CN101466409A - 细霉素衍生物 - Google Patents

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Abstract

公开了具有部分例如硫化物或二硫化物的细霉素衍生物，其可结合于细胞结合试剂例如抗体。还描述了此类细霉素衍生物结合物的治疗用途；此类结合物具有治疗用途，因为它们能以靶向的方式向特定细胞群释放细胞毒性的细霉素衍生物。

Description

细霉素衍生物
发明领域
本发明涉及新颖的细霉素(leptomycin)衍生物及其治疗用途。更特别的，本发明涉及含有可共价结合于细胞结合剂的部分(连接基团)的新颖的细霉素衍生物，并且该相应的结合物包括通过连接体结合于所述细胞结合剂的所述细霉素衍生物。所述结合物提供能够在体内被活化和释放的治疗剂，并且以靶向的方式递送到特定细胞群。
发明背景
已出现许多涉及用单克隆抗体-药物结合物靶向肿瘤细胞的报告{Sela et al，Immunoconjugates，第189-216页(C.Vogel，ed.1987)；Ghoseet al，Targeted Drugs，第1-22页(E.Goldberg，ed.1983)；Diener et al，Antibody Mediated Delivery Systems，第1-23页(J.Rodwell，ed.1988)；Pietersz et al，Antibody Mediated Delivery Systems，第25-53页(J.Rodwell，ed.1988)；Bumol et al，Antibody Mediated Delivery Systems，第55-79页(J.Rodwell，ed.1988)；G.A.Pietersz & K.Krauer，2 J.DrugTargeting，183-215(1994)；R.V.J.Chari，31 Adv.Drug Delivery Revs.，89-104(1998)；W.A.Blattler & R.V.J.Chari，in Anticancer Agents，Frontiers in Cancer Chemotherapy，317-338，ACS Symposium Series 796；以及I.Ojima et al eds，American Chemical Society 2001}。细胞毒药物例如甲氨蝶呤、柔红霉素、多柔比星、长春新碱、长春碱、美法仑、丝裂霉素C、苯丁酸氮芥、刺孢霉素(calicheamicin)和maytansinoids已结合于多种鼠科单克隆抗体。在某些情况下，该药物分子通过中间载体分子连接于抗体分子，该中间载体分子例如血清白蛋白{Garnett et al，46Cancer Res.2407-2412(1986)；Ohkawa et al，23 Cancer Immunol.Immunother.81-86(1986)；Endo et al，47Cancer Res.1076-1080(1980)}、右旋糖酐{Hurwitz et al，2 Appl.Biochem.25-35(1980)；Manabi et al，34Biochem.Pharmacol.289-291(1985)；Dillman et al，46 Cancer Res.4886-4891(1986)；以及Shoval et al，85 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.8276-8280(1988)}、或者聚谷氨酸{Tsukada et al，73 J.Natl.Canc.Inst.721-729(1984)；Kato et al，27 J.Med.Chem.1602-1607(1984)；Tsukada etal，52 Br.J.Cancer 111-116(1985)}。
目前有大量的连接体可用于制备此类免疫结合物，包括能裂解的和不能裂解的连接体。然而，体外细胞毒试验已显示，抗体-药物结合物很少达到与游离的未结合的药物相同的细胞毒效能。这提示药物分子从结合的抗体释放的机制是非常低效的。免疫毒素领域的早期著作显示，通过单克隆抗体与催化活性蛋白毒素之间的二硫键形成的结合物比含有其它连接体的结合物更具毒性{Lambert et al，260 J.Biol.Chem.12035-12041(1985)；Lambert et al，Immunotoxins 175-209(A.Frankel，ed.1988)；Ghetie et al，48 Cancer Res.2610-2617(1988)}。此种改善的细胞毒性要归因于高的还原型谷胱甘肽的细胞内浓度造成该抗体分子与该毒素之间二硫键的有效裂解。Maytansinoids和刺孢霉素是高细胞毒性的药物的最初实例，它们通过二硫键连接到单克隆抗体。已显示这些药物的抗体结合物在体外具有高的效能，以及在小鼠中的人肿瘤移植物模型中特别的抗肿瘤活性{R.V.J.Chari et al.，52 Cancer Res.，127-131(1992)；C.Liu et al.，93，Proc.Natl.Acad.Sci.，8618-8623(1996)；L.M.Hinman et al.，53，Cancer Res.，3536-3542(1993)；以及P.R.Hamann et al，13，BioConjugate Chem.，40-46(2002)}。
细霉素B：
Figure A200780021535D00071
是一种最初从链霉菌属(Steptomyces spp.)中分离的天然产物，如US4,771,070和US 4,792,522中所报道的。它在筛选抗微生物活性时被最初识别，并随后被鉴定为抗肿瘤剂(Komiyama et al.，J.Antibiotics 1985，38(3)，427-429和US 2003/0162740)。在分子水平，细霉素B作为核转出受体CRM1的抑制剂，其结合并影响“载货蛋白”的核转运。在细胞水平，细霉素B通过在细胞循环的G1和G2相末端抑制细胞而起效(Kalesseet al.，Synthesis 2002，8，981-1003)。然而，其对哺乳动物细胞的极度毒性(Hamamoto et al.，J.Antibiotics 1983，36(6)，639-645)使得它不可能用于临床。因此，非常希望减小细霉素衍生物对非靶细胞的毒性。
通过经靶向递送到肿瘤位置而改变体内分布，导致对非靶组织的低毒性，由此降低全身毒性而可以大大改善细霉素衍生物的治疗作用。为了实现该目标，本发明人考虑制备细霉素B衍生物与特异性靶向肿瘤细胞的细胞结合剂的结合物，为的是呈现高度靶向特异性细胞毒性。
发明概述
本发明目的是提供含有连接基团的细霉素衍生物，所述连接基团可共价结合于细胞结合剂，并且该相应的结合物包括通过连接体结合于所述细胞结合剂的所述细霉素衍生物。所述结合物提供能够在体内被活化和释放的治疗剂，并且以靶向的方式递送到特定细胞群。为了进一步增强水溶性，可将任选的聚乙二醇间隔基导入到该连接基团中。
本发明化合物可用于细胞毒结合物，在该结合物中细胞结合剂与本发明的一种或多种化合物连接。细胞结合剂包括抗体及其片断、干扰素类、淋巴因子类、维生素类、激素类和生长因子类。还提供了含有此类结合物的药物组合物。
该细胞毒结合物可用于通过施用有效量的上述药物组合物来治疗受试者的方法。根据所选细胞结合剂结合的细胞类型，许多疾病可以体内、离体或体外治疗。此类疾病包括例如多种癌症的治疗，包括淋巴瘤、白血病、肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌等。
因此，提供了通过结合到特异性细胞结合剂的方式而可用于靶向特定细胞类型的细霉素衍生物。
附图简述
图1显示了实施例6的结合物huC242-SSNPB-细霉素衍生物的体外细胞毒性和特异性。
发明详述
本发明人发现能够连接到细胞结合剂的细霉素衍生物，从而通过经靶向将该衍生物递送到肿瘤位置而改变体内分布，导致对非靶组织的低毒性，由此降低全身毒性而改善此类衍生物的治疗作用。
为了实现此目标，本发明人合成示例性的细霉素衍生物，其包括使细霉素衍生物结合到细胞结合剂的连接基团。该连接基团可含有聚乙二醇间隔基。该连接基团用于结合细胞结合剂，并且优选包括二硫键或硫化物(或者本文称为硫醚)键。
