BRPI0710791A2 - população de célula tronco renal, identificação e uso terapêutico - Google Patents

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Abstract

POPULAçãO DE CéLULA TRONCO RENAL, IDENTIFICAçãO E USO TERAPêUTICO. é descrita uma nova população de ccs renais que exibe co-expressão superficial dos marcadores CD133 e CD24, as ditas ccs possuem capacidade de cc tronco e são capazes de diferenciação tubulogénica, adipogênica, osteogênica e neurogênica.

Description

POPULAÇÃO DE CÉLULA TRONCO RENAL, IDENTIFICAÇÃO E USOTERAPÊUTICO
Campo da invenção
A presente invenção refere-se ao campo das célulastronco e sua utilização.
Estado da técnica
É bem conhecido que muitos órgãos adultos contêmcélulas tronco pluripotentes envolvidas na manutenção daintegridade tissular e nos processos de reparo.
A disponibilidade de células tronco renais capazes deregenerar tecido renal após dano é muito importante para aperspectiva de prevenção e terapia e qualquer tipo de danorenal. De fato, doenças renais agudas e crônicasrepresentam uma emergência de saúde pública tendo em vistasua relevância epidemiológica e os altos custos envolvidosem tratamentos substitutivos, tais como diálise etransplante.
Sumário da invenção
A invenção disponibiliza células tronco renaiscapazes de co-expressar em si os marcadores CD 133 e CD 24em sua superfície.
Breve descrição das figuras
A Figura 1 mostra a co-expressão de marcadores CD24 eCD133 de célula tronco e identifica uma sub-populaçãocelular na cápsula de Bowman de rins adultos humanos.A Figura 2 refere-se ao isolamento e caracterizaçãode células CD24+CD133+.
A Figura 3 mostra a capacidade proliferativa decélulas CD24+CD133+ em comparação com células CD24-CD133-.
A Figura 4 mostra a diferenciação de clones obtidos apartir de células CD24+CD133+ derivadas da cápsula deBowman a células tubulares epiteliais.
A Figura 5 mostra a diferenciação de clones obtidos apartir de células CD24+CD133+ derivadas da cápsula deBowman a osteoblastos e adipócitos.
A Figura 6 mostra a aquisição de propriedadesneuronais fenotípicas e funcionais por clones obtidos apartir de células CD24+CD133+ derivadas da cápsula deBowman.
A Figura 7 mostra células CD24+CD133+ de rim humanoimplantadas em rins de camundongos SCID afetados porinsuficiência renal aguda (ARF), e a geração de diferentestipos de células tubulares.
A Figura 8 mostra que células CD24+CD133+ protegemcamundongos tratados com glicerol contra deterioração daestrutura e função renais.
Descrição detalhada da invenção.
A presente invenção permite a superação do problemamencionado acima disponibilizando células tronco renaispluripotentes.
De fato, foi observado surpreendentemente que célulasrenais capazes de co-expressar os marcadores CD133 e CD24(CD24+CD133+) em sua superfície possuem capacidade decélula tronco.Identificação e isolamento de células tronco renaisVinte rins normais humanos foram examinados pormicroscopia confocal utilizando-se anticorpos monoclonaisanti-CD24 e anti-CDl33. Foi observado que o CD24, ummarcador para a população de células progenitorasembrionárias renais, é expresso seletivamente em células doepitéli o parietal da cápsula de Bowman e em uma sub-população de células tubulares epiteliais. O anticorpomonoclonal anti-CDl33, que identifica seletivamente célulastronco derivadas de vários tecidos humanos, detectou umasub-população de células da cápsula de Bowman e estruturastubulares raras (Fig. 1) . A imunofluorescência dupla paraCD24 e CD133 mostrou que os dois marcadores identificam umasub-população de células da cápsula de Bowman que éprincipalmente localizada no pólo urinário do glomérulo efreqüentemente se estende para a parte do túbulo maispróxima ao pólo urinário (Fig. 1). As mesmas células foramtambém rotuladas com o anticorpo monoclonal anti-CDl06. Nototal, estes resultados sugerem a existência, no rim adultohumano, de uma população celular no nível do epitélio dacápsula de Bowman e de uma população rara de célulastubulares, na qual diferentes marcadores de célula troncosão co-expressos, como mostrado na Figura 1, as váriasimagens dos quais são descritas abaixo em detalhe:
a) Marcação por imunofluorescência dupla, mostrando aexpressão de CD24 (vermelho) e CD133 (verde) em células dacápsula de Bowman de um rim de um indivíduo humano adulto.A superposição dos dois padrões de marcação (amarelo)mostram a co-expressão de CD24 e CD133 em uma sub-populaçãode células localizada no pólo urinário (UP, barra de 50μm). Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (azul) .
