível no plasma menor que 500 pg/mL, mais particularmente menor que 400 pg/mL, mais particularmente menor que 300 pg/mL de NT- pró-BNP não está associado com um risco maior de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da medicação com ESA.

De acordo com a invenção, por exemplo, um nível correspon- dente a um nível no plasma equivalente ou maior que 300 pg/mL, mais parti- cularmente equivalente ou maior que 400 pg/mL, mais particularmente equi- valente ou maior que 500 pg/mL de NT-pró-BNP está associado com um risco maior de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conse- qüência da medicação com ESA.

De acordo com a invenção, por exemplo, um nível correspon- dente a um nível no plasma equivalente ou maior que 1000 pg/mL de NT- pró-BNP pode indicar um risco enormemente maior em pode ser considera- do o fato de que o paciente não deve ser tratado com ESA de forma alguma.

É evidente que os níveis fornecidos podem se sobrepor, depen- dendo da sensibilidade e da especificidade escolhidas. Portanto, de acordo com a invenção, por exemplo, um nível correspondente a um nível no plas- ma de 300 até 500 pg/mL, mais particularmente de 350 até 450 pg/mL, mais particularmente de 380 até 420 pg/mL, particularmente de 400 pg/mL de NT- pró-BNP é capaz de distinguir entre nenhum risco maior e um risco maior de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da medica- ção com ESA. Se o nível medido for maior que este nível de distinção, então o nível medido indica um risco maior de sofrer uma complicação cardiovas- cular como uma conseqüência da medicação com ESA. Tal nível de distin- ção também pode ser chamado de "faixa" ou "limiar de decisão".

Uma vez que o risco em um paciente foi diagnosticado, pode ter conseqüências em relação ao tratamento subsequente como descrito abai- xo. Os graus de risco mencionados abaixo se referem particularmente aos graus de risco associados com os níveis descritos anteriormente de NT-pró- BNP.

Se um método de acordo com a presente invenção não indicar um risco maior, então o tratamento pode ser continuado como planejado, por exemplo, uma dosagem alta de ESA pode ser administrada (ou de forma correspondente esta pode ser intencionada para um nível-alvo alto de ESA). O tratamento com ESA pode ser acompanhado pelo monitoramento dos ní- veis de NT-pró-BNP em intervalos espaçados de forma imprecisa, por e- xemplo, a cada 4 semanas, 2 meses ou 3 meses.

O nível de referência pode ser adaptado para grupos particula- res de pacientes. Por exemplo, o nível de referência para a medida em a- mostras de sangue pode ser aumentado em 10-30 %, mais preferencialmen- te 15-25%, mais preferencialmente 20 % para pacientes que sofrem de do- ença renal.

Se um método de acordo com a presente invenção indicar um maior risco, então o tratamento pode ser adaptado. Preferencialmente, o tratamento será acompanhado pela medida adicional do nível dos peptídeos do tipo BNP da invenção e pelo diagnóstico adicional, tal como eletrocardio- grafia, ecocardiografia ou quaisquer outros métodos adequados conhecidos pelo cardiologista perito. A dosagem de medicação com ESA pode ser redu- zida ou nenhuma medicação com ESA pode ser administrada. Portanto, a presente invenção fornece ainda um método de tratamento de um paciente que está recebendo ou está para receber uma medicação com ESA. Como já mencionado, a presente invenção também permite de- terminar uma dosagem de medicação otimizada com um ESA1 particular- mente em relação ao risco cardiovascular do paciente. Portanto, a presente invenção refere-se ainda a um método para a determinação da dosagem de uma medicação, preferencialmente uma medicação futura, de um ESA que será administrado a um paciente particularmente em relação ao risco do pa- ciente de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da dita medicação com ESA, que compreende as etapas de (a) medida, pre- ferencialmente in vitro, do nível de um peptídeo do tipo BNP no paciente, (b) determinação da dosagem que será administrada ao paciente através da comparação do nível medido do peptídeo do tipo BNP com pelo menos um nível de referência que faz a distinção entre as dosagens diferentes que de- vem ser administradas.