以前已显示，使用可裂解键例如二硫键，高度细胞毒药物连接到抗体确保细胞内全部活性药物的释放，并且此类结合物以抗原特异性方式呈细胞毒性{R.V.J.Chari et al，52 Cancer Res.127-131(1992)；R.V.J.Chari et al.，55 Cancer Res.4079-4084(1995)；以及美国专利5,208,020和5,475,092}。在本发明中，本发明人描述了细霉素衍生物的合成，它们结合到单克隆抗体的方法，以及测定此类结合物的体外细胞毒性和特异性的方法。因此，本发明提供了制备涉及清除患病细胞或异常细胞的治疗剂的有用化合物，所述的细胞被杀死或溶解，它们例如肿瘤细胞、病毒感染的细胞、微生物感染的细胞、寄生虫感染的细胞、自身免疫细胞(产生自身抗体的细胞)、活化的细胞(与移植物排斥或移植物抗宿主疾病有关的那些)或者任何其它类型的患病细胞或异常细胞，同时显示出最小的副作用。
因此，本发明教导了细霉素衍生物的合成，该细霉素衍生物可化学连接到细胞结合剂，并且在保护基团释放时仍维持母体细霉素衍生物的高度细胞毒性。当与细胞结合剂连接时，这些化合物对细胞结合剂结合的细胞是呈细胞毒性的，并且对非靶细胞具有低得多的毒性。
本发明的细霉素衍生物
本发明的细霉素衍生物包括能够使该衍生物结合到细胞结合剂的连接基团。
根据本发明，“细霉素衍生物”是指如Kalesse et al在Synthesis 2002，8，981-1003中所定义的细霉素家族的成员，并且包括：细霉素类例如细霉素A和细霉素B，callystatin类，ratjadone类例如ratjadone A和ratjadoneB，anguinomycin类例如anguinomycin A、B、C、D，kasusamycin类，leptolstatin，leptofuranin类例如leptofuranin A、B、C、D。细霉素A和B的衍生物是优选的。
为了使该衍生物连接到细胞结合剂，该衍生物必需包括允许该衍生物通过连接体例如二硫键、硫化物(或者本文称为硫醚)键、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团或酯酶不稳定的基团连接到细胞结合剂的部分(连接基团)。制备该衍生物以便它们含有通过例如二硫键、硫醚键、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团或酯酶不稳定的基团使该细霉素衍生物连接到细胞结合剂所必需的部分。为了进一步增强在水溶液中的溶解度，该连接基团可含有聚乙二醇间隔基。
优选地，使用硫化物连接体或二硫化物连接体，因为所靶向的细胞的还原环境导至该硫化物或二硫化物的裂解并释放具有相关的细胞毒性增加的该衍生物。
根据优选的方面，本发明提供了细霉素衍生物，其中的末端羰基官能团代表了能够使该衍生物连接到细胞结合剂的部分。该连接部分可含有聚乙二醇间隔基。实例包括能够通过二硫键、硫醚键、酸不稳定的基团、光不稳定的基团、肽酶不稳定的基团或酯酶不稳定的基团连接的部分，并且是本领域公知的{参见，例如，美国专利5,846,545，其通过引用并入本文}。优选的部分是能够通过二硫键例如硫醇或二硫化物连接的那些。可以使用含有任何末端离去基团的混合的二硫化物，如谷胱甘肽，烷硫基如甲硫基、吡啶基硫基、芳基硫基、硝基吡啶基硫基、羟基羰基吡啶基硫基、(硝基)羟基羰基吡啶基硫基等，只要此类二硫化物能够进行使该衍生物与细胞结合剂偶合的二硫化物-交换反应。
更具体的，本发明衍生物是式(I)：
Figure A200780021535D00101
其中
Ra和Ra’是H或-Alk；优选地Ra是-Alk，优选甲基，并且Ra’是H；
R17是任选被OR、CN、NRR’、全氟烷基取代的烷基；优选地，R17是烷基，更优选甲基或乙基；
R9是任选被OR、CN、NRR’、全氟烷基取代的烷基；优选地，R9是烷基，更优选甲基；
X是-O-或-NR-；优选地，X是-NR-；
Y是-U-、-NR-U-、-O-U-、-NR-CO-U-、-U-NR-CO-、-U-CO-、-CO-U-；
优选地，当X是-O-时，Y是-U-、-NR-U-、-U-NR-CO-；
其中U选自直链或支链的-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-、-(OCH2CH2)m-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-Alk-、-(OCH2CH2)m-、-环烷基-、-杂环基-、-环烷基-Alk-、-Alk-环烷基-、-杂环基-Alk-、-Alk-杂环基-；
其中m是选自1至2000的整数；
优选地，U是直链或支链的-Alk-，
Z是-Alk-；
n是0或1；优选地n是0；
T表示H，硫醇保护基团例如Ac、R1或SR1，其中R1表示H、甲基、Alk、环烷基、任选取代的芳基或杂环基，或者T表示
Figure A200780021535D00111
其中：
Ra、Ra’、R17、R9、X、Y、Z、n定义如上文；
优选地，T是H或SR1，其中R1表示Alk，更优选甲基；
R、R’相同或不同，是H或烷基；
Alk表示直链或支链的烷基；优选地Alk表示(-(CH2-q(CH3)q)p-，其中p表示1至10的整数；并且q表示0至2的整数；优选地，Alk表示-(CH2)-或-C(CH3)2-。
或其药学可接受的盐、水合物、或水合的盐，或者这些化合物的多晶型晶体结构或其光学异构体、外消旋体、非对映体或对映体。
优选的化合物可选自：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫烷基-乙基)-酰胺
双-[(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯乙基)-酰胺]
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-乙基)-酰胺
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫烷基-乙基)-酰胺
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基)-酰胺
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺
或其药学可接受的盐、水合物、或水合的盐，或者这些化合物的多晶型晶体结构或其光学异构体、外消旋体、非对映体或对映体。
如定义于本文的，烷基包括直链或支链的C1-C20烷基。直链烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。支链的烷基的实例包括异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基和1-乙基丙基。环烷基即环状烷基的实例包括环丙基、环丁基、环戊基和环己基。芳基的实例包括苯基和萘基。取代的芳基的实例包括被以下基团取代的例如苯基或萘基的芳基：烷基基团，卤素例如Cl、Br、F，硝基，氨基，磺酸基，羧酸基，羟基和烷氧基。杂环是指任选的芳族环，其包含一个或多个选自O、N和S的杂原子，实例包括呋喃基、吡咯基(pyrrollyl)、吡啶基、(例如，2-取代的嘧啶基团)和噻吩。
可以对本发明的含有硫化物或二硫化物的或者含有巯基的衍生物评价它们在体外培养条件下抑制各种不需要的细胞系增殖的能力。细胞系例如Ramos细胞系和HL60可容易地用于评价这些化合物的细胞毒性。可以使待评价的细胞暴露于所述化合物24小时，再通过已知的方法直接分析测定细胞的生存分数。然后可从这些分析的结果计算IC50值。
如用于本文的，表达“能连接到细胞结合剂”是指包含至少一个连接基团或其前体的细霉素衍生物，所述至少一个连接基团或其前体适合于使所述衍生物结合到细胞结合剂；优选的连接基团是硫醇、硫化物或二硫化物键，或其前体。
如用于本文的，表达“连接到细胞结合剂”是指包含至少一种通过适宜的连接基团或其前体结合到细胞结合剂的细霉素衍生物的结合物分子；优选的连接基团是硫醇、硫化物或二硫化物键，或其前体。
如用于本文的，术语＂患者＂是指动物例如供育种、陪伴或保存目的的有价值的动物，或者优选人或人类儿童，其罹患或者可能罹患一种或多种本文所述的疾病和病症。
如用于本文的，＂治疗有效量＂是指本发明化合物有效预防、减轻、消除、治疗或控制本文所述疾病和病症的症状的量。术语＂控制＂意指其中可以有本文所述疾病和病症的进展的缓解、中断、阻止或中止的所有的进程，但是不是必然指所有疾病和病症的症状的全部消除，并且欲意包括预防性治疗。
