BRPI0712899A2 - derivados de leptomicina - Google Patents

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BRPI0712899A2
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BRPI0712899-1A
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Herve Bouchard
Alain Commercon
Ravi V J Chari
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Sanofi Aventis
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Abstract

DERIVADOS DE LEPTOMICINA. A presente invenção refere-se a derivados de leptomicina tendo uma porção, tal como um sulfeto ou dissulfeto, que podem conjugar-se a um reagente de ligação celular tal como um anticorpo. O emprego terapêutico de tais conjugados de derivado de leptomicina é também descrito; tais conjugados possuem emprego terapêutico por que eles podem liberar derivados de leptomicina citotóxicos para uma população celular específica de uma maneira objetiva.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "DERIVADOS DE LEPTOMICINA". CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a novos derivados de Ieptomicina e seus empregos terapêuticos. Mais especificamente, a invenção refere-se a novos derivados de Ieptomicina que contêm uma porção (grupo de ligação) que pode ser covalentemente ligada a um agente de ligação de célula, e os conjugados correspondentes compreendendo o referido derivado de Iepto- micina ligado por meio de um Iigante ao referido agente de ligação de célula. Os referidos conjugados fornecem agentes terapêuticos capazes de serem ativados e liberados in vivo, e liberados às populações celulares específicas de uma maneira objetiva. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Muitos relatos surgiram os quais são direcionados a atingir célu- Ias de tumor com conjugados de anticorpo fármaco monoclonal {Sela e ou- tros, em Immunoconjugates, pp. 189-216 (C. Vogel, ed. 1987); Ghose e ou- tros, em Targeted Drugs, pp. 1-22 (E. Goldberg, ed. 1983); Diener e outros, em Antibody Mediated Delivery Systems, pp. 1-23 (J. Rodwell, ed. 1988); Pietersz e outros, em Antibody Mediated Delivery Systems, pp. 25-53 (J. Rodwell, ed. 1988); Bumol e outros, em Antibody Mediated Delivery Sys- tems, pp. 55-79 (J. Rodwell, ed. 1988); G.A. Pietersz & K.Krauer, 2 J. Drug Targeting, 183-215 (1994); R. V. J. Chari, 31 Adv. Drug Delivery Revs., 89- 104 (1998); W.A. Blattler & R.V.J. Chari, em Anticancer Agents, Frontiers em Câncer Chemotherapy, 317-338, ACS Symposium Series 796; e I. Ojima e outros eds, American Chemical Society 2001}. Os fármacos citotóxicos tais como metotrexato, daunorrubicina, doxorrubicina, vincristina, vinblastina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, caliqueamicina e maitansinoides foram conjugados a uma variedade de anticorpos monoclonais de murino. Em al- guns casos, as moléculas de fármaco foram ligadas às moléculas de anti- corpo através de uma molécula de veículo intermediária tal como albumina de soro {Garnett e outros, 46 Câncer Res. 2407- 2412 (1986); Ohkawa e outros, 23 Câncer Immunol. Immunother. 81-86 (1986); Endo e outros, 47 Câncer Res. 1076-1080 (1980)}, dextran {Hurwitz e outros, 2 Appl. Biochem. 25-35 (1980); Manabi e outros, 34 Biochem. Pharmacol. 289-291 (1985); Dillman e outros, 46 Câncer Res. 4886-4891 (1986); e Shoval e outros, 85 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 8276-8280 (1988)}, ou ácido poliglutâmico {Tsukada e outros, 73 J. Natl. Cane. Inst. 721-729 (1984); Kato e outros, 27 J. Med. Chem. 1602-1607 (1984); Tsukada e outros, 52 Br. J. Câncer 111- 116(1985)}.
Um amplo grupo de Iigantes está agora disponível para a prepa- ração de tais imunoconjugados, incluindo igualmente Iigantes de clivagem e não-clivagem. Os testes de citotoxicidade in vitro, entretanto, revelaram que os conjugados de anticorpo-fármaco raramente alcançam a mesma potência citotóxica como os fármacos não-conjugados livres. Isto sugeriu que os me- canismos pelos quais as moléculas de fármaco são liberadas dos anticorpos conjugados sejam muito ineficientes. Recente trabalho na área de imunoto- xinas mostrou que os conjugados formados por meio de pontes de dissulfeto entre os anticorpos monoclonais e toxinas de proteína cataliticamente ativas foram mais citotóxicos do que os conjugados contendo outros Iigantes {Lam- bert e outros, 260 J. Biol. Chem. 12035-12041 (1985); Lambert e outros, em Immunotoxins 175-209 (A. Frankel, ed. 1988); Ghetie e outros, 48 Câncer Res. 2610-2617 (1988)}. Esta citotoxicidade melhorada foi atribuída à con- centração intracelular elevada de glutationa reduzida contribuindo para a clivagem eficiente da ligação de dissulfeto entre a molécula de anticorpo e a toxina. Maitansinoides e caliqueamicina foram os primeiros exemplos de fármacos altamente citotóxicos que foram ligados aos anticorpos monoclo- nais por meio de ligações de dissulfeto. Os conjugados de anticorpo destes fármacos mostraram possuir potência elevada in vitro e atividade antitumor excepcional em modelos de xenoenxerto de tumor humanos em camundon- gos {R. V. J. Chari e outros, 52 Câncer Res., 127-131 (1992); C. Liu e ou- tros, 93, Proc. Natl. Acad. ScL, 8618-8623 (1996); L.M. Hinman e outros, 53, Câncer Res., 3536-3542 (1993); e P.R. Hamann e outros, 13, BioConjugate Chem., 40-46 (2002)}. Leptomicina B: é um produto natural originalmente isolado de Steptomyces spp., como rela- tado em US 4.771 .070 e US 4.792.522. Foi originalmente identificado como um resultado da avaliação para atividade antimicrobiana e subseqüentemen- te identificado como um agente antitumor (Komiyama e outros, J.Antibiotics 1985, 38(3), 427-429 e US 2003/0162740). No nível molecular, a Ieptomicina B age como um inibidor do receptor de exportação nuclear CRM1, o qual se liga a e afeta a translocação nuclear das "proteínas cargo". No nível celular, a Ieptomicina B age interrompendo-se as células no fim das fases G1 e G2 do ciclo celular (Kalesse e outros, Synthesis 2002, 8, 981- 1003). Entretanto, sua toxicidade extrema voltada para células de mamífero (Hamamoto e ou- tros, J. Antibiotics 1983, 36(6), 639-645) tornam seu emprego clínico impos- sível. É, desse modo, altamente desejável reduzir a toxicidade dos derivados de Ieptomicina com relação às células não-direcionadas.
A eficácia terapêutica dos derivados de Ieptomicina pode ser grandemente melhorada mudando-se a distribuição in vivo através da libera- ção direcionada ao sítio de tumor, resultando na toxicidade inferior para teci- dos não-alvejados, e assim, toxicidade sistêmica inferior. A fim de alcançar este objetivo, os presente inventores consideraram preparar conjugados de derivados de Ieptomicina B com agentes de ligação de célula que são espe- cificamente direcionadas a células de tumor, com a finalidade de exibir cito- toxicidade específica de alvo elevada. SUMÁRIO DA INVENÇÃO
O objetivo da presente invenção é fornecer derivados de Iepto- micina que contenham um grupo de ligação que pode ser covalentemente ligado a um agente de ligação de célula, e os conjugados correspondentes compreendendo o referido derivado de Ieptomicina ligado por meio de um Iigante ao referido agente de ligação de célula. Os referidos conjugados for- necem agentes terapêuticos capazes de serem ativados e liberados in vivo, e liberados às populações de célula específica de uma maneira direcionada. A fim de também realçar a solubilidade em água, um espaçador opcional de polietileno glicol pode ser introduzido no grupo de ligação.
Os compostos da invenção podem ser empregados em conjuga- dos citotóxicos nos quais um agente de ligação celular é ligado a um ou mais dos compostos da presente invenção. Os agentes de ligação celular incluem anticorpos e fragmentos destes, interferonas, linfocinas, vitaminas, hormô- nios e fatores de crescimento. As composições farmacêuticas contendo tais conjugados são também fornecidas.
Os conjugados citotóxicos podem ser empregados em um méto- do para tratar um indivíduo administrando uma quantidade eficaz da compo- sição farmacêutica acima. De acordo com o tipo celular ao qual o agente de ligação celular selecionado se liga, muitas doenças podem ser tratadas in vivo, ex vivo ou in vitro. Tais doenças incluem, por exemplo, o tratamento de muitos tipos de câncer, incluindo linfomas, leucemias, câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, e similar(es).
Desse modo, são fornecidos derivados de Ieptomicina os quais são úteis no direcionamento de tipos de célula específicos por meio da con- jugação a um agente de ligação de célula específico. BREVE DESCRIÇÃO DA FIGURA A Figura 1 exibe citotoxicidade in vitro e especificidade do Deri-
vado do conjugado huC242- SSNPB- Ieptomicina do exemplo 6. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Os presentes inventores descobriram os derivados de Ieptomici- na os quais são capazes de se ligar aos agentes de ligação celular pelos quais a eficácia terapêutica de tais derivados é melhorada mudando-se a distribuição in vivo através da liberação direcionada dos derivados ao sítio de tumor, resultando em uma toxicidade inferior aos tecidos não-alvejados, e portanto toxicidade sistêmica inferior.
A fim de alcançar este objetivo, os inventores sintetizaram deri- vados de Ieptomicina exemplares que compreendem um grupo de ligação para a conjugação do derivado de Ieptomicina a um agente de ligação celu- lar. O grupo de ligação pode conter um espaçador de polietileno glicol. O grupo de ligação é empregado para a conjugação aos agentes de ligação celular, e preferivelmente compreende uma ligação de dissulfeto ou uma ligação de sulfeto (ou denominado aqui tioéter).