b) Marcação por imunofluorescência dupla, detectadano maior aumento, mostrando a expressão de CD24 (vermelho)e CDl33 (verde) em células da cápsula de Bowman. Asuperposição dos dois padrões de marcação mostra a co-localização de CD24 e CD133 no citoplasma e na membrana decélulas voltadas para o glomérulo (G), embora apenas o CD24seja expresso na membrana basal (amarelo, barra de 10 μm) .
Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (azul).
c) Detecção de CD133 com dois anticorpos monoclonaisanti-CDl33 diferentes. O anticorpo 293C3 (vermelho) e oanticorpo AC133 (verde) marcam a mesma sub-população decélulas na cápsula de Bowman. A imagem superposta,mostrando ambos os padrões de marcação, mostra a co-marcação das mesmas células (amarelo, barra de 50 μm) .
Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (azul).
d) Detecção de CD24 (vermelho), CD133 (verde) e CD29(azul) no nível dos glomérulos. A marcação de CD29 permitea identificação das arteríolas aferentes (AA). A imagemsuperposta mostra que CD24 e CD133 são seletivamente co-expressos em uma sub-população de células localizadas nolado oposto do pólo vascular (amarelo, barra de 50 μm) .
e) Marcação de imunofluorescência tripla, detectadano aumento maior, mostrando a expressão de CD24 (vermelho),CD133 (verde) e CD106 (azul) nas células da cápsula. Aimagem superposta mostra a co-localização de CD24 e CD133(amarelo) no citoplasma e na membrana de células voltadaspara o glomérulo (G) , embora CD24 e CD106 (cor púrpura)sejam co-expressos na membrana basal. Áreas visíveis deco-expressão de CD24, CD133 e CD106 são coloridas de branco(barra de 10 ym).
Células CD24+CD133+ foram então isoladas de maneira ase avaliar suas características morfológicas e funcionais.Para este propósito, o componente cortical do tecido renalfoi separado do componente medular e submetido aesmagamento. Os glomérulos foram isolados por uma técnicade separação padrão utilizando-se peneiras de diferentesporosidades. De maneira a se evitar a destruição dacápsula de Bowman células CD24+CD133+, a suspensãoglomerular não foi digerida, mas foi diretamente cultivadaem placas de plástico contendo EGM-MV suplementado com 20%FBS. Células provenientes dos glomérulos cultivados foramexaminadas para sua capacidade de formar agregadoscelulares assemelhando-se a neuroesferas e o fenótipo decélula tronco foi acessado por microscopia confocal eanálise citofluorimétrica conforme mostrado na Figura 2, asvárias imagens das quais são descritas abaixo em detalhe:
a) 0 primeiro painel à esquerda mostra células emproliferação provenientes de um glomérulo encapsulado emcultura (40x). As imagens subseqüentes obtidas pormicroscopia a laser confocal mostram que a população emproliferação expressa CD24 (verde). Contra-coloração dosnúcleos com To-pro-3 (azul). A imagem superposta mostraque as células em proliferação expressem quantidadesnotáveis de CD24 (barra de 100 μπι) .
b) Marcação por imunofluorescência dupla detectando aexpressão de CD24 (vermelho) e CD133 (verde), mostrando aco-localização seletiva dos dois marcadores na populaçãoderivada de células glomerulares em proliferação. Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (azul). A imagemsuperposta mostra marcação intensa de CD24 e CD133 nasmesmas células (amarelo, barra de 100 μm).