Se uma dosagem de medicação com um ESA for escolhida, é geralmente desejável escolher a dosagem mais alta possível que atinja o tratamento eficiente de anemia, mas a dose não causa efeitos colaterais in- desejados. Entretanto, se o médico responsável não estiver ciente do risco de um efeito colateral indesejado particular, tal como uma complicação car- diovascular, então este pode acidentalmente escolher uma dosagem que é muito alta e que pode resultar em uma complicação cardiovascular. Em con- traste, se o médico não puder determinar um certo risco, então este pode escolher uma dosagem que é muito baixa para atingir o benefício terapêutico ótimo, particularmente o tratamento eficiente da anemia.

Preferencialmente, a dosagem deve ser alta o bastante para tra- tar suficientemente a anemia, com a finalidade de reduzir o esforço sobre o coração. Preferencialmente, a dosagem deve ser baixa o suficiente para evi- tar uma complicação cardiovascular resultante da medicação com ESA.

Vantajosamente, a presente invenção fornece (1) informação de que há um risco de sofrer uma complicação cardiovascular como uma con- seqüência do tratamento com ESA e (2) informação em relação à otimização da dosagem do ESA (particularmente de acordo com o nível-alvo de hemo- globina) para minimizar o risco de complicação cardiovascular. A invenção (3) fornece ainda informação do fato de que o trata- mento com ESA pode ser iniciado em casos de anemia relativamente bran- da, isto é, já em níveis relativamente altos de Hb em um paciente (por e- xemplo, em 11,0 até 12,5 g/dl) ("tratamento precoce") ou, ao invés disso, na anemia ligeiramente mais grave (por exemplo, menos que 10,5 g/dl ou em 9,5 até 10,5 g/dl de Hb) ("tratamento tardio").

Mais particularmente, se o nível do peptídeo do tipo BNP indicar um risco maior de sofrer uma complicação cardiovascular (tal como descrito em outro lugar neste relatório descritivo), então indica que o paciente não deve ser tratado com uma dosagem alta de um ESA e/ou indica que o paci- ente pode ser tratado apenas com uma dosagem baixa de um ESA e/ou in- dica que o tratamento não deve ser iniciado precocemente. Pode também indicar que o paciente não deve ser tratado com um ESA. Pode também in- dicar que o paciente deve ser adicionalmente tratado como descrito para o caso de um risco maior, preferencialmente o paciente deve ser adicional- mente monitorado como descrito em outro lugar.

No contexto da invenção, os termos "dosagem baixa" e "dosa- gem alta" de um ESA são preferencialmente entendidos como dosagens ne- cessárias para aumentar o nível de hemoglobina até um certo valor alvo. Assim, os termos "dosagem baixa" e "dosagem alta" podem também ser en- tendidos se referindo a uma correção "parcial" versus "completa" da anemia. Uma dosagem baixa refere-se preferencialmente a uma dosagem de ESA que não é maior que a necessária para atingir um nível de Hb de 13 g/dl, mais preferencialmente uma dosagem que não é maior que a necessária para atingir um nível de Hb de 12 g/dl. Os exemplos de dosagens baixas podem incluir dosagens de ESA direcionadas para atingir um nível-alvo de Hbde 9, 9,5, 10, 10,5, 11, 11,5, 12, 12,5 ou 13 g/dl. Uma dosagem alta refe- re-se preferencialmente a uma dosagem de ESA suficiente para atingir um nível de Hb de pelo menos 14 g/dl, mais preferencialmente uma dosagem suficiente para atingir um nível de Hb de 14,5 g/dl. Os exemplos de dosa- gens altas podem incluir dosagens de ESA direcionadas para atingir um ní- vel-alvo de Hb de 14, 14,5, 15 g/dl. Alternativamente, os termos "dosagem baixa" e "dosagem alta" podem ser entendidos como as dosagens capazes de aumentar o nível de Hb em menos de 2 g/dl particularmente em menos que 1,5 g/dl, 1 g/dl ou 0,5 g/dl (dosagens baixas) ou em menos que 2 g/dl, 2,5 g/dl ou 3 g/dl (dosagens altas).

