BRPI0715318A2 - mÉtodo para reduzir a pressço itraocular e mÉtodo para assegurara a liberaÇço de uma composiÇço terapÊutica para reduzir a pressço intraocular - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA REDUZIR A PRESSçO INTRAOCULAR E MÉTODO PARA ASSEGURAR A LIBERÇçO DE UMA COMPOSIÇçO TERAPÊUTICA PARA REDUZIR A PRESSçO INTRAOCULAR. São providos para redução da pressão intraocular em um individos tendo um distúrbio ocular causando uma pressão intraocular elevada, tal como glaucoma. O método compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica para redução da pressão ocular compreendendo um antagonista (A~3 AR) receptor de adenosina subtipo A~3, incluindo dihidropirina, piridina, sal de piridíno ou triazoloquinazolina, e derivados dos mesmos tendo, expressamente, uma atividade antagonista A~3Ar, incluindo, por exemplo, o antagonista A~3AR baseado no nucleosídeo, MRS-3820. Adicioanlmente é provido um método para assegurar a liberação de uma composição terapêutica administrada topicamente para reduzir a pressão intraocular, sendo que método requer, expressamente, a abertura física de um canal através da barreira da córnea do olho do paciente por uma microagulha ou micropipeta para permitir o transporte da composição tópica para antes da câmara do olho.

Description

"MÉTODO PARA REDUZIR A PRESSÃO INTRAOCULAR E MÉTODO PARA ASSEGURAR A LIBERAÇÃO DE UMA COMPOSIÇÃO TERAPÊUTICA PARA REDUZIR A PRESSÃO INTRAOCULAR". Campo da invenção

A presente invenção refere-se ao uso de um antagonista do receptor de adenosina subtipo A3 como uma espécie-cruzada farmacêutica para reduzir a pressão intraocular, e métodos para assegurar a liberação efetiva ao sitio alvo. Histórico da invenção

0 glaucoma, um distúrbio caracterizado pelo aumento da pressão intraocular (IOP), é um dos principais causadores da cegueira irreversível ("Quigley et al. - Br. J. Ophthalmol", 80:389-393, (1996)). A pressão intraocular é determinada pela proporção do fluxo direcionado de humor aquoso através do epitélio ciliar e da resistência à saída do fluxo direcionado para a câmara anterior dos olhos. Em uma resistência de fluxo de saída fixada, um aumento no fluxo de entrada irá aumentar o IOP até que a soma da pressão dos fluxos direcionados de saída, dependente e independentes da pressão se compare a soma dos fluxos direcionados de entrada. 0 IOP aumentado conduz, tipicamente, à morte da célula do gânglio retinal e a uma atrofia do nervo óptico. A redução do IOP elevado é apenas uma estratégia que, atualmente, não é documentada de forma equivalente como um método para retardar o início de e diminuir a progressão da cegueira glaucomatosa. Muitos componentes de transporte que sustentam o fluxo direcionado de entrada são conhecidos (figura 1), mas sua regulação pouco entendida. 0 humor aquoso dos olhos é formado pelo epitélio ciliar, que compreende duas camadas celulares: as células epiteliais pigmentadas externas (PE) em frente ao estroma e as células epiteliais não-pigmentadas internas (NPE) em contato com o humor aquoso. A atividade dos canais Cl" é provavelmente um fator limitante pela taxa na secreção do humor aquoso, resultando em um baixo nível de linha de partida da atividade do canal e da predominância do ânion cloreto no fluido transferido (Coca-Prados et al., "Am. J. Physiol.", 268: C572-C579 (1995)). Assim, acredita-se que a secreção do humor aquoso dentro dos olhos seja uma conseqüência de dois processos fisiologicamente opostos: secreção de fluido dentro dos olhos pelas células NPE e reabsorção do fluido (secreção externa dos olhos) pelas células PE. Adicionalmente, a liberação do ion cloreto (Cl") pelas células epiteliais ciliares não-pigmentadas (NPE) dentro do humor aquoso adjacente a via dos canais Cl", parece aumentar a secreção, enquanto que a liberação de Cl", pelas células epiteliais ciliares pigmentadas (PE) dentro do estroma nas proximidades parece reduzir a secreção liquida (Civan, xxCurrent Toplcs in Membranes", 45:1-24 (1998); Civan, "News Physiol. Sci.", 12:158-162 (1997)).

Descobriu-se que a adenosina ativa os canais CI"/NPE, que capacitam a liberação de CTfCarre et al., "Am. J. Physiol", (Cell Physiol, 42), 273:C1354-C1361 (1997)). As purinas, uma classe de compostos químicos que inclui adenosina, ATP e compostos relacionados pode regular a secreção dos humores aquosos, em parte através da modificação da atividade do canal Cl". Ambas as células NPE e PE tem sido relatadas por liberar a ATP para a superfície extracelular, onde a ATP pode ser metabolizada para adenosina pelas ecto-enzimas (Mitchell et al., "Proc. Natl. Acad. Sei", U.S.A., 95:7174-7178, (1998)), e ambos os tipos de células possuem receptores para adenosina (Wax et al., "Exp. Eye Res.", 57:89-95 (1993); Wax et al., "Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.", 35:3057- 3063, (1994); Kvanta et al., "Exp. Eye. Res.", 65:595-602 (1997)) e receptores ATP (Wax et al., supra, 1993; Shahidullah et al. , "curr. Eye Res.", 16:1006-1016 (1997)). Adicionalmente, estudos in vítro em coelhos têm associado os receptores de adenosina A2 com a secreção aumentada e a pressão intraocular elevada (Crosson et al., "Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.", 37:1833-1839, (1996) ) e os receptores de adenosina Al com a conversão J 3

(Crosson, "J. Pharmacol. Exp. Ther.", 273: 320-326, (1995)). Associações qualitativamente similares com a pressão intraocular, mas não com a secreção, têm sido observadas em macacos cinomólogos (Tain et al., "Exp. Eye Res.", 64:979-989 (1997)).

A pressão intraocular tem também sido reduzida pelo estimulo da reabsorção do humor aquoso. Em principio, isto poderia ser conseguido pela ativação dos canais de cloreto na superfície basolateral da camada de célula pigmentada, que poderia liberar o cloreto de volta para dentro do estroma. Nas células PE, isto tem sido acompanhado usando o anti-estrogênio, Tamoxifen. Alternativamente, os receptores de adenosina (ARs) tiveram um potencial promissor para diminuir o IOP. Isto é devido ao nocaute dos receptores de adenosina A3 que demonstra reduzir o IOP in vivo nos camundongos. As observações in vitro indicam que a redução de nocaute iniciado em IOP é mediada através de uma redução no fluxo direcionado para dentro. Quando combinado, os relatórios publicados demonstraram que: (1) a adenosina ativa os canais Cl" das células NPE (Carré et al. , supra, 1997); (2) a ativação do canal Cl" é mediada por A3ARs (Mitchell et al., "Am. J. Physiol"., 276:C659-C666, (1999)); (3) os canais Cl" ativados por A3AR constituem uma fração maior dos canais Cl" das células NPE (Carré et al. , "Am. J. Physyol.: Cell Physiol"., 279:C440-C451 (2000)); (4) os antagonistas de A3AR diminuem o IOP do olho do camundongo (Ávila et al. , "Br. J. Pharmacol.", 134: 241-245, (2001)); Avila et al. , "Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.", 43:3021-3026, (2002); Yang et al., "Curr. Eye Res.", 30:747-754 (2005)); e (5) o IOP do receptor de adenosina do subtipo A3 (A3AR)-nulo de camundongos é não-responsivo ao antagonista de A3AR, MRS-1191. Especificamente, os agonistas A3AR relatados aumentam ou estimulam os canais Cl" nas células NPE bovinas dissecadas frescas e nas células humanas imortalizadas e nos canais CI- aquoso- orientados do corpo da íris-ciliar de coelhos intactos, > enquanto o antagonista A3AR diminui a atividade do canal Cl" das células NPE de frente para a superfície aquosa do epitélio ciliar (Carre et al. , supra, 1997; Mitchell et al., supra, 1999). Em contraste, os agonistas A3AR exercem um efeito relativamente pequeno nas células da rota de fluxo direcionado de saída convencional (Fleischhauser et al., "J. Membr. Biol.", 193:121-136 (2003); Karl et al., "Am. J. Physiol.Cell Physiol"., 288:C784-C794 (2005) ) . Os fármacos atualmente prescritos para glaucoma, na forma de colírio, incluem pilocarpina, timolol, betaxolol, levobunolol, metipranolol, epinefrina, divivefrina, latanoprost, carbachol, e inibidores potentes de colinesterase, tais como ecotiofato, e inibidores de anidrase carbônica, tais como dorzolamidet. Muitas destas pesquisas efetivas para uma terapia médica de glaucoma envolvem uma redução na taxa de fluxo dentro do olho. Entretanto, atualmente, nenhum destes fármacos tem sido satisfatórios, em parte devido aos efeitos colaterais e ao inconveniente da determinação no programa de dosagem, e a eficácia de espécie-cruzadas não têm sido previamente relatada. Todavia, tem permanecido uma necessidade progressiva para confirmar que o composto antagonista A3AR é útil nas espécies cruzadas para reduzir o IOP para tratar glaucoma, com uma eficácia melhorada, ação prolongada, e reduzido efeito colateral; e também para determinar se determinadas formas de administração de compostos farmacêuticos terapêuticos aos olhos são mais eficazes do que outras. Sumário da invenção

A presente invenção é dirigida à necessidade de compostos capazes de reduzir a pressão intraocular para o tratamento de glaucoma com eficácia melhorada, ação prolongada e, reduzido efeito colateral e ainda, que demonstrem uma liberação de inibidor A3 potente independente da espécie através da córnea, evitando, assim, a variação substancial de espécies na resposta dos receptores de adenosina subtipo A3 para antagonistas. É importante demonstrar que uma resposta favorável em um roedor de laboratório também é representativa de um efeito favorável similar nos humanos. Isto é particularmente importante uma vez que o camundongo é um animal de laboratório protegido para estudo das implicações funcionais de mutações espontâneas e bio- construidas. Portanto, em uma configuração da presente invenção, os métodos preferidos para redução da pressão intraocular no olho, compreendem uma etapa de administração para um animal ou um paciente de uma quantidade redutora de pressão ocular efetiva de uma composição farmacêutica de espécies cruzadas

compreendendo um antagonista receptor de adenosina subtipo A3. Em um aspecto desta configuração o antagonista receptor de A3 é uma dihidropiridina, piridina, um sal de piridinio ou triazoloquinazolina. Derivados de compostos selecionados destas classes, tendo, expressamente a atividade do antagonista receptor de A3, são ainda contemplados dentro da presente invenção.