Foi previamente mostrado que a ligação de fármacos altamente citotóxicos aos anticorpos empregando uma ligação de clivagem, tal como uma ligação de dissulfeto, garante a liberação de fármaco completamente ativo dentro da célula, e que tais conjugados são citotóxicos de uma maneira específica de antígeno {R. V. J. Chari e outros, 52 Câncer Res. 127-131 (1992); R.V.J. Chari e outros, 55 Câncer Res. 4079- 4084 (1995); e as Pa- tentes dos Estados Unidos nos 5.208.020 e 5.475.092}. Na presente inven- ção, os inventores descrevem a síntese dos derivados de leptomicina, pro- cedimentos para sua conjugação aos anticorpos monoclonais e para medi- ção da especificidade e citotoxicidade in vitro de tais conjugados. Desse mo- do, a invenção fornece compostos úteis para a preparação de agentes tera- pêuticos direcionados à eliminação de células anormais ou doentes que de- vem ser mortas ou Iisadas tais como as células de tumor, células infectadas por vírus, células infectadas por micro-organismo, células infectadas por pa- rasita, células autoimunes (células que produzem auto-anticorpos), células ativadas (aquelas envolvidas em rejeição a enxerto ou doença de enxerto vs. hospedeiro), ou qualquer outro tipo de células anormais ou doentes, ao mesmo tempo que exibindo efeitos colaterais mínimos.
Desse modo, a invenção ensina a síntese dos derivados de lep- tomicina que podem ser quimicamente ligados ao agente de ligação celular e que mantêm, mediante a liberação do grupo de proteção, a citotoxicidade elevada dos derivados de leptomicina de origem. Estes compostos quando ligados a um agente de ligação celular são citotóxicos às células as quais o agente de ligação celular se liga e são muito menos tóxicos às células não- alvo.
Derivados de leptomicina da invenção Os derivados de leptomicina de acordo com a presente invenção
compreendem um grupo de ligação capaz de conjugar o derivado a um a- gente de ligação celular. De acordo com a presente invenção, "derivados de leptomicina" referem-se aos membros da família de leptomicina como definido em Kales- se e outros em Synthesis 2002, 8, 981-1003, e incluem: leptomicinas, tais como leptomicina A e leptomicina B, calistatinas, ratjadonas tais como ratja- dona A e ratjadona B, anguinomicinas tais como anguinomicina A, B, C, D, casusamicinas, leptolestatina, leptofuraninas, tais como Ieptofuranina A, B, C1 D.
Os derivados de leptomicina AeB são preferidos.
A fim de ligar o derivado a um agente de ligação celular, o deri- vado deve incluir uma porção (grupo de ligação) que permita que os deriva- dos sejam ligados a um agente de ligação celular por meio de uma ligação tal como uma ligação de dissulfeto, uma ligação de sulfeto (ou denominado aqui tioéter), um grupo de ácido lábil, um grupo fotolábil, um grupo peptida- se-lábil, ou um grupo de esterase-lábil. Os derivados são preparados de mo- do que contenham uma porção necessária para ligar o derivado de leptomi- cina a um agente de ligação celular por meio de, por exemplo, uma ligação de dissulfeto, uma ligação de tioéter, um grupo de ácido lábil, um grupo foto- lábil, um grupo de peptidase-lábil, ou um grupo de esterase-lábil. A fim de também realçar a solubilidade em soluções aquosas, o grupo de ligação po- de conter um espaçador de polietileno glicol.
Preferivelmente, uma ligação de sulfeto ou dissulfeto é empre- gada por causa do meio de redução dos resultados de célula direcionada na clivagem do sulfeto ou dissulfeto e liberação dos derivados com um aumento associado na citotoxicidade. De acordo com um aspecto preferido, a presente invenção for-
nece derivados de leptomicina em que a função de carbonila terminal repre- senta uma porção que permite a ligação do derivado a um agente de ligação celular. A porção de ligação pode conter um espaçador de polietileno glicol. Exemplos incluem porções que permitem ligações por meio de ligação de dissulfeto, uma ligação de tioéter, um grupo de ácido lábil, um grupo fotolá- bil, um grupo de peptidase-lábil, ou um grupo de esterase-lábil, e são bem- conhecidas na técnica {vide, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos n° 5.846.545, que é incorporada aqui por referência}. As porções preferidas são aquelas que permitem a ligação por meio de uma ligação de dissulfeto, por exemplo tiol ou dissulfeto. Dissulfetos misturados contendo qualquer grupo de saída terminal, tais como glutationa, alquil tio tal como metiltio, piridiltio, ariltio, nitropiridiltio, hidroxicarbonilpiridiltio, (nitro)hidroxicarbonilpiridiltio, e similar(es) podem ser empregados contanto que tais dissulfetos sejam capa- zes de passar por uma reação de permuta de dissulfeto para o acoplamento do derivado ao agente de ligação celular.
Mais especificamente, os derivados da invenção são da fórmula
(I):
J J R**
O ' » ' Ά9 ' γ^^ο^Ο
R17
0)
em que
Ra e Ra1 são H ou -Alq; preferivelmente Ra é -AIq1 preferivel- mente metila e Ra1 é H;
R17 é alquila opcionalmente substituída por OR, CN, NRR', per-
fluoroalquila; preferivelmente, R17 é alquila, mais preferivelmente metila ou etila;
R9 é alquila opcionalmente substituída por OR, CN, NRR1, per- fluoroalquila; preferivelmente, R9 é alquila, mais preferivelmente metila;
X é -O- ou -NR-; preferivelmente, X é -NR-;
Y é -U-, -NR-U-, -0-U-, -NR-CO-U-, -U-NR-CO-, -U-CO-, -CO-U-
; preferivelmente, quando X for -O-, Y seja -U-, -NR-U-, -U-NR-CO-; onde U é selecionado de -AIq- linear ou ramificada, -AIq(OCH2CH2), -(OCH2CH2)m- Alq-, -AIq(OCH2CH2)m-AIq-, -(OCH2CH2)m-, -Cicloalquila-, -Heterocíclico-, - Cicloalquil-Alq-, -Alq-Cicloalquila-, -Heterocíclico-Alq-, -Alq-HeterocicIico-;
Onde m é um número inteiro selecionado de 1 a 2000; preferi-
velmente, U é -AIq- linear ou ramificada,
Z é -AIq-;
η é O ou 1; preferivelmente η é 0; T representa H1 um grupo de proteção de tiol tal como Ac, Ri ou SRi, em que Ri representa H, metila, Alq, Cicloalquila, arila opcionalmente substituída ou heterocíclico, ou T representa
R17
onde:
Ra, Ra', R17, R9, Χ, Υ, Ζ, η são como acima definidos; preferi-
velmente, T é H ou SRi, em que Ri representa Alq, mais preferivelmente metila;
R, R' idênticos ou diferentes são H ou alquila; Alq representa uma alquila linear ou ramificada; preferivelmente Alq representa (-(CH2 q (CH3)q)p- onde ρ representa um número inteiro de 1 a 10; e q representa um número inteiro de 0 a 2; preferivelmente, Alq repre- senta -(CH2)- ou -C(CH3)2-,
ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, ou sais hi- dratados, ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enantiômeros.
Os compostos preferidos podem ser selecionados de: ácido (2-metilsulfanil-etil)-amida de (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- Hidróxi-3,5, 7,9,11 ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico, ácido Bis-[(2-mercaptoetil)-amida de (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)-
(R)-6-hidróxi-3,5, 7,9,11 ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo- nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico],
ácido (2-Mercapto-etil)-amida de (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11 , 15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico,
ácido (2-Metildissulfanil-etil)-amida de (2E,10E,12E,16Z,18E)- (R)-6-hidróxi-3,5, 7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo- nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico,
ácido (2-Metil-2-metildissulfanil-propil)-amida de (2Ε, 10E112Ε,16Ζ, 18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11, 15, 17-heptametil-19- ((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8- oxo-nonadeca-2,
10,12,16,18-pentaenoico,
ácido (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida de (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11 ,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo- 3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8- oxo-nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, ou sais hidratados, ou as estruturas cristalinas polimórficas destes compostos ou seus isômeros ópti- cos, racematos, diastereômeros ou enantiômeros. Como definido aqui, a alquila inclui CrC2O alquilas lineares ou
ramificadas. Exemplos de alquilas lineares incluem metila, etila, propila, buti- Ia1 pentila e hexila. Exemplos de alquilas ramificadas incluem isopropila, iso- butila, sec-butila, terc-butila, isopentila e 1-etil-propila. Exemplos de cicloal- quilas, isto é, alquilas cíclicas, incluem ciclopropila, ciclobutila, ciclopentila e ciclo-hexila. Exemplos de arilas incluem fenila e naftila. Exemplos de arilas substituídas incluem arilas tais como fenila ou naftila substituída com grupos alquila, com halogênios, tais como Cl, Br, F, grupos nitro, grupos amino, gru- pos ácido sulfônico, grupos ácido carboxílico, grupos hidróxi e grupos alcóxi. Os heterocíclicos referem-se aos anéis opcionalmente aromáticos, compre- endendo um ou mais heteroátomos selecionados de O, N, e S, e os exem- plos incluem furila, pirrolila, piridila, (por exemplo, um grupo pirimidina 2- substituído) e tiofeno.
Os derivados contendo sulfeto ou dissulfeto e contendo mercap- to da presente invenção podem ser avaliados pela sua capacidade de su- primir a proliferação de várias linhagens celulares indesejáveis in vitro sob condições de incubação. As linhagens celulares tais como, por exemplo, li- nhagem celular Ramos e HL60 podem facilmente ser empregadas para a avaliação da citotoxicidade destes compostos. As células a serem avaliadas podem ser expostas aos compostos durante 24 horas e as frações de sobre- vivência das células medidas em ensaios diretos por métodos conhecidos. Os valores de IC50 podem em seguida ser calculados a partir dos resultados dos ensaios. Como empregado neste, a expressão "ligação a um agente de ligação celular" refere-se ao derivado de Ieptomicinas compreendendo pelo menos um grupo de ligação, ou um precursor deste, adequado à ligação dos referidos derivados a um agente de ligação celular; os grupos de ligação pre- feridos são ligações de tiol, sulfeto ou dissulfeto, ou precursores destes.