Por exemplo, uma dosagem alta pode corresponder a uma do- sagem suficiente para manter um nível-alvo de 13 até 15 g/dl de hemoglobi- na em um paciente com um nível de 11,0 até 12,5 g/dl de hemoglobina antes do início da medicação com ESA. Em um outro exemplo, uma dosagem bai- xa pode corresponder a uma dosagem suficiente para manter um alvo de 10,5 até 11,5 g/dl de hemoglobina em um paciente com um nível menor que 10,5 g/dl de hemoglobina, preferencialmente com um nível entre 9,5 e 10,5 g/dl, antes do início da medicação com ESA.

A invenção fornece meios e métodos em relação ao diagnóstico do risco de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência do tratamento com ESA. Em particular, o ensinamento da invenção refere-se a dosagens ESA consideradas anteriormente como não estando associadas com o risco de sofrer uma complicação cardiovascular, por exemplo, uma dosagem que não é maior que a necessária para atingir uma concentração de hemoglobina no sangue de pelo menos 17, 18, 19 ou 20 g/dl. Assim, o ensinamento da presente invenção já se refere a dosagens que não causam a hiperviscosidade do sangue ou quaisquer outros eventos adversos conhe- cidos no contexto de doping sangüíneo em atletas.

Será considerado que os valores fornecidos acima para dosa- gem "baixa" ou "alta" não se referem às dosagens requeridas em indivíduos normais (em que o ESA pode não ser necessário de forma alguma para a- tingir os ditos níveis), mas às dosagens administradas a pacientes que so- frem de anemia. Em particular, os níveis se referem a pacientes que possu- em um nível de Hb (antes que o tratamento com ESA seja iniciado) menor que 12 g/dl, particularmente menor que 10 g/dl, mais particularmente menor que 9 g/dl, mais particularmente menor que 8 g/dl em um paciente do sexo masculino ou a um nível de Hb (antes que o tratamento com ESA seja inici- ado) menor que 11 g/dl, particularmente menor que 10 g/dl, mais particular- mente menor que 9 g/dl, mais particularmente menor que 8 g/dl em um paci- ente do sexo feminino.

O perito na técnica está familiarizado com os métodos para de- terminar as dosagens de ESA para atingir um certo nível ou um valor alvo de Hb. Por exemplo, em um paciente anêmico (por exemplo, que possui um nível de Hb de 9,5 até 12,5 g/dl) o tratamento pode ser iniciado com uma dosagem que corresponde a 2000 unidades internacionais de NeoRecor- mon®, administradas de forma subcutânea uma vez por semana. O nível de Hb em tal paciente seria medido, por exemplo, após uma semana ou após um mês e a dosagem seria adicionalmente adaptada até que fosse encon- trado um regime de tratamento que satisfizesse um certo valor alvo. Pode haver adaptação e monitoramento adicionais da dosagem, por exemplo, de- pendendo da progressão da doença. Será considerado que os níveis de Hb realmente atingidos podem flutuar até um certo grau, por exemplo, depen- dendo da freqüência de administração do ESA ou da progressão da doença.

Quaisquer modalidades ou características preferidas menciona- das nesta descrição obviamente se aplicam de forma correspondente ao aspecto de determinação da dosagem da medicação com ESA. A invenção refere-se ainda ao monitoramento do risco de sofrer

uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da medicação, particularmente de uma medicação futura, com um ESA. Além disso, a in- venção refere-se ainda ao monitoramento adicional do risco uma vez que o risco foi diagnosticado. Mais particularmente, o monitoramento refere-se ao monitoramento em um paciente no qual no momento de tal primeira medida ou diagnóstico qualquer medicação anterior com um ESA, mais particular- mente eritropoietina ou uma variante da mesma, ocorreu pelo menos um mês, particularmente pelo menos 2 meses, mais particularmente pelo menos 6 meses, mais particularmente pelo menos 1 ano antes do momento da me- dida ou do diagnóstico. Ainda mais particularmente, no momento da primeira medida ou diagnóstico o paciente não tinha recebido qualquer medicação anterior com um ESA. A invenção refere-se ainda ao monitoramento da pre- sente condição cardiovascular em qualquer tal paciente.