Em uma configuração expressa, o antagonista receptor do subtipo A3 pode ser selecionado dentre MRS-1097, MRS- 1191, MRS-122 0, MRS-1523, MRS-1292, MRS-1523, MRS-3642, MRS-37 71, MRS-3826, MRS-3827, MRS-3820, MRS-1220, LJ- 1830, LJ-1831, LJ-1833, LJ-1834, LJ-1835, LJ-1836 e LJ- 1837. A aplicação de um fármaco exemplificativo (MRS- 3820), que é um antagonista receptor de adenosina subtipo A3 (AR), a base de nucleosideo, de espécie cruzada, é descrita abaixo para o propósito geral da presente invenção para diminuir a pressão intraocular (IOP) in vivo, provendo um efeito terapêutico para pacientes glaucomatosos.

Vantajosamente, a composição farmacêutica é administrada topicamente, sistematicamente ou oralmente.

Preferivelmente, a composição farmacêutica é uma pomada, gel, colírio ou injetável. É um objetivo, portanto, determinar se a córnea apresenta uma barreira substancial para a liberação terapêutica das referidas composições farmacêuticas para o interior do olho por aplicação tópica das gotas para o filme de lágrima.

Objetivos adicionais, vantagens e características novas da invenção serão representados em parte na descrição, nos exemplos e nas figuras a seguir, todos estes em caráter meramente ilustrativo apenas, e não pretendem de qualguer forma limitar a invenção e, em parte serão aparentes aos técnicos no assunto no exame da descrição a seguir, e podem ser ensinamentos para a prática da invenção.

Breve descrição dos desenhos

0 resumo precedente, bem como a descrição detalhada a seguir da invenção serão melhor entendidos quando lidos em conjunto com os desenhos anexos. Deve ser entendido, entretanto, que a invenção não está limitada aos arranjos e instrumentais demonstrados.

A figura 1 ilustra um diagrama esquemático apresentando as células epiteliais não-pigmentadas oculares (NPE) e as células epiteliais pigmentas (PE), e os efeitos de ATP, de adenosina (Ado) e tamoxifen (TMX) no movimento do humor aquoso. Ecto = ecto-enzimas; A3 = receptor de adenosina subtipo A3;

As figuras 2A - 2B ilustram o efeito dos antagonistas A3 na redução isotônica estimulada por IB-MECA das células NPE. A figura 2A demonstra que o antagonista seletivo A3 de MRS-IO97 (300 nM) , previne a redução iniciada pelo agonista seletivo A3 N6-(3-iodobenzil)-adenosina-5'-N- metiluronamida (IB-MECA) (P<0,01, distribuição-F). A figura 2B demonstra que o antagonista seletivo de A3 MRS- 1191 (100 nM) previne a redução característica iniciada por IB-MECA (n=4, P<0,01 por distribuição-F). O MRS-1191 não afeta o volume celular na ausência de IB-MECA, confirmando a especificidade da interação (n=4). As trajetórias sólidas são mínimos quadrados que se adequam em mono-exponenciais, enquanto os dados representam a disposição não significante da redução ligada pelas linhas pontilhadas;

As figuras 3A - 3C demonstram os efeitos do antagonista receptor de A3 seletivo na redução isotônica estimulada através da adenosina das células NPE. Aplicação de 300 nM de MRS-1097 (Figura 3A; n=4), 100 nM de MRS-1191 (Figura 3B; n=3) , e 100 nM de MRS-1523 (Figura 3C; n=3), todos preveniram a redução da característica iniciada pela ativação não-seletiva dos receptores de adenosina com 100 μΜ de adenosina (P<0,01, distribuição F) . As trajetórias sólidas são mínimos quadrados que se adequam em mono- exponenciais, enquanto os dados representam a disposição não significante da redução ligada às linhas pontilhadas; As figuras 4A - 4C demonstram os efeitos dos agonistas receptores de adenosina no volume isotônico das células NPE. Na figura 4A, o agonista seletivo A3 de IB-MECA produzido uma redução rápida em 100 nM (n=4, V°°= 95,6 + 0,2%; τ = 4,5 + 0,6 minutos; P<0,01 por distribuição F). Em contraste, o agonista seletivo Al N6-

ciclopentiladenosina (CPA) teve pouco efeito em 100 nM, e nenhum efeito em todos a 3 μΜ (n=4). Na figura 4B, em 100 nM, o agonista seletivo A2 CGS-21680 não exerceu efeito, mas o agonista seletivo A3 de IB-MECA novamente produziu redução (n=4, P<0,01 por distribuição F) . Na figura 4C, em uma alta concentração (3 μΜ) , o agonista seletiva A2 de CGS-21680 também reduziu o isosmótico inicial. Entretanto, a pré-incubação das células com o antagonista receptor de A3 seletivo MRS-1191 (100 nM) aboliu este efeito (n=4, P< 0,01; distribuição F) . As trajetórias sólidas são mínimos-quadrados que se adequam em mono- exponenciais, enquanto os dados representam a disposição não significante da redução ligada às linhas pontilhadas; A figura 5 mostra o efeito de IB-MECA em uma corrente de curto-circuito (Isc) através do epitélio ciliar de coelhos intactos. Como uma etapa inicial na análise de dados, período de 20 minutos da corrente da linha básica apenas antes da adição de qualquer agente foi ajustado pela análise linear de mínimos-quadrados. A linha gerada pela análise foi extrapolada em um ponto a 45 minutos, após da introdução daquele agente. Cada resposta atual foi subtraída de sua respectiva linha de base extrapolada para resultar em uma linha básica inicial comum, aproximadamente em uma constante atual zero. Todos os registros foram colocados em um registrador em relação ao tempo do agente de introdução (tempo 0) . Os registros de controle (solvente), IB-MECA com solvente, e B-MECA corrigido pelo solvente foram medidos separadamente. IB- MECA foi sempre adicionado em presença de 5 nM Ba2+ para isolar a contribuição dos Cl" na resposta.

As figuras 6A e 6B representam as estruturas químicas. A figura 6 A representa as estruturas do agonista de adenosina fisiológico, o agonista completo CL-IB-MECA, e os derivados de nucleosídeos MRS-3771 e MRS-3642. A figura 6B representa a estrutura de MRS-3820, (2-(2- cloro-6-(3-iodobenzilamino)-9H-purin-9- ila)tetrahidrotiofeno-3,4-diol. 2 0 Descrição detalhada de determinadas configurações

0 mecanismo proposto da ação dos agonistas receptores A3, tais como uma adenosina (Ado), na influência da secreção de humor aquoso, é demonstrada na figura 1. ATP é liberada das células PE e/ou NPE. ATP é então convertida em adenosina pelas ecto-enzimas (ecto) . A adenosina liga- se então aos receptores A3 nas células NPE, resultando em uma abertura dos canais Cl". Isto resulta e um aumento há produção de humor aquoso e uma pressão intraocular aumentada. Adicionalmente, estímulos simultâneos por ATP e o tamoxifen ativa o fluxo direcionado para dentro de Cl" das células PE, conduzindo a uma diminuição líquida na formação do humor aquoso. ATP age nos receptores P2 das células PE, promove a abertura dos canais Cl-, e uma diminuição na produção de humor aquoso resultando na pressão intraocular diminuída.

A presente invenção inclui a observação de que os antagonistas receptores de adenosina subtipo A2 (relacionado aqui como "antagonista A3") inibem a diminuição das espécies cruzadas das células NPE como determinado pela medida do volume celular na solução isosmótica. Esta inibição da diminuição celular implica em uma redução liquida da secreção do humor aquoso através da membrana da célula NPE que resultaria em uma redução da pressão intraocular (Figura 1) . Estes receptores A3 estão presentes nas células NPE humanas e de coelhos e sustenta a ativação dos canais (Cl") de cloreto de NPE por adenosina. A diminuição das células PE implica em um estimulo de uma reabsorção liquida do humor aquoso através da membrana da célula PE em direção ao estroma, o que resultaria em uma redução liquida na formação do humor liquido e na redução da pressão intraocular (figura 1). Assim, os receptores de adenosina seletivos A2 aumentam a atividade do canal de cloreto das células NPE, e o bloqueio destes receptores pelos antagonistas A3, ou compostos relacionados, reduz a atividade do canal de cloreto e a secreção pelas células NPE dentro do humor aquoso. Como resultado, os antagonistas A3 podem ser utilizados para diminuir a pressão intraocular como um tratamento de espécies cruzadas para o glaucoma e outras condições oculares no qual ele é desejável diminuir a pressão intraocular. A medida da corrente de curto-circuito através do epitélio ciliar de coelhos intactos, do volume celular na cultura suspensa de células NPE humanas, e de correntes de células inteiras a partir de células NPE bovinas frescas e células humanas cultivadas embutidas em ladrilhos ("patch-clamped") tendo indicado que a manutenção do receptor de adenosina estimula a secreção de Cl" em células NPE de mamíferos (Carre et al., supra, 1997; patente norte-americana US 6,528,516). Como evidenciado pelos dados apresentados em ambas as células HCE humanas (uma linha de célula de células NPE humanas) e o corpo ciliar de coelhos.

O agonista seletivo A3 de IB-MECA (N6-(3-iodobenzil)- adenosina-5'N-metiluronamida) aumentou a corrente de curto circuito através do corpo ciliar da iris de coelhos na presença de Ba2+, uma mudança consistente com um fluxo direcionado para dentro aumentado de CI~ a partir das células NPE. Na presença de gramicidina para isolar a condutância de Cl", IB-MECA conduziu as células HCE humana para uma redução de uma maneira dependente da dose; o Kd de ~55 nM é consistente com um estimulo máximo dos receptores de A3 nos miócitos cardíacos em 100 nM de IB-MECA (Shahidulla et al, "Curr. Eye Res.", 16:1006-1016, 1997). O agonista A3 altamente específica CI-IB-MECA também produziu uma diminuição das células HCE na presença de gramicidina. A gramicidina reparte-se rapidamente em membranas de plasma para formar um poro seletivo de cátion, e é amplamente utilizada para estudar a regulação de volume (Hoffmann et al. , "Interaction of Cell Volume and Cell Function", Lang et al., Eds., Springer, Heidlberg, Alemanha, PP.188-248, Série ACEP (1993) ) . Sob estas condições, a liberação da célula CI- torna-se um fator limitante da taxa em ambos, hiposmótico (Civan et al., "Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.," 35:2876- 2886 (1994)) e diminuição da célula isosmótica (Carre et al., supra 1997).