ç) Cultura primária de células da cápsula de Bowmanrepresenta uma população homogênea compreendendoaproximadamente 100% de células expressando CD24, CD133,CDl06, CD105 e CD44, e teste negativo para marcadores decélula endotelial CD31 e CD34. Uma análise por citometriade fluxo de uma cultura representativa é também mostrada.
d) Uma cultura primária derivada de célulasCD24+CD133+ da cápsula de Bowman não expressa marcadores delinhagem renal, tal como CD35 ou EMA-I, conforme mostradopor citometria de fluxo nos dois primeiros painéis. Émostrado, por microscopia confocal, que as mesmas célulasnão expressem THG (terceiro painel) e LTA (quarto painel)(barra de 100 |om) . Marcação histoquímica negativa parafosfatase alcalina (último painel). Uma culturarepresentativa é mostrada.
e) Determinação dos níveis de mRNA Oct-4 "RT-PCRquantitativa em tempo real" em culturas de célulasendoteliais, células renais tubulares, células mesangiais,podócitos, células do músculo liso, células CD24+CD133+ ecélulas HEK. Os resultados são expressos como média ± DPde determinações em triplicata realizadas em culturasprimárias de 5 diferentes doadores.
f) Determinação dos níveis de mRNA BmI-I por "RT-PCRquantitativa em tempo real" em culturas de célulasendoteliais, células renais tubulares, células mesangiais,podócitos, células do músculo liso, células CD24+CD133+ ecélulas HEK. Os resultados são expressos como média ± DPde determinações em triplicata realizadas em culturasprimárias de 5 diferentes doadores.
Células isoladas expressaram tanto CD24 quanto CD133,embora não expressem qualquer marcador hematopoiético(CD34, CD45), endotelial (CD31, CD34), podócito ou tubular(EMA-1, Lotus tetragonolobus, Dolichos biflorus, fosfatasealcalina) (Fig. 2).
De maneira a melhor definir as características decélula tronco das células isoladas, a expressão de Oct-4,um marcador de célula tronco embrionária típico, foiavaliada em conjunto com a expressão de BmI-I, um outrofator de transcrição crítico para a manutenção dacapacidade de auto-renovação de células tronco e para aprevenção de senilidade celular, desta forma demonstrando anatureza de célula tronco das células CD24+CD133+ (Fig. 2).Esta é também a primeira descrição de uma população decélulas renais que expressão os fatores de transcrição decélula tronco Oct-4 e BmI-I em cultura.
De maneira a se avaliar se células CD24+CD133+ tambémexibem propriedades funcionais de células tronco, as ditascélulas foram rotuladas em cultura com CFDA-SE e semeadasem EGM-MV suplementado com FBS 20%. Os dados daproliferação mostraram uma capacidade proliferativa muitomais alta das ditas células em comparação com outrascélulas renais que não expressão a combinação dosmarcadores CDl33 e CD24.
De fato, células CD24-CD133- (isto é, não expressandoCDl33 e CD24) foram preparadas a partir de tecido corticalde rim humano digerido com métodos enzimáticos (porexemplo, colagenase) para degradar o tecido conectivo,seguindo-se a separação por métodos imunológicos, emparticular métodos imunomagnéticos. Estas células foramentão semeadas no mesmo meio e, após a adesão, foramavaliadas por análise citofluorimétrica. Quando célulasÇD24+ÇD133+ foram semeadas com células ÇD24-CD133- nasmesmas placas de cultivo em uma proporção de 1:1, e emmeios diferentes, a proporção entre células CD24+CD133+ eCD24-CD133- se alterou para aproximadamente 9 para 1 apósapenas 10 dias de cultura (Fig. 3). De maneira a validaradicionalmente a evidência de que culturas de célulaCD2 4+CD133+ exibem propriedades funcionais característicasde células tronco, as ditas células provenientes deglomérulos em cultura foram separadas e células individuaisforam clonadas por limitação de diluição em placas "multi-poço" revestidas com fibronectina. Células CD24-CD133,obtidas por separação imunomagnética e também clonadas porlimitação de diluição em pacas "multi-poço" revestidas comfibronectina, foram utilizadas como controle; apenas ospoços contendo uma única célula foram avaliados. Opotencial clonogênico foi observado como sendo 41,3 ± 14%para células CD24+CD133+ obtidas a partir de culturasglomerulares e 2,1 ± 1,9 para células CD24-CD133-.Observe-se que os clones raros derivados de células CD24-CD133- resultaram de uma pequena contaminação de fundo comcélulas CD24+CD133+.
De maneira a se acessar a capacidade de célulasCD24+CD133+ cultivadas se diferenciarem em vários tipos decélula, clones individuais de célula CD24+CD133+ dediferentes doadores foram cultivadas sob condiçõesfavorecendo a diferenciação tubulogênica, adipogênica,osteogênica e neurogênica.