O termo "monitoramento" é conhecido pelo perito na técnica e foi definido em outro lugar neste relatório descritivo. Mais particularmente, o monitoramento pode ser realizado através do diagnóstico do risco do pacien- te em intervalos regulares, por exemplo, em intervalos de aproximadamente 2 horas, 10 horas, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 1 semana, 2 semanas, 3 se- manas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 4 meses, 6 meses ou 1 ano. O termo "aproximadamente" neste contexto é entendido pelo perito na técnica. Por- tanto, o intervalo real pode também desviar de um intervalo regular depen- dendo das circunstâncias práticas de forma a providenciar equipamentos adequados etc. Particularmente o intervalo pode, por exemplo, desviar em até 100%, preferencialmente até 50%, mais preferencialmente até 25%, mais preferencialmente até 10%.

O monitoramento pode ser realizado acompanhando a medica- ção com um ESA ou não acompanhando o tratamento com um ESA. O mo- nitoramento também permite adaptar e otimizar adicionalmente a dosagem de uma medicação com ESA.

Quaisquer modalidades ou características preferidas menciona- das nesta descrição evidentemente se aplicam de forma correspondente ao aspecto de monitoramento.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para decidir o tratamento de um paciente com uma medicação com ESA e/ou para decidir em relação à dosagem de uma medicação com ESA planejada, que compreende as etapas de (a) medida, preferencialmente in vitro, do nível de um peptídeo do tipo BNP, (b) diagnóstico do risco do paci- ente de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência da medicação com ESA através da comparação do nível medido do peptídeo do tipo BNP com níveis conhecidos associados com graus diferentes de ris- co em um paciente, (c) início opcional de um exame do paciente por um car- diologista, (d) recomendação do início do tratamento ou da abstenção do tratamento, opcionalmente considerando o resultado do exame do paciente pelo cardiologista. Preferencialmente, o início de um exame por um cardiolo- gista e/ou a abstenção do tratamento é recomendada se o método indicar a presença de um risco maior de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de medicação com um ESA. É evidente que o método possa ser adaptado de acordo com todas as modalidades ou os aspectos preferidos da invenção mencionados neste relatório descritivo.

Os exemplos a seguir ilustram a invenção e não é pretendido que limitem seu escopo de forma alguma.

Finalmente, a presente invenção abrange ainda o uso dos dis- positivos descritos anteriormente aqui ou do peptídeo do tipo BNP ou de uma variante do mesmo para o diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medica- ção futura com um ESA.

Todas as referências citadas neste relatório específico são in- corporadas aqui como referência em relação ao conteúdo total de sua divul- gação e ao conteúdo da divulgação mencionado especificamente neste rela- tório descritivo. Descrição das Figuras:

Figura 1: Gráficos de Kaplan-Meier e proporções de risco (HR, proporções de risco) para o ponto final cardiovascular primário. Figura 2: Gráficos de Kaplan-Meier e proporções de risco (HR,

proporções de risco) para eventos cardíacos adversos (complicações cardí- acas).

Figura 3: Gráficos de Kaplan-Meier e proporções de risco (HR, proporções de risco) para eventos cardiovasculares adversos (AE) (compli- cações cardiovasculares).

Figura 4: Exibição gráfica de proporções de risco estimadas (HR, proporções de risco) para eventos cardiovasculares adversos (CVAE) e o ponto final cardiovascular primário (P Endp) incluindo intervalos de confiança de 95%. Exemplo 1

Medida de NT-pró-BNP:

O NT-pró-BNP é determinado através de um ensaio imunológico eletroquimioluminescente (Elecsys proBNP sandwich immunoassay; Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) em Elecsys 2010. O ensaio funciona de acordo com o princípio de ensaio imunológico em sanduíche com eletroqui- mioluminescência. Em uma primeira etapa, o anticorpo de captura IgG mar- cado com biotina (1-21), o anticorpo sinal F(ab')2 (39-50) marcado com rutê- nio e 20 microlitros de amostra são incubados a 37 0C durante 9 minutos. Depois disso, micropartículas magnéticas revestidas com estreptavidina são adicionadas e a mistura é incubada durante 9 minutos adicionais. Após a segunda incubação, a mistura de reação é transferida para a célula de me- dida do sistema onde as contas são capturadas de forma magnética na su- perfície de um eletrodo. A marcação não-ligada é removida através da lava- gem da célula de medida com tampão.