Além disso, os antagonistas A3 MRS-1097 e MRS-1191 previnem a diminuição induzida por IB-MECA em concentrações bem abaixo de seu Ki para os receptores Ai e A2a. 0 agonista Ai de CPA não teve um efeito consistente no volume celular. 0 agonista A2A de CGS-21680 não teve efeito em baixas concentrações. 0 efeito de CGS-21680 na diminuição foi apenas detectado em uma concentração de 500 vezes maior do que o valor de Ki para o receptor A3, e este efeito foi bloqueado pelo antagonista A3 MRS-1191. Os antagonistas A3 MRS-1097, MRS-1191 e MRS-1523 bloqueiam a diminuição produzida por 10 μΜ de adenosina. MRS-1523, MRS-3642, MRS-3771, MRS-3826, MRS-1649 e MRS- 3827 foram cada um testado pelos inventores e descobriu- se que um IOP menor no camundongo. Também útil são MRS 1220, e nucleosideos LJ-1830, LJ-1831, LJ-183, LJ-1834, LJ-1835, LJ-1836 e LJ-1837 (todos sintetizados pelo L.S., Jeong, Korea para NIH) . Conseqüentemente, qualquer derivado de um dihidropiridina, piridina, sal de piridinio ou triazoloquinazolina, tendo, expressamente, a atividade do antagonista do receptor de A3, é contemplado ainda dentro da presente invenção. Junto com estas observações indicam que a ativação estimulada por adenosina de Cl" liberado pela linha HCE das células NPE humano é primariamente mediada pela ocupação de um receptor de adenosina subtipo A3.

Em uma configuração, o antagonista A3 de MRS-3820 (2-(2- cloro-6(3-iodobenzilamino)-9H-purin-9-

ila)tetrahidrotiofeno-3,4diol), sintetizado por L.S. Jeong, Korea para NIH, quando testado não-invasivamente em camundongos normais, usando uma concentração gotejada aplicada topicamente de 250 μΜ (micromolar) reduziu significativamente a pressão intraocular (IOP) dentro de minutos após a aplicação inicial. Uma redução ainda maior foi vista em 30 minutos após administração (4,2 + 0,7 mmHg a partir da linha de base de 16,7 + 1,1, p<0,001 por teste-t emparelhado). Enquanto o ponto dos métodos da presente invenção é qualitativo, mais do que quantitativo (tempo ou magnitude. "Significantemente" nesta situação refere-se a uma medida da redução de IOP de pelo menos < 0,05 abaixo, que é a definição convencionalmente aceita do termo. Uma mudança significativa é uma na qual o IOP é reduzido em pelo menos 5% da condição de pré-tratamento, ou pelo menos 10%, ou pelo menos 20%, ou pelo menos 30%, ou pelo menos 50%, ou pelo menos 60%, ou pelo menos 75%, ou pelo menos 90% e acima de 99% de diferença. Ficará claro a partir dos dados a seguir, acima dos períodos de medida, geralmente 5 a 10 minutos, ou 15 minutos, ou 20 minutos, ou 25 minutos, ou 30 minutos, ou mais freqüentemente 35 minutos ou acima, até 45 minutos ou acima de 1 hora, MRS 3820 diminuiu significativamente a pressão intraocular, nas espécies cruzadas. Existe uma mudança estatística significativa no IOP, ainda que a probabilidade seja menor que 1 em 20 (P < 0,05) tal que um efeito seria observado apenas pela mudança. Além disso, a redução de IOP foi aplicada em uma aplicação expressamente "independente da espécie", será descrita em maiores detalhes abaixo, e o suporte da iniciativa para liberação de um inibidor A3, independente da espécie, para a diminuição das células epiteliais ciliares não- pigmentadas (NPE) pro ativação dos canais CI-. Os termos "Espécies cruzadas" e "independente da espécie" são utilizados para um significado ordinário, ou seja, que resulta de dados independentes da espécie de animal de teste selecionado, e dos resultados literal e completamente diferente entre as espécies. A forma de pró-fármaco deste antagonista receptor de A3 é também contemplada para administração ao olho, os quais foram então convertidos aos antagonistas ativos, que na seqüencia reduziu a pressão intraocular.

Em uma outra configuração, o antagonista A2, iodeto 2,4- dietil-l-metil-3-(etilsulfanilcarbonil)-5-

etiloxicarbonil-6-fenilpiridio (MRS-1649) foi utilizado para reduzir a pressão intraocular. A sintese dos compostos MRS é geralmente descrita na patente norte- americana US 6,528,516 incorporado aqui por referência. O representante do composto MRS, derivado de 3,5-diacil- 1,2,4-trialquil-6-fenilpiridio exibe uma solubilidade em água unicamente elevada (43 mM) e pode ser extraída rapidamente dentro de éter. Em adição, a forma do pró- fármaco deste composto, o correspondente 1-metil- 1,4dihidropiridina, pode ser oxidado para formar compostos MRS-1649 in vitro em presença de um tecido homogenado. Assim, é contemplado que a forma do pró- fármaco do antagonista receptor A3 pode ser administrada ao olho, o qual irá então ser convertido aos antagonistas ativos que irão reduzir a pressão intraocular.

Em adição aos antagonistas receptores A3 particulares discutidos nos exemplos abaixo: MRS-1097 (3-etil-5- benzil-2-metil-6-fenil-1, 4-estiril-4-l,4-( + )- dihidropiridina-3,5-dicarboxilato), MRS-1191 (3-0etil-5- benzil-2-metil-6-fenil-4-feniiletilnil-1,4- ( + )- dihidropiridina-3,5-dicarboxilato) (Jiang et al. , "J. Med.

Chem.", 40:2596-2608 (1997)), MRS-1423 (Li et al. , "J. Med. Chem.", 42:706-721 (1999)), e MRS-3820 (2-(2-cloro-

6- ( 3-iodobenzilamino)-9H-purin-9-ila)tetrahidrotiofeno- 3,4diol), o uso de qualquer um dos antagonistas receptores de A3 ou análogo do mesmo para reduzir a

pressão intraocular está dentro do escopo da invenção. Outros antagonistas receptores de A3 para uso na presente invenção foram descritos por Jacobson ("Trends Pharmacol. Sci.", 19:184-191 (1998)) e incluem MR-1334 (3-etil-5-( 4- nitrobenil)-2-metil-6-fenil-4-feniletilnil-1,4 ( + )- dihidropiridina-3,5-dicarboxilato)), MRS-1067 (3,6-

dicloro-2' -(isopropoxi)-4'-metilflavona) , MRS-1220 (9- cloro-2-(2-furil)-5-fenilacetilamino-[1,2,4]- triazolo[1,5-c]quinazolina) , L249313 (6-carboximetil-5,9- diidro-9-metil-2-fenil-[1,2,4]-triazolo[5,1- a] [2,7]naftiridina) e L268605 (3-(4-metoxifenil)-5-amino-

7-oxo-triazolo[3,2]pirimidina), VUF8504 (4-metoxi-N-[2- (2-piridinil)quinazdin-4-ila]benzamida) e do gênero.

Os dados apresentados abaixo demonstram a capacidade de vários agentes de espécie cruzada em bloquear a diminuição das células NPE e a promover a redução das células PE. 0 efeito liquido destes agentes seria reduzir a pressão intraocular in vitro. Também contemplado dentro da matéria objeto da presente invenção é o uso de quatro classes de agentes químicos de antagonistas receptores de A3 para redução da pressão intraocular: dihidropiridinas (por exemplo, MRS 1097, MRS 1191), piridinas, sais de piridínio (por exemplo, Compostos 23 (Xie et al., "J. Med. Chem.", 42:4232-4238 (1999))) e triazoloquinazolinas (por exemplo, MRS 1220 (Pugliese et al., "Br. J. Pharmacol. 147:524-532 (2006)), e derivados dos mesmos tendo atividade antagonista A3AR (por exemplo, derivados de triazoquinazolina: MRS 1220, e nucleosideos LJ-1830, LJ 1831, LJ1833, LJ-1834, LJ-1835, LJ-1836 e LJ 1837) . Estas classes de compostos são também descritos no pedido internacional PCT/WO 97/27177, e a patente norte- americana US 6,528,516.

A determinação de se um composto pode agir como um antagonista receptor A3 pode ser determinado pelo uso padrão de ensaios de ligação farmacológica. Entretanto, quando os testes foram iniciados para demonstrar que o efeito de redução IOP de antagonistas A3AR é independente das espécies sendo tratadas, métodos foram necessários para permitir uma determinação confiável das mudanças no IOP nos olhos de camundongos pequenos. Os efeitos dos antagonistas A3AR no IOP dos camundongos foram medidos pela técnica servo-nulo invasiva, desenvolvida por inventores para os olhos dos pequenos camundongos, e que requer empalação da córnea com uma agulha de vidro, fina e oca, cujo diâmetro inclinado é de cerca de 5 micrômetros. Usando a técnica servo-nula (Ávila et al., supra, 2001), a redução relativamente grande no IOP (de cerca de 5 mm Hg) em camundongo normal sugeriu que, como demonstrado acima, os antagonistas A3 são indicados, quando utilizados compostos terapêuticos in vivo para tratamento de pacientes com glaucoma. Entretanto, duas observações adicionais foram observadas. Primeiramente, a aplicação tópica de um antagonista A3AR provê apenas uma diminuição muito leve no IOP em macacos (Okamura et al. , "Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (14):3775-3779 (2004)), mas àquelas medidas foram conduzidas não-invasivamente, sem perfuração da córnea. Em segundo lugar, a resposta do IOP de camundongos à aplicação tópica dos antagonistas A3AR foi muito mais rápida em camundongos medidos com a técnica invasiva servo-nulo, quando comparado com outros mamíferos (Avilla et al., supra, 2001, 2002; Pang et al., "Exp. Eye Res.", 80 (2):207-214 (2005)). Esta segunda descoberta é dirigida em maiores detalhes no Exemplo 1, abaixo.

A diminuição da pressão intraocular com uma combinação de um anti-estrogênio e JATP, ou qualquer composto capaz de promover a liberação de ATP a partir das células NPE, também é contemplado sozinho ou em combinação, incluindo combinações com antagonistas A3. 0 uso de um antagonista calmodulina para diminuição da pressão intraocular também está dentro do escopo da invenção incluindo, mas não limitado ao cloreto de calmidazolio, domínio de ligação a calmodulina, HCl de cloropromazina, melitina, HCl, fenoxibenzamina, dimaleato de trifluoperazina, W-5, W-7, W-12 e W-13. Estes compostos estão disponíveis na Calbiochem, San Diego, Califórnia. O uso de análogos dos compostos acima identificados para a redução da pressão está dentro do escopo da presente invenção.

Estes agentes podem ser utilizado para tratar distúrbios oculares resultantes, associadas com, ou causadas por, um aumento na pressão ocular, tal como glaucoma. Os agentes podem ser processados de acordo com os métodos convencionais para produzir agentes medicinais para administração para mamíferos ou outros animais submetidos ao IOP aumentado, preferivelmente aos humanos. Os pacientes pretendidos ou indivíduos (coletivamente relacionados aqui como "indivíduos") da presente invenção incluem qualquer animal ou humano submetido a, ou pré- disposto a, um IOP aumentado do olho do tipo resultante em um estado de doença reconhecido como glaucoma.