A diferenciação tubulogênica foi obtida por incubaçãoclones de célula CD24+CD133+ por 30 dias em meio de culturaREBM comercial, contendo SingleQuotes (hidrocortisona,hEGF, FBS, epinefrina, insulina, triiodotironina,transferrina e gentamicina/amfotericina-B) (Çambrex BioScience), suplementado com 50 ng/ml de HGF (Peprotech,Rocky Hill, NJ).
As diferenciações osteogênica, adipogênica eneurogênica dos clones de célula CD24+CD133+ foraminduzidas conforme previamente descrito. Para a induçãoosteogênica, células PEC CD24+CD133+ foram cultivadas emmeio α-MEM suplementado com soro eqüino 10%, contendoadicionalmente dexametasona 100 nM, ácido ascórbico 50 (JM edi β-glicerofosfato 2 mM (todos estes reagentes eram daSigma-Aldrich) . 0 meio de cultura foi substituído duasvezes por semana por 3 semanas. Para a diferenciaçãoadipogênica, células CD24+CD133+ foram incubadas em DMEM dealta glicose (hg) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendodi soro fetal bovino (FBS) , di dexametasona 1 μΜ, l-metil-3-isobutilxantina 0,5 μΜ (IBMX), 10 μg/ml de insulina eindometacina 100 μΜ (todos estes reagentes eram da Sigma-Aldrich) . Após 72 horas, o meio foi trocado para DMEM hgcom FBS 10%, contendo 10 μg/ml de insulina, por 24 horas.Estes tratamentos foram repetidos três vezes. As célulasforam então mantidas em DMEM hg com FBS 10% e 10 μg/ml deinsulina por mais uma semana. Para a diferenciaçãoneurogênica, células CD24+CD133+ foram semeadas em DMEM hgcom FBS 10%. Após 24 horas, o meio de cultura foisubstituído por DMEM hg com FBS 10%, contendo B27(Invitrogen) , 10 ng/ml de di EGF (Peprotech) e 20 ng/ml debFGF (Peprotech) . Cinco dias depois, as células foramlavadas e incubadas em DMEM suplementado com 5 μg/ml deinsulina, indometacina 200 μΜ e IBMX 0,5 mM, na ausência deFBS, por 5 horas. Foi realizada marcação co vermelho dealizarina, Oil-Red O ou fosfatase alcalina conformedescrito [ver Romagnani P. et al: "CDl4+CD341ow cells withstem cell phenotypic and functional features are the majorsource of circulating endothelial progenitors." Circ. Res.97: 314-322, 2005; Boquest AC et al. : "Isolatin andtranscription profiling of purified uncultured humanstromal stem cells: alteration of gene expression after invitro cell culture." Mol. Biol. Célula 16: 1131-1141, 2005;Pittenger MF et al. : "Multilineage potential of adult humanmesenchymal stem cells." Science 284: 143-147, 1999].
A diferenciação tubulogênica foi demonstrada com baseno acesso à aquisição de características de marcador decélulas epiteliais tubulares renais completamentediferenciadas, tais como fosfatase alcalina, aminopeptidaseA (principalmente expressa por células epiteliais do túbuloproximal), co-transportador de Na-Cl sensível a tiazida(principalmente expresso por células epiteliais dos túbulosdistais), EMA-I, Lotus tetragonolobus, Dolichos biflorus eaquaporinas 1 e 3. Estes marcadores foram detectados pormicroscopia confocal, análise citofluorimétrica edeterminação de mRNA por RT-PCR quantitativa (Fig. 4).