Na última etapa, é aplicada uma voltagem no eletrodo na pre- sença de um tampão contendo tripropilamina e o sinal eletroquimiolumines- cente resultante é registrado por um fotomultiplicador. Todos os reagentes e as amostras são tratados de forma totalmente automática pelo instrumento Elecsys®. Os resultados são determinados através de uma curva de calibra- ção que é gerada especificamente para o instrumento através da calibração de 2 pontos e uma curva de controle é fornecida pelo código de barras do reagente. O teste é realizado de acordo com as instruções do fabricante. Exemplo 2

Obtenção das amostras:

São tiradas amostras do sangue para a análise do peptídeo do tipo BNP em tubos de EDTA contendo 5000 U de aprotinina (Trasylol, Beyer, Alemanha) e tubos e Litio-Heparina (para a química clínica), quando apro- priado. As amostras de sangue e urina são imediatamente centrifugadas du- rante 10 min a 3400 rpm a 4 0C. Os sobrenadantes são armazenados a -80°C até a análise. Exemplo 3 Objetivo:

O estudo CREATE era um estudo multicêntrico de grupos para- lelos aleatório aberto para investigar o efeito da correção precoce da anemia com epoetina beta sobre a redução do risco cardiovascular em pacientes com anemia renal crônica que não estão em terapia de reposição renal. O objetivo primário do estudo era investigar o efeito do tratamento precoce com epoetina beta em relação ao nível-alvo de hemoglobina (Hb) de 13-15 g/dl sobre a morbidade cardiovascular e comparar estes efeitos com os atin- gidos com o tratamento com epoetina beta para manter um nível-alvo de Hb de 10,5-11,5 g/dl. Método:

O ponto final primário era o ponto final combinado de todos os eventos cardiovasculares especificados pelo protocolo (tempo até o primeiro evento): angina pectoris que leva à hospitalização durante pelo menos 24 h ou ao prolongamento da hospitalização, falência cardíaca aguda, infato do miocárdio fatal ou não-fatal, derrame fatal ou não-fatal, morte súbita, ataque isquêmico cerebral transitório (TIA), doença vascular periférica (amputação, necrose), arritmias cardíacas que levam à hospitalização durante pelo me- nos 24 h ou ao prolongamento da hospitalização. Variáveis secundárias:

- mortalidade cardiovascular, mortalidade de todas as causas, falência cardíaca crônica (classificação da NYHA), intervenções cardiovas-

culares: tempo até o evento e freqüência de episódios

- admissões no hospital e duração das hospitalizações por ra- zões cardiovasculares

- índice de massa do ventrículo esquerdo, volume do ventrículo esquerdo, fração de expulsão do ventrículo esquerdo, redução fracional do

miocárdio

- Qualidade de Vida (questionário SF-36)

No subestudo do NT-pró-BNP, medidas de laboratório adicionais foram feitas na linha de base 6, 12, 24, 36 e 48 meses, para um subconjunto de pacientes no estudo CREATE. As medidas realizadas são NT-pró-BNP e outras são medidas de laboratório.