Os agentes podem ser empregados na mistura com excipientes convencionais, ou seja, substâncias veículo orgânico ou inorgânico farmaceuticamente aceitável apropriado para aplicação parenteral, enteral (por exemplo, oral) ou aplicação tópica que não reage deleteriamente com os agentes. Os veículos

farmaceuticamente aceitáveis apropriados incluem, mas não estão limitados a água, sal, soluções, álcoois, goma arábica, óleos vegetais, álcool benzílico, polietileno glicol, gelatina, carboidratos tais como lactose, amilose ou amido, estearato de magnésio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, óleo perfumado, monoglicerídeo do ácido graxo e diglicerideo, ésteres de ácido graxo de pentaeritritol, hidroxi de metilcelulose, polivinil pirrolidona, etc.. As preparações farmacêuticas podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, por exemplo, lubrificantes, conservantes, e estabilizantes, agentes umidificantes, emulsificantes, sais para influenciar na pressão osmótica, tampões, colorantes, aromatizantes e/ou substâncias aromáticas e do gênero que não reage deleteriamente com os compostos ativos. Eles podem também ser combinados do modo desejado com outros agentes ativos, por exemplo, vitaminas. Para aplicação parenteral, são particularmente apropriados injetáveis, soluções estéreis,

preferivelmente soluções oleosas e aquosas, bem como emulsões suspensas, ou implantes, incluindo supositórios. Ampolas são unidades de dosagens convenientes. Para aplicação enteral, particularmente apropriadas são tabletes, líquidos, gotas, supositórios ou cápsulas. Um xarope, elixir ou do gênero pode ser utilizados quando um veículo adoçante for empregado. Composições de liberação sustentadas ou dirigidas podem ser formuladas, por exemplo, com lipossomas ou àquelas onde o composto ativo é protegido com revestimentos diferencialmente degradáveis, por exemplo, por micro-encapsulação, revestimentos múltiplos, etc. Também é possível liofilizar os agentes para uso na preparação dos produtos para injeção.

Para aplicação tópica, são empregadas formas não- pulverizada, viscosa para semi-sólido ou formas sólidas compreendendo um veículo compatível com aplicação tópica e tendo uma viscosidade dinâmica preferivelmente maior do que a da água. As formulações apropriadas incluem, mas não estão limitadas a, soluções, suspensões, emulsões, cremes, pomadas, pós, ungüento, curativos, aerossóis, etc., que são, se desejado, esterilizados ou misturados com os agentes auxiliares, por exemplo, conservantes, estabilizantes, agentes umidificantes, tampões ou sais para influenciar a pressão osmótica, permeabilidade ocular, etc.. Para aplicação tópica também são apropriadas preparações aerossóis pulverizáveis onde o ingrediente ativo, preferivelmente em combinação com um material veiculo inerte liquido ou sólido, é embalado em uma garrafa squeeze ou em uma mistura com um propulsor volátil pressurizado, normalmente um propulsor gasoso, por exemplo, freon.

Em uma configuração preferida, o agente é formulado dentro de uma formulação farmacêutica apropriada para administração ao olho, incluindo colírio, géis e pomadas. Ver também os efeitos da barreira descobertos recentemente da membrana da córnea, resultante na passagem bloqueada ou inibida do fármaco topicamente aplicado para a área alvo como relatado recentemente por Wang et al., "Experim. Eye Research", 85:105-112 (2007), que pode ser considerada pelo pessoal medico na liberação dos fármacos de liberação de IOP para o olho de um paciente animal ou humano. Para administração sistêmica, a dosagem dos agentes de acordo a esta invenção geralmente está entre cerca de 0,1 μg/kg e 10 μg/kg, preferivelmente entre cerca de 10 μg/kg e 1 μg/kg. Para administração tópica, as dosagens entre cerca de 0,000001% e 10% do ingrediente ativo são contemplados, preferivelmente entre cerca de 0,1% e 4$. Será apreciado que as quantidades preferidas atuais do agente irão variar de acordo com o agente específico sendo utilizado com a severidade do distúrbio e, as composições particulares sendo formuladas, de acordo com a aplicação e a espécie sendo tratada. As dosagens para um determinado hospedeiro podem ser determinadas usando considerações convencionais, por exemplo, por comparação habitual das atividades diferenciais dos compostos submetidos e de um agente conhecido, por exemplo, por meio de um protocolo farmacológico convencional apropriado. Os agentes são administrados a partir do menor uma vez por dia (por exemplo, todos os outros dias), quatro vezes por dia.

A invenção é definida ainda por referência aos exemplos específicos a seguir, mas não limitados a estes. A referência é feita ao compêndio padrão de biologia molecular que contém definições e métodos e significam realizar técnicas básicas, abrangidas pela presente invenção. Será aparente aos técnicos no assunto que muitas modificações, ambos os materiais e métodos, podem ser praticados sem fugir dos propósitos ou limites do escopo desta invenção. EXEMPLOS

Nos exemplos a seguir, duas descobertas são mencionadas nos Exemplos 1 até 3, respectivamente. A primeira é uma determinação de se a córnea apresenta uma barreira substancial para a liberação terapêutica do fármaco redutor de IOP para o interior do olho, quando os referidos fármacos são topicamente aplicados como gotas para o filme de lágrima. A segunda é uma determinação de se existe uma variação de espécie substancial na resposta dos receptores de adenosina subtipo A3 para os antagonistas administrados, ou se a resposta for independente, uma vez que sem a referida confirmação, uma resposta favorável em um roedor de laboratório não necessariamente asseguraria um efeito similarmente favorável em um humano. Nos exemplos a seguir, determinados materiais e métodos são utilizados, freqüentemente de maneira que corresponda aos materiais e métodos associados com experimentos previamente relacionados, tais como àqueles relatados nas patentes US No.: 6,528,516.

Em geral, valores são apresentados como a média + 1 SE. 0 número dos experimentos é indicado pelo símbolo Ν. A hipótese nula, em que medidas experimentais e de linha de base dividem a mesma média e distribuição, foi testada com o teste t Studant e pelo limite de signif icância superior da distribuição F, como indicado. 0 teste t Studant foi aplicado para comparar a significância entre as médias simples ou os parâmetros simples ajustados. A distribuição-F foi aplicada para testar se o tempo de curso da medida do volume em diferentes suspensões refletiria uma população simples dos pontos de dados.

MATERIAIS: Gramicidina, adenosina, 2-cloroadenosina, tamoxifen, ATP, 17a- e β-estradiol, DiC8, carbachol, atropina, histamina, e trifluorperazina forma obtidos a partir da Sigma Chemical Co., (St. Louis, Mo.). CPA (N6- ciclopentil-adenosina), CGS-21680, IB-MECA, Cl-IB-MECA e MRS-1191 (3-etil-5-benzil-2-metil-6-fenil-4-feniletilnil- 1,4 (+)-diidropiridina-3, 5-dicarboxilato) foram obtidos a partir da "Research Biochemicals International" (Natick, Mass). Fura-2-ΑΜ foi comprado da "Molecular Probes" (Eugene,, Oreg.). MRS-1097, MRS-1523 e MRS-3820 foram providos pelo Dr. Kenneth A. Jacobson (National Institutes of Health) e pelo Dr. Bruce L. Liang (University of Pennsylvania). O composto Cl-IB-MECA (MH- C-7-O 8; Lot.No. CMVIII-12) foi provido pela "Research Biochemicals International" como parte do Programa de Síntese Química", do Instituto nacional da Saúde Mental", Contrato N01MH30003. DIDS [ácido 4,4'-diisotiociano-2,2'- disulfônico] e fura-2-ΑΜ foram obtidos da "Molecular Probes, Inc." (Eugene, Oreg.). NPPB [5-nitro-2-(3- fenilpropilamino)-benzoato] e estaurosporina foram obtidos da "Biomol. Research Laboratories, Inc.", (Plymouth Meeting, Pa.).

CULTURA DE CÉLULA: a linha de célula HCE (célula epitelial humana) (Carre et al. , supra, 1997), é uma linha de célula NPE imortalizada obtida a partir das culturas primárias do epitélio humano adulto. As células foram crescidas em meio Eagle modificado Dulbecco (DMEM, #11965-027, Gibco BRL, Grand Island, N.Y.) com 10% de soro bovino fetal (FBS, A-1115-L, HyClone Laboratories, Inc., Logan, Utah) e 50 mg/ml gentamieina (#15750-011, Gibco BRL) , a 37°C, em CO2 a 5% (Wax et al. , "Exp. Eye Res.", 57:3057-3063 (1993); Yantorno et al., "Exp. Eye Res.", 49:423-437 (1989)). 0 meio de crescimento teve uma osmolalidade de 328 mOsm. As células foram passadas a cada 607 dias e foram estudadas de 8-13 dias após a passagem, após a pesquisa de confluência. Uma linha de célula PE imortalizada a partir de uma cultura primária do epitélio ciliar pigmentado bovino também foram crescidas sob condições adequadas.

Medida do volume celular em solução isosmótica: O volume de células PE e de NPE foi medido uma vez que o movimento do fluido sustentado uma mudança no volume das células PE e NPE, respectivamente. Também acredita-se ser o mesmo que o movimento do fluido que fundamenta a secreção do humor aquoso (Figura 1).

Após a coleta das células de um frasco simples T-75 por tripsinização (Yantorno et al. , supra), uma alíquota de 0,5-ml da suspensão celular HCE, ou da suspensão celular bovina, em DMEM (ou em meio livre Cl", onde apropriado) , foi adicionado a 20 ml de cada uma da solução de teste, que continha (em mM): 110,0 de NaCl, 15,0 de HEPES [ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanosulfônico] , 2,5 de CaCl2; 1,2 de MgCl2; 4,7 KCl; 1,2 KH2PO4; 30,0 NaHCO3; e 10,0 de glicose, em um pH de 7,4 e osmolalidade de 298- 305 mOsm. Alíquotas paralelas de células foram estudadas no mesmo dia. Uma alíquota serviu usualmente como um controle, e as outras foram expostas a condições experimentais diferentes no tempo da suspensão. A mesma quantidade de veículo solvente (dimetilformamida, DMSO ou etanol) foi adicionada sempre para o controle e para as alíquotas experimentais. A seqüência de estudo das suspensões foi variada para remover artefatos dependentes do tempo sistemático (Civan et al., "Exp. Eye Res.", 54:181-191 (1992)); Vivan et al., 1994).