Os resultados são mostrados na Fig. 4, as váriasimagens dos quais são descritas abaixo em detalhe:a) Fotomicrografias representativas da marcaçãohistoquímica com fosfatase alcalina de células CD24+CD133+antes (dia 0) e após (dia 30) a incubação em meio decultura favorecendo a diferenciação tubular. Aumentooriginal: x65, x80 e x32 0, respectivamente.
b) Marcação com LTA antes (dia 0) e após (dia 30) aincubação em meio de cultura favorecendo a diferenciaçãotubular, conforme acessado por microscopia confocal(verde). Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (barrade 100 μιη) .
c) Expressão de THG antes (dia 0) e após (dia 30) aincubação em meio de cultura favorecendo a diferenciaçãotubular, conforme acessado por microscopia confocal(verde). Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (barrade 100 fim) .
d) Marcação dupla com LTA (verde) e THG (vermelho)mostrando a co-existência no mesmo clone de células co-expressando marcadores de diferentes segmentos tubulares(imagem superposta, amarelo) e células expressando ou omarcador tubular proximal ou o distai (barra de 100 (im) .
e) Determinação por RT-PCR de níveis aumentados demRNA para marcadores tubulares após 30 dias de cultura emmeio favorecendo a diferenciação tubular, em comparação comos valores obtidos com as mesmas células antes dadiferenciação. As colunas representem os valores médios ±DP obtidos depois da diferenciação de 50 diferentes clones.
f) Esquerda: fotomicrografias representativas dasimagens de fluorescência confocal. Imagens registradas a488 nm de comprimento de onda de excitação, antes e depoisda adição de angiotensina II (1 μΜ) (barra de 20 |im) .Direita: cinética no tempo das alterações na intensidade dafluorescência registrada em 5 células individuais de cadaum dos 10 diferentes clones examinados.
A diferenciação adipogênica foi demonstrada peloacesso à aquisição da morfologia celular característica e apartir da marcação positiva de vacúolos de lipídeo com Oil-Red O. Além disto, a RT-PCR quantitativa mostrou umaumento acentuado dos níveis de mRNA de adiponectina (Fig.5). A diferenciação osteogênica foi avaliada a partir dacapacidade dos clones celulares em formar colôniaspositivas para fosfatase alcalina; no curso dadiferenciação estas colônias se tornaram em nódulosmineralizados, conforme mostrado pela marcação com vermelhode alizarina que detecta depósitos celulares ricos emcálcio. A osteogênese foi comprovada adicionalmente pelaanálise da expressão de mRNA Runx2. Os resultados obtidosapós as diferenciações adipogênica e osteogênica sãomostrados na Fig. 5, as várias imagens dos quais sãodescritos abaixo em detalhe:
a) Esquerda: fotomicrografias representativas damarcação histoquímica com alizarina e fosfatase alcalinaantes (dia 0) e depois (dia 21) da incubação das célulasÇD24+CD133+ em meio de cultura favorecendo a diferenciaçãoosteogênica (xlOO). Direita: determinação dos níveis demRNA Runx2 antes (dia 0) e depois (dia 21) da incubação nomesmo meio de cultura. As colunas representam valoresmédios ± DP obtidos de 50 diferentes clones.
b) Esquerda: fotomicrografias representativas damarcação histoquímica com Oil red-0 antes (dia 0) e depois(dia 21) da incubação de células CD24+CD133+ em meio decultura favorecendo a diferenciação adipogênica (x200).Meio: Algumas células diferenciadas examinadas com o maioraumento (x320). Direita: determinação dos níveis de mRNAde adiponectina no dia 0 e após 21 dias de incubação nomesmo meio de cultura. As colunas representam valoresmédios ± DP obtidos de 50 clones diferentes.
A diferenciação neurogênica foi demonstrada com basena aquisição de morfologia semelhante a neurônio e altaexpressão, nos níveis de mRNA e proteína, da proteína tau,proteína associada a microtúbulo (MAP-2), enolase neuronalespecífica, nestina, colesterol-acetil transferase, beta-tubulina III e neurofilamento 200. Além disto, estudoselectrofisiológicos tornaram possível se demonstrar que ascélulas neuronais assim obtidas mostravam a presença decanais de cálcio e sódio dependentes de voltagem comcaracterísticas inteiramente semelhantes a neurônio, comomostrado na Fig. 6, as várias imagens dos quais sãodescritas abaixo em detalhe:
a) Ausência de marcadores neuronais NF2 00, NFM, ChATe MAP-2 antes da incubação das células CD24+CD133+ em meiofavorecendo a diferenciação neurogênica, acessada pormicroscopia confocal. Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3 (barra de 100 μιτι) . É mostrado um experimentorepresentativo.
