BRPI0710599A2 - dispositivo de fluxo passante, biossensor e métodos para preparar um analito em uma amostra lìquida para detecção e para processar lìquido de amostra - Google Patents

Abstract

DISPOSITIVO DE FLUXO PASSANTE, BIOSSENSOR E MéTODOS PARA PREPARAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA LìQUIDA PARA DETECçãO E PARA PROCESSAR LìQUIDO DE AMOSTRA. Um dispositivo de fluxo passante aperfeiçoado é apresentado no qual a espuma produzida pelo bombeamento de fluido no dispositivo é mantida fora das câmaras de reação por intermédio de uma membrana porosa hidrófoba ou hidrófila atuando como uma membrana coletora de ar.

Description

"DISPOSITIVO DE FLUXO PASSANTE, BIOSSENSOR E MÉTODOSPARA PREPARAR UM ANALITO EM UMA AMOSTRA LÍQUIDAPARA DETECÇÃO E PARA PROCESSAR LÍQUIDO DE AMOSTRA"

A presente invenção trata da manipulação de fluidos, maisespecificamente de um dispositivo ou método para análise. Particularmente, apresente invenção refere-se a aparelhos para processamento direto ou análiseou diagnose tais como previstos em biorreatores, sensores ou partes debiossensores, e a métodos de utilização dos aparelhos em causa. Oprocessamento ou análise ou diagnose pode incluir hibridização ou aferra-mento de ligandos.

Biossensores são conhecidos para a análise de uma amostra.Tipicamente, amostras compreendendo uma análise são contatadas com umasonda específica, que pode ser detectada e/ou quantificada opticamente ou poroutros meios físicos. Os biossensores em causa fazem uso de métodos dedetecção que são baseados sobre a interação de (óligo) nucleotídeoscomplementares, antígeno-anticorpos, ligando-receptores ou outras interaçõesproteína-proteina específicas. Mais convenientemente as sondas ou analitossão imobilizadas sobre um suporte permitindo a separação física decomponentes potencialmente interferentes nas amostras ou reagentes. Entre ossuportes típicos se incluem placas de multipoços, membranas, colunas, ouchips produzidos de diferentes tipos de material suscetível de aferrar o analitoe/ou sonda de interesse.

A análise é freqüentemente conduzida de maneira a investigarquantitativamente a composição de uma amostra (líquida), particularmentecom relação à detecção da presença, ausência ou valor de seqüências de DNAou RNA específicas ou proteínas em uma amostra. Especialmente PCR, aReação de Cadeia de Polimerase, tem contribuído enormemente para odesenvolvimento de ensaios de todos os tipos para a detecção da presença ouausência de DNA ou seqüências de RNA. Atualmente é possível coletaramostras contendo DNA de um organismo e determinar a presença, ausênciaou proporção contida de seqüências de DNA específicas. Tecnologia édisponível para efetuar a dita análise para múltiplas seqüências de alvos aomesmo tempo, a denominada detecção multíplice de seqüências alvo para deesse modo aumentar o rendimento. Por exemplo, para a detecção de bactériasespecíficas em uma amostra de sangue ou semelhante, um método dedetecção é conhecido que é baseado sobre um método de multiplicação deDNA e a ligação deste DNA com moléculas traçadoras fluorescentes.Somente tipos específicos de DNA se ligarão com moléculas sondaespecíficas. A presença de DNA ligada é então detectada por meios ópticos,e.g. ativação por uma fonte de luz e detecção por uma câmera. A detecção dapresença, ausência ou valor de um gene, de um alelo, de um traçado genéticoou desordem, um polimorfismo, um polimorfismo de um único nucleotídeo(SNP) ou da presença de DNA o RNA exógenos em um organismo, isto é, apresença, ausência ou quantidade de patógenos ou bactérias em organismos.

Para processamento em larga escala e/ou temporalmenteeficiente de amostras, dispositivos foram desenvolvidos nos quais asdiferentes etapas de manipulação das reações de detecções (aplicação deamostra, lavagem, contato com a sonda) foram automatizadas. Rápidadiagnose e.g. de uma doença infecciosa em uma amostra de um paciente oude um contaminante em um lote de alimento pode ser crucial. Para realizarhibridização ou ligação mais rápida das configurações de fluxo passante dosreagentes foi proposta, hibridização de fluxo passante conforme descrita napatente US n2 5 741 647, baseia-se sobre o direcionamento do fluxo dasmoléculas reagindo através de uma membrana porosa sobre a qual as sondasde oligonucleotido alvo são imobilizadas. A taxa de ligação molécula éaumentada por ordens de grandeza uma vez que as interações molecularesocorrem em volumes tridimensionais mais exatamente do que em umasuperfície bidimensional convencional.Uma célula de fluxo passante utilizando fluxo alternativoatravés de um substrato previsto em um poço pelo qual o volume líquido dofluido de amostra é forçado a passar através dos canais no substrato a partir dolado superior do substrato para o lado inferior do substrato e de retorno pelomenos uma vez sob condições que são favoráveis para uma reação entrequalquer análito presente na amostra e a substância de ligação.

O documento WO A 03/005013 expõe um chip microarraybaseado em filtração. O chip microarray compreende um substrato defiltração micro poroso aleatoriamente orientado de ésteres de celulosecarregados e uma pluralidade de diferentes moléculas de captura de analitoespecíficas afixadas ao substrato em um micro conjunto. Em algumasmodalidades, este dispositivo pode apresentar formação de espuma emalgumas das câmaras ou canais. A espuma pode perturbar a mediação exatade analito.

Um dos objetivos da invenção é apresentar aparelhosalternativos ou aperfeiçoados para processamento ou análise ou diagnose porpassagem através tais como previstas em biorreatores, sensores ou partes desensores especialmente partes de biossensores, e a métodos de uso dosaparelhos em causa. O processamento ou análise ou diagnóstico pode incluirhibridização ou ligamento de ligandos. Uma vantagem do dispositivo emétodo da presente invenção, é que sua análise ou diagnóstico confiávelfacilita desenvolver remédios apropriados, e.g. o preparo de medicamentospara o tratamento de um mal diagnosticado. Por exemplo, a detecção em umaamostra (por exemplo), digamos de sangue de um organismo (p.ex. humano)de um patógeno (p.ex., uma bactéria) pode ser realizada mais efetivamente eprecisamente e conduzir a diagnose e ao correspondente tratamento (e.g.antibiótico).

Verificou-se surpreendentemente que a inclusão de pelo menosuma membrana porosa adicional no trajeto de fluido que conduz a umacâmara que é ligada com uma membrana porosa tendo sondas imobilizadassobre a mesma, reduz ou previne a formação de espuma.

De acordo com um primêiro aspecto, a invenção apresenta umdispositivo atravessante compreendendo um trajeto de vazão que inclui:

- uma primeira câmara;

- uma segunda câmara

- um substrato poroso entre a primeira e a segunda câmara; e

- um servo motor de fluxo de fluido assegurando a passagemdo líquido de amostra ao longo do trajeto de vazão da primeira para a segundacâmara através do dito substrato ou via um ou mais canais em torno dosubstrato;

no qual pelo menos um substrato poroso é assegurado entre a primeira esegunda câmara e pelo menos uma membrana porosa adicional é prevista notrajeto de vazão.

O dispositivo pode ser parte de um biorreator ou de umbiossensor. Uma membrana coletora de ar deste tipo ou filtro de ar odeauxiliar a prevenir que espuma se acumule e impeça o fluxo durantesubseqüentes ciclos de fluxo ou altere o trajeto de detecção óptica.

O dispositivo de preferência compreende um canal de retornoentre a primeira e a segunda câmara. A membrana poros de preferência éprevista entre a segunda câmara e o canal de retorno. Isto pode prevenir oacúmulo na primeira câmara (câmara superior da figura 1 ou 2).

A membrana porosa deve ter poros suficientemente pequenospara que a pressão capilar no interior da membrana seja mais alta que apressão pneumática usada para transferência do fluido. A membrana porosadeve ser umedecível e, por conseguinte, hidrófila quando são usados fluidosaquosos. Isto apresenta a vantagem de prevenir o acúmulo de espuma emfluidos biológicos comuns, que são aquosos e com freqüência contémdetergentes.O dispositivo pode ser disposto de forma que o fluido sejacirculado de forma.unidirecional entre a primeira e a segunda câmara. Umfluxo unidirecional simplifica a implementação do servo comando de fluxo defluido.