如用于本文的，术语＂药学可接受的＂是指这样的化合物、材料、赋形剂、组合物或剂型，它们在合理的医学判断范围内，它们适合于与人类和动物的组织接触而无过度的毒性、刺激性、过敏反应或与合理的利益/风险比相称的其它疑难并发症。
如用于本文的，＂药学可接受的盐＂是指所公开化合物的衍生物，其中所述的母体化合物通过制备其酸式盐或碱式盐而被修饰。药学可接受的盐包括例如从非毒性无机或有机酸形成的本发明化合物常规的非毒性盐或季铵盐。例如，此类常规的非毒性盐包括从无机酸例如盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等得到的那些；以及从有机酸例如乙酸、丙酸、琥珀酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸、葡萄糖醛酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、甲苯磺酸、草酸、富马酸、马来酸、乳酸等制备的盐。其它加成盐包括铵盐例如氨丁三醇盐、葡甲胺盐、吡咯乙醇(epolamine)盐等，金属盐例如钠盐、钾盐、钙盐、锌盐或镁盐。
本发明药学可接受的盐可以从含有碱性或酸性部分的母体化合物通过常规化学方法合成。通常，此类盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量的适宜的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在此两者的混合物中反应来制备。一般地，非水介质如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈是优选的。适宜的盐的列表可在Remington′sPharmaceutical Sciences，17th ed.，Mack Publishing Company，Easton，PA，1985，p.1418中找到，其公开通过引用并入本文。
根据再进一步的目的，本发明还涉及制备本发明化合物的方法。
本发明的化合物和方法可以以本领域技术人员公知的多种途径制备。所述化合物可以例如通过使用或改编下文描述的方法来合成，或者如本领域技术人员理解的根据它们的变化形式来合成。对于本领域技术人员而言，适宜的修饰和取代将会是容易地显而易见并且是公知的，或者可以容易地从科技文献获得的。
特别是，此类化合物可从R.C.Larock，Comprehensive OrganicTransformations，Wiley-VCH Publishers，1999中找到。
应理解，本发明化合物可含有一个或多个不对称取代的碳原子，并且可以以光学活性或外消旋形式分离。因此，意图包括一种结构的全部手性的、非对映体的、外消旋的形式以及全部几何异构形式，除非特别指出了具体的立体化学或异构体形式。本领域公知如何制备和分离此类光学活性形式。例如，立体异构体的混合物可以通过标准技术分离，该标准技术包括，但不限于，外消旋形式的拆分，正相、反相和手性色谱层析，优选盐形成、重结晶等；或者通过从手性原料手性合成或通过靶手性中心的有计划合成。
本发明化合物可通过多种合成路线来制备。试剂和原料是可商购的，或者是通过本领域普通技术人员根据公知技术容易合成的。全部取代基，除非另有指明，均如前文所定义。
在下文描述的反应中，可能需要保护反应性官能团，例如羟基、氨基、亚胺基、硫代或羧基，其中这些在终产物中是期望的，以避免它们不希望的参与反应。常规保护基团可以根据标准操作使用，例如参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts在Protective Groups in Organic Chemistry，3rded.，John Wiley and Sons，1999中；J.F.W.McOmie在Protective Groupsin Organic Synthesis，Plenum Press，1973中。
一些反应可以在碱存在下进行。对于在此反应中所用的碱的性质无特别的限制，并且常规用于此类反应的任何碱均可在此同等使用，只要其对分子的其它部分没有不良作用。适宜的碱的实例包括：氢氧化钠，碳酸钾，三乙胺，碱金属氢化物如氢化钠和氢化钾；烷基锂化合物如甲基锂和丁基锂；以及碱金属醇盐如甲醇钠和乙醇钠。
通常，反应在适宜的溶剂中进行。可以使用各种溶剂，只要它对反应或者对有关的试剂无不良作用。适宜的溶剂的实例包括：烃，其可以是芳香族的、脂肪族的或环状脂肪族的烃，例如己烷、环己烷、苯、甲苯和二甲苯；酰胺类例如二甲基酰胺，醇类例如乙醇和甲醇，以及醚类例如二乙基醚和四氢呋喃。
该反应可以是宽泛的温度范围内进行。一般地，我们发现有利地在0℃至150℃的温度(更优选从约室温至100℃)下进行该反应。反应所需时间还可以宽泛变化，这取决于许多因素，特别是反应温度以及试剂的性质。然而，只要该反应在上述优选条件下是有效的，3小时至20小时的时间通常是足够的。
由此制备的化合物可以通过常规方式从反应混合物中回收。例如，可以通过从反应混合物中蒸馏出溶剂来回收该化合物，或者，如果需要，在从反应混合物中蒸馏出溶剂之后，将残余物倾入到水中，接着用水不混溶的有机溶剂萃取，再从该萃取物中蒸馏出溶剂。另外，如果需要，该产物进以进一步通过多种公知技术来纯化，所述的公知技术例如重结晶、再沉淀或多种色谱技术，特别是柱色谱法或者制备型薄层色谱法。
制备本发明式(I)化合物的方法包括使式(II)和(III)相应化合物反应的步骤：
Figure A200780021535D00151
其中Ra、Ra’、R17、R9、X、Y、Z、T、n定义如式(I)。
一般地，此反应可以在常规偶合试剂存在下进行，该偶合试剂包括抑制外消旋作用的试剂例如HOBT，和/或用于将羧酸活化成酰胺或酯形式的脱水剂例如DIC、DCC。
典型地，此反应可以在适宜的有机溶剂例如二氯甲烷中进行。
当式(I)中T是H时，该反应可另选地用N-酰化剂例如新戊酰氯在碱包括有机碱如三乙胺存在下进行。
另选地，当式(I)中T是H时，式(I)化合物还可以从式(I)相应化合物(其中T是S-R1)在二硫键的还原剂如三烷基膦并且更特别地是TCEP存在下获得。此反应通常可以在水性介质例如有机溶剂和水的混合物如THF/水中进行。
式(I)化合物的二聚体可以通过使式(II)相应化合物与式(IV)相应化合物：
HX-Y-(Z)n-S-S-(Z)n-Y-XH   (IV)
在常规偶合试剂存在下反应来制备，该偶合试剂包括抑制外消旋作用的试剂例如HOBT，和/或用于将羧酸活化成酰胺或酯形式的脱水剂例如DIC、DCC。
典型地，此反应可以在适宜的有机溶剂例如二氯甲烷中进行。
该方法还包括分离所得产物的其它步骤。
本发明还涉及细霉素衍生物结合物，其包含通过连接体连接到一种或多种本发明细霉素衍生物的细胞结合剂，所述的连接体包含所述的连接基团。
优选地，细胞结合剂是抗体或其片断。
优选地，所述的连接体包含-S-或-S-S-基团。
细胞结合剂的制备
细胞结合剂可以是目前已知或成为已知的任何种类，并且包括肽类和非肽类。一般地，这些可以是含有至少一个结合位点的抗体(特别是单克隆抗体)或抗体片断，淋巴因子类、激素类、生长因子类、营养素转运分子(例如转铁蛋白)，或者任何其它细胞结合分子或物质。
可以使用的细胞结合剂的更具体的实例包括：
-单克隆抗体；
-单链抗体；
-抗体片断例如Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv{Parham，131 J.Immunol.2895-2902(1983)；Spring et al，113 J.Immunol.470-478(1974)；Nisonoffet al，89 Arch.Biochem.Biophys.230-244(1960)}；
-干扰素类；
-肽类；
-淋巴因子类例如IL-2，IL-3，IL-4，IL-6；
-激素类例如胰岛素、TRH(促甲状腺激素释放激素)、MSH(黑色素细胞刺激素)、甾体激素类例如雄激素类和雌激素类；
-生长因子和集落刺激因子例如EGF、TGFα、胰岛素样生长因子(IGF-I、IGF-II)G-CSF、M-CSF和GM-CSF{Burgess，5 Immunology Today155-158(1984)}；维生素类例如叶酸盐；以及
-转铁蛋白{O′Keefe et al，260 J.Biol.Chem.932-937(1985)}。