b) Forte expressão dos marcadores neuronais NF200,NFM, ChAT e MAP-2 após a diferenciação das células no mesmomeio (verde). Contra-coloração dos núcleos com To-pro-3(barra de 100 μτη) . É mostrado um experimentorepresentativo.c) Aumento maior de um experimento representativo,mostrando a aquisição de morfologia neuronal típica, bemcomo marcação com ChAT (verde) em células CD24+CD133+cultivadas sob condições favorecendo a diferenciaçãoneurogênica (barra de 100 μπι) .
d) Determinação por "RT-PCR quantitativa em temporeal" dos níveis aumentados de mRNA para diferentesmarcadores neuronais após o cultivo das células sobcondições favorecendo a neurogênese, em comparação com osvalores das mesmas células antes da diferenciaçãoneurogênica. As colunas representam valores médios ± DPobtidos de 50 diferentes clones.
e-h) Correntes de Ca2+ e Na+ em neurônios derivados decélulas CD24+CD133+.
As correntes representativas foram registradas a umpotencial de -90 mV, impulsos de 1-s foram aplicados em umaescala de -80 a 50 mV com incrementos de 10-mV. Os dadosforam obtidos em diferentes tempos de amostragem (50 με nosprimeiros 100 ms e 1 ms para a duração restante do teste)de maneira a se detectar fenômenos rápidos e lentos e acinética no tempo da corrente Ica do tipo L de Ca2+; porrazões de clareza, apenas são apresentados os traços decorrente registrados a -60, -40, -20, 0, 20, 30 e 40 mV.f, A curva Ica-V foi determinada na corrente de pico (n =
26) . g, A cinética no tempo da corrente INa de Na+; apenassão apresentados os traços de corrente registrados a -60,-40, -30, -20, -10, 0, 20 e 30 mV; a linha vermelha indicaINa induzida a 0 mV na presença de TTX (1 μΜ) . h, a curvaIwa-V determinada na corrente de pico (n = 26) . f, h A linhacontínua superposta nos dados representa a função deativação:
<formula>formula see original document page 16</formula>
onde Gmax é a condutância máxima, Vrev é a inversão aparentede potencial, Va é o potencial que induz metade do aumentomáximo da condutância e ka é o fator de inclinação, i,Desativação da INa evocada a um potencial de -90 mV; sãoapresentados apenas os traços sem pré-impulso (-90 mV) ecom -70, -60, -30, -40 e -30 mV de pré-impulso. j, Curva dedesativação normalizada para INa, a linha contínuasuperposta nos dados representa a função de desativação:
<formula>formula see original document page 16</formula>
onde Vrh é o potencial que aciona a corrente metade damáxima e kh é o fator de inclinação para a desativação.Para comparação, a curva registrada à direita refere-se àativação.
De acordo com a invenção, células CD24+CD133+ foramtambém isoladas por purificação com separaçãoimunomagnética a partir de tecido renal total digerido comcolagenase, e o mesmo foi feito também para células CD24-CD133-.
Neste caso, as células de interesse foram obtidas porpurificação das célula em suspensão, obtidas como descritoacima, para CD133 e então para CD24 ou vice-versa. Destaforma, é possível se obter virtualmente todas as célulasCD24+CD133+. A população obtida por estes vários métodosconsiste em uma população mista de células da cápsula deBowman e de células derivadas de túbulos renais rarosexpressando CD133 e CD24. No total, a população de célulaCD24+CD133+ representa cerca de 0,5-9% de todas as célulasrenais residentes, e varia entre os indivíduos. Todos osexperimentos descritos acima foram também repetidos com umapopulação CD24+CD133+ obtida com os vários métodos deseparação imunomagnética listados acima, e confirmaram queos rins contêm uma população de células tronco adultasdotadas de capacidade regenerativa e de amplificação,caracterizadas pela co-expressão de marcadores CD133 eCD24, derivados principalmente do pólo urinário das cápsulade Bowman e por uma parte muito menor de células renaistubulares.
Além disto, a presente invenção refere-se acomposições para uso terapêutico, contendo células troncorenais que são capazes, conforme descrito acima, de co-expressar os marcadores CD133+ e CD24+ e dotadas decapacidade regenerativa tubulogênica, adipogênica,osteogênica e neurogênica.
Adicionalmente, a invenção refere-se ao uso das ditascélulas para a preparação de composições úteis para oreparo de danos renais.