Os volumes celulares de suspensões isosmóticas foram medidos com um Contador Coulter (modelo ZBI-Channelyzer II), usando 100 μπι de abertura (civan et al., supra, 1994). Como previamente descrito (Wax et al., supra, 1993), o volume celular (Vc) da suspensão foi tomado a partir do pico da função de distribuição. A redução celular foi ajustada como uma função do tempo (t) para uma função mono-exponencial:

Vc = V28 + (V0-V-) - [e~(t~V/t] Onde V°° é o volume celular afirmado estável, V0 é o volume celular no primeiro ponto (t0) do curso do tempo a ser ajustado, e t é o tempo constante da redução. Para o propósito da redução de dados, os dados foram normalizados para o primeiro ponto do tempo, tomado como sendo 100% do volume isotônico. Os ajustes forma obtidos pela análise de regressão não linear de mínimo-quadrado, permitindo que ambos, V°° e t sejam variáveis. Os estudos prévios demonstraram que a adenosina causa a redução isotônica celular por ativação dos canais CI~ nas células NPE (Carre et al., supra, 1997), os níveis de adenosina utilizados foram suficientemente altos para ativar os receptores de adenosina subtipos Rlr A2a, A2B ou A3, de modo a diferenciar entre estes receptores, os experimentos foram repetidos usando uma série de agonistas e antagonistas seletivos para estes receptores. Na presença de gramicidina, o agonista A3 IB-MECA conduziu a uma redução nas células de uma maneira dependente da concentração. O Kd aparente para a redução induzida por IB-MECA foi de 55 + 10 nM. O IB-MECA é um agonista altamente seletivo para do receptor A3, onde o Ki relatado para o receptor A3 é 50 vezes menor que ele é para o receptor Ai ou A2b (Gallo-Rodrigez et al., "J. Med. Chem.", 37:636-646, (1994)); Jacobson et al. , supra, 1995; Jacobson et al., FEBS Lett., 336:57-60, (1993)). Foi também determinado que se antagonistas seletivos A3 preveniriam a redução mediada por A3 putativo produzida por IB-MECA. As alíquotas paralelas das suspensões foram pré-incubadas com MRS-1097, um antagonista seletivo A3 com valores Ki para a ligação (em nM) aos receptores A1/A2A/A3 de 5, 930/4, 770/108 (Jacobson et al. , "Neuropharmacol. ", 36:1157-1165 (1997)). A pré-incubação por 2 minutos com 300 nM de MRS-1097 bloqueado com redução isosmótica ligada caracteristicamente por 100 nM de IB-MECA (figura 2A) . Um segundo antagonista A3 altamente seletivo, MRS-1191, (Jiang et al, "J. Med. Chem.", 39:4667-4675, 1996), com valores Ki para a ligação (em nM) aos receptores humanos A1/A2A/A3 de 40, 100/>100, 000/31,4 também foi utilizado. A pré-incubação por 2 minutos com 100 nM de MRS-1097 também preveniu uma resposta subseqüente para 100 nM de IB-MECA (Figura 2B). 0 agonista fisiológico alcançando os receptores de adenosina é provavelmente o próprio nucleosideo de adenosina, que eleva a liberação de ATP pelas células epiteliais ciliares e pela atividade ecto-enzimática (Mitchell et al. , supra, 1998). A adenosina desperta a redução isosmótica das células NPE humanas cultivadas com um EC50 de 3-10 μΜ (Civan et al, supra, 1997). Nesta faixa de concentração, a adenosina também age como um agonista não-seletivo de todos os quatro subtipos do receptor de adenosina (Fredholm et al, "Pharamcol. Rev.", 46: 143-156 91994); Fredholm et al., "Trends Pharmacol Sci.", 18:79-82 (1997)). Como ilustrado na Figura 3, uma pré-incubação tanto com 100 nM do antagonista seletivo A3 MRS-1191 (Figura 3B), ou 300 nM do antagonista seletivo A3 MRS-1097 (Figura 3A) , bloqueando a redução produzida caracteristicamente por 10 μΜ de adenosina. MRS-1523, um antagonista A3 com valores Ki para a ligação (em nM) aos receptores humanos A1/A2A /A3 de 15,600/2,050/19 (Li et al., "J. Med. Chem.", 41:318 6-3201, 1998), também eliminou as ações de adenosina.

Assim, a capacidade dos antagonistas A3 específicos para inibir a resposta a adenosina não-específica sugere que a contribuição aos outros receptores para ativação dos canais CI~ foi mínimo. Para testar ainda este efeito dos agonistas A1 e A2a foram testados. CPA é um agonista seletivo Ai com um Ki para o receptor R1 de 0,6 nM. Entretanto, o CPA não produziu redução significante em 30 nM e 1 μΜ (dados não mostrados, N=3) e 3 μΜ (Figura 4 A) . Um efeito pequeno e lento de significãncia indeterminada foi detectada na concentração intermediária de 100 nM (Figura 4A) . Algumas reatividades cruzadas com receptores A3 podem ser esperadas, resultando em um Ki de CPA para o subtipo A3 de 43 nM (Klotz et al. , supra). CGS-21680 é amplamente utilizado o agonista A2a com um valor IC50 de 22 nM para o receptor A2a (Hutchison et al. , "J. Pharmacol. Exp. Ther.", 251:47-55, 1989, Jarvis et al., "J. Pharmacol. Exp. Ther", 253:888-893, 1989). CGS-21680 não teve efeito detectável em uma concentração de 100 nM (figura 4B), mas não desperta a redução isosmótica em uma concentração maior que 30 vezes (3 μΜ) (figura 4C).

Entretanto, o Ki para o CGS-21680 no receptor A3 é de 67 nM (Klotz et al., supra), e então, CGS-21680 poderia ter ação tanto nos receptores A2a ou receptores A3 em altas concentrações. Para distinguir entre estas

possibilidades, alíquotas paralelas das suspensões foram pré-incubadas com o antagonista 100 nM MRS-1191. MRS-1191 preveniu a redução produzida por altas concentrações de CGS-21680 (Figura 5C, P<0,01, teste F) , indicando que a redução observada foi mediada pela reatividade cruzada com os receptores A3. Como aparentemente não existe uma alta-afinidade dos agonistas A2b (Klotz et al., supra) a contribuição do estímulo do receptor A2B não foi perseguida, apesar de a capacidade dos antagonistas A3 inibir a resposta com 10 μΜ de adenosina (Figura 4) debatendo contra a regra para o receptor A2b. Por exemplo, MRS-1191 em 10 μΜ não desloca a ligação do radio -Iigante para os receptores A2B humanos recombinantes, assim, ele é um antagonista A3 verdadeiramente seletivo. Medidas trans-epitelial: Em experimentos animais, preferivelmente coelhos, após anestesia e sacrifício (Carre et al., "J. Membr. Biol. 146:293-305 (1995), o corpo íris-ciliar (I-CB) foi desnucleado e isolado como descrito por Carre et al., 1995. Em um experimento, a pupila e a íris central foram obstruídos com um disco Lucite, e o corpo íris-ciliar foi montado entre as duas metades de uma câmara de Lucite. O círculo ds tecido exposto proveu uma superfície de área projetada de 0,93 cm2. As preparações foram continuamente borbulhadas com 95% de ) 2-5% de C02 para manutenção do pH de 7,4 em uma solução de Ringers compreendendo (em mM) : 110,0 NaCl, 10,0 HEPES (ácido), 5,0 HEPES (Na+), 30,0 NaHCO3, 2,5 CaCl2, 1,2 MgCl2, 5,9 KCl, e 10,0 de glicose, em uma osmolalidade de 305 mOsm, BaCl2 (5 mM) foi adicionado à solução para bloquear a corrente K+. A potência transepitelial foi fixada em 0 mV, corrigida para a resistência da solução em série, e a corrente curto- circuito foi monitorada em um registro gráfico. Os dados foram adquiridos digitalmente em 10 Hz via um conversor DigiData 1200 A e um software AxoScope 1,1 (Axo Instruments, Foster city, Calif.). A média tirada automaticamente foi realizada com um fator de redução de 100 para conseguir uma taxa de amostragem final de 6/minutos.

Correção do possível efeito do solvente: A adenosina em alta concentração (100 μΜ) foi descoberta por aumentar a corrente de curto circuito através do corpo ciliar do coelho (Carre et al., supra, 1997). Portanto, uma alta concentração (30 μΜ) do agonista A3 IB-MECA foi testada para determinar se ela também foi afetou a corrente de curto-circuito. Nesta concentração, o veículo

(dimetilformamida) por si só exerce efeitos significantes (Figura 5, trajetória menor). 0 efeito do solvente foi corrigido como a seguir: solvente sozinho foi inicialmente introduzido (para 0,1%), seguido pelo mesmo volume de solvente (para 0,2%) contendo o agonista, e finalizando com a adição de um terceiro volume idêntico do solvente sozinho (para uma concentração final de 0,3%). A redução da corrente de curto-circuito seguindo a primeira adição do solvente foi sempre maior do que a terceira. Em cada um dos quatro experimentos, o tempo de curso da primeira e da terceira adição foi tirado a média para estimar o efeito de elevar a concentração do solvente sem a adição do agonista de 0,1% a 0,2% durante o período experimental. A figura 5 apresenta a trajetória média para o efeito médio do solvente, o curso de tempo médio não corrigido seguindo a exposição para o IB-MECA, e a trajetória média + 1 SEM para a resposta corrigida do solvente. Os experimentos foram realizados em presença de 5 mM Ba2+ para minimizar a contribuição da corrente K+. 0 IB-MECA produziu um aumento significante na corrente de curto-circuito; um aumento na corrente de curto-circuito em presença de Ba2+ sugerindo que o efeito é mediado peal ativação da condução de Cl" na membrana básica lateral das células NPE. A natureza sustentada do estimulo é consistente com o curso do tempo da redução da célula na resposta ao estimulo de A3.

Exemplo 1- Barreira da córnea para liberação de fármacos tópicos para o alvo dentro do olho. Os efeitos dos antagonistas A3AR no camundongo IOP foram tradicionalmente medidos pela técnica servo-nulo invasiva desenvolvida pelos inventores para os olhos de pequenos camundongos, e os quais requerem o impalamento da córnea com uma agulha de vidro fina, oca, cujo diâmetro da ponta é de cerca de 5 micrômetros (Ávila et al. , supra, 2001, 2002) . Entretanto, de modo a demonstrar o efeito da redução de IOP in vivo dos compostos antagonistas A3AR, a técnica de teste foi refinada. Um pneumotonômetro foi adaptado para medir o IOP não-invasivamente do camundongo (Ávila et al, "Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.", 46:3274- 3280, 2005) ) . Usando esta técnica, descobriu-se que tomados 30 minutos para os antagonistas A3AR (MRS-1191) para iniciar a diminuição do IOP do camundongo significativamente após a aplicação tópica aos olhos, enquanto o mesmo fármaco começa a diminuir o IOP dentro de cerca de um minuto quando o IOP é medido com a técnica servo-nulo invasiva. De outra forma, o aumento no IOP despertado pelo agonista AR não-seletivo adenosina foi retardado por cerca de 10 minutos quando medido de forma não-invasiva. Estes resultados provêem uma forte indicação de que a resposta rápida do IOP do camundongo para uma aplicação tópica dos antagonistas A3AR foi atualmente um resultado da entrada do fármaco através do tecido danificado em torno da ponta da micropipeta, apesar dos mesmos efeitos terem sido observados após uma liberação muito menor do fármaco por difusão através de uma córnea muito fina do camundongo (cerca de 17 0 micrômetros de profundidade).