单克隆抗体技术容许产以特异性单克隆抗体的形式产生极具选择性的细胞结合剂。本领域特别公知的是产生单克隆抗体的技术，该单克隆抗体是通过用感兴趣的抗原例如完整的靶细胞、从该靶细胞分离的抗原、全病毒、减毒病毒和病毒蛋白例如病毒外壳蛋白来免疫小鼠、大鼠、仑鼠或任何其它哺乳动物而产生的。
适宜的细胞结合剂的选择是取决于被靶向的特定细胞群的选择事项，但是如果能得到适宜的，通常单克隆抗体是优选的。
例如，单克隆抗体MY9是一种鼠科IgG1抗体，其特异性结合于CD33抗原{J.D.Griffin et al 8 Leukemia Res.，521(1984)}，并且如果该靶细胞如在急性髓性白血病(AML)的疾病中表达CD33，其可被使用。类似地，单克隆抗体抗-B4是一种鼠科IgG1抗体，其在B细胞上结合于CD19抗原{Nadler et al，131 J.Immunol.244-250(1983)}，并且如果该靶细胞是B细胞或者是例如在非何杰金氏淋巴瘤或慢性成淋巴细胞性白血病中表达此抗原的患病细胞，其可被使用。
另外，结合于骨髓细胞的GM-CSF可以用作针对来自急性骨髓性白血病的患病细胞的细胞结合剂。结合活化的T-细胞的IL-2可用于预防移植移植物排斥，用于治疗和预防移植物-抗-宿主疾病，以及用于治疗急性T-细胞性白血病。结合黑素细胞的MSH可用于治疗黑素瘤。
结合物的制备
衍生物和细胞结合剂的结合物可以使用目前已知或者日后开发的任何技术形成。一般地，本发明结合物的制备方法包括使本发明细霉素衍生物与细胞结合剂在试剂的存在下反应的步骤，所述的试剂包含对衍生物的连接基团和细胞结合剂有活性的官能团，以便该衍生物和细胞结合剂通过包含所述连接基团的连接体连接在一起。优选地，所述的连接体包含硫化物键或二硫化物键。
衍生物可以制备成含有游离氨基，然后通过酸不稳定的连接体或者通过光不稳定的连接体连接到抗体或其它细胞结合剂。该衍生物可以与具有适宜序列的肽缩合，接着连接到细胞结合剂以产生对肽酶不稳定的连接体。细胞毒性化合物可以制备成含有伯羟基基团，其可以被琥珀酰化并连接到细胞结合剂以产生结合物，该结合物可以通过细胞内酯酶裂解以释放游离细霉素衍生物。优选地，该衍生物合成成含有游离的或受保护的硫醇基团，有或没有含PEG的间隔基，然后一种或多种含硫化物、二硫化物或硫醇的衍生物各自通过二硫键或硫醚键共价连接到细胞结合剂。
本发明代表性的结合物是细霉素衍生物与抗体、抗体片断、表皮生长因子(EGF)、黑色素细胞刺激素(MSH)、促甲状腺激素(TSH)、雌激素、雌激素类似物、雄激素和雄激素类似物的结合物。
下文描述了制备细霉素衍生物和细胞结合剂的各种结合物的代表性实例。
二硫化物连接体：抗体huMy-9-6是定向抑制CD33抗原的鼠科单克隆抗体My-9-6的遗传性人源化形式，其发现于人骨髓细胞的表面，包括急性髓性白血病(AML)的多数案例(E.J.Favaloro，K.F.Bradstock，A.Kabral，P.Grimsley & M.C.Berndt，Disease Markers，5(4)：215(1987)；M.G.Hoffee，D.Tavares，R.J.Lutz，Robert J.，PCT国际申请(2004)WO2004043344)。My-9-6可以用于结合物的制备。用N-琥珀酰亚胺基-3-吡啶基二硫代丙酸酯如前所述修饰该抗体{J.Carlsson，H.Drevin & R.Axen，Biochem.J.，173：723(1978)}，每抗体分子平均导入4个吡啶基二硫代基团。使该修饰的抗体与含有硫醇的细霉素衍生物反应，产生二硫化物-连接的结合物。
硫醚连接体：本发明含有硫醇的衍生物可以如前所述通过硫醚键连接到抗体和其它细胞结合剂(美国专利US5,208,020)。该抗体或其它细胞结合剂可以用已知的或可商购的例如以下的化合物修饰：N-硫代琥珀酰亚胺基-4-(5-硝基-2-吡啶基-二硫代)丁酸酯(SSNPB)、N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-羧酸酯(SMCC)、N-琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧基-(6-氨基己酸酯(amidocaproate))，其为SMCC的“长链”类似物(LC-SMCC)。这些交联试剂形成不可裂解的得自基于马来酰亚胺基部分的连接体。
包含基于卤代乙酰基部分的交联试剂包括：N-琥珀酰亚胺基-4-(碘乙酰基)-氨基苯甲酸酯(SIAB)、N-琥珀酰亚胺基碘乙酸酯(SIA)、N-琥珀酰亚胺基溴乙酸酯(SBA)和N-琥珀酰亚胺基3-(溴-乙酰氨基)丙酸酯(SBAP)。这些交联试剂形成不可裂解的得自基于卤代乙酰基部分的连接体。该修饰的细胞结合剂可以与含有硫醇的药物反应，得到硫醚连接的结合物。
酸不稳定的连接体：本发明含有氨基的细霉素衍生物可以如前所述通过酸不稳定的连接体连接到抗体和其它细胞结合剂{W.A.Blattler etal，Biochemistry 24，1517-1524(1985)；美国专利US4,542,225、4,569,789、4,618,492、4,764,368}。
类似地，本发明含有酰肼(hydrazido)基的细霉素衍生物可以如前所述通过酸不稳定的腙连接体连接到抗体和其它细胞结合剂的碳水化合物部分{对于腙连接体的实例参见B.C.Laguzza et al，J.Med.Chem.，32，548-555(1989)；R.S.Greenfield et al，Cancer Res.，50，6600-6607(1990)}。
光不稳定的连接体：本发明含有胺基团的细霉素衍生物可以如前所述通过光不稳定的连接体连接到抗体和其它细胞结合剂{P.Senter et al，Photochemistry and Photobiology，42，231-237(1985)；美国专利US4,625,014}。
肽酶不稳定的连接体：本发明含有胺基团的细霉素衍生物还可以通过肽间隔基连接到细胞结合剂。前面已显示，药物与大分子蛋白质载体之间的短肽间隔基在血清中稳定，但是容易被细胞内肽酶水解{A.Trouet et al，Proc.Natl.Acad.Sci.，79，626-629(1982)}。含有有氨基基团的细霉素衍生物可以使用缩合剂例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(EDC-HCl)而与肽缩合，得到可以连接到细胞结合剂的肽衍生物。
酯酶不稳定的连接体：本发明具有羟基烷基基团的细霉素衍生物可以用琥珀酸酐琥珀酰基化，然后连接到细胞结合剂，产生一种结合物，该结合物可以通过细胞内酯酶裂解而释放游离药物{例如参见E.Aboud-Pirak et al.，Biochem Pharmacol.，38，641-648(1989)}。
通过已知方法以相同方式制备抗体、抗体片断、蛋白质或肽激素类、蛋白质或肽生长因子类和其它蛋白质的结合物。例如肽和抗体可以通过本领域已知的方法用例如以下的交联剂修饰：N-琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯、N-琥珀酰亚胺基4-(2-吡啶基二硫代)戊酸酯(SPP)、4-琥珀酰亚胺基-氧基羰基-α-甲基-α-(2-吡啶基二硫代)-甲苯(SMPT)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SDPB)、琥珀酰亚胺基吡啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)、4-(2-吡啶基二硫代)丁酸N-氢琥珀酰亚胺酯(SPDB)、琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺基甲基]环己烷-1-羧酸酯(SMCC)，N-硫代琥珀酰亚胺基-3-(2-(5-硝基-吡啶基二硫代)丁酸酯(SSNPB)、2-亚氨基四氢噻吩(2-iminothiolane)、或S-乙酰基琥珀酸酐。参见，Carlsson etal.，173，Biochem.J.723-737(1978)；Blattler et al.，24，Biochem.1517-1524(1985)；Lambert et al.，22，Biochem.3913-3920(1983)；Klotz etal.，96，Arch.Biochem.Biophys.，605(1962)；以及Liu et al.，18，Biochem.，690(1979)，Blakey and Thorpe，1 Antibody，Immunoconjugates &Radio-pharmaceuticals，1-16(1988)，Worrell et al.1 Anti-Cancer DrugDesign 179-184(1986)。然后使由此得到的游离的或受保护的含有硫醇的细胞结合剂与含有二硫化物或硫醇的细霉素衍生物反应，产生结合物。