Como empregado neste, a expressão "ligado a um agente de ligação celular" refere-se à molécula conjugada compreendendo pelo menos um derivado de Ieptomicina ligado a um agente de ligação celular por meio de um grupo de ligação adequado, ou um precursor deste; os grupos de Ii- gação preferidos são ligações de tiol, sulfeto ou dissulfeto, ou precursores destes. Como empregado aqui, o termo "paciente" refere-se a um animal, tal como um animal valioso para reprodução, companhia ou propósitos de pre- servação ou preferivelmente um ser humano ou uma criança humana, que está afligido com, ou possui o potencial para ser afligido com uma ou mais doenças e condições descritas aqui.
Como empregado aqui, uma "quantidade terapeuticamente efi- caz" refere-se a uma quantidade de um composto da presente invenção que seja eficaz na prevenção, redução, eliminação, tratamento ou controle dos sintomas das condições e doenças descritas aqui. O termo "controle" é des- tinado a referir-se a todos os processos em que possa existir um atraso, in- terrupção, impedimento ou parada da progressão das doenças e condições descritas aqui, porém não necessariamente indique uma eliminação total de todos os sintomas da condição e doença, e é destinado a incluir o tratamen- to profilático.
Como empregado aqui, o termo "farmaceuticamente aceitável"
refere-se àqueles compostos, materiais, excipientes, composições ou formas de dosagem que estão, dentro do escopo do diagnóstico médico seguro, adequados para contactar com os tecidos de seres humanos e animais sem toxicidade excessiva, irritação, resposta alérgica ou outras complicações problemáticas comensuradas com uma relação benefício/risco razoável.
Como empregado aqui, "sais farmaceuticamente aceitáveis" re- ferem-se aos derivados dos compostos descritos onde o composto de ori- gem é modificado preparando-se sais de base ou ácido destes. Os sais far- maceuticamente aceitáveis incluem os sais não-tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário do composto de origem formado, por exemplo, de ácidos orgânicos ou inorgânicos não-tóxicos. Por exemplo, tais sais não- tóxicos convencionais incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos tais como clorídrico, bromídrico, sulfúrico, sulfâmico, fosfórico, nítrico e simi- lar(es); e os sais preparados de ácidos orgânicos tais como acético, propiô- nico, succínico, tartárico, cítrico, metanossulfônico, benzenossulfônico, glu- corônico, glutâmico, benzoico, salicílico, toluenossulfônico, oxálico, fumárico, maléico, lático e similar(es). Outros sais de adição incluem sais de amônio tais como trometamina, meglumina, epolamina, etc., sais de metal tais como de sódio, de potássio, de cálcio, de zinco ou de magnésio.
Os sais farmaceuticamente aceitáveis da presente invenção po- dem ser sintetizados a partir do composto de origem o qual contém uma porção básica ou acídica por métodos químicos convencionais. Geralmente, tais sais podem ser preparados reagindo-se as formas de base ou ácido li- vres destes compostos com uma quantidade estoiquiométrica do ácido ou base apropriado em água ou em um solvente orgânico, ou em uma mistura dos dois. Geralmente, meios não-aquosos tipo éter, acetato de etila, etanol, isopropanol, ou acetonitrila são preferidos. As listas de sais adequados são encontradas em Remington1S Pharmaceutical Sciences, 17a edição, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1985, p. 1418, cuja descrição é incorpora- da aqui por referência.
De acordo com ainda outro objetivo, a presente invenção é tam- bém concernida com o processo de preparação dos compostos da invenção.
Os compostos e processo da presente invenção podem ser pre- parados de várias formas bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Os compostos podem ser sintetizados, por exemplo, por aplicação ou adap- tação dos métodos descritos abaixo, ou variações destes como apreciado pelo versado na técnica. As modificações e as substituições apropriadas es- tarão facilmente evidentes e bem-conhecidas ou facilmente obteníveis da literatura científica por aqueles versados na técnica. Em particular, tais métodos podem ser encontrados em R.C. La- rock, Comprehensive Organic Transformations, WiIey-VCH Publishers, 1999.
Será apreciado que os compostos da presente invenção podem conter um ou mais átomos de carbono assimetricamente substituídos, e po- dem ser isolados em formas racêmicas ou optícamente ativas. Desse modo, todas as formas quirais, diastereoméricas, racêmicas e todas as formas iso- méricas geométricas de uma estrutura são pretendidas, a não ser que a for- ma isomérica ou estereoquímica específica seja especificamente indicada. É bem-conhecido na técnica como preparar e isolar tais formas opticamente ativas. Por exemplo, as misturas de estereoisômeros podem ser separadas por técnicas-padrão incluindo, porém não limitado à resolução de formas racêmicas, cromatografia normal, de fase reversa, e quiral, formação de sal preferencial, recristalização, e similar(es), ou pela síntese quiral dos materi- ais de partida quirais ou pela síntese deliberada dos centros quirais alvo. Os compostos da presente invenção podem ser preparados por
uma variedade de vias sintéticas. Os reagentes e os materiais de partida são comercialmente disponíveis, ou facilmente sintetizados por técnicas bem- conhecidas por alguém versado nas técnicas. Todos os substituintes, a não ser que de outros modo indicado, são como previamente definidos. Nas reações descritas posteriormente, pode ser necessário pro-
teger grupos funcionais reativos, por exemplo grupos hidróxi, amino, imino, tio ou carbóxi, onde estes são desejados no produto final, para evitar sua participação indesejada nas reações. Os grupos de proteção convencionais podem ser empregados de acordo com a prática padrão, por exemplo, vide T. W. Greene e P. G. M. Wuts em Protective Groups in Organic Chemistry, 3a edição, John Wiley and Sons, 1999; J. F. W. McOmie in Protective Groups in Organie Synthesis, Plenum Press, 1973.
Algumas reações podem ser realizadas na presença de uma base. Não existe restrição particular na natureza da base a ser empregada nesta reação, e qualquer base convencionalmente empregada nas reações deste tipo pode igualmente ser empregada aqui, contanto que ela não pos- sua efeito adverso sobre outras partes da molécula. Exemplos de bases a- dequadas incluem: hidróxido de sódio, carbonato de potássio, trietilamina, hidretos de metal de álcali, tais como hidreto de sódio e hidreto de potássio; compostos de alquil-lítio, tais como metil-lítio e butil-lítio; e alcóxidos de me- tal de álcali, tais como metóxido de sódio e etóxido de sódio.
Usualmente, as reações são realizadas em um solvente ade-
quado. Uma variedade de solventes pode ser empregada, contanto que ele não possua efeito adverso sobre a reação ou sobre os reagentes envolvidos. Exemplos de solventes adequados incluem: hidrocarbonetos, os quais po- dem ser hidrocarbonetos aromáticos, alifáticos ou cicloalifáticos, tais como hexano, ciclo-hexano, benzeno, tolueno e xileno; amidas, tais como dimetil- formamida; álcoois tais como etanol e metanol e éteres, tais como dietil éter e tetra-hidrofurano.
As reações podem ocorrer sobre uma ampla faixa de temperatu- ras. Em geral, verificou-se ser conveniente realizar a reação em uma tempe- ratura de OcC a 150 0C (mais preferivelmente de cerca de temperatura ambi- ente a 100 0C). O tempo requerido para a reação pode também variar am- plamente, dependendo de muitos fatores, notavelmente a temperatura de reação e a natureza dos reagentes. Entretanto, contanto que a reação seja efetuada sob as condições preferidas delineadas acima, um período de 3 a 20 horas será normalmente suficiente.
O composto desse modo preparado pode ser recuperado da mistura reacional por métodos convencionais, por exemplo, os compostos podem ser recuperados destilando-se o solvente da mistura reacional ou, se necessário após a destilação do solvente da mistura reacional, derramar o resíduo em água seguido pela extração com um solvente orgânico imiscível em água e destilar o solvente do extrato. Adicionalmente, o produto pode, se desejado, ser também purificado por várias técnicas bem-conhecidas, tais como recristalização, reprecipitação ou as várias técnicas de cromatografia, notavelmente cromatografia de coluna ou cromatografia de camada fina pre- parativa.
O processo de preparação dos compostos da fórmula (I) com- preende a etapa de reagir os correspondentes compostos das fórmulas (II) e (III):
Rtt
(H)
Τ—S—(Ζ)η—Y-XH (III)
em que Rai Ra', R17, R9, Χ, Υ, Ζ, Τ, η são definidos como na fórmula (I).
Geralmente, esta reação pode ser realizada na presença de re- agentes de acoplamento usuais, incluindo reagentes para suprimir a racemi- zação tal como HOBT, e/ou agentes de desidratação empregados para ati- var o ácido carboxílico para a formação de amida ou éster, tal como DIC, DCC.
Tipicamente, esta reação pode ser realizada em um solvente orgânico adequado tal como diclorometano. Onde na fórmula (I), T é H, a reação pode ser alternativamente
realizada com um agente de N-acilação, tal como cloreto de pivaloíla, na presença de uma base, incluindo bases orgânicas, tal como trietilamina.
Alternativamente, onde na fórmula (I), T é H, os compostos da fórmula (I) podem também ser obtidos dos correspondentes compostos da fórmula (I) onde T é S-R1, na presença de um agente de redução de ligação de dissulfetos, tais como trialquilfosfinas e mais particularmente TCEP. Esta reação pode ser geralmente conduzida em meio aquoso tal como misturas de um solvente orgânico e água, por exemplo, THF/água.
Os compostos de dímero da fórmula (I) podem ser preparados reagindo-se um correspondente composto da fórmula (II) com um corres- pondente composto da fórmula (IV):
HX-Y-(Z)n-S-S-(Z)n-Y-XH (IV), na presença de reagentes de acoplamento usuais, incluindo reagentes para suprimir a racemização tal como HOBT1 e/ou agentes de desidratação em- pregados para ativar o ácido carboxílico para a formação de amida ou éster, tal como DIC, DCC. Tipicamente, esta reação pode ser realizada em um solvente orgânico adequado tal como diclorometano.