O dispositivo de preferência é adaptado para que o fluido seja

circulado ou recirculado da segunda câmara para a primeira câmara através deum canal de retorno. Isto admite um maior aproveitamento de reagentespermitindo um tempo de contato mais prolongado entre o substrato e o líquidode amostra.

Alternativamente, o servo comando de fluxo de fluido é

adaptado para circulação bidirecional para de essa maneira circular o fluidoda primeira para a segunda câmara e de volta da segunda câmara para aprimeira câmara através do substrato poroso. A circulação bidirecional nãosomente permite um melhor aproveitamento de reagentes permitindo umtempo de contato mais longo entre o substrato poroso e o líquido de amostra,porém, também assegura um misturamento superior.

Reagentes, moléculas de anal ita ou sondas podem serimobilizadas sobre ou retidas pelo substrato poroso. A imobilização/retençãopode permitir subseqüente detecção, e.g. por fluorescência, fosforescência,quimiluminescência, eletroluminescência, etc. Para análise de DNA ou RNA,o substrato de preferência é suscetível de covalentemente ou nãocovalentemente ligar oligonucleotídeos.

A presente invenção também pode apresentar um método parapreparar um analito em uma amostra líquida para detecção, cujo métodocompreende as etapas de:

a) imobilizar uma sonda suscetível de ligar-seespecificamente com o dito analito sobre um substrato poroso posicionadoentre uma primeira e uma segunda câmara de um dispositivo analítico;

b) transferir o líquido de amostra contendo o dito analito aolongo de um trajeto de vazão incluindo a primeira e a segunda câmara paradesse modo circular o líquido de amostra sobre o substrato poroso;

c) opcionalmente recircular o líquido de amostra para aprimeira câmara através de um canal de retorno;

no qual uma membrana porosa é prevista no trajeto de circulação de modo areduzir ou prevenir a formação de espuma em qualquer uma das câmaras oucanais como um resultado da dita transferência.

A presente invenção pode também apresentar um método paraprocessar uma amostra líquida, cujo método compreende as etapas de:

a) imobilizar um primeiro reagente sobre um substratoporoso posicionado entre uma primeira e uma segunda câmara de umdispositivo de fluxo passante;

b) transferir a amostra líquida contendo um segundo reagenteao longo de um trajeto de vazão que inclui a primeira e a segunda câmara paradesse modo circular o fluido líquido de amostra através do substrato poroso;

c) opcionalmente recircular a amostra liquida para a primeiracâmara através de um canal de retorno

em que uma membrana porosa é prevista no trajeto de vazão de modo areduzir ou prevenir a formação de espuma em qualquer uma das câmaras ocanais como um resultado da dita transferência.

Qualquer um dos aspectos característicos adicionais pode serconjuntamente combinado com qualquer um dos aspectos. Outras vantagensse evidenciarão aqueles versados na técnica, especialmente em relação à outratécnica anterior. Numerosas variações e modificações podem ser introduzidassem se afastar das reivindicações da presente invenção. Por conseguinte, deveser claramente entendido que a modalidade da presente invenção é meramenteilustrativa e não é proposta para limitar o âmbito da presente invenção.

Como a presente invenção pode ser posta em prática passa aser descrito a seguir a título de exemplo com referência aos desenhos, deacordo com os quais:

A fig. 1 ilustra um dispositivo de fluxo passante de acordocom uma modalidade da presente invenção compreendendo uma primeirauma primeira (2) e uma segunda (1) câmara, um substrato (3), um dispositivode pressão suscetível de bombear fluido através do substrato da câmara 2 paraa câmara 1 (20), um dispositivo de pressão suscetível de bombear fluidoatravés do substrato da câmara 1 para a câmara 2 (60), canais de bombeio, umcanal de retorno (6), e uma membrana porosa (5) posicionada no fundo dacâmara 1.

A fig. 2 mostra uma modalidade adicional do dispositivo defluxo passante da fig. 1.

As figs. 3a a h mostram sumários dos ciclos de bombeio quepodem ser usados com a presente invenção fazendo uso do dispositivo defluxo passante da fig. 1, especialmente dispositivos de fluxo passantemencionados nas modalidades específicas onde somente estão presentes querdispositivos de pressão (20) quer dispositivos de pressão (60).

A fig. 4 mostra um dispositivo de fluxo passante de acordocom outra modalidade da presente invenção compreendendo uma primeira (2)e uma segunda câmara (1), um substrato (3), um dispositivo prementesuscetível de bombear fluido através do substrato da câmara 2 para a câmara 1(60), canais de bombeio, um canal de retorno (6), e uma membrana porosa (5)posicionada no fundo da câmara 1.

A presente invenção será descrita com respeito à modalidadesespecíficas e com referência a determinados desenhos porém a invenção naestá limitada aos mesmos porém somente pelas reivindicações. Quaisquersinais de referência nas reivindicações na devem ser interpretados comolimitativos do âmbito.

Os desenhos descritos são somente esquemáticos e não sãolimitativos. Nos desenhos, as dimensões de alguns dos elementos podem estarexageradas e não representadas em escala para fins ilustrativos. Onde o termo"compreendendo" é usado na presente descrição e reivindicações, não excluioutros elementos ou etapas. Onde um artigo indefinido ou artigo definido aoreportar-se a um nome singular, e.g., 'um' ou 'uma', 'o' ou 'a', isto inclui umplural daquele nome salvo algo seja especificamente declarado.

Outrossim, os termos primeiro, segundo, terceiro esemelhantes na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguirentre elementos similares e não indispensavelmente para descrever umaordem seqüencial ou cronológica. Deve ser entendido que os termos assimusados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que asmodalidades da invenção aqui descritas são suscetíveis de operação em outrasseqüências além daquelas descritas ou ilustradas aqui. Particularmente, nadescrição, as modalidades e reivindicações, os termos "primeiro volume" ou"primeira câmara" e "segundo volume" ou "segunda câmara" devem serconsideradas intercambiáveis, elo fato de servirem exclusivamente paradiscernir os dois volumes ou câmaras. Por exemplo, virando o dispositivo decabeça para baixo, ou introduzindo o líquido de amostra no segundo volume,ou de qualquer outra maneira, os dois itens podem ser permutados.

Outrossim, a expressão "em comunicação fluídica" é propostapara significar que o fluido (líquido ou gás) é suscetível de contatar asuperfície ou volume simplesmente escoando-se no sentido daquela superfícieou para o interior daquele volume (sem passar por um substrato) como emvasos comunicantes. Não é proposto estar limitado aqueles casos em queefetivamente existe um fluido presente que contata a superfície ou estápresente no volume.

Outrossim, é observado que cada um do primeiro e segundovolume pode compreender um número de subvolumes, por exemplo, paraguiar líquido de amostra para diferentes partes paralelas do substrato comdiferentes substâncias ligantes, ou para mais de um substrato.Funcionalmente, e para a finalidade do presente documento, estes subvolumessão considerados ser um volume, quer um primeiro volume, quer um segundovolume.

A expressão "canal" inclui, para a finalidade da presenteinvenção, não somente trajetos de paredes retas de uma extremidade a outra,porém de preferência mais genericamente qualquer trajeto físico para fluidosentre uma e outra extremidade do substrato..Os ditos canais podem assimtambém compreender trajetos de fluido aleatórios, tais como trajetos curvosou irregulares, ramificações, uma coleção de vazios interligados no substrato,etc. O substrato pode assim compreender e.g. materiais tipo esponja tendo osditos vazios interligados,porém também falsos tecidos (non woven) tendonumerosos trajetos de fluido entre as fibras e assim por diante.

E explicitamente observado que a expressão "bomba"compreende, para a finalidade da presente invenção, tanto bombas ativascomo passivas. Aqui, a designação de "bomba passiva" é proposta parasignificar um dispositivo que compreende uma câmara fechada ou semelhantecom um volume variável, tal como um volume de bomba com uma paredeflexível. Aqui, uma bomba deste tipo é designada de passiva uma vez que nãoacumula ativamente uma pressão, porém, serve para passar adiante umapressão exercida por outra bomba externa. Bombas ativas são suscetíveis deestabelecer uma diferença de pressão por si própria. Em outras palavras, uma"bomba" no presente contexto refere-se a um espaço fechado com uma partemóvel para variar o volume da parte.