通过以上方法制得的结合物可以通过标准柱色谱法或通过HPLC纯化。
单克隆抗体或细胞结合剂与本发明细霉素衍生物之间优选的结合物是如上文讨论的通过二硫键或硫醚键连接的那些。此类细胞结合结合物是通过已知方法制备的，该方法例如将单克隆抗体用琥珀酰亚胺基吡啶基-二硫代丙酸酯(SPDP)修饰{Carlsson et al，173，Biochem.J.，723-737(1978)}。然后通过用含有硫醇的细霉素衍生物处理将所得硫代吡啶基团置换，产生二硫化物连接的结合物。通过二硫化物桥连接的含有1至10个细霉素衍生物的结合物通过此方法容易地制备。由此方法制备的结合物充分描述于美国专利US5,585,499，其通过引用并入本文。
细胞结合剂和本发明细霉素衍生物之间的结合物的体外细胞毒性
本发明细霉素衍生物以及它们与细胞结合剂的结合物的细胞毒性可以在裂解保护基团并转化成活性药物之后测定。对非粘附细胞系例如Namalwa和HL60的细胞毒性可以通过细胞增殖曲线的后-外推法(back-extrapolation)来测定，其如Goldmacher et al，135，J.Immunol.，3648-3651(1985)中所述。这些化合物对粘附细胞系例如A-375和SCaBER的细胞毒性可以通过克隆形成分析(clonogenic assay)测定，其如Goldmacher et al.，102 J.Cell Biol.1312-1319(1986)中所述。
抑制所选细胞群生长的治疗剂和方法
本发明还提供抑制所选细胞群生长的治疗剂，其包含：
(a)细胞毒量的一种或多种与细胞结合剂连接的上述细霉素衍生物，和
(b)药学可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
类似地，本发明还提供抑制所选细胞群生长的方法，其包括使细胞群或者怀疑含有来自所述选择的细胞群的细胞的组织与细胞毒量的细胞毒剂接触，所述细胞毒剂包含一种或多种与细胞结合剂连接的上述细霉素衍生物。
该细胞毒剂如上文所述制备。
适宜的药学可接受的载体、稀释剂、和赋形剂是公知的，并且可以通过本领域技术人员根据临床表现依据来确定。
适宜的载体、稀释剂和/或赋形剂的实例包括：(1)Dulbecco′s磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，含有约1mg/ml至25mg/ml人血清白蛋白，(2)0.9％盐水溶液(0.9％ w/v NaCl)，和(3)5％(w/v)右旋糖。
抑制所选细胞群生长的方法可以在体外、体内或离体实施。
体外应用的实例包括处理细胞培养物以便杀灭除所需变异体以外的全部细胞，所述的变异体不表达靶抗原；或者杀灭表达不需要的抗原的变异体。
非临床体外应用的条件是根据熟练技术人员容易确定的。
离体应用的实例包括在它们移植到同一患者之前处理自体骨髓，以便杀灭患病的或恶性细胞；在它们移植之前处理骨髓，以便杀灭有活性的T细胞并防止移植物抗宿主病(GVHD)。
可以按下文进行临床离体处理，以便在癌症治疗或自身免疫疾病治疗中在自体移植之前从骨髓中除去肿瘤细胞或淋巴样细胞，或者在移植之前从同种异体骨髓或组织中除去T细胞和其它淋巴样细胞以便预防GVHD。从患者或其它个体收集骨髓，然后在含有血清的介质中培养，向其中中加入本发明的细胞毒剂，其浓度为约10μM至1pM，在约37℃下培养约30分钟至约48小时。培养浓度和时间的确切条件(＝剂量)是熟练技术人员容易确定的。培养之后，将该骨髓细胞用含有血清的介质洗涤，再根据已知方法通过静脉内(i.v.)输注返回到患者。在患者接受其它治疗的情况下，例如在收集骨髓和再输注受处理的细胞的时间之间的烧蚀(ablative)化疗或全身照射疗程中，使用标准医学设备将该受处理的骨髓细胞在液氮中冷冻保存。
对于临床体内应用，本发明的细胞毒剂将以测试了无菌和内毒素水平的溶液供应，或者以可重新溶解于无菌注射用水中的冷冻干燥的固体供应。结合物施用的适宜方案的实例如下。结合物以静脉内(i.v.)弹丸剂(bolus)每周给药达6周。单次注射剂量(bolus dose)在50至400ml的生理盐水中给予，其中可加入人血清白蛋白(例如0.5至1ml的人血清白蛋白浓溶液，100mg/mL)。剂量将为每周静脉内(i.v.)约50μg至10mg/kg体重(每次注射范围为10μg至100mg/kg)。治疗6周之后，患者可接受第二疗程的治疗。在有关给药途径、赋形剂、稀释剂、剂量、次数等方面的具体临床方案可以通过熟练技术人员根据临床表现依据来确定。
可以根据体内或离体方法杀灭所选细胞群来治疗的医学病症的实例包括：任何类型的恶性肿瘤，其包括，例如，肺癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、和淋巴器官癌；黑素瘤；自身免疫性疾病，例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、和多发性硬化症；移植物排斥，例如肾移植排斥、肝移植排斥、肺移植排斥、心脏移植排斥、和骨髓移植排斥；移植物抗宿主病；病毒感染，例如CMV感染、HIV感染、AIDS等；细菌感染；以及寄生虫感染，例如贾第虫病、阿米巴病、血吸虫病，以及由本领域技术人员确定的其它类。
实施例
本发明现通过参考非限制性实施例来说明。除非另有说明，所有的百分数、比率、部分等以重量计。
材料和方法
熔点是使用电热仪测定的，未经校正。NMR光谱是在BrukerAVANCE400(400MHz)光谱仪上记录的。化学位移以ppm报告，相对于TMS为内标。质谱是使用Bruker Esquire 3000系统获得的。紫外光谱在Hitachi U1200分光光度计上记录。HPLC使用Beckman Coulter GOLD125系统进行，该系统配备Beckman Coulter系统GOLD 168可变波长检测器和Waters RADIALPAK(一种反相C-18柱)。薄层色谱法是在Analtech GF硅胶TLC板上进行的。用于快速色谱法的硅胶来自Baker。四氢呋喃通过用钠金属蒸馏干燥。二甲基乙酰胺和二甲基甲酰胺通过用氢化钙在减压下蒸馏干燥。所用的全部其它溶剂为试剂级或HPLC级。
人癌细胞系HL60、Namalwa、A-375、COLO205和Ramos得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。Kara是鼠科肿瘤细胞系，其已稳定转染人CD33抗原。
试验部分
质谱分析按以下进行：
EI-CI分析：直接导入(DCI＝样品沉积在细丝上)
质谱仪Finnigan SSQ7000；质量范围m/z＝29-900；电子能量70eV；源温度70℃；反应物气体(reactant gaz)氨性CI；EI＝通过电子碰撞离子化；CI＝化学电离。
电喷雾分析：(阳性电喷雾：ES+；阴性电喷雾：ES-)
LC-MS-DAD-ELSD：
MS：Waters-Micromass ZQ；LC：Agilent HP 1100；LC柱XbridgeWaters C18，3 X 50mm，2.5μm；洗脱液：梯度水(含0.1％甲酸)+乙腈；UV：DAD(λ＝200-400nm)。
实施例1：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫烷基-乙基)-酰胺
Figure A200780021535D00241
向20mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸和5.6mg的HOBT(1-羟基苯并三唑)在0.3ml的二氯甲烷中的溶液中在近20℃温度下导入7.65μl的DIC(N，N′-二异丙基碳二亚胺)，然后导入5.2mg的2-(硫代甲基)乙胺。将反应混合物在近20℃温度下搅拌20.5小时，然后通过直接沉积到2个制备型硅胶TLC板(厚0.5mm，20 x 20cm)上纯化。将制备型TLC板用甲醇/二氯甲烷的混合物(5/95，以体积计)洗脱，然后将所需产物从硅胶中用甲醇/二氯甲烷的混合物(15/85，以体积计)提取。获得1.4mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫烷基-乙基)-酰胺为黄色固体，其特征如下