O grupo de estudo inteiro foi acompanhado em relação à ocor- rência de eventos adversos incluindo eventos adversos cardíacos e cardio- vasculares (CV). Todos os eventos CV foram classificados pela equipe de segurança de fármacos profissional da Roche nas categorias de MedDRA (Medicai Directionary of Regulatory Activities). Os Eventos Cardíacos com- preendiam eventos específicos como angina pectoris, arritmias falência car- díaca aguda ou crônica, infato do miocárdio, bradicardia e taquicardia. Os eventos cardiovasculares contêm em adição eventos relacionados com o sistema vascular tal como hipertensão, hipotensão, doença vascular periféri- ca ou trombose de veias profundas. É típico que para os registros de even- tos adversos fossem também observados distúrbios inespecíficos sob even- tos cardiovasculares tais como palpitações ou vermelhidão. Análise:

Em uma primeira linha de base da análise preliminar os níveis de NT-pró-BNP de 266 pacientes da população do estudo CREATE foram separados em 2 grupos de tratamento ("Hb alta" = valor alvo de Hb de 13- 15g/dl e "Hb baixa" = valor alvo de Hb de 10,5-11,5 pg/dl). Além disso, os grupos foram divididos pelo nível de NT-pró-BNP mediano preliminar do gru- po todo (> e < 400 pg/mL). O tempo até o primeiro evento cardíaco que é definido pelo ponto final primário do estudo foi representado graficamente em um gráfico de Kaplan Meier (por exemplo, fração da população que não sofreu este evento particular) Figura 1. As proporções de risco (isto é, o fator em que o respectivo risco é aumentado ou diminuído) foram calculadas e os valores de ρ < 0,05 foram considerados significativos. Igualmente, foram ge- rados os gráficos de Kaplan-Meier para o tempo até o primeiro evento cardí- aco adverso (Figuras 2-3). Resultados Preliminares:

Uma visão geral das taxas de incidência (ignorando a sincroni- zação dos eventos) dos 2 grupos de tratamento é fornecida pela tabela a seguir: CV AE ponto final de CV primário NT-pró- BNP<400 NT-pró- BNP>400 NT-pró- BNP<400 NT-pró- BNP>400 Hb baixa 47 % 49% 11 % 21 % Hb alta 40% 68% 11 % 35%

No grupo de pacientes com níveis de linha de base de NT-pró- BNP abaixo de 400 pg/mL nenhuma diferença em relação ao ponto final de CV primário ou aos eventos adversos cardiovasculares é evidente para os 2 grupos de tratamento, enquanto que aqueles com valores de linha de base acima de 400 pg/mL exibem maiores incidências, em particular, para o grupo de 'Hb alta'. Uma análise mais aproximada através de métodos de 'tempo até o evento' mostrou que um risco estatisticamente significativamente maior de sofrer o ponto final cardiovascular primário era observado no grupo de tratamento de "Hb alta" (>3,7 vezes) e uma forte tendência para o grupo de "Hb baixa", quase não atingindo uma significância estatística (Figura 1).

Os pacientes com valores acima de 400 pg/mL comparados com aqueles com valores abaixo de 400 pg/mL sofreram estatisticamente signifi- cativamente mais eventos cardíacos em ambos os grupos de estratégia de tratamento com uma proporção de risco maior para o grupo de "Hb alta" (Fi- gura 2). Para os eventos adversos cardiovasculares o risco era estatistica- mente significativamente maior no grupo que foi tratado com a estratégia de valor alvo alto que no de estratégia de valor alvo baixo (grupo de pacientes com valores de linha de base >400 pg/mL) (Fig 3). Os resultados da análise de risco para o ponto final primário e os eventos adversos cardiovasculares são resumidos no gráfico de Forest (Figura 4), que mostra as proporções de risco estimadas junto com os intervalos de confiança. Conclusão:

Os resultados preliminares indicam que o NT-pró-BNP poderia identificar uma população de pacientes (níveis de linha de base abaixo de 400 pg/mL) dentro da população de CREATE que pode ser tratada de forma segura com epoetina beta o a estratégia de Hb alvo baixa e alta. Em pacien- tes com níveis de NT-pró-BNP acima de 400 pg/mL na linha de base, o mar- cador identifica um grupo de pacientes em um risco maior de eventos cardí- acos e cardiovasculares. A faixa de 400 pg/mL é uma escolha preliminar e há a possibilidade de outras escolhas dependendo da situação da decisão clínica. Uma análise de risco benefício cuidadosa, em particular, para a es- tratégia de Hb alvo alta é indicada, incluindo um monitoramento completo da condição de CV para esta estratégia de tratamento.