Para verificar este efeito, um parâmetro inteiramente diferente foi monitorado nos animais de teste. As propriedades da barreira do olho do camundongo por monitoramento (1) do tamanho da pupila seguido por aplicação tópica do carbachol (um agente miótico) e (2) resposta da pressão intraocular (IOP) para o fármaco purinérgico medido por ambos, o sistema de micropipeta servo-nulo invasiva (SNMS) e pneumatometria não-invasiva. Os animais de teste foram camundongos suiços pretos de criação externa de sexos misturados, 7-9 semanas de idade e 25 a 30 g em peso, obtido da Taconic Inc. (Germantown, NY), e mantido sob 12:12 horas de ciclos de luz/iluminação escura e permitindo um acesso irrestrito para o alimento e para a água. Os camundongos foram anestesiados com Ketamina intraperitoneal (250 mg Kg-1) suplementado por proparacaina tópica de HCl a 0,5% (Allergan, Bauscjh &Lomb) para a medida IOP. 0 IOP foi medido invasivamente (SNHS) e não-invasivamente por pneumatometria em animais separados.

Para medir o diâmetro da pupila, a pupila e um administrador adjacente tendo uma graduação de 1-mm foram imaginados com uma câmara digital. Cuidado foi tomado para evitar a aplicação mecânica de stress e, conseqüentemente, para evitar o deslocamento da ponta da micropipeta a partir de sua posição na câmara anterior. O comprimento foi medido por IMAGEJ (National Institutes of Health) e os diâmetros da pupila foram calibrados para a graduação.

Pela pesquisa de SNMS (Ávila et al. Supra, 2001), a micropipeta de exploração, de 5 - 10 mm de diâmetro externo, foi preenchida com uma solução altamente condutora e avançou através da córnea dentro da câmara anterior. Uma técnica refinada por Wang et al. , "Invest. Ophthalmol. Vis. Sei" (série on-line) (Agosto 31, 2006) disponível no site

WWW,iovs.org/egi/letters/46/9/3274#422, estabilidade

aumentou e reduziu o barulho de fundo dos registros, permitindo a fabricação de micropipetas cuja resistência é de 0,1 - 0,3 ΜΩ, ao invés de 0,25 - 0,4 ΜΩ usado inicialmente. A solução de enchimento foi reduzida de 3 M KCl para 2M de NaCl, ao invés de 3 M KCl. A resistência da micropipeta enchida foi balanceada em um circuito de pontes, e a ponta foi então avançada através da córnea. Na entrada para o interior da câmara do olho, o IOP força o humor aquoso muito menos condutor dentro da ponta da micropipeta, deslocando a solução de enchimento original. A resistência da micropipeta foi, desse modo, aumentada não balanceou o circuito de pontes e despertou um aumento para prover uma contra-pressão, restaurando a posição da solução de enchimento e retornando a resistência para seu valor inicial. Assim, o valor da contra-pressão se igual ao do IOP. Como no passado (Ávila et al., supra 2001), a estabilidade dos registros permitiu uma medida contínua para dez minutos durante o curso da aplicação do fármaco. Por comparação, o IOP foi medido não-invasivamente por penumatometria (OBT) (Ávila et al, supra, 2005) . Como previamente descrito, o pneumatonômetro de ponta comercialmente disponível para tomografia do sangue ocular (OBT) (Blood Flow Analyzer [BFA] sonda de ponta: Paradigm Medicai Industries, Inc.) foi ajustado para um estabelecimento da construção de hábito. 0 fluxo de ar de uma fonte de pressão constante foi passado através do estabelecimento para alcançar a formação do diafragma da extremidade da ponta de BFA. 0 fluxo de ar desloca o diafragma para foram, permitindo o escape do ar através dos furos na parede da ponta da sonda para dentro da atmosfera. A pressão foi monitorada com um transdutor conectado através de uma conexão em T para a base da ponta do BFA. 0 arranjo da sonda foi avançado para a córnea com o filme de lágrima, como indicado por uma transferência na leitura da linha básica de produtividade. Em um método refinado, a ponta foi retirada até que a ponta da micropipeta fosse visualmente deslocada do filme de lágrima. Δ produtividade foi então ajustada para zero antes do avanço da ponta novamente. 0 contato com a córnea pressiona o diafragma da ponta de BFA, obstruindo o acesso do fluxo de ar para o furo de escape e eleva a pressão em uma base da ponta. O aumento na pressão com o avanço da sonda mostra, caracteristicamente, uma paralisação relativa ou uma região de curvatura, que é tomada por ser o ponto final para o IOP.

Este experimento foi simplificado para expedir a identificação do ponto final, e a sonda foi subseqüentemente avançada em cerca de 10 etapas padrões de aproximadamente 50 mm em intervalos de cerca de 10 segundos para identificar a região de curvatura (Wang et al, supra, 2006) . Em todo caso, foi considerado tecnicamente aceitável se a pressão registrada também demonstrou oscilações de pressão claramente em sincronia com a medida simultânea do pulso cardíaco. O pneumatonométrico estima que o IOP foi previamente encontrado por concordar com a medida manométrica em preparações canuladas e a estimativa obtida pela técnica servo-nula (Ávila et al., supra, 2005). Tendo estabelecido o valor da linha de base do IOP, a posição entre os eixos do avanço do micro-manipulador foi observada, e a sonda foi retraída do contato com a córnea. A medida subseqüente do IOP em períodos de tempos posteriores foi obtida por avanço da ponta da sonda da mesma posição, com a colocação do camundongo mantido esterotacticamente. As medidas foram conduzidas em intervalos de 10 minutos para evitar os artefatos potenciais associados com pressão prolongada na córnea. Seguindo este protocolo, a medida controle demonstrou uma maior estabilidade, acima de 30 minutos do período da medida.

A taxa cardíaca foi monitorada com um transdutor de pressão embalada em torno da cauda (MLT1010, Adinstruments, USA) . Ambos, o IOP e os sinais do pulso cardíaco foram filtrados em passagem de banda ("band- pass") (1 -100 Hz), amplificados usando um condicionador sinal (CyberAmp 380, Axon Instruments Inc., USA) e então digitalizado em 1 kHz usando um conversor de análogo para digital (MiniDigi 1 A sistema de aquisição de dois canais, Axon Instruments Inc., USA) em um modo de intervalo livre. 0 arquivo digital resultante foi analisado off-line usando Clampfit 9 (Axon Instruments). HCl Ketamina foi comprado da Phoenix Pharmaceutical Inc. (St. Joseph, MO). Outros fármacos foram obtidos da: Sigma Chemical (St. Louis, MO) . Os fármacos foram aplicados topicamente com uma pipeta Eppendorf. Os MRS-1191 e Cl- IB-MECA foram inicialmente dissolvidos em DMSO e então adicionados a uma solução salina contendo cloreto de benzalcônio para aumentar a permeabilidade corneal. A solução final gotejada contida no fármaco em concentrações declaradas junto com < 2% de DMSO e 0,005% de cloreto de benzalcônio em uma osmolalidade de 295 - 300 mOsm. 0 DMSO foi omitido, no geral, nas gotas contendo os compostos hidrofílicos de adenosina, carbacol e carboxifluoresceína.

Efeitos no IOP medido invasivamente foram observados 10 minutos após a aplicação tópica, porque, após este tempo, a presença continuada da micropipeta pode ser associada com uma tendência descendente do IOP, ainda sob as condições de controle. Em contraste, gotas menores (5 ml ao invés de 10 m) foram aplicadas ao olho mais freqüentemente (três vezes ao invés de uma vez) com a técnica não-invasiva, de modo a antecipar a secura do olho associada com o fluxo de ar a partir do pneumatômetro. Com o protocolo não-invasivo, o IOP foi estável por 30 minutos sob as condições de controle. O diâmetro da pupila foi medido antes e 10 minutos após a adição tópica de 10 ml de gotas contendo 40 mM (0,073 mg) do carbachol miótico em ambos os olhos do camundongo. Um olho não foi perfurado; o outro olho foi empalado com a micropipeta SNMS. Tanto o olho direito quanto o olho esquerdo de cada camundongo foi escolhido aleatoriamente para empalamento. Em uma concentração muito baixa e na ausência de uma micropipeta, a exposição ao carbachol durante 10 minutos não teve um efeito significante no tamanho da pupila. O diâmetro da linha de base foi de 1,80 + 0,17 mm (n = 6, P > 0,4) . Em contraste, com o impalamento da córnea do outro olho com uma micropipeta, o carbachol tópico reduziu o diâmetro da pupila em 38%, contraindo em 0,76 + 0,09 mm a partir da linha básica de 2,00 + 0,15 mm (n = 6, P < 0,0005). Em uma concentração das gotas dez vezes menores e uma dose (4 mM e 7,3 ng), o carbachol não teve efeito no tamanho da pupila, com ou sem o impalamento da córnea (dados não ilustrados; η = 2) . Os resultados indicaram que mesmo com a perfuração da córnea produzida pelas micropipetas de pontas finas usadas para tonometria SNMS pode facilitar a liberação do fármaco a partir do filme de lágrima para os sitios alvos intraocular.

Se a penetração do fármaco dentro do Iho foi influenciada pelo impalamento da córnea por uma micropipeta, foi ainda testado para aplicação tópica de 10 ml de gotas contendo 0,003% de carboxifluoresceina (0,3 mg) em ambos os olhos de dois camundongos. A carboxifluoresceina em uma molécula altamente polar que atravessa a camada da barreia do olho enfermo. Em cada camundongo, uma micropipeta de exploração foi primeiramente avançada dentro do humor aquoso de um olho enquanto o olho companheiro não foi empalado. Após 5 minutos, o olho foi lavado com salina isotônica. Fluorescência verde foi observada na câmara anterior dos olhos empalados de camundongos, mas não nos olhos controles, novamente sugerindo que a perfuração da córnea com a micropipeta pode facilitar a transferência dos fármacos e químicos para a lágrima dentro do humor aquoso.

A aplicação tópica de adenosina agonista Ar não-seletivo, mM em um volume de gotas de 10 ml (26,7 mg), aumentou prontamente o IOP de camundongos. 0 pico de resposta foi alcançado dentro de muitos minutos e a média + S.E.M., aumentada acima da linha básica após 10 minutos foi de 24,0 + 4,7 mitiHG (n = 14, P < 0,001). Similarmente, o agonista seletivo A3 CI-IB-MECA (200 mM, 1,09 ng) elevou o IOP em 10,0 + 2,9 mmHg (n = 9, P < 0,01). O antagonista A3 MRS-1191 dihidropiridina seletivo estabelecido exerceu um efeito oposto. Em uma concentração na gota de 2,5 mM (11,94 mg), MRS-1191 reduziu o IOP em 6,1 + 1,1 mmHg, novamente acima de um período de muitos minutos após a aplicação ( n= 6, P < 0,001).