Um modelo de necrose tubular aguda em camundongosSCID foi utilizado para testar se as células troncoidentificadas pelos depositantes, isoladas de rim humanoadulto, podem regenerar tecido renal danificado. Estemodelo envolve injeção intramuscular de glicerolhipertônico que provoca miólise maciça e hemólise,resultando em dano tubular severo e insuficiência renalaguda. O dano tubular tem seu máximo no terceiro dia apósa injeção e então regride espontaneamente depois de cercade 10 dias. A extensão do dano induzido foi avaliada pormarcação com hematoxilina/eosina, mostrando necrose extensadas células tubulares epiteliais, formação de cilindrostubulares de hialina, perda do bordo em escova dos túbulosproximais e achatamento do epitélio tubular.
Nos terceiro e quarto dias, um grupo de 8 camundongosfoi inoculado na veia da cauda com 1,5 χ 10^6 célulasCD24+CD133+, enquanto um outro grupo de 8 camundongos foiinoculado com solução salina e um terceiro grupo de 8camundongos foi inoculado com 1,5 χ 10^6 células CD24-CD133-renais, utilizando-se o mesmo procedimento. A integraçãodas células tronco CD24+CD133+ nos túbulos danificados foidemonstrada pela utilização de células rotuladas com ocorante fluorescente PKH2 6 (vermelho) e rotulagemsimultânea de túbulos proximais e distais com LTA ewAglutinina de Dolicholus biflorusn", respectivamente. Alémdisto, a integração da população de célula tronco nasestruturas tubulares foi confirmada por uma técnicaimunohistoquímica que faz uso do antígeno HLA-I específicopara células humanas e citoqueratina como marcador decélula epitelial geral. Por fim, o método FISH para ocromossomo Y foi utilizado para se detectar células renaisde doadores humanos masculinos inoculadas em camundongosfêmeas SCID. Os resultados de todos os três métodosmostraram integração seletiva de células CD24+CD133+ emtúbulos renais dos camundongos SCID injetados. Nenhumaintegração pode ser mostrada em camundongos injetados comsolução salina ou naqueles injetados com células CD24-CD133- renais humanas, como mostrado na Figura 7, as váriasimagens dos quais são descritas abaixo em detalhe:
a) Microscopia clássica mostrando tecido renal de umcamundongo normal marcado com hematoxilina/eosina (H&E,esquerda) ou com faloidina (verde, direita) (barra de 50μπι) .
b) Dano necrótico tubular observado após injeçãointramuscular de glicerol, como mostrado por marcação comH&E (esquerda) ou faloidina (direita) , com a últimamostrando perda do bordo em escova e achatamento dascélulas epiteliais (verde, barra de 50 μπι) .
c) Fotomicrografia representativa mostrando uma seçãode rim de um camundongo SCID com insuficiência renal agudainjetado com células CD24-CD133- renais humanas; a marcaçãocom LTA não mostra células marcadas de vermelho pormicroscopia confocal (barra de 20|±m).
d) Fotomicrografia representativa mostrando uma seçãode rim de camundongos com insuficiência renal agudainjetados com células CD24+CD133+ tratadas com o rótuloPKH26 (vermelho), marcadas com LTA (verde), conformemostrado por microscopia confocal. As setas pequenasindicam a presença de muitas células vermelhas. A setagrande indica um túbulo proximal (barra de 20 Mm) .
e) Aumento maior da seção de rim em d) mostrandoregeneração de uma estrutura tubular proximal (barra de 20Mm) .
f) Alimento maior de uma outra seção de rim obtida deum camundongo com insuficiência renal aguda injetado comcélulas CD24+CD133+ PEC tratadas com o rótulo PKH26(vermelho), e marcação com DBA na superfície basal de duasestruturas tubulares (verde), mostrando regeneração de umaestrutura de túbulo coletor (seta). Outras estruturastubulares marcadas com PKH2 6, mas não o marcador do dutocoletor DBA, são visíveis (barra de 20 |Xm) .
g) Marcação imunohistoquímica dupla paracitoqueratina (azul) e antígenos classe I HLA humanos(vermelho) em rins de camundongos SCID com insuficiênciarenal aguda induzida por glicerol (ARF). Painel esquerdo:ausência de sinal vermelho nos túbulos de uma seção de rimde um camundongo injetado com células CD24-ÇD133-; painéisdo ineio s direito: marcação celular positiva para osantígenos classe I HLA humanos (vermelho, setas) em túbulosexpressando citoqueratina (azul) de camundongos SCID cominsuficiência renal aguda (ARF) induzida por glicerol apósinjeção de células CD24+CD133+ PEC.
h) Detecção do cromossomo Y pela técnica FISH emcamundongos de controle injetados com solução salina(painel esquerdo) e em rins de camundongos fêmeas injetadascom células CD24+CD133+ obtidas de rins humanos masculinos(vermelho, painéis do meio e direito) (barra de 20 μπι) .