Claims (16)

1. Processo para o diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medica- ção futura com um agente de estimulação da eritropoiese (ESA), que com- preende as etapas de a) medida do nível de um peptídeo do tipo BNP ou de uma vari- ante do mesmo em uma amostra do paciente, b) diagnóstico do dito risco através da comparação do nível me- dido do peptídeo do tipo BNP ou de uma variante do mesmo com pelo me- nos um nível de referência.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa a) e/ou a etapa b) são realizadas antes que a medicação com o ESA seja inici- ada e/ou quando o paciente ainda não recebeu a medicação com um ESA.

3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 2, em que o peptídeo do tipo BNP é BNP1 NT-pró-BNP ou uma variante do mesmo.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que o peptídeo do tipo BNP é NT-pró-BNP ou uma variante do mesmo.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 4, em que o nível de referência corresponde a um nível no plasma de NT-pró-BNP de 300 até 500 pg/mL, particularmente de 350 até 450 pg/mL.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 5, em que um nível medido acima do nível de referência indica que o risco é maior.

7. Processo de acordo com a reivindicação 6, em que o risco maior refere-se a um aumento de pelo menos 1,5 vez, particularmente 2 ve- zes, mais particularmente 3 vezes quando comparado com o risco de um paciente normal, preferencialmente de um paciente normal da mesma idade, sexo e doença que causa anemia.

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 ou 7, em que o risco maior indica que o paciente não deve ser tratado com uma dosagem alta de um ESA.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a dosa- gem alta do ESA corresponde a uma dosagem suficiente para atingir uma concentração de hemoglobina no sangue de pelo menos 14 pg/dl, particu- larmente 14,5 g/dl, mais particularmente 15 g/dl.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 9, em que o ESA é escolhido do grupo que consiste em (a) eritropoetina isolada da urina, (b) epoetina beta, (c) epoetina delta, (e) epoetina omega, (f) darbepoetina alfa e (g) Cera.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 10, em que a complicação cardiovascular é doença cardíaca coronaria- na, síndrome coronariana aguda, infato do miocárdio, disfunção do ventrícu- lo esquerdo, falência cardíaca congestiva ou trombose.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 11, em que o nível do peptídeo do tipo BNP é medido utilizando um Ii- gante de ligação específica, preferencialmente um anticorpo ou um aptâme- ro.

13. Uso de um meio de diagnóstico capaz de medir, preferenci- almente in vitro, o nível de um paciente de um peptídeo do tipo BNP, particu- larmente NT-pró-BNP, para o diagnóstico do risco do paciente de sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medicação futura com um ESA.

14. Uso de um kit que compreende um meio capaz de medir, preferencialmente in vitro, o nível de um paciente de um peptídeo do tipo BNP ou uma variante do mesmo, particularmente NT-pró-BNP ou uma vari- ante do mesmo, para o diagnóstico do risco do paciente de sofrer uma com- plicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medicação futura com um ESA.

15. Dispositivo para o diagnóstico do risco de um paciente sofrer uma complicação cardiovascular como uma conseqüência de uma medica- ção futura com um ESA, que compreende (a) meios para medir a quantidade de um peptídeo do tipo BNP ou uma variante do mesmo em uma amostra do paciente; e (b) meios para diagnosticar o dito risco através da comparação do nível medido com pelo menos um nível de referência.

16. Processo para a decisão de uma medicação futura de um paciente com um ESA, particularmente com uma dosagem alta de um ESA, que compreende as etapas de (a) medida, preferencialmente in vitro, do nível de um peptídeo do tipo BNP ou uma variante do mesmo, (b) diagnóstico do risco do paciente sofrer uma complicação car- diovascular como uma conseqüência da medicação planejada através da comparação do nível medido do peptídeo do tipo BNP ou uma variante do mesmo com pelo menos um nível de referência, (c) início opcional do exame do paciente por um cardiologista, (d) recomendação para interromper a medicação com ESA ou recomendação de apenas uma medicação com uma dosagem baixa do ESA se o processo indicar a presença de um risco maior de sofrer uma complica- ção cardiovascular como uma conseqüência da medicação com ESA.