质谱：
●CI：m/z＝617：[M+NH4]+；m/z＝600：[M+H]+
在光谱仪BRUKER AVANCE DMX-600上获得的600MHz处的1HNMR光谱具有以下化学位移(δ，ppm)—以氯仿为溶剂-d1(CDCl3-d1)，参比7，27，温度303K：0，79(d，J＝6，5Hz，3H)；0，97(d，J＝7，0Hz，3H)；1，07(d，J＝7，0Hz，3H)；1，12(d，J＝7，0Hz，3H)；1，15(d，J＝7，5Hz，3H)；1，71(m，1H)；1，81(s，3H)；1，82(m 部分隐蔽，1H)；1，83(s，3H)；2，08(m，2H)；2，11(s，3H)；2，13(s，3H)；2，15(dd，J＝6，5和13，5Hz，1H)；2，45(m宽峰，1H)；2，53(m，1H)；2，66(t，J＝6，5Hz，2H)；2，70(m，1H)；2，82(m，1H)；3，50(q，J＝6，5Hz，2H)；3，61(m，1H)；3，65(m，1H)；5，01(dd，J＝4，5和7，5Hz，1H)；5，09(d，J＝10，0Hz，1H)；5，26(d，J＝10，0Hz，1H)；从5，55至5，66(m，2H)；5，69(dd，J＝7，5和16，0Hz，1H)；5，97(t 宽峰，J＝6，5Hz，1H)；6，00(d，J＝10，0Hz，1H)；6，02(d，J＝15，5Hz，1H)；6，75(d，J＝16，0Hz，1H)；6，95(dd，J＝6，0和10，0Hz，1H)。
实施例2：
双-[(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯乙基)-酰胺]
Figure A200780021535D00251
向20mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸和5.6mg的HOBT(1-羟基苯并三唑)在0.3ml的二氯甲烷中的溶液中在近20℃温度下导入12.8mg的胱氨酸二盐酸盐、7.65μl的DIC(N，N′-二异丙基碳二亚胺)，然后导入11.6μl的三乙胺。将反应混合物在近20℃温度下搅拌22小时，然后通过直接沉积到2个制备型硅胶TLC板(厚0.5mm，20 x 20cm)上纯化。将制备型TLC板用甲醇/二氯甲烷的混合物(5/95，以体积计)洗脱，然后将所需产物从硅胶中用甲醇/二氯甲烷的混合物(15/85，以体积计)提取。获得4.6mg的双-[(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七-甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-硫代乙基)-酰胺]为白色固体(white solid blanc)，其特征如下：
质谱：
●ES+：m/z＝1167：[M+H]+
●ES-：：m/z＝1211：[M-H+HCOOH]-
实施例3：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-乙基)-酰胺
Figure A200780021535D00261
向20mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸和8μl的三乙胺在0.15ml的二氯甲烷中的溶液中在近0℃温度下导入6.1μl的新戊酰氯。在近0℃温度下15分钟之后，加入4.4mg的2-氨基乙硫醇在0.15ml的二氯甲烷和0.05ml的乙醇中的溶液。将反应混合物在近20℃温度下搅拌1小时，然后通过直接沉积到2个制备型硅胶TLC板(厚0.5mm，20 x 20cm)上纯化。将制备型TLC板用甲醇/二氯甲烷的混合物(8/92，以体积计)洗脱，然后将所需产物从硅胶中用甲醇/二氯甲烷的混合物(15/85，以体积计)提取。获得2.3mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-乙基)-酰胺为无色玻璃状物，其特征如下：
质谱：
●ES+：m/z＝586：[M+H]+
●ES-:：m/z＝630：[M-H+HCOOH]-
在光谱仪BRUKER AVANCE DRX-400上获得400MHz处的1HNMR光谱具有以下化学位移(δ，ppm)—以氯仿为溶剂-d1(CDCl3-d1)，参比7，27，温度303K：0，80(d，J＝6，5Hz，3H)；0，98(d，J＝6，5Hz，3H)；1，08(d，J＝7，5Hz，3H)；1，14(d，J＝6，5Hz，3H)；1，16(d，J＝7，0Hz，3H)；1，72(m，1H)；从1，80至1，87(m 隐蔽，1H)；1，82(s，3H)；1，84(s，3H)；2，09(m，2H)；2，11(s，3H)；2，16(dd，J＝6，5和13，5Hz，1H)；2，54(m，1H)；从2，65至2，74(m，3H)；2，83(m，1H)；3，48(q，J＝6，5Hz，2H)；从3，60至3，70(m，2H)；5，00(dd，J＝4，0和7，0Hz，1H)；5，10(d，J＝10，5Hz，1H)；5，27(d，J＝10，5Hz，1H)；5，58(s，1H)；5，60(td 部分隐蔽，J＝7，5和15，5Hz，1H)；5，70(dd，J＝7，0和15，5Hz，1H)；从5，96至6，06(m，3H)；6，75(d 宽峰，J＝15，5Hz，1H)；6，97(dd，J＝6，0和10，0Hz，1H)。
实施例4：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫烷基-乙基)-酰胺
Figure A200780021535D00271
向20mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸和5.6mg的HOBT(1-羟基苯并三唑)在0.15ml的二氯甲烷中的溶液中在近20℃温度下导入7.65μl的DIC(N，N′-二异丙基碳二亚胺)，然后导入8mg的2-甲基二硫代-乙胺在0.15ml的二氯甲烷中的溶液。将反应混合物在近20℃温度下搅拌2小时，然后通过直接沉积到2个制备型硅胶TLC板(厚0.5mm，20 x 20cm)上纯化。将制备型TLC板用甲醇/二氯甲烷的混合物(7/93，以体积计)洗脱，然后将所需产物从硅胶中用甲醇/二氯甲烷的混合物(15/85，以体积计)提取。获得3.4mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫烷基-乙基)-酰胺为浅黄色油状物，其特征如下：
质谱：
●ES+：m/z＝632：[M+H]+
●ES-:：m/z＝630：[M-H]-；m/z＝676：[M-H+HCOOH]-
在光谱仪BRUKER AVANCE DRX-400上获得的400MHz处的1HNMR光谱具有以下化学位移(δ，ppm)—以氯仿为溶剂-d1(CDCl3-d1)，参比7，27，温度303K：0，81(d，J＝6，5Hz，3H)；0，98(d，J＝6，5Hz，3H)；1，08(d，J＝7，5Hz，3H)；1，14(d，J＝6，5Hz，3H)；1，16(d，J＝7，0Hz，3H)；1，72(m，1H)；从1，79至1，86(m，1H)；1，82(s，3H)；1，84(s，3H)；2，09(m，2H)；2，11(s 宽峰，3H)；2，15(dd，J＝5，5和13，5Hz，1H)；2，35(s 宽峰，1H)；2，43(m，3H)；2，54(m，1H)；2，70(m，1H)；2，83(m，1H)；2，86(t，J＝6，5Hz，2H)；从3，59至3，70(m，4H)；5，01(dd，J＝4，0和7，0Hz，1H)；5，11(d，J＝10，0Hz，1H)；5，27(d，J＝10，0Hz，1H)；5，56(s，1H)；5，60(td部分隐蔽，J＝7，5和15，5Hz，1H)；5，70(dd，J＝7，0和15，5Hz，1H)；5，93(t，J＝6，0Hz，1H)；6，00(d，J＝10，0Hz，1H)；6，02(d，J＝15，5Hz，1H)；6，75(d，J＝15，5Hz，1H)；6，96(dd，J＝6，0和10，0Hz，1H).