A presente invenção refere-se a um dispositivo de fluxopassante para processar, e.g. analisar, um líquido de amostra. A análise podeser quanto à presença ou proporção de um analito no líquido de amostra. Umacélula de fluxo passante de acordo com uma modalidade da presente invençãoé ilustrada esquematicamente na fig. 1 e uma parte de uma modalidade dodispositivo é mostrada na fig. 2. A célula de fluxo passante tal como mostradana fig. 1 ou fig. 2 pode ser parte de um dispositivo de bio-processamento talcomo um biorreator ou um conjunto sensor ou detector, e.g. na forma de umcartucho para diagnose molecular. A célula compreende um substrato porosotendo uma primeira superfície 12 e uma segunda extremidade oposta 14, osubstrato 3 tendo uma pluralidade de canais atravessantes da primeirasuperfície para a segunda superfície. Opcionalmente, o substrato 3 pode sermunido pelo menos parcialmente de uma substância ligante específica para oanálito. Uma primeira câmara 2 ou primeiro volume está em comunicaçãofluídica com a primeira superfície, uma segunda câmara 1 ou volume está emcomunicação fluídica com a segunda superfície, e um dispositivo premente talcomo um fluido pressurizado ou bomba é previsto para estabelecer umadiferença de pressão entre a primeira câmara 2 e a segunda câmara 1. Porexemplo, a bomba pode ser operativamente conectada com a primeira câmara.

Na modalidade da presente invenção uma bomba é designadapelo numerai de referência 20. O canal de retorno 6 conecta a segunda câmara1 e a primeira câmara 2 através da primeira abertura 32 e da segunda abertura30, e pode ser fechado por intermédio da válvula de canal de retorno opcional24. Quando somente a bomba 20 está presente, a válvula 24 é exigida paracriar sobrepressão na primeira câmara 1. A válvula 24 é aberta para liberarpressão para que o fluido retorne através do canal 6 da segunda câmara 1 paraa primeira câmara 2. O dispositivo de introdução de líquido de amostra 26pode ser fechado por intermédio da válvula de admissão 28.

Em uma modalidade da presente invenção a bomba 20compreende um volume de bomba 40 e um contra volume 42 com umaabertura de admissão de pressão 44, e é dividido pela membrana flexível 46.

O substrato poroso 3 ode ser qualquer tipo apropriado desubstrato conhecido na técnica. Por exemplo, falsos tecidos (non-woven),substratos baseados sobre fibras ocas polidas e atacadas por corrosão de vidroou de outros materiais podem ser usados, substratos eletro formados, e assimpor diante. De preferência, o substrato é pelo menos parcialmente transparentepara radiação, de preferência radiação óptica, tal como ultravioleta, luz visívelou infravermelha. Isto aperfeiçoa as possibilidades de detecção para osubstrato.

O dispositivo de introdução de líquido de amostra 26 foiindicado somente muito esquematicamente a título de um tipo de canal deintrodução. Em princípio, qualquer dispositivo de introdução desejadoconhecido no estado da técnica pode ser previsto. O dispositivo de introduçãode líquido de amostra 26 pode ser cerrado por intermédio da válvula deadmissão 28. Observe-se que, quando a válvula de admissão 28 está fechada,o dispositivo da fig. 1 compreende um sistema completamente fechado,compreendendo as câmaras 1, 2 e 40. Isto reduz grandemente o risco decontaminação.

A célula de fluxo passante pode ser operada como segue deacordo com uma modalidade da presente invenção. O líquido de amostra éprimeiramente inserido no interior da câmara superior 2. Aplicando pressãode fluido acima do líquido na câmara 2, o líquido de amostra, e.g. contendoum analito, e.g. um polinucleotídeo em uma célula-tampão de hibridização, ébombeado da câmara superior 2 para a segunda câmara inferior 1 através deum substrato poroso 3. Entidades químicas ou biológicas tais como sonda, oureagentes ou moléculas de analito usualmente serão retidas por, ouimobilizadas sobre o substrato. Por exemplo, no contexto de detecção deDNA, o substrato poroso 3 retém ou imobiliza sondas de captura. Um ciclo debombeio é completado aplicando diferença de pressão fluídica entre o líquidode amostra na câmara Iea câmara 2 que força o fluido para o interior dacâmara Iea seguir o bombeando de volta para a câmara 2 através do retorno6. A diferença de pressão entre a câmara 1 e 2 pode ser construída utilizandoduas câmaras de pressurização e pressões positivas alternadas para acionarpositivamente o fluido ou utilizando uma câmara e alternar pressões negativae positiva. Em ambos os casos diferenças de pressão são geradas entre ascâmaras 1 e 2 para desse modo forçar o líquido a se deslocar entre elas. Emuma aplicação típica tal como detecção de DNA este ciclo de bombeio érepetido aproximadamente 30 vezes. Devido às pequenas dimensões dosporos no substrato poroso (resultando em uma alta relação desuperfície/volume) e o tempo de contato estendido entre moléculas alvo esondas de captura como um resultado dos numerosos ciclos de bombeio, orendimento de captura de moléculas alvo (e.g. em experimentos dehibridização) é muito alto.

O substrato 3 compreende canais diretos, conectando aprimeira câmara 2 com a segunda câmara 1. Se o substrato está molhado,pode apresentar uma alta pressão de bolhas. Aqui, a pressão de bolhasrelaciona-se com a diferença de pressão através do substrato que é requeridapara bombear gás através do substrato. Para sua realização, o fluido nosubstrato tem de ser deslocado contra a ação capilar dos poros no substrato.Esta pressão de bolhas de preferência é muito mais alta que a pressão debombeio de líquido de amostra, que é tomada para ser a pressão que permite olíquido a passar através do substrato. Muitos substratos que podem ser usadospara o substrato 3 apresentam uma pressão de bolha da ordem de vários bars,ao passo que a pressão de bombeio do líquido de amostra é da ordem devárias dezenas de milibares até várias centenas de milibares, emboranaturalmente outros valores sejam possíveis. Tudo isto depende entre outrosfatores da pressão capilar nos canais dentro do substrato 3. É observado queos dispositivos descritos abaixo para uso com a presente invenção são emprincípio apropriados para substratos 3 com uma alta pressão de bolhas,embora possam ser usados para substratos dotado de pressões de bombeiolíquido comparáveis e pressões de bolhas, caso necessário.

As ditas altas pressões de bolhas permitem bombear o líquidode amostra que é recolhido num lado do substrato 3, através do substrato 3,para o lado oposto do mesmo. Nele, o líquido de amostra egressa do substrato.Em outras palavras, o substrato é contatado pelo gás no lado oposto. Assim,se a seguir a pressão (diferença de) fosse invertida, somente gás seriabombeado através do substrato. Todavia, devido a maior pressão para istoexigida, isto não ocorrerá, e a pressão aumentará na segunda câmara 1. Emoutras palavras, o substrato 3 atua como uma válvula unidirecional, de talmodo que o líquido de amostra tem de ser descarregado do segundo volumepelo aumento da pressão de gás acima do líquido na segunda câmara 1.

A exposição acima de passar líquido e/ou gás através dosubstrato 3 particularmente se aplica para um posicionamentosubstancialmente horizontal do substrato 3 quando em uso. Quandoposicionado horizontalmente, o substrato 3 pode ser molhado por igual, elíquido passa mais ou menos homogeneamente através do substrato 3. Istotem uma influência positiva sobre a homogeneidade e precisão de detecção.Não obstante, o substrato 3 pode ser posicionado inclinado ou mesmoverticalmente, embora isto possa influenciar a homogeneidade de detecção.

No caso de um substrato 3 no qual a pressão de bolhas e apressão de bombeio do fluido não diferem substancialmente, isto nãofunciona corretamente, pois gás pode passar através deste substrato de formarelativamente fácil. Assim, como uma opção, pelo menos uma dentre aprimeira câmara e a segunda câmara compreende um volume de contatodiretamente em contato com o substrato, um volume reservatório e umaválvula entre o volume de contato e o volume reservatório. Esta opção, comum volume divisível, permite o uso de um substrato dotado de uma pressãorelativamente baixa denominada pressão de bolhas, quando comparada com apressão de bombeio de líquido para bombear um líquido de amostra atravésda amostra. O líquido de amostra bombeado através do substrato no sentidodo volume no segundo lado ou lado oposto do substrato, não se acumulará novolume diretamente em contato com o segundo ou lado oposto, isto é, ovolume de contato, porém passará através da válvula, aqui às vezes designadade válvula de volume de contato, e se acumulará no volume de reservatório. Aválvula de volume de contato pode assumir a função de alta pressão de bolhasde outros substratos paro fechamento do volume de reservatório. Todas asoutras funcionalidades de outras modalidades aqui mencionadas podem entãotambém se aplicar a substratos com pressões de bombeio não muito diferentese pressões de bolhas. Em outras palavras, a modalidade com o segundoexemplo compreendendo um volume de contato, um volume reservatório euma válvula de volume de contato é ainda mais versátil quanto à seleção desubstrato, todavia ao custo de uma contagem de partes mais elevada.

Como descrito acima, um substrato que, quando molhado, porexemplo, pelo líquido de amostra, tem uma alta pressão de bolhas, o substratopode funcionar como uma barreira de gás, enquanto permitindo a passagemde líquido através do mesmo. Assegurando uma pressão (diferença de) entre aprimeira câmara 2 e a segunda câmara 1 que está entre a pressão de bolhas e apressão de bombeio do líquido de amostra, o líquido de amostra serábombeado através do substrato enquanto o gás é ainda aprisionado pelosubstrato. Assim uma propriedade intrínseca do substrato é que ele tambémpode funcionar como uma "membrana coletora de ar".

Vantajosamente, a pressão de bolhas é pelo menos 10% maisalta, de preferência pelo menos 50% mais alta, e ainda mais preferivelmentepelo menos 200% mais alta que a pressão da bomba de líquido de amostra.Quando a pressão de bolhas é pelo menos 10% mais alta, é relativamente fácilestabelecer uma diferença de pressão conveniente entre a pressão de bombeiode líquido de amostra e a pressão de bolhas, permitindo fluido a fluir semfluxo de gás. Outrossim, variações não demasiadamente críticas quer de umaquer de ambas da pressão de bolhas e da pressão de bombeio, e.g., devido àmaterial ligante no substrato, não afetam o correto funcionamento dodispositivo. Quando a pressão de bolhas é pelo menos 50% mais alta, é nãosomente fácil estabelecer uma diferença de pressão de trabalho, porém adiferença de pressão pode ser selecionada de tal maneira que a taxa de vazãode líquido de amostra está em uma faixa útil, uma vez que uma diferença depressão mais alta assegura uma taxa de vazão mais alta. Particularmente,quando a pressão de bolhas é pelo menos 200% mais alta que a pressão debombeio de líquido de amostra, uma vazão de liquido de amostra muito útilpode ser estabelecida. Observe-se que outras diferenças relativas entre apressão de bolhas e a pressão de bombeio de líquido de amostra podem aindaconduzir a resultados úteis.

Na exposição acima somente diferenças relativas formaexpostas. É alternativamente também possível selecionar o substrato de talmodo que a diferença absoluta entre a pressão de bolhas e a pressão debombeio de líquido de amostra seja alta quanto possível, ou pelo menos maisalta que um valor desejado. Particularmente, porém sem limitação, a pressãode bolhas é pelo menos de 100 mbar, de preferência pelo menos 1 bar maisalta que a pressão de bombeio de líquido de amostra, para um substratomolhado, com vantagens similares como mencionado acima. Mais uma vez,outras diferenças também podem conduzir a resultados desejáveis.

Em modalidades específicas, o dispositivo compreende umaparede em torno de pelo menos uma da primeira câmara 2 e da segundacâmara 1 que é pelo menos parcialmente transparente. A dita parede pelomenos parcialmente transparente permite a detecção óptica, e.g. de DNAsendo delimitado a sondas opticamente variáveis, etc. sobre o substrato 3 semefetuar sua remoção do dispositivo. Naturalmente, simples inspeção visualtambém pode ser permitida por uma parte transparente desta natureza.

Transparente é proposto para compreender pelo menos,transparente à luz visível, e/ou a ultravioleta e/ou à radiação infravermelha,embora transparência para outros tipos de radiação seja também contemplada.

A parede pelo menos parcialmente transparente pode ser prevista como omaterial da parede propriamente dita, como uma parte transparente separadaem uma abertura na parede (isto é, uma janela), etc.

Nas modalidades da presente invenção, o dispositivoadicionalmente compreende um sistema de detecção. O assegurar um sistemade detecção torna o dispositivo como um todo mais versátil, e é mais fácilcasar o dispositivo de análise com produtos específicos a serem detectados. Odispositivo de detecção pode propriamente dito compreender uma janelatransparente, ou ser dotado de uma posição operativa com respeito a umajanela, um orifício na parede, etc..

O dispositivo de detecção pode compreender qualquer sistemade detecção conhecido apropriado, tal como um sistema de detecção óptico,e.g. detecção fluorescente. Se desejado, o dispositivo de análise, e/ou odispositivo de detecção, pode compreender partes adicionais, tal como umafonte de luz, um filtro, etc. requerido para seu funcionamento, e.g. detectar oanalito associado com o material ligante. Estas partes adicionais são somenteopcionais no dispositivo de análise.

O dispositivo pode detectar baseado sobre rótulo,comprimento, mobilidade, seqüência de nucleotídeo, massa ou umacombinação dos mesmos. Em determinadas modalidades o dispositivo podedetectar baseado sobre princípios ópticos, eletroquímicos, magnéticos. Emprincípio qualquer dispositivo de detecção conveniente conhecido da técnicaprecedentemente existente pode ser usado.

As modalidades do dispositivo de acordo com a presenteinvenção também podem opcionalmente compreender um dispositivo coletorde dados para recolher dados obtidos do dispositivo de detecção, ou tambémpodem compreender opcionalmente um dispositivo processador de dados paraprocessar os dados.

Para permitir a introdução de amostra líquida o dispositivodescrito acima pode adicionalmente compreender um dispositivo deintrodução de líquido de amostra. Este dispositivo de introdução de líquido deamostra não é considerado ser uma limitação sobre a presente invenção. Podepor exemplo compreender simplesmente um a abertura de introdução e/ou umcanal de introdução, de preferência com uma válvula de fechamento. Após5introduzir o líquido de amostra, a válvula pode ser fechada, e um dispositivocompletamente fechado é assegurado ou pelo menos possível. Qualquer outraimplementação do dispositivo de introdução de líquido de amostra é incluídodentro do âmbito da presente invenção, e.g. aqueles permitindo a introdução(substancialmente) isenta de contaminação de um líquido de amostra.

Opcionalmente, o dispositivo da invenção é substancialmentefechado. Naturalmente, durante a introdução do líquido de amostra, existeuma conexão com outra parte do sistema ou com o mundo exterior. Todavia,é contemplado que um dispositivo de acordo com a presente invenção possaser pelo menos substancialmente completamente cerrado, por intermédio dedispositivos de fechamento existentes sobre ou no dispositivo. Isto pode serrealizado, e.g. pelo fornecimento de válvulas sobre todos os canais possíveispara o ambiente. Um dispositivo deste tipo pode proporcionar análise commenor risco de contaminação, ex.g. através de DNA exógeno de um operador.

Mais especificamente, a invenção pode ser implementadacomo um cassete substancialmente fechável compreendendo o dispositivo defluxo passante de acordo com a invenção. Um cassete deste tipo depreferência é compacto e portátil, tal modo que possa ser facilmenteempregado para uso in situ. De preferência pode compreender qualquer outrodispositivo desejado, tal como o armazenamento de fluidos, de uma ou maisbombas, etc. tal como descrito no presente pedido, ou de outro modoconhecido daqueles versados na técnica. Vantajosamente, o cassete édescartável, de maneira a prevenir a contaminação ao reutilizar um cassetedessa natureza. Será ainda possível, todavia, proporcionar um cassetereutilizável de acordo com a presente invenção.Opcionalmente, o canal de retorno 6 permite líquido deamostra escoar-se para o interior da primeira e/ou segunda câmara oposta aosubstrato 3. Isto permite aproveitamento ideal de p.ex. a gravidade pararecolher o líquido de amostra, e assegurar efetivo bombeamento do líquido deamostra. Este efeito é aperfeiçoado ainda mais se a parede em torno daprimeira câmara e/ou a parede em torno da segunda câmara tiver um perfilque se afila no sentido de uma respectiva abertura na parede, que conecta arespectiva câmara com o canal de retorno como mostrado, por exemplo, nafigura 2 para a câmara inferior 1. Assim a parte inferior quer da primeira querda segunda câmara pode ser troncônica em forma. Isto reduz o risco que aamostra líquida permaneça para trás na primeira ou segunda câmara.

Todavia, uma deficiência do dispositivo descrito acima residena formação de espuma quando o fluido é bombeado, e.g. de volta da câmara1 para a câmara 2. A espuma pode ser formada no canal de retorno 6 devidoao misturamento do líquido com o fluido, e.g. ar comprimido, usado para obombeio. A espuma pode encher ambas as câmaras por completo e pode seescapar para outras partes do dispositivo, e.g. as câmaras de bombeio,causando perda de fluido e redução em eficiência, e.g. no rendimento dehibridação.

A espuma pode se formar devido ao misturamento de líquidocom um gás tal como o ar usado para aplicar pressão no canal de retorno.Eventualmente a espuma pode encher significativamente ou por completoambas as câmaras e após escapar-se para outras partes do sensor ou conjuntodetector, e.g. para outras partes de um cartucho de diagnose molecular. Apresença de bolhas de ar sobre o substrato afetará o rendimento da reaçãoentre os reagentes e/ou moléculas de analito e/ou as sondas, dependendo dequal destas é fornecida sobre o substrato e pode obstruir o trajeto de luz ópticapara detectar as moléculas capturadas. Onde o fluido é repetidamentecirculado através do disco, isto pode resultar na perda de todo o fluido após 2a 3 ciclos e assim prevenir a reação ou ligação dos reagentes e das moléculasde analito e/ou das sondas, dependendo de quais se situam sobre o substrato.

De acordo com a presente invenção, um aperfeiçoamento deum dispositivo de fluxo passante é apresentado, que se endereça ao problemade formação de espuma. O dispositivo de fluxo passante que pode ser parte deum dispositivo de bio-processamento tal como um biorreator ou um conjuntode reator ou detector, na forma de um cartucho para diagnose molecular comomostrado esquematicamente nas figs. 1 e 2 possui uma membrana adicional(5) designada aqui de "membrana coletora de ar" prevista no trajeto de fluxode líquido de amostra. De acordo com a presente invenção, a formação deespuma após a circulação, e.g., bombeamento de reagentes líquidos, oulíquido contendo moléculas ou sondas ao longo de um trajeto de vazão queinclui a câmara 1 e câmara 2 pode ser prevenida usando uma membranacoletora de ar 5 que é uma membrana porosa suscetível de reter o arimpedindo o mesmo de ser forçado através de fluidos e de capturar as bolhasde ar que são geradas pelo fluxo de fluido. A captura de ar pela membrana érealizada limitando ou controlando a pressão sobre o fluido e/ou assegurarque a dimensão dos poros seja tal que o líquido é permitido a passar atravésda membrana ao passo que o ar não pode penetrar no interior da membrana.

De preferência, a faculdade umectante da membrana para o líquido deamostra deve ser boa, de tal modo que o líquido permaneça como umrevestimento sobre as superfícies internas da membrana às pressões aplicadas.

A membrana coletora de ar de preferência é situada emalgumas modalidades na saída de pelo menos uma das câmaras 1 e/ou 2. Porconseguinte, em uma modalidade uma membrana coletora de ar 5 é aplicadano fundo da segunda câmara 1 onde o líquido de amostra egressa para o canalde retorno 6 ou o escape. Todavia, uma membrana coletora de ar adicionalpode ser colocada na saída da primeira câmara 2 para a segunda câmara 1.Esta segunda membrana coletora de ar também pode ser proporcionada pelosubstrato poroso 3 em uma modalidade. De acordo com uma modalidadeespecífica, a circulação no dispositivo é unidirecional de uma câmara paraoutra, e.g. da câmara 2 para a câmara 1. O fluido é opcionalmente recicladopara a câmara 2 por intermédio de um canal de retorno 6 separado ou canaisligando a câmara Iea câmara 2. Enquanto transferindo o fluido da câmara 2para a câmara 1, o fluido passa sobre ou através do substrato poroso 3. Otrajeto de retorno ao longo do canal ou canais de retorno 6 evita o substrato 3.Nesta configuração, a membrana coletora de ar 5 pode ser posicionada em ouadjacente à saída da câmara 1 ou na entrada para a câmara 2. Por exemplo amembrana 5 pode ser localizada entre um servo comando de fluxo de fluidotal como uma bomba e a saída da câmara 1 ou a entrada da câmara 2. Maisespecificamente, onde o servo comando de fluxo de fluido está localizadoabaixo da câmara 1, a membrana coletora de ar 5 está posicionada no fundoda câmara 1 como mostrado na figura 2.

A membrana coletora de ar 5 usada no contexto da presenteinvenção pode consistir de material poroso que seja quer hidrófilo querhidrófobo dependendo do fato do líquido de amostra que passa através damembrana ser baseado em água ou baseado em solvente orgânico. Amembrana deve ser selecionada de tal modo que fluido molhe a superfície damembrana. Em uma modalidade a membrana 5 consistirá de-um material, quenão adsorva reagentes usados nas câmaras do dispositivo da invenção. Emoutra modalidade a membrana coletora de ar 5 pode conter vários sítios quepossam adsorver compostos que possam interferir com o método de captura.Por exemplo, iniciadores (rotulados) que não foram usados para amplificaçãopodem ser capturados que reduzem sinais de fundo sobre o substrato decaptura 3. Alternativamente, sondas de captura podem ser previstas queremovem fios de amplicon que não são rotulados. Tipicamente, o líquido deamostra a ser passado através da membrana 5 será aquoso, e.g. quando oaparelho é usado com fluidos biológicos. Exemplos de materiais apropriadospara a membrana coletora de ar da presente invenção incluem porém estarlimitados a membranas de metal de prata, óxido de alumínio, nitroceluloseopcionalmente reforçada com nylon, poliétersulfona, policarbonato (PCTE),PTFE, PVDF, ou poliésteres. Alternativamente, nylon ou ésteres de celulosemisturados podem ser usados. Os materiais podem ter sido revestidos ousuperficialmente tratados para alterar suas propriedades umectantes. Umexemplo de um tratamento que pode alterar as propriedades da superfície deum polímero é a descarga corona ou plasma que pode aumentar o caráterhidrófilo da superfície. Entre outros tratamentos de superfície se incluemrevestimentos, e.g. revestimentos hidrófílos. Exemplos de membranas porosasão apresentados no pedido EP 1239000, intitulado "Membranas HidrófilasPorosas", que se relaciona com membranas porosas hidrófilas e um métodopara sua preparação. As membranas têm uma alta permeabilidade aquosa,sendo facilmente molháveis pela água, e no estado molhado apresentam umapermeabilidade a gás muito mais baixa do que quando no estado nãomolhado.

A dimensão dos poros da membrana coletora de ar da presenteinvenção deve ser bastante pequena para que a pressão capilar no interior damembrana seja maior que a pressão pneumática usada no sistema parabombeio. De acordo com uma modalidade específica, a dimensão dos porosoé de 1 μ para uma pressão de bombeamento de cerca de 1 bar; A dimensãodos poros também deve ser selecionada de modo que os reagentes e/oumoléculas de analito e/ou as sondas possam atravessar as membranas. Sem serlimitados por teoria, para alguns substratos porosos com poros cilíndricosparalelos a Lei de Hagen-Poiseuille pode ser útil como uma guia para adimensão de poros requerida (como um guia para a pressão de bombeiorequerida):

ΔΡ = 128 μ L Q/(n D4N)

com ΔΡ: pressão (queda), μ: viscosidade; L: comprimento de poros (isto é,espessura do substrato); fluxo de volume; D: diâmetro de poros; N: número deporos. A pressão assim se escalona com o diâmetro E(-4);

A fórmula acima mencionada descreve a diferença de pressãopara realizar determinado fluxo Q [L/s] através da membrana. Ao passo que apressão capilar (pressão de bolhas) é descrita pela fórmula

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na qual, γ é a tensão interfacial (interface água/a é de 72 d.cm), r a dimensãodos poros, θ é o ângulo entre o menisco e a parede do poro. Para um poro deum mícron e ângulo de 45 graus, a pressão capilar para a interface água ar éde 3,5 bares.

Na presente invenção também substratos porosos.com porosaleatórios ou meios porosos constituídos de partículas podem ser usados. Naúltima hipótese, e sem ser limitados por teoria, para determinados dos ditossubstratos constituídos de partículas podem ser usados. Neste caso, e sem serlimitados por teoria, para determinados dos ditos substratos o escalonamentoda pressão (queda) com o cubo do diâmetro dos poros pode ser útil como umguia para a dimensão de poros requerida.

Devido à alta pressão capilar no interior da membrana coletorade ar somente fluido é bombeado da câmara 2 para a câmara 1 ao passo que oar não pode penetrar no interior da membrana. Isto conduz à operação isentade espuma da célula de fluxo passante.

O dispositivo da presente invenção compreende um servocomando de fluxo de fluido, e.g. um dispositivo para passar fluido da câmara2 através do substrato 3 para a câmara 1. O dispositivo para travessia podeconsistir em uma bomba ou um comutador para comutar um fluxo de fluidopressurizado no sentido das câmaras 1 e/ou 2. Alternativamente, uma pressãonegativa pode ser produzida na saída das câmaras, e.g. por uma bomba devácuo ou venturi. O vácuo é também suscetível de produzir formação deespuma em líquidos que é então suprimida pelos métodos e materiais dapresente invenção.

De acordo com uma modalidade alternativa da presenteinvenção, o dispositivo da invenção é munido de um servo comando de fluxode fluido, tal como uma bomba ou de uma combinação de comutador/válvulapara comutar uma corrente pressurizada de fluido, que pode assegurarcirculação bidirecional de fluido reversível entre as duas câmaras.

De acordo com a presente modalidade, como nas demaismodalidades, o substrato 3 opera de tal modo que também funciona comomembrana coletora de ar.

De acordo com a presente modalidade o dispositivo podeassegurar um maior contato dos reagentes e/ou das moléculas de analito e/ousondas, dependendo de quais são previstos sobre o substrato de forma aaumentar a sensibilidade. Para obter fluxo bidirecional dois servo comandosde fluxo de fluido podem ser usados, um para cada direção e um controladorpara controlar qual dos dois servo comandos é usado a qualquer tempo.

O uso do dispositivo conforme mostrado na fig. 1 seráexplanado em maior detalhe com referência às flgs. 3a-3h para um dispositivode fluxo passante equipado com um dispositivo premente constituído por umabomba 20. Observa-se que o diferencial de pressão entre a primeira câmara 2e a segunda câmara 1 pode ser estabelecido e/ou liberado por intermédio dabomba e fechamento e/ou abertura da válvula de canal de retorno 24.Inicialmente, o líquido de amostra é introduzido na primeira câmara 2 (flgs.3a e b). O líquido de amostra é então bombeado através do substrato 3 para asegunda câmara 1 aumentando a pressão na primeira câmara 2 (flgs. 3c a e).Com isto, a bomba 20 pode deslocar a membrana flexível 46 na direção dovolume da bomba 40, por exemplo, introduzindo gás pressurizado em contravolume 42 através da abertura de admissão de pressão 44 (figura 3d). Aqui, aválvula de canal de retorno 34, assim como a válvula de admissão 28, estáfechada. Sob a influência da pressão aumentada na primeira câmara 2, aamostra passará através do substrato 3 no sentido da segunda câmara 1.

Quando o valor desejado de liquido de amostra tiver sidobombeado através do substrato 3, a pressão é liberada (fig. 3c). De maneira abombear o líquido de amostra de retorno da segunda câmara 1 para o interiorda primeira câmara 2, a válvula de canal de retorno 24 é aberta e a pressão naprimeira câmara 2 é baixada, por exemplo, ventilando o contra volume 42 quecausará a membrana flexível 46 a se deslocar de tal modo que o volume dabomba 40 aumentará (fig. 3f). Todo líquido que tiver se acumulado no fundoda segunda câmara 1, próximo à segunda abertura 30, será bombeado para aprimeira câmara 2 através da membrana coletora de ar 5 e do canal de retorno6. Isto é causado pela pressão na segunda câmara 1, que foi aumentada pelolíquido de amostra adicionado, não esquecendo que o gás não pode passaratravés do substrato 3. Se este aumento de pressão não é suficiente parabombear o líquido de amostra de retorno para a primeira câmara 2, a pressãona primeira câmara pode ser decrescida invertendo a ação de bombeio dabomba 20, antes de abrir a válvula de canal de retorno 24. Subseqüentemente,a válvula de canal de retorno 24 é fechada, e o ciclo pode ser repetido (figs.3g e h). Deve ser observado que o substrato 3 e a membrana coletora de arpermanecem molhados após este primeiro ciclo, isto é, ambos desempenhamsuas plenas funções como válvula unidirecional e/ou supressor de espuma.

Observa-se que a bomba 20 pode compreender uma partemóvel, aqui na forma de uma membrana flexível e substancialmenteimpermeável a gás 46, que pode ativamente alterar o volume de volume dabomba 40, e assim a pressão na primeira câmara 2. Alternativamente, abomba 20 pode ser conectada com dispositivos de bombeio separados (nãomostrados) através da abertura de admissão de pressão 44. Naquele caso, amembrana flexível, ou a parte móvel em geral, pode ser uma parte passiva.

Os ciclos de bombeio das figs. 3a a h também podem serexecutados em uma modalidade alternativa, fazendo uso de uma bombaadicional 60, dotada de um volume de bomba adicional 6 e de um contravolume adicional 64, dividido pela membrana flexível adicional 66. Oassegurar uma bomba adicional 60 oferece a vantagem de que tanto naprimeira câmara 2 como na segunda câmara 1 a pressão pode ser aumentadaou decrescida, de forma independente uma da outra. O ponto de partida maisuma vez é a introdução do líquido de amostra na primeira câmara 2 através dodispositivo de introdução de líquido de amostra 26, válvula de admissão 28,separadamente do canal de retorno 6 e da primeira abertura 32 (figs. 3a e b).Observe-se que é possível proporcionar um canal de introdução separado, nãocombinado com um canal de retorno 6.

O líquido de amostra está pronto para ser bombeado através dosubstrato 3. A válvula de introdução de líquido de amostra 28 e a válvula decanal de retorno 24 são fechadas. Observe-se que a membrana flexível 46pode ter se deslocado no sentido do contra volume 42, de maneira a acomodarno volume da bomba 40 o volume de gás que foi expelido da primeira câmara2 ao introduzir o liquido de amostra (fig. 3b).

Com a válvula de admissão 28 e a válvula de canal de retorno24 fechadas, um diferencial de pressão entre a primeira câmara 2 e a segundacâmara 1 é estabelecido pela ação combinada da bomba 20 e bomba adicional60, de tal modo que o fluido de amostra flui através do substrato 3 no sentidoda segunda câmara 1.

Para estabelecer a diferença de pressão, é possível aumentar apressão na primeira câmara 2 por intermédio da bomba 20 (fig. 3d).. Aqui, amembrana flexível 46 se desloca na direção da seta. Alternativamente, ouadicionalmente, é possível decrescer a pressão na segunda câmara 1 porintermédio da bomba adicional 60. Aqui, a membrana flexível adicional 66 sedesloca na direção indicada (fig. 3d). Naturalmente, é também possívelaumentar a pressão em ambas as câmaras, porém mais na primeira câmara 2do que na segunda câmara 1, ou decrescer a pressão de uma maneira análoga.Caso líquido de amostra suficiente, por exemplo, a totalidadedo líquido de amostra tiver sido bombeada através do substrato 3 para asegunda câmara 1, a diferença de pressão é liberada, por exemplo, pelaabertura da válvula de canal de retorno 24, ou liberando a pressão na bomba20 e/ou na bomba 60 (fig. 3e).

Para bombear o líquido de amostra da segunda câmara 1através da membrana coletora de ar 5 para primeira câmara 2, a válvula docanal de retorno 24 é aberta enquanto uma diferença de pressão oposta éestabelecida. Por exemplo, a bomba 20 exerce uma pressão sobre a primeiracâmara 2 que é mais baixa que a pressão na segunda câmara 1 que é exercidapela bomba adicional 60 (fig. 3f). Isto pode, por exemplo, ser estabelecidodeslocando as membranas flexíveis 46 e 66 nas direções indicadas. Para isto,os respectivos contra volumes da bomba 20 e a bomba adicional 60 podem serpressurizadas correspondentemente. Alternativamente, as partes móveis dasbombas 20 e 60 podem elas próprias ser movidas de forma a estabelecerativamente as pressões.

O líquido de amostra fluirá da segunda câmara 1 através damembrana coletora de ar 5, canal de retorno 6 e da válvula de canal de retorno24 para a primeira câmara 2. Se a quantidade desejada de líquido de amostra,por exemplo, a totalidade do líquido de amostra, tiver sido bombeada para aprimeira câmara 2, a diferença de pressão é liberada e a válvula de canal deretorno 24 é fechada (fig. 3g). O dispositivo de análise está pronto agora pararepetir o ciclo (fig. 3b).

Os ciclos de bombeio das figs. 3a a h também podem serexecutados em ainda outra modalidade, fazendo uso de um dispositivo depressão sendo a bomba 60 e uma válvula sendo a válvula de admissão 28como ilustrada no dispositivo de fluxo passante da fig. 4. O uso do dispositivoconforme ilustrado na fig. 4 será explanado em maior detalhe com referênciaàs figs. 3a-3h para um dispositivo de fluxo passante equipado com umdispositivo de pressão sendo a bomba 60 e uma válvula sendo a válvula deadmissão 28.

Observa-se que a diferença de pressão entre a primeira câmara2 e a segunda câmara 1 pode ser estabelecida e/ou liberada por intermédio dabomba 60 sem a presença da válvula de canal de canal 24 da fig. 1. Devido atanto o substrato 3 como a membrana coletora de ar 5 funcionar comoválvulas unidirecionais, a presença da válvula de canal de retorno 24 da fig. 1não é requerida nesta modalidade específica, porém sua presença não obstantefacilitaria a introdução do líquido de amostra na primeira câmara 2 no iníciodo experimento. A válvula de canal de retorno 24 da fig. 1 ode assimopcionalmente ser incluída nesta modalidade de realização específica.

Inicialmente, o líquido de amostra é introduzido na primeiracâmara 2 (figs. 3a e b). O líquido de amostra é a seguir bombeado através dosubstrato 3 para a segunda câmara 1 decrescendo a pressão na segundacâmara 1 (figs 3c a e). Para isso, a bomba 60 mover a membrana flexível 66na direção do volume da bomba 64, por exemplo, por inverter a ação derecalque da bomba 60, ou pela bomba de vácuo ou venturi (fig. 3d). Aqui, aválvula de admissão 28 é fechada. Sob a influência da pressão decrescida nasegunda câmara 1, a amostra fluirá da primeira câmara 2 através do substrato3 no sentido da segunda câmara 1.

Quando a quantidade desejada de líquido de amostra tiver sidobombeada através do substrato 3, a pressão é liberada (fig. 3e). Todo líquidoque tiver se acumulado no fundo da segunda câmara 1, próximo à segundaabertura 30, será então bombeado para a primeira câmara 2 através damembrana coletora de ar 5 e do canal de retorno 6 (fig. 3f). Para isto, a bomba60 pode deslocar a membrana flexível 66 na direção de volume de bomba 62,por exemplo, introduzindo gás pressurizado em contra volume 64 através daabertura de entrada de pressão 68 (fig. 3f), lembrando que o gás não podepassar através do substrato 3 nem através da membrana coletora de ar 5.Subseqüentemente, o ciclo pode ser repetido (figs. 3g e h). Deve serobservado que o substrato 3 e a membrana coletora de ar podem permanecermolhados após este primeiro ciclo, isto é, ambos desenvolvem suas plenasfunções como válvula unidirecional e/ou supressor de espuma.

Observe-se que a bomba 60 pode compreender uma partemóvel, aqui na forma de uma membrana flexível e substancialmenteimpermeável a gás 66, que pode ativamente alterar o volume de bomba 62, eassim a pressão na segunda câmara 1. Alternativamente, a bomba 60 pode seconectada com dispositivos de bombeio separados (não mostrados) através daabertura de entrada de pressão 68. Naquele caso, a membrana flexível, ou aparte móvel em geral, pode ser uma parte passiva.

Os ciclos de bombeio da fig. 3 podem ser executados em aindaoutra modalidade alternativa na qual o fluido pode ser inicialmente bombeadopara a câmara inferior 1. Nesta modalidade a ordem de fluxo de fluido édescrita por uma seqüência de desenhos dada por 3a, 3c, 3f, 3g, 3h, 3b, 3c, 3d.

A presente invenção foi verificada experimentalmente com omaterial de membrana para membranas 5, que é atualmente usado parahibridização 5, que ligará amplicons PCR (muitos diferentes em um líquido)especificamente sobre sítios específicos sobre o substrato. O conjunto podeser usado para genotipia, detecção de polimorfismo, análise de expressão degene, imunoavaliações, etc., porém, muitos outros materiais porosos poderiamser usados.

O dispositivo da presente invenção é apropriado para processarou analisar uma amostra fluida. Por exemplo, um primeiro reagente pode serum catalisador ou enzima retida por ou imobilizada sobre o substrato e umsegundo reagente é previsto no fluido, e.g. um substrato para a enzima oucatalisador. O dispositivo é então usado como um biossensor ou um reator,e.g. um biorreator.

Alternativamente, o dispositivo da presente invenção é própriopara a detecção, identificação ou quantificação de um ou mais analitos. Napresente modalidade, o analito é contemplado para ser qualquer composto talcomo, porém não limitado a DNA, RNA, proteína peptídeo, ou compostosquímicos. A detecção, identificação, e/ou quantificação do analito éassegurada no dispositivo da presente invenção utilizando uma ou maissondas específicas pelas quais quer o analito a ser detectado ou identificadoou a(s) sonda(s) é/são retidos por ou imobilizados sobre um substratopermeável e a respectiva sonda ou analito é bombeada através do substratopermeável. O analito a ser detectado ou quantificado ou a/s sonda/s que sãoretidas por ou imobilizadas sobre um substrato permeável podem ser retidospor moléculas espaçadoras. O analito pode ser identificado e/ou quantificadoquer em forma isolada quer em forma semi-isolada ou como um componentede uma amostra (e.g. uma amostra biológica, amostra de alimento, amostraambiental, etc.).

Opcionalmente, onde o analito é DNA (tal como na detecçãode DNA bacteriano ou viral), o analito é amplificado, tal como por PCR,anterior à detecção por sonda específicas, de modo a adicionalmente aumentara sensibilidade da detecção anterior à detecção por sondas especificas, demodo a aumentar adicionalmente a sensibilidade da detecção. Os ditosrecursos de amplificação podem ser usados com ou incorporados aodispositivo da presente invenção, com isto o produto da amplificação ébombeado diretamente para o interior quer da câmara 1 quer da câmara 2 parabombeamento através ou sobre o substrato.

A natureza da/s sonda/s específica/s utilizadas no contexto dapresente invenção é determinada pelo analito a ser identificado e/ouquantificado e pode ser, por exemplo, porém, não limitada a uma sonda deácido nucléico (RNA, DNA, PNA), um anticorpo ou um fragmento domesmo, ou uma proteína ou peptídeo suscetível de especificamente ligar-secom o analito tal como um receptor, um hapteno ou um ligando. Porconseguinte, as interações sobre o substrato sobre o qual a detecção é baseadapodem incluir, porém, não limitada, a uma sonda de ácido nucléico (RNA,DNA, PNA), um anticorpo ou um fragmento do mesmo, ou uma proteína oupeptídeo suscetível de especificamente ligar-se com o analito tal como umreceptor, um hapteno ou um ligando. Por conseguinte, as interações sobre osubstrato sobre o qual a detecção é baseada podem incluir, porém, sem estarlimitadas a hibridização, ligação anticorpo-antígeno, interações proteína-proteina, interações ligando - receptor etc.

Opcionalmente, a sonda pode ser rotulada para permitirdetecção direta da sonda, e.g. por meios ópticos (e.g. fluorescência, cor de luzvisual) ou outros meios (e.g., campo magnético, radioatividade) sobre osubstrato. Alternativamente, é contemplado que a detecção da ligação doanalito com a sonda é visualizada e/ou quantificada por intermédio de umreagente rotulado suscetível de detectar especificamente o analito ou sondaligado especificamente com o substrato (e.g. antibióticos secundários). Adetecção pode ser efetuada utilizando qualquer detector apropriado, e.g. umdetector óptico tal como um microscópio, um fotodetector ou conjuntofotodetector, uma câmera CCD ou CMOS que está situada em uma unidadede leitura. A iluminação é realizada por qualquer fonte de luz apropriada (e.g.LEDs, OILEDs, ou laser ou lâmpada). Filtros de excitação e emissão podemser usados para aplicar os comprimentos de onda corretos e remover luz defundo da fonte e/ou fontes de luz. Todos estes componentes são situados emum dispositivo de leitura. A luz ingressando a partir do topo da célula (nacâmara 2), e emitida (ou refletida) é detectada do mesmo lado.

O dispositivo da presente invenção assegura a interação de umfluido com um reagente imobilizado sobre ou retido por um substrato poroso.Particularmente, o dispositivo da presente invenção assegura a interação deum ou mais analitos com uma ou mais sondas, com isto quer os analitos queras sondas são retidos ou imobilizados sobre um substrato. O componente nãoimobilizado da reação é previsto em um fluido, que é bombeado através dosubstrato. A natureza do fluido será determinada pela natureza da interaçãoanalito-sonda. Fluidos apropriados para assegurar e/ou promover reações dehibridização ou interações proteína-proteina são conhecidos daquelesversados na técnica e podem incluir um solvente tal como água, sais,detergentes, acelerantes e componentes de baferização. Para reações dehibridização, o termo "buffer de hibridização" é genericamente adotado,enquanto que para interações de proteína-proteína, menção é feita a "buffer deincubação".

De acordo com a presente invenção, aquela uma ou maissondas ou analitos são retidas por ou imobilizadas sobre um substratopermeável, por meio do qual de acordo com uma modalidade específica, osubstrato é uma membrana. Mais especificamente, a membrana é de ummaterial tal como, porém não limitado a nylon, sílica, nitrocelulose ou PVDF.

Estas membranas podem ser opcionalmente reticuladas para ligação covalentede pequenas moléculas tais como sondas DNA. Alternativamente, outrosmateriais podem ser usados tal com uma membrana de óxido metálico, maisespecificamente membranas de óxido de alumínio. Alternativamente, osubstrato é munido de canais como exposto no documento WO 95/11755. Oprimeiro tipo é constituído de fibras de vidro ocas. O segundo tipo éproduzido por ataque eletroquímico de uma pastilha de silício cristalina. Oterceiro tipo é produzido por ataque de trilha nuclear de um substratoinorgânico.

A imobilização do analito ou sondas opcionalmente pode serprevista em um conjunto, permitindo multiplexação.

A imobilização de sonda(s) ou de analito(s) pode ser atravésde adsorção não covalente ou ligação covalente sobre o substrato. Moléculasespaçadoras podem ser usadas para afixar a sonda ou analito ao substrato. Aimobilização também pode ser realizada retendo a sonda ou analito entre duasmembranas, que são seletivamente não permeáveis à sonda ou ao analito. Naúltima hipótese, a sonda ou analito é retida pelas membranas.

Ensaios nos quais o dispositivo de acordo com a invençãopode se usado podem incluir seqüenciamento por hibridização, imunoensaios,ensaios receptor/ligando e semelhantes.

O dispositivo de acordo com a invenção pode ser usado paraanalisar espécimes biológicos (tais como sangue, fezes, urina, saliva..),amostras d alimento, águas servidas, água potável, etc., para um ou mais atéum grande úmero de analitos.

Será entendido que, embora não sendo crítico para a invenção,o dispositivo de acordo com a presente invenção pode ser operado de duasmaneiras. Genericamente, uma ou mais sondas são imobilizadas sobre osubstrato entre a câmara Iea câmara 2 e o fluido contendo um ou maisanalitos é bombeado através do substrato da câmara superior para a câmara 2,de onde opcionalmente é recirculado para a câmara 1 por intermédio de umcanal de retorno ou alternativamente bombeado de volta para a câmara 1através do substrato. Alternativamente, o analito é imobilizado, quer emforma purificada ou como parte de uma amostra sobre o substrato entre acâmara Iea câmara 2 e reagentes contendo uma ou mais sondas sãobombeados através do substrato da câmara 1 para a câmara 2.

Será entendido, além disso, que o dispositivo da presenteinvenção adicionalmente compreenderá canais adicionais e entradas e saídaspara introduzir em, extrair reagentes e/ou fluidos das câmaras do dispositivo.Por exemplo, líquido de amostra proveniente de um módulo PCR ingressa nacélula descrita de acordo com as modalidades da presente invenção quer nacâmara 1 quer na câmara 2. Opcionalmente, hibridização adicional éadicionada e (após ser circulada através do módulo PCFR para incluir líquidode amostra PCR remanescente) inserida quer na câmara 1 quer na câmara 2.Após ter realizado um número de ciclos o líquido de amostra é opcionalmenteremovido do sistema (e.g. bombeado para uma câmara externa).

Opcionalmente, uma solução de lavagem é inserida (na câmara 1 ou 2) etambém circulada através do dispositivo. A detecção ode ser realizada emqualquer etapa de ciclo (antes e após a lavagem).

Importante também pode ser que a temperatura do líquido deamostra seja controlada, e.g. aquecida. Isto pode ser realizado comaquecedores externos. A temperatura pode, em algum ponto — e.g. após umciclo - ser elevada para aumentar a rigorosidade do ensaio (e.g. especialmentepara ensaios de hibridização) e para registrar curvas de fusão de alvosdelimitados. Preferencialmente, isto eleva a temperatura a ser realizadadurante os ciclos de.lavagem.

Claims (13)

1. Dispositivo de fluxo passante caracterizado pelo fato de quecompreende um trajeto de circulação incluindo:uma primeira câmara;uma segunda câmara;um substrato poroso entre a primeira e a segunda câmara; eum servo comando de circulação de fluido assegurando apassagem de líquido de amostra ao longo do trajeto de circulação da primeirapara a segunda câmara através do substrato ou via um canal ou canais emtorno do substrato;em que pelo menos uma substância porosa é prevista entre aprimeira e a segunda câmara e pelo menos uma membrana porosa adicionalser prevista no trajeto de circulação.

2. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que compreende um canal de retorno entre a primeira e a segundacâmara e em que pelo menos um a membrana porosa é prevista no canal deretorno entre a segunda e a primeira câmara.

3. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações-1 a 2, caracterizado pelo fato de que a membrana porosa é hidrófila.

4. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes, caracterizado pelo fato de que líquido de amostra é circuladounidirecionalmente entre a primeira e a segunda câmaras.

5. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que o servo comando de circulação de fluido é adaptado paracirculação bidirecional para dessa maneira circular o líquido de amostra deretorno da segunda câmara para a primeira câmara através do substratoporoso.

6. Dispositivo de acordo com qualquer reivindicaçãoprecedente, caracterizado pelo fato de que uma membrana porosa adicional éprevista na ou adjacente a uma entrada da primeira câmara de modo a reduzirou prevenir a formação de espuma em qualquer uma das câmaras ou canais.

7. Dispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesprecedentes caracterizado pelo fato de que reagentes, moléculas de analito ousondas são imobilizados ou retidos pelo substrato poroso.

8. Dispositivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizadopelo fato de que o substrato poroso é suscetível de ligar covalentemente ounão covalentemente oligonucleotídeos.

9. Dispositivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizadopelo fato de que a membrana porosa tem sítios que podem adsorvercompostos que possam interferir com os reagentes, moléculas de analito ousondas sobre o substrato poroso.

10. Dispositivo de acordo com a reivindicação 9, caracterizadopelo fato de que os sítios são adaptados para ser iniciadores de captura quenão foram usados em uma etapa de método de amplificação.

11. Biossensor caracterizado pelo fato de que compreende odispositivo de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes.

12. Método para preparar um analito em uma amostra líquidapara detecção, método este que compreende as etapas de:a) imobilizar uma sonda suscetível de especificamente liga-secom o dito analito sobre um substrato poroso posicionado entre uma primeirae uma segunda câmara de um dispositivo analítico;b) transferir o liquido de amostra contendo o analito ao longode um trajeto de circulação incluindo a primeira e a segunda câmara paradesse modo circular o líquido de amostra sobre o substrato poroso;c) opcionalmente recircular o líquido de amostra para aprimeira câmara através de um canal de retorno;caracterizado pelo fato de que uma membrana porosa éprevista no trajeto de circulação de modo a reduzir ou prevenir a formação deespuma em qualquer uma das câmara ou canais como um resultado da ditatransferência.

13. Método para processar líquido de amostra, o métodocompreende as etapas dea) imobilizar um primeiro reagente sobre um substratoporoso posicionado entre uma primeira e uma segunda câmara de umdispositivo de fluxo passante;b) transferir o líquido de amostra contendo um segundoreagente ao longo de um trajeto de circulação que inclui a primeira e asegunda câmara para desse modo circular o líquido de amostra sobre osubstrato poroso.c) recircular opcionalmente o líquido de amostra para aprimeira câmara através de um canal de retorno;caracterizado pelo fato de que uma membrana porosa éprevista no trajeto de circulação de modo a reduzir ou prevenir a formação deespuma em qualquer uma das câmaras ou canais como um resultado da ditatransferência.