Quando a medida de IOP em um pneumatonométrico não- invasivo foi testada em resposta à adenosina, CI-IB-MECA e MRS-1191 (gotas de 5 μΐ cada) na ausência do empalamento da córnea, o aumento detectável foi lento e menor (P < 0,02) do que o medido pela técnica servo-nulo invasiva. A diferença entre o SNMS e as medidas penumotonométricas foi ainda mais evidente com o agonista seletivo A3 CI-IB-MECA, o qual não produziu um aumento significante no IOP. A diminuição pneumotonometricamente medida no IOP reduzido pelo antagonista A3 MRS-1191 estabelecido foi próximo àquele detectado pelo SNMS. Entretanto, a diminuição máxima observada

penumotonometricamente foi observada no final do experimento, 30 minutos após a aplicação inicial de MRS- 1191. Em contraste, o efeito máximo do MRS-1191 detectado pelo SNMS foi muito precoce, em 9,6 - 1,1 minutos. A importância na descoberta deste experimento foi que: (1) a aplicação tópica de 40 mM (0, 073 mg) de carbachol produziu rápida constrição da pupila (miose) após o empalamento da córnea com uma micropipeta, mas não após a aplicação tópica sem o empalamento da córnea; e (2) a administração tópica do agonista de adenosina e CI-IB- MECA e do antagonista MRS-1191 reduziu menos, teve efeitos de IOP mais lentos na medida não invasiva pela pneumotonometria do que quando medido invasivamente pela tonometria SNMS. Embora múltiplos fatores possam estar envolvidos, incluindo a espessura da córnea de murino, foi eventualmente determinada pelos experimentos apresentados aqui, da tecnologia da medida de IOP, por si só, participa de uma regra importante na liberação do composto terapêutico aplicado topicamente para uma câmara anterior. De qualquer forma a pesquisa SNMS envolve uma micropipeta fina de exploração, cujo diâmetro é de 5-10 mm, algumas 5-10 vezes menores do que a micro-agulha utilizada na técnica de manométrica convencional, o empalamento da córnea muda significativamente a liberação do fármaco ao seu alvo.

A delicadeza da ponta minimiza o vazamento, mas a medida de IOP paralela pela técnica invasiva e não-invasiva demonstra que o revestimento ocular do olho do camundongo, apesar de sua estrutura fina, apresenta uma barreira substancial à penetração do fármaco. Os resultados obtidos com o carbachol e fármaco purinérgico documentaram que a liberação do fármaco é aumentada pelo empalamento da córnea com a micropipeta. Todos os fármacos purinérgicos atualmente estudados exerceram efeitos rápidos e amplos no IOP do camundongo se aplicado topicamente durante o empalamento da córnea, mas exibe taxas altamente variáveis de ação quando aplicados aos olhos não tratados. A permeabilidade ocular destes fármacos purinérgicos não foi uma simples função da hidrofobicidade relativa. Por fazer uma medida complementar do IOP do camundongo pela tonometria SNMS facilita substancialmente a liberação do fármaco através da barreira da córnea ou do revestimento ocular e, aumenta a eficácia do fármaco, mesmo se a penetração tópica do fármaco é muito lenta para manifestar os efeitos fisiológicos convincentes nos olhos intactos. Exemplo 2 - Efeitos independentes da espécie de antagonistas A3AR in vivo em um modelo animal. Os antagonistas A3AR utilizados nos estudos prévios ambos bloquearam a redução iniciada pela adenosina das células NPE humanas cultivadas e diminuiu o IOP de camundongos. As células NPE foram a partir de 4-clones, derivadas de uma cultura primária de epitélio ciliar não-pigmentado humano (ver, Martin-Vasallo et al., "J. Cell Physiol.', 141:243-252 (1989). Entretanto, os derivados

heterociclico, tais como dihidropiridina MRS-1191 e a piridina MRS-1523, utilizadas naqueles estudos, revelaram variantes de afinidades amplas para as diferentes espécies de A3AR. Esta variabilidade é ilustrada por uma afinidade de ligação muito alta do antagonista para o rato, em relação aos receptores A3 humanos, variando de para > 30.000 (Yang et al. , supra, 2005). A não- generalidade da seletividade do antagonista, portanto, limitou a capacidade para avaliar a relevância clinica potencial dos antagonistas A3 conhecidos em modelos animais, nos quais a seletividade de A3 dos compostos poderia ser muito diferente dos humanos.

Para dirigir este fluxo de afinidade, os antagonistas A3 foram construídos através da modificação dos agonistas A3, cuja alta afinidade de IB-MECA aos receptores A3 se estende através das espécies. Ver, a verificação prévia de que os antagonistas A3, por exemplo, MRS-1292 (Gao ETA al., "Biochem. Pharmacol.", 65: 1675-1684 (2003)), é efetivo tanto no bloqueio da redução despertada pela adenosina das células NPE humanas cultivadas e na diminuição de IOP do camundongo (Yang et al, supra, 2005) . 0 MRS-1292 foi testado no camundongo por duas razões. Os camundongos transgênicos provêem uma oportunidade conveniente para o estudo da fisiologia e farmacologia molecular nos animais vivos (por exemplo, Avila et al., supra, 2003) . Em segundo lugar, a medida do IOP permitiu o acesso aos efeitos de MRS-1292 no parâmetro alvo. Entretanto, os protocolos de estímulo de adenosina reconhecidos não foram usados nos camundongos porque eles não apenas estimulam os receptores A3, mas também ativam outros ARs que tem efeitos independentes no IOP. Portanto, para direcionar o acesso ao efeito de MRS- 1292 in vivo nos camundongos, o IOP foi monitorado antes e após a aplicação do fármaco. 0 IOP foi monitorado com o sistema de micropipetas servo-nulo (SNMS). Os protocolos de teste são descritos em detalhes por Yang et al. , supra, 2005, incorporados aqui por referência. 0 MRS-1292 é um derivado de nucleosideo estruturalmente relacionado ao agonista IB-MECA, cuja alta afinidade de IB-MECA nos receptores A3 estende-se através das espécies. 0 MRS-1292 também é um receptor A3 seletivo tanto em humanos quanto em ratos. Notavelmente, a proporção da afinidade de ratos para humanos para os receptores A3 é similar para o MRS-1292 e o agonista A3 seletivo. Quando o MRS-1292 foi testado por Yang et al. , supra 2005, descobriu-se que opera como um antagonista do receptor adenosina A3 em efeitos imitados de antagonistas A3 não purina em células NPE humanas cultivadas e o IOP alterado de camundongo. Especificamente, as células NPE humanas cultivadas, pré-tratadas com os antagonistas por dois minutos antes do inicio da medida, foram suspensas na solução controle contendo gramicidina, demonstrando uma redução leve acima de 60 minutos de estudo (Δν°° = 1,2 + 0,1%). 0 símbolo Δν°°, simboliza a redução de um estado estável. A adenosina (10 μΜ) aumentou o grau de redução muitas vezes. O MRS-1292 reduziu significativamente a magnitude (Δν°° = 1,9 + 0,2%, ρ < 0,001 pelo teste t- Student) e diminui a taxa de redução de funcionamento de adenosina. Na presença de MRS-1292, o tempo constante (τ) da redução foi prolongado a partir de 3,8 + 0,6 para 11,67 +2,6 minutos (p< 0,02). Em presença do antagonista A3 1,4-dihidropiridina MRS-1191, as células tratadas com adenosina demonstrar nenhuma redução exponencial. Como observado previamente, o MRS-1191 não foi previamente utilizado com sucesso para antagonizar os ARs humanos, de ratos e de camundongos. A adição tópica das gotas contendo 25 μΜ do antagonista putativo MRS-1292 produziu uma redução máxima no IOP por 8 a 19 minutos (média 15 + 1 minuto) de 4,4 + 0,8 mm Hg (n = ίο, ρ < 0, 005, teste t Student) . Em comparação, a adição do mesmo volume de salina na mesma osmolalidade não produziu mudança significante no IOP (-0,3 + 1,2 mmHg, η = 6, ρ > 0,8) 14 minutos mais tarde. Assim, em concordância com as observações prévias, o agonista A3AR IB-MECA produziu um aumento rápido do IOP de 4,6 + 1,6 mmHg (n = 6, ρ < 0,05 pelo teste t Student) em 140 nM. Em uma concentração 10 vezes menor, IB-MECA aumentou o IOP em 2,2 + 0,5 mm Hg (p < 0,02) . Em contraste, em uma concentração da gota muito maior (1400 nM) , IB-MECA não exerceu efeito significante ( - 1,2 + 1,9 mmHg), presumivelmente devido a reação cruzada com A2aARs. Para estimar uma faixa aproximada, a "penetração" foi definida por Yang et al, como a proporção ao valor Ki publicado em receptores in vitro para uma concentração efetiva mínima, para um número de agonistas e antagonistas de adenosina. Assim, a faixa de penetração de 1:100 para 1:1000 para os fármacos purinérgicos que foram testados no camundongo, não foi muito diferente da penetração do fármaco de 1:100 para os agentes aplicados topicamente aos coelhos e primatas. Esta regra de manusear também se aplica aos bloqueadores de acilguanidina e bumetanida, cujos efeitos tópicos também foram estudados nos olhos dos camundongos. Desta forma, uma penetração de aproximadamente 1:1000 que Yang et al. Relatou em 2003 na citação para MRS-1292, no experimento atual é consistente com os estudos passados. Usando uma estratégia similar, dois novos antagonistas A3 MRS-3642 e MRS-3771, foram desenvolvidos. 0 composto anterior, MRS-1292, foi uma modificação do agonista A3 IB-MECA. Os dois novos fármacos (MRS-3642 e MRS-3771) foram modificações de agonistas A3 mais seletivas CI-IB- MECA, (estrutura mostrada na figura 6) , e foram, portanto, antecipados por serem ainda mais seletivos do que o MRS-1292. Usando a técnica servo-nula invasiva, ambos os novos fármacos, MRS-3642 e MRS-3771, demonstraram serem eficazes na diminuição do IOP de camundongos usando medidas invasivas (Tabela 1).