实施例5：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基)-酰胺
Figure A200780021535D00281
向225.4mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸在1.5ml的二氯甲烷中的溶液中在近0℃温度下导入63.6mg的HOBT(1-羟基苯并三唑)和110mg的2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙胺在1.5ml的二氯甲烷中的溶液，然后导入86.2μl的DIC(N，N′-二异丙基碳二亚胺)。将反应混合物在近0℃温度下搅拌15小时，然后用30ml的二氯甲烷稀释。将有机相用10ml的水洗涤两次，用硫酸钠干燥，在烧结玻璃上过滤，然后在减压下在近40℃温度下浓缩。将所得残余物通过柱色谱法在硅胶(20g SiO2，15-35μm)上纯化，洗脱梯度为甲醇/二氯甲烷从0/100至10/90(以体积计)。在减压下在近40℃温度下将含有所需产物的级分浓缩。获得212.1mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基)-酰胺为黄色玻璃状物，其特征如下：
质谱：
●ES+：m/z＝660：[M+H]+
●ES-:：m/z＝658：[M-H]-；m/z＝704：[M-H+HCOOH]-
在光谱仪BRUKER AVANCE DRX-400上获得的400MHz处的1HNMR光谱具有以下化学位移(δ，ppm)—以氯仿为溶剂-d1(CDCl3-d1)，参比7，27，温度303K：0，80(d，J＝6，5Hz，3H)；0，97(d，J＝6，5Hz，3H)；1，08(d，J＝7，5Hz，3H)；1，14(d，J＝6，5Hz，3H)；1，16(d，J＝7，0Hz，3H)；1，32(s，6H)；1，72(m，1H)；1，82(s，3H)；1，83(m 隐蔽，1H)；1，84(s，3H)；2，08(m，2H)；2，11(s 宽峰，3H)；2，15(dd，J＝6，5和13，5Hz，1H)；2，43(s，3H)；2，54(m，1H)；2，70(m，1H)；2，83(m，1H)；3，45(d，J＝6，0Hz，2H)；从3，59至3，69(m，2H)；5，00(dd，J＝4，0和7，0Hz，1H)；5，10(d，J＝10，5Hz，1H)；5，26(d，J＝10，0Hz，1H)；从5，54至5，64(m，2H)；5，70(dd，J＝7，0和15，5Hz，1H)；5，83(t，J＝6，0Hz，1H)；6，00(d，J＝10，5Hz，1H)；6，02(d，J＝15，5Hz，1H)；6，75(d，J＝15，5Hz，1H)；6，96(dd，J＝6，5和10，5Hz，1H).
实施例6：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺
Figure A200780021535D00291
向200mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基)-酰胺在7.7ml的四氢呋喃和3.85ml的水中的溶液中在近20℃温度下加入217.2mg的TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐)。在近20℃温度下16小时之后，将反应混合物用30ml的乙酸乙酯稀释，用15ml的水、15ml的盐水洗涤2次，用硫酸镁干燥，用烧结玻璃过滤，再在减压下在近40℃温度下浓缩。将所得黄色油通过柱色谱法在硅胶(20g SiO2，15-35μm，洗脱梯度为甲醇/二氯甲烷从1/99至10/90(以体积计))上纯化。在减压下在近40℃温度下将含有所需产物的级分浓缩。获得122.6mg的(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺为黄色玻璃状物，其特征如下：
质谱：
●ES+：m/z＝614：[M+H]+
●ES-:：m/z＝612：[M-H]-；m/z＝658：[M-H+HCOOH]-
在光谱仪BRUKER AVANCE DRX-500上获得的500MHz处的1HNMR光谱具有以下化学位移(δ，ppm)—以氯仿为溶剂-d1(CDCl3-d1)，参比7，27，温度303K：0，80(d，J＝6，5Hz，3H)；0，97(d，J＝6，5Hz，3H)；1，07(d，J＝7，5Hz，3H)；1，13(d，J＝6，5Hz，3H)；1，16(d，J＝6，5Hz，3H)；1，38(s，6H)；1，72(m，1H)；1，82(s，3H)；1，84(s，3H)；1，85(m 部分隐蔽，1H)；2，09(m，2H)；2，11(s，3H)；2，17(dd，J＝6，5和13，5Hz，1H)；2，54(m，1H)；2，70(m，1H)；2，83(m，1H)；3，38(d，J＝6，5Hz，2H)；从3，61至3，70(m，2H)；5，01(dd，J＝4，0和7，0Hz，1H)；5，09(d，J＝10，0Hz，1H)；5，26(d，J＝10，0Hz，1H)；5，59(dt 部分隐蔽，J＝7，5和15，5Hz，1H)；5，63(s，1H)；5，69(dd，J＝7，0和15，5Hz，1H)；6，00(d，J＝10，0Hz，1H)；6，02(d，J＝15，5Hz，1H)；6，04(t 部分隐蔽，J＝6，5Hz，1H)；6，75(d，J＝15，5Hz，1H)；6，97(dd，J＝6，0和10，0Hz，1H)。
抗体与细霉素衍生物的结合：
抗结肠癌抗体huC242与细霉素衍生物的结合：
Figure A200780021535D00301
制备人源化的抗结肠肿瘤抗体(huC242)与实施例6化合物的二硫化物连接的结合物(在本文称为实施例6的huC242-SSNPB-细霉素)。使该huC242抗体与6-倍摩尔过量的抗体修饰剂SSNPB(N-硫代琥珀酰亚胺基4-(5-硝基-2-吡啶基二硫代)丁酸酯)以9mg/ml的抗体浓度在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mM EDTA、5％二甲基乙酰胺)中在环境温度下反应90分钟。将反应混合物通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱纯化，该色谱在pH 6.5的含有50mM NaCl和2mM EDTA的50mM磷酸钾缓冲液中平衡。添加及不添加β-巯基乙醇分析该修饰的抗体样品，并确定每个抗体中具有掺入的～6个硝基吡啶基二硫代基团。将每个连接基团2-倍摩尔过量的细霉素-SH药物加入到该修饰的抗体样品中，该抗体为2mg/ml，在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mM EDTA、10％二甲基乙酰胺)中。反应后经分光光度法(394nm)和HPLC测定5-硝基吡啶-2-硫酮的释放。在环境温度下反应约90min之后，将该混合物通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mM EDTA)中纯化。在250nm/280nm处的吸收比，结合物为0.78，相比之下未修饰抗体为0.37，证明细霉素基团掺入到该结合物中(导致在250nm处吸收度增加)。
去糖基化huC242-细霉素结合物的质谱分析显示了147492、148212、148936和149660道尔顿处的结合物峰，其相应于每个抗体分子中掺入的1、2、3和4个细霉素分子。
抗-CD19(huB4)抗体与细霉素衍生物的结合：
抗-CD19抗体(人源化的B4抗体)与细霉素的结合物是用二硫化物和不可裂解的硫醚连接体制备的。第一样品(-S-S-连接体)包括抗-CD19(huB4)抗体，该抗体通过二硫化物连接体SSNPB(N-硫代琥珀酰亚胺基4-(5-硝基-2-吡啶基二硫代)丁酸酯)连接到实施例6的化合物。第二样品包括huB4抗体，该抗体通过马来酰亚胺连接体SMCC(N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺基-甲基)环己烷羧酸酯)连接到实施例6的化合物。
HuB4-SSNPB-细霉素结合物(实施例6的huB4-SSNPB-细霉素)：
Figure A200780021535D00311