O processo pode também incluir a outra etapa de isolar o produ- to obtido. A presente invenção também concerne um conjugado de derivado de Ieptomicina compreendendo um agente de ligação celular ligado a um ou mais derivados de Ieptomicina de acordo com a invenção através de um Ii- gante compreendendo o referido grupo de ligação. Preferivelmente, os agen- tes de ligação celular são anticorpos ou fragmentos destes.
Preferivelmente, o Iigante compreende um grupo de -S- ou -S-S-. Preparação dos agentes de ligação celular
Agentes de ligação celulares podem ser de qualquer tipo atual- mente conhecido, ou que tornou-se conhecido, e incluem peptídeos e não- peptídeos. Geralmente, estes podem ser anticorpos (especialmente anticor- pos monoclonais) ou um fragmento de um anticorpo que contém pelo menos um sítio de ligação, linfocinas, hormônios, fatores de crescimento, moléculas de transporte de nutriente (tais como transferrina), ou qualquer outra subs- tância ou molécula de ligação de célula.
Exemplos mais específicos de agentes de ligação celular que podem ser empregados incluem: - anticorpos monoclonais;
- anticorpos de cadeia única;
- fragmentos de anticorpos tais como Fab, Fab', F(ab')2 e Fv {Parham, 131 J. Immunol. 2895-2902 (1983); Spring e outros, 113 J. Immunol. 470-478 (1974); Nisonoff e outros, 89 Arch. Biochem. Biophys. 230-244 (1960)};
- interferonas;
- peptídeos;
- linfocinas tais como IL-2, IL-3, IL-4, IL-6;
- hormônios tais como insulina, TRH (hormônios de liberação de tirotropina), MSH (hormônio de estimulação de melanócito), hormônios de esteroide, tais
como androgênios e estrogênios;
- fatores de crescimento e fatores de estimulação de colônia tais como EGF, TGFa, fator de crescimento tipo insulina (IGF-I, IGF-II) G-CSF, M-CSF e GM- CSF {Burgess, 5 Immunology Today 155-158 (1984)}; vitaminas, tais como folato e
- transferrina {0'Keefe e outros, 260 J. Biol. Chem. 932-937 (1985)}.
A tecnologia de anticorpo monoclonal permite a produção de agentes de ligação celular extremamente seletivos na forma de anticorpos monoclonais específicos. Particularmente bem-conhecidos na técnica são as técnicas para criar anticorpos monoclonais produzidos por imunização de camundongos, ratos, hamsters ou qualquer outro mamífero com o antígeno de interesse tal como a célula-alvo intacta, antígenos isolados da célula-alvo, vírus inteiros, vírus inteiros atenuados, e proteínas virais tais como proteínas virais capsidiais.
A seleção do agente de ligação celular apropriado é um assunto de interesse que depende da população celular particular a que deve ser direcionada, porém em geral anticorpos monoclonais são preferidos se um apropriado está disponível.
Por exemplo, o anticorpo monoclonal MY9 é um anticorpo de IgGI de murino que se liga especificamente ao antígeno CD33 {J. D. Griffin e outros 8 Leucemia Res., 521 (1984)} e pode ser empregado se as células- alvo expressarem CD33 como na doença de leucemia mielógena aguda (A- ML). Similarmente, o anticorpo monoclonal anti-B4 é um IgGI de murino, que se liga ao antígeno CD19 sobre as células B {Nadler e outros, 131 J. Immunol. 244-250 (1983)} e pode ser empregado se as células-alvo forem células B ou células doentes que expressem este antígeno tal como em Iin- foma de não-Hodgkin's ou leucemia linfoblástica crônica. Adicionalmente, GM-CSF que se liga às células mieloide podem
ser empregados como um agente de ligação celular às células doentes de leucemia mielógena aguda. IL-2, o qual se liga às células T ativadas, pode ser empregado para a prevenção de rejeição a enxerto de transplante, para a terapia e prevenção de doença de enxerto-versus-hospedeiro, e para o tratamento de leucemia de célula T aguda. MSH, o qual se liga a melanóci- tos, pode ser empregado para o tratamento de melanoma. Preparação de Conjugados Os conjugados dos derivados e um agente de ligação celular podem ser formados empregando-se quaisquer técnicas atualmente conhe- cidas ou desenvolvidas mais tarde. Geralmente, o processo de preparação dos conjugados da invenção compreende a etapa de reagir um derivado de Ieptomicina da invenção com um agente de ligação celular na presença de um reagente compreendendo funções reativas com relação ao grupo de li- gação do derivado e o agente de ligação celular, de modo que o derivado e o agente de ligação celular sejam ligados por meio de um Iigante compreen- dendo o referido grupo de ligação. Preferivelmente, o referido Iigante com- preende uma ligação de sulfeto ou dissulfeto.
Os derivados podem ser preparados para conter um grupo ami- no livre e em seguida ligados a um anticorpo ou outro agente de ligação ce- lular por meio de um ácido Iigante lábil, ou por um Iigante fotolábil. Os deri- vados podem ser condensados com um peptídeo tendo uma sequencia ade- quada e subseqüentemente ligados a um agente de ligação celular para produzir um Iigante lábil de peptidase. Os compostos citotóxicos podem ser preparados para conter um grupo hidroxila primário, o qual pode ser succini- Iado e ligado a um agente de ligação celular para produzir um conjugado que pode ser clivado por esterases intracelulareses para liberar o derivado de Ieptomicina livre. Preferivelmente, os derivados são sintetizados para conter um grupo tiol protegido ou livre, com ou sem um espaçador contendo PEG, e em seguida um ou mais derivados contendo sulfeto, dissulfeto ou tiol são cada qual covalentemente ligados ao agente de ligação celular por meio de uma ligação de dissulfeto ou ligação de tioéter. Os conjugados representativos da invenção são conjugados dos
derivados de Ieptomicina com anticorpos, fragmentos de anticorpo, fator de crescimento epidérmico (EGF), hormônio estimulador de melanócito (MSH), hormônio estimulador de tiroide (TSH), estrogênio, análogos de estrogênio, andrógeno, e análogos de andrógeno. Exemplos representativos da preparação de vários conjugados
dos derivados de Ieptomicina e os agentes de ligação celular são descritos abaixo. Ligantes de dissulfeto: Anticorpo huMy-9-6 é uma forma geneti- camente humanizada do anticorpo monoclonal de murino My-9-6 direciona- do contra o antígeno CD33 encontrado sobre a superfície de células mieloi- des humanas, incluindo a maioria dos casos de leucemia mieloide aguda (AML) (EJ. Favaloro, K.F. Bradstock, A. Kabral, P. Grimsley & M. C. Berndt, Disease Markers, 5(4):215 (1987); M.G. Hoffee, D. Tavares, R.J. Lutz, Ro- bert J., CT Int. Appl. (2004) WO 2004043344). My-9-6 pode ser empregado para a preparação de conjugados. O anticorpo é modificado com propionato de N-succinimidil-3-piridilditio como previamente descrito {J. Carlsson, H. Drevin & R. Axen, Biochem. J., 173:723 (1978)} para introduzir, na média, 4 grupos de piridilditio por molécula de anticorpo. O anticorpo modificado é reagido com o derivado de Ieptomicina contendo tiol para produzir um conju- gado ligado a dissulfeto.
Ligantes de tioéter: os derivados contendo tiol da presente in- venção podem ser ligados a anticorpos e outross agentes de ligação celular por meio de uma ligação de tioéter como previamente descrito (Patente dos Estados Unidos n° 5.208.020). O anticorpo ou outro agente de ligação celu- lar pode ser modificado com o composto conhecido ou comercialmente dis- ponível tal como N-sulfossuccinimidil-4-(5-nitro-2- piridil-ditio)butanoato (SSNPB), 4-(maleimidometil)ciclo-hexano-carboxilato de N-succinimidila (SMCC), N-succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclo-hexano-1 -carbóxi-(6- a - midocaproato), que é um análogo de "cadeia longa" de SMCC (LC-SMCC). Estes reagentes de reticulação formam Iigantes não-cliváveis derivados de porções com base em maleimido. Os reagentes de reticulação compreendendo uma porção com
base em haloacetila incluem N-succinimidil-4-(iodoacetil)-aminobenzoato (SIAB), iodoacetato de N-succinimidila (SIA)1 bromoacetato de N- succinimidila (SBA) e 3-(bromo-acetamido)propionato de N-succinimidila (SBAP). Estes reagentes de reticulação formam Iigantes não-cliváveis deri- vados de porções com base em haloacetila. O agente de ligação celular mo- dificado pode ser reagido com um fármaco contendo tiol para fornecer um conjugado ligado a tioéter. Ligantes de ácido-lábil: Os derivados de Ieptomicina contendo grupo amino da presente invenção podem ser ligados a anticorpos e outross agentes de ligação celular por meio de um Iigante de ácido lábil como previ- amente descrito {W. A. Blattler e outros, Biochemistry 24, 1517-1524 (1985);
Patentes dos Estados Unidos nos 4.542.225, 4.569.789, 4.618.492, 4.764.368}.
Similarmente, um derivado de Ieptomicina contendo grupo hidra- zido da presente invenção pode ser ligado à porção de carboidrato dos anti- corpos e outross agentes de ligação celular por meio de um Iigante de hidra- zona de ácido lábil {para exemplos de Iigantes de hidrazona vide B. C. La- guzza e outros, J. Med. Chem., 32, 548-555 (1989); R. S. Greenfield e ou- tros, Câncer Res., 50, 6600-6607 (1990)}.
Ligantes fotolábeis: os derivados de Ieptomicina contendo grupo amina da presente invenção podem ser ligados aos anticorpos e outross a- gentes de ligação celular por meio de um Iigante fotolábil como previamente descrito {P. Senter e outros, Photochemistry e Photobiology, 42, 231-237 (1985); Patente dos Estados Unidos n° 4.625.014}.
Ligantes de peptidase lábeis: os derivados de Ieptomicina con- tendo grupo amina da presente invenção podem também ser ligados aos agentes de ligação celular por meio de espaçadores de peptídeo. Foi previ- amente mostrado que espaçadores de peptídeo pequenos entre fármacos e veículos de proteína macromolecular são estáveis em soro, porém são fa- cilmente hidrolisados por peptidases intracelulares {A. Trouet e outros, Proc. Natl. Acad. ScL, 79, 626-629 (1982)}. Os derivados de Ieptomicina contendo grupo amino podem ser condensados com peptídeos empregando-se agen- tes de condensação tais como 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodi-imida- HCI (EDC-HCI) para fornecer um derivado de peptídeo que possa ser ligado aos agentes de ligação celular.
Ligantes de Esterase-lábeis: Os derivados de Ieptomicina da presente invenção carregando um grupo hidróxi alquila podem ser sucinila- dos com anidrido succínico e em seguida ligados a um agente de ligação celular para produzir um conjugado que possa ser clivado por esterases in- tracelulares para liberar o fármaco livre. {Para exemplos vide E. Aboud-Pirak e outros, Biochem Pharmacol., 38, 641-648 (1989)}.
Os conjugados de anticorpos, fragmentos de anticorpo, hormô- nios de proteína ou peptídeo, fatores de crescimento de proteína ou peptí- deo e outras proteínas são feitos da mesma forma por métodos conhecidos. Por exemplo, os peptídeos e anticorpos podem ser modificados com reagen- tes de reticulação tais como 3-(2-piridilditio)propionato de N- succinimidila, 4- (2-piridilditio)pentanoato de N-succinimidila (SPP), 4-succinimidil-oxicarbonil- a-metil-a-(2-piridila ditio)-tolueno (SMPT), N-succinimidil-3-(2- piridilditio) bu- tirato (SDPB), piridil-ditiopropionato de succinimidila (SPDP), éster de N- hidrossuccinimida de ácido 4-(2- piridilditio)butanoico (SPDB), 4-[N- maleimi- dometil]ciclo-hexano-1-carboxilato de succinimidila (SMCC), N- sulfossuccinimidil-3-(2-(5-nitro- piridilditio) butirato (SSNPB), 2-iminotiolano, ou anidrido S-acetilsuccínico por métodos conhecidos. Vide, Carlsson e ou- tros, 173, Biochem. J. 723-737 (1978); Blattler e outros, 24, Biochem. 1517- 1524 (1985); Lambert e outros, 22, Biochem. 3913-3920 (1983); Klotz e ou- tros, 96, Arch. Biochem. Biophys., 605 (1962); e Liu e outros, 18, Biochem., 690 (1979), Blakey e Thorpe, 1 Antibody, Immunoconjugates & Radiophar- maceuticals, 1-16 (1988), Worrell e outros. 1 Anti-Cancer Drug Design 179- 184 (1986). O agente de ligação celular contendo tiol livre ou protegido des- se modo derivado é em seguida reagido com um derivado de Ieptomicina contendo tiol ou dissulfeto para produzir conjugados.
Os conjugados produzidos pelos métodos acima podem ser puri- ficados por cromatografia de coluna padrão ou por HPLC. Preferivelmente os conjugados entre os anticorpos monoclonais
ou os agentes de ligação celular e derivados de Ieptomicinas da presente invenção são aqueles que são ligados por meio de uma ligação de dissulfe- to, ou ligação de tioéter como acima discutido. Tais conjugados de ligação celular são preparados por métodos conhecidos tais como anticorpos mono- clonais de modificação com piridil- ditiopropionato de succinimidila (SPDP) {Carlsson e outros, 173, Biochem. J., 723-737 (1978)}. O grupo tiopiridila resultante é em seguida removido por tratamento com derivado de Ieptomi- cina contendo tiol para produzir conjugados ligados a dissulfeto. Os conju- gados contendo de 1 a 10 derivados de Ieptomicina ligados por meio de uma ponte de dissulfeto são facilmente preparados por este método. A conjuga- ção por este método é inteiramente descrita na Patente dos Estados Unidos n° 5.585.499, que é incorporada por referência.
Citotoxicidade In Vitro dos conjugados entre os agentes de ligação celular e os derivados de Ieptomicina da presente invenção.
A citotoxicidade dos derivados de Ieptomicina da presente in- venção e seus conjugados com os agentes de ligação celular pode ser me- dida após a clivagem do grupo de proteção e conversão no fármaco ativo. A citotoxicidade para linhagens celulares não-aderentes tais como Namalwa e HL60 pode ser medida por reextrapolação das curvas de proliferação celular como descrito em Goldmacher e outros, 135, J. Immunol., 3648-3651 (1985). A citotoxicidade destes compostos para linhagens celulares aderentes tais como A-375 e SCaBER pode ser determinada por ensaios clonogênicos co- mo descrito em Goldmacher e outros, 102 J. Cell Biol. 1312-1319 (1986).
Agente terapêutico e Método para inibir o crescimento de popu- lações celulares selecionadas
A presente invenção também fornece um agente terapêutico pa- ra inibir o crescimento de populações celulares selecionadas compreenden- do:
(a) uma quantidade citotóxica de um ou mais derivados de Iep- tomicina acima descritos ligados a um agente de ligação celular, e
(b) um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitá-
vel.
Similarmente, a presente invenção fornece um método para ini- bir o crescimento de populações celulares selecionadas compreendendo contatar um tecido ou população celular suspeito de conter células da referi- da população celular selecionada com uma quantidade citotóxica de um a- gente citotóxico compreendendo um ou mais dos derivados de Ieptomicina acima descritos ligados a um agente de ligação celular.
O agente citotóxico é preparado como acima descrito. Os excipientes, diluentes e veículos farmaceuticamente aceitá- veis adequados são bem-conhecidos e podem ser determinados por aqueles versados na técnica como as provas da situação clínica.
Exemplos de veículos, diluentes e/ou excipientes adequados incluem: (1) solução salina tamponada por fosfato de Dulbecco, pH de cerca de 7,4, contendo cerca de 1 mg/ml a 25 mg/ml de albumina de soro humano, (2) 0,9% de solução salina (0,9% peso/volume de NaCI), e (3) 5% (pe- so/volume) de dextrose.
O método para inibir o crescimento de populações celulares se- lecionadas pode ser praticado in vitro, in vivo, ou ex vivo.
Exemplos de empregos in vitro incluem tratamentos de culturas celulares a fim de matar todas as células exceto para variantes desejadas que não expressam o antígeno-alvo; ou matar as variantes que expressam o antígeno indesejado. As condições de emprego in vitro não-clínico são facilmente de-
terminadas pelo versado na técnica.
Exemplos de empregos ex vivo incluem tratamentos de medula óssea autóloga antes de seu transplante no mesmo paciente a fim de matar as células doentes ou malignas: os tratamentos de medula óssea antes de seu transplante a fim de matar as células T competentes e prevenir a doença enxerto-versus-hospedeiro (GVHD).
O tratamento clínico ex vivo para remover as células de tumor ou células Iinfoide da medula óssea antes do transplante autólogo no tratamen- to de câncer ou no tratamento de doença autoimune, ou para remover as células T e outras células Iinfoide da medula óssea alogeneica ou tecido an- tes do transplante a fim de prevenir GVHD, pode ser realizado como segue. A medula óssea é colhida do paciente ou outro indivíduo e em seguida incu- bada em meio contendo soro ao qual é adicionado o agente citotóxico da invenção, as concentrações variam de cerca de 10 μΜ a 1 μΜ, durante cer- ca de 30 minutos a cerca de 48 horas a cerca de 37 0C. As condições exatas de concentração e o tempo de incubação (=dose) são facilmente determina- dos pelo versado na técnica. Após a incubação, as células da medula óssea são lavadas com meio contendo soro e retornadas ao paciente por infusão i.v. de acordo com métodos conhecidos. Em circunstâncias onde o paciente receba outro tratamento tal como um curso de quimioterapia ablativa ou irra- diação do corpo total entre o tempo de colheita da medula e a reinfusão das células tratadas, as células da medula tratada são armazenadas congeladas em nitrogênio líquido empregando-se equipamento médico padrão.
Para o emprego clínico in vivo, o agente citotóxico da invenção será fornecido como soluções que são testadas quanto à esterilidade e quanto aos níveis de endotoxina ou como um sólido Iiofilizado que pode ser redissolvido em água estérila para injeção. Exemplos de protocolos adequa- dos de administração conjugada são como segue. Os conjugados são forne- cidos semanalmente durante 6 semanas como bolo i.v. As doses de bolo são fornecidas em 50 a 400 ml de solução salina normal a qual albumina de soro humano (por exemplo, 0,5 a 1 mL de uma solução concentrada de al- bumina de soro humano, 100 mg/mL) pode ser adicionada. As dosagens serão de cerca de 50 pg a 10 mg/kg de peso corporal por semana, i.v. (vari- ação de 10 Mg a 100 mg/kg por injeção). Seis semanas após o tratamento, o paciente pode receber um segundo curso de tratamento. Os protocolos clíni- cos específicos com respeito à via de administração, excipientes, diluentes, dosagens, tempos, etc., podem ser determinados pelo versado na técnica como as provas de situação clínica.
Exemplos de condições médicas que podem ser tratadas de a- cordo com os métodos in vivo ou ex vivo de matar as populações celulares selecionadas incluem malignidade de qualquer tipo incluindo, por exemplo, câncer do pulmão, mama, cólon, próstata, rim, pâncreas, ovário, e órgãos linfáticos; melanomas; doenças autoimunes, tais como Iupus sistêmico, artri- te reumatoide, e esclerose múltipla; rejeições a enxerto, tais como rejeição a transplante renal, rejeição a transplante de fígado, rejeição a transplante de pulmão, rejeição a transplante cardíaco, e rejeição a transplante de medula óssea; doença enxerto versus hospedeiro; infecções virais, tais como infec- ção de CMV, infecção de HIV, AIDS, etc; infecção bacteriana; e infecções por parasita, tais como giardíase, amebíase, esquistossomíase, e outras como determinado por alguém versado na técnica. EXEMPLOS
A invenção será agora ilustrada por referência aos exemplos não-limitantes. A não ser que de outros modo estabelecido, todas as porcen- tagens, relações, partes, etc. são em peso. MATERIAIS E MÉTODOS
Os pontos de fusão foram medidos empregando-se um aparato eletrotérmico e são não-corrigidos. Os espectros de RMN foram registrados em um espectrômetro Bruker AVANCE400 (400 MHz). As alterações quími- cas são relatadas em ppm relativo a TMS como um padrão interno. Os es- pectros de massa foram obtidos empregando-se um sistema Bruker Esquire 3000. Os espectros ultravioleta foram registrados em um espectrofotômetro Hitachi U1200. HPLC foi realizada empregando-se um sistema Beckman Coulter GOLD 125 equipado com um detector de comprimento de onda vari- ável Beckman Coulter system GOLD 168 e um Waters RADIALPAK, (uma coluna C-18 de fase reversa). A cromatografia de camada fina foi realizada em placas de TLC em sílica-gel Analtech GF. A sílica-gel para cromatografia de coluna rápida foi de Baker. O tetra-hidrofurano foi seco por destilação sobre metal de sódio. Dimetilacetamida e dimetilformamida foram secos por destilação sobre hidreto de cálcio sob pressão reduzida. Todos os outros solventes empregados foram grau de reagentes ou grau de HPLC.
As linhagens de célula de câncer humano HL60, Namalwa, A- 375, COL0205 e Ramos foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC). Kara é um tipo de linhagem de célula de tumor de murino que foi estavelmente transfectada com o antígeno CD33 humano. PARTE EXPERIMENTAL
A análise de espectrometria de massa foi conduzida como se- gue:
Análise de EI-CI: introdução direta (DCI = depósito de amostra sobre filamento) Espectrômetro de massa Finnigan SSQ7000; variação de massa m/z = 29 - 900; energia de elétron 70eV; temperatura da fonte 70°C; gás reagente Cl amoníaco; El = lonização através de impacto eletrônico; Cl = lonização química.
Análise de eletrospray: (eletrospray positiva: ES+ ; eletrospray negativa: ES") LC-MS-DAD-ELSD:
MS: Waters-Micromass ZQ; LC: Agilent HP 1100; coluna LC X- bridge Waters C18, 3X50 mm, 2,5 μιη; eluente: gradiente água (com 0,1 % de ácido fórmico) + acetonitrila; UV: DAD (λ = 200 - 400 nm). Exemplo 1:
(2-Metilsulfanil-etil)-amida de ácido (2E, 10E, 12ET16Z, 18E)-(R)-6-Hidróxi- 3,5,7,9,11 ,15, 17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H- piran-2-il)-8- oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico.
A uma solução de 20 mg de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11,15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico e 5,6 mg de HOBT (1-hidroxibenzotriazol) em 0,3 ml de diclorometano, são introduzidos em uma temperatura próxima de 20°C, 7,65 μΙ de DIC (N1N1- di- isopropilcarbodi-imida) em seguida 5,2 mg de 2-(tiometil)etilamina. A mistura reacional é agitada em uma temperatura próxima de 20°C durante 20,5 ho- ras, em seguida purificada por depósito direto sobre 2 placas de TLC em sílica-gel preparativa (espessura de 0,5 mm, 20x20 cm). As placas de TLC preparativa foram eluídas com uma mistura de metanol / diclorometano (5/95 em volumes) em seguida o produto desejado é extraído de sílica-gel com uma mistura de metanol / diclorometano (15/85 em volumes). 1,4 mg de (2- metilsulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E, 16Z,18E)-(R)-6- hidróxi- 3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran- 2-il)- 8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico são obtidos como um sóli- do amarelo cujas características são as seguintes: Espectros de massa:
• Cl: m/z = 617: [M+NH4]+ ; m/z = 600: [M+H]+ Espectros de 1H RMN a 600 MHz obtidos em um espectrômetro BRUKER AVANCE DMX-600 com as seguintes alterações químicas (δ em ppm ) - em clorofórmio como solvente - d1 (CDCI3- d1) referência a 7,27 em uma temperatura de 303K : 0,79 (d, J = 6,5 Hz1 3H); 0,97 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1 ,07 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1 ,12 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1 ,15 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1 ,71 (m, 1 H); 1 ,81 (s, 3H); 1 ,82 (m parcialmente mascarado, 1 H); 1 ,83 (s, 3H); 2,08 (m, 2H); 2,11 (s, 3H); 2,13 (s, 3H); 2,15 (dd, J = 6,5 e 13,5 Hz, 1 H); 2,45 (m amplo, 1 H); 2,53 (m, 1H); 2,66 (t, J = 6,5 Hz, 2H); 2,70 (m, 1 H); 2,82 (m, 1 H); 3,50 (q, J = 6,5 Hz, 2H); 3,61 (m, 1 H); 3,65 (m, 1 H); 5,01 (dd, J = 4,5 e 7,5 Hz, 1 H); 5,09 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); 5,26 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); de 5,55 a 5,66 (m, 2H); 5,69 (dd, J = 7,5 e 16,0 Hz, 1 H); 5,97 (t amplo, J = 6,5 Hz1 1H); 6,00 (d, J = 10,0 Hz, 1H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,75 (d, J = 16,0 Hz, 1 H); 6,95 (dd, J = 6,0 e 10,0 Hz, 1 H). Exemplo 2:
Bis-[(2-mercaptoetil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)- 6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico].
§ f OM O
A uma solução de 20 mg de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11 ,15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico e 5,6 mg de HOBT (1-hidroxibenzotriazol) em 0,3 ml de diclorometano são introduzidos em uma temperatura próxima de 20°C 12,8 mg de dicloroidrato de cistamina, 7,65 μΙ de DIC (N,N'-di-isopropilcarbodi-imida) em seguida 11,6 μΙ de trieti- lamina. A mistura reacional é agitada em uma temperatura próxima de 20°C durante 22 horas, em seguida purificada por depósito direto sobre 2 placas de TLC em sílica-gel preparativa (espessura de 0,5 mm, 20 χ 20 cm). As placas de TLC preparativas foram eluídas com uma mistura de metanol / diclorometano (5/95 em volumes) em seguida o produto desejado é extraído da sílica-gel com uma mistura de metanol / diclorometano (15/85 em volu- mes). 4,6 mg de bis-[(2-tioetil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18EHR)-6- hidróxi-3,5,7,9,11 ,15,17-hepta-metil-19-((2S,3S)-3-metil- 6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico] são obtidos co- mo um sólido branco cujas características são as seguintes:
Espectros de massa:
• ES+: m/z = 1167: [M+H]+
• ES-: m/z = 1211 : [M-H+HCOOH]'
Exemplo 3:
(2-Mercapto-etil)-amida de ácido (2E,10EI12E,16Z)18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7I9,11,15,17-heptametil-19-((2SI3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico.
OM O
A uma solução de 20 mg de ácido (2E)10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11 ,15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico e 8 μΙ de trietila- mina em 0,15 ml de diclorometano é introduzido em uma temperatura próxi- ma de 0°C 6,1 μΙ de cloreto de pivaloíla. Após 15 minutos em uma tempera- tura próxima de 0 0C, uma solução de 4,4 mg de 2-aminoetanotiol em 0,15 ml de diclorometano e 0,05 ml de etanol é adicionada. A mistura reacional é agitada em uma temperatura próxima de 20°C durante 1 hora, em seguida purificada por depósito direto sobre 2 placas de TLC em sílica-gel preparati- va (espessura de 0,5 mm, 20 χ 20 cm). As placas de TLC preparativas foram eluídas com uma mistura de metanol / diclorometano (8/92 em volumes) em seguida o produto desejado é extraído de sílica-gel com uma mistura de me- tanol / diclorometano (15/85 em volumes). 2,3 mg de (2-Mercapto-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-hidróxi-3,5,7,9, 11 ,15,17-heptametil- 19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca- 2,10,12,16,18-pentaenoico são obtidos como um vidro incolor cujas caracte- rísticas são as seguintes:
Espectros de massa:
• ES+: m/z = 586: [M+H]+
• ES-:: m/z = 630: [M-H+HCOOH]"
Espectros de 1 H RMN a 400 MHz obtidos em um espectrômetro BRUKER AVANCE DRX-400 com as seguintes alterações químicas (δ em ppm ) - em clorofórmio como solvente - d1 (CDCI3- d1) referência a 7,27 em uma temperatura de 303K: 0,80 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,98 (d, J = 6,5 Hz, 3H) 1 ,08 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1 ,14 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1 ,16 (d, J = 7,0 Hz, 3H) 1,72 (m, 1 H); de 1,80 a 1,87 (m mascarado, 1 H); 1,82 (s, 3H); 1,84 (s, 3H) 2,09 (m, 2H); 2,11 (s, 3H); 2,16 (dd, J = 6,5 e 13,5 Hz, 1H);2,54(m, 1 H); de 2,65 a 2,74 (m, 3H); 2,83 (m, 1 H); 3,48 (q, J = 6,5 Hz, 2H); de 3,60 a 3,70 (m, 2H); 5,00 (dd, J = 4,0 e 7,0 Hz, 1 H); 5,10 (d, J = 10,5 Hz, 1 H); 5,27 (d, J = 10,5 Hz, 1 H); 5,58 (s, 1 H); 5,60 (td parcialmente mascarado, J = 7,5 e 15,5 Hz1 1 H); 5,70 (dd, J = 7,0 e 15,5 Hz, 1 H); de 5,96 a 6,06 (m, 3H); 6,75 (d amplo, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,97 (dd, J = 6,0 e 10,0 Hz, 1H). Exemplo 4:
(2-Metildissulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)- (R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo- nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico.
iH O
rrrrrr^ς^ζχ
A uma solução de 20 mg de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6-
hidróxi-3,5,7,9,11 ,15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico e 5,6 mg de HOBT (1-hidroxibenzotriazol) em 0,15 ml de diclorometano são introduzidos em uma temperatura próxima de 20°C 7,65 μΙ de DIC (NiN1- di-isopropilcarbodi- imida) em seguida uma solução de 8 mg de 2-metilditio-etilamina em 0,15 ml de diclorometano. A mistura reacional é agitada em uma temperatura próxi- ma de 20 0C durante 2 horas, em seguida purificada por depósito direto so- bre 2 placas de TLC em sílica-gel preparativa (espessura de 0,5 mm, 20 χ 20 cm). As placas de TLC preparativas foram eluídas com uma mistura de me- tanol / diclorometano (7/93 em volumes) em seguida o produto desejado é extraído de sílica-gel com uma mistura de metanol / diclorometano (15/85 em volumes). 3,4 mg de (2-metildissulfanil-etil)-amida de ácido (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)-(R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-(2S,3S)- 3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18- pen- taenoico são obtidos como um óleo amarelo-claro cujas características são as seguintes:
Espectros de massa:
• ES+: m/z = 632: [M+H]+
• ES:: m/z = 630: [M-H]-; m/z = 676: [M-H+HCOOH]"
Espectros de 1 H RMN a 400 MHz obtidos em um espectrômetro
BRUKER AVANCE DRX- 400 com as seguintes alterações químicas (δ em ppm ) - em clorofórmio como solvente - d1 (CDCI3-d1) referência a 7,27 em uma temperatura de 303K: 0,81 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,98 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1 ,08 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1 ,14 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1 ,16 (d, J = 7,0 Hz1 3H); 1,72 (m, 1 H); de 1,79 a 1,86 (m, 1 H); 1,82 (s, 3H); 1,84 (s, 3H); 2,09 (m, 2H); 2,11 (s amplo, 3H); 2,15 (dd, J = 5,5 e 13,5 Hz, 1H); 2,35 (s amplo, 1 H); 2,43 (m, 3H); 2,54 (m, 1H); 2,70 (m, 1 H); 2,83 (m, 1 H); 2,86 (t, J = 6,5 Hz, 2H); de 3,59 a 3,70 (m, 4H); 5,01 (dd, J = 4,0 e 7,0 Hz, 1H); 5,11 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); 5,27 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); 5,56 (s, 1 H); 5,60 (td parcialmente mascarado, J = 7,5 e 15,5 Hz, 1 H); 5,70 (dd, J = 7,0 e 15,5 Hz, 1 H); 5,93 (t, J = 6,0 Hz, 1 H); 6,00 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,75 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,96 (dd, J = 6,0 e 10,0 Hz, 1 H). Exemplo 5:
(2-Metil-2-metildissulfanil-propil)-amida de ácido (2E,10E, 12E,16Z,18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil- 6-0X0-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico.
V QH O
Y
0
A uma solução de 225,4 mg de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)- 6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10, 12, 16,18-pentaenoico em 1,5 ml de diclorometano são introduzidos, em uma temperatura próxima de 0°C, uma solução de 63,6 mg de HOBT (1-hidroxibenzotriazol) e 110 mg de 2-metil-2- metildissulfanil-propilamina em 1,5 ml de diclorometano, em seguida 86,2 μΙ de DIC (Ν.Ν'-di-isopropilcarbodi-imida). A mistura reacional é agitada em uma temperatura próxima de O0C durante 15 horas, em seguida é diluída com 30 ml de diclorometano. A fase orgânica é lavada duas vezes com 10 ml de água, seca sobre sulfato de sódio, filtrada sobre vidro sinterizado, em seguida concentrada sob pressão reduzida em uma temperatura próxima de 40°C. O resíduo assim obtido é purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (20 g de SiO2 15-35 μιτι, gradiente de eluição metanol / diclorome- tano de 0/100 a 10/90 (em volumes). As frações contendo o produto deseja- do são concentradas sob pressão reduzida em uma temperatura próxima de 40°C. 212,1 mg de (2-metil-2-metildissulfanil-propil)-amida de ácido (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)-(R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19- ((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-
2,10,12,16,18-pentaenoico são obtidas como um vidro amarelo cujas carac- terísticas são as seguintes:
Espectros de massa: • ES+: m/z = 660: [M+H]+ · ES'1: m/z = 658: [M-H]-; m/z = 704: [M-H+HCOOH]-
Espectros de 1 H RMN a 400 MHz obtidos em um espectrômetro BRUKER AVANCE DRX- 400 com as seguintes alterações químicas (δ em ppm ) - em clorofórmio como solvente - d1 (CDCI3- d1) referência a 7,27 em uma temperatura de 303K: 0,80 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,97 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,08 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1,14 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,16 (d, J = 7,0 Hz, 3H); 1,32 (s, 6H); 1,72 (m, 1 H); 1,82 (s, 3H); 1,83 (m mascarado, 1 H); 1,84 (s, 3H); 2,08 (m, 2H); 2,11 (s amplo, 3H); 2,15 (dd, J = 6,5 e 13,5 Hz, 1 H); 2,43 (s, 3H); 2,54 (m, 1 H); 2,70 (m, 1 H); 2,83 (m, 1 H); 3,45 (d, J = 6,0 Hz1 2H); de 3,59 a 3,69 (m, 2H); 5,00 (dd, J = 4,0 e 7,0 Hz, 1 H); 5,10 (d, J = 10,5 Hz, 1H); 5,26 (d, J = 10,0 Hz, 1H); de 5,54 a 5,64 (m, 2H); 5,70 (dd, J = 7,0 e 15,5 Hz, 1 H); 5,83 (t, J = 6,0 Hz, 1H); 6,00 (d, J = 10,5 Hz, 1 H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,75 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,96 (dd, J = 6,5 e 10,5 Hz, 1 H). Exemplo 6:
(2-Mercapto-2-metil-propil)-amida de ácido (2E, 10E, 12E, 16Z118E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6- oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8- oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico. A uma solução de 200 mg de (2-metil-2-metildissulfanil-propil)- amida de ácido (2EI10E)12E,16Z(18EHR)-6-hidróxi-3(5,7I9,11,15,17- heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo- nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico em 7,7 ml de tetra-hidrofurano e 3,85 ml de água, em uma temperatura próxima de 20°C, são adicionados 217,2 mg de TCEP (cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina). Após 16 horas em uma temperatura próxima de 20°C, a mistura reacional é diluída com 30 ml de acetato de etila, lavada duas vezes com 15 ml de água, 15 ml de salmoura, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada sobre vidro sinterizado e concentra- da sob pressão reduzida em uma temperatura próxima de 40°C. O óleo a- marelo assim obtido é purificado por cromatografia de coluna sobre sílica-gel (25 g de S1O2 15-35 pm, gradiente de eluição metanol / diclorometano de 1/99 a 10/90 (em volumes)). As frações contendo o produto desejado são concentradas sob pressão reduzida em uma temperatura próxima de 40°C. 122,6 mg de (2-mercapto-2-metil-propil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z, 18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo- 3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8- oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico são obtidos como um vidro amarelo cujas características são as seguintes: Espectros de massa: · ES+: m/z = 614: [M+H]+
• ES": m/z = 612: [M-H]"; m/z = 658: [M-H+HCOOH]- Espectros de 1 H RMN a 500 MHz obtidos em um espectrômetro BRUKER AVANCE DRX- 500 com as seguintes alterações químicas (δ em ppm) - em clorofórmio como solvente - d1 (CDCI3- d1) referência a 7,27 em uma temperatura de 303K: 0,80 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 0,97 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,07 (d, J = 7,5 Hz, 3H); 1,13 (d, J = 6,5 Hz^ 3H); 1,16 (d, J = 6,5 Hz, 3H); 1,38 (Si 6H); 1,72 (m, 1 H); 1,82 (s, 3H); 1,84 (s, 3H); 1,85 (m parcialmente mascarado, 1 H); 2,09 (m, 2H); 2,11 (s, 3H); 2,17 (dd, J = 6,5 e 13,5 Hz, 1 H); 2,54 (m, 1 H); 2,70 (m, 1 H); 2,83 (m, 1 H); 3,38 (d, J = 6,5 Hz, 2H); de 3,61 a 3,70 (m, 2H); 5,01 (dd, J = 4,0 e 7,0 Hz, 1 H); 5,09 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); 5,26 (d, J = 10,0 Hz1 1H); 5,59 (dt parcialmente mascarado, J = 7,5 e 15,5 Hz, 1 H); 5,63 (s, 1 H); 5,69 (dd, J = 7,0 e 15,5 Hz, 1 H); 6,00 (d, J = 10,0 Hz, 1 H); 6,02 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,04 (t parcialmente mascarado, J = 6,5 Hz1 1 H); 6,75 (d, J = 15,5 Hz, 1 H); 6,97 (dd, J = 6,0 e 10,0 Hz, 1 H). Conjugação dos anticorpos com os Derivados de leptomicina:
Conjugação de anticorpo anticólon huC242 com os derivados de
leptomicina:
TrrriT^Cii
Um conjugado ligado a dissulfeto de um anticorpo de tumor anticó- lon humanizado (huC242) com o composto do exemplo 6 foi preparado (referi- do aqui como huC242-SSNPB- leptomicina do exemplo 6). O anticorpo huC242 foi reagido com um excesso molar de 6 vezes do agente de modifi- cação de anticorpo SSNPB (4-(5-niro-2-piridilditio) butanoato de N- sulfossuccinimidila) em uma concentração de anticorpo de 9 mg/ml em tam- pão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 5% de dimetilacetamida) durante 90 minutos em temperatura ambi- ente. A mistura reacional foi purificada por cromatografia de exclusão de ta- manho Sephadex G-25 equilibrada em tampão de fosfato de potássio a 50 mM pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM e EDTA a 2 mM. A amostra de anticor- po modificado foi avaliada com e sem a adição de β-mercaptoetanol e de- terminada ter -6 grupos nitropiridilditio incorporados por anticorpo. Um ex- cesso molar de 2 vezes de fármaco de Leptomicina-SH por grupo Iigante foi adicionado à amostra de anticorpo modificado em 2 mg/ml em tampão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 10% de dimetilacetamida). A reação foi seguida espectrofotometrica- mente (394 nm) e por HPLC para a liberação de 5- nitropiridina-2-tiona. Após a reação em temperatura ambiente durante cerca de 90 minutos, a mistura foi purificada por cromatografia de exclusão de tamanho Sephadex G-25 em tampão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM). A relação de absorvência em 250 nm/280 nm de 0,78 para o conjugado versus 0,37 para o anticorpo não-modificado demonstrou a incor- poração de grupo Ieptomicina no conjugado (resultando em absorvência aumentada a 250 nm).
A análise espectrométrica de massa de um conjugado de huC242-leptomicina desglicosilado mostrou picos conjugados a 147492, 148212, 148936, e 149660 dáltons correspondentes a 1, 2, 3, e 4 moléculas de Ieptomicina incorporadas por molécula de anticorpo. Conjugação de anticorpo Anti-CDI 9 (huB4) com os derivados de Ieptomici- nas:
Os conjugados de anticorpo anti-CD19 (anticorpo B4 humaniza-
do) com Ieptomicina foram preparados com Iigantes de tioéter não-cliváveis e dissulfeto. A primeira amostra (ligante -S-S-) consistiu em anticorpo anti- CD19 (huB4) ligado ao composto do exemplo 6 por meio do ligante de dis- sulfeto SSNPB (4-(5-nitro-2-piridil-ditio)butanoato de N-sulfossuccinimidila).
A segunda amostra consistiu em anticorpo huB4 ligado ao composto do e- xemplo 6 por meio do ligante de maleimida SMCC (4-(maleimido-metil)ciclo- hexanocarboxilato de N-succinimidila).
Conjugado de HuB4-SSNPB-Leptomicina (huB4-SSNPB-leptomicina do e- xemplo 6):
IHIB4
S
4 mg de anticorpo huB4 foi reagido com um excesso molar de
7,5 vezes do ligante SSNPB em uma concentração de anticorpo de 8 mg/ml em tampão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 5% de dimetilacetamida) durante 90 minutos em tempe- ratura ambiente. A mistura reacional foi purificada por cromatografia de ex- clusão de tamanho Sephadex G-25 em tampão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM). A amostra de anticor- po modificado foi avaliada com e sem a adição de β- mercaptoetanol e de- terminada ter 5,3 grupos de nitropiridilditio incorporados por anticorpo. Um excesso molar de 3 vezes do fármaco do exemplo 6 por grupo ligante foi adicionado à amostra de anticorpo modificado a 1 mg/ml em tampão de fos- fato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 10% de dimetilacetamida). A reação foi seguida espectrofotometricamente (394 nm) e por HPLC para a liberação de 5-nitropiridina-2-tiona. Depois da reação seguir durante a noite em temperatura ambiente, a mistura foi purifi- cada por cromatografia de exclusão de tamanho Sephadex G- 25 em tam- pão de citrato a 10 mM (pH 5,5, contendo NaCI a 135 mM). A amostra foi avaliada com e sem a adição de β-mercaptoetanol e determinada ter 4,3 Ii- gantes reagidos por anticorpo. A análise da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) mostrou 95% de anticorpo monomérico.
Conjugado de HuB4-SMCC-Leptomicina:
tluB4N 0
rL
ν Β . r
4 mg de anticorpo huB4 foi reagido com um excesso molar de 7,5 vezes de Iigante SMCC em uma concentração de anticorpo de 8 mg/ml em tampão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 5% de dimetilacetamida) durante 90 minutos em tempe- ratura ambiente. A mistura reacional foi purificada por cromatografia de ex- clusão de tamanho Sephadex G-25 em tampão de fosfato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM). O número de grupos maleimida incorporados na amostra foi avaliado adicionando-se um excesso de tiol (cisteína) e determinado ter 3,3 grupos Iigantes por anticorpo. Um ex- cesso molar de 3 vezes do fármaco do exemplo 6 por grupo de maleimida foi adicionado à amostra de anticorpo modificado a 1 mg/ml em tampão de fos- fato de potássio a 50 mM (pH 6,5, contendo NaCI a 50 mM, EDTA a 2 mM, 10% de dimetilacetamida). Após a reação seguir durante a noite em tempe- ratura ambiente, a mistura foi purificada por cromatografia de exclusão de tamanho Sephadex G-25 em tampão de citrato a 10 mM (pH 5,5, contendo NaCI a 135 mM). A análise de SEC exibiu 98% de anticorpo monomérico.
A análise de espectrometria de massa de um conjugado de huB4-SMCC-leptomicina desglicosilado exibiu picos de conjugado de 145138, 145860 e 146566 dalton correspondendo a 1, 2, e 3 moléculas de Ieptomicina incorporadas por molécula de anticorpo. Resultados Biológicos:
A avaliação de citotoxicidade de huB4-SSNPB-leptomicina do conjugado do exemplo 6 em células de câncer Ramos (CD19 antígeno posi- tivo) e HL60 (antígeno negativo) por ensaio de viabilidade de WST exibiu valores de IC5o de 1,4 χ 10 9 M e 4,2 χ 10"9 Μ, respectivamente, desse modo demonstrando a atividade citotóxica específica de antígeno do conjugado de anticorpo de leptomicina. A avaliação de citotoxicidade de huC242-SSNPB-leptomicina do
conjugado do exemplo 6 em células de câncer COLO 205 (CanAg antígeno positivo) e células A375 exibiu valores de IC50 de 1,3 χ 10"10 M e >5,0 χ 10"9 Μ, respectivamente. (Figura 1).
Certas patentes e publicações impressas foram referidas na pre- sente descrição, os ensinamentos das quais são por meio deste cada qual incorporado em suas respectivas totalidades por referência.
Ao mesmo tempo em que a invenção foi descrita em detalhes e com referência às modalidades específicas desta, será evidente para al- guém versado na técnica que várias alterações e modificações podem ser feitas a elas sem divergir do espírito e escopo destas.

Claims (13)

1. Derivado de Ieptomicina de fórmula (I) <formula>formula see original document page 37</formula> em que: Ra e R1a são H ou uma CrC2OaIquiIa linear ou ramificada; Ri7 é alquila opcionalmente substituída por OR, CN, NRR', per- fluoroalquila; R9 é alquila opcionalmente substituída por OR, CN1 NRR11 per- fluoroalquila; X é -NR-; Y é Ci -C20 alquila linear ou ramificada; η é 0; T representa um grupo de proteção de tiol tal como Ac, Ri ou SR1, em que Ri representa H, metila, uma C1-C20 alquila Iinearou ramificada ou T representa <formula>formula see original document page 37</formula> em que Ra, R1a, R17, Rg, Χ, Υ, Ζ, η são como acima definidos; R1 R1 idênticos ou diferentes são H ou uma CrC20 alquila linear ou ramificada; ou os sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, ou sais hidra- tados, ou as estruturas cristalinas polimórficas do referido derivado de Iep- tomicina ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enantiô- meros.
2. Derivado de Ieptomicina de acordo com a reivindicação 1, em que Ra é CrC20 alquila linear ou ramificada, e R1a é H.
3. Derivado de Ieptomicina de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que Ri7 é uma CrC20 alquila linear ou ramificada.
4. Derivado de Ieptomicina de acordo com a reivindicação 1 a 3, em que Rg é uma CrC2oalquila linear ou ramificada.
5. Derivado de Ieptomicina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, em que T é H ou SRi1 em que Ri representa uma Cr C2oalquila linear ou ramificada.
6. Derivado de Ieptomicina escolhido na seguinte lista : (2-Metilsulfanil-etil)-amida de ácido (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)- (R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11,15I17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3>6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo- nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico, Bis-[(2-mercaptoetil)-amida de ácido (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)- (R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo- nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico], (2-Mercapto-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)-(R)-6- hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di-hidro- 2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2, 10, 12, 16, 18-pentaenoico, (2-Metildissulfanil-etil)-amida de ácido (2E,10E,12E,16Z,18E)- (R)-6-hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo-3,6-di- hidro-2H-piran-2-il)-8- oxo-nonadeca-2, 10,12,16,18-pentaenoico, (2-Metil-2-metildissulfanil-propil)-amida de ácido (2E,10E,12E, 16Z, 18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6- oxo-3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8-oxo-nonadeca-2,10,12,16,18-pentaenoico, (2-Mercapto-2-metil-propil)-amida de ácido (2E, 10E, 12E, 16Z, 18E)-(R)-6-Hidróxi-3,5,7,9,11,15,17-heptametil-19-((2S,3S)-3-metil-6-oxo- 3,6-di-hidro-2H-piran-2-il)-8- oxo-nonadeca ,2,10,12,16,18-pentaenoico, ou os sais farmaceuticamente aceitáveis, hidratos, ou sais hidra- tados, ou as estruturas cristalinas polimórficas dos referidos compostos ou seus isômeros ópticos, racematos, diastereômeros ou enantiômeros.
7. Composição farmacêutica compreendendo o derivado de Iep- tomicina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veí- culo farmaceuticamente aceitável.
8. Emprego de um derivado de Ieptomicina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, para a preparação de um medica- mento para tratar câncer.
9. Processo de preparação de um composto como definido nas reivindicações 1 a 6, compreendendo a etapa de reagir os correspondentes compostos das fórmulas (II) e (III): <formula>formula see original document page 39</formula> em que Ra, R'a, R17, R9, Χ, Υ, Ζ, Τ, η são definidos como nas reivindicações1 a 6.
10. Processo de preparação de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que na fórmula (I), T é H, com- preendendo reagir um composto correspondente da fórmula (I) em que T é S-R-i, na presença de um agente de redução de ligação de dissulfetos.
11. Processo de preparação de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que T representa: <formula>formula see original document page 39</formula> compreendendo reagir um composto correspondente de fórmula (II): HO- com um composto correspondente de fórmula (IV): <formula>formula see original document page 39</formula>
12. Processo de preparação de um conjugado compreendendo a etapa de reagir um derivado de Ieptomicina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, com um agente de ligação celular modificado com- preendendo uma função reativa com relação ao grupo de ligação do deriva- do de leptomicina, de modo que o derivado e o agente de ligação celular sejam ligados um ao outro por meio do referido Iigante compreendendo o referido agente de ligação.
13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que o referi- do agente de ligação celular modificado compreendendo função reativa com relação ao referido grupo de ligação do derivado é obtido reagindo-se o refe- rido agente de ligação celular com um reagente selecionado de SMCC1 SSNPB, LC-SMCC, SIAB, SIA, SBA1 SPAP.
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