Na tabela I, um ponto final de 10 minutos foi utilizado para a medida invasiva em vista das tendências discutidas acima do IOP, ainda sob condições controladas. Também a necessidade de gotas menores, mais freqüentes foi discutida acima com relação às técnicas não invasivas usando o pneumotonômetro. Como acima, com o protocolo não-invasivo, o IOP foi estável durante 30 minutos sob condições controladas. Cu

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Exemplo 3 - Efeito de MRS-3820, independente da espécie Em vista dos resultados de espécies cruzadas mencionados antes, uma série de modificações de dois antagonistas A3AR baseado em nucleosídeos, MRS-3642 e MRS-3771, foram desenvolvidos para reter sua eficácia de espécie cruzada como antagonistas A3AR, e ainda também foi suficientemente permeável através da córnea para produzir reduções rápidas em IOP de camundongos. Isto permitiu uma determinação da eficácia de cada um dos compostos pro medida invasiva de IOP, e sua capacidade em cruzar a córnea rapidamente seria monitorada por medida não- invasiva de IOP. Um número de ésteres de MRS-3771 e MRS 3642 foram testados. Foram medidos invasivamente, o MRS- 3824 e a ineficácia (tabela 1). 0 MRS-3833 reduziu o IOP levemente em 200 nM não invasivamente, mas foi de outra forma ineficiente invasivamente e não-invasivamente (Tabela 1) . 0 MRS-3826 e o MRS-3827 diminuíram o IOP de camundongos quando invasivamente medido, mas não teve efeito acima do período da medida não-invasiva. 0 antagonista A3AR baseado em nucleosídeo, MRS-3820, foi descoberto por ser eficaz, tanto por medida invasiva e não-invasiva. MRS-3820 (LJ-1251), uma modificação de MRS- 3642, foi preparado por L.S. Jeong para NIH. A estrutura de MRS-3820 (2-(2-cloro-6-(3-iodobenzilamino)-9H-purina- 9-ila)tetrahidrotiofeno-3,4-diol é mostrada na figura 6B. Notavelmente, o MRS-3820 demonstrou ter menor medida não- invasiva de IOP dentro de 20 minutos. Como ilustrado na Tabela 1, a relação da resposta-concentração foi medida tanto por técnica invasiva quanto por técnica não- invasiva, apesar da magnitude das respostas não serem diretamente comparáveis devido a, como observado acima, aos protocolos e aos pontos limites do tempo utilizados com as duas técnicas serem necessariamente diferentes. Após a aplicação tópica de 250 μΜ de MRS-3820, a resposta máxima medida não-invasiva foi de -4,2 + 0,7 mm Hg, 30 minutos mais tarde (Tabela 1). Além disso, 250 μΜ de MRS- 3820 reduziu significativamente o IOP após um breve intervalo de 20 minutos após a aplicação, em 3,4 + O,7 111111 Hg (N = 6, P = 0, 004) . A redução no IOP produzido por MRS-3820, medido tanto invasivamente quanto não- invasivamente indica que este composto pode penetrar rapidamente a córnea para agir como antagonista em receptores A3 no sitio alvo, das células epiteliais ciliares não-pigmentadas. O trabalho in vitro com células epiteliais ciliares e tecidos acima mencionados (Carre et al., supra, 1997; Mitchell et al. , supra, 1999; Carre et al, supra, 2000) indica que o antagonismo dos receptores A3 reduz a atividade do canal CI~ das células epiteliais ciliares não-pigmentada. A redução de taxa posterior na formação do humor aquoso reduziu o IOP.

Tabela 2:

Efeito da aplicação tópica de MRS-3771 na pressão intraocular de camundongos C57, quando medido invasivamente pela técnica servo nulo.

Exp. No.: Cepa de Linha de MRS-3771 Mudança Camundongo Base (mm Hg) (mm Hg) no IOP (mm Hg) 05072 9B C57 13, 6 12, 7 -0,9 05072 9C C57 16, 4 11, 8 -4,6 050801C C57 11, 4 8,9 -2, 5 050801D C57 22, 8 19, 4 -3,4 050802A C57 20, 8 16, 2 -4,6 050802B C57 14, 3 10,5 -3, 9 Média + SEM 16, 5 + 13,2 + -3,3+0,6; emparelhada 1,8 1,6 P=O,002 ao teste t

Os dados da tabela 1, tomados juntos com as medidas de ligação não-publicadas de MRS-3820 verificaram ainda que este composto funcionalmente atravesse as espécies na ligação aos receptores A3. Os experimentos foram realizados usando as células CHO aderentes estavelmente transfectadas com o cDNA codificante dos receptores de adenosina (exceto para o A2aAR expresso nas células HEK 293). A ligação foi realizada usando [3H]CCPA, [3H] CGS- 21680, e [ 125I]AB-MECA como radio-ligantes para receptores Αχ, A2a , e A3, respectivamente. Os valores apresentados aqui são expressos como médias + SEM, N=3-4 . NECA foi utilizado para determinar a ligação não-especifica. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre a ligação de MRS-3820 para os receptores A3 humanos e de ratos. Especificamente, a ligação aos receptores A3 humanos foi de 4,2 + 0,5 nM e para os receptores A3 de ratos foi de 3,9 + 1,2 nM. A ligação aos receptores A3 é também altamente seletiva.

A potência (Ki, nM + SEM) em cada um dos quatro receptores de adenosina humanos é: 2,485 + 940 nM (Αχ), 341 + 74,6 nM (A2a) , < 10% até 10 mM (A2b) e 4,16 + 0,50 nM (A3). Adicionalmente, a ligação de MRS-3820 antagoniza funcionalmente os receptores A3 humanos. Em um ensaio AMP cíclico funcional no receptor A3 humano expresso em células CHO, MRS-3820 dependente da dose deslocou o agonista (CI-IB-MECA) na curva da resposta a dose para a direita como um antagonista, correspondente ao valor KB de 1,92 nM. Assim, a eficácia de MRS-3820, como antagonista de espécie-cruzada foi verificado como um antagonista A3 funcional em humanos e ratos (ver, Jacbson e Gao, supra) e em camundongo (tabela 1) . A grande redução no IOP do camundongo normal foi uma indicação da eficácia potencial dos antagonistas A3AR. A lata seletividade dos fármacos, como mostrado, reduziu a possibilidade dos efeitos colaterais. Em adição, o efeito do IOP produziu evidência de que MRS-3820 atravessou a córnea.

Conseqüentemente, a presente invenção provê um método definitivo para liberação de um inibidor A3 potente, independente da espécie, através da barreira corneal para reduzir a atividade dos canais Cl", das células (NPE) epitelial ciliar não-pigmentada, reduzindo, desse modo, a taxa de formação de humor aquoso e a diminuição da pressão intraocular.

A descrição de cada patente, pedido de patente e publicação, citada ou descrita, neste documento foi incorporada aqui por referência, em sua integra. Enquanto a especificação anterior foi descrita com relação às configurações preferidas, e quaisquer detalhes representados têm o propósito ilustrativo, será aparente aos técnicos no assunto, sem fugir do escopo e do espirito da presente invenção, que a invenção pode ser submetida a várias modificações e configurações adicionais, e que determinados detalhes descritos aqui podem ser consideravelmente variados sem fugir dos princípios básicos da invenção. As referidas modificações e configurações adicionais também estão pretendidas dentro do escopo das reivindicações anexas.

Claims (15)

1. Método para reduzir a pressão intraocular, em um indivíduo com um distúrbio ocular, definido por elevada pressão ocular, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar a um indivíduo, uma quantidade efetiva de uma composição farmacêutica de espécies cruzadas, para redução da pressão ocular, compreendendo um antagonista receptor de adenosina subtipo A3.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o antagonista receptor de adenosina subtipo A3 compreender uma dihidropiridina, piridina, um sal de piridínio ou triazoloquinazolina, ou derivados dos mesmos, tendo, expressamente, uma atividade do antagonista receptor de adenosina subtipo A3.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de o antagonista receptor de adenosina subtipo A3 no método compreender uma composição consistindo de MRS-10 97, MRS-1191, MRS-1220, MRS-1523, MRS-1292, MRS- 1523, MRS-1292, MRS-1523, MRS-3642, MRS-3771, MRS-3826, MRS-3827, MRS-1220, MRS-1649, LJ-1830, LJ-1831, LJ1833, LJ-1834, LJ-1835, LJ-1836, LJ-1837 e MRS-3820.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de o antagonista receptor de adenosina subtipo A3 compreender (2-(2-cloro-6(3-iodobenzilamino)-9H-purin- 9-ila) tetrahidrotiofeno-3,4-diol ou MRS-3820.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração da composição farmacêutica tópica, sistêmica, ou oral.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de compreender ainda a administração da composição farmacêutica topicamente em um filme de lágrima dos olhos do paciente, na forma de uma pomada, gel ou gotas para os olhos.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente empalar a córnea do olho do paciente com uma microagulha ou micropipeta dentro de 0,1-30 minutos de administração da composição ao filme de lágrima do olho.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de a etapa de empalar ser parte de uma avaliação invasiva da eficácia da composição para reduzir a pressão intraocular do olho.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de compreender a técnica invasiva de servo- nulo.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de a pressão intraocular elevada ser sintomática de glaucoma no paciente.

11. Método para assegurar a liberação de uma composição terapêutica para reduzir a pressão intraocular, em um indivíduo com um distúrbio ocular, definido por elevada pressão intraocular, caracterizado pelo fato de compreender: administrar topicamente em um filme de lacrima do olho do indivíduo, uma quantidade efetiva da composição farmacêutica para reduzir a pressão intraocular compreendendo um antagonista receptor de adenosina subtipo A3; e empalar a córnea do olho do paciente com uma microagulha ou micropipeta dentro de 0,1-30 minutos da administração da composição ao filme de lágrima do olho.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o antagonista receptor de adenosina subtipo A3 compreender uma dihidropiridina, piridina, um sal de piridínio ou triazoloquinazolina, ou derivados dos mesmos, tendo, expressamente, uma atividade L do antagonista receptor de adenosina subtipo A3.

13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de o antagonista receptor de adenosina subtipo A3 no método compreender uma composição consistindo de MRS-1097, MRS-1191, MRS-1220, MRS-1523, MRS-1292, MRS-1523, MRS-3642, MRS-3771, MRS-3826, MRS- 3827, MRS-1220, MRS-1649, LJ-1830, LJ-1831, LJ1833, LJ- 1834, LJ-1835, LJ-1836, LJ-1837 e MRS-3820.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de o antagonista receptor de adenosina subtipo A3 compreender (2-(2-cloro-6(3- iodobenζilamino)-9H-purin-9-ila)tetrahidrotiofeno-3,4- diol ou MRS-3820.

15. Método para reduzir a pressão intraocular em um indivíduo com um distúrbio ocular, caracterizado pelo fato de compreender a etapa de administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um pró-fármaco do antagonista receptor de adenosina subtipo A3 de espécie cruzada, para reduzir a pressão ocular, que ativa ou assegura a produção de uma quantidade efetiva do receptor da adenosina subtipo A3, redutora de pressão ocular, in vivo, para reduzir a pressão ocular.