A identificação desta população no rim, e ademonstração de sua capacidade de reparação, têmimplicações importantes no campo da medicina regenerativa,para a terapia de patologias renais.
Finalmente, o potencial de reparo in vivo de umapopulação de célula tronco CD24+CD133+ renal pluripotente econseqüente recuperação da funcionalidade renal foramacessados por duas abordagens experimentais distintas. Defato, a azotemia foi determinada em vários momentos após ainjeção de glicerol, tanto em camundongos tratados comcélulas CD24+CD133+ e quanto naqueles injetados com sacsalina. Em comparação com os camundongos injetados comsolução salina, os camundongos tratados com célulasCD24+CD133+ mostraram, 14 dias após a injeção de glicerol,valores de azotemia significativamente mais baixos que eramtotalmente comparáveis com os valores medidos nos mesmoscamundongos antes da indução de dano renal. Além disto, apresença de áreas fibróticas foi avaliada por marcação"alfa-SMA" nos mesmos camundongos 14 dias após a injeção deglicerol. 0 grupo de camundongos submetido a injeção decélulas CD24+CD133+ mostrou uma extensão de áreasfibróticas significativamente menor em comparação com ogrupo de camundongos injetado com solução salina, comomostrado na Figura 8, as várias imagens dos quais sãodescritas abaixo em detalhe:
a. Os níveis de nitrogênio no sangue (BUN) foramdeterminados a vários intervalos nos camundongos tratadoscom glicerol que receberam solução salina (linha vermelha)ou células CD24+CD133+ (linha preta). As colunasrepresentam valores médios ± DP. η = 8 para cada ponto notempo; total 80 camundongos. *p < 0,01 e **p < 0,001 versusglicerol + solução salina nos mesmos tempos.
b. Comparação dos níveis de nitrogênio no sangue(BUN) entre camundongos sadios (branco), camundongostratados com solução salina (linha cinza) e camundongostratados com células CD24+CD133+ (cinza escuro) no dia 14.
c. Fotomicrografia representativa de rins decamundongos tratados com solução salina, marcados para apresença de α-SMA (verde) . Os núcleos são marcados com To-pro-3 (barra de 100 μπι) .d. Fotomicrografia representativa de rins decamundongos tratados com células CD24+CD133+ e marcadospara a presença de a-SMA (verde) . Os núcleos são marcadoscom To-pro-3 (barra 100 fim) .

Claims (7)

1. Células tronco renais caracterizadas pelo fato deco-expressarem os marcadores CD133+ e CD24+.
2. Células renais de acordo com a reivindicação 1caracterizadas pelo fato de serem originadas a partir dacápsula de Bowman.
3. Composição caracterizada pelo fato de compreendercélulas tronco renais de acordo com as reivindicações 1 e-2.
4. Processo para o isolamento de células troncorenais conforme definidas nas reivindicações 1 e 2,caracterizado pelo fato compreender as etapas de:- isolamento de glomérulos renais por uma técnica deseparação padrão empregando peneiras com diferentespermeabilidades;cultivar a suspensão glomerular assim obtidadiretamente em placas de plástico contendo EGM-MVsuplementado com FBS 20%;- isolamento de células provenientes dos glomérulosem cultura que expressam os marcadores CD133 e CD24.
5. Processo para o isolamento de células conformedefinidas nas reivindicações 1-2, caracterizado pelo fatode ser por separação imunomagnética a partir de tecidorenal total digerido com colagenase, utilizando-se osmarcadores CD133 e CD24.
6. Uso de uma população de célula tronco conformedefinida nas reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato deser na preparação de uma composição para o reparo de danosrenais.
7. Uso de uma população de célula tronco conformedefinida nas reivindicações 1-2, caracterizado pelo fato deser na preparação de uma composição para a regeneração dediferentes tipos de células residentes no rim.
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