使4mg的huB4抗体与7.5-倍摩尔过量的SSNPB连接体以8mg/ml的抗体浓度在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mMEDTA、5％二甲基乙酰胺)中在环境温度下反应90min。将反应混合物通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mM EDTA)中纯化。添加及不添加β-巯基乙醇分析该修饰的抗体样品，并确定每个抗体中具有掺入的5.3个硝基吡啶基二硫代基团。将每个连接基团3-倍摩尔过量的药物加入到该修饰的抗体样品中，该抗体为1mg/ml，在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mMNaCl、2mM EDTA、10％二甲基乙酰胺)中。反应后经分光光度法(394nm)和HPLC测定5-硝基吡啶-2-硫酮的释放。在环境温度下过夜反应之后，使该混合物在10mM柠檬酸缓冲液(pH 5.5，含有135mM NaCl)中通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱纯化。添加及不添加β-巯基乙醇分析样品，并确定每个抗体中具有4.3个反应的连接体。尺寸排阻色谱(SEC)分析显示95％单体抗体。
HuB4-SMCC-细霉素结合物：
Figure A200780021535D00321
使4mg的huB4抗体与7.5-倍摩尔过量的SMCC连接体以8mg/ml的抗体浓度在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mMEDTA、5％二甲基乙酰胺)中在环境温度下反应90min。将反应混合物通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mM EDTA)中纯化。掺入到样品中的马来酰亚胺(maleimide)基团的数目是通过添加过量的硫醇(半胱氨酸)来分析的，并确定每个抗体中具有3.3个连接基。将每个马来酰亚胺基团3-倍摩尔过量的实施例6的药物加入到该修饰的抗体样品中，该抗体为1mg/ml，在50mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5，含有50mM NaCl、2mM EDTA、10％二甲基乙酰胺)中。在环境温度下过夜反应之后，使该混合物在10mM柠檬酸缓冲液(pH 5.5，含有135mM NaCl)中通过Sephadex G-25尺寸排阻色谱纯化。SEC分析显示98％单体抗体。
去糖基化huB4-SMCC-细霉素结合物的质谱分析显示了145138、145860和146566道尔顿处的结合物峰，其相应于每个抗体分子中掺入的1、2和3个细霉素分子。
生物学结果：
通过WST-生存能力分析，实施例6的huB4-SSNPB-细霉素结合物对Ramos(CD19抗原—阳性)和HL60(抗原阴性)癌细胞的毒性评价分别显示出1.4 x 10-9M和4.2 x 10-9M的IC50值，由此证实了细霉素-抗体结合物的抗原特异性细胞毒活性。
实施例6的huC242-SSNPB-细霉素结合物对COLO 205(CanAg抗原—阳性)癌细胞和A375细胞的毒性评价，分别显示出1.3 x 10-10M和>5.0 x 10-9M的IC50值(图1)。
某些专利和出版的文献已在本公开中提及，它们的教导以其各自的全部内容通过引用各自并入本文。
虽然本发明已经详细地并参照其特定实施方案进行了描述，对于本领域技术人员明显的是，可以进行各种改变和修饰而不会脱离其精神和范围。

Claims (25)

1.细霉素衍生物，其包括能够使所述细霉素衍生物结合到细胞结合剂的连接基团。
2.根据权利要求1的细霉素衍生物，其中所述的连接基团包括硫醇键、硫化物键或二硫化物键。
3.根据权利要求1或2的细霉素衍生物，其中所述衍生物如式(I)：
Figure A200780021535C00021
其中：
Ra和Ra’是H或-Alk；
R17是任选被OR、CN、NRR’、全氟烷基取代的烷基；
R9是任选被OR、CN、NRR’、全氟烷基取代的烷基；
X是-O-或-NR-；
Y是-U-、-NR-U-、-O-U-、-NR-CO-U-、-U-NR-CO-、-U-CO-、-CO-U-；
其中U选自-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-、-(OCH2CH2)m-Alk-、-Alk(OCH2CH2)m-Alk-、-(OCH2CH2)m-、-环烷基-、-杂环基-、-环烷基-Alk-、-Alk-环烷基-、-杂环基-Alk-、-Alk-杂环基-；
其中m是选自1至2000的整数；
Z是-Alk-；
n是0或1；
T表示H，硫醇保护基团例如Ac、R1或SR1，其中R1表示H、甲基、Alk、环烷基、任选取代的芳基或杂环基，或者T表示
Figure A200780021535C00022
其中：
Ra、Ra’、R17、R9、X、Y、Z、n定义如上文；
R、R’相同或不同，是H或烷基；
Alk表示直链或支链的烷基；
或其药学可接受的盐、水合物、或水合的盐，或者这些化合物的多晶型晶体结构或其光学异构体、外消旋体、非对映体或对映体。
4.权利要求3所述的细霉素衍生物，其中Ra是-Alk，并且Ra’是H。
5.根据权利要求3或4所述的细霉素衍生物，其中R17是烷基。
6.根据权利要求3、4或5所述的细霉素衍生物，其中R9是烷基。
7.根据权利要求3至6任一项所述的细霉素衍生物，其中X是-NR。
8.根据权利要求3至7任一项所述的细霉素衍生物，其中Y是-U。
9.根据权利要求3至8任一项所述的细霉素衍生物，其中U是-Alk。
10.根据权利要求3至9任一项所述的细霉素衍生物，其中-Alk-是直链或支链的C1-C20烷基。
11.根据权利要求3至10任一项所述的细霉素衍生物，其中T是H或SR1，其中R1表示Alk。
12.根据前述权利要求任一项所述的细霉素衍生物，其选自：
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基硫烷基-乙基)-酰胺；
双-[(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯乙基)-酰胺]；
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-乙基)-酰胺；
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基二硫烷基-乙基)-酰胺；
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-甲基-2-甲基二硫烷基-丙基)-酰胺；
(2E，10E，12E，16Z，18E)-(R)-6-羟基-3，5，7，9，11，15，17-七甲基-19-((2S，3S)-3-甲基-6-氧代-3，6-二氢-2H-吡喃-2-基)-8-氧代-十九烷-2，10，12，16，18-五烯酸的(2-巯基-2-甲基-丙基)-酰胺；
或其药学可接受的盐、水合物、或水合的盐，或者这些化合物的多晶型晶体结构或其光学异构体、外消旋体、非对映体或对映体。
13.细霉素衍生物结合物，其包含通过连接体与一种或多种根据前述权利要求任一项所述的细霉素衍生物连接的细胞结合剂，所述连接体包含所述的连接基团。
14.权利要求13所述的细霉素衍生物结合物，其中所述的细胞结合剂是抗体或其片断。
15.权利要求13或14所述的细霉素衍生物结合物，其中所述的连接体包括-S-或-S-S-基团。
16.权利要求13、14或15所述的细霉素衍生物结合物，其中所述的连接体包括连接到对硫醇、硫化物或二硫化物有反应性的官能团的所述连接基团。
17.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至12任一项所述的细霉素衍生物和药学可接受的载体。
18.一种药物组合物，其包含根据权利要求13至16任一项所述的结合物和药学可接受的载体。
19.权利要求1至12任一项的细霉素衍生物用于制备治疗癌症的医药的用途。
20.权利要求13至16任一项的结合物用于制备治疗癌症的医药的用途。
21.制备权利要求3至12任一项的化合物的方法，其包括使式(II)和(III)相应化合物反应的步骤：
Figure A200780021535C00041
T—S—(Z)n—Y—XH
(III)
其中Ra、Ra’、R17、R9、X、Y、Z、T、n定义如式(I)。
22.制备权利要求3至12任一项的化合物的方法，其中在式(I)中T是H，该方法包括使其中的T是S-R1的式(I)相应化合物在二硫键的还原剂存在下反应的步骤。
23.制备权利要求3至12任一项的二聚体化合物的方法，其包括使式(II)相应化合物与式(IV)相应化合物反应的步骤：
HX-Y-(Z)n-S-S-(Z)n-Y-XH(IV)
24.制备权利要求13至16任一项的结合物的方法，其包括使权利要求1至12任一项定义的细霉素衍生物与修饰的细胞结合剂反应的步骤，所述的细胞结合剂包含对该衍生物的所述连接基团有反应性的官能团，以便该衍生物和该细胞结合剂通过所述连接体连接在一起，该连接体包含所述连接基团。
25.权利要求24所述的方法，其中所述修饰的细胞结合剂包含对该衍生物的所述连接基团有反应性的官能团，该修饰的细胞结合剂是通过使所述细胞结合剂与选自SMCC、SSNPB、LC-SMCC、SIAB、SIA、SBA、SBAP的试剂反应获